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EP1294880A2 - Peptides antimicrobiens de la famille des defensines, polynucleotides codant ces peptides, vecteurs et organismes transformes les contenant - Google Patents

Peptides antimicrobiens de la famille des defensines, polynucleotides codant ces peptides, vecteurs et organismes transformes les contenant

Info

Publication number
EP1294880A2
EP1294880A2 EP01949535A EP01949535A EP1294880A2 EP 1294880 A2 EP1294880 A2 EP 1294880A2 EP 01949535 A EP01949535 A EP 01949535A EP 01949535 A EP01949535 A EP 01949535A EP 1294880 A2 EP1294880 A2 EP 1294880A2
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
peptide
host organism
transformed
polynucleotide
termicin
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP01949535A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Mireille Lamberty
Philippe Bulet
Marie-Pascale Latorse
Jules Hoffmann
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biogemma SAS
Original Assignee
Rhobio SA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Rhobio SA filed Critical Rhobio SA
Publication of EP1294880A2 publication Critical patent/EP1294880A2/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N37/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids
    • A01N37/44—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing organic compounds containing a carbon atom having three bonds to hetero atoms with at the most two bonds to halogen, e.g. carboxylic acids containing at least one carboxylic group or a thio analogue, or a derivative thereof, and a nitrogen atom attached to the same carbon skeleton by a single or double bond, this nitrogen atom not being a member of a derivative or of a thio analogue of a carboxylic group, e.g. amino-carboxylic acids
    • A01N37/46—N-acyl derivatives
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/50—Isolated enzymes; Isolated proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/43504—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates
    • C07K14/43563—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from invertebrates from insects
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8279—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance
    • C12N15/8281—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for biotic stress resistance, pathogen resistance, disease resistance for bacterial resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
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    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
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    • A01K2217/00—Genetically modified animals
    • A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Definitions

  • Antimicrobial peptides of the defensin family polynucleotides encoding these peptides, vectors and transformed organisms containing them
  • the present invention relates to new antimicrobial peptides of the family of defensins, in particular antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifungals, called antifung
  • the invention also relates to transformed organisms, in particular yeasts producing specificin, or plant cells and plants, the quantitativeins produced by transformed plants conferring on them resistance to diseases, in particular of fungal origin.
  • the invention also relates to the use of toxicins as a medicament and the pharmaceutical compositions comprising them.
  • Invertebrates especially Insects, a number of substances naturally produced by these organisms which give them protection against pathogens of bacterial or fungal origin. These substances are generally peptides which are said to be antibacterial, antifungal or antimicrobial depending on whether they have a preferential activity with respect to bacteria, fungi, or a mixed activity with respect to these two types of pathogens.
  • bactericide or fungicide means both the bactericidal or fungicidal properties proper as well as the bacteriostatic or fungistatic properties.
  • the solution to the technical problem of the present invention therefore lies in the isolation of peptides identified, initially, preferentially by their antimicrobial properties rather than by their structures.
  • This solution is obtained with the definition of in vitro tests for inhibiting the growth of bacteria, fungi or yeasts, which tests make it possible to screen extracts from a large number of organisms, in particular insects, for the presence of 'activities with respect to at least one of these tests.
  • a characteristic toxicin is isolated from the termite Pseudacanthotermes spiniger.
  • a proliferative factor is a peptide belonging to the class of insect defensins.
  • the insect defensins class mainly includes antibacterial and / or antifungal peptides characterized by the fact that they contain six cysteines linked together by three dissulfide bridges.
  • the invention therefore relates to new peptides, antiins.
  • te ⁇ nicins present mainly a fungicidal activity, in particular against the filamentous fungi responsible for plant diseases and the fungi of human and animal pathology.
  • the antiins also have an activity with respect to yeasts of human pathology, as well as lytic or static properties on Gram-positive bacteria.
  • the present invention also relates to polynucleotides encoding a therapeuticin as defined above.
  • polynucleotide means a natural or artificial nucleotide sequence which may be of DNA or RNA type, preferably of DNA type, in particular double strand.
  • the polynucleotides can either be artificially synthesized, or correspond to the polynucleotides of the insect from which they are isolated, or else correspond to fragments derived from these polynucleotides, suitable for the expression of the toxicin in the host organism where said antiin will be expressed.
  • the polynucleotides can be obtained according to standard isolation and purification methods, or alternatively by synthesis according to the usual techniques for successive hybridizations of synthetic oligonucleotides. These techniques are in particular described by Ausubel el al. (1987, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Greene, Publ. Wiley & Sons).
  • the polynucleotides coding for therapeuticin comprise polynucleotides coding for the peptide sequence described by the sequence identifier SEQ ID NO: 2. It is well known to those skilled in the art that this definition includes all polynucleotides which, although comprising different nucleotide sequences as a result of the degeneration of the genetic code, code for the same amino acid sequence, which is represented by l SEQ ID NO: 2.
  • the present invention also includes isolated polynucleotides encoding toxicins and capable of selectively hybridizing to one of the polynucleotides previously described.
  • polynucleotide capable of hybridizing selectively is meant according to the invention the polynucleotides which, by one of the usual methods of the prior art (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C. ed., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), hybridize with the above polynucleotides at a level significantly above background.
  • the background noise can be linked to the hybridization of other polynucleotides present, in particular other cDNAs present in a cDNA library.
  • the level of the signal generated by the interaction between the polynucleotide capable of selective hybridization and the polynucleotides defined by the above sequence ID according to the invention is generally 10 times, preferably 100 times more intense than that of l interaction of other DNA sequences generating background noise.
  • the level of interaction can be measured, for example, by labeling the probe with radioactive elements, such as 12 P.
  • Selective hybridization is generally obtained by using very harsh environmental conditions (for example 0.03 M NaCl and 0.03 M sodium citrate at about 50 ° C-60 ° C).
  • the invention also includes isolated polynucleotides encoding toxicins and homologs of the polynucleotides previously described.
  • homologous polynucleotides having one or more sequence modifications with respect to the nucleotide sequences described above and coding for a therapeuticin whose properties are not significantly altered. These modifications can be obtained according to the usual mutation techniques leading in particular to the addition, deletion, or substitution of one or more nucleotides with respect to the sequences of the invention.
  • the degree of homology will be at least 70% relative to the sequences of the invention, preferably at least 80%, more preferably at least 90%.
  • the methods for measuring and identifying the homologies between the nucleic acid sequences are well known to those skilled in the art.
  • One can use for example the PILEUP or BLAST programs in particular Altschul et al, 1993, J. Mol. Evol. 36: 290-300; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215: 403-10).
  • the present invention also relates to fragments of the polynucleotides described above.
  • fragment denotes in particular a fragment of at least 20 nucleotides, in particular of at least 50 nucleotides, and preferably of at least 100 nucleotides.
  • the polynucleotide according to the invention is represented by the sequence identifier SEQ ID NO: 1.
  • the present invention also relates to polynucleotides comprising at least one of the polynucleotides as described above.
  • a topical agent is a peptide comprising the peptide sequence described by the sequence identifier SEQ ID NO: 2 or a fragment of this sequence.
  • fragment is meant essentially a biologically active fragment, that is to say a fragment of the sequence of a therapeuticin having the same antimicrobial activity as a complete proliferator.
  • the NH 2 terminal residue of a therapeuticin can exhibit a post-translational modification, for example acetylation, just as the C-terminal residue can exhibit a post-translational modification, for example an amidation.
  • a toxicin as described in the present invention differs from defensins of insects of the state of the art by its peptide structure, and in particular of another defensin of insects, the heliomicine described in patent application WO 99/53053, by the structural characteristic of having a number of amino acid residues between cysteines no. 3 and 4 greater than 9.
  • the cysteine residues of a therapeuticin form at least one intramolecular disulfide bridge, preferably three disulfide bridges.
  • the bridges of sulfides are established between the cysteine residues 1 and 4, 2 and 5 and 3 and 6.
  • the present invention also relates to a chimeric gene comprising at least, operably linked, a functional promoter in a host organism, a polynucleotide coding for a toxicin as defined in the present invention, and a functional terminator in this same organism host.
  • the various elements that a chimeric gene can contain are, on the one hand, elements regulating the transcription, translation and maturation of proteins, such as a promoter, a sequence coding for a signal peptide or a peptide transit, or a terminator constituting a polyadenylation signal, and on the other hand a polynucleotide coding for a protein.
  • operatively linked to one another means that said elements of the chimeric gene are linked to each other so that the functioning of one of these elements is affected by that of another.
  • a promoter is operably linked to a coding sequence when it is able to affect the expression of said coding sequence.
  • the choice of regulatory elements constituting the chimeric gene is essentially a function of the host species in which they must function, and those skilled in the art are capable of selecting functional regulatory elements in a given host organism. By “functional” is meant capable of functioning in a given host organism.
  • the promoters which the chimeric gene according to the invention may contain are either constitutive or inducible. It also appears important that the chimeric gene also includes a signal peptide or a transit peptide which makes it possible to control and direct the production of toxicin specifically in a part of the host organism, such as for example the cytoplasm, a particular compartment of the cytoplasm, the cell membrane, or in the case of plants in a particular type of cell or tissue compartments or in the extracellular matrix.
  • the transit peptide can be a chloroplastic or mitochondrial addressing signal, which is then cleaved in the chloroplasts or the mitochondria.
  • the signal peptide can be an N-terminal signal or "prepeptide", optionally in combination with a signal responsible for the retention of the protein in the endoplasmic reticulum, or an addressing peptide vacuolar or "propeptide".
  • the endoplasmic reticulum is the cell compartment where operations are carried out to mature the protein produced, such as, for example, the cleavage of the signal peptide.
  • Transit peptides can be either single or double.
  • the double transit peptides are optionally separated by an intermediate sequence, that is to say that they comprise, in the direction of transcription, a sequence coding for a transit peptide of a plant gene coding for an enzyme with plastid localization. , a part of the sequence of the mature N-terminal part of a plant gene coding for an enzyme with plastid location, then a sequence coding for a second transit peptide of a plant gene coding for an enzyme with plastid location.
  • Such double transit peptides are for example described in patent application EP 0 508 909.
  • signal peptide useful according to the invention mention may be made in particular of the signal peptide of the PR-1 gene from tobacco described by Cornelissen et al. (1987, Nucleic Acid Res. 15, 6799-681 1) in particular when the chimeric gene according to the invention is introduced into plant cells or plants, or the signal peptide of the precursor of the factor factor ⁇ l (Brake et al., 1985, In: Gething M.-J. (eds.); Protein transport and secretion, pp.103-108, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) when the chimeric gene according to the invention is introduced into yeasts.
  • the present invention also relates to a vector containing a chimeric gene according to the invention.
  • the vector according to the invention is useful for transforming a host organism and for expressing in it a toxicin.
  • This vector can be a plasmid, a cosmid, a bacteriophage or a virus.
  • the main qualities of this vector must be an ability to maintain and self-replicate in the cells of the host organism, in particular thanks to the presence of an origin of replication, and to express toxicin there.
  • the choice of such a vector as well as the techniques for inserting into it the chimeric gene according to the invention are widely described in Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Nolan C.
  • the vector used in the present invention also contains, in addition to the chimeric gene of the invention, a chimeric gene containing a selection marker.
  • This selection marker makes it possible to select the host organisms actually transformed, that is to say those which have incorporated the vector.
  • the host organism to be transformed is a plant.
  • the host organism is a microorganism, in particular a yeast.
  • markers containing antibiotic resistance genes such as, for example, that of the hygromycin phosphotransferase gene (Gritz et al., 1983, Gene 25: 179-188), but also markers containing herbicide tolerance genes such as the bar gene (White et al, NAR 18: 1062, 1990) for bialaphos tolerance, the EPSPS gene (US 5,188,642) for glyphosate tolerance or the HPPD gene (WO 96/38567) for tolerance to isoxazoles. Mention may also be made of genes coding for easily identifiable enzymes such as the enzyme GUS, genes coding for pigments or enzymes regulating the production of pigments in transformed cells. Such selection marker genes are described in particular in patent applications WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, and WO 97/04103.
  • the present invention also relates to transformed host organisms, containing a vector as described above.
  • host organism any mono or multicellular organism, lower or higher, into which the chimeric gene according to the invention can be introduced, for the production of toxicin.
  • bacteria for example E. coli, yeasts, in particular of the genera Saccharomyces, Kluyveromyces, or Pichia, fungi, in particular Aspergillus, a baculovirus, or preferably plant and plant cells .
  • plant cell any cell originating from a plant and which can constitute undifferentiated tissues such as calluses, differentiated tissues such as embryos, parts of plants, plants or seeds.
  • plant means any differentiated multicellular organism capable of photosynthesis, in particular monocots or dicots, more particularly crop plants intended or not for animal or human consumption, such as corn, wheat, rapeseed, soybeans, rice, sugar cane, beet , tobacco, cotton.
  • transformed host organism means a host organism which has incorporated the chimeric gene of the invention into its genome, and consequently produces a toxicin in its tissues, or in a culture medium.
  • those skilled in the art can use one of the many known transformation methods.
  • One of these methods consists in placing the cells to be transformed in the presence of polyethylene glycol (PEG) and of the vectors of the invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genêt. 168 (1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochemistry 70 (4), 503-517).
  • Electroporation is another method which consists in subjecting the cells or tissues to be transformed and the vectors of the invention to an electric field (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6 (7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989 , Aust. J. Biotechnol. 3 (1), 56-62).
  • Another method is to directly inject the vectors into host cells or tissues by micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gene 33 (2), 121-136).
  • the so-called "biolistic” method can be used. It consists in bombarding cells or tissues with particles on which the vectors of the invention are adsorbed (Bruce et al. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (24), 9692-9696; Klein and al., 1992, Biotechnology 10 (3). 286-291; US Patent No. 4,945,050).
  • the transformation of plants will be carried out using bacteria of the genus Agrobacterium, preferably by infection of the cells or tissues of said plants with A.
  • tumefaciens Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gene 23 (3): 315-330
  • A. rhizogenes Bevan and Chilton, 1982, Annu. Rev. Genêt. 16: 357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci . 4 (1), 24-28.
  • the transformation of plant cells by Agrobacterium tumefaciens is carried out according to the protocol described by Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14 (6), 745-750).
  • the present invention therefore also relates to transformed microorganisms containing a chimeric gene according to the invention, and expressing toxicin.
  • the transformation of microorganisms makes it possible to produce toxicin on a semi-industrial or industrial scale.
  • the microorganism to be transformed can be yeast, fungus, bacteria, or virus.
  • a person skilled in the art will be able to select the regulatory elements of the chimeric gene allowing the optimization of toxicin production. These regulatory elements are in particular promoter sequences, transcription activators, signal or transit peptides, terminator sequences and start and stop codons.
  • the transformed host organism is a yeast.
  • the transformation of a yeast can be carried out with an expression vector comprising a polynucleotide coding for proin and the following elements:
  • the ura-3 gene is used for yeast and the gene which confers resistance to ampicillin for E. coli,
  • a nucleic acid sequence allowing replication (origin of replication) of the plasmid in yeast is used,
  • nucleic acid sequence allowing replication (origin of replication) of the plasmid in E. coli, - a chimeric gene according to the invention consisting
  • a promoter regulatory sequence Any promoter sequence of a gene expressing itself naturally in yeast can be used.
  • the promoter of the Mf ⁇ l gene from S. cerevisiae is used as described in Betz et al. (1987, J. Biol. Chem., 262, 546-548) or Reichhart et al. (1992, Invert. Reprod. Dev., 21, 15-24), (2) of a sequence coding for a signal peptide (or prepeptide) in association with an addressing peptide (or propeptide). These regions are important for the correct secretion of the peptide.
  • the sequence encoding the pre-pro-peptide of the precursor of factor MF ⁇ 1 is used as described in Betz et al. (1987, J. Biol. Chem., 262, 546-548) or Reichhart et al. (1992, Invert. Reprod. Dev., 21, 15-24), (3) of a polynucleotide according to the invention
  • PGK phosphoglycerate kinase
  • yeasts of species 5 cerevisiae are transformed with the expression vector by the lithium acetate method (Ito et al., 1993, J. Bacteriol, 153, pp
  • the transformed yeasts are selected on a selective agar medium which does not contain uracil. Mass production of the transformed yeasts is carried out by culture for 24 h to 48 h in a selective liquid medium.
  • the present invention therefore also relates to a process for preparing toxicin, comprising the steps of culturing a transformed microorganism comprising a gene coding for specificin as defined above in an appropriate culture medium, then the extraction and total or partial purification of the specificin obtained.
  • the regulatoryin-producing microorganism used is a transformed yeast comprising a chimeric gene according to the invention.
  • the yeasts are removed by centrifugation and the culture supernatant is brought into contact with an acid solution which may be a solution of a mineral or organic acid such as example hydrochloric acid or acetic acid.
  • the extract obtained is then centrifuged cold at a speed of 4000 to 10,000 rpm at 4 ° C, for 30 to 60 min.
  • the purification of toxicin can be preceded by a fractionation step of the supernatant obtained following the extraction step.
  • the extract is deposited on the reverse phase to carry out a solid phase extraction.
  • the water-soluble molecules are washed with a dilute acid solution and the hydrophobic molecules are eluted with an appropriate eluent.
  • trifluoroacetic acid is used for washing and an eluent containing increasing amounts of acetonitrile in dilute acid solution.
  • a second extraction step in the solid phase is carried out and preferably on the ion exchange phase.
  • the non-retained molecules are washed in a saline buffer at acidic pH and the cationic molecules are eluted with a solution with increasing concentration of salts.
  • the quality required for good fixation of the molecules is obtained with an ammonium acetate buffer at a concentration of less than 100 ⁇ M.
  • an eluent containing a saline chaotropic agent in buffered solution is used.
  • the purification of anti-inflammatory agent is carried out in a reverse phase HPLC step with a suitable eluent which may be different or identical to that of the reverse phase. previous.
  • the different stages of the purification are followed by a test for inhibition of fungal and bacterial growth in a liquid medium.
  • the tests are carried out with the fungus Neurospora crassa, and the bacterium Micrococcus luteus.
  • the quantitative in sequence produced by the transformed yeasts is analyzed according to the Edman degradation sequencing method and by mass spectrometry.
  • the structural characterization is carried out directly on the peptide produced, on the peptide modified by reduction / alkylation as well as on fragments of the peptide.
  • the peptide sequence and the molecular mass of the toxicin produced as well as the minimum inhibitory concentration (CM1). against the filamentous fungus Neurospora crassa were compared with those of a reference toxicin, the native fluorescentin extracted from whole bodies of Pseudacanthotermes spiniger.
  • the two molecules have the same primary structure with the exception of the presence of an additional C-terminal amino acid in the recombinant molecule, namely a peptide residue consisting of an amino acid, preferably glycine (Gly ) to replace the C-terminal amidation of the peptide residue represented by the amino acid C-terminal a ide of the natural molecule, namely the peptide residue consisting of the amino acid - Arg-amide.
  • the determination of the position of the disulfide bridges indicates that the arrangement of the disulfide bridges is identical in the two peptides, native and produced by the transformed microorganism.
  • the invention also relates to transformed plants containing a chimeric gene according to the invention and expressing in their tissues a toxicin according to the invention, said quantitativein conferring on these plants resistance towards pathogenic organisms.
  • the chimeric gene used to obtain transformed plants according to the invention may contain a constitutive promoter or an inducible promoter.
  • promoter any promoter of a gene expressing itself naturally in plants can be used, in particular a promoter of bacterial, viral or vegetable origin.
  • constitutive promoters which can be used in the chimeric gene of the present invention
  • bacterial promoters such as that of the octopine synthase gene or that of the nopaline synthase gene
  • promoters viral such as that of the gene controlling the transcription of RNA19S or 35S of the cauliflower mosaic virus (Odell et al., 1985, Nature, 313, 810-812), or the promoters of the rib mosaic virus Cassava (as described in patent application WO 97/48819).
  • promoters of plant origin mention will be made of the promoter of the gene for the small ribulose-biscarboxylase / oxygenase (RuBisCO) subunit, the promoter of a histone gene as described in application EP 0 507 698, or the promoter of a rice actin gene (US 5,641,876 ). Mention may also be made of the regulatory element defined by the functional association of a histone gene promoter associated with an actin gene intron as described in patent application WO 99/34005.
  • RuBisCO small ribulose-biscarboxylase / oxygenase
  • the chimeric gene contains an inducible promoter.
  • An inducible promoter is a promoter which functions, that is to say which induces the expression of a coding sequence, only when it is itself induced by an inducing agent.
  • This inducing agent is generally a substance which can be synthesized in the host organism following a stimulus external to said organism, this external stimulus possibly being for example a pathogenic agent.
  • the inducing agent can also be a substance external to this host organism capable of penetrating inside of it.
  • the promoter used in the present invention is inducible following the aggression of the host organism by a pathogenic agent.
  • Such promoters are known, such as, for example, the promoter of the plant O-methyltransferase class II (COMT II) gene described in patent application FR 99 03700, the PR-1 promoter from Arabidopsis (Lebel et al, 1998, Plant J. 16 (2): 223-233), the EAS4 promoter of the sesquiterpene synthase gene from Tobacco (Yin et al., 1997, Plant Physiol. 115 (2), 437-451), or the promoter of the gene encoding 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Nelson et al., 1994, Plant Mol. Biol. 25 (3): 401-412).
  • COMP O-methyltransferase class II
  • the chimeric gene can also contain, in association with the promoter regulatory sequence, other regulatory sequences, which are located between the promoter and the coding sequence, such as transcription activators ("enhancer"), such as, for example, the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or of the tobacco etch virus (TEV) described by Carrington and Freed (1990, J. Virol. 64, 1590-1597). It can also contain a signal peptide or a transit peptide as described above.
  • transcription activators such as, for example, the translational activator of the tobacco mosaic virus (TMV) described in application WO 87/07644, or of the tobacco etch virus (TEV) described by Carrington and Freed (1990, J. Virol. 64, 1590-1597.
  • terminating elements which can be used in the chimeric gene of the present invention, we can cite by way of example the terminating element nos of the gene coding for nopaline synthase from Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res 1 1 (2), 369-385), or the terminator of a histone gene as described in application EP 0 633 317.
  • the chimeric gene can also be associated with a selection marker adapted to the transformed host organism.
  • selection markers are well known to those skilled in the art. It could be an antibiotic resistance gene, or a herbicide tolerance gene for plants. Such herbicide tolerance genes are well known to those skilled in the art and in particular described in patent applications EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 or WO 97/04103.
  • the transformed plants according to the invention also include the transformed plants resulting from the culture and / or crossing of the above regenerated plants, as well as the seeds of transformed plants.
  • the plants thus transformed are resistant to certain diseases, in particular certain fungal or bacterial diseases, preferably to fungal diseases such as those caused, for example, by a fungus of the genus Cercospora, in particular Cercospora fijensis, of the genus Septoria in particular.
  • Septoria nodorum or Septoria tritici of the genus Fusarium, in particular Fusarium nivale or Fusarium graminearum, of the genus Botrylis, in particular Botrytis cinerea, or of the genus Rhizoctonia, in particular Rhizoctonia solani.
  • the cells and plants transformed according to the invention can comprise, in addition to a chimeric gene according to the invention, at least one other chimeric gene containing a polynucleotide encoding a protein of interest.
  • polynucleotides encoding a protein of interest mention may be made of polynucleotides encoding an enzyme for resistance to a herbicide, for example the polynucleotide encoding the enzyme bar (White et al., NAR 18: 1062, 1990) tolerance to bialaphos, the polynucleotide coding for the EPSPS enzyme (US 5,188,642; WO 97/04103) for tolerance to glyphosate or the polynucleotide coding for the HPPD enzyme (WO 96/38567).
  • disease resistance polynucleotides may also be contained in these plants, for example a polynucleotide coding for the enzyme oxalate oxidase as described in patent application EP 0 531 498 or US patent 5,866,778, or a polynucleotide coding for another antibacterial and / or antifungal peptide such as those described in patent applications WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, and WO99 / 91089.
  • SAT serine acetyltransferase enzyme
  • the other sequences can be integrated using the same vector comprising a chimeric gene, which comprises a first sequence coding for proliferin and at least one other sequence coding for another peptide or protein of interest.
  • the plants according to the invention can also be obtained by crossing parents, one carrying the gene according to the invention coding for progenitor, the other carrying a gene coding for at least one other peptide or protein of interest.
  • the present invention also relates to a method of cultivating transformed plants according to the invention, the method consisting in planting the seeds of said transformed plants in an area of a field suitable for the cultivation of said plants, to be applied to said surface of the said field an agrochemical composition, without substantially affecting said seeds or said transformed plants, then harvesting the cultivated plants when they reach the desired maturity and optionally separating the seeds from the harvested plants.
  • agrochemical composition comprising at least one active product having one of the following activities, herbicide, fungicide, bactericide, virucide or insecticide.
  • the agrochemical composition comprises at least one active product having at least one activity fungicide and / or bactericide, more preferably having an activity complementary to that of the quantitativein produced by the plants transformed according to the invention.
  • product having an activity complementary to that of specificin is meant according to the invention a product having a spectrum of complementary activity, that is to say a product which will be active against attacks by contaminants (fungi, bacteria or viruses) insensitive to specificin, or a product whose activity spectrum covers that of specificin, in whole or in part, and whose application dose will be reduced substantially due to the presence of specificin produced by the plant transformed.
  • Termicin is a peptide which is particularly active against fungi and yeasts and certain bacteria, and can therefore be used as a preventive or curative measure to protect various organisms against fungal and / or bacterial attack.
  • the present invention therefore also relates to regulatoryin as a medicament. It also relates to the use of toxicin for the treatment of plants against fungal and / or bacterial attack, by applying the toxicin directly on said plants.
  • the present invention also relates to a composition
  • a composition comprising a therapeuticin according to the invention and a suitable vehicle.
  • the first quality of the suitable vehicle is that it does not substantially degrade the quantitativein in the composition, and that it does not reduce the bactericidal and fungicidal properties of the toxicin.
  • vehicle is meant any substance which is added to toxicin in the present composition in order to essentially promote the transport and the protection of said toxicin.
  • This composition can be a cosmetic composition and in this case the appropriate vehicle is cosmetically acceptable, further adapted for application to the skin or the integuments.
  • the composition may also be a pharmaceutical composition for therapeutic use in human or animal health, and in this case the appropriate vehicle is pharmaceutically acceptable, suitable for administration of toxicin topically, per os or by injection.
  • the composition can be an agrochemical composition and in this case the appropriate vehicle is agrochemically acceptable, suitable for application on plants or near plants, without degrading them.
  • the composition can be a food composition for animal or human food, and in this case the appropriate vehicle is food acceptable, that is to say compatible with assimilation of the composition by ingestion.
  • Termites whole bodies are reduced to a fine powder in a mortar in the constant presence of liquid nitrogen.
  • An extract can be produced on both male and female animals, naive or immune.
  • An extract from blood cells or salivary glands is also possible.
  • the solution which enables the extract to be made contains, in addition to trifluoroacetic acid, a protease inhibitor (aprotinin at a final concentration of 10 ⁇ g / ml) and a melanization inhibitor (phenylthiourea at 20 ⁇ M).
  • a protease inhibitor aprotinin at a final concentration of 10 ⁇ g / ml
  • a melanization inhibitor phenylthiourea at 20 ⁇ M
  • the fraction containing the peptide was analyzed by reverse phase chromatography on an Aquapore RP-300 C 8 semi-preparative column (Brownlee TM, 220 x 7 mm, 300 ⁇ ), the elution was carried out by a linear gradient of acetonitrile from 2 to 60% in 0.05% TFA for 120 minutes at a constant flow rate of 1.3 ml / min.
  • the fractions were collected manually by following the variation in absorbance at 214 nm and 225 nm. The collected fractions were dried under vacuum, reconstituted with ultrapure water and analyzed for their antimicrobial activity using the tests described below.
  • the antimicrobial fraction corresponding to the peptide was analyzed on two size exclusion columns mounted in series (Ultraspherogel SEC 3000 and SEC 2000, 7.5 x 300 mm, Beckman TM) and protected by a pre-column (Ultraspherogel SEC , 7.5 x 40 mm, Beckman TM).
  • the elution is carried out under isocratic conditions with 30% acetonitrile in the presence of 0.05% TFA at a flow rate of 0.4 ml / min.
  • the fractions are collected as a function of the variation in optical density measured at 225 and 214 nm.
  • the collected fractions were dried under vacuum, reconstituted with ultrapure water and analyzed for their antimicrobial activity using the tests described below.
  • the antimicrobial fraction corresponding to the peptide was analyzed on the same column in reverse phase as for the initial step, using as elution conditions a discontinuous linear gradient of acetonitrile in acidified water (TFA 0.05% ) 2-15% in 10 min and 15-45% in 120 min. The fractions are collected and analyzed for their antimicrobial activity as before.
  • the antimicrobial fraction is analyzed on a reverse phase analytical column Aquapore OD-300 (220 x 4.6 mm, Brownlee TM) and the elution of the compound of interest carried out by a linear biphasic gradient of acetonitrile in acidified water 2-15% in 10 min followed by a gradient of 22-32% in 50 min at a flow rate of 0.8 ml / min and at a controlled temperature of 30 ° C.
  • the last purification step is carried out on a reverse phase column with small internal diameter called “narrow bore” (Delta Pak HPIC 18 , 2 x 150 mm, Waters TM) at a controlled temperature at 30 ° C at a flow rate of 0.2 ml / min.
  • the gradient used to perform this last purification step is a linear two-phase gradient of acetonitrile in acid medium (TFA 0.05%) of 2-17% in 10 min and 17-27% in 40 min.
  • TFA 0.05%) linear two-phase gradient of acetonitrile in acid medium
  • the purity of the antifungal peptide was verified by capillary zone electrophoresis on a 270-HT model (PEApplied Biosystems division of Perkin Elmer). 1 ⁇ l of a 50 ⁇ M solution of purified peptide was injected with vacuum assistance into a silica capillary (72 cm ⁇ 50 ⁇ m) and the analysis was carried out in 20 mM citrate buffer at pH 2.5. The electrophoresis was carried out at 20 kV from the anode to the cathode for 20 min at 30 ° C. The migration was recorded at 200 nm. 2-2 Determination of the number of cysteines: reduction and S-pyridylethylation.
  • the number of cysteine residues was determined on the native peptide by reduction and S-pyridylethylation. 1 nanomole of native peptide was reduced in 40 ⁇ l of 0.5 M Tris / HCl buffer, pH 7.5 containing 2 mM of EDTA and 6 M of guanidinium chloride in the presence of 2 ⁇ l of 2.2 M dithiothreitol The reaction medium was placed under a nitrogen atmosphere. After 60 min of incubation in the dark, 2 ⁇ l of freshly distilled 4-vinylpyridine were added to the reaction which was then incubated for 10 min at 45 ° C in the dark and under a nitrogen atmosphere.
  • the pyridylethylated peptide was then separated from the constituents of the reaction medium by reverse phase chromatography using a linear gradient of acetonitrile in the presence of 0.05% TFA. 2-3 Determination of the mass of the native peptide, of the S-pyridylethylated peptide and of the proteolysis fragments by MALDI-TOF mass spectrometry (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight).
  • the mass measurements were carried out on a MALDI-TOF mass spectrometer Bruker Biflex TM III (Bremen, Germany) in positive linear mode.
  • the mass spectra were calibrated externally with a standard mixture of peptides of known m / z, respectively 2199.5 Da, 3046.4 Da and 4890.5 Da.
  • the various products to be analyzed were deposited on a thin layer of ⁇ -cyano-4-hydroxycinnamic acid crystals obtained by rapid evaporation of a saturated solution in acetone. After drying under a slight vacuum, the samples were washed with a drop of 0.1% trifluoroacetic acid before being introduced into the mass spectrometer. 2-4 Sequencing by Edman degradation.
  • the peptide fragments were separated by reverse phase HPLC on a Narrowbore Delta-Pak TM HPIC ! 8 column (Waters Associates , 150 x 2 mm) in a linear acetonitrile gradient from 0 to 60% in 90 min in 0.05% TFA with a flow rate of 0.2 ml / min and a constant temperature of 30 ° C.
  • the fragments obtained were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry and the peptide corresponding to the C-terminal fragment was sequenced by degradation of Edman.
  • thermolysin Boehringer Manheim, thermolysin / peptide ratio, 1/2 by weight: weight
  • MES buffer N-ethylmorpholine
  • reaction was stopped by addition of formic acid and the reaction products were immediately separated by reverse phase chromatography on a Narrowbore Delta-Pak TM HPIC 18 column (Waters Associates, 150 x 2.2 mm) in a linear gradient of acetonitrile from 2 to 50% in 100 min in 0.05% TFA at a flow rate of 0.2 ml / min at 30 ° C preceded by an isocratic step at 2% acetonitrile for 10 min.
  • the fragments obtained were analyzed by MALDI-TOF mass spectrometry and sequenced by Edman degradation.
  • Example II Expression of specificin in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
  • the assembly was carried out from 6 synthetic oligonucleotides coding for the 36 amino acids of monitoringin preceded by the 5 C-terminal amino acids of the preprosequence of the factor al (Mfal) of yeast and followed by the additional peptide residue constituted by l amino acid glycine (SEQ ID NO: 3).
  • the oligonucleotides were chosen taking into account the preferential codons used by S. cerevisiae.
  • Oligonucleotides 2 to 5 were phosphorylated at their 5 'ends by the action of the polynucleotide kinase (New England Biolabs); - Oligonucleotides 1 to 6 were mixed, heated to 100 ° C and hybridized by slowly decreasing the temperature to 25 ° C for 3 hours;
  • hybrid oligonucleotides were subjected to a treatment with the ligase of bacteriophage T4 (New England Biolabs) for 15 hours at 15 ° C;
  • the Sphl-HinDIII fragment of the vector M13JM132 contains the promoter sequence of the yeast MF ⁇ 1 gene as well as the sequence encoding the pre-pro region of the factor MF ⁇ 1.
  • the synthetic toxicin gene is therefore inserted between the pre-pro sequences of factor Mf ⁇ 1 and the transcription terminator; this construction must therefore ensure the maturation and secretion of specificin.
  • Example II-3 Transformation of a strain of S. cerevisiae by the DNA of the plasmid pSEA2 and analysis of transformants.
  • the yeast strain TGY 48.1 (MATa, ura3-D5, his, pral, prbl, prcl, cpsl; Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev. 21, pp 15-24) was transformed with the plasmid p .IL193, The transformants were selected at 29 ° C. on a selective YNBG medium (0.67% yeast nitrogen base, 2% glucose), supplemented with 0.5% casamino acids and containing no uracil. After transformation, several yeast clones, selected for the ura + character, were cultured for 48 h at 29 ° C. in 50 ml of selective medium.
  • the fractions were collected manually by following the variation in absorbance at 225 nm and 254 nm.
  • the collected fractions were dried under vacuum, reconstituted with ultrapure water and analyzed for their antimicrobial activity in the conditions described in Example III.
  • Example II-4 Production of recombinant toxicin on a semi-preparative scale.
  • One of the quantitativein-expressing transformed yeast clones was cultured at 29 ° C for
  • the recombinant peptide is eluted with a solution with high ionic strength (for example 1M sodium chloride) in 25 mM ammonium carbonate buffer at pH 3.6.
  • the recombinant peptide is desalted on a Sep-Pak TM cartridge C, 8 , (Waters Associates) equilibrated with acidified water (TFA 0.05%).
  • the recombinant peptide retained on the cartridge is then eluted with an acetonitrile solution in acidified water (TFA 0.05%), a 45% solution of acetonitrile is advantageous.
  • the fraction containing the peptide is purified by analysis by HPLC on a preparative reverse phase column Aquapore RP-300 C s (Brownlee TM, 250 x 10 mm, 300 ⁇ ), using a discontinuous linear gradient of 2% acetonitrile. at 17% in 10 min and from 17 to 27% in 60 min in the 0.05% TFA with a constant flow rate of 2.5 ml / min.
  • the fractions were collected manually by following the variation in absorbance at 225 nm and 254 nm.
  • Example III In vitro activity test: measurement of the antimicrobial activity by microspectrophotometry.
  • This methodology was used for the demonstration of antimicrobial molecules during the various purification stages, for the determination of the spectrum of activity of the peptide and for the determination of the minimum inhibitory concentration (MIC) at which the peptide was active. .
  • the MIC was expressed as a concentration range [a] - [b] where [a] was the minimum concentration where growth began and [b] the concentration for which no growth was observed . Examples of the specific activity of specificin with respect to filamentous fungi, yeasts and bacteria are given in Tables 1 to 4.
  • Example III-1 Activity Detection Test Against Filamentous Fungi
  • Antifungal activity was detected by a growth inhibition test in liquid medium.
  • the spores of the fungi to be tested were suspended in a “Potato-Glucose” type culture medium.
  • a “Potato-Glucose” type culture medium Preferably, 12 g of Potato Dextrose Broth medium (Difco) is used per 1 1 of demineralized water.
  • Two antibiotics were added to the culture medium: tetracycline (final concentration of 10 ⁇ g / ml) and cefotaxime (100 ⁇ g / ml).
  • 10 ⁇ l of each fraction to be analyzed are deposited in microtitration plates in the presence of 90 ⁇ l of culture medium containing the spores (at a final concentration of 104 spores / ml).
  • the incubation was carried out in a humid chamber at 30 ° C for 48 hours.
  • the fungal growth was observed under a light microscope after 24 h and quantified after 48 hours by measuring the absorbance at 600 nm using a microtiter plate reader spectrophotometer.
  • Tricophyton mentagrophyles donation from Dr H. Koenig, Hôpital civil, France
  • Nectria haematococca Fusarium culmorum, Trichoderma viride (mycotheque of the clergy University of Leuven, Belgium)
  • Neurospora crassa Fusarium oxysporum, (mycotheque of the governing Clause, Paris).
  • Table 2 activity of proliferative fungi. The activity is here expressed as a growth percentage corresponding to 100 ⁇ (1 - absorbance with product / absorbance of the control without product), the absorbance being measured at 600 nm, 5 days after the start of the experiment.
  • Example III-2 Test for Detection of Activity Against Yeasts
  • the different yeast strains were incubated in a culture medium of the "Sabouraud" type and incubated at 30 ° C. for 24 h with slow shaking.
  • Candida albicans Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae (donation from Dr H. Koenig, Civil Hospital, France)
  • Saccharomyces cerevisiae obtained from Dr H. Koenig, Civil Hospital, France
  • Table 3 below. Table 3: Termicin activity against yeasts.
  • Example III-3 Activity Detection Test Against Bacteria
  • Antibacterial activity was detected by a growth inhibition test in liquid medium.
  • the bacteria to be tested were suspended in a nutritive medium of the "Poor Broth” or "Luria Bertani” type.
  • a 10 g / l solution of bacterotryptone using 5 g / l NaCl prepared in demineralized water for "Poor Broth” and a 10 g / l solution of bacterotryptone, 10 g / l NaCl are used.
  • Streptococcus pyogenes 25-50 Micrococcus luteus 50-100 Bacillus megaterium 50-100
  • Example III-3 show activity against Gram-positive bacteria.

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Abstract

La présente invention a pour objet de nouveaux peptides antimicrobiens de la famille des défensines, en particulier antifongiques, appelés termicines, des polynucléotides codant pour ces peptides, des vecteurs les contenant pour la transformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation dudit organisme. L'invention concerne également des organismes transformés, en particulier des levures produisant de la termicine, ou des cellules végétales et des plantes, les termicines produites par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique. L'invention concerne également l'utilisation des termicines à titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les comprenant.

Description

Peptides antimicrobiens de la famille des défensines, polynucleotides codant ces peptides, vecteurs et organismes transformés les contenant
La présente invention a pour objet de nouveaux peptides antimicrobiens de la famille des défensines, en particulier antifongiques, appelés termicines, des polynucleotides codant pour ces peptides, des vecteurs les contenant pour la transformation d'un organisme hôte et le procédé de transformation dudit organisme.
L'invention concerne également des organismes transformés, en particulier des levures produisant de la termicine, ou des cellules végétales et des plantes, les termicines produites par les plantes transformées leur conférant une résistance aux maladies, en particulier d'origine fongique.
L'invention concerne également l'utilisation des termicines a titre de médicament et les compositions pharmaceutiques les comprenant.
Dans les domaines de la santé végétale comme dans celui de la santé animale, il existe un besoin permanent d'obtention de nouvelles molécules permettant de lutter contre les infections d'origine fongique. En santé végétale, la protection des cultures contre les maladies fongiques passe essentiellement par la pulvérisation de fongicides de synthèse sur lesdites cultures. Cependant, il existe aujourd'hui un besoin grandissant de rendre les plantes résistantes contre les maladies notamment fongiques afin de diminuer, voire d'éviter, d'avoir recours à des traitements avec des produits de protection antifongiques, en vue de protéger l'environnement. Un moyen d'augmenter cette résistance aux maladies consiste à transformer les plantes de manière qu'elles produisent des substances à même d'assurer leur défense contre ces maladies.
Dans le domaine de la santé humaine et animale, il existe des infections fongiques opportunistes pour lesquelles aucun traitement réellement efficace n'est disponible à l'heure actuelle. En particulier, c'est le cas de certaines mycoses invasives graves qui touchent des patients hospitalisés dont le système immunitaire est déprimé à la suite d'une transplantation, d'une chimiothérapie ou de l'infection par le VIH. En comparaison de l'arsenal des agents antibactériens, la panoplie actuelle des agents antifongiques est très limitée. Il existe donc un besoin réel de caractériser et de développer de nouvelles classes de substances antifongiques. Le problème technique de la présente invention consiste donc à isoler de nouveaux peptides antifongiques, lesquels peptides trouveront des applications dans les domaines de la protection des cultures, ainsi que dans ceux de la santé et de la nutrition humaines et animales. On connaît chez les Invertébrés, notamment chez les Insectes, un certain nombre de substances naturellement produites par ces organismes qui leurs confèrent une protection vis-à- vis d'agents pathogènes d'origine bactérienne ou fongique. Ces substances sont généralement des peptides qui sont dits antibactériens, antifongiques ou antimicrobiens selon qu'ils ont une activité préférentielle vis-à-vis des bactéries, des champignons, ou une activité mixte vis-à-vis de ces deux types de pathogènes. Au sens de la présente invention, on entend par bactéricide ou fongicide tant les propriétés bactéricides ou fongicides proprement dites que les propriétés bactériostatiques ou fongistatiques.
Parmi les peptides d'insectes connus, on peut citer ceux décrits dans les demandes de brevets WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, et WO99/91089. La difficulté de trouver de nouveaux peptides chez les insectes relève du fait qu'il existe différentes classes de peptides que l'on ne retrouve pas chez tous les insectes, et que des peptides appartenant à une même classe peuvent posséder des propriétés différentes selon les insectes desquels ils sont isolés (Dimarcq et al., 1998, Biopolymers [Peptide science], vol.47, 465-477; Bulet et al., 1999, Dev. Comp. Immunol., vol.23, 329-344).
Au regard des difficultés évoquées ci-dessus, il ressort que l'état de la technique actuel ne permet pas de déduire une activité biologique uniquement à partir de la structure peptidique des peptides antimicrobiens connus. En conséquence, il est donc peu efficace de chercher à créer un nouveau peptide avec une activité antimicrobienne désirée en se basant sur la séquence peptidique de peptides connus. Il est également peu efficace d'utiliser la séquence nucléotidique codant pour un peptide antimicrobien décrit dans l'état de la technique comme sonde pour rechercher des séquences semblables dans des banques de cDNA issues d'autres organismes, excepté lorsque ces autres organismes font partie d'un groupe zoologique restreint, par exemple une famille, au sein duquel une faible variabilité moléculaire existe. La solution au problème technique de la présente invention se trouve donc dans l'isolement de peptides identifiés, dans un premier temps, préférentiellement par leurs propriétés antimicrobiennes plutôt que par leurs structures. Cette solution est obtenue avec la définition de tests in vitro d'inhibition de croissance de bactéries, de champignons ou de levures, lesquels tests permettent de cribler des extraits d'un grand nombre d'organismes, en particulier des insectes, pour la présence d'activités vis-à-vis d'au moins un de ces tests.
Dans la définition d'une stratégie d'isolement de nouveaux peptides, il est donc apparu important d'orienter la recherche vers des insectes vivant dans des milieux hostiles en contact avec des microorganismes pathogènes potentiels, ceci afin d'augmenter les chances de trouver des insectes dont l'arsenal de peptides est particulièrement développé, car adapté à ces milieux. En outre, afin de cibler une activité particulière, il est également possible d'orienter ce criblage vers des insectes dont on suspecte fortement, de par leurs mœurs, qu'ils posséderont des peptides ayant une activité préférentielle vis-à-vis d'un type de microorganisme. C'est cette dernière stratégie qui a été mise en œuvre dans la présente invention afin de répondre au problème technique énoncé ci-dessus. En effet, afin d'isoler de nouveaux peptides antifongiques, il a été choisi de cribler des insectes vivant en contact étroit avec des champignons.
La solution au problème technique consistant à isoler de nouveaux peptides antifongiques a donc été obtenue par l'isolement de nouveaux peptides, les termicines, isolés à partir d'insectes vivant en contact symbiotique avec un champignon, en particulier de termites champignonnistes de la famille des Macrotermitinae. Cette famille de termites vit en contact étroit avec un champignon basidiomycète symbiotique du genre Termitomyces qui lui assure une digestion efficace des matériaux lignocellulosiques. En particulier, une termicine caractéristique est isolée à partir du termite Pseudacanthotermes spiniger. De manière générale, une termicine est un peptide faisant partie de la classe des défensines d'insectes. La classe des défensines d'insectes regroupe majoritairement des peptides antibactériens et/ou antifongiques caractérisés par le fait qu'ils contiennent six cystéines reliées entre-elles par trois ponts dissulfures.
L'invention a donc pour objet de nouveaux peptides, les termicines. Comme prévu par la stratégie décrite ci-dessus, les teπnicines présentent principalement une activité fongicide, notamment contre les champignons filamenteux responsables des maladies des plantes et les champignons de la pathologie humaine et animale. Après analyse, il apparaît que les termicines possèdent également une activité vis-à-vis des levures de la pathologie humaine, ainsi que des propriétés lytiques ou statiques sur les bactéries à Gram positif. Après avoir synthétisé un gène codant une termicine, on a trouvé qu'il pouvait être inséré dans un organisme hôte, comme une levure ou une plante, afin d'exprimer ladite termicine dans ledit organisme hôte et, soit produire de la termicine purifiée ou non, soit conférer au dit organisme hôte des propriétés de résistance aux maladies fongiques, apportant une solution particulièrement avantageuse aux problèmes énoncés ci-dessus.
La présente invention concerne également des polynucleotides codant pour une termicine telle que définie ci-dessus. Selon la présente invention, on entend par " polynucléotide " une séquence nucléotidique naturelle ou artificielle pouvant être de type ADN ou ARN, de préférence de type ADN, notamment double brin.
Selon des modes particuliers de réalisation de l'invention, les polynucleotides peuvent être soit synthétisés artificiellement, soit correspondre aux polynucleotides de l'insecte duquel ils sont isolés, soit encore correspondre à des fragments dérivés de ces polynucleotides, adaptés pour l'expression de la termicine dans l'organisme hôte où ladite termicine sera exprimée. Les polynucleotides peuvent être obtenus selon les méthodes standards d'isolation et de purification, ou encore par synthèse selon les techniques usuelles d'hybridations successives d'oligonucléotides synthétiques. Ces techniques sont notamment décrites par Ausubel el al. (1987, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Greene, Publ. Wiley & Sons).
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, les polynucleotides codant pour la termicine comprennent des polynucleotides codant pour la séquence peptidique décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO:2. Il est bien connu de l'homme du métier que cette définition inclut tous les polynucleotides qui, bien que comprenant des séquences nucléotidiques différentes comme résultat de la dégénérescence du code génétique, codent pour une même séquence d'acides aminés, laquelle est représentée par l'identificateur de séquences SEQ ID NO: 2.
La présente invention comprend également des polynucleotides isolés codant pour des termicines et capables de s'hybrider de manière sélective à un des polynucleotides précédemment décrits. Par « polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective », on entend selon l'invention les polynucleotides qui, par une des méthodes usuelles de l'état de la technique (Sambrook et al., 1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. éd., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press), s'hybrident avec les polynucleotides ci-dessus à un niveau supérieur au bruit de fond de manière significative. Le bruit de fond peut être lié à l'hybridation d'autres polynucleotides présents, notamment d'autres ADNc présents dans une banque d'ADNc. Le niveau du signal généré par l'interaction entre le polynucléotide capable de s'hybrider de manière sélective et les polynucleotides définis par la séquence ID ci-dessus selon l'invention est généralement 10 fois, de préférence 100 fois plus intense que celui de l'interaction des autres séquences d'ADN générant le bruit de fond. Le niveau d'interaction peut être mesuré par exemple, par marquage de la sonde avec des éléments radioactifs, comme le 12P. L'hybridation sélective est généralement obtenue en employant des conditions de milieu très sévères (par exemple NaCl 0,03 M et citrate de sodium 0,03 M à environ 50°C-60°C). L'invention comprend également des polynucleotides isolés codant pour des termicines et homologues des polynucleotides précédemment décrits. Par « homologue », on entend selon l'invention des polynucleotides présentant une ou plusieurs modifications de séquence par rapport aux séquences nucléotidiques décrites ci-dessus et codant pour une termicine dont les propriétés ne sont pas significativement altérées. Ces modifications peuvent être obtenues selon les techniques usuelles de mutation conduisant notamment à l'addition, la délétion, ou la substitution d'un ou plusieurs nucléotides par rapport aux séquences de l'invention. De manière avantageuse, le degré d'homologie sera d'au moins 70 % par rapport aux séquences de l'invention, de préférence d'au moins 80 %, plus préférentiellement d'au moins 90 %. Les méthodes de mesure et d'identification des homologies entre les séquences d'acides nucléiques sont bien connues de l'homme du métier. On peut employer par exemple les programmes PILEUP ou BLAST (notamment Altschul et al, 1993, J. Mol. Evol. 36 :290-300 ; Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215 :403-10).
La présente invention concerne également des fragments des polynucleotides décrits ci- dessus. Le terme "fragment" désigne notamment un fragment d'au moins 20 nucléotides, en particulier d'au moins 50 nucléotides, et de préférence d'au moins 100 nucléotides.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le polynucléotide selon l'invention est représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1.
La présente invention concerne également des polynucleotides comprenant au moins un des polynucleotides tels que décrits précédemment.
Tous les polynucleotides décrits ci-dessus codent des termicine. En conséquence, l'invention s'étend donc à tous les peptides codés par l'ensemble de ces polynucleotides.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, une termicine est un peptide comprenant la séquence peptidique décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2 ou un fragment de cette séquence. Par fragment, on entend essentiellement un fragment biologiquement actif, c'est-à-dire un fragment de la séquence d'une termicine possédant la même activité antimicrobienne qu'une termicine complète.
Le résidu NH2 terminal d'une termicine peut présenter une modification post- traductionnelle, par exemple une acétylation, de même que le résidu C-terminal peut présenter une modification post-traductionnelle, par exemple une amidation.
En outre, une termicine telle que décrite dans la présente invention se distingue des défensines d'insectes de l'état de la technique par sa structure peptidique, et notamment d'une autre défensine d'insectes, l'héliomicine décrite dans la demande de brevet WO 99/53053, par la caractéristique structurale de posséder un nombre de résidus acides aminés entre les cystéines n°3 et 4 supérieur à 9. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention, les résidus cystéine d'une termicine forment au moins un pont disulfure intramoléculaire, de préférence trois ponts disulfures. Selon un mode préférentiel de réalisation de l'invention les ponts di sulfures sont établis entre les résidus cystéine 1 et 4, 2 et 5 et 3 et 6.
La présente invention concerne également un gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle, un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte, un polynucléotide codant pour une termicine tel que défini dans la présente invention, et un élément terminateur fonctionnel dans ce même organisme hôte. Les différents éléments qu'un gène chimère peut contenir sont, d'une part, des éléments régulateurs de la transcription, de la traduction et de la maturation des protéines, tels qu'un promoteur, une séquence codant pour un peptide signal ou un peptide de transit, ou un élément terminateur constituant un signal de polyadénylation, et d'autre part un polynucléotide codant pour une protéine. L'expression "liés entre eux de manière opérationnelle" signifie que lesdits éléments du gène chimère sont liés entre eux de manière à ce que le fonctionnement d'un de ces éléments est affecté par celui d'un autre. A titre d'exemple, un promoteur est lié de manière opérationnelle à une séquence codante lorsqu'il est capable d'affecter l'expression de ladite séquence codante. La construction du gène chimère selon l'invention et l'assemblage de ses différents éléments est réalisable par l'emploi de techniques bien connues de l'homme du métier, notamment celles décrites dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. éd., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press). Le choix des éléments régulateurs constituant le gène chimère est essentiellement fonction de l'espèce hôte dans laquelle ils doivent fonctionner, et l'homme du métier est capable de sélectionner des éléments régulateurs fonctionnels dans un organisme hôte donné. Par "fonctionnels", on entend capables de fonctionner dans un organisme hôte donné. Les promoteurs que peut contenir le gène chimère selon l'invention sont soit constitutifs, soit inductibles. Il apparaît également important que le gène chimère comprenne aussi un peptide signal ou un peptide de transit qui permet de contrôler et d'orienter la production de la termicine de manière spécifique dans une partie de l'organisme hôte, comme par exemple le cytoplasme, un compartiment particulier du cytoplasme, la membrane cellulaire, ou dans le cas des plantes dans un type particulier de compartiments cellulaires ou de tissus ou dans la matrice extracellulaire. Selon un mode de réalisation, le peptide de transit peut être un signal d'adressage chloroplastique ou mitochondrial, lequel est ensuite clivé dans les chloroplastes ou les mitochondries.
Selon un autre mode de réalisation de l'invention, le peptide signal peut être un signal N- terminal ou " prépeptide ", éventuellement en association avec un signal responsable de la rétention de la protéine dans le réticulum endoplasmique, ou un peptide d'adressage vacuolaire ou " propeptide ". Le réticulum endoplasmique est le compartiment cellulaire où sont mises en œuvre des opérations de maturation de la protéine produite, comme par exemple le clivage du peptide signal.
Les peptides de transit peuvent être soit simples, soit doubles. Les peptides de transit doubles sont éventuellement séparés par une séquence intermédiaire, c'est à dire qu'ils comprennent, dans le sens de la transcription, une séquence codant pour un peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, une partie de séquence de la partie mature N-terminale d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale, puis une séquence codant pour un second peptide de transit d'un gène végétal codant pour une enzyme à localisation plastidiale. De tels peptides de transit doubles sont par exemple décrits dans la demande de brevet EP 0 508 909.
Comme peptide signal utile selon l'invention, on peut citer en particulier le peptide signal du gène PR-l du tabac décrit par Cornelissen et al. (1987, Nucleic Acid Res. 15, 6799-681 1 ) en particulier lorsque le gène chimère selon l'invention est introduit dans des cellules végétales ou des plantes, ou le peptide signal du précurseur du facteur Mat αl (Brake et al., 1985, In: Gething M.-J. (eds.); Protein transport and sécrétion, pp.103-108, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York) lorsque le gène chimère selon l'invention est introduit dans des levures.
La présente invention concerne également un vecteur contenant un gène chimère selon l'invention. Le vecteur selon l'invention est utile pour transformer un organisme hôte et exprimer dans celui-ci une termicine. Ce vecteur peut être un plasmide, un cosmide, un bactériophage ou un virus. De manière générale, les principales qualités de ce vecteur doivent être une capacité à se maintenir et à s'autorépliquer dans les cellules de l'organisme hôte, notamment grâce à la présence d'une origine de réplication, et à y exprimer une termicine. Le choix d'un tel vecteur ainsi que les techniques d'insertion dans celui-ci du gène chimère selon l'invention sont largement décrits dans Sambrook et al. (1989, Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Nolan C. éd., New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press) et font partie des connaissances générales de l'homme du métier. De manière avantageuse, le vecteur utilisé dans la présente invention contient également, en plus du gène chimère de l'invention, un gène chimère contenant un marqueur de sélection. Ce marqueur de sélection permet de sélectionner les organismes hôtes effectivement transformés, c'est-à-dire ceux ayant incorporé le vecteur. Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, l'organisme hôte à transformer est une plante. Selon un autre mode de réalisation, l'organisme hôte est un microorganisme, en particulier une levure. Parmi les marqueurs de sélection utilisables, on peut citer des marqueur contenant des gènes de résistance aux antibiotiques tel que, par exemple, celui du gène de l'hygromycine phosphotransférase (Gritz et al., 1983, Gène 25:179-188), mais également des marqueurs contenant des gènes de tolérance aux herbicides tel que le gène bar (White et al, NAR 18:1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le gène EPSPS (US 5,188,642) pour la tolérance au glyphosate ou encore le gène HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer des gènes codant pour des enzymes facilement identifiables comme l'enzyme GUS, des gènes codant pour des pigments ou des enzymes régulant la production de pigments dans les cellules transformées. De tels gènes marqueurs de sélection sont notamment décrits dans les demandes de brevet WO 91/02071, WO 95/06128, WO 96/38567, et WO 97/04103.
La présente invention concerne également des organismes hôte transformés, contenant un vecteur tel que décrit ci-dessus. Par organisme hôte, on entend tout organisme mono ou pluricellulaire, inférieur ou supérieur, dans lequel le gène chimère selon l'invention peut être introduit, pour la production de termicine. Il s'agit en particulier de bactéries, par exemple E. coli, de levures, en particulier des genres Saccharomyces, Kluyveromyces, ou Pichia, de champignons, en particulier Aspergillus, d'un baculovirus, ou de préférence de cellules végétales et de plantes.
Par "cellule végétale", on entend selon l'invention toute cellule issue d'une plante et pouvant constituer des tissus indifférenciés tels que des cals, des tissus différenciés tels que des embryons, des parties de plantes, des plantes ou des semences.
On entend par "plante" selon l'invention, tout organisme multicellulaire différencié capable de photosynthèse, en particulier monocotylédones ou dicotylédones, plus particulièrement des plantes de culture destinées ou non à l'alimentation animale ou humaine, comme le maïs, le blé, le colza, le soja, le riz, la canne à sucre, la betterave, le tabac, le coton.
On entend par "organisme hôte transformé", un organisme hôte qui a incorporé dans son génome le gène chimère de l'invention, et produit en conséquence une termicine dans ses tissus, ou dans un milieu de culture. Pour obtenir les organismes hôtes selon l'invention, l'homme du métier peut utiliser une des nombreuses méthodes de transformation connues.
Une de ces méthodes consiste à mettre les cellules à transformer en présence de polyéthylène glycol (PEG) et des vecteurs de l'invention (Chang and Cohen, 1979, Mol. Gen. Genêt. 168(1), 111-115; Mercenier and Chassy, 1988, Biochimie 70(4), 503-517). L'électroporation est une autre méthode qui consiste à soumettre les cellules ou tissus à transformer et les vecteurs de l'invention à un champ électrique (Andreason and Evans, 1988, Biotechniques 6(7), 650-660; Shigekawa and Dower, 1989, Aust. J. Biotechnol. 3(1), 56-62). Une autre méthode consiste à directement injecter les vecteurs dans les cellules ou les tissus hôtes par micro-injection (Gordon and Ruddle, 1985, Gène 33(2), 121-136). De manière avantageuse, la méthode dite de "biolistique" pourra être utilisée. Elle consiste à bombarder des cellules ou des tissus avec des particules sur lesquelles sont adsorbés les vecteurs de l'invention (Bruce et al.. 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86(24), 9692-9696; Klein et al., 1992, Biotechnology 10(3). 286-291; US Patent No. 4,945,050). De manière préférentielle, la transformation de plantes se fera à l'aide de bactéries du genre Agrobacterium, de préférence par infection des cellules ou tissus desdites plantes par A. tumefaciens (Knopf, 1979, Subcell. Biochem. 6, 143-173; Shaw et al., 1983, Gène 23(3):315-330) ou A. rhizogenes (Bevan et Chilton, 1982, Annu. Rev. Genêt. 16:357-384; Tepfer and Casse-Delbart, 1987, Microbiol. Sci. 4(1), 24-28). De manière préférentielle, la transformation de cellules végétales par Agrobacterium tumefaciens est réalisée selon le protocole décrit par Ishida et al. (1996, Nat. Biotechnol. 14(6), 745-750).
L'homme du métier fera le choix de la méthode appropriée en fonction de la nature de l'organisme hôte à transformer.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, la présente invention concerne donc également des microorganismes transformés contenant un gène chimère selon l'invention, et exprimant la termicine. La transformation de microorganismes permet de produire de la termicine à échelle semi-industrielle ou industrielle. Le microorganisme à transformer peut être une levure, un champignon, une bactérie, ou un virus. Selon le microorganisme à transformer, l'homme du métier saura sélectionner les éléments régulateurs du gène chimère permettant d'optimiser la production de termicine. Ces éléments régulateurs sont notamment des séquences promotrices, des activateurs de transcription, des peptides signal ou de transit, des séquences terminatrices et des codons start et stop.
De manière préférentielle, l'organisme hôte transformé est une levure. A titre d'exemple, la transformation d'une levure peut être réalisée avec un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant la termicine et les éléments suivants :
- des marqueurs permettant de sélectionner les transformants. De préférence, on utilise le gène ura-3 pour la levure et le gène qui confère la résistance à Pampicilline pour E. coli,
- une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du plasmide dans la levure. De préférence on utilise l'origine de réplication du plasmide 2μ de levure,
- une séquence nucléique permettant la réplication (origine de réplication) du plasmide dans E. coli, - un gène chimère selon l'invention constitué
(1) d'une séquence de régulation promotrice. On peut utiliser toute séquence promotrice d'un gène s'exprimant naturellement dans la levure. De préférence, on utilise le promoteur du gène Mfαl de S. cerevisiae tel que décrit dans Betz et al. (1987, J. Biol. Chem., 262, 546-548) ou Reichhart et al. (1992, Invert. Reprod. Dev., 21, 15-24), (2) d'une séquence codant pour un peptide signal (ou prépeptide) en association avec un peptide d'adressage (ou propeptide). Ces régions sont importantes pour la sécrétion correcte du peptide. De préférence, on utilise la séquence codant le pré-pro-peptide du précurseur du facteur MFαl tel que décrit dans Betz et al. (1987, J. Biol. Chem., 262, 546-548) ou Reichhart ét al. (1992, Invert. Reprod. Dev., 21, 15-24), (3) d'un polynucléotide selon l'invention
(4) d'une séquence de régulation terminatrice ou de polyadénylation, De préférence, on utilise le terminateur de la phosphoglycérate kinase (PGK) de S. cerevisiae. Dans la cassette d'expression, la séquence codant la termicine est insérée en aval de la séquence pré- pro et en amont du terminateur de la PGK. Ces éléments ont été décrits dans plusieurs publications dont Reichhart et al. (1992,
Invert. Reprod. Dev., 21, pp 15-24), Michaut et al. (1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10) et Lamberty et al. (1999, JBC, 274, pp. 9320-9326). De manière préférentielle, on transforme des levures de l'espèce 5. cerevisiae avec le vecteur d'expression par la méthode à l'acétate de lithium (Ito et al., 1993, J. Bacteriol, 153, pp
163-168). Les levures transformées sont sélectionnées sur un milieu gélose sélectif qui ne contient pas d'uracile. La production en masse des levures transformées est réalisée par culture pendant 24 h à 48 h dans un milieu liquide sélectif.
La présente invention concerne donc également un procédé de préparation de la termicine, comprenant les étapes de culture d'un microorganisme transformé comprenant un gène codant pour la termicine tel que défini ci-dessus dans un milieu de culture approprié, puis l'extraction et la purification totale ou partielle de la termicine obtenue. De manière préférentielle, le microorganisme producteur de termicine utilisé est une levure transformée comprenant un gène chimère selon l'invention.
De manière préférée, lors de l'extraction de la termicine produite par les levures, on élimine les levures par centrifugation et on met en contact le surnageant de culture avec une solution acide qui peut être une solution d'un acide minéral ou organique comme par exemple l'acide chlorhydrique ou de l'acide acétique. L'extrait obtenu est ensuite centrifugé à froid à une vitesse de 4000 à 10.000 rpm à 4°C, pendant 30 à 60 min.
La purification de la termicine peut être précédée d'une étape de fractionnement du surnageant obtenu suite à l'étape d'extraction. De manière préférée, au cours de l'étape de f actionnement, l'extrait est déposé sur de la phase inverse pour réaliser une extraction en phase solide. Le lavage des molécules solubles dans l'eau est effectué avec une solution acide diluée et l'élution des molécules hydrophobes avec un éluant approprié. De manière préférentielle, on utilise l'acide trifluoroacétique pour le lavage et un éluant contenant des quantités croissantes d'acétonitrile en solution acide diluée.
De manière avantageuse une seconde étape d'extraction en phase solide est réalisée et préférentiellement sur de la phase échangeuse d'ions. Le lavage des molécules non retenues est effectué dans un tampon salin à pH acide et l'élution des molécules cationiques réalisée par une solution à concentration croissante en sels. La qualité requise pour une bonne fixation des molécules est obtenue avec un tampon acétate d'ammonium à une concentration inférieure à 100 μM. De manière préférentielle, on utilise un éluant contenant un agent chaotropique salin en solution tamponné.
De manière préférée la purification de la termicine est effectuée en une étape HPLC en phase inverse avec un éluant convenable qui peut être différent ou identique à celui de la phase inverse précédente. Les différentes étapes de la purification sont suivies par un test d'inhibition de croissance fongique et bactérienne en milieu liquide. De préférence, les tests sont effectués avec le champignon Neurospora crassa , et la bactérie Micrococcus luteus.
La séquence de la termicine produite par les levures transformées est analysée selon la méthode de séquençage par dégradation d'Edman et par spectrométrie de masse. La caractérisation structurale est réalisée directement sur le peptide produit, sur le peptide modifié par réduction/alkylation ainsi que sur des fragments du peptide. La séquence peptidique et la masse moléculaire de la termicine produite ainsi que la concentration minimale inhibitrice (CM1). contre le champignon filamenteux Neurospora crassa ont été comparées avec celles d'une termicine de référence, la termicine native extraite des corps entiers de Pseudacanthotermes spiniger. Les résultats montrent que les deux molécules présentent la même structure primaire à l'exception de la présence d'un acide aminé supplémentaire C-terminal dans la molécule recombinante, à savoir un reste peptidique constitué d'un acide aminé de préférence la glycine (Gly) pour remplacer l'amidation C-terminale du reste peptidique représenté par l'acide aminé C- terminal a idé de la molécule naturelle à savoir le reste peptidique constitué de l'acide aminé - Arg-amide. La détermination de la position des ponts disulfure indique que l'arrangement des ponts disulfures est identique dans les deux peptides, natif et produit par le microorganisme transformé.
L'invention concerne également des plantes transformées contenant un gène chimère selon l'invention et exprimant dans leurs tissus une termicine selon l'invention, ladite termicine conférant à ces plantes une résistance vis-à-vis d'organismes pathogènes. Le gène chimère utilisé pour obtenir des plantes transformées selon l'invention peut contenir un promoteur constitutif ou un promoteur inductible. Comme promoteur, on peut utiliser tout promoteur d'un gène s'exprimant naturellement dans les plantes en particulier un promoteur d'origine bactérienne, virale ou végétale. Parmi les promoteurs constitutifs qui peuvent être utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple, des promoteurs bactériens, comme celui du gène de l'octopine synthase ou celui du gène de la nopaline synthase, des promoteurs viraux, comme celui du gène contrôlant la transcription des ARN19S ou 35S du virus de la mosaïque du Choux-Fleur (Odell et al., 1985, Nature, 313, 810-812), ou les promoteurs du virus de la mosaïque de la nervure du Manioc (tels que décrits dans la demande de brevet WO 97/48819). Parmi les promoteurs d'origine végétale on citera le promoteur du gène de la petite sous-unité de ribulose-biscarboxylase/oxygénase (RuBisCO), le promoteur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 507 698, ou le promoteur d'un gène d'actine de riz (US 5,641,876). On peut également citer l'élément régulateur défini par l'association fonctionnelle d'un promoteur de gène d'histone associé à un intron de gène d'actine tel que décrit dans la demande de brevet WO 99/34005.
Selon un autre mode particulier de réalisation de l'invention, le gène chimère contient un promoteur inductible. Un promoteur inductible est un promoteur qui ne fonctionne, c'est-à-dire qui n'induit l'expression d'une séquence codante, que lorsqu'il est lui-même induit par un agent inducteur. Cet agent inducteur est en général une substance qui peut être synthétisée dans l'organisme hôte suite à un stimulus externe audit organisme, ce stimulus externe pouvant être par exemple un agent pathogène. L'agent inducteur peut également être une substance externe à cet organisme hôte capable de pénétrer à l'intérieur de celui-ci. De manière avantageuse, le promoteur utilisé dans la présente invention est inductible suite à l'agression de l'organisme hôte par un agent pathogène. De tels promoteurs sont connus, comme par exemple le promoteur du gène d'O-méthyltransférase de classe II (COMT II) de plante décrit dans la demande de brevet FR 99 03700, le promoteur PR-1 dArabidopsis (Lebel et al, 1998, Plant J. 16(2):223-233), le promoteur EAS4 du gène de la sesquiterpène synthase du Tabac (Yin et al., 1997, Plant Physiol. 115(2), 437-451), ou le promoteur du gène codant la 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A reductase (Nelson et al., 1994, Plant Mol. Biol. 25(3):401-412). Selon l'invention, le gène chimère peut également contenir en association avec la séquence de régulation promotrice, d'autres séquences de régulation, qui sont situées entre le promoteur et la séquence codante, telles que des activateurs de transcription ("enhancer"), comme par exemple l'activateur de translation du virus de la mosaïque du tabac (TMV) décrit dans la demande WO 87/07644, ou du virus etch du tabac (TEV) décrit par Carrington and Freed (1990, J. Virol. 64, 1590-1597). Il peut également contenir un peptide signal ou un peptide de transit tel que décrit précédemment.
Parmi les éléments terminateurs pouvant être utilisés dans le gène chimère de la présente invention, nous pouvons citer à titre d'exemple l'élément terminateur nos du gène codant la nopaline synthase d 'Agrobacterium tumefaciens (Bevan et al., 1983, Nucleic Acids Res. 1 1(2), 369-385), ou l'élément terminateur d'un gène d'histone tel que décrit dans la demande EP 0 633 317.
Pour les procédés de transformation des cellules végétales et de régénération des plantes, on citera notamment les brevets et demandes de brevets suivants: US 4,459,355, US 4,536,475, US 5,464,763, US 5,177,010, US 5,187,073, EP 267,159, EP 604 662, EP 672 752, US 4,945,050, US 5,036,006, US 5,100,792, US 5,371,014, US 5,478,744, US 5,179,022, US 5,565,346, US 5,484,956, US 5,508,468, US 5,538,877, US 5,554,798, US 5,489,520, US 5,510,318, US 5,204,253, US 5,405,765, EP 442 174, EP 486 233, EP 486 234, EP 539 563, EP 674 725, WO 91/02071 et WO 95/06128.
Selon la présente invention, le gène chimère peut également être associé à un marqueur de sélection adapté à l'organisme hôte transformé. De tels marqueurs de sélection sont bien connus de l'homme du métier. Il pourra s'agir d'un gène de résistance aux antibiotiques, ou encore d'un gène de tolérance aux herbicides pour les plantes. De tels gènes de tolérance aux herbicides sont bien connus de l'homme du métier et notamment décrits dans les demandes de brevet EP 115 673, WO 87/04181, EP 337 899, WO 96/38567 ou WO 97/04103.
Les plantes transformées selon l'invention incluent également les plantes transformées issues de la culture et/ou du croisement des plantes régénérées ci-dessus, ainsi que les graines de plantes transformées.
Les plantes ainsi transformées sont résistantes à certaines maladies, en particulier à certaines maladies fongiques ou bactériennes, de préférence à des maladies fongiques telles que celles causées, par exemple, par un champignon du genre Cercospora, en particulier Cercospora fijensis, du genre Septoria en particulier Septoria nodorum ou Septoria tritici, du genre Fusarium, en particulier Fusarium nivale ou Fusarium graminearum, du genre Botrylis, en particulier Botrytis cinerea, ou du genre Rhizoctonia, en particulier Rhizoctonia solani.
Bien entendu, les cellules et plantes transformées selon l'invention peuvent comprendre, en plus d'un gène chimère selon l'invention, au moins un autre gène chimère contenant un polynucléotide codant pour une protéine d'intérêt. Parmi les polynucleotides codant pour une protéine d'intérêt, on peut citer des polynucleotides codant une enzyme de résistance à un herbicide, par exemple le polynucléotide codant pour l'enzyme bar (White et al., NAR 18: 1062, 1990) pour la tolérance au bialaphos, le polynucléotide codant pour l'enzyme EPSPS (US 5,188,642; WO 97/04103) pour la tolérance au glyphosate ou encore le polynucléotide codant pour l'enzyme HPPD (WO 96/38567) pour la tolérance aux isoxazoles. On peut également citer un polynucléotide codant pour une toxine insecticide, par exemple un polynucléotide codant pour une toxine de la bactérie Bacillus thuringiensis (pour exemple, voir International Patent Application WO 98/40490). Peuvent également être contenus dans ces plantes d'autres polynucleotides de résistance aux maladies, par exemple un polynucléotide codant pour l'enzyme oxalate oxydase tel que décrit dans la demande de brevet EP 0 531 498 ou le brevet US 5,866,778, ou un polynucléotide codant pour un autre peptide antibactérien et/ou antifongique tels que ceux décrits dans les demandes de brevets WO 97/30082, WO 99/24594, WO 99/02717, WO 99/53053, et WO99/91089. On peut également citer des polynucleotides codant pour des caractères agronomiques de la plante, en particulier un polynucléotide codant pour une enzyme delta-6 désaturase tel que décrit dans les brevets US 5,552,306, US 5,614,313, et demandes de brevets WO 98/46763 et WO 98/46764, ou un polynucléotide codant pour une enzyme serine acétyltransférase (SAT) tel que décrit dans les demandes de brevets WO 00/01833 et PCT/FR 99/03179.
Les autres séquences peuvent être intégrées au moyen du même vecteur comprenant un gène chimère, lequel comprend une première séquence codant pour la termicine et au moins une autre séquence codant pour un autre peptide ou protéine d'intérêt.
Elles peuvent également être intégrées au moyen d'un autre vecteur comprenant au moins la dite autre séquence, selon les techniques usuelles définies ci-dessus.
Les plantes selon l'invention peuvent encore être obtenues par croisement de parents, l'un portant le gène selon l'invention codant pour la termicine, l'autre portant un gène codant pour au moins un autre peptide ou protéine d'intérêt.
La présente invention concerne également un procédé de culture des plantes transformées selon l'invention, le procédé consistant à planter les graines des dites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture des dites plantes, à appliquer sur la dite surface du dit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle les dites graines ou les dites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
Par composition agrochimique, on entend selon l'invention toute composition agrochimique comprenant au moins un produit actif ayant l'une des activités suivantes, herbicide, fongicide, bactéricide, virucide ou insecticide.
Selon un mode préférentiel de réalisation du procédé de culture selon l'invention, la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide, plus préférentiellement présentant une activité complémentaire de celle de la termicine produite par les plantes transformées selon l'invention.
Par produit présentant une activité complémentaire de celle de la termicine, on entend selon l'invention un produit présentant un spectre d'activité complémentaire, c'est à dire un produit qui sera actif contre des attaques de contaminants (champignons, bactéries ou virus) insensibles à la termicine, ou encore un produit dont le spectre d'activité recouvre celui de la termicine, totalement ou en partie, et dont la dose d'application sera diminuée de manière substantielle du fait de la présence de la termicine produite par la plante transformée.
La termicine est un peptide particulièrement actif contre les champignons et les levures et certaines bactéries, et peut être a ce titre employé a titre préventif ou curatif pour protéger différents organismes contre des agressions fongiques et/ou bactériennes. La présente invention concerne donc également la termicine a titre de médicament. Elle concerne également l'utilisation de la termicine pour le traitement des plantes contre des agressions fongiques et/ou bactériennes, en appliquant la termicine directement sur lesdites plantes.
La présente invention concerne également une composition comprenant une termicine selon l'invention et un véhicule approprié. Le véhicule approprié a pour première qualité de ne pas dégrader de manière substantielle la termicine dans la composition, et de ne pas diminuer les propriétés bactéricides et fongicides de la termicine. Par véhicule, on entend toute substance qui est ajoutée à la termicine dans la présente composition afin de favoriser essentiellement le transport et la protection de ladite termicine. Cette composition peut être une composition cosmétique et dans ce cas le véhicule approprié est cosmétiquement acceptable, adapté en outre pour une application sur la peau ou les phanères. La composition peut également être une composition pharmaceutique pour un usage thérapeutique en santé humaine ou animale, et dans ce cas le véhicule approprié est pharmaceutiquement acceptable, approprié pour une administration de la termicine par voie topique, per os ou par injection. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition peut être une composition agrochimique et dans ce cas le véhicule approprié est agrochimiquement acceptable, approprié pour une application sur les plantes ou a proximité des plantes, sans les dégrader. Selon un autre mode de réalisation de l'invention, la composition peut être une composition alimentaire pour l'alimentation animale ou humaine, et dans ce cas le véhicule approprié est alimentairement acceptable, c'est-à-dire compatible avec une assimilation de la composition par ingestion. Les exemples ci-après permettent d'illustrer la présente invention, sans toutefois en limiter la portée.
Exemple I : Isolement et caractérisation de la termicine à partir de corps entiers ou de cellules sanguines d'imagos (maies ou femelles) naifs ou immunisés de l'isoptère
Pseudacanthotermes spiniger
Exemple 1.1 : Isolement de la termicine
1-1 Induction de la synthèse biologique d'une substance antifongique dans l'hémolymphe de Pseudacanthotermes spiniger Les imagos de l'isoptère champignoniste Pseudacanthotermes spiniger ont été immunisés à l'aide d'une injection de 2 μl d'un mélange de 2500 cellules de Micrococcus luteus (Gram- positive) et de 2500 cellules d'Escherichia coli 1106 (Gram-negative) préparées à partir de cultures réalisées en milieu de Luria-Bertani durant 12 heures à 37°C. Les animaux ainsi infectés ont été pendant 24 h dans une chambre humide contenant du terreau et maintenue à 25°C. Les animaux sont sacrifiés par congélation et conservés jusqu'à utilisation au congélateur. 1-2 Préparation de l'extrait
Les termites (corps entiers) sont réduits en une fine poudre dans un mortier en présence constante d'azote liquide. Un extrait peut être réalisé aussi bien sur des animaux mâles que femelles, naïfs ou immunisés. Un extrait à partir de cellules sanguines ou de glandes salivaires est également possible.
1-3 Acidification de l'extrait
Après réchauffement lent de la poudre obtenue, une solution d'acide trifluoroacétique à 0,1% est ajouté lentement afin d'obtenir un pH de l'extrait proche de 3. La solution qui permet la réalisation de l'extrait contient outre de l'acide trifluoroacétique, un inhibiteur de protéases (aprotinine à une concentration finale de 10 μg/ml) et un inhibiteur de la mélanisation (phénylthiourée à 20 μM). L'extraction en condition acide du peptide a été réalisée pendant 30 min sous agitation légère dans un bain d'eau glacée. L'extrait obtenu a été ensuite centrifugé à 6°C pendant 30 min à 14000g. 1-4 Purification des peptides a) Prépurification par extraction en phase solide Une quantité d'extrait équivalente à 200 individus a été déposée sur un support de phase inverse, tel que commercialisé sous la forme de cartouche (Sep-Pak™ C18, Waters Associates), équilibré avec de l'eau acidifiée (TFA 0,05 %). Les molécules hydrophiles ont été éliminées par un simple lavage avec de l'eau acidifiée. L'élution du peptide a été réalisée par une solution d'acétonitrile à 40% préparée dans le TFA 0,05%. La fraction éluée à 40% d'acétonitrile a été séchée sous vide dans le but d'éliminer l'acétonitrile et le TFA puis elle a été reconstituée dans de l'eau ultrapure stérile avant d'être soumise à la première étape de purification. Il est également possible de réaliser l'élution du peptide avec des concentrations d'acétonitrile en milieu acidifié comprises entre 20% et 100%. b) Purification par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) sur colonne de phase inverse et colonne d'exclusion de taille.
-première étape : la fraction contenant le peptide a été analysée par chromatographie de phase inverse sur une colonne semi-préparative Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 7 mm, 300 À), l'élution a été réalisée par un gradient linéaire d'acétonitrile de 2 à 60% dans le TFA 0,05% pendant 120 minutes à un débit constant de l,3ml/min. Les fractions ont été collectées manuellement en suivant la variation de l'absorbance à 214 nm et 225 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure et analysées pour leur activité antimicrobienne en utilisant les tests décrits ci-dessous.
- seconde étape : la fraction antimicrobienne correspondant au peptide a été analysée sur deux colonnes d'exclusion de taille montées en séries (Ultraspherogel SEC 3000 et SEC 2000, 7.5 x 300 mm, Beckman™) et protégées par une pré-colonne (Ultraspherogel SEC, 7.5 x 40 mm, Beckman™). L'élution est réalisée en conditions isocratiques par 30% d'acétonitrile en présence de TFA 0,05% au débit de 0,4 ml/min. Les fractions sont récoltées en fonction de la variation de densité optique mesurée à 225 et 214 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure et analysées pour leur activité antimicrobienne en utilisant les tests décrits ci-dessous.
- troisième étape : la fraction antimicrobienne correspondant au peptide a été analysée sur la même colonne en phase inverse que pour l'étape initiale, en utilisant comme conditions d'élution un gradient linéaire discontinu d'acétonitrile en eau acidifiée (TFA 0,05%) de 2-15% en 10 min et de 15-45% en 120 min. Les fractions sont recueillies et analysées pour leur activité antimicrobiennes comme précédemment.
- quatrième étape : la fraction antimicrobienne est analysée sur une colonne analytique de phase inverse Aquapore OD-300 (220 x 4.6 mm, Brownlee™) et l'élution du composé d'intérêt réalisée par un gradient linéaire biphasique d'acétonitrile en eau acidifiée de 2-15% en 10 min suivit par un gradient de 22-32% en 50 min au débit de 0,8 ml/min et à une température contrôlée de 30°C.
- dernière étape de purification : la dernière étape de purification est effectuée sur une colonne de phase inverse à faible diamètre interne dite "narrow bore" (Delta Pak HPIC18, 2 x 150 mm, Waters™) à une température contrôlée à 30°C au débit de 0,2 ml/min. Le gradient utilisé pour effectuer cette dernière étape de purification est un gradient linéaire diphasique d'acétonitrile en milieu acide (TFA 0,05%) de 2-17% en 10 min et de 17-27% en 40 min. Les conditions de fractionnement ainsi que de détermination de l'activité antimicrobienne sont celles décrites pour les étapes antérieures (étapes 1 à 4, ci dessus).
Exemple 1.2 : caractérisation structurale de la termicine
2-1 Vérification de la pureté par électrophorèse capillaire de zone
La pureté du peptide antifongique a été vérifiée par électrophorèse capillaire de zone sur un modèle 270-HT (PEApplied Biosystems division de Perkin Elmer). 1 ni d'une solution à 50μM de peptide purifié a été injecté sous assistance par le vide dans un capillaire de silice (72 cm x 50 μm) et l'analyse a été réalisée en tampon citrate 20 mM à pH 2,5. L'électrophorèse a été réalisée à 20 kV de l'anode à la cathode pendant 20 min à 30°C. La migration a été enregistrée à 200 nm. 2-2 Détermination du nombre des cystéines : réduction et S-pyridyléthylation. Le nombre de résidus cystéine a été déterminé sur le peptide natif par réduction et S- pyridyléthylation. 1 nanomole de peptide natif ont été réduites dans 40 μl de tampon Tris/HCl 0,5 M, pH 7,5 contenant 2 mM d'EDTA et 6 M de chlorure de guanidinium en présence de 2 μl de dithiothréitol 2,2 M. Le milieu réactionnel a été placé sous atmosphère d'azote. Après 60 min d'incubation à l'obscurité, 2 μl de 4-vinylpyridine fraîchement distillée ont été ajoutés à la réaction qui a été alors incubée durant 10 min à 45°C à l'obscurité et sous atmosphère d'azote. Le peptide pyridyléthylé a été ensuite séparé des constituants du milieu réactionnel par chromatographie de phase inverse en utilisant un gradient linéaire d'acétonitrile en présence de TFA 0,05%. 2-3 Détermination de la masse du peptide natif, du peptide S-pyridyléthylé et des fragments de proteolyse par spectrométrie de masse MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight).
Les mesures de masses ont été effectuées sur un spectromètre de masse MALDI-TOF Bruker Biflex™ III (Bremen, Allemagne) en mode linéaire positif. Les spectres de masse ont été calibrés de façon externe avec un mélange standard de peptides de m/z connus, respectivement 2199.5 Da, 3046.4 Da et 4890.5 Da. Les différents produits à analyser ont été déposés sur une fine couche de cristaux d'acide α-cyano-4-hydroxycinnamique obtenue par une évaporation rapide d'une solution saturée dans l'acétone. Après séchage sous un léger vide, les échantillons ont été lavés par une goutte d'acide trifluoroacétique à 0,1% avant d'être introduits dans le spectromètre de masse. 2-4 Séquençage par dégradation d'Edman.
Le séquençage automatique par dégradation d'Edman du peptide natif, du peptide S- pyridyléthylé et des différents fragments obtenus après les différents clivages protéolytiques et la détection des dérivés phénylthiohydantoines ont été réalisés sur un séquenceur ABI473A ( EApplied Biosy stems division de Perkin Helmer). 2-5 Clivages protéolytiques.
- Confirmation de la séquence peptidique dans la région C-terminale. 600 pmoles de peptide réduit et S-pyridyléthylé ont été incubées en présence d'endoprotéinase-Arg-C à un ratio de 1 :50 en poids:poids (clivage spécifique des résidus arginine du côté C-terminal, Takara, Otsu) selon les conditions préconisées par le fournisseur (Tris HC1 10 mM pH 8 en présence de Tween 20 à 0,01%). L'incubation est réalisée durant 16 h à 37£°C. Après arrêt de la réaction avec du TFA 0 ;05% ou toute autre solution acide inférieure à 3% final, les fragments peptidiques ont été séparés par HPLC en phase inverse sur une colonne de type Narrowbore Delta-Pak™ HPIC!8 (Waters Associates, 150 x 2 mm) dans un gradient linéaire d'acétonitrile de 0 à 60% en 90 min dans le TFA 0,05% avec un débit de 0,2 ml/min et une température constante de 30°C. Les fragments obtenus ont été analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF et le peptide correspondant au fragment C-terminal a été séquence par dégradation d'Edman.
-Détermination de l'arrangement des ponts disulfure par proteolyse à la thermolysine.
Le peptide natif (6 μg) a été incubé durant 1 heure en présence de 3 μg de thermolysine (Boehringer Manheim, rapport thermolysine/peptide, 1/2 en poids : poids) à 37°C dans le tampon MES (N-éthylmorpholine) 0,1 M à pH 7 en présence de 2 mM de CaCl2. La réaction a été arrêtée par addition d'acide formique et les produits de la réaction ont été immédiatement séparés par chromatographie de phase inverse sur une colonne Narrowbore Delta-Pak™ HPIC18 (Waters Associates, 150 x 2,2 mm) dans un gradient linéaire d'acétonitrile de 2 à 50% en 100 min dans du TFA 0,05% au débit de 0,2 ml/min à 30°C précédée d'une étape isocratique à 2 % d'acétonitrile pendant 10 min. Les fragments obtenues ont été analysés par spectrométrie de masse MALDI-TOF et séquences par dégradation d'Edman.
Exemple II : Expression de termicine dans la levure Saccharomyces cerevisiae.
Toutes les techniques employées ci-après sont des techniques standards de laboratoire. Les protocoles détaillés de ces techniques ont été notamment décrits dans Ausubel et /.(1987, Current Protocols in Molecular Biology, eds. Greene, Publ. Wiley & Sons)
Exemple II-l Assemblage du gène synthétique
L'assemblage a été réalisé à partir de 6 oligonucléotides synthétiques codant pour les 36 acides aminés de la termicine précédés des 5 acides aminés C-terminaux de la préproséquence du facteur al (Mfal) de la levure et suivie du reste peptidique additionnel constitué par l'acide aminé glycine (SEQ ID NO:3). Les oligonucléotides ont été choisis en tenant compte des codons préférentiels utilisés par S. cerevisiae.
L'assemblage s'est déroulé en plusieurs étapes :
- les oligonucléotides 2 à 5 ont été phosphorylés à leurs extrémités 5' par action de la polynucléotide kinase (New England Biolabs) ; - les oligonucléotides 1 à 6 ont été mélangés, chauffés à 100°C et hybrides par diminution lente de la température à 25 °C pendant 3 heures ;
-les oligonucléotides hybrides ont été soumis à un traitement par la ligase du bactériophage T4 (New England Biolabs) pendant 15 heures à 15° C ;
- le bloc d'ADN résultant de l'hybridation des oligonucléotides représenté sur la figure 1 , borné par les sites de restriction HinDIII et Sal I, a été inséré dans le plasmide pBluescript SK+
(Stratagène) digéré par les enzymes HinDIII et Sal I . Le mélange de ligation a ensuite été utilisé pour transformer des cellules compétentes d' E. coli DH5α. (Stratagène). Plusieurs clones ont été analysés et séquences. Un de ces clones qui présentait la séquence recherchée a été appelé pJL187. Exemple II-2 : Construction du vecteur qui permet la sécrétion de la termicine synthétisée.
Le fragment d'ADN HinDIII-SalI du vecteur pJL187, portant la séquence codant la termicine ainsi que le fragment Sphl-HinDIII du vecteur M13JM132 (Michaut et al, 1985, FEBS Letters, 395, pp 6-10, Lamberty et al, 1999, JBC, 274,pp. 9320-9326) ont été insérés entre les sites SphI et Sali du plasmide pTG4812 (Michaut et al, 1996, FEBS Letters, 395, pp 6-10, Lamberty et al, 1999, JBC, 274,pp. 9320-9326). Le fragment Sphl-HinDIII du vecteur M13JM132 contient la séquence du promoteur du gène MFαl de la levure ainsi que la séquence codant la région pré-pro du facteur MFαl. Dans le plasmide résultant, pJL193, le gène synthétique de la termicine se retrouve donc inséré entre les séquences pré-pro du facteur Mfα 1 et le terminateur de transcription; cette construction doit donc assurer la maturation et la sécrétion de la termicine.
Exemple II-3 : Transformation d'une souche de S. cerevisiae par l'ADN du plasmide pSEA2 et analyse destransformants. La souche de levure TGY 48.1 (MATa, ura3-D5, his, pral, prbl, prcl, cpsl ; Reichhart et al., 1992, Invert. Reprod. Dev. 21, pp 15-24) a été transformée par le plasmide p.IL193, Les transformants ont été sélectionnés à 29°C sur un milieu sélectif YNBG (0,67% yeast nitrogen base, 2% glucose), supplémenté avec 0,5 % de casamino acides et ne contenant pas d'uracile. Après transformation, plusieurs clones de levures, sélectionnés pour le caractère ura+, ont été mis en culture pendant 48 h à 29°C dans 50 ml de milieu sélectif.
Après centrifugation (4000 g, 30 min, 4°C), le surnageant a été acidifié jusqu'à pH 3,5 avec de l'acide acétique, avant d'être déposé sur une cartouche Sep-Pak™ C18, (Waters Associates) équilibrée avec de l'eau acidifiée (TFA 0,05 %). Les différentes protéines fixées sur la cartouche ont été éluées par des solutions de TFA 0,05% contenant des pourcentages croissants d'acétonitrile.
La fraction 45 %, présentant une activité antimicrobienne, a été concentrée sous vide et soumise à une étape de purification par analyse en HPLC sur une colonne analytique de phase inverse Aquapore RP-300 C8 (Brownlee™, 220 x 4,6 mm, 300 Â), en utilisant un gradient linéaire d'acétonitrile de 2% à 40% en 80 min et de 17 à 27% en 60 min dans le TFA 0,05% avec un débit constant de 0,8 ml/min. Les fractions ont été collectées manuellement en suivant la variation de l'absorbance à 225 nm et 254 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure et analysées pour leur activité antimicrobienne dans les conditions décrites dans l'exemple III. La caractérisation structurale du peptide a été réalisée comme décrit dans l'exemple 1.2.
Exemple II-4 : Production de termicine recombinante à l'échelle semi-préparative. Un des clones de levure transformée exprimant la termicine a été cultivé à 29°C pendant
24 h dans 100 ml de milieu sélectif. Cette préculture a ensuite été utilisée pour inoculer 4 1 de milieu sélectif et la culture a été réalisée pendant 48 h à 29 °C. Les levures ont été éliminées par centrifugation (4000 g, 30 min, 4°C). Après centrifugation (4000 g, 30 min, 4°C), le surnageant a été acidifié jusqu'à pH 3,5 avec de l'acide acétique, avant d'être déposé sur une cartouche Sep- Pak™ C,8, (Waters Associates) équilibrée avec de l'eau acidifiée (TFA 0,05 %). Les différentes protéines fixées sur la cartouche ont été éluées par des solutions de TFA 0,05% contenant des pourcentages croissants d'acétonitrile.
La fraction 45 %, présentant une activité antimicrobienne, a été concentrée sous vide et soumise à une étape de purification par extraction en phase solide sur une cartouche échangeuse de cations de type sep-Pak CM équilibrée dans 25 mM de tampon acétate d'ammonium à pH 3,6. Le peptide recombinant est élue par une solution à haute force ionique (par exemple 1M de chlorure de sodium) en tampon carbonate d'ammonium 25 mM à pH 3,6. Le peptide recombinant est désalé sur une cartouche Sep-Pak™ C,8, (Waters Associates) équilibrée avec de l'eau acidifiée (TFA 0,05 %). Le peptide recombinant retenu sur la cartouche est alors élue par une solution d'acétonitrile en eau acidifiée (TFA 0,05%), une solution à 45% d'acétonitrile est avantageuse. La fraction contenant le peptide est purifiée par-analyse en HPLC sur une colonne préparative de phase inverse Aquapore RP-300 Cs (Brownlee™, 250 x 10 mm, 300 Â), en utilisant un gradient linéaire discontinu d'acétonitrile de 2% à 17% en 10 min et de 17 à 27% en 60 min dans le TFA 0,05% avec un débit constant de 2,5 ml/min. Les fractions ont été collectées manuellement en suivant la variation de l'absorbance à 225 nm et 254 nm. Les fractions recueillies ont été asséchées sous vide, reconstituées avec de l'eau ultrapure et analysées pour leur activité antimicronienne dans les conditions décrites dans l'exemple III. La caractérisation structurale du peptide a été réalisée comme décrit dans l'exemple 1.2. Exemple III : Test d'activité in vitro : mesure de l'activité antimicrobienne par microspectrophotométrie.
Cette méthodologie a été utilisée pour la mise en évidence des molécules antimicrobiennes au cours des différentes étapes de purification, pour la détermination du spectre d'activité du peptide et pour la détermination de la concentration minimale inhibitrice (CMI) à laquelle le peptide a été actif. La CMI a été exprimée comme un intervalle de concentration [a] - [b] où [a] a été la concentration minimale où l'on observe un début de croissance et [b] la concentration pour laquelle aucune croissance n'a été observée. Des exemples de l'activité spécifique de la termicine, vis-à-vis des champignons filamenteux, des levures et des bactéries, sont donnés dans les tableaux 1 à 4.
Exemple III-l : Test de détection d'activité contre les champignons filamenteux
L'activité antifongique a été détectée par un test d'inhibition de croissance en milieu liquide. Les spores des champignons à tester ont été mises en suspension dans un milieu de culture de type " Pomme de terre-Glucose ". De préférence, on utilise 12 g de milieu Potato Dextrose Broth (Difco) pour 1 1 d'eau déminéralisée. Deux antibiotiques ont été rajoutés au milieu de culture : la tétracycline (concentration finale de 10 μg/ml) et la céfotaxime ( 100 μg/ml). On dépose 10 μl de chaque fraction à analyser dans des plaques de microtitration en présence de 90 μl de milieu de culture contenant les spores (à une concentration finale de 104 spores/ml). L'incubation a été réalisée en chambre humide à 30°C durant 48 heures. La croissance fongique a été observée au microscope photonique après 24 h et quantifiée après 48 heures par mesure de l'absorbance à 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre lecteur de plaque de microtitration.
- champignons filamenteux testés : , Tricophyton mentagrophyles (don du Dr H. Koenig, Hôpital civil, Strasbourg) ; Nectria haematococca, Fusarium culmorum, Trichoderma viride (mycothèque de l'Université Catholique de Leuven, Belgique) ; Neurospora crassa, Fusarium oxysporum, (mycothèque de la Société Clause, Paris).
Les résultats du test d'activité de la termicine contre les champignons filamenteux sont reportés dans le Tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : activité de la termicine contre les champignons filamenteux
Champignons CMI de la termicine (μM)
Neurospora crassa 0,2-0,4
Fusarium culmorum 0,2-0,4
Fusarium oxysporum 0,8-1,5
Nectria haematococca 0,05-0,1
Trichoderma viride 6-12
Tricophyton mentagrophytes 6-12
Tableau 2 : activité de la termicine contre les champignons phytopathogènes. L'activité est ici exprimée par un pourcentage de croissance correspondant à 100 x (1 - absorbance avec produit/ absorbance du témoin sans produit), l' absorbance étant mesurée à 600 nm, 5 jours après le début de l'expérience.
Les résultats du tableau 2 montrent une activité importante sur les champignons phytopathogènes . Exemple III-2 : Test de détection d'activité contre les levures
Les différentes souches de levure ont été mises en incubation dans un milieu de culture de type " Sabouraud " et incubée à 30°C pendant 24 h sous agitation lente. L'échantillon à tester (10 μl) a été déposé dans des puits de plaque de microtitration dans lesquels ont été ajoutés 90 μl d'une culture diluée de levure dont la densité a été ajustée à DO 600 = 0,001. On évalue la croissance par la mesure de l'absorbance à 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre lecteur de plaque de microtitration.
-levures testées : Candida albicans, Cryptococcus neoformans, Saccharomyces cerevisiae (don du Dr H. Koenig, Hôpital civil, Strasbourg) Les résultats du test d'activité de la termicine contre les levures sont reportés dans le
Tableau 3 ci-dessous. Tableau 3: activité de la termicine contre les levures.
Levures CMI de la termicine (μM)
Candida albicans 6-12 Cryptococcus neoformans 6-12 Saccharomyces cerevisiae 6-12
Les résultats des exemples III-l et III-2 montrent l'excellente activité antifongique du peptide selon l'invention.
Exemple III-3 : Test de détection d'activité contre les bactéries
L'activité antibactérienne a été détectée par un test d'inhibition de croissance en milieu liquide. Les bactéries à tester ont été mises en suspension dans un milieu nutritif de type " Poor Broth " ou " Luria Bertani ". De préférence, on utilise une solution de bactotryptone à 10 g/1 additionnée de NaCl à 5 g/1 préparée dans de l'eau déminéralisée pour le " Poor Broth " et une solution de bactotryptone à 10 g/1, NaCl 10g/l,.et extrait de levure 5 g/1 à pH 7,4 pour le milieu Luria Bertani On dépose 10 μl de chaque fraction à analyser dans des plaques de microtitration en présence de 90 μl de milieu de culture contenant les bactéries (à une concentration finale équivalente à ImDO à 600 nm). L'incubation a été réalisée à 25°C durant 12 à 24 heures. La croissance bactérienne a été mesurée en suivant l'absorbance à 600 nm à l'aide d'un spectrophotomètre lecteur de plaque de microtitration. - bactéries testées : , Bacillus megaterium eXMicrococcus luteus (collection de l'Institut Pasteur de Paris) ; Aerococcus viridans, Staphylococcus aureus et Streptococcus pyogenes (don du Pr. Monteil, Institut de bactériologie, Université Louis Pasteur de Strasbourg) pour les souches à Gram positif et Escherichia coli D22, E. coli SBS363 (don de Mr Boquet du Centre d'Etudes Nucléaires de Saclais) et Pseudomonas aeruginosa pour les gennes à Gram négatif.
Les résultats du test d'activité de la termicine contre les bactéries, lorsqu'elles se sont avérées sensibles, sont reportés dans le Tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4: activité de la termicine contre les bactéries à Gram positif
Bactéries CMI de la termicine (μM)
Streptococcus pyogenes 25-50 Micrococcus luteus 50-100 Bacillus megaterium 50-100
Les résultats de l'exemple III-3 montrent une activité contre les bactéries à Gram positif.

Claims

Revendications
1- Polynucléotide isolé codant pour une termicine
2- Polynucléotide selon la revendication 1, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide sélectionné parmi le groupe consistant en:
(a) un polynucléotide isolé codant pour le peptide décrit par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 2
(b) un polynucléotide isolé s'hybridant au polynucléotide selon (a) (c) un polynucléotide isolé homologue d'un polynucléotide selon (a) ou (b)
(d) un fragment d'un polynucléotide selon (a), (b), ou (c)
3- Polynucléotide selon la revendication 2, caractérisé en ce qu'il comprend un polynucléotide représenté par l'identificateur de séquence SEQ ID NO: 1
4- Polynucléotide isolé comprenant un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 3
5- Peptide antimicrobien de la famille des défensines, caractérisé en ce qu'il est codé par un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4
6- Peptide antimicrobien selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il comprend la séquence d'acides aminés décrite par l'identificateur de séquence SEQ ID NO:2
7- Gène chimère comprenant au moins, liés entre eux de manière opérationnelle: (a) un promoteur fonctionnel dans un organisme hôte
(b) un polynucléotide selon l'une des revendications 1 à 4
(c) un élément terminateur fonctionnel dans un organisme hôte
8- Gène chimère selon la revendication 7, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur constitutif 9- Gène chimère selon la revendication 7, caractérisé en ce que le promoteur est un promoteur inductible
10- Gène chimère selon l'une des revendications 7 à 9, caractérisé en ce qu'il comprend, en plus, un peptide signal ou un peptide de transit fonctionnel dans ledit organisme hôte
11- Gène chimère selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'organisme hôte est un microorganisme
12- Gène chimère selon la revendication 11, caractérisé en ce que le microorganisme est une levure
13- Gène chimère selon l'une des revendications 7 à 10, caractérisé en ce que l'organisme hôte est une cellule végétale ou une plante
14- Vecteur d'expression ou de transformation contenant un gène chimère selon l'une des revendications 7 à 13
15- Vecteur selon la revendication 14, caractérisé en ce qu'il est un plasmide, un phage ou un virus
16- Organisme hôte transformé avec l'un des vecteurs selon l'une des revendications 14 ou 15
17- Organisme hôte selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il s'agit d'un microorganisme
18- Organisme hôte selon la revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme est une bactérie de l'espèce Escherichia coli
19- Organisme hôte selon la revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme est une levure du genre Saccharomyces, Kluyveromyces ou Pichia 20- Organisme hôte selon la revendication 17, caractérisé en ce que le microorganisme est un baculovirus
21- Cellule végétale transformée contenant un gène chimère selon l'une des revendications
7 à 13
22- Plante transformée contenant un gène chimère selon l'une des revendications 7 à 13
23- Plante transformée selon la revendication 22, caractérisé en ce qu'elle est résistante aux maladies fongiques telles que celles causées par des champignons du genre Cercospora, en particulier Cercospora fijensis, du genre Septoria en particulier Septoroa nodorum ou Septoria tritici, du genre Fusarium, en particulier Fusarium nivale ou Fusarium graminearum, du genre Botrytis, en particulier Botrytis cinerea, ou du genre Rhizoctonia, en particulier Rhizoctonia solani.
24- Partie d'une plante selon la revendication 23
25- Graines d'une plante selon la revendication 23
26- Procédé de production d'un peptide selon l'une des revendications 5 ou 6, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de:
(a) culture d'un organisme hôte transformé selon l'une des revendications 16 à 20 ou d'une cellule végétale selon la revendication 21 dans un milieu de culture approprié, (b) extraction et purification totale ou partielle du peptide selon l'une des revendications 5 ou 6 produit au cours de l'étape (a) par l'organisme hôte transformé
27- Composition comprenant un peptide antimicrobien selon l'une des revendications 5 ou 6 et un véhicule approprié. 28- Procédé de protection des plantes vis-à-vis d'organismes phytopathogènes, caractérisé en ce que l'on exprime dans lesdites plantes une termicine selon l'une des revendications 5 ou 6 par transformation desdites avec un vecteur selon l'une des revendications 14 ou 15
29- Procédé de culture de plantes transformées selon l'une des revendications 22 ou 23, caractérisé en ce qu'il consiste à planter les graines desdites plantes transformées dans une surface d'un champ approprié pour la culture desdites plantes, à appliquer sur ladite surface dudit champ une composition agrochimique, sans affecter de manière substantielle lesdites graines ou lesdites plantes transformées, puis à récolter les plantes cultivées lorsqu'elles arrivent à la maturité souhaitée et éventuellement à séparer les graines des plantes récoltées.
30- Procédé de culture selon la revendication 29, caractérisé en ce que la composition agrochimique comprend au moins un produit actif ayant au moins une activité fongicide et/ou bactéricide.
31- Procédé de culture selon la revendication 30, caractérisé en ce que le produit actif présente une activité complémentaire de celle du peptide selon l'une des revendications 5 ou 6.
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