HU219505B - Eljárás növényből származó intracelluláris fehérjék extracelluláris térbe való irányítására és patogénellenes hatásuk fokozására - Google Patents

Abstract

A találmány tárgyát eljárások képezik növényből származóintracelluláris fehérjéknek a növény vagy a növény sejtjénekextracelluláris terébe való irányítására és növények patogénellenes,elsősorban gombaellenes hatásának fokozására a patogénellenes hatásúintracelluláris fehérje extracelluláris térbe történő irányításával.Az extracelluláris térbe történő irányítást a találmány szerintieljárással úgy érik el, hogy a fehérje intracelluláris lokalizációjátbiztosító C-terminálist kódoló nyitott leolvasási keret 3’-terminálisvégét módosítják. ŕ

Description

A találmány tárgyát eljárások képezik növényből származó intracelluláris fehéijéknek a növény vagy a növény sejtjének extracelluláris terébe való irányítására és növények patogénellenes, elsősorban gombaellenes hatásának fokozására a patogénellenes hatású intracelluláris fehérje extracelluláris térbe történő irányításával.

Gombaellenes hatású növényi fehérjék ismertek a szakirodalomból. Egy babból tisztított kitináz gátolja a Trichoderma viride növekedését [Schlumbaum et al., Natúré, 324, 365-367 (1986)].

Mauch és munkatársai leírnak egy borsókitinázt, amely agarlemez-vizsgálatban gátolja a Trichoderma viride növekedését [Plánt Physiol., 88, 936-942 (1988)]. Ennek az enzimnek azonban csak korlátozott a hatása, például az Ascomyceták rendjébe tartozó Cladosporium cucumerinum növekedésére, és nincs hatása többek között az Oomyceták rendjébe tartozó Phytophthora cactorum, Ruthium aphanidermatum és a Pythium ultimum növekedésére. Tehát ennek az enzimnek egy lényeges hátránya az, hogy korlátozott a hatástartománya. Egy hasonló vizsgálatban megállapították, hogy a p-l,3-glukanáz hasonló növekedésgátló hatással rendelkezik a Fusarium solani f. sp. pisi esetében.

Young és Pegg leírnak egy olyan preparátumot, amely hidrolitikus hatással rendelkezik a Verticillum alboatrum izolált sejtfalaira, és amely paradicsomból tisztított endo-P-l,3-glükanáz és gombából tisztított exo-p-l,3-glükanáz kombinációját tartalmazza [Physiol. Plánt Pathol., 21,411-423 (1982)]. Egyik enzim sem hat a saját gazdaszervezetére.

Bohlman és munkatársai [EMBO J., 7, 1559-1565 (1986)] számos tionint, többek között árpalevélből, kukoricából, búzából, zabból és különböző kétszikű növényből izolált tionint írnak le, amelyek jelentős gombaellenes hatással rendelkeznek az in vitro tesztekben.

Továbbá a WO 89/02744 számú közzétételi iratban leírnak olyan fehérjéket, amelyek megnövelik az antibiotikumok gombaellenes hatását. Ezeket a növényi fehéijéket általában szinergisztikus antifúngális proteinek (synergistic antifúngal proteins), rövidítve SAFPok néven emlegetik. A SAFP-okat polioxinokkal és nikkomicinekkel kombinálva alkalmazzák, amelyek önmagukban is aktívak fitopatogén gombákkal szemben; a SAFP-okkal kombinálva hatásuk 10-100-szorosára is nőhet. A SAFP-oknak önmagukban nincs gombaellenes hatásuk.

Növényekben a kitinázok és glukanázok, valamint nagyszámú, különböző, úgynevezett patogenezishez kapcsolódó (pathogenesis-related; PR-) fehérje szintéziséről ismert, hogy egy hiperszenzitív válaszként ismert jelenség kíséri, amit többek között egy inkompatibilis növényi patogén indít be. Ez a hiperszenzitivitási reakció végül abban jelentkezik, hogy a növény nagyszámú patogénnel szemben válik rezisztenssé. Hasonlóképpen, a PR-fehéijék szintézisét számos biotikus és abiotikus faktor indukálhatja, például a gombasejtfalak fragmentjei, kémiai indukálószerek, például a szalicilát és hasonlók, ami szintén a növény széles patogén rezisztenciájában nyilvánul meg. Ezt a rezisztenciát, amit vagy egy inkompatibilis patogénnel, vagy egy biotikus vagy abiotikus faktorral, illetve kémiai anyaggal lehet kiváltani, „indukált rezisztenciának” hívják. Jóllehet, sokat kell még tanulni az indukált rezisztenciáról és ezeknek a PR-fehéijéknek a szerepéről, némi osztályozást már végeztek. Dohányban úgy tűnik, hogy dohány-mozaikvírussal (TMV) való kezelés hatására legalább 5 típusú PR-fehéqe indukálódik. Ez az osztályozás olyan tulajdonságokon alapul, mint például a molekulatömeg, szerológiai kapcsolat, aminosavszekvencia homológiája, és ha ismert, akkor az enzimatikus aktivitás. Ezeken az osztályokon belül további felosztást lehet végezni, intracelluláris és extracelluláris fehérjékre, amelyek a növényi sejtben való lokalizációjuktól eltekintve megfelelnek egymásnak, az előbb említett tulajdonságok alapján [Bol. J. F. et al., Annu. Rév. Phytopathol. 28, 113-138 (1990)]. Mivel ezekről a fehérjékről az a vélemény, hogy valamilyen módon szerepet játszanak a patogén rezisztenciában, igen nagy erőfeszítéseket tettek arra, hogy a lehetséges antipatogén hatású fehérjéket azonosítsák a PR-fehéijék családjában.

A mai napig a gombaellenes hatású fehéqék szűrővizsgálatának, izolálásának és megközelítése a PRfehéijék szűrővizsgálata a már ismert tulajdonságok, például a molekulatömeg, pl (izoelektromos pont), vagy enzimaktivitás alapján. Ez különösképpen igaz a kitinázokra és a P-l,3-glükanázokra, amelyeknek a szubsztrátjai előfordulnak a legtöbb patogén és/vagy kártevő sejtfalában vagy kültakarójában.

Ennek a megközelítésnek egyik hátránya, hogy vagy nincs, vagy nagyon kicsi a korreláció az enzimaktivitás (azaz a kitináz- és glükanázaktivitás) és a gombaellenes hatás között, és emiatt gyakran fölöslegesen izolálnak fehérjéket, amelyekről azután kiderül, hogy nincs lényeges gombaellenes hatásuk. A második hátrány az, hogy gyakran még nehezebb olyan PR-fehéijéket izolálni, amelyeknek az aktivitása vagy a funkciója ismert, és a legtöbb PR-fehérje esetében erről van szó.

Ezért szükség van olyan hatékony és megbízható módszerekre és eljárásokra, amelyek segítségével a növények patogénellenes tulajdonsága felerősíthető.

Vizsgálataink során azt találtuk, hogy a találmány szerint izolált patogénellenes fehérjék patogénellenes hatása fokozható, ha a patogénellenes hatású intracelluláris fehérjét az extracelluláris térbe irányítjuk. Kimutattuk, hogy a növényből származó intracelluláris fehérje tartalmaz egy 15-20 aminosavból álló C-terminális részt, amely a fehérje intracelluláris lokalizációját biztosítja. Továbbá felismertük, hogy a C-terminálist kódoló nyitott leolvasási keret 3’-terminális végének módosításával megelőzhető, hogy a fehéije az intracelluláris térben, például vakuólában lokalizálódjon. A patogénellenes intracelluláris fehérjék elsősorban gombaellenes hatásúak, előnyösen kitinázok, p-l,3-glükanázok, osmotinszerű fehéijék és PR-fehéijék, például PR-1 fehéije.

A találmány továbbá egy génterméket tartalmazó transzformált növényi anyag előállítására és a géntermék extracelluláris térbe történő szekretálására is vonatkozik. A találmány tárgyát képezi továbbá rekombináns polinukleotid szekvenciák és vektorok alkalmazása a fenti eljárásokban.

HU 219 505 Β

Az alábbiakban ismertetjük az ábrákat.

Az 1. ábrán az AP20 és a dohányból származó osmotin II (Singh et al., 1989, supra) és az osmotin I (Singh et al., 1987, supra), valamint egy paradicsomból származó osmotin (Tosm) (King et al., 1988, supra) aminosavszekvenciáját hasonlítjuk össze.

A 2. ábrán a pMOG189 expressziós vektor sematikus ábráját láthatjuk.

A 3. ábrán a pMOG404 bináris vektort láthatjuk; LB=a T-DNS bal oldala, RB=a T-DNS jobb oldala.

A találmány szerint patogénellenes hatású fehérjét egy növényből úgy állítunk elő, hogy

1. ) egy indukált rezisztenciát mutató növényből kivonatot készítünk;

2. ) egy patogénellenes vizsgálatban meghatározzuk, hogy a kivonat tartalmaz-e patogénellenes aktivitást;

3. ) a patogénellenes aktivitást a kivonat fehéijetisztítási módszenei végzett frakcionálása és patogénellenes vizsgáló módszer alkalmazásával tisztítjuk;

4. ) a patogénellenes hatású aktivitás fehéijetermészetét igazoljuk.

A patogén szakkifejezéssel a továbbiakban bármely olyan szervezetet jelölünk, amely képes betegséget okozni, illetve egyéb módon hatni a növényre, például csökkenteni a növekedését, fejlődését, a biomasszát, az életképességet, a tápértékét, illetve a növény attraktivitását. Ilyen szervezetek közé tartoznak a fonalférgek, a gombák, a baktériumok, a vírusok és kártevők, például a rovarok.

Egy patogénellenes vizsgálatnak tartalmaznia kell egy vizsgálatot, amely megállapítja, hogy egy kivonatnak vagy egy frakciónak van-e patogénellenes hatása, oly módon, hogy az említett kivonatnak vagy frakciónak egy alikvot részét hozzáadjuk a táptalajhoz, vagy hozzáadjuk a patogén tápanyagához, amelyben vagy amelyen a patogént hagyjuk kicsírázni és/vagy fejlődni és/vagy növekedni, olyan körülmények között, amelyek megengedik a patogén csírázását és/vagy növekedését és/vagy fejlődését, és értékeljük a patogénellenes hatást, ami az említett frakció jelenlétének következménye.

A találmány szerint gombaellenes fehéijéket növényekből az alábbi lépésekből álló eljárással izolálhatunk:

1. ) a növényt egy inkompatibilis patogénnel, egy biotikus vagy abiotikus faktorral kezeljük, ami indukált rezisztenciát okoz az említett növényben;

2. ) az említett növényből egy levélkivonatot készítünk;

3. ) a levélkivonatot sómentesítjük, majd 4 °C-on inkubáljuk;

4. ) az inkubált levélkivonatot centrifugáljuk;

5. ) a 4.) lépésben kapott levélkivonat-felülúszónak egyik alikvot részében megvizsgáljuk a gombaellenes aktivitást oly módon, hogy az említett felülúszót azzal a gombával inkubáljuk, amely ellen aktivitással rendelkező fehérjét keresünk, olyan körülmények között, amelyek alkalmasak arra, hogy az említett gomba növekedjen és/vagy kicsírázzon, majd összehasonlítjuk az így inkubált gomba növekedését és/vagy csírázását egy olyan gombáéval, amelyet a gombaellenes aktivitás nélkül inkubáltunk;

6. ) az említett felülúszót frakcionáljuk egy vagy több nem denaturáló fehéijefrakcionálási módszer alkalmazásával; és

7. ) kiválasztjuk azokat a frakciókat, amelyek gombaellenes hatást mutatnak, oly módon, hogy a frakciók egy alikvot részét az 5.) lépésben a felülúszókra leírt módon megvizsgáljuk;

8. ) az említett kiválasztott frakciót tovább tisztítjuk egy vagy több nem denaturáló fehéijefrakcionáló módszer alkalmazásával;

9. ) ha szükséges, akkor megismételjük a 7.) és 8.) lépéseket addig, amíg a gombaellenes hatású fehérje lényegében mentes más fehérjéktől.

A tisztítás során a gombaellenes aktivitásnak vizsgálhatjuk a fehérjeszerű hatását oly módon, hogy melegítjük és/vagy proteázzal kezeljük, valamint hasonló módokon. Ha lehetséges, akkor a gombaellenes aktivitás elegendő tisztítása, valamint annak megállapítása után, hogy fehérjéről van-e szó, néhány fizikai paraméterét meghatározhatjuk, például a molekulatömegét, izoelektromos pontját, hidrofobocitását, enzimatikus aktivitását és hasonlókat, hogy szelektívebben megválaszthassuk a következő frakcionálási vagy tisztítási eljárást, és a legjobb tisztítási eredményt kapjuk. Az optimális fehérjetisztítási technikák (kombinációjának) megválasztása az említett fizikai paraméterek alapján bőven a fehéqetisztításban jártas szakember tudásához tartozik. Feltételezhető, hogy a használt növényi anyagtól és az éppen tisztított gombaellenes fehérétől függően az optimális körülmények megválasztásához szükség lehet némi próbálkozásra, ami nem tekinthető indokolatlan, nem megkövetelhető kísérletezésnek.

Ha egyszer a gombaellenes fehéije eléggé tiszta, akkor az aktivitásának a körét meg lehet vizsgálni más gombákra, amelyek lehetnek más növényi patogén gombák, állati vagy emberi patogén gombák, baktériumok, fonalférgek és hasonlók. Minden egyes esetben a koncentrációnak, a pH-nak és az ionerősségnek a stabilitásra és/vagy a gombaellenes hatásra nézve optimális értékét meg lehet határozni.

A módszer alkalmazható úgy, hogy az 1.) lépésben más növényi anyagot használunk, beleértve ugyanannak a növénynek más részeit, például a gyökeret, szárat és hasonlókat, valamint egy másik növényi variánst vagy fajt. Előnyösen olyan növényvonalat, -variánst vagy -fajt kell választani, amely indukált rezisztenciát mutat.

Ha a gombaellenes hatású fehéije lényegében mentes más fehéijéktől és/vagy más anyagoktól, akkor a gombaellenes fehérjének a (részleges) aminosavszekvenciáját meg lehet határozni. Az aminosavszekvenciát visszaalakítva nukleotid szekvenciává egy próbakészletet szintetizálhatunk kémiailag azoknak a cDNSeknek vagy genomiális kiónoknak az izolálása céljából, amelyek a gombaellenes fehérjét (vagy egy részét) kódolják, és amelyet elvileg fel lehet használni olyan növények előállítására, amelyek az említett gombára ke3

HU 219 505 Β vésbé érzékenyek. Ebből a célból egy nyitott leolvasási keretet, azaz egy cDNS-t vagy DNS-fragmentet, amely a gombaellenes fehérjét (vagy egy részét) kódolja, megfelelő módon összekapcsoljuk olyan elemekkel, amelyek a növényi sejtben való expresszióhoz szükségesek. Ha a gombaellenes fehérje egy intracelluláris fehérje, akkor a nyitott leolvasási keretet úgy változtatjuk meg, hogy az expresszió után a fehérje az extracelluláris térbejusson ki.

Illusztráció céljából bemutatjuk egy osmotinszerű fehérje izolálását és azonosítását, valamint ezt követően az ezt a fehérjét kódoló cDNS klónozását. Emellett ez a tipikus módszer eljárást ad arra is, hogyan állítsunk elő gombákra kevésbé érzékeny, transzgenikus növényt, egy nyitott leolvasási keret magas szintű expressziója révén, amely az említett osmotinszerű fehéijét kódolja az említett növényben. Továbbá bemutatjuk, hogy ez a normális körülmények között intracelluláris osmotinszerű fehéije a találmány szerinti eljárással hogyan irányítható az extracelluláris térbe, és ezáltal megnövekedett gombaellenes hatást biztosít abban a növényben, amelyben előállították.

Nyilvánvaló, hogy ahol megnevezzük az osmotinszerű fehéijéket, ott ezek csak a találmány szerinti módszer és eredmények illusztrálását szolgálják, és nem áll szándékunkban a találmány oltalmi körét az osmotinszerű fehérjékre korlátozni. Ennélfogva a találmány szerint előállított más gombaellenes fehérjék alkalmazása is a találmány oltalmi körébe tartozik.

Úgy észleltük, hogy ha növényeket egy inkompatibilis patogénnel kezelünk, és ezzel egy hiperszenzitivitási reakciót váltunk ki, akkor néhány nappal az inokulálás után levélkivonatok készíthetők, amelyekből olyan frakciók nyerhetők ki, amelyek erős gombaellenes hatást mutatnak. Azt találtuk, hogy számos dohányból és paradicsomból előállított frakcióban a gombagátló hatás nem a P-l,3-glükanázoknak vagy kitinázoknak tulajdonítható, mivel a tovább tisztított, gombagátló hatással rendelkező frakciókban egyáltalán nem lehetett glükanáz- vagy kitinázaktivitást kimutatni. A gombaellenes hatás hőre érzékenynek bizonyult. A dohányból származó aktív komponensről kiderült, hogy egy hidrofób fehéije, amelynek molekulasúlya körülbelül 24 kD, bázikus izoelektromos pontja (pl) van, és az AP20 jelzést kapta (AP24-ként is hivatkozunk rá). Az AP20 tisztítása és az aminosavszekvenciájának meghatározása után kiderült, hogy ez a rész azonos az osmotin megfelelő részével, amely egy, a dohányban előforduló ismert fehérje [Singh, N. K. et al., Plánt Physiol., 85, 529-536 (1987); Sing, N. K. et al., Plánt Physiol., 90, 1096-1101 (1989)], és amely az osmotinok néven ismert fehérjék, vagy más néven az osmotinszerű fehétjék közé tartozik. Az osmotinszerű fehérjék onnan kapták a nevüket, mert felfedezték, hogy többek között akkor szintetizálódnak, amikor a növényi sejtek ozmotikusán adaptálódnak magas koncentrációjú nátrium-kloridot, kálium-kloridot vagy polietilénglikolt tartalazó táptalajhoz, de az osmotinszerű fehérjék akkumulációja az ozmotikus anyag folyamatos jelenlétének függvényének tűnik. (Néhány) ozmotikus hatással nem rendelkező anyag, például a kadmiumklorid jelenlétében az akkumuláció nem fordul elő [King et al., Plánt Mól. Biok, 7,441-449 (1986)].

A dohányban két osmotint írtak le, az osmotin-I-et, amely egy vízoldható forma, és az osmotin-II-t, amely egy detergensben oldódó, viszonylag proteáz rezisztens forma. Mindkét dohányból származó osmotin molekulatömege körülbelül 24 kD, nagyon hasonló az aminosav-összetételűk, és hasonlóak egy paradicsomból (Lycopersicon esculentum) származó 24 kD méretű fehérjéhez, valamint más fehérjékhez, beleértve a Thaumatococcus daniellii-ből származó thaumatint, a dohányból származó, patogenezishez kapcsolódó S fehérjét (PR-S), és egy bifunkciós kukoricatripszin/a-amiláz inhibitort. Osmotinszerű fehérjéket, amelyek szerológiailag mind rokonok, és molekulatömegük megfelel a dohányból és paradicsomból izolált osmotinokénak, leírtak többek között kölesből, szójababból, répából (Daucus carota), gyapotból, burgonyából (Solanum tuberosum) [Singh et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 739-743 (1987)], lucernából (Medicago sativa) és babból (Phaseolus) (King et al., im.).

Mostanáig nem volt ismert az osmotin hatása. Általában azt feltételezték, hogy az osmotinok feladata az, hogy a növényeknek ozmózistűrő képességet biztosítsanak alacsony víztartalom mellett [lásd például Grosset et al., Plánt Phys., 92, 520-527 (1990)].

A fizikai paraméterek hasonlósága, azaz a majdnem azonos molekulatömeg, az aminosavszekvencia, ami azonos a dohányból származó osmotin-II-ével, és majdnem azonos a dohányból, valamint a paradicsomból (NP24) származó osmotin-I-ével, azonkívül a megfelelő pl-érték alapján azt a következtetést vonták le, hogy az AP20 gombaellenes hatású fehérje valójában egy osmotin. Annak a feltételezésnek az ellenőrzésére, hogy a gombaellenes hatás az osmotinszerű fehérjék általános tulajdonsága-e, megvizsgáltuk, hogy egy paradicsomból származó osmotinszerű fehérje, amelyet NP24 néven ismernek, képes-e gátolni a P. infestanst. Azt találtuk, hogy az NP24 gombaellenes hatással is rendelkezik.

Ebből azt a következtetést vontuk le, hogy a dohányból és a paradicsomból származó osmotinszerű fehérjék gombaellenes hatással rendelkeznek és ennélfogva alkalmasak arra, hogy egy gombaellenes készítményben használjuk fel őket. Figyelembe véve a nagy homológiát az osmotinszerű fehérjék között a növények világában, azt tételezzük fel, hogy más, nem a dohányból vagy a paradicsomból származó osmotinok is rendelkeznek gombaellenes hatással.

Az osmotinok vagy osmotinszerű fehérjék azok, amelyek aminosav-szekvenciájának homológiája a dohányból származó osmotinnal több mint 70%, vagy még nagyobb, előnyösen 80%-nál nagyobb, bázikus plvel rendelkeznek, szintézisük korrelációban van a növényi sejteknek magas NaCl-koncentrációjú táptalajhoz való adaptációjával, és legalább egy gombával szemben hatásos gátlószerek. A gombaellenes hatást az alábbiakban úgy határozzuk meg, mint bármely, egy gomba

HU 219 505 Β csírázására, növekedésére és/vagy differenciálódására gyakorolt gátló hatást, illetve bármely olyan hatást, amely a gomba életképességét és/vagy fertőzőképességét csökkenti.

Az osmotinok előállítása során azt a lehetőséget használjuk ki, hogy ezeknek a fehéijéknek a szintézise indukálható, például oly módon, hogy a növényt egy inkompatibilis patogénnel fertőzzük meg, amely lehet vírus, baktérium vagy gomba. Azonban nem szükséges a növényeket patogénekkel fertőzni. Az osmotinszintézis indukálására más módszerek is használhatók, például az, hogy a növényeket vagy a tenyésztett növényi sejteket nátrium-klorid és/vagy polietilénglikol hatásának tesszük ki. Ez a sejtekben magas koncentrációjú osmotint eredményez; az akkumuláció egészen a 12%-ot is elérheti [Singh et al., Plánt Physiol., 85, 529-536 (1987)]. Az osmotinszintézist indukálhatjuk úgy is, hogy a növényeket vagy a növényi sejteket ABA-val (abszcizinsav) kezeljük [Singh et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 739-743 (1987)].

Azok a növények, amelyekből az osmotinokat izolálni lehet, lehetnek többek között köles, szójabab, gyapot, paradicsom és burgonya [Singh et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 739-743 (1987); King et al., Plánt Mól. Bioi. 10, 401-412 (1988)], de más, az előzőkben említettektől eltérő növényekből származó osmotinok (osmotinszerű fehéijék) is kielégítőek, ha a dohány osmotinjával megfelelő homológiát mutatnak, vagy a fizikai paraméterei összehasonlíthatók a dohányból származó osmotinéval. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint az osmotinszerű fehéijék izolálására az olyan dohánynövények (beleértve a sejttenyészeteket is) anyagát használjuk fel, amelyeket valamilyen stresszfaktor hatásának teszünk ki, ilyen lehet például egy ozmotikus hatású anyag, szárazság vagy egy patogén, előnyösen dohány-mozaikvírus (TMV), illetve egy olyan növény anyagát használjuk fel, amelyet a Phythophthora infestansszal fertőztünk meg, vagy arachidonsawal kezeltük.

Az osmotinszerű fehéijék izolálása során felhasználhatjuk az általánosan ismert fehéijefrakcionálási technikákat (vagy azok kombinációit), például a centrifugálást, kromatografálást, elektroforézist és hasonlókat. Preparatív célokra előnyösen olyan technikákat használunk, amelyek nemdenaturáló körülményeket alkalmaznak. A találmány egy előnyös megvalósítási módja szerint gélkromatográfiát és ioncserélő kromatográfiát alkalmazunk a hidrofób kölcsönhatásokon alapuló kromatográfiával kombinálva, mikor is az elúciót UV-spektrofotometriával követjük. A kapott frakciókat vizsgálhatjuk, hogy megtalálható-e bennük az előre csíráztatott vagy előre nem csíráztatott gombaspórák növekedését gátló hatás, amely gombaspórák érzékenyek az osmotinszerű fehéijékre, ilyenek például a Phytophthora nemzetségbe tartozó gombák, előnyösen a Phytophthora infestans. A spórákat (1 és 100 spóra mikroliterenként, előnyösen 5 és 20 spóra mikroliterenként) alkalmas táprétegen vizsgálhatjuk, például burgonyás-szőlőcukros agáron (PDA) és hasonlókon. A gomba fejlődését és növekedését könnyen meghatározhatjuk oly módon, hogy a micéliumot a frakció hozzáadása után bizonyos időközönként megfestjük; a kontrollkészítménnyel inkubált gombaspórákkal összehasonlítva, a gombaellenes faktor jelenlétét meg lehet határozni. Azok a frakciók, amelyek azt mutatják, hogy bennük hőre érzékeny gombaellenes hatás található, megelemezhetők, hogy van-e bennük osmotinszerű fehéije, az elemzést a molekulatömeg alapján (elektroforézist alkalmazva), és/vagy immunblott technikával végezhetjük, például dohányból származó osmotin vagy patogenezishez kapcsolódó fehéije (PRS) elleni antitestek alkalmazásával. Az osmotint tartalmazó frakciókat tovább frakcionálhatjuk, például hidrofób kölcsönhatáson alapuló kromatográfiát (HIC) vagy nagynyomású folyadékkromatográfiát (HPLC) alkalmazva; ezekkel a technikákkal majdnem teljes tisztaság érhető el. Az itt ismertetett eljárással lehetséges osmotinszerű fehéijéket izolálni bármely, az említett fehérjéket tartalmazó növényből.

A gomba növekedésének gátlásával az osmotinokat például élelmiszerek, kozmetikumok, illetve gyógyszerek vagy gyógyhatású készítmények konzerválására lehet használni, vízben oldva szobanövények és mezőgazdasági termények permetezésére, gyümölcsök, zöldségek és más termények konzerválására lehet használni egy korlátozott ideig, és mindegyik olyan esetben, amikor a gombák növekedését gátolni kell, az osmotinok számára alkalmas körülmények között. Tehát az osmotint adhatjuk önmagában vagy alkalmas hordozóval kombinálva, vagy ha szükséges, akkor más gombaellenes anyagokkal kombinálva porok, granulátumok, aeroszolok, oldatok, gélek, illetve más oldószerekkel vagy hordozókkal kombinált formában.

Készítményekben való alkalmazás céljából, például azért, hogy a hatásterületét szélesítsük, az osmotinok és más gombagátló anyagok kombinációja is használható, ilyenek például a klasszikus gombaellenes antibiotikumok, a SAFP-ok, és a kémiai fungicidek, például a polioxinok, nikkomicinek, karboximidek, aromás szénhidrátok, karboxinok, morfolinok, a szteroid bioszintézis gátlói, a szerves foszforvegyületek, enzimek, például a glükanázok, kitinázok, lizozimek és hasonlók. Akár önmagában, akár más aktív adalékanyagokkal kombinálva, az osmotint olyan koncentrációban alkalmazzuk, amelyben eléri a végső célt, általában 1 pg/ml és 100 mg/ml közötti koncentrációban, előnyösen 5 pg/ml és 5 mg/ml közötti koncentrációban, 3,0 és 9,0 közötti pH-tartományban. Általában a pufferolt készítmények alkalmazása kívánatos, például 1 mM és 1 M közötti foszfátpufferok, előnyösen 10 mM és 100 mM közötti, különösen előnyösen 15 mM és 50 mM közötti koncentrációban, jóllehet az alacsony pufferkoncentrációknál kívánatos, hogy sót adjunk hozzá az ionerősség fokozására, például nátrium-kloridot 1 mM és 1 M közötti koncentrációban, előnyösen 10 mM és 100 mM közötti koncentrációban.

A találmány speciális megvalósítási módja során olyan transzgenikus növényeket kapunk, amelyek csökkent gombaérzékenységgel rendelkeznek annak következtében, hogy egy vagy több növényi részben egy vagy több osmotinszerű fehéijét kódoló gén konstitutíven exp5

HU 219 505 Β resszálódik, vagy azért, mert egyszerre konstitutíven expresszálódik egy osmotin gén és például egy glükanáz és/vagy egy kitináz gén vagy hasonló a növény egy vagy több részében extracelluárisan. A dohányban megtalálható gének mellett [Singh et al., Plánt Physiol., 85, 529-536 (1987)], illetve a paradicsomban megtalálható gének mellett, azaz az NP24-et kódoló gén mellett [King et al., Plánt Mól. Bioi. 10, 401-412 (1988)], osmotin gének előfordulnak többek között kölesben, szójababban, burgonyában, paradicsomban, répában, gyapotban és másban, és ezek is felhasználhatók ilyen célokra. Az ismert technikák alkalmazásával a szakterületen jártas szakember számára köteles tudás osmotinszerű fehérjéket kódoló géneket vagy cDNS-eket izolálni különböző növényfajokból, egy polinukleotidpróba, például egy dohányból származó osmotin génffagment, vagy egy osmotin gén ismert szekvenciáján alapuló szintetikus oligonukleotidpróba segítségével. Közismert technikák alkalmazásával egy gyakorlott szakember képes a kapott osmotin génfragmentet megsokszorozni, meghatározni a DNS-fragment nukleotid szekvenciáját, majd a génfragmentet vagy cDNS-t megfelelő orientációban klónozni egy olyan vektorba, amely megfelelő szekvenciákat tartalmaz ahhoz, hogy a génfragmentet a növény egy vagy több részében expresszáljuk. Ha egy ilyen expressziós konstrukciót megfelelő módon hozzáadunk növényi anyaghoz, akkor ennek eredménye transzformáit növényi anyag, amelyet azután olyan teljes, transzformáit növények regenerálására lehet használni, amelyek az osmotin fehéijét vagy annak egy részét kódoló gént vagy génfragmentet expresszálják a növényben vagy annak néhány részében.

Egy előnyös módszer olyan DNS-fragment izolálására, amely egy osmotin gént, illetve annak egy részét tartalmazza, a polimeráz láncreakció (PCR) technika alkalmazása, amelyet Maniatis és munkatársai írnak le [Maniatis et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2. kiadás (1989)]. Egy osmotin gén publikált szekvenciájából, vagy egy tisztított osmotin ismert aminosavszekvenciája alapján meghatározott nukleotid szekvenciából kiindulva bármely kívánt génfragmentet elő lehet állítani, például olyan szintetikus oligonukleotidok segítségével, amelyek komplementerek a kívánt fragment 5’ és 3’ régióival. Ha hagyjuk, hogy ezek az oligonukleotidok hibridizációs indítómolekulaként hibridizálódjanak in vitro a növény DNS-éhez, vagy egy cDNS-könyvtárhoz (előnyösen olyan növényi sejtekből előállítva, amelyeket patogén vagy ozmotikus stressz hatásának tettünk ki), és néhány polimerizációs ciklust végrehajtunk, akkor a keresett fragment szelektíven amplifikálható. Az indítómolekulákat úgy szintetizálhatjuk meg, hogy olyan belső restrikciós hasítási helyeket tartalmazzanak, amelyek megfelelnek egy linearizált klónozó vektor végeinek azért, hogy ezzel biztosítsuk az amplifikált fragmentek könnyű ligálását a vektorba. Az izolált fragmentet ezután klónozhatjuk és tovább manipulálhatjuk. így még különböző osmotinszerű fehéijék génjeiből származó fragmentek kombinációit, beleértve az ilyen gének teljesen szintetikus fragmentjeit is, összekapcsolhatjuk, és így egy kiméra osmotinszerű fehéijét kódoló egyetlen nyitott leolvasási keretet állíthatunk elő.

Az újonnan bejuttatott fehérje növényben való expressziója céljából egy transzkripciós promotert kell beépíteni az expressziós konstrukcióba; felhasználhatjuk többek között a CaMV 35S promoterét, az úgynevezett T-DNS-promotereket vagy növényi promotereket, adott esetben egy vagy több enhanszer fragmenttel együtt. Általában erős konstitutív promotereket használnak, amelyek az összes, vagy a legtöbb növényi részben működőképesek, jóllehet szövetspecifikus vagy a fejlődés során eltérő módon szabályozott, illetve másképpen szabályozott vagy indukálható promoterek is használhatók. Egy szabályozható, azaz egy szövetspecifikus promoter előnyös lehet, ha a fitopatogén gomba például csak bizonyos részeit érinti a gombának, illetve csak bizonyos növényi részeken keresztül fertőz. A növényben működő promoter és a kódolószekvencia mellett más szabályozószekvenciákra is szükség van az expressziós konstrukcióban, például transzkripciós enhanszerekre, transzlációs enhanszerekre, amilyen például a TMV RNS genomjának a leader szekvenciája [Gallie, D. R. et al., Nucleic Acids Research, 16, 883-893 (1988)], mRNS stabilizálószekvenciákra, mint amilyen a lucerna-mozaikvírus (A1MV) RNA4-leader szekvenciája, intronokra, egy transzkripciós terminációs és poliadenilezési jelre, amilyen például a nopalin szintetáz terminátora (Tnos). Az ismert, hogy ezeket az elemeket miként lehet egy expressziós konstrukcióban hasznosítani abból a célból, hogy gén expresszióját a kívánt módon befolyásoljuk. Hogy a gén expresszióját tovább optimalizáljuk, kívánatos lehet egy genomiális klón alkalmazása egy cDNS-klón helyett. Egy másik módszer szerint, ha szükséges, akkor szintetikus intront építhetünk be a cDNS-szekvenciába.

Hogy valamennyi gombagátló hatást kapjunk, ahhoz elvileg elegendő, ha egy osmotinszerű fehéije génjének erős konstitutív vagy specifikusan szabályozott erős expresszióját eléijük a transzgenikus növényben vagy annak néhány részében. A vad típusú osmotinszerű fehérjéről feltételezik, hogy a növényi sejt vakuólumaiban akkumulálódik. Azt találták, hogy ha a vad típusú, osmotinszerű fehérje expresszálódik, akkor gombaellenes hatás figyelhető meg.

A találmány szerinti eljárásban intracelluláris osmotin(szerű) fehéijét az extracelluláris térbe irányítunk oly módon, hogy megváltoztatjuk az azt kódoló gént. Ennek elérésére egy lehetséges út az, ha körülbelül 20 C-terminális aminosavat eltávolítunk a vad típusú, az osmotin mRNS által kódolt primer transzlációs termékről, amely valószínűleg az intracelluláris lokalizációért felelős. A fehéije C-terminális részének eltávolítását elérhetjük például úgy, hogy a génbe transzlációs stopkodont építünk be, hogy ezzel megakadályozzuk azoknak a kodonoknak az aminosawá való átírását, amelyek a 3’ vég felé találhatók. Ennek egyik változataként az osmotinszerű fehéije C-terminális részét megváltoztathatjuk a vad típushoz képest, hogy ezzel gátoljuk a helyes működését. A nyitott leolvasási keretet meg is hosszabbíthatjuk, hogy ezzel a vad típusú, osmotinszerű fehéijét meg6

HU 219 505 Β változtassuk, és ezzel megakadályozzuk a C-terminális megfelelő működését, aminek eredménye az extracelluláris irányítottság. Az a módszer önmagában, amellyel a fehéijét a sejtből kijuttatjuk, nem kritikus a találmány szempontjából egészen addig, amíg a fehérje módosítása nem rontja le a gombaellenes hatását.

A dohány levélkorongjaiban például azt találtuk, hogy az osmotinszerű fehérje irányítottságának megváltoztatása a gombaellenes hatás jelentős mértékű megerősödésével jár a P. nicotianae var. nicotianae gombával szemben.

Bizonyos esetekben kívánatos lehet olyan növények előállítása, amelyek mind egy vad típusú, intracelluláris osmotinszerű fehérjét kódoló gént, mind egy extracelluláris térbe irányuló, osmotinszerű fehéijét kódoló gént tartalmaznak, hogy ezzel tovább erősítsük a gombaellenes hatást.

A fentiek alapján a találmány egyik tárgya eljárás egy növényből származó intracelluláris feltétjének a növény vagy a növény egy sejtjének extracelluláris terébe való irányítására, ahol az említett intracelluláris fehérje tartalmaz egy C-terminális részt, amely a fehétje intracelluláris lokalizációját biztosítja, amely abban áll, hogy az intracelluláris fehétje C-terminális részét kódoló, nyitott leolvasási keret 3’-terminális végét úgy módosítjuk, hogy megelőzzük az intracelluláris fehérje Cterminális rész által normál körülmények között biztosított intracelluláris lokalizációját.

Az intracelluláris fehétje előnyösen egy patogénellenes vagy gombaellenes fehérje.

A találmány további tárgya eljárás egy növényből származó intracelluláris, patogénellenes fehérje patogénellenes hatásának fokozására, amely abban áll, hogy az intracelluláris fehéijét az extracelluláris térbe irányítjuk. Az említett irányítást előnyösen az intracelluláris fehéijét kódoló nyitott leolvasási keret 3'-terminális végének módosításával érjük el. Az intracelluláris fehérje előnyösen egy kilináz, P-l,3-glükanáz vagy egy osmotinszerű fehérje.

A találmány tárgya továbbá eljárás egy target peptid extracelluláris átvitelének megakadályozására, amely abban áll, hogy expresszálunk egy kunéra peptidet, amelyet az említett target peptidből és a Gln-Ala-His-ProAsn-Phe-Pro-Leu-Glu-Met-Pro-Gly-Ser-Asp-AgluVal-Ala-Lys szekvenciával vagy annak egy részével rendelkező C-terminális peptidből állítottunk elő. A kiméra peptidet kódoló DNS-szekvenciát vagy -vektort is alkalmazhatjuk ebben az eljárásban.

A találmány még további tárgya eljárás egy fehérének, amely természet szerint egy vakuólába irányító szekvenciával rendelkezik a C-terminálisán, amely természetesen a fehéijét a növényi vakuólába irányítja, egy növény extracelluláris terébe történő kivitelére, amely abban áll, hogy

a) izolálunk egy nyitott leolvasási keretet tartalmazó DNS-szekvenciát, amely az említett fehéijét a Cterminálisán lévő vakuoláris irányítószekvenciával együtt kódolja;

b) eltávolítjuk a nyílt leolvasási keretből a vakuoláris irányítószekvenciát kódoló DNS-szekvenciát létrehozva egy módosított DNS-szekvenciát, amely a fehérjét a C-terminális aminosavak nélkül kódolja;

c) bevisszük a b) lépésben kapott módosított DNSszekvenciát egy alkalmas növényi expressziós vektorba;

d) transzformáljuk a c) lépés termékét egy alkalmas növénybe; és

e) az így kapott növényt megfelelő körülmények között tenyésztjük, miközben a b) lépésben kapott módosított DNS-szekvencia által kódolt fehéije kifejeződik és szekretálódik.

Ilyen fehéijék előnyösen a patogenezishez kapcsolt fehérjék, mint például a kitináz, glukanáz, PR-1 fehérje és osmotin, még előnyösebben az osmotin, legelőnyösebben a dohányban előforduló osmotin. Az említett növény előnyösen dohány- vagy burgonyanövény.

A fenti eljárást előnyösen úgy valósítjuk meg, hogy a b) lépésben a C-terminális 15-20 aminosavat kódoló DNS-szekvenciát eltávolítjuk a nyílt leolvasási keretből, előnyösen a DNS-szekvencia 3'-terminális végére egy transzlációs stopkodon beépítésével. A c) lépés terméke előnyösen a pMOG405 expressziós plazmid vektor.

A találmány tárgyát képezi továbbá egy eljárás transzformált növényi anyag előállítására, amely tartalmaz egy génterméket, amely természet szerint egy vakuoláris irányítószekvenciával rendelkezik a C-terminálisán, és a géntermék extracelluláris térbe történő szekretálására, amely abban áll, hogy

a) izolálunk a géntermék fehéijéhez egy DNS-szekvenciát, amely a C-terminálisán egy vakuoláris irányítószekvenciával rendelkezik és természet szerint a fehérjét a növényi vakuólába irányítja;

b) eltávolítjuk az említett DNS-szekvenciából a vakuoláris irányítószekvenciát kódoló szekvenciát, létrehozva ezáltal egy módosított DNS-szekvenciát, amely a fehérjét a C-terminális aminosavak nélkül kódolja;

c) bevisszük a b) lépésben kapott módosított DNSszekvenciát egy alkalmas növényi expressziós vektorba;

d) transzformáljuk a c) lépés termékét egy alkalmas növénybe; és

e) tenyésztjük a d) lépésben kapott növényt megfelelő körülmények között, miközben a b) lépésben kapott módosított DNS-szekvencia által kódolt fehéije kifejeződik és az extracelluláris térbe szekretálódik; és

f) szkríneljük az így kapott növényi anyagot, és izoláljuk a pozitív transzformánsokat.

A géntermék előnyösen egy patogenezishez kapcsolt fehérje az alábbiak közül: kitináz, glukanáz, PR-1 és osmotin, még előnyösebben osmotin és legelőnyösebben a dohányban vagy burgonyában előforduló osmotin.

A fenti eljárást előnyösen úgy kivitelezzük, hogy a b) lépésben eltávolítjuk a fehéije C-terminális 15-20 aminosavát kódoló DNS-szekvenciát a nyílt leolvasási keretből, előnyösen a 20 aminosavat kódoló szekvenciát egy transzlációs stopkodon beépítésével a DNS-szekvencia 3'-terminális végére. A c) lépés terméke előnyösen a pMOG405 expressziós vektor. Az említett növény előnyösen dohány- vagy burgonyanövény.

HU 219 505 Β

A találmány rekombináns polinukleotidoknak a fenti eljárásokban való alkalmazására is vonatkozik, amelyek tartalmaznak:

(i) egy növényekben működőképes promotert;

(ii) egy nyílt leolvasási keretet, amely egy intracelluláris, patogenezishez kapcsolt fehéijét kódol az említett promoter szabályozása alatt, ahol a nyílt leolvasási keretet módosítottuk, hogy az intracelluláris patogenezishez kapcsolt fehéijét az extracelluláris térbe irányítsa, létrehozva egy transzlációs stopkodont a nyílt leolvasási keret 3’-végén, ami az intracelluláris patogenezissel kapcsolt fehéije intracelluláris irányításához szükséges Cterminális aminosavainak delécióját eredményezi; és (iii) egy terminátort, amely működőképesen kapcsolódik az említett nyílt leolvasási kerethez.

A rekombináns polinukleotid előnyösen egy kitinázt, glükanázt, osmotint vagy pR-l-et, még előnyösebben egy osmotint kódol, amely természet szerint a növényi sejt vakuólájába irányítódik. A módosított rekombináns polinukleotid alkalmazásával lehetővé válik a vakuólából az apoplasztba történő irányítás.

Az újonnan bejuttatott génkonstrukciók expressziós szintjét úgy lehet meghatározni, hogy az extracelluláris folyadékban elemezzük a fehérjéket, vagy az összes fehéijét elemezzük, Western biot technikát alkalmazva. Hasonlóképpen egy ismert módszerrel az mRNS relatív mennyisége meghatározható a Northern biot technika alkalmazásával, olyan próbát használva a hidridizáláshoz, amely az osmotin mRNS-re irányul. Azokat a transzformált növényeket, amelyek láthatóan magas szinten expresszálják akár a vad típusú, akár az irányított osmotinszerű fehérjét kódoló génkonstrukciót, ezt követően megvizsgáljuk, hogy rezisztensek-e a gombákra, oly módon, hogy a növényt egy fitopatogén gombával fertőzzük meg, és a kifejlődő szimptómák sebességét, súlyosságát összehasonlítjuk a nem transzformáit növényekével. Egy másik módszer a gombákkal szemben kialakult rezisztencia vizsgálatára, ha a gomba hatását a transzgenikus növények levélkorongjain vizsgálják a teljes növény helyett. Ennek a módszernek az az előnye, hogy viszonylag könnyű a szimptómák kifejlődését megítélni többé-kevésbé kvantitatív módon.

Mikroorganizmusokat transzformálhatunk egy osmotinszerű fehérjét, illetve annak egy részét kódolt génfragmenttel az osmotinszerű fehéije előállítása céljából, hogy így a gombaellenes preparátumokban használható osmotinszerű fehéqéket kapjunk. Az előnyös mikroorganizmusok például baktériumok, úgymint Bacillus fajok, illetve élesztők. Egy másik módszer szerint egy osmotinszerű fehérjét kódoló génnel vagy génffagmenttel transzformált mikroorganizmusok, amelyek osmotinszerű fehérjét termelnek, használhatók a növények megmentésére, ha képesek az említett növényen vagy annak jelenlétében növekedni. Az előnyös mikroorganizmusok például a Pseudomonas vagy Rhizobium fajok. Egy osmotinszerű fehéije cDNS-fragmentjének Escherichia coliban való expresszióját már sikerült megvalósítanunk.

A találmány legtöbb olyan megvalósítási módja, amelyben növényeket a növényben expresszálandó génkonstrukcióval transzformálunk megköveteli, hogy számos, általánosan ismert mikrobiológiai, molekuláris biológiai, rekombináns DNS, növényi transzformációs és növényi szövettenyésztéses technikákat alkalmazzunk, amelyek mind ismertek a szakterületen jártas szakember számára. A DNS izolálására, manipulálására és amplifikálására alkalmas standard technikák, valamint a rekombináns DNS replikálódásához alkalmas vektorok, megfelelő baktériumtörzsek, szelekciós markerek, táptalajok és hasonlók mind ismertek, leírásuk megtalálható Maniatis és munkatársai munkájában [Maniatis et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, DNA Cloning: I. és II. kötet, Cold Spring Harbor Laboratory, 2. kiadás, D. N. Glover szerk. (1989); és From Genes to Clones, E. L. Winnacker ed. (1987)].

A baktériumokban való klónozásra alkalmas ismert vektorok, mint például a pUC18 (lásd általában a From Genes to Clones) és a pEMBL plazmidok (Dente L., Nucleic Acids Research, 11, 1645-1655). Az utóbbi plazmidoknak az az előnyük, hogy bizonyos egyszálú DNS-bakteriofágok replikációorigóját tartalmazzák, és ezáltal ezek a plazmidok közvetlenül felhasználhatók DNS-szekvencia meghatározására. Sanger et al. módszerével [Sanger et al., J. Mól. Bioi., 14, 161-178 (1980)].

A rekombináns géneknek a növényi genomba való juttatására számos technika ismert, például az Agrobacteriummal való transzformáció, a növényi szövet bombázása DNS-sel borított részecskékkel [Klein et al., Natúré, 327, 70-73 (1987)], a közvetlen DNS-felvétel, például kalcium/PEG-módszerrel [Krens F. A. et al., Natúré, 296, 72-74 (1982)], illetve a DNS mikroinjektálása protoplasztokba [Crossway A. et al., Mól. Gén. Génét., 202, 179-186 (1986)], és hasonlók. A növényi transzformációs technikák általános áttekintéséhez lásd például Lichtenstein et al., in: Genetic Engineering, 6. kötet, 104-182 szerk. Rigby, (1987). A találmány két előnyös megvalósítási módja szerint az Agrobacterium bináris vektorrendszerét alkalmazzuk. A bináris vektorrendszer elvét Hoekema és munkatársai írták le [Natúré, 303,179-180 (1983); Bevan et al., Nucleic Acids Research, 12, 8711-8721 (1984)].

A genetikai anyag bejuttatása után egy egész, új növény generálható a transzformált sejtből (protoplasztból) vagy transzformált szövetből. Egy másik módszer szerint a virágporsejtek transzformálhatok és használhatók egy befogadó növény beporzására. A transzformált növények szelekcióját úgy végezhetjük el, ha például ugyanazon a DNS-ffagmenten, amelyen a beviendő gén található, van még egy jelzőgén. A jelzőgének kódolhatnak például herbicid- vagy antibiotikumrezisztenciát, vagy olyan enzimeket, amelyek képesek egy színreakciót katalizálni, vagy egy könnyen megfigyelhető (például közvetlenül látható) tulajdonságot kódolnak. A jelzőgént expresszáló növények valószínűleg tartalmazzák a bevitt osmotinszerű fehérje génjét is. A kiválasztott növényekben vizsgálhatjuk az osmotinszerű fehérje expresszióját, a szakterületen jártas szakember számára ismert Western vagy Northern biot technikák

HU 219 505 Β alkalmazásával. A gombákra rezisztens növények kiválaszthatók azok közül, amelyek jól expresszálnak oly módon, hogy a növényeket bármely olyan gomba hatásának tesszük ki, amely az ugyanabba a variánsba tartozó növényen patogén hatással van.

Az említett transzformációs technikák alkalmazásával elvileg nincs korlátja a találmány gyakorlati alkalmazásának a kiválasztott gazdanövény szempontjából. Mind kétszikű növényeket (azaz a paradicsomot, burgonyát, babot, szójababot, repcét, gyapotot és hasonlókat), mind az egyszikű növényeket (kukorica, búza, árpa, Asparagus, rizs és hasonlók) sikerrel lehet transzformálni rekombináns DNS-sel, majd teljesen felnőtt, magot hozó növényekké regenerálni, amelyek rekombináns DNS-t expresszáló növénnyé fejlődnek.

A találmány előnyös megvalósítási módjai szerint dohány-, burgonya- és paradicsomnövényeket lehet transzformálni dohányból származó osmotin génnel. Az azonban nyilvánvaló, hogy a találmány bármely olyan terményre alkalmazható, amely érzékeny olyan gombára, amellyel szemben az osmotin gátló hatást mutat.

A leírásban idézett publikációk jelzik azt a szakmai felkészültségi szintet, amelyre a találmány megvalósítása során szükség van. Az összes publikációt, legyen az találmány vagy más, és ebben a leírásban előbb vagy utóbb említettük, referenciaként tartjuk számon.

Az alábbiakban megadott példák csak a bővebb szemléltetés célját szolgálják, és semmiképpen sem tekinthetők úgy, hogy az oltalmi kör csak ezekre korlátozódik.

1. példa

AzAP20 izolálása TMV-vel indukált dohánynövényből

7-8 hetes dohány (Nicotiana tabacum cv. Samsun NN) leveleit beoltjuk dohány-mozaikvírussal (TMV), a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel. A fertőzés után hét nappal 400 g levelet gyűjtünk, majd 4 °C-on homogenizálunk 600 ml 0,5 M nátrium-acetát, 15 mM 2-merkapto-etanol és 4 g aktív szén összetételű oldatban egy Waring blendor berendezést alkalmazva. A homogenizátumot gézen átszűrjük, majd ezt követően a szűrletet 5000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszót ezután 50 percig 22 000 g-vel centrifugáljuk és Sephadex G25 oszlopon (Pharmacia) sómentesítjük, amelynek hossza 60 cm, szélessége 11,5 cm, és 20 mM nátrium-acetát (pH=5,2) pufferrel van egyensúlyba hozva. A fehérjéket tartalmazó frakciót éjszakán át 4 °C-on tároljuk, majd ezt követően 45 percig 22 000 g-vel centrifugáljuk. A felülúszót egy S-Sepharose „fást flow” (Pharmacia) oszlopon engedjük át, amely 5 cm hosszú, átmérője 5 cm, és 20 mM nátriumacetát (pH=5,2) pufferrel van egyensúlyba hozva, körülbelül 15 ml/perc áramlási sebességgel. A nem kötődő fehérjéket összegyűjtjük. A megkötött fehérjéket leoldjuk oly módon, hogy az előzőleg említett pufferben egy lineárisan növekvő nátrium-klorid-gradienst alkalmazunk (0-500 mM), az áramlási sebesség 3 ml/perc és 4,2 ml-es frakciókat gyűjtünk. Minden második frakciót elektroforézissel vizsgálunk, 12,5%-os poliakrilamid gélt alkalmazva nátrium-dodecil-szulfát (SDS) jelenlétében, referenciaként 20-66 kD méretű molekulatömegmarkereket alkalmazva. Ugyanezen frakcióknak egy másik részéből a gombaellenes hatást vizsgáljuk.

A gombaellenes hatás vizsgálatához egy mikrotiter lemez vizsgálati módszert fejlesztettünk ki. Mind a 24, mind a 96 lyukú mikrotiter lemezek alkalmazhatók. Ezt követően 250 pl (24 lyukú lemez) vagy 50 μΐ (96 lyukú lemez) burgonyás-szőlőcukros agart (PDA) pipettázunk az egyes lyukakba. A P. infestans spóráit vízben szuszpendáljuk, és a lyukakba adagoljuk: 500-700 spórát (50 μΐ térfogatban) a 24 lyukú lemezhez, és 100-200 spórát (25 μΐ térfogatban) a 96 lyukú lemezhez. A vizsgálandó frakciók részeit 15 mM dikáliumhidrogén-foszfát/kálium-dihidrogén-foszfát (pH=6,0), 20 mM nátrium-klorid összetételű, szűréssel sterilezett (0,22 pm-es szűrőn) oldattal szemben dializáljuk, majd a spóraszuszpenzióhoz adjuk (100, illetve 50 μΐ-t, attól függően, hogy a 24 vagy a 96 lyukú lemezeket használjuk). Alacsony foszfátkoncentráció tűnt szükségesnek, mivel a P. infestans érzékenynek bizonyult a magas foszfátkoncentrációra; 15 mM kálium-foszfát elegendőnek bizonyult, és nem volt hatása a P. infestans növekedésére. A nátrium-klorid hozzáadása ahhoz kell, hogy stabilizáljuk a gombaellenes hatást alacsony foszfátkoncentráció mellett. Kontrollként ugyanezeket a frakciókat a dialízis után 10 percig forraltuk. Ezt követően ezeket a lemezeket sötétben inkubáltuk 20 °C-on 4-5 napig. A gombagátló hatás első jelei a mikroszkóp alatt már 20 óra elteltével megfigyelhetők. A gombagátló hatás úgy jelentkezik, mint a csírázó spórák és a hifacsúcsok növekvő csíracsöveinek lízise. Egy későbbi stádiumban a micellális növekedés gátlása is megfigyelhető.

Az aktív komponens további tisztításához az aktív gombaellenes frakciókat egyesítjük, dializáljuk 1 M ammónium-szulfát, 50 mM dikálium-hidrogén-foszfát/kálium-dihidrogén-foszfát (pH=7,0) összetételű oldattal szemben, majd ezt követően egy 0,22 pm pórusméretű szűrőn szűrjük. A szűrletet egy hidrofób kölcsönhatás alapján működő (HIC) oszlopra visszük (Phenylsuperose HR 5/5, Pharmacia), amelyet előzőleg a dialízispufferrel hoztunk egyensúlyba. Az összes előző lépést 4 °C-on végezzük.

A megkötött fehérjéket eluáljuk, egy 50 mM dikálium-hidrogén-foszfát/kálium-dihidrogén-foszfát pufferral (pH=7,0) készített, csökkenő ammónium-szulfát-gradienst (1 M-ról 0 M-ra) alkalmazva 0,5 ml/perc áramlási sebességgel, szobahőmérsékleten. Az eluálási program az alábbi:

- 5 perc alatt az eredeti ammónium-szulfát-koncentráció 100%-ról 30%-ra csökken,

- 7,5 percig eluálunk az eredeti ammónium-szulfátkoncentráció 30%-ával,

- 10 perc alatt az eredeti ammónium-szulfát-koncentráció 30%-ról 0%-ra csökken.

A gombaellenes fehérje az oszlopról körülbelül

5,5 perc alatt oldódik le (körülbelül 2,7 ml) az eredeti ammónium-szulfát-koncentráció 0%-nál; a csúcsfrakcióban a gombaellenes fehérje körülbelül 95%-os tisztaságú. Az összes említett lépést szobahőmérsékleten hajtjuk végre. Abból a célból, hogy a gombaellenes ha9

HU 219 505 Β tású fehérjét 99%-os tisztaságban kapjuk meg, ezeket a frakciókat 1 M ammónium-szulfát, 50 mM dikáliumhidrogén-foszfát/kálium-dihidrogén-foszfát pufferrel (pH=7,0) szemben dializáljuk, majd 0,22 mikronos szűrőn megszűrjük, és újból átbocsátjuk a HlC-oszlopon, az alábbi elúciós programot alkalmazva:

7.5 perc alatt 100%-ról 15%-ra csökkenés;

12.5 perc alatt 15%-kal;

perc alatt 15%-ról 0%-ra.

A gombaellenes hatású fehérje 13 perc elteltével eluálódik az oszlopról (körülbelül 2,7 ml); ez az eluátum 99%-os tisztaságú fehérjét tartalmaz. 400 g levélből 400 pg fehérje izolálható 95%-os tisztaságban, illetve 200 pg gombaellenes fehérje 99%-os tisztaságban.

A 24 kD-ra becsült molekulatömegű fehérje az AP20 jelzést kapta.

2. példa

Az AP20 aminosavszekvenciájának felderítése

Az AP20 N-terminális része aminosavszekvenciáját a szakterületen jártas szakember számára ismert módszerekkel határoztuk meg [lásd például Matsudairo et al., J. Bioi. Chem., 262, 10035-10038 (1987)]. Az AP20 részleges aminosavszekvenciájának, valamint a dohányból és a paradicsomból származó osmotin aminosavszekvenciájának az összehasonlítása látható az 1. ábrán. Az ábrán látható, hogy az AP20 40 N-terminális aminosava teljesen azonos a dohányból származó osmotin II N-terminális aminosav szekvenciájával, és nagyon erős homológiát mutat a paradicsomból származó NP24 osmotinszerű fehérjével.

Az AP20 molekulatömegének pontos meghatározását egydimenziós poliakrilamid gélelektroforézissel végeztük (1D-PAGE), 66 és 20 kD közötti molekulatömegű referenciákat alkalmazva. E szerint a módszer szerint a molekulatömeget 24 kD-nak határoztuk meg, ami nagyon jól egyezik más osmotinok elektroforetikus mobilitásával.

Az izoelektromos pontot izoelektromos fókuszálási kromatográfiával pl 4,3-9,5 között határoztuk meg. Az AP20 mobilitása a használt gél/puffer-rendszerben nem tette lehetővé a pl pontos meghatározását, mivel az AP20 látszólag magasabb pl-értékkel rendelkezik, mint a legtöbb bázikus marker (pH=9,5); ebből azt a következtetést vontuk le, hogy az AP20 pl-értéke 9,5-nél nagyobb. Az AP20 és a dohányból, valamint a paradicsomból származó osmotinok fizikai paramétereinek az összehasonlításából kiderült (azonos molekulatömeg, nagyon bázikus pl, az első 40 N-terminális aminosav azonossága), hogy az AP20 egy osmotin. Az általunk izolált osmotin (AP20) gombaellenes hatásának a megállapításából és az AP20, valamint más osmotinok közötti erős aminosavszekvencia-konzerválódásból is ugyanez a következtetés vonható le. Az a véleményünk, hogy a növényvilágban található többi osmotinszerű fehérje is hasonló gombaellenes hatással fog rendelkezni.

3. példa

Osmotin izolálása paradicsomból és gombaellenes hatásának vizsgálata P. infestans ellen

A paradicsomnövények befertőzésére használt módszert Heller és Gessler írta le [J. Pathology, 116,

323-328 (1986)].

Kéthónapos paradicsomnövényeket (Lycopersicon esculentum cv. Moneymaker) oltunk be P. infestans zoospóráival. A zoospórák egy lxlO⁵ sporangium/ml inkubáló táptalaj összetételű szuszpenzióban képződtek. Ebből a szuszpenzióból 6 darab 10 μϊ-es cseppet vittünk fel az egyes levelekre. A leveleket 15 °C-on inkubáltuk, 95-100%-os légnedvesség és alacsony fényintenzitás mellett, ameddig a léziók láthatókká nem váltak (körülbelül 5 nap). Ezt követően a hőmérsékletet 22 °C-ra emeltük, a levegő nedvességtartalmát 75%-ra csökkentettük, és a fényintenzitást normális szintre emeltük. Újabb három nap elteltével a nekrotikus léziókat tartalmazó leveleket összegyűjtöttük és -80 °C-on tároltuk.

Az osmotin paradicsomlevelekből való izolálása (beleértve a P. infestans-tesztet is), hasonló az AP20 dohányból való izolálásához, amint azt az 1. példában ismertettük.

A paradicsomból származó osmotin világos gátló hatással rendelkezik a P. infestans növekedésére. Kontrollkísérletekben, amikor az osmotint egy pufferben 100 °C-ra melegítettük, lízis nem volt megfigyelhető.

4. példa

A pMOGl 80 előállítása

Abból a célból, hogy elérjük az osmotin gének transzgenikus növényekben való magas szintű, konstitutív expresszióját, egy erős promotert tartalmazó expressziós konstrukciót állítottunk elő. Ebből a célból a pROKI [Baulcombe et al., Natúré, 321, 446-449 (1986)] expressziós kazettáját egy EcoRI-HindlII-fragment formájában pUC18-ba klónoztuk. Ez a kazetta tartalmazza a CaMV 35S promotert egy EcoRI-BamHI restrikciós fragmenten, valamint a nopalin szintetáz (nos) transzkripciós terminációs részét egy BamHI-HindlII-fragmenten. A promoter fragment tartalmazza a CaMV genom -800tól a + 1-es bázisig terjedő részét, ahol a + 1-es pozíció a transzkripciós iniciáció helye [Guilley et al., Cell, 30, Ί63-ΊΤ3 (1982)]. A szakirodalomból ismert, hogy a -343-as és a -90-es nukleotid közötti szekvencia megduplázásával a CaMV 355 promoter aktivitása megnő [Kay et al., Science, 236, 1299-1302 (1987)]. Ahhoz, hogy egy olyan promoter fragmentet kapjunk, amely a dupla „expressziós erősítő fragmentet” (enhanszer) tartalmazza, az alábbi klónozási lépéseket hajtjuk végre. Először a -512-es pozícióban, az Ncol felismerési hely előtt levő szekvenciát eltávolítjuk, és a felismerési helyet magát is egy EcoRI felismerési helyre változtatjuk. Ebből a célból a pUC 18-ban levő expressziós kazettát Ncol restrikciós enzimmel hasítjuk, majd a kapott végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük, és EcoRI-linkereket kapcsolunk hozzájuk.

A kapott plazmidot EcoRI-restrikciós enzimmel hasítjuk, ezzel kivágjuk az EcoRI-fragmentet, majd a végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük. Ezt követően a feltöltött AccI-EcoRV promoter fragmentet (a -388-as és a -90-es nukleotidok között) a lineáris plazmidba klónozzuk, ahol is egy új EcoRI hasítási hely keletkezik

HU 219 505 Β a feltöltött EcoRI és a feltöltött AccI hasítási hely találkozásánál. Az újonnan kapott pM0G181 plazmid tartalmazza a CaMV 35S promoterét, most már egy dupla erősítő szekvenciával, egy olyan expressziós kazettában, amely még mindig egy EcoRI-HindlII-fragmenten található. Ezt követően a pMOG181-ből a pMOG180-származékot állítjuk elő. Ebből a célból a vektort BamHI restrikciós enzimmel hasítjuk, a kapott végeket Klenow-polimerázzal feltöltjük, és egy szintetikus kétszálú DNS-fragmentet, amely a szekvenciák felsorolásában a SEQID 1 jelzést kapta, és amely a lucema-mozaikvírus RNA4 leader szekvenciáját tartalmazza, a lineáris plazmidba klónozzuk. Az újonnan képződött BamHI restrikciós hasítási helyre való szelekció után a transzkripciós iniciációs hely körül található 5’-GGATC-3’pentanukleotidot elimináljuk in vitro mutagenezist alkalmazva. Az így kapott plazmid jele pMOG180.

5. példa

Az osmotinnak megfelelő cDNS-ek klónozása és a pMOG404 bináris vektor előállítása

Egy dohány cDNS-könyvtárat készítünk egy ΖΑΡ-cDNS szintézis kit alkalmazásával (Stratagene Cat# 200400, 200401). A TMV-vel fertőzött Samsun NN dohánylevelekből poliadenilezett RNS-t izolálunk és a cDNS szintéziséhez használjuk fel, a szakterületen jártas szakember számára ismert standard technikák alkalmazásával. EcoRI és Xhol restrikciós enzimekkel való emésztés után a cDNS-ffagmenteket a lambda ZAP kompatibilis kaijaival ligáljuk.

Az előzőkben ismertetett lambda ZAP dohány cDNS-könyvtárat a paradicsom NP24 génjével homológ szekvenciákat tartalmazó próbával vizsgáljuk át [King et al., Plánt Mól. Bioi., 10, 401-412 (1988)]. A tarfolt hibridizálási technika alkalmazásával [Benton and Davis, Science, 196, 180-182 (1977)] körülbelül 7 rekombináns fágot azonosítottunk. Az ezeknek a fágoknak a DNS-ében levő inszerteket pBluescript (SK-) plazmidba szubklónozzuk, az in vivő kivágási módszer alkalmazásával. A különböző cDNS-klónok nukleotid szekvenciáját az M13 szekvenálási módszer alkalmazásával határozzuk meg. Ezek a vizsgálatok, kombinálva az AP20 fehérje részleges aminosavszekvenciájával való összehasonlítással, kimutatták, hogy csak 3 klón tartalmazza a közel teljes cDNS-szekvenciát. Az egyik cDNS-klón tartalmazza az osmotin teljes kódolószekvenciáját, a transzlációs-iniciációs kodon adenin-timidin dinukleotidja kivételével [Singh et al., (1989) i. m.]. Ezt a kiónt a továbbiakban osmotin cDNS-klónként tartjuk nyilván. A jellemzett AP20 fehérje N-terminális aminosavszekvenciája pontosan megfelel az osmotin megfelelő szekvenciájának, amit az osmotin cDNS-klón alapján lehet kikövetkeztetni.

PCR alkalmazásával egy BamHI felismerési helyet és egy Adenin-Timin dinukleotidot építünk be az osmotin cDNS elé, ezáltal egy transzlációs iniciációs kodont hozunk létre; a gén mögé egy BamHI felismerési helyet építünk be. Ezekhez a PCR-reakciókhoz az SEQID2 és az SEQID3 oligonukleotidokat használjuk indítómolekulaként (lásd a szekvencialistát, SEQID2 és SEQID3).

A módosított cDNS-szekvenciát leellenőrizzük, hogy tartalmaz-e nemkívánatos mutációkat, amelyek a PCR-módszer alkalmazása következtében léphetnek fel. A szekvenciát a szekvencialistában mutatjuk be, SEQID4 jelzéssel. Az osmotin gént egy BamHI-ffagment formájában klónozzuk a BamHI-restrikciós enzimmel linearizált pMOG180 vektorba (a konstrukciót lásd a VIII. példában; 2. ábra). A kapott expressziós konstrukció egy Sst-HindlII-ffagmenten a karfiol-mozaikvírus (CaMV) 35S promoterét tartalmazza az osmotin gén előtt, és ezt követi a nopalin szintetáz (nos) transzkripciós terminátor. Az expressziós konstrukciót a pMOG23 bináris vektorba klónozzuk (letétbe helyezve a Centraal Bureau voor Schimmelcultures te Baam, the Netherlands, No. CBS 102.90 számon 1990. 01. 29-én), miután az SSTI és a HindlII restrikciós enzimekkel linearizáltuk. A kapott plazmid, jele pMOG404 (3. ábra) már tartalmazza mind az osmotin gént, mind az NPTII gént, a bal és jobb oldali T-DNS-szekvenciák közé lokalizálva. A pRK2013 plazmid segítségével ezt a bináris vektort Escherichia coli DH5a-ból az Agrobacterium tumefaciens LBA4404 törzsbe mobilizáljuk. Az LBA4404 (pMOG404) transzkonjugánst izoláljuk ebből a keresztezésből, 20 mg/1 rifampicint és 100 mg/1 kanamicint tartalmazó táptalajon.

6. példa

Egy extracelluláris osmotinkódoló pMOG405 vektor konstrukciója

A vad típusú osmotinról leírták, hogy intracellulárisan fordul elő, főleg a növényi sejtek vakuólumaiban [Singh et al., Plánt Physiol., 85, 529-536 (1987)]. Abból a célból, hogy elérjük az osmotin szekrécióját az extracelluláris térbe, egy transzlációs stopkodont építettünk be a vad típusú osmotinnak a pMOG404-en megtalálható cDNS-ébe, a cDNS által kódolt fehétje C-terminálisától számított 20. és 21. kodonja közé. A szakterületen jártas szakemberek számára ismert PCR-technika alkalmazásával a stopkodont úgy állítjuk elő, hogy egy timidin-(T) csoportot építünk be a 694-es és 695-ös nukleotid közé. A nukleotidok sorszámát a szekvencialistán megadott SEQID4-szekvencia alapján adjuk meg. Az így módosított osmotinszekvenciát leellenőrizzük, hogy tartalmaz-e nemkívánatos, a PCR-technika alkalmazása következtében létrejövő mutációkat. Az elmutált cDNS egy olyan osmotint kódol, amelyről hiányzik a vad típusú osmotin mRNS primer transzlációs termékének a 20 C-terminális aminosava. Az így kapott bináris vektor jele pMOG405, a megfelelő Agrobacterium transzkonjugáns jele LBA4404 (pMOG405). Amint az a 8. példában látható, a pMOG405 által kódolt osmotin valóban extracellulárisan halmozódik fel.

7. példa

Transzgenikus növények előállítása

A burgonya (Solanum tuberosum cv bintje) transzformációját az Agrobacterium LBA4404 (pMOG404) és LBA4404 (pMOG405) törzsekkel a Hoekema és munkatársai által leírt módszerrel végezzük [Bio/Technology, 7, 273-278 (1989)].

HU 219 505 Β

A dohány transzformálásához a levélkorongmódszert alkalmazzuk [Horsch et al., Science, 227, 1229-1231 (1985)]. A levélkorongokat együtt tenyésztjük az Agrobaterium LBA4404 (pMOG404) vagy az LBA4404 (pMOG405) törzsekkel, majd ezt követően standard módszerek alkalmazásával 100 mg/ml kanamicint tartalmazó szelekciós táptalajon tenyésztjük. A transzgenikus hajtásokat teljes növényekké regeneráljuk, és vizsgáljuk az osmotin gén expresszióját. Ehhez az elemzéshez az úgynevezett Westem-blot technikát alkalmazzuk, és a patogenezishez kapcsolódó fehéije (PR-S) elleni antitesteket használunk, valamint a Northem-blot technikát alkalmazzuk, próbaként egy osmotin cDNS-fragmentet használva. A Westem-blot elemzés felfedte, hogy nincs különbség a pMOG404 és a pMOG405 által kódolt osmotin méretében, bár a két konstrukcióban az osmotinkódoló régiók 20 kodon hosszúságban eltérnek. Ez azt sugallja, hogy a növényben a vad típusú osmotin C-terminális processzáláson esik át.

8. példa

A pMOG404 és pMOG405 transzgenikus dohánynövények elemzése a transzgenikus termék irányítottsága szempontjából

Abból a célból, hogy kimutassuk az osmotin extracelluláris irányítottságát a pMOG405 transzgenikus dohánynövényekben, a következő kísérletet hajtottuk végre. A pMOG404 transzgenikus növényi vonalak és a pMOG405 transzgenikus növényi vonalak Fl növényeinek leveleit, amelyek az újonnan bevitt osmotin gént expresszálják, valamint a nem transzgenikus növények leveleit használjuk az összes fehérje, valamint az extracelluláris fehéije extrakciójára. Az extracelluláris fehérjék extrakciójához extracelluláris folyadékot gyűjtünk De Wit és Spikman módszerével [Physiol. Plán Pathol., 20, 1-11 (1982)]. Az extracelluláris folyadék izolálása után a visszamaradó levélanyagból is extraháljuk a fehérjéket. A teljes kivonatban (Totál) az extracelluláris folyadékban (EF) és az azokban a levelekben, amelyekből az extracelluláris folyadékot eltávolítottuk (-EF) található fehéijék elemzéséhez az úgynevezett Westem-blot technikát alkalmazzuk, AP20 specifikus antitesteket, vagy a patogenezishez kapcsolt fehéije (PR-S) elleni antitestek felhasználásával. Az 1. táblázatban látható eredmények azt mutatják, hogy a pMOG405 transzgenikus növényekben az osmotin valóban az extracelluláris térbe irányul.

1. táblázat

Az osmotin irányítása az extracelluláris térbe a pMOG405 transzgenikus dohánynövényekben

Növény	Fehéqeminta
Összes	EF	-EF
Nem transzgenikus	-	-	-
pMOG404	+ + + +	-	+ + + +
pMOG405	+ + + +	+ + +	+

-: nincs AP20 +-tői + + ++-ig: növekvő mennyiségű osmotin

9. példa

A gombafertőzéssel szembeni rezisztencia vizsgálata a transzgenikus dohánynövényekben

A Phytophthora nicotianae var. nicotianae (Pnn) gomba egy Oomyceta. Ez egy gyökérpatogén, amelynek többek között a dohány is a gazdanövénye. A növények megfertőződése a levelek hervadásában és/vagy a szár aljának a rothadásában jelentkezik (fekete szár). A dohány végül elpusztul a fertőzéstől.

Körülbelül 1-2 cm átmérőjű levélkorongokat vágunk pMOG404 transzgenikus, vektortranszgenikus és nem transzgenikus dohánynövényekből. A levélkorongokat fejjel lefelé úsztatjuk steril desztillált vizet tartalmazó Petri-csészében. Mindegyik korongra 10 μΐ zoospóraszuszpenziót csöppentünk (5000 spóra/ml). Mindegyik kísérletben háromszor 10 korongot használunk, azaz összesen 20 kontrollkorongot kísérletenként. Körülbelül egy nap elteltével a kezdődő fertőzés első jelei láthatók a kontrollkorongokon. Három nap elteltével a kontroll-levélkorongok teljesen befertőződnek (vízzel átitatódás). A pMOG404 transzgenikus növényekből származó levélkorongok három nap elteltével enyhébb tüneteket mutatnak. A kísérlet eredményei többször reprodukálhatók. Ez a példa azt sugallja, hogy egy intracelluláris osmotin gént konstitutíven expresszáló dohánynövények csökkent érzékenységet mutatnak a Phytophthora nicotianae var. nicotianae (Pnn) gombára, amely a dohánynövények természetes kórokozója.

Ahhoz, hogy a teljes dohánynövénynek a P. nicotianae var. nicotianae gombával szembeni rezisztenciáját megbecsüljük, a következő kísérleteket végezzük. Tíz, az LBA404 (pMOG404) plazmiddal transzformált transzgenikus növényt (olyanokat választunk, amelyek jól expresszálják az osmotin gént), tíz olyan növényt, amelyeket az osmotint nem tartalmazó vektorral transzformáltunk (ezek neve vektortranszgenikus növény), és tíz nem transzformált növényt megfertőzünk egy olyan vizes szuszpenzióval, amely 2xl0⁵ Pnn zoospórát tartalmaz. Ezt a szuszpenziót a szár tövéhez pipettázzuk a talajra. Ezután 100 ml vizet öntünk a szár tövébe. Ezek után megfigyeljük a betegség tüneteinek időbeli kifejlődését. Két-három nap elteltével a kontrollnövények (a nem transzgenikus és vektortranszgenikus növények) a betegség első jeleit mutatják, azaz hervadni kezdenek. A pMOG404 transzgenikus növények közül néhány a betegség tüneteinek lassúbb kifejlődését mutatja. Ennél azonban jobb védelemre van szükség. Az osmotin növénybeli lokalizációjának hatását a következő kísérletben vizsgáltuk.

10. példa

A gombarezisztencia vizsgálata olyan transzgenikus dohánynövényekben, amelyek extracellulárisan expresszálnak osmotint

Az Agrobacterium tumefaciens LBA4404 (pMOG405) segítségével olyan transzgenikus dohánynövényeket állítottunk elő, amelyek a megváltoztatott osmotin gént expresszálják, és ennek eredménye a termelt osmotin irányítása az apoplasztba. Az extracellu12

HU 219 505 Β lárisan kiválasztódó osmotin gént jól expresszáló növényeket, az elemzés módját lásd a 8. példában, megvizsgáltuk, hogy rezisztensek-e a Phytophthora nicotianae var. nicotianae-re (Pnn).

A kísérleteket 10-10 olyan levélkorongon végeztük, amelyeket egy pMOG404 transzgenikus, két pMOG405 transzgenikus és egy nem transzgenikus dohányvonalból nyertünk ki. Három nap elteltével a nem transzgenikus növénnyel (2# vonal), a pMOG404-et jól expresszáló növénnyel (1# vonal) és a pMOG405-öt jól expresszáló két növénnyel (6# és 9# vonal) kapott eredményeket elemezzük. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók.

2. táblázat

Gombarezisztencia vizsgálata transzgenikus és nem transzgenikus dohányvonalakból nyert levélkorongokon, Phytophthora nicotianae-n vizsgálva

Növényvonal	Fertőzött terület
#2	8 korong 100%
	2 korong 60%
pMOG404 #1	7 korong 100%
	3 korong<25%
pMOG405 #6	1 korong 100%
	2 korong 60%
	7 korong <25%
pMOG405 #9	3 korong 100%
	2 korong 60%
	5 korong <25%

A százalékok a P. nicotianae által fertőzött területet fejezik ki, a fertőzés után 3 nappal.

A 2. táblázat eredményei világosan mutatnak egy megerősödött gombaellenes hatást a levélkorongokon, ha az osmotint az extracelluláris térbe irányítjuk, az intracellulárisan lokalizált osmotinhoz viszonyítva. Azt gondoljuk, hogy az itt levélkorongokon igazolt gombarezisztencia megnyilvánul a teljes növényekben is.

A gombarezisztencia növényekben való megbecsléséhez az említett vonalaknak megvizsgáljuk a gombarezisztenciáját, az előző példában leírt módon. Azt gondoljuk hogy a pMOG405 transzgenikus dohánynövények sokkal rezisztensebbek, mint a pMOG404 vektorral transzformált növények.

Az osmotinszerű fehétjékkel végzett, a gombaellenes hatásra vonatkozó megfigyelések alapján azt a következtetést vonjuk le, hogy a gombaellenes hatás akkor érhető el, ha a gombaellenes hatású fehérje magas szinten expresszálódik a növényben, mint például a jelen esetben, a CaMV 35S, azaz egy konstitutív promoter szabályozása alatt.

Azt találtuk továbbá, hogy ha egy intracelluláris gombaellenes hatású fehérje szintézisét az extraceluláris térbe irányítjuk, akkor a gombaellenes hatás jelentős felerősödése figyelhető meg. A legújabb, kitinázokkal és P-l,3-glükanázokkal végzett hasonló vizsgálatok megerősítik ezt a megfigyelést. Még fontosabb, hogy az a megfigyelés, hogy az osmotinszerű fehétjék, amelyek intracelluláris fehérjék, gombaellenes hatást mutatnak, kiegészítik azt a képet, amely egyre teljesebb lesz, és az alábbiakban magyarázunk meg.

Már bizonyos ideje ismert volt, hogy bizonyos kitinázok és glükanázok gombaellenes hatást mutatnak. Néhány növényi kitináz és glükanáz gombaellenes hatásának a növényben való kimutatása (azaz a transzformáit növényekben) nehéznek bizonyult. Ennek az oka most már világos, mivel a legújabb eredmények szerint az említett enzimek közül csak azoknak a fajtáknak van gombaellenes hatásuk, amelyek intracellulárisan fordulnak elő. Ezt most megerősíti a gombaellenes fehérjék egy harmadik csoportja, azaz az osmotinszerű fehérjék, amelyek intracelluláris fehérjék, míg a PR-S, ami nagyon homológ az osmotinszerű fehérjékkel, és a rezisztencia indukciójával termelődik, de amelyik extracelluláris fehérje, nem rendelkezik gombaellenes hatással. A negyedik kategória, az úgynevezett patogenezishez kapcsolódó fehérjék kategóriája (kitinázok, glükanázok és az osmotinszerű fehérjék a másik három csoport) szintén beleillik ebbe a képbe.

Ha azonban nem teszünk ellene, akkor az intracelluláris gombaellenes fehérjék expressziója az említett génekkel transzformált növényekben valószínűleg csak egy nagyon enyhe hatást okoz, mivel ezek a fehérjék nem érik el azt a helyet, ahol a hatásukat ki kellene fejteniük.

Ezekből a megfigyelésekből a következőket vontuk le.

1. Az összes fehérjének, amelyek a rezisztencia indukálásával termelődnek, beleértve legalább a kitinázokat, a glükanázokat és az osmotinszerű fehérjéket, az intracelluláris formája lényegesen magasabb gombaellenes hatást mutat, mint a nekik megfelelő extracelluláris forma. Feltételezhető, hogy a legtöbb, ha nem az összes PR-fehérje-csoport extracelluláris formája alacsony, vagy semmilyen gombaellenes hatást nem mutat.

2. Amint azt a pMOG405 növényekkel végzett kísérleteink mutatják, egy gombaellenes hatású növény előnyös támadási pontja, függetlenül attól, hogy eredetileg a növény melyik részében lokalizálódon, az extracellulációs tér.

3. A gombafertőzés sikeres leküzdésében azoknak az intracelluláris fehérjéknek egy gombaellenes készítményben való használata kifejezetten javasolt, amelyek a rezisztencia indukciója során termelődnek.

4. Ha az a célunk, hogy olyan növényeket kapjunk, amelyek kevésbé érzékenyek a gombákra, akkor az említett növényeket egy olyan nyitott leolvasási kerettel kell transzformálni, amelyik egy olyan intracelluláris gombaellenes hatású fehérjét kódol, amelyik a termelődése során az előnyös támadási pontjára, az extracelluláris térbe irányul.

A fenti kijelentések alapján azonban nem szabad azt a következtetést levonni, hogy az összes olyan intracelluláris fehéije, amelyik a hiperszenzitív válasz során

HU 219 505 Β szintetizálódik, valóban gombaellenes hatással rendelkezik. Ezért a „fordított megközelítés”, azaz az inkább a gombaellenes hatásból, mint az enzimatikus hatásból való kiindulás nagyon hasznos ana, hogy csak azokat az (intracelluláris) fehéqéket válasszuk ki, amelyek valóban rendelkeznek gombaellenes hatással. Ezután ezeknek a fehérjéknek a gombákkal szembeni ellenállásra gyakorolt hatását a növényekben kell megvizsgálni, az említett gombaellenes hatású fehérjét kódoló, nyitott leolvasási kerettel transzformálva egy érzékeny növényt, előnyösen azután, hogy a nyitott leolvasási keretet úgy módosítottuk, hogy biztosítsa az extracelluláris térbe való irányulást.

11. példa

A gombarezisztencia elemzése transzgenikus burgonyanövényekben

A pMOG404 és pMOG405 vektorokkal transzformáit burgonyanövények érzékenységének vizsgálata céljából a 20 legjobb transzgenikus osmotint expresszáló növényt a Phytophthora infestans gomba lxlO⁵ spórájával permetezzük be nedvesedésig. A P. infestans erős patogénje a burgonyanövénynek. Hatására a levelek teljesen elhervadnak, sérül a szár és végül a növény teljesen elpusztul. Kontrollként 20 nem transzformált növényt és 20, az osmotin gént nem tartalmazó vektorral transzformált növényt (vektortranszgenikus növény) permetezünk be azonos mennyiségű spórával. A növényeket 18 °C-on és 95-100%-os légnedvesség mellett növesztjük. A betegség kifejlődését a bepermetezés utáni 7. és 14. napon értékeljük ki oly módon, hogy meghatározzuk a gomba által érintett levélfelület nagyságát. Az érintett levélfelületet az összes megszámlált levelek területének arányában fejezzük ki. Növényenként 8-10 (alsó) levelet számlálunk meg; az egyes növények megszámlált leveleiből átlagot számolunk. Az alábbi, 3. táblázatban az eredmények becslését adjuk meg.

(+ az összes levélfelület 0-25%-a érintett + + 25-50% érintett + + + 50-75% érintett + + + + 75-100% érintett).

3. táblázat

A burgonyanövények becsült érzékenysége a P. infestans gombával szemben

	7. nap
+	+ +	+ + +	+ + + +
Nem transzgenikus	-	-	15±10%	85±10%
V ektortranszgenikus	-	-	15±10%	85±10%
pMOG404-transzgenikus	25±10%	25±10%	20±10%	30±10%
pMOG405-transzgenikus	25±10%	30±10%	30±10%	15±10%
	14. nap
	+	+ +	+ + +	+ +++
Nem transzgenikus			10±10%	90±10%
V ektortranszgenikus			10±10%	90±10%
pMOG404-transzgenikus	20±10%	10±10%	10±10%	60±10%
pMOG405-transzgenikus	20±10%	25±10%	30±10%	25 ±10%

A kísérletben alkalmazott oltóanyaggal a nem transzformáit és a vektorral transzformált növények erősen fertőződnek a 7. napon. A 7. napon a pMOG404 növények közül csak körülbelül a növények 30%-a erősen fertőzött; a pMOG404 növényeknek körülbelül 70%-ánál 55 sokkal lassabban fejlődik ki a fertőzés (+-tól a + + + +ig), mint a kontrollnövényeknél. Az várható, hogy a 14. napon a pMOG404 növényeknek csak 10-50%-a mutatja a fertőzés könnyű vagy közepes (+ vagy + + ) formáját, míg 10-30%-a csak enyhén, vagy egyáltalán nem 60 fertőződik (+). Az extracellulárisan irányított osmotin (azaz a pMOG405 növények) még tovább késlelteti a fertőzés kifejlődését, mint a pMOG404 transzgenikus vonalaknál.

SZEKVENCIALISTA

1. számú szekvencia Szekvencitípus: nukleotid Szekvenciahossz: 34 Szál: kettős Topológia: lineáris

HU 219 505 Β

Molekulatípus: szintetikus Eredet

Organizmus: lucema-mozaikvírus

Klón: Tulajdonságok: lucema-mozaikvírus RNS4

TTTTTATTTT TAATTTTCTT TCAAATACTT CCAG 34

2. számú szekvencia Szekvenciatípus: nukleotid Szekvenciahossz: 32 Szál: egyes

Topológia: lineáris Molekulatípus: szintetikus

Eredet

Organizmus: Klón: 10 Tulajdonságok: osmotin-cDNS-hez homológiával ren delkező PCR-primer

GCCGGATCCA ATTCGGCACA TGGGCAACTT GA 32

3. számú szekvencia Szekvenciatípus: nukleotid Szekvenciahossz: 26 Szál: egyes

Topológia: lineáris Molekulatípus: szintetikus Eredet

Organizmus: Klón: 4. számú szekvencia Szekvenciatípus: nukleotid Szekvenciahossz: 883 Szál: kettős

Topológia: lineáris Molekulatípus: cDNS Eredet

Organizmus: Nicotiana tabacum Klón: pMOG404

Tulajdonságok: osmotin-cDNS-hez homológiával ren- 25 Tulajdonságok: osmotinszerű fehérjét kódoló delkező PCR-primer

GTTTATTACA GCAAGGATCC TGACTT 34

GGATCCAATT CGGCAC

ATG GGC AAC TTG AGA TCT TCT TTT GTT TTC TTC CTC CTT GCC 58

Met Gly Asn Leu Arg Ser Ser Phe Val Phe Phe Leu Leu Ala

TTG GTG ACT TAT ACT TAT GCT GCC ACT ATC GAG GTC CGA AAC 100

Leu Val Thr Tyr Thr Tyr Ala Ala Thr Ile Glu Val Arg Asn

AAC TGT CCG TAC ACC GTT TGG GCG GCG TCG ACA CCC ATA GGC 142

Asn Cys Pro Tyr Thr Val Trp Ala Ala Ser Thr Pro Ile Gly

GGT GGC CGG CGT CTC GAT CGA GGC CAA ACT TGG GTG ATC AAT 184

Gly Gly Arg Arg Leu Asp Arg Gly Gin Thr Trp Val Ile Asn

GCG CCA CGA GGT ACT AAA ATG GCA CGT GTA TGG GGC CGT ACT 226

Ala Pro Arg Gly Thr Lys Met Ala Arg Val Trp Gly Arg Thr

AAT TGT AAC TTC AAT GCT GCT GGT AGG GGT ACG TGC CAA ACC 268

Asn Cys Asn Phe Asn Ala Ala Gly Arg Gly Thr Cys Gin Thr

GGT GAC TGT GGT GGA GTC CTA CAG TGC ACC GGG TGG GGT AAA 310

Gly Asp Cys Gly Gly Val Leu Gin Cys Thr Gly Trp Gly Lys

CCA CCA AAC ACC TTG GCT GAA TAC GCT TTG GAC CAA TTC AGT 352

Pro Pro Asn Thr Leu Ala Glu Tyr Ala Leu Asp Gin Phe Ser

GGT TTA GAT TTC TGG GAC ATT TCT TTA GTT GAT GGA TTC AAC 394

Gly Leu Asp Phe Trp Asp Ile Ser Leu Val Asp Gly Phe Asn

ATT CCG ATG ACT TTC GCC CCG ACT AAC CCT AGT GGA GGG AAA 4 36

Ile Pro Met Thr Phe Ala Pro Thr Asn Pro Ser Gly Gly Lys

TGC CAT GCA ATT CAT TGT ACG GCT AAT ATA AAC GGC GAA TGT 478

Cys His Ala Ile His Cys Thr Ala Asn Ile Asn Gly Glu Cys

CCC CGC GAA CTT AGG GTT CCC GGA GGA TGT AAT AAC CCT TGT 520

Pro Arg Glu Leu Arg Val Pro Gly Gly Cys Asn Asn Pro Cys

ACT ACA TTC GGA GGA CAA CAA TAT TGT TGC ACA CAA GGA CCT 562

Thr Thr Phe Gly Gly Gin Gin Tyr Cys Cys Thr Gin Gly Pro

TGT GGT CCT ACA TTT TTC TCA AAA TTT TTC AAA CAA AGA TGC 604

Cys Gly Pro Thr Phe Phe Ser Lys Phe Phe Lys Gin Arg Cys

CCT GAT GCC TAT AGC TAC CCA CAA GAT GAT CCT ACT AGC ACT 646

Pro Asp Ala Tyr Ser Tyr Pro Gin Asp Asp Pro Thr Ser Thr

TTT ACT TGC CCT GGT GGT AGT ACA AAT TAT AGG GTT ATC TTT 688

HU 219 505 Β

Phe

Thr

Cy s

Pro

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Arg

Val

Ile

Phe

TGT

CCT

AAT

GGT

CAA

GCT

CAC

CCA

AAT

TTT

CCC

TTG

GAA

ATG

730

Cys

Pro

Asn

Gly

Gin

Al a

Hi s

Pro

Asn

Phe

Pro

Leu

Glu

Me t

CCT

GGA

AGT

GAT

GAA

GTG

GCT

AAG

TAG

AGTGGCTATT

767

Pro

Gly

Ser

Asp

Glu

Val

Al a

Lys

TCTGTAATAA GATCACCTTT TGGTCAAATT ATTCTATCGA CACGTTAGTG 817 TAAGACAATC TATTTGACTC GTTTTTATAG TTACGTACTT TGTTTGAAGT 867 GATCAAGTCA GGATCC 883

5. számú szekvencia Szekvenciatípus: nukleotid Szekvenciahossz: 884 Szál: kettős

Topológia: lineáris Molekulatípus: cDNS

Eredet

Organizmus: Nicotiana tabacum Klón: pMOG404

Tulajdonságok: 20 C-terminális aminosav nélküli, os motinszerű fehérjét kódoló

GGATCCAATT CGGCAC

ATG

GGC

AAC

TTG

AGA

TCT

TCT

TTT

GTT

TTC

TTC

CTC

CTT

GCC

58

Me t

Gly

Asn

Leu

Arg

Ser

Ser

Phe

Val

Phe

Phe

Leu

Leu

Al a

TTG

GTG

ACT

TAT

ACT

TAT

GCT

GCC

ACT

ATC

GAG

GTC

CGA

AAC

100

Leu

Val

Thr

Tyr

Thr

Tyr

Al a

Al a

Thr

Ile

Glu

Val

Arg

Asn

AAC

TGT

CCG

TAC

ACC

GTT

TGG

GCG

GCG

TCG

ACA

CCC

ATA

GGC

142

Asn

Cys

Pro

Tyr

Thr

Val

Trp

Al a

Al a

Ser

Thr

Pro

Ile

Gly

GGT

GGC

CGG

CGT

CTC

GAT

CGA

GGC

CAA

ACT

TGG

GTG

ATC

AAT

184

Gly

Gly

Arg

Arg

Leu

Asp

Arg

Gly

Gin

Thr

Trp

Val

Ile

Asn

GCG

CCA

CGA

GGT

ACT

AAA

ATG

GCA

CGT

GTA

TGG

GGC

CGT

ACT

226

Al a

Pro

Arg

Gl y

Thr

Lys

Me t

Al a

Arg

Val

Trp

Gly

Arg

Thr

AAT

TGT

AAC

TTC

AAT

GCT

GCT

GGT

AGG

GGT

ACG

TGC

CAA

ACC

268

Asn

Cys

Asn

Phe

Asn

Al a

Al a

Gly

Arg

Gly

Thr

Cys

Gin

Thr

GGT

GAC

TGT

GGT

GGA

GTC

CTA

CAG

TGC

ACC

GGG

TGG

GGT

AAA

310

Gly

Asp

Cys

Gly

Gly

Val

Leu

Gin

Cy s

Thr

Gly

Trp

Gly

Lys

CCA

CCA

AAC

ACC

TTG

GCT

GAA

TAC

GCT

TTG

GAC

CAA

TTC

AGT

352

Pro

Pro

Asn

Thr

Leu

Al a

Glu

Tyr

Al a

Leu

Asp

Gin

Phe

Ser

GGT

TTA

GAT

TTC

TGG

GAC

ATT

TCT

TTA

GTT

GAT

GGA

TTC

AAC

394

Gly

Leu

As p

Phe

Trp

Asp

Ile

Ser

Leu

Va 1

Asp

Gly

Phe

Asn

ATT

CCG

ATG

ACT

TTC

GCC

CCG

ACT

AAC

CCT

AGT

GGA

GGG

AAA

436

Ile

Pro

Me t

Thr

Phe

Alá

Pro

Thr

Asn

Pro

Ser

Gly

Gly

Lys

TGC

CAT

GCA

ATT

CAT

TGT

ACG

GCT

AAT

ATA

AAC

GGC

GAA

TGT

478

Cy s

Hi s

Al a

Ile

Hi s

Cys

Thr

Al a

Asn

Ile

Asn

Gly

Glu

Cys

CCC

CGC

GAA

CTT

AGG

GTT

CCC

GGA

GGA

TGT

AAT

AAC

CCT

TGT

520

Pro

Arg

Glu

Leu

Arg

Val

Pro

Gly

Gly

Cy s

Asn

Asn

Pro

Cys

ACT

ACA

TTC

GGA

GGA

CAA

CAA

TAT

TGT

TGC

ACA

CAA

GGA

CCT

562

Thr

Thr

Phe

Gly

Gly

Gin

Gin

Tyr

Cys

Cy s

Thr

Gin

Gly

Pro

TGT

GGT

CCT

ACA

TTT

TTC

TCA

AAA

TTT

TTC

AAA

CAA

AGA

TGC

604

Cy s

Gly

Pro

Thr

Phe

Phe

Ser

Lys

Phe

Phe

Lys

Gin

Arg

Cy s

CCT

GAT

GCC

TAT

AGC

TAC

CAA

CAA

GAT

GAT

CCT

ACT

AGC

ACT

646

Pro

Asp

Al a

Tyr

Ser

Tyr

Pro

Gin

Asp

As p

Pro

Thr

Ser

Thr

TTT

ACT

TGC

CCT

GGT

GGT

AGT

ACA

AAT

TAT

AGG

GTT

ATC

TTT

688

Phe

Thr

Cys

Pro

Gly

Gly

Ser

Thr

Asn

Tyr

Arg

Val

Ile

Phe

TGT CCT 694 Cys Pro

TAATGGTCAA GCTCACCCAA ATTTTCCCTT GGAAATGCCT GGAAGTGATG 744 AAGTGGCTAA GTAGAGTGGC TATTTCTGTA ATAAGATCAC CTTTTGGTCA 794 AATTATTCTA TCGACACGTT AGTGTAAGAC AATCTATTTG ACTCGTTTTT 844 ATAGTTACGT ACTTTGTTTG AAGTGATCAA GTCAGGATCC 884

HU 219 505 Β

Claims (32)

1. SZABADALMI IGÉNYPONTOK

   1. Eljárás egy növényből származó intracelluláris fehéijének a növény vagy a növény egy sejtjének extracelluláris terébe való irányítására, ahol az említett intracelluláris fehérje tartalmaz egy C-terminális részt, amely a fehéije intracelluláris lokalizációját biztosítja, azzal jellemezve, hogy az intracelluláris fehéije C-terminális részét kódoló, nyitott leolvasási keret 3'-terminális végét úgy módosítjuk, hogy megelőzzük az intracelluláris fehérje C-terminális rész által biztosított intracelluláris lokalizációját.
2. 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az intracelluláris fehéije egy patogénellenes vagy gombaellenes fehéije.
3. 3. Eljárás egy növényből származó intracelluláris, patogénellenes fehérje patogénellenes hatásának fokozására, azzal jellemezve, hogy az intracelluláris fehérjét az extracelluláris térbe irányítjuk.
4. 4. A 3. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett irányítást az intracelluláris fehérjét kódoló, nyitott leolvasási keret 3’-terminális végének módosításával éljük el.
5. 5. Az 1-4. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az intracelluláris fehérje egy kitináz, p-l,3-glükanáz vagy egy osmotinszerű fehéije.
6. 6. Eljárás egy target peptid extracelluláris átvitelének megakadályozására, azzal jellemezve, hogy expresszálunk egy kiméra peptidet, amelyet az említett target pepiidből és a Gln-Ala-His-Pro-Asn-Phe-ProLeu-Glu-Met-Pro-Gly-Ser-Asp-Glu-Val-Ala-Lys szekvenciával vagy annak egy részével rendelkező C-terminális peptidből állítunk elő.
7. 7. A 6. igénypontban megadott kiméra peptidet kódoló vektor alkalmazása extracelluláris átvitel meggátlására szolgáló eljárásban.
8. 8. Eljárás egy fehérjének, amely természet szerint egy vakuólába irányító szekvenciával rendelkezik a Cterminális végén, amely természet szerint a fehéqét a vakuólába irányítja, egy növény extracelluláris terébe történő kivitelére, azzal jellemezve, hogy

   a) izolálunk egy nyitott leolvasási keretet tartalmazó DNS-szekvenciát, amely az említett fehéqét a C-terminálisán lévő vakuoláris irányítószekvenciával együtt kódolja;

   b) eltávolítjuk a nyílt leolvasási keretből a vakuoláris irányítószekvenciát kódoló DNS-szekvenciát, létrehozva egy módosított DNS-szekvenciát, amely a fehérjét a C-terminális aminosavak nélkül kódolja;

   c) bevisszük a b) lépésben kapott, módosított DNSszekvenciát egy alkalmas növényi expressziós vektorba;

   d) transzformáljuk a c) lépés termékét egy alkalmas növénybe; és

   e) az így kapott növényt megfelelő körülmények között tenyésztjük, miközben a b) lépésben kapott, módosított DNS-szekvencia által kódolt fehéqe kifejeződik és szekretálódik.
9. 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehéqe egy patogenezishez kapcsolt fehéqe az alábbiak közül: kitináz, glükanáz, PR-1 vagy osmotin.
10. 10. A 8. vagy 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben az osmotin fehérje C-terminális 15-20 aminosavát kódoló DNS-szekvenciát távolítjuk el a nyílt leolvasási keretből.
11. 11. A 10. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben az osmotin fehéqe C-terminális 20 aminosavát kódoló DNS-szekvenciát távolítjuk el a nyílt leolvasási keretből.
12. 12. A 11. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 20 C-terminális aminosavat kódoló DNS-szekvenciát a nyílt leolvasási keretből az említett fehéqét kódoló, módosított DNS-szekvencia 3’-terminális végére egy transzlációs stopkodon beépítésével távolítjuk el.
13. 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés terméke a pMOG405.
14. 14. A 9-13. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett osmotin természet szerint a dohányban fordul elő.
15. 15. A 8-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett növény a burgonya- vagy a dohánynövény.
16. 16. Eljárás transzformált növényi anyag előállítására, amely tartalmaz egy génterméket, amely természet szerint egy vakuoláris irányítószekvenciával rendelkezik a C-terminálisán, és a géntermék extracelluláris térbe történő szekretálására, azzal jellemezve, hogy

    a) izolálunk egy DNS-szekvenciát a géntermékfehérjéhez, amely a C-terminálisán egy vakuoláris irányítószekvenciával rendelkezik, és természet szerint a fehérjét a növényi vakuólába irányítja;

    b) eltávolítjuk az említett DNS-szekvenciából a vakuoláris irányítószekvenciát kódoló szekvenciát, létrehozva ezáltal egy módosított DNS-szekvenciát, amely a fehéqét a C-terminális aminosavak nélkül kódolja;

    c) be visszük a b) lépésben kapott, módosított DNSszekvenciát egy alkalmas növényi expressziós vektorba;

    d) transzformáljuk a c) lépés termékét egy alkalmas növénybe; és

    e) tenyésztjük a d) lépésben kapott növényt megfelelő körülmények között, miközben a b) lépésben kapott, módosított DNS-szekvencia által kódolt fehéqe kifejeződik és az extracelluláris térbe szekretálódik; és

    f) szkríneljük az így kapott növényi anyagot, és izoláljuk a pozitív transzformánsokat.
17. 17. A 16. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a fehéqe egy patogenezishez kapcsolt fehéqe az alábbiak közül: kitináz, glükanáz, PR-1 vagy osmotin.
18. 18. A 16. vagy 17. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben az osmotin fehéqe Cterminális 15-20 aminosavát kódoló DNS-szekvenciát távolítjuk el a nyílt leolvasási keretből.
19. 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a b) lépésben az osmotin fehéqe C-terminális 20 aminosavát kódoló DNS-szekvenciát távolítjuk el a nyílt leolvasási keretből.
20. 20. A 19. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a 20 aminosavat kódoló DNS-szekvenciát a nyílt leolvasási keretből az említett fehéijét kódoló, mó17

    HU 219 505 Β dosított DNS-szekvencia 3’-terminális végére egy transzlációs stopkodon beépítésével távolítjuk el.
21. 21. A 20. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a c) lépés terméke a pMOG405.
22. 22. A 17-21. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett osmotin természet szerint a dohányban fordul elő.
23. 23. A 16-22. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az említett növény dohányvagy burgonyanövény.
24. 24. Egy rekombináns polinukleotid alkalmazása a

    8-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárásában, amely tartalmaz:

    (i) egy növényekben működőképes promotert;

    (ii) egy nyílt leolvasási keretet, amely egy intracelluláris, patogenezishez kapcsolt fehéijét kódol az említett promoter szabályozása alatt, ahol a nyílt leolvasási keretet módosítottuk, hogy az intracelluláris patogenezishez kapcsolt fehérjét egy apoplasztba irányítsa, létrehozva egy transzlációs stopkodont a nyílt leolvasási keret 3’-végén, ami az intracelluláris patogenezissel kapcsolt fehéije intracelluláris irányításához szükséges C-terminális aminosavainak delécióját eredményezi; és (iii) egy terminátort, amely működőképesen kapcsolódik az említett nyílt leolvasási kerethez.
25. 25. A 24. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a patogenezishez kapcsolt fehérje egy hidrolitikus enzim az alábbiak közül: kitináz, glükanáz, PR-1 vagy osmotin.
26. 26. A 24. vagy 25. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a módosítást megelőzően a fehérje, amely osmotin, természet szerint a vakuólába irányitódik.
27. 27. A 25. vagy 26. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az osmotin természetesen a dohányban fordul elő.
28. 28. A 24. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a rekombináns polinukleotid tartalmaz:

    (i) egy növényekben működőképes promotert, amely működőképesen kapcsolódik (ii) egy kitináz, glükanáz, osmotin vagy egy PR-1 intracelluláris fehéijét kódoló, nyílt leolvasási kerethez, amelyet módosítottunk egy transzlációs stopkodon létrehozásával a nyílt leolvasási keret 3’-végén, ami az intracelluláris fehéije intracelluláris irányításához szükséges C-terminális aminosavainak delécióját eredményezi, és az intracelluláris fehérjét az extracelluláris térbe irányítja; és (iii) egy transzkripciós, terminációs szabályozórégiót, amely működőképesen kapcsolódik a nyílt leolvasási kerethez.
29. 29. A 28. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az osmotin természet szerint egy növényi sejt vakuólájába irányitódik.
30. 30. A 28. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy az osmotin természet szerint a dohányban fordul elő.
31. 31. Egy 24-30. igénypontok bármelyike szerinti rekombináns polinukleotidot tartalmazó plazmid alkalmazása a 8-23. igénypontok bármelyike szerinti eljárásban.
32. 32. A 31. igénypont szerinti alkalmazás, azzal jellemezve, hogy a plazmid pMOG405.