EA043376B1

EA043376B1 - Составы антитела b7-h4

Info

Publication number: EA043376B1
Application number: EA202091747
Authority: EA
Inventors: Юн Цюань; Чин-Йи Хуан; Харджит Сингх Ганда
Original assignee: Файв Прайм Терапьютикс, Инк.
Priority date: 2018-02-21
Filing date: 2019-02-21
Publication date: 2023-05-22

Description

1. Область техники

В настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антитела к B7H4, и способы применения таких составов.

2. Уровень техники

B7-H4 (также известный как B7x, B7-S1 и VTCN1) представляет собой иммунорегулирующую молекулу, которая разделяет гомологию с другими членами семейства B7, включая PD-L1. Это трансмембранный белок типа I, состоящий из эктодоменов как IgV, так и IgC. В то время как экспрессия B7-H4 в здоровых тканях относительно ограничена на уровне белка, B7-H4 экспрессируется в нескольких солидных опухолях, таких как гинекологические карциномы молочной железы, яичника и эндометрия. Экспрессия B7-H4 в опухолях имеет тенденцию к корреляции с неблагоприятным прогнозом. Рецептор B7H4 неизвестен, но считается, что он экспрессируется на поверхности T-клеток. Считается, что B7-H4 непосредственно ингибирует активность T-клеток.

Учитывая экспрессию и функцию B7-H4, антител, которые специфически связываются с B7-H4, разрабатываются для терапии, включающей модуляцию B7-H4, например, для лечения рака. Соответственно, существует необходимость в фармацевтических композициях, содержащих антитела к B7-H4 и их антигенсвязывающие фрагменты, для введения в таких способах лечения.

3. Сущность изобретения

В настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция состоящая из (i) антитела или его антигенсвязывающего фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, (ii) буфер, выбранный из группы, состоящей из ацетатного или цитратного буфера, и (iii) сахар, при этом pH композиции составляет от около 4,5 до около 6 или от 4,5 до 6.

В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR 20502.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит (i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека и содержит CDR 20502, (ii) буфер и (iii) pH композиции составляет от около 4,5 до около 6 или от 4,5 до 6.

В определенных аспектах CDR 20502 представляют собой CDR, определенные по Кабату, CDR, определенные по Чотиа, или CDR, определенные по AbM. В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательности области, определяющей комплементарность (CDR) 1, вариабельной области тяжелой цепи (VH), CDR2 VH, CDR3 VH и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 5-10 соответственно.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит не более чем 45% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит не более чем 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит от около 35% до около 45% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит от 35% до 45% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах композиция содержит не более чем 20% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит не более чем 20% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит от около 9% до около 18% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит от 9% до 18% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах композиция содержит не более чем 45% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах композиция содержит не более чем 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязы- 1 043376 вающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит не более чем 60% кислых и основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах композиция содержит не более чем 55% кислых и основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах композиция содержит не более чем 45% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах композиция содержит не более чем 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах композиция содержит не более чем 20% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит от около 30% до около 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит от 30% до 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит от около 35% до около 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит от 35% до 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит от около 10% до около 17% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит от 10% до 17% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит от около 11% до около 16% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C. В определенных аспектах фармацевтическая композиция содержит от 11% до 16% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C.

В определенных аспектах композиция содержит не более чем 55% кислых и основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C.

В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит CDR 20502. В определенных аспектах CDR 20502 представляют собой CDR, определенные по Кабату, CDR, определенные по Чотиа, или CDR, определенные по AbM. В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержат последовательности области, определяющей комплементарность (CDR) 1, вариабельной области тяжелой цепи (VH), CDR2 VH, CDR3 VH и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 5-10 соответственно.

В определенных аспектах pH композиции составляет от около 4,5 до около 6 или от 4,5 до 6.

В определенных аспектах композиция содержит буфер. В определенных аспектах буфер представляет собой ацетатный или цитратный буфер.

В определенных аспектах композиция дополнительно содержит сахар. В определенных аспектах сахар выбран из группы, состоящей из сахарозы, сорбита и трегалозы.

В определенных аспектах концентрация буфера составляет от около 15 мМ до около 25 мМ. В определенных аспектах концентрация буфера составляет от 15 до 25 мМ. В определенных аспектах концентрация буфера составляет от около 18 мМ до около 22 мМ. В определенных аспектах концентрация буфера составляет от 18 мМ до 22 мМ. В определенных аспектах концентрация буфера составляет около 20 мМ. В определенных аспектах концентрация буфера составляет 20 мМ.

В определенных аспектах концентрация сахара составляет от около 225 мМ до около 300 мМ. В определенных аспектах концентрация сахара составляет от 225 мМ до 300 мМ. В определенных аспектах концентрация сахара составляет от около 250 мМ до около 290 мМ. В определенных аспектах концентрация сахара составляет от 250 мМ до 290 мМ. В определенных аспектах концентрация сахара составляет около 270 мМ. В определенных аспектах концентрация сахара составляет 270 мМ.

В определенных аспектах концентрация сахара в от около 10 до около 15 раз превышает концентрацию буфера. В определенных аспектах концентрация сахара в от 10 до 15 раз превышает концентрацию буфера. В определенных аспектах концентрация сахара в около 13,5 раз превышает концентрацию буфера. В определенных аспектах концентрация сахара в 13,5 раз превышает концентрацию буфера.

В определенных аспектах композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В определенных аспектах поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат. В определенных аспектах полисорбат представляет собой полисорбат 20. В определенных аспектах концентрация полисорбата составляет от около 0,025% до около 0,075% масса/объем (мас./об.). В определенных аспектах композиция дополнительно содержит поверхностно-активное вещество. В определенных аспектах поверхностно-активное вещество представляет собой полисорбат. В определенных аспектах полисорбат представляет собой полисорбат 20. В определенных аспектах концентрация полисорбата составляет от 0,025% до 0,075% масса/объем (мас./об.). В определенных аспектах концентрация полисорбата составляет от около 0,035% до около 0,065% масса/объем (мас./об.). В определенных аспектах концентрация полисорбата составляет от 0,035% до 0,065% масса/объем (мас./об.). В определенных аспектах концентра- 2 043376 ция полисорбата составляет около 0,005% масса/объем (мас./об.). В определенных аспектах концентрация полисорбата составляет 0,005% масса/объем (мас./об.).

В определенных аспектах концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислые и основные варианты) составляет от около 5 мг/мл до около 30 мг/мл. В определенных аспектах концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислые и основные варианты) составляет от 5 мг/мл до 30 мг/мл. В определенных аспектах концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислые и основные варианты) составляет от около 10 до около 25 мг/мл. В определенных аспектах концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислые и основные варианты) составляет от 10 до 25 мг/мл. В определенных аспектах концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислые и основные варианты) составляет около 20 мг/мл. В определенных аспектах концентрация антитела или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислые и основные варианты) составляет 20 мг/мл.

В определенных аспектах pH композиции составляет от около 5,0 до около 6.0. В определенных аспектах pH композиции составляет от 5,0 до 6,0. В определенных аспектах pH композиции составляет около 5. В определенных аспектах pH композиции составляет 5. В определенных аспектах pH композиции составляет около 5,5. В определенных аспектах pH композиции составляет 5,5.

В определенных аспектах композиция представляет собой жидкость. В определенных аспектах композиция предназначена для парентерального введения. В определенных аспектах композиция предназначена для внутривенного введения. В определенных аспектах буфер представляет собой ацетатный буфер, а вспомогательное вещество представляет собой сахарозу. В определенных аспектах композиция содержит около 20 мМ ацетата, около 270 мМ сахарозы, около 20 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и около 0,05% полисорбата 20, причем pH композиции составляет около 5,0. В определенных аспектах композиция содержит концентрацию сахарозы, которая около в 13,5 раза превышает концентрацию ацетата, около 20 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента и около 0,05% полисорбата 20, причем pH композиции составляет около 5,0. В определенных аспектах композиция содержит 20 мМ ацетата, 270 мМ сахарозы, 20 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и 0,05% полисорбата 20, причем pH композиции составляет 5,0. В определенных аспектах композиция содержит концентрацию сахарозы, которая в 13,5 раза превышает концентрацию ацетата, 20 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и 0,05% полисорбата 20, причем pH композиции составляет 5,0.

В определенных аспектах буфер представляет собой цитратный буфер, а вспомогательное вещество представляет собой сахарозу. В определенных аспектах композиция содержит около 20 мМ цитрата, около 270 мМ сахарозы, около 20 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и около 0,05% полисорбата 20, причем pH композиции составляет около 5,5. В определенных аспектах композиция содержит концентрацию сахарозы, которая в около 13,5 раза превышает концентрацию цитрата, около 20 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и около 0,05% полисорбата 20, причем pH композиции составляет около 5,5. В определенных аспектах композиция содержит 20 мМ цитрата, 270 мМ сахарозы, 20 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и 0,05% полисорбата 20, причем pH композиции составляет 5,5. В определенных аспектах композиция содержит концентрацию сахарозы, которая в 13,5 раза превышает концентрацию цитрата, 20 мг/мл антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и 0,05% полисорбата 20, причем pH композиции составляет 5,5.

В определенных аспектах антитело содержит VH, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 11, и/или VL, содержащий аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 12. В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22.

В определенных аспектах по меньшей мере 95% антител или их антигенсвязывающих фрагментов в композиции являются афукозилированными. В определенных аспектах фукозилирование в композиции является необнаруживаемым.

В определенных аспектах композиция содержит полноразмерное антитело.

В определенных аспектах композиция содержит антигенсвязывающий фрагмент. В определенных аспектах антигенсвязывающий фрагмент содержит Fab, Fab', F(ab')₂, одноцепочечный Fv (scFv), дисульфидносвязанный Fv, V-NAR домен, IgNar, интратело, IgGACH2, миниантитело, F(ab')₃, тетратело, триатело, диатело, однодоменное антитело, DVD-Ig, Fcab, mAb², (scFv)₂ или scFv-Fc.

В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с B7-H4 яванского макака. В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с B7-H4 крысы. В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с B7-H4 мыши.

В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент специфически связывается с IgV доменом B7-H4 человека.

В определенных аспектах pI антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет около

- 3 043376

8,2. В определенных аспектах pI антитела или его антигенсвязывающего фрагмента составляет 8,2.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция состоит из (i) антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, (ii) около 20 мМ ацетата, (iii) около 270 мМ сахарозы и (iv) около 0,05% масса/объем полисорбата 20, причем pH композиции составляет около 5,0. В определенных аспектах фармацевтическая композиция состоит из (i) антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, (ii) 20 мМ ацетата, (iii) 270 мМ сахарозы и (iv) 0,05% масса/объем полисорбата 20, причем pH композиции составляет 5,0.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция состоит из (i) антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, (ii) около 20 мМ цитрата, (iii) около 270 мМ сахарозы и (iv) около 0,05% масса/объем полисорбата 20, причем pH композиции составляет около 5,5. В определенных аспектах фармацевтическая композиция состоит из (i) антитела, содержащего тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 21, и/или легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность, представленную в SEQ ID NO: 22, (ii) 20 мМ цитрата, (iii) 270 мМ сахарозы и (iv) 0,05% масса/объем полисорбата 20, причем pH композиции составляет 5,5.

В определенных аспектах шприц или флакон содержит фармацевтическую композицию, представленную в настоящем документе.

В определенных аспектах способ лечения рака, экспрессирующего B7-H4 у субъекта, включает введение субъекту фармацевтической композиции, представленной в настоящем документе. В определенных аспектах рак представляет собой солидную опухоль. В определенных аспектах рак выбран из группы, состоящей из рака молочной железы, протоковой карциномы, рака эндометрия, рака яичников, немелкоклеточного рака легких, рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака почки и рака мочевого пузыря. В определенных аспектах рак молочной железы представляет собой трижды негативный рак молочной железы или положительный на рецептор гормона рак молочной железы. В определенных аспектах немелкоклеточный рак легких представляет собой плоскоклеточную карциному.

В определенных аспектах субъект представляет собой человека.

В определенных аспектах фармацевтическая композиция вводится парентерально. В определенных аспектах фармацевтическая композиция вводится внутривенно.

4. Краткое описание графических материалов

На фиг. 1 представлена температура развертывания (Tm1) B7-H4 антитела 20502 (афукозилированное) при различных условиях pH, измеренных с помощью системы UNit. (См. пример 3.)

На фиг. 2 представлено влияние pH буфера на образование агрегатов антитела к B7-H4 20502 (афукозилированное) при 40°C, как определено с помощью эксклюзионной высокоэффективной жидкостной хроматографии (эксклюзионная ВЭЖХ). Состав для каждого значения pH приведен в табл. 13. Процент высокомолекулярных частиц (BMM) составлял около 0 при T0 для всех протестированных значений pH. (См. пример 3.)

На фиг. 3 представлено влияние pH буфера на образование фрагмента при 40°C, как определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. Состав для каждого значения pH приведен в табл. 13. Процент низкомолекулярных частиц (HMM) составлял около 0 при T0 для всех протестированных pH. (См. пример 3.)

На фиг. 4 представлено влияние pH буфера на образование агрегатов (как определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) при 40°C в составах, содержащих 20 мМ цитрата, 270 мМ сахарозы и 0,05% полисорбата 20 (PS20). (См. пример 4.)

На фиг. 5 представлено влияние pH буфера на образование фрагмента (как определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) при 40°C в составах, содержащих 20 мМ цитрата, 270 мМ сахарозы и 0,05% PS20. Процент HMM составлял около 0 при T0 для всех протестированных pH. (См. пример 4.)

На фиг. 6 представлено влияние pH буфера на кислотные варианты (как определено с помощью изоэлектрического фокусирования под визуализационным контролем (iCE)) при 40°C. (См. пример 4.)

На фиг. 7 представлено влияние типов буферов на образование агрегатов (как определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) при 40°C. (См. пример 5.)

На фиг. 8 представлено влияние типов буферов на образование фрагментов (как определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) при 40°C. (См. пример 5.)

На фиг. 9 представлено влияние типов буферов на образование кислых вариантов (как определено с помощью iCE) при 40°C. (См. пример 5.)

На фиг. 10 представлено влияние типов буферов на образование основных вариантов (как определено с помощью iCE) при 40°C. (См. пример 5.)

На фиг. 11 представлено влияние вспомогательных веществ на образование агрегатов (как определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) при 40°C. (См. пример 6.)

На фиг. 12 представлено влияние вспомогательных веществ на образование фрагментов (как опре- 4 043376 делено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) при 40°C. (См. пример 6.)

На фиг. 13 представлено влияние вспомогательных веществ на кислотные варианты (как определено с помощью iCE) при 40°C. (См. пример 6.)

На фиг. 14 представлено влияние вспомогательных веществ на основные варианты (как определено с помощью iCE) при 40°C. (См. пример 6.)

На фиг. 15 представлен профиль дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) 20502 (афукозилированное) в выбранном составе. (См. пример 6.)

5. Подробное описание сущности изобретения

В настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, которые специфически связываются с B7-H4 человека. Фармацевтические композиции могут быть стабильными, например, в условиях длительного хранения, при повторяющихся циклах замораживания-оттаивания (например, по меньшей мере 5 циклов) и/или при перемешивания. Как указано в настоящем документе, фармацевтическая композиция, содержащая антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент, может иметь pH от около 4,5 до около 6, антитело к B7H4 или его антигенсвязывающий фрагмент (например, в концентрации от около 5 до около 25 мг/мл), буфер (включая, но не ограничиваясь этим, ацетат или цитрат), вспомогательное вещество (включая, но не ограничиваясь этим, сахарозу, трегалозу и сорбит) и/или поверхностно-активное вещество (включая, но не ограничиваясь этим, полисорбат, например, полисорбат 20 (PS20)).

В конкретном варианте осуществления в настоящем документе предлагается жидкая водная фармацевтическая композиция, содержащая 20 мг/мл антитела к B7-H4 (например, афукозилированное антитело 20502) в 20 мМ ацетата, 270 мМ сахарозы и 0,05% PS20 с pH 5,0. В другом варианте осуществления в настоящем документе предлагается жидкая водная фармацевтическая композиция, содержащая 20 мг/мл антитела к B7-H4 (например, афукозилированное антитело 20502) в 20 мМ цитрата, 270 мМ сахарозы и 0,05% PS20 с pH 5,5.

Фармацевтические композиции, представленные в настоящем документе, могут быть полезны для лечения состояний, таких как рак.

1. Терминология.

Термин B7-H4, в контексте настоящего документа, относится к полипептидам B7-H4 млекопитающих, включая, но не ограничиваясь этим, нативные полипептиды B7-H4 и изоформы полипептидов B7-H4. B7-H4 охватывает полноразмерные непроцессированные полипептиды B7-H4, а также формы полипептидов B7-H4, которые возникают в результате процессинга внутри клетки. Полинуклеотид B7H4, нуклеотид B7-H4 или нуклеиновая кислота B7-H4 относится к полинуклеотиду, кодирующему B7-H4.

Термин антитело означает молекулу иммуноглобулина, которая распознает и специфически связывается с мишенью, такой как белок, полипептид, пептид, углевод, полинуклеотид, липид или комбинации вышеуказанного по меньшей мере через один сайт распознавания антигена в вариабельной области молекулы иммуноглобулина. Термин антитело, в контексте настоящего документа, охватывает интактные поликлональные антитела, интактные моноклональные антитела, химерные антитела, гуманизированные антитела, антитела человека, слитые белки, содержащие антитело, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, при условии, что антитела проявляют желаемую биологическую активность. Антитело может относиться к любому из пяти основных классов иммуноглобулинов: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, или их подклассов (изотипов) (например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 и IgA2) на основании идентичности их константных доменов тяжелой цепи, называемых альфа, дельта, эпсилон, гамма и мю соответственно. Различные классы иммуноглобулинов имеют отличные и хорошо известные структуры субъединиц, и трехмерные конфигурации. Антитела могут быть голыми или конъюгированы с другими молекулами, такими как токсины, радиоизотопы и т.д.

Термин фрагмент антитела относится к части интактного антитела. Антигенсвязывающий фрагмент, антигенсвязывающий домен или антигенсвязывающая область относится к части интактного антитела, которая связывается с антигеном. Антигенсвязывающий фрагмент может содержать антигенный участок распознавания интактного антитела (например, определяющие комплементарность области (CDR), достаточные для специфического связывания антигена). Примеры антигенсвязывающих фрагментов антител включают, но не ограничиваются ими, фрагменты Fab, Fab', F(ab')₂ и Fv, линейные антитела и одноцепочечные антитела. Антигенсвязывающий фрагмент антитела может быть получен из любых видов животных, таких как грызуны (например, мышь, крыса или хомяк) и человека, или может быть получен искусственно.

Термины антитело к B7-H4 и антитело, которое связывается с B7-H4 относятся к антителу, которое способно специфически связываться с B7-H4 с достаточной аффинностью, так что антитело может быть использовано как диагностический и/или терапевтический агент для нацеливания на B7-H4. Термины специфически связывающий, иммуноспецифически связывающий, иммуноспецифически распознающий и специфически распознающий, в контексте настоящего документа, являются аналогичными терминами в контексте антител или их антигенсвязывающих фрагментов. Эти термины указывают, что антитело или его антигенсвязывающий фрагмент связывается с эпитопом через его антигенсвязывающий

- 5 043376 домен и что связывание влечет за собой некоторую комплементарность между антигенсвязывающим доменом и эпитопом. Соответственно, антитело, которое специфически связывается с B7-H4 человека (SEQ ID NO: 1), может также связываться с B7-H4 из других видов (например, B7-H4 яванского макака, мыши и/или крысы) и/или B7-H4 белком, продуцируемые из других аллелей человека, но степень связывания с несвязанным белком, не относящимся к B7-H4 (например, другими членами семейства белков B7, такими как PD-L1), составляет менее чем около 10% связывания антитела с B7-H4, как измерено, например, радиоиммуноанализом (RIA). В конкретном варианте осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент для применения в составе, представленном в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека, яванского макака, мыши и крысы.

Моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к популяции гомогенного антитела или антигенсвязывающего фрагмента, вовлеченного в высокоспецифичное распознавание и связывание одной антигенной детерминанты или эпитопа. Это отличается от поликлональных антител, которые обычно включают разные антитела, направленные против разных антигенных детерминант. Термин моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент охватывает как интактные, так и полноразмерные моноклональные антитела, а также фрагменты антител (такие как Fab, Fab', F(ab')₂, Fv), одноцепочечные (scFv) мутанты, слитые белки, содержащие часть антитела, и любую другую модифицированную молекулу иммуноглобулина, содержащую участок распознавания. Кроме того, моноклональное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к таким антителам и их антигенсвязывающим фрагментам, полученным любым числом способов, включая, но не ограничиваясь ими, гибридомы, фаговый отбор, рекомбинантная экспрессия и трансгенные животные.

Термины вариабельная область или вариабельный домен, в контексте настоящего документа, используются взаимозаменяемо и являются общими в данной области техники. Вариабельная область обычно относится к части антитела, обычно к части легкой или тяжелой цепи, обычно к аминоконцу от 110 до 120 аминокислот или от 110 до 125 аминокислот в зрелой тяжелой цепи и от около 90 до 115 аминокислот в зрелой легкой цепи, которые различаются по последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности конкретного антитела к его конкретному антигену. Изменчивость в последовательности сконцентрирована в тех областях, которые называются областями, определяющими комплементарность (CDR), в то время как более высоко консервативные области в вариабельном домене называются каркасными областями (FR). Не желая быть связанными каким-либо конкретным механизмом или теорией, полагают, что CDR легкой и тяжелой цепей несут основную ответственность за взаимодействие и специфичность антитела с антигеном. В определенных вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область человека. В некоторых вариантах осуществления вариабельная область включает CDR грызунов или мыши, и каркасные области человека (FR). В конкретных вариантах осуществления вариабельная область представляет собой вариабельную область приматов (например, приматов, не являющихся человеком). В некоторых вариантах осуществления вариабельная область включает CDR грызунов или мыши, и каркасные области приматов (FR).

Термины VL и домен VL используются взаимозаменяемо для обозначения вариабельной области легкой цепи антитела.

Термины VH и домен VH используются взаимозаменяемо для обозначения вариабельной области тяжелой цепи антитела.

Термин нумерация по Кабат и подобные термины известны в данной области техники и относятся к системе нумерации аминокислотных остатков в вариабельных областях тяжелой и легкой цепи антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента. В определенных аспектах CDR могут быть определены в соответствии с системой нумерации по Кабат (см., например, Kabat EA & Wu TT (1971) Ann NY Acad Sci 190: 382-391 and Kabat EA et al., (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NTH Publication No. 91-3242). Используя систему нумерации по Кабат, CDR в молекуле тяжелой цепи антитела обычно присутствуют в положениях аминокислот от 31 до 35, которые необязательно могут включать одну или две дополнительные аминокислоты, следующие за 35 (упоминается в схеме нумерации по Кабат как 35A и 35B) (CDR1), положения аминокислот от 50 до 65 (CDR2) и положения аминокислот от 95 до 102 (CDR3). Используя систему нумерации по Кабат, CDR в молекуле легкой цепи антитела обычно присутствуют в положениях аминокислот 24-34 (CDR1), положениях аминокислот 50-56 (CDR2) и положениях аминокислот 89-97 (CDR3). В конкретном варианте осуществления CDR антител, описанных в настоящем документе, были определены в соответствии со схемой нумерации по Кабат.

Система нумерации Чотиа ссылается вместо этого на расположение структурных петель (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)). Конец петли CDR-H1 по Чотиа при нумерации согласно системе нумерации по Кабату варьируется между H32 и H34 в зависимости от длины петли (это связано с тем, что в схеме нумерации по Кабат в H35A и H35B размещаются вставки; если ни 35A, ни 35B не присутствуют, петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, петля заканчивается на 33; если присутствуют оба 35A и 35B, петля заканчивается на 34). Гипервариабельные области AbM представляют собой компромисс между CDR по Кабат и структурными петлями по Чотиа, и используются программным обеспечением Oxford Molecular для моделирования антител AbM.

- 6 043376

Петля	По Кабат	АЬМ	По Чотиа
L1	L24-L34	L24-L34	L24-L34
L2	L50-L56	L50-L56	L50-L56
L3	L89-L97	L89-L97	L89-L97
Н1	Н31-Н35В	Н26-Н35В	Н26-Н32..34
		(Нумерация Кабат)
Н1	Н31-Н35	Н26-Н35	Н26-Н32
		(Нумерация	Чотиа)
Н2	Н50-Н65	Н50-Н58	Н52-Н56
НЗ	Н95-Н102	Н95-Н102	Н95-Н102

Термин константная область и константный домен, в контексте настоящего документа, являются взаимозаменяемыми и имеют общие значения в данной области техники. Константная область представляет собой часть антитела, например, карбоксильную концевую часть легкой и/или тяжелой цепи, которая не участвует непосредственно в связывании антитела с антигеном, но которая может проявлять различные эффекторные функции, такие как взаимодействие с Fc-рецептором. Константная область молекулы иммуноглобулина обычно имеет более консервативную аминокислотную последовательность относительно вариабельного домена иммуноглобулина. В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит константную область или ее часть, достаточную для антителозависимой клеточноопосредованной цитотоксичности (ADCC).

Термин тяжелая цепь, в контексте настоящего документа, при использовании в отношении антитела может относиться к любому отдельному типу, например, альфа (α), дельта (δ), эпсилон (ε), гамма (γ) и мю (μ), на основе аминокислотной последовательности константного домена, которая приводит к классам антител IgA, IgD, IgE, IgG и IgM соответственно, включая подклассы IgG, например, IgG1, IgG2, IgG3 и IgG4. Аминокислотные последовательности тяжелой цепи хорошо известны в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления тяжелая цепь представляет собой тяжелую цепь человека.

Термин легкая цепь, в контексте настоящего документа, при использовании в отношении антитела может относиться к любому другому типу, например, каппа (к) или лямбда (λ) на основе аминокислотной последовательности константных доменов. Аминокислотные последовательности легкой цепи хорошо известны в данной области техники. В конкретных вариантах осуществления легкая цепь представляет собой легкую цепь человека.

Термин химерные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты относятся к антителам или их антигенсвязывающим фрагментам, причем аминокислотная последовательность происходит от двух или более видов. Как правило, вариабельная область как легкой, так и тяжелой цепей соответствует вариабельной области антител или их антигенсвязывающих фрагментов, полученных от одного вида млекопитающих (например, мыши, крысы, кролика и т. д.) с желаемой специфичностью, аффинностью и способностью, в то время как константные области гомологичны последовательностям антител или их антигенсвязывающих фрагментов, полученных от другого (обычно человека), чтобы избежать вызывания иммунного ответа у этого вида.

Термин гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент относится к формам нечеловеческих (например, мышиных) антител или антигенсвязывающих фрагментов, которые представляют собой специфические цепи иммуноглобулинов, химерные иммуноглобулины или их фрагменты, которые содержат минимальное количество нечеловеческой последовательности (например, мыши). Как правило, гуманизированные антитела или их антигенсвязывающие фрагменты представляют собой иммуноглобулины человека, в которых остатки из комплементарной определяющей области (CDR) заменены остатками из CDR нечеловеческого вида (например, мыши, крысы, кролика, хомяка), которые имеют желаемую специфичность, аффинность и способность (привитые CDR) (Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-327 (1988); Verhoeyen et al., Science 239:1534-1536 (1988)). В некоторых случаях определенные остатки каркасной области Fv (FR) иммуноглобулина человека заменяются соответствующими остатками в антителе или фрагменте вида, не принадлежащему к человеку, который обладает желаемой специфичностью, аффинностью и способностью. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть дополнительно модифицированы путем замены дополнительных остатков либо в каркасной области Fv, и/или в остатках CDR нечеловеческого происхождения для уточнения и оптимизации специфичности антитела, его антигенсвязывающего фрагмента, аффинности и/или способности. В общем, гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент будет содержать вариабельные домены, содержащие все или по существу все области CDR, которые соответствуют иммуноглобулину, не относящемуся к человеку, тогда как все или по су

- 7 043376 ществу все области FR являются таковыми из консенсусной последовательности иммуноглобулина человека. Гуманизированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент также могут содержать по меньшей мере часть константной области или домена иммуноглобулина (Fc), обычно иммуноглобулина человека. Примеры способов, используемые для получения гуманизированных антител, описаны в патенте США № 5225539; Roguska et al., Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 91(3):969-973 (1994), и Roguska et al., Protein Eng. 9(10):895-904 (1996). В некоторых вариантах осуществления гуманизированное антитело представляет собой антитело с измененной поверхностью.

Термин антитело человека или его антигенсвязывающий фрагмент означает антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, имеющий аминокислотную последовательность, полученную из генного локуса иммуноглобулина человека, где такое антитело или антигенсвязывающий фрагмент получают с использованием любого способа, известного в данной области техники. Данное определение антитела человека или его антигенсвязывающего фрагмента включает интактные или полноразмерные антитела и их фрагменты.

Афукозилированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, или антитело, или его антигенсвязывающий фрагмент, лишенные фукозы, относится к антителу изотипа IgG1 или IgG3, или его антигенсвязывающему фрагменту, в котором отсутствует гликозилирование константной области фукозы. Гликозилирование IgG1 или IgG3 человека происходит по Asn297 в виде гликозилирования олигосахаридным диантеннарным комплексом фукозы, оканчивающимся после 2 остатков Gal. В некоторых вариантах осуществления афукозилированное антитело лишено фукозы по Asn297. Эти структуры обозначены как остатки гликана G0, Gl (a 1,6 или 1,3) или G2 в зависимости от количества концевых остатков Gal. См., например, Raju, T. S., BioProcess Int. 1: 44-53 (2003). Гликозилирование типа CHO антитела Fc описано, например, в Routier, F. FL, Glycoconjugate J. 14: 201-207 (1997).

Способы измерения количества фукозы включают любые способы, известные в данной области техники. Для целей настоящего изобретения фукозу обнаруживают способом, описанным в Примере 1 WO 2015/017600, который полностью включен в настоящее описание посредством ссылки. Вкратце, анализ гликанов осуществляют путем высвобождения гликанов из антитела (например, путем ферментативного высвобождения), маркировки гликанов антраниловой кислотой (2-AA), а затем очистки меченых гликанов. Для разделения гликанов и измерения относительного количества каждого гликана в антителе используют ВЭЖХ с нормальной фазой с флуоресцентным детектированием. Гликаны могут быть положительно идентифицированы с отсутствием или включением фукозы с помощью масс-спектрометрии. В некоторых вариантах осуществления фукоза является необнаруживаемой в композиции, содержащей множество афукозилированных антител или их антигенсвязывающих фрагментов. В некоторых вариантах осуществления афукозилированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает повышенной активностью ADCC, что может быть измерено с помощью анализа, приведенного в Примере 12 в настоящем документе. В некоторых вариантах осуществления афукозилированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает повышенной аффинностью к Fc-гамма RIIIA. В некоторых вариантах осуществления афукозилированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает повышенной аффинностью к Fc-гамма RIIIA(V158). В некоторых вариантах осуществления афукозилированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает повышенной аффинностью к Fcгамма RIIIA(F158). Сродство к Fc-гамма RIIIA или его аллелям можно измерить с помощью анализа, приведенного в Примере 10 в настоящем документе.

Аффинность связывания обычно относится к силе общей суммы нековалентных взаимодействий между одним сайтом связывания молекулы (например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом) и его партнером связывания (например, антигеном). Если не указано иное, в контексте настоящего документа, аффинность связывания относится к внутренней аффинности связывания, которая отражает взаимодействие 1:1 между членами пары связывания (например, антителом или его антигенсвязывающим фрагментом и антигеном). Сродство молекулы X к ее партнеру Y обычно может быть представлено константой диссоциации (KD). Сродство может быть измерено и/или выражено несколькими способами, известными в данной области техники, включая, но не ограничиваясь этим, константу равновесной диссоциации (KD) и константу равновесной ассоциации (KA). KD вычисляется из отношения k_off/k_on, тогда как KA вычисляется из отношения k_on/k_off. k_on относится к константе скорости ассоциации, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном, а ko_ff относится к диссоциации, например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента с антигеном, k_on and k_off могут быть определены способами, известными специалисту в данной области техники, такими как BIAcore® или KinExA.

Термин эпитоп, в контексте настоящего документа, является термином в данной области техники и относится к локализованной области антигена, с которой антитело или его антигенсвязывающий фрагмент могут специфически связываться. Эпитоп может представлять собой, например, смежные аминокислоты полипептида (линейный или непрерывный эпитоп) или эпитоп, например, может объединяться из двух или более несмежных областей полипептида или полипептидов (конформационных, нелинейных, прерывистых или несмежных эпитопов). В некоторых вариантах осуществления эпитоп, с которым специфически связывается антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, может быть определен, напри

- 8 043376 мер, с помощью ЯМР-спектроскопии, исследований рентгеновской дифракционной кристаллографии, анализов ИФА, обмена водород/дейтерий в сочетании с масс-спектрометрией (например, жидкостной хроматографии с масс-спектрометрией с электрораспылением), анализов на основе олигопептидного сканирования и/или мутагенезного картирования (например, картирование сайт-направленного мутагенеза). Для рентгеновской кристаллографии, кристаллизация может быть выполнена с использованием любого из известных в данной области техники способов (например, Giege R et al., (1994) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4): 339-350; McPherson A (1990) Eur J Biochem 189: 1-23; Chayen NE (1997) Structure 5: 1269-1274; McPherson A (1976) J Biol Chem 251: 6300-6303). Кристаллы антитело/его антигенсвязывающий фрагмент: антиген могут быть изучены с использованием хорошо известных способов дифракции рентгеновских лучей и могут быть уточнены с использованием компьютерного программного обеспечения, такого как X-PLOR (Yale University, 1992, распространяется Molecular Simulations, Inc.; см., например, Meth Enzymol (1985) volumes 114 & 115, eds Wyckoff HW et al.,; U.S. 2004/0014194), и BUSTER (Bricogne G (1993) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1): 37-60; Bricogne G (1997) Meth Enzymol 276A: 361-423, ed Carter CW; Roversi P et al., (2000) Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10): 13161323). Исследования мутагенезного картирования могут быть выполнены с использованием любого способа, известного специалисту в данной области техники. См., например, Champe M et al., (1995) J Biol Chem 270: 1388-1394 и Cunningham BC & Wells JA (1989) Science 244: 1081-1085 для описания способов мутагенеза, включая способы аланин-сканирующего мутагенеза.

Полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция, которые выделены, представляет собой полипептид, антитело, полинуклеотид, вектор, клетку или композицию, которая находится в форме, не встречающейся в природе. Выделенные полипептиды, антитела, полинуклеотиды, векторы, клетка или композиции включают те, которые были очищены до такой степени, что они больше не присутствуют в той форме, в которой они находятся в природе. В некоторых вариантах осуществления выделенные антитело, полинуклеотид, вектор, клетка или композиция являются по существу чистой. Термин по существу чистый, в контексте настоящего документа, относится к материалу, который имеет чистоту по меньшей мере 50% (т.е., не содержит загрязнений), чистоту по меньшей мере 90%, чистоту по меньшей мере 95%, чистоту по меньшей мере 98% или чистоту по меньшей мере 99%.

Термины полипептид, пептид и белок используются в настоящем документе взаимозаменяемо для обозначения полимеров аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может содержать модифицированные аминокислоты, и он может быть разделен не аминокислотами. Кроме того, указанные термины включают аминокислотный полимер, который был модифицирован природным путем или путем вмешательства; например, образованием дисульфидных связей, гликозилированием, липидацией, ацетилированием, фосфорилированием или любыми другими манипуляциями, или модификациями, такие как конъюгация с меченым компонентом. В определение также включены, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, неприродные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Понятно, что поскольку полипептиды по настоящему изобретению основаны на антителах, в некоторых вариантах осуществления полипептиды могут встречаться в виде отдельных цепей или связанных цепей.

Термин клетка-хозяин, в контексте настоящего документа, может быть любым типом клеток, например, первичной клеткой, клеткой в культуре, или клеткой из клеточной линии. В конкретных вариантах осуществления термин клетка-хозяин относится к клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, и потомству или потенциальному потомству такой клетки. Потомство такой клетки может не быть идентичным родительской клетке, трансфицированной молекулой нуклеиновой кислоты, например, из-за мутаций или влияния окружающей среды, которые могут произойти в последующих поколениях или интеграции молекулы нуклеиновой кислоты в геном клетки-хозяина.

Термин фармацевтический состав или фармацевтическая композиция относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет биологической активности активного ингредиента быть эффективной, и который не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому будет вводится состав. Состав может быть стерильным.

Термин лекарственное средство относится к готовой лекарственной форме, например, к жидкому составу, содержащему действующее вещество, как правило, но не обязательно, в сочетании с одним или более другими ингредиентами.

Термин действующее вещество относится к активному ингредиенту, например антителу к B7-H4 или его антигенсвязывающему фрагменту (например, афукозилированному антителу 20502), который предназначен для обеспечения фармакологической или биологической активности или другого прямого эффекта в диагностике, излечении, смягчении, лечении или профилактики заболевания, но не включает промежуточные соединения, используемые при синтезе такого ингредиента.

Термин буфер, в контексте настоящего документа, относится к компоненту в растворе, который позволяет раствору противостоять изменениям pH b. Буферы включают, например, ацетатный, цитратный, сукцинатный и гистидиновый буферы.

Стабильный состав представляет собой состав, в котором активный ингредиент (например, антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент) по существу сохраняет свою физическую стой

- 9 043376 кость и/или химическую стабильность, и/или биологическую активность при хранении. Стабильность может быть измерена при выбранных условиях (например, при температуре) в течение выбранного периода времени. Составы, представленные в настоящем документе, могут быть стабильными при комнатной температуре (около 25°C) в течение по меньшей мере 6 месяцев и/или стабильными при около 2-8°C в течение по меньшей мере 1 года. Составы, представленные в настоящем документе, также могут быть стабильными после замораживания (например, до -70°C) и оттаивания состава, далее называемых цикл замораживания/оттаивания. Составы, представленные в настоящем документе, также могут быть стабильными после перемешивания.

Термины вводить, вводимый, введение и тому подобное, используемые в настоящем документе, относятся к способам, которые могут использоваться для обеспечения доставки лекарственного средства, например, антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента в желаемый участок биологического действия (например, внутривенное введение). Способ введения, которые можно применять с агентами и способами, описанными в настоящем документе, можно найти, например, в Goodman and Gilman, The Pharmacological Basis of Therapeutics, current edition, Pergamon; и Remington's, Pharmaceutical Sciences, current edition, Mack Publishing Co., Easton, Pa.

В контексте настоящего документа термины субъект и пациент употребляются взаимозаменяемо. Субъектом может быть животное. В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой млекопитающее, такое как отличное от человека животное (например, корова, свинья, лошадь, кошка, собака, крыса, мышь, обезьяна или другой примат, и т.д.). В некоторых вариантах осуществления субъект представляет собой яванского макака. В некоторых вариантах осуществления изобретения субъект представляет собой человека.

Термин терапевтически эффективное количество относится к количеству лекарственного средства, например, антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента, эффективного для лечения заболевания или расстройства у субъекта. В случае рака терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшить количество раковых клеток; уменьшить размер или нагрузку опухоли; ингибировать до некоторой степени инфильтрацию раковых клеток в периферические органы; ингибировать до некоторой степени метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли; облегчить до некоторой степени один или более симптомов, связанных с раком; и/или приводят к благоприятному ответу, такому как увеличение выживаемости без прогрессирования заболевания (PFS), выживаемости без заболевания (DFS), общей выживаемости (OS), полного ответа (CR), частичного ответа (PR) или в некоторых случаях стабильное заболевание (SD), уменьшение прогрессирующего заболевания (PD), уменьшение времени до прогрессирования (TTP) или любая их комбинация. В той степени, в которой лекарственное средство может предотвращать рост и/или убивать существующие раковые клетки, оно может быть цитостатическим и/или цитотоксическим.

Такие термины, как лечение, лечащий, лечить, облегчающий и облегчение относятся к терапевтическим мерам, которые лечат, замедляют, уменьшают симптомы и/или останавливают прогрессирование патологического состояния или расстройства. Таким образом, те, кто нуждается в лечении, включают тех, кто уже имеет диагноз или подозрение на заболевание. В определенных вариантах осуществления субъект успешно лечится от рака в соответствии со способами по настоящему изобретению, если пациент демонстрирует одно или более из следующего: уменьшение количества или полное отсутствие раковых клеток; уменьшение размера опухоли; ингибирование или отсутствие проникновения раковых клеток в периферические органы, включая, например, распространение рака в мягкие ткани и кости; торможение или отсутствие метастазирования опухоли; торможение или отсутствие роста опухоли; облегчение одного или более симптомов, связанных с конкретным раком; снижение заболеваемости и смертности; улучшение качества жизни; уменьшение онкогенности, онкогенной частоты или онкогенной способности опухоли; уменьшение количества или частоты раковых стволовых клеток в опухоли; дифференцировка онкогенных клеток в неопухолевое состояние; увеличение выживаемости без прогрессирования (PFS), выживаемость без заболевания (DFS), общая выживаемость (OS), полный ответ (CR), частичный ответ (PR), стабильное заболевание (SD), уменьшение прогрессирующего заболевания (PD), уменьшенное время до прогрессирования (TTP) или любая их комбинация.

Термины рак и раковый относятся или описывают физиологическое состояние у млекопитающих, при котором популяция клеток характеризуется нерегулируемым ростом клеток. Примеры рака включают, но не ограничиваются ими, гинекологические виды рака (например, рак молочной железы (включая трижды негативный рак молочной железы, протоковая карцинома, рак яичников и рак эндометрия), немелкоклеточный рак легких, рак поджелудочной железы, рак щитовидной железы, рак почки (например, почечно-клеточная карцинома) и рак мочевого пузыря (например, карцинома уротелиальной клетки). Рак может быть раком, который экспрессирует B7-H4 или раком, экспрессирующим B7-H4. Такие термины относятся к раку, содержащему клетки, которые экспрессируют B7-H4. Рак может быть первичной опухолью или может быть запущенным или метастатическим раком.

Рефрактерный рак представляет собой рак, который прогрессирует, даже если противоопухолевое лечение, такое как химиотерапия, применяют к больному раком.

Рецидивирующий рак представляет собой рак, который повторно развивается, или на начальном

- 10 043376 участке или в отдаленном месте, после ответа на начальную терапию.

Пациент с рецидивом представляет собой пациента, который имеет признаки или симптомы рака после ремиссии. Необязательно пациент имеет рецидив после адъювантной или неоадъювантной терапии.

В контексте настоящего документа в настоящем раскрытии и формуле изобретения, формы единственного числа включают формы и множественного числа, если контекст явно не предписывает иное.

Следует понимать, что в тех случаях, когда варианты осуществления описаны в настоящем документе с формулировкой содержащий, в противном случае аналогичные варианты осуществления, описанные в терминах состоящий из и/или состоящий в основном из, также предлагаются. В настоящем раскрытии содержит, содержащий, включающий и имеющий и тому подобное может иметь значение, приписанное им в патентном праве США, и может означать включает, включающий и тому подобное; состоящий по существу из или состоящий по существу аналогичным образом имеет значение, указанное в патентном праве США, и термин является открытым, что допускает присутствие большего, чем то, что указано, если основные или новые характеристики того, что говорится не изменяются при наличии более того, что указано, но исключают варианты осуществления предшествующего уровня техники.

Если специально не указано или не очевидно из контекста, используемый в настоящем документе термин или понимается как включающий. Термин и/или, используемый в такой фразе, как A и/или B, предназначен для обозначения A и B, A или B, A и B. Аналогично, термин и/или, используемый в такой фразе, как A, B и/или C, предназначен для охвата каждого из следующих вариантов осуществления: A, B и C; A, B или C; A или C; A или B; B или C; A и C; A и B; B и C; A (один); B (один); и C (один).

Термины около и приблизительно, в контексте настоящего документа, когда используются для изменения числового значения или числового диапазона, указывают, что отклонения от 5% до 10% выше и от 5% до 10% ниже значения или диапазона остаются в пределах предполагаемого значение приведенного значения или диапазона.

Любые композиции или способы, представленные в настоящем документе, могут быть объединены с одной или более любыми другими композициями и способами, представленными в настоящем документе.

5.2 Фармацевтические композиции, содержащие антитела к B7-H4.

В настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции (например, водные фармацевтические композиции), содержащие антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент (например, как описано в разделе 5.3 ниже).

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, является устойчивой к множественным циклам замораживания-оттаивания. Цикл замораживания-оттаивания может включать замораживание фармацевтической композиции (например, при температуре около -70°C), а затем оттаивание фармацевтической композиции (например, при комнатной температуре). Фармацевтическая композиция может быть стабильной в течение по меньшей мере пяти циклов замораживания-оттаивания. Циклы замораживания-оттаивания (например, по меньшей мере пять циклов замораживания-оттаивания) могут не приводить к изменению внешнего вида, растворимым агрегатам или невидимым невооруженным глазом твердым частицам.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, является стабильной при перемешивании. Перемешивание может включать встряхивание (например, при 300 оборотах в минуту на орбитальном шейкере) в течение около трех дней при комнатной температуре. Перемешивание может не привести к изменению внешнего вида, растворимым агрегатам, вариантам, отличающимся зарядами или невидимым невооруженным глазом твердым частицам.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, является стабильной в условиях длительного хранения. Условия длительного хранения могут включать хранение при температуре около 5°C (например, от около 2°C до около 8°C) в течение около 6 месяцев или около 1 года. Условия длительного хранения могут включать хранение при температуре около 25°C в течение около 6 месяцев или около 1 года. Условия длительного хранения могут включать хранение при температуре около 40°C в течение около 3 месяцев, около 6 месяцев или около 1 года.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, является устойчивой к множественным (например, по меньшей мере пяти) циклам замораживания-оттаивания, стабильной при перемешивании и/или стабильной в условиях длительного хранения.

В определенных вариантах осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, является стабильной при хранении при температуре около -70°C и при хранении при температуре от около 2°C до около 8°C в течение около 1 года.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция может содержать антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент. В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислотные и основные варианты) в составе составляет от около 5 мг/мл до около 30 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислотные и основ- 11 043376 ные варианты) в фармацевтической композиции составляет от около 10 мг/мл до около 25 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислотные и основные варианты) в фармацевтической композиции составляет около мг/мл.

В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислотные и основные варианты) в композиции составляет от 5 мг/мл до 30 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислотные и основные варианты) в фармацевтической композиции составляет от 10 мг/мл до 25 мг/мл. В некоторых вариантах осуществления концентрация антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента (включая его кислотные и основные варианты) в фармацевтической композиции составляет 20 мг/мл.

Как предусмотрено в настоящем документе, фармацевтическая композиция может содержать буфер. В определенных вариантах осуществления буфер представляет собой ацетатный буфер. В определенных вариантах осуществления буфер представляет собой цитратный буфер. В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, ацетатного или цитратного) составляет от около 15 до около 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, ацетатного или цитратного) составляет от около 18 до около 22 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, ацетатного или цитратного) составляет около 20 мМ.

В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, ацетатного или цитратного) составляет от 15 до 25 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, ацетатного или цитратного) составляет от 18 до 22 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация буфера (например, ацетатного или цитратного) составляет 20 мМ.

Как предусмотрено в настоящем документе, фармацевтическая композиция может содержать вспомогательное вещество, например сахар, такое как сахароза, сорбит или трегалоза. В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества (например, сахарозы) составляет от около 225 мМ до около 300 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества (например, сахарозы) составляет от около 250 мМ до около 290 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества (например, сахарозы) составляет около 270 мМ.

В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества (например, сахарозы) составляет 225 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества (например, сахарозы) составляет от 250 мМ до 290 мМ. В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества (например, сахарозы) составляет 270 мМ.

Как предусмотрено в настоящем документе, фармацевтическая композиция может содержать буфер (например, ацетатный или цитратный) и вспомогательное вещество, такое как сахар (например, сахароза). В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества, такого как сахар (например, сахароза), от около в 10 до около в 15 раз превышает концентрацию буфера (например, ацетатного или цитратного). В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества, такого как сахар (например, сахароза), около в 13,5 раз превышает концентрацию буфера (например, ацетатного или цитратного).

В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества, такого как сахар (например, сахароза), в от 10 до 15 раз превышает концентрацию буфера (например, ацетатного или цитратного). В некоторых вариантах осуществления концентрация вспомогательного вещества, такого как сахар (например, сахароза) в 13,5 раз превышает концентрацию буфера (например, ацетатного или цитратного).

Как предусмотрено в настоящем документе, фармацевтическая композиция может содержать поверхностно-активное вещество, например, полисорбат. Полисорбат может представлять собой, например, полисорбат 20 (PS20). В некоторых вариантах осуществления концентрация поверхностноактивного вещества (например, PS20) составляет около 0,025-0,075% массы по объему (мас./об.). В некоторых вариантах осуществления концентрация поверхностно-активного вещества (например, PS20) составляет от около 0,035 до около 0,065% мас./об. В некоторых вариантах осуществления концентрация поверхностно-активного вещества (например, PS20) составляет около 0,05% мас./об.

В некоторых вариантах осуществления концентрация поверхностно-активного вещества (например, PS20) составляет 0,025-0,075% массы по объему (мас./об.). В некоторых вариантах осуществления концентрация поверхностно-активного вещества (например, PS20) составляет от 0,035 до 0,065% мас./об. В некоторых вариантах осуществления концентрация поверхностно-активного вещества (например, PS20) составляет 0,05% мас./об.

Как предусмотрено в настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от около 4,5 до около 6. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет от около 5 до около 6. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет около 5. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет около 5,5. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет около 6.

В настоящем документе, в некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция

- 12 043376 имеет pH от 4,5 до 6. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет от 5 до 6. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет 5. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет 5,5. В некоторых вариантах осуществления pH фармацевтической композиции составляет 6.

Как предусмотрено в настоящем документе, фармацевтическая композиция может представлять собой жидкость. Фармацевтическая композиция (например, жидкая фармацевтическая композиция) может быть для парентерального введения, например, для внутривенного введения.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит от около 5 мг/мл до около 30 мг/мл антитела к B7-H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в, от около 15 мМ до около 25 мМ ацетата, от около 225 мМ до около 300 мМ сахарозы и от около 0,025% до около 0,075% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от около 4,5 до около 6 например, около 5. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит от 5 мг/мл до 30 мг/мл антитела к B7-H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в, от 15 мМ до 25 мМ ацетата, от 225 мМ до 300 мМ сахарозы и от 0,025% до 0,075% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от 4,5 до 6, например, 5. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит от около 10 мг/мл до около 25 мг/мл антитела к B7-H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в, от около 18 мМ до около 22 мМ ацетата, от около 250 мМ до около 290 мМ сахарозы и от около 0,035% до около 0,065% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от около 4,5 до около 6, например, около 5. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит от 10 мг/мл до 25 мг/мл антитела к B7-H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в от 18 мМ до 22 мМ ацетата, от 250 мМ до 290 мМ сахарозы и от 0,035% до 0,065% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от 4,5 до 6, например, 5. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит 20 мг/мл антитела к B7H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в 20 мМ ацетата, 270 мМ сахарозы и 0,05% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH 5,0. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит от около 5 мг/мл до около 30 мг/мл антитела к B7-H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в от около 15 мМ до около 25 мМ цитрата, от около 225 мМ до около 300 мМ сахарозы и от около 0,025% до около 0,075% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от около 4,5 до около 6, например, около 5,5. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит от 5 мг/мл до 30 мг/мл антитела к B7-H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в от 15 мМ до 25 мМ цитрата, от 225 мМ до 300 мМ сахарозы и от 0,025% до 0,075% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от 4,5 до 6, например, около 5,5. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит от около 10 мг/мл до около 25 мг/мл антитела к B7-H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в от около 18 мМ до около 22 мМ цитрата, от около 250 мМ до около 290 мМ сахарозы и от около 0,035% до около 0,065% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от около 4,5 до около 6, например, около 5,5. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция содержит от 10 мг/мл до 25 мг/мл антитела к B7-H4 или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в от 18 мМ до 22 мМ цитрата, от 250 мМ до 290 мМ сахарозы и от 0,035% до 0,065% PS20. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция имеет pH от 4,5 до 6, например, около 5,5. В одном варианте осуществления фармацевтическая композиция представляет собой жидкость.

В одном варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция содержит 20 мг/мл антитела или его фрагмента (например, афукозилированного антитела 20502) в 20 мМ цитрата, 270 мМ сахарозы и 0,05% PS20. В одном варианте осуществления жидкая фармацевтическая композиция имеет pH 5,5.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека (например, афукозилированное антитело 20502), причем композиция содержит не более 40% кислых вариантов антитела или его антиген-связывающих фрагментов, и/или не более 20% основных вариантов антитела или его

- 13 043376 антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев при хранении при 5°C.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека (например, афукозилированное антитело 20502), причем композиция содержит от около 30% до около 45%, от около 30% до около 40 % или от около 35% до около 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или от около 11% до около 16%, от около 10% до около 17% или от около 9% до около 18% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев при хранении при 5°C. В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека (например, афукозилированное антитело 20502), причем композиция содержит от 30% до 45%, от 30% до 40 % или от 35% до 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, и/или от 11% до 16%, от 10% до 17% или от 9% до 18% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев при хранении при 5°C.

В некоторых вариантах осуществления фармацевтическая композиция содержит антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, причем композиция содержит не более 60% или 55% кислых и основных вариантов антитела, или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев при хранении при 5°C В некоторых вариантах осуществления композиция также содержит не более 40% кислых вариантов и/или не более 20% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев при хранении при 5°C. В некоторых вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или их антигенсвязывающие фрагменты, и фармацевтически приемлемый носитель. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты, например, причем по меньшей мере 80% антител в композиции являются афукозилированными. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты, например, причем по меньшей мере 85% антител в композиции являются афукозилированными. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты, например, причем по меньшей мере 90% антител в композиции являются афукозилированными. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты, например, причем по меньшей мере 95% антител в композиции являются афукозилированными. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты, например, причем по меньшей мере 96% антител в композиции являются афукозилированными. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты, например, причем по меньшей мере 97% антител в композиции являются афукозилированными. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты, например, причем по меньшей мере 98% антител в композиции являются афукозилированными. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты, например, причем по меньшей мере 99% антител в композиции являются афукозилированными. В конкретных вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит афукозилированные антитела к B7H4 или антигенсвязывающие фрагменты, причем фукоза является необнаруживаемой в композиции.

В некоторых вариантах осуществления предлагаются фармацевтические композиции, в которых фармацевтическая композиция содержит (i) изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека, включающим (a) последовательности области определяющей комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), CDR2 VH, CDR3 VH и CDR1, CDR2 и CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 5-10 соответственно, (b) вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11 и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или (c) тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22 и (ii) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество.

В настоящем документе также предлагается фармацевтическая композиция, в которой фармацевтическая композиция содержит (i) антитела или их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с B7-H4 человека и содержат последовательности области определяющей комплементарность (CDR) 1 вариабельной области тяжелой цепи (VH), CDR2 VH, CDR3 VH и CDR1, CDR2 и

- 14 043376

CDR3 вариабельной области легкой цепи (VL) SEQ ID NO: 5-10 соответственно и (ii) фармацевтически приемлемое вспомогательное вещество, причем по меньшей мере 80%, по меньшей мере 85%, по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95%, по меньшей мере 96%, по меньшей мере 97%, по меньшей мере 98% или по меньшей мере 99% антител или их антигенсвязывающих фрагментов в композиции являются афукозилированными. В одном варианте осуществления (i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент содержит вариабельную область тяжелой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 11, и вариабельную область легкой цепи, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 12, или (ii) антитело содержит тяжелую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 21, и легкую цепь, содержащую аминокислотную последовательность SEQ ID NO: 22.

5.3 Антитела к B7-H4.

В настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антитела (например, моноклональные антитела, такие как химерные, гуманизированные антитела или антитела человека) и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с B7-H4 (например, B7H4 человека). Типовые антитела B7-H4 и их антигенсвязывающие фрагменты, которые могут быть использованы в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, известны в данной области техники. Аминокислотные последовательности для B7-H4 человека, яванского макака, мыши и крысы известны в данной области техники и также представлены в настоящем документе, как представлено SEQ ID NO: 1-4 соответственно.

В7-Н4 человека:

MASLGQILFWSIISIIIILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLSD

IVIQWLKEGVLGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTD

AGTYKC YIITSKGKGNANLEYKTGAF SMPEVNVD YNAS SETLRCEAPRWFPQPT VVWA SQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVT ESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFFAISWALLPLSPYLMLK (SEQ ID NO:1)

В7-Н4 яванского макака:

MASLGQILFWSIISIIFILAGAIALIIGFGISGRHSITVTTVASAGNIGEDGILSCTFEPDIKLS

DIVIQWLKEGVIGLVHEFKEGKDELSEQDEMFRGRTAVFADQVIVGNASLRLKNVQLTD

AGTYKC YIITSKGKGNANLEYKTGAF SMPEVNVD YNAS SETLRCEAPRWFPQPT VVWA SQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVT ESEIKRRSHLQLLNSKASLCVSSFLAISWALLPLAPYLMLK (SEQ ID NO:2) B7-H4 мыши:

MASLGQIIFWSIINIIIILAGAIALIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLNG IVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLTD AGTYTCYIRTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAWAS QVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKVTD SEVKRRSQLQLLNSGPSPCVFSSAFVAGWALLSLSCCLMLR (SEQ ID NO:3)

B7-H4 крысы:

MASLGQIIFWSIINVIIILAGAIVLIIGFGISGKHFITVTTFTSAGNIGEDGTLSCTFEPDIKLN GIVIQWLKEGIKGLVHEFKEGKDDLSQQHEMFRGRTAVFADQVVVGNASLRLKNVQLT DAGTYTCYIHTSKGKGNANLEYKTGAFSMPEINVDYNASSESLRCEAPRWFPQPTVAW ASQVDQGANFSEVSNTSFELNSENVTMKVVSVLYNVTINNTYSCMIENDIAKATGDIKV TDSEVKRRSQLELLNSGPSPCVSSVSAAGWALLSLSCCLMLR (SEQ ID NO:4)

В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7H4 человека. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и яванского макака. В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека, мыши и крысы. В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека, яванского макака, мыши и крысы.

B7-H4 содержит эктодомен IgC (аминокислоты 153-241 SEQ ID NO: 1) и эктодомен IgV (аминокислоты 35-146 SEQ ID NO: 1). В определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфи- 15 043376 чески связывается с доменом IgV B7-H4 человека. Соответственно в настоящем документе представлены фармацевтические композиции, содержащие антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с полипептидом, состоящим из аминокислот 35-146 SEQ ID NO: 1.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит шесть CDR антитела 20502, перечисленные в табл. 1 и 2.

Таблица 1

Аминокислотная последовательность CDR VH ¹_____________

Антит	CDR1 VH	CDR2 VH	CDR3 VH
ело	(SEQ ID NO:)	(SEQ ID NO:)	(SEQ ID NO:)
20502	GSIKSGSYYWG (SEQ	NIYYSGSTYYNPSLRS	AREGSYPNQFDP
IDNO:5)	(SEQ ID NO :6)	(SEQ ID NO :7)

'CDR VH в табл. 1 определяются по Кабат

Таблица 2

Аминокислотная последовательность CDR² VL_____________

Антитело	CDR1 VL (SEQ ID NO:)	CDR2VL (SEQ ID NO:)	CDR3 VL (SEQ ID NO:)
20502	RASQSVSSNLA (SEO Ш NO:8)	GASTRAT (SEQ ID NO :9)	QQYHSFPFT (SEQ ID NO: 10)

2' CDR VL в табл. 2 определяются по Кабат

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит VH антитела 20502, указанную в табл. 3.

Таблица 3

Аминокислотная последовательность вариабельной области тяжелой цепи (VH)

Антитело	Аминокислотная последовательность VH (SEQ ГО NO)
20502	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIKSGSYYWGWIRQPPGKGLE WIGNIYYSGSTYYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYY CAREGSYPNQFDPWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 11)

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит VL 20502, указанную в табл. 4.

Таблица 4

Аминокислотная последовательность вариабельной области легкой цепи (VL)

Антитело	Аминокислотная последовательность VL (SEQ ID NO)
20502	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIY GASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYHSFPFTFG GGTKVEIK (SEQ ID NO: 12)

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит VH и VL антитела 20502, указанные в табл. 3 и 4.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит каркасные области VH антитела 20502, указанные в табл. 5.

Таблица 5

Аминокислотная последовательность FR³ VH

Анти тело	FR1 VH (SEQ ID NO:)	FR2 VH (SEQ ID NO:)	FR3 VH (SEQ ID NO:)	FR4 VH (SEQ ID NO:)
20502	QLQLQESGPGLVK PSETLSLTCTVSG (SEQ ID NO: 13)	WIRQPPGKGLE WIG (SEQ ID NO: 14)	RVTISVDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYY C (SEQ ID NO:15)	WGQGTLVT VSS (SEQ ID NO: 16)

³· Каркасные области VH, описанные в табл. 5, определяются на основе границ системы нумерации Кабат для CDR. Соответственно, CDR VH определяются по Кабат, а каркасные области представляют собой аминокислотные остатки, окружающие CDR в вариабельной области в формате FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фарма- 16 043376 цевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит каркасные области VL антитела 20502, указанные в табл. 6.

Таблица 6

Аминокислотная последовательность FR⁴ VL

Антител о	FR1 VL (SEQ ID NO:)	FR2 VL (SEQ ID NO:)	FR3 VL (SEQ ID NO:)	FR4 VL (SEQ ID NO:)
20502	EIVMTQ SPATES VS PGERATLSC (SEQ ID NO: 17)	WYQQKPGQAP RLLIY (SEQ ID NO: 18)	GIPARFSGSGSGT EFTLTISSLQSEDF AVYYC (SEQ ID NO: 19)	FGGGTKVEI К (SEQ ID NO:20)

^4. Каркасные области VL, описанные в табл. 6, определяются на основе границ системы нумерации по Кабат для CDR. Соответственно, CDR VL определяются по Кабат, а каркасные области представляют собой аминокислотные остатки, окружающие CDR в вариабельной области в формате FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 и FR4

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит четыре каркасных области VH и четыре каркасных области VL антитела 20502, перечисленные в табл. 5 и 6.

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит последовательность тяжелой цепи антитела 20502, приведенную в табл. 7.

Таблица 7

Аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи

Антитело

Аминокислотная последовательность полноразмерной тяжелой цепи (SEQ Ш NO)

20502

QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIKSGSYYWGWIRQPPGKGL EWIGNIYYSGSTYYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVY YCAREGSYPNQFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGT AALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSV VTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAP ELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVS NKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGF YPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQ QGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ГО NO:21)

В некоторых вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит последовательность легкой цепи антитела 20502, приведенную в табл. 8.

Таблица 8

Аминокислотные последовательности полноразмерной легкой цепи

Антитело	Аминокислотная последовательность полноразмерной легкой цепи (SEQ Ш NO)
20502	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLL IYGASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYHSFPF TFGGGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREA KVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:22)

В некоторых вариантах осуществления антитело или антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, специфически связывается с B7-H4 человека и содержит последовательность тяжелой цепи и последовательность легкой цепи антитела 20502, перечисленные в табл. 7 и 8.

В определенных аспектах антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, описывается только его VL-доменом или только его VH-доменом или только его 3 CDR VL или только его 3 CDR VH. См., например, Rader C et al., (1998) PNAS 95: 8910-8915, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте, описывая гуманизацию мышиного антитела к о^3 путем идентификации дополняющей легкой

- 17 043376 цепи или тяжелой цепи, соответственно, от легкой цепи человека или библиотеки тяжелой цепи, приводящей к вариантам гуманизированного антитела, имеющим сродство настолько же или более высокое, чем сродство исходного антитела. См. также Clackson T et al., (1991) Nature 352: 624-628, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте, описывая способы получения антител, которые специфически связываются со специфическим антигеном с использованием специфического VL домена (или домена VH), и скрининг библиотеки на дополняющий VH домен (или VL домен). Скрининг привел к 14 новым партнерам для конкретного домена VH и 13 новым партнерам для конкретного домена VL, которые связывались сильнее, как определено с помощью ИФА. См. также Kim SJ & Hong HJ, (2007) J Microbiol 45: 572-577, которая включена в настоящее описание посредством ссылки во всей ее полноте, описывая способы получения антител, которые специфически связывают специфический антиген, с использованием специфического домена VH и скрининга библиотеки (например, библиотеки VL человек) на дополняющие VL домены; выбранные VL домены в свою очередь, могут быть использованы для направленного отбора дополняющих комплементарных (например, человека) VH доменов.

В некоторых аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающий фрагмент могут быть определены в соответствии со схемой нумерации по Чотиа, которая относится к местоположению иммуноглобулина структурных петель (см., например, Chothia C & Lesk AM, (1987), J Mol Biol 196: 901-917; AlLazikani B et al., (1997) J Mol Biol 273: 927-948; Chothia C et al., (1992) J Mol Biol 227: 799-817; Tramontano A et al., (1990) J Mol Biol 215(1): 175-82 и патент США № 7709226). Как правило, при использовании системы нумерации по Кабату петля по Чотиа CDR-H1 представлена аминокислотами тяжелой цепи 2632, 33 или 34, петля по Чотиа CDR-H2 представлена аминокислотами тяжелой цепи 52-56, и петля по Чотиа CDR-H3 представлена аминокислотами тяжелой цепи 95-102, в то время как петля по Чотиа CDRL1 представлена аминокислотами легкой цепи 24-34, петля по Чотиа CDR-L2 представлена аминокислотами легкой цепи 50-56 и петля по Чотиа CDR-L3 представлена аминокислотами легкой цепи 89-97. Конец петли CDR-H1 по Чотиа при нумерации согласно системе нумерации по Кабату варьируется между H32 и H34 в зависимости от длины петли (это связано с тем, что в схеме нумерации по Кабату в H35A и H35B размещаются вставки; если ни 35A, ни 35B не присутствуют, петля заканчивается на 32; если присутствует только 35A, петля заканчивается на 33; если присутствуют оба 35A и 35B, петля заканчивается на 34).

В некоторых аспектах в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека) и содержат CDR VH и VL по Чотиа из антитела 20502, перечисленные в табл. 3 и 4. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека) и содержат один или более CDR, в которых CDR по Чотиа и по Кабат имеют одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека) и состоят из комбинаций CDR по Кабату, и CDR по Чотиа.

В некоторых аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии с системой нумерации IMGT, как описано в Lefranc M-P, (1999) The Immunologist 7: 132-136 и Lefranc M-P et al., (1999) Nucleic Acids Res 27: 209-212. Согласно системе нумерации IMGT VH-CDR1 находится в положениях 26-35, VH-CDR2 находится в положениях 51- 57, VH-CDR3 находится в положениях 93-102, VL-CDR1 находится в положениях 27-32, VL-CDR2 находится в положениях 5052, и VL-CDR3 находится в положениях 89-97. В конкретном варианте осуществления в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела и антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека) и содержат CDR VH и VL IMGT из антитела 20502, перечисленные в табл. 3 и 4, например, как описано в Lefranc M-P (1999) выше и Lefranc M-P et al., (1999) выше).

В определенных аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии с MacCallum RM et al., (1996) J Mol Biol 262: 732-745. См. также, например, Martin A. Protein Sequence and Structure Analysis of Antibody Variable Domains, в Antibody Engineering, Kontermann и Dubel, eds., Chapter 31, pp. 422-439, Springer-Verlag, Berlin (2001). В конкретном варианте осуществления в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с B7-H4 (например, B7H4 человека) и содержат CDR VH и VL, из антитела 20502, перечисленные в табл. 3 и 4, как определено методом из MacCallum RM et al.

В определенных аспектах CDR антитела или его антигенсвязывающего фрагмента могут быть определены в соответствии со схемой нумерации AbM, которая относится к гипервариабельным областям AbM, и которая представляют собой компромисс между CDR по Кабат и структурными петлями Чотиа, и используется в программном обеспечении для моделирования антител AbM Oxford Molecular (Oxford Molecular Group, Inc.). В конкретном варианте осуществления в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела или антигенсвязывающие фрагменты, которые специфически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека) и содержат CDR VH и VL из антитела 20502,

- 18 043376 перечисленные в табл. 3 и 4, как определено схемой нумерации AbM.

В конкретных аспектах в настоящем документе предложены фармацевтические композиции, содержащие антитела, которые содержат тяжелую цепь и легкую цепь.

Что касается легкой цепи, в конкретном варианте осуществления легкая цепь антитела, описанного в настоящем документе, представляет собой легкую цепь каппа. Константная область легкой цепи каппа человека может содержать следующую аминокислотную последовательность:

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQ DSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ ID NO:23).

Константная область легкой цепи каппа человека может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью: CGGACCGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAA TCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAA GTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCAC AGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCA AAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTG

AGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGT (SEQ IDNO 24).

В конкретном варианте осуществления изобретения антитела, которое иммуноспецифически связывается с полипептидом B7-H4 (например, B7-H4 человека) фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, включает легкую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VL содержит множество последовательностей указанных в табл. 4, и при этом константная область легкой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области легкой цепи каппа человека.

В конкретном варианте осуществления изобретения антитела, которое иммуноспецифически связывается с B7-H4 (например, B7-H4 человека) фармацевтическая композиция, описанная в настоящем документе, включает тяжелую цепь, причем аминокислотная последовательность домена VH содержит множество аминокислотных последовательностей указанных в табл. 3, и при этом константная область тяжелой цепи содержит аминокислотную последовательность константной области тяжелой цепи гамма.

Константная область тяжелой цепи IgG 1 человека может содержать следующую аминокислотную последовательность:

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSS GLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGG PSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQY NSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR DELTKNQ VSLTCLVKGF YP SDIAVEWESNGQPENNYKTTPP VLD SDGSFFLYSKLT VDK SRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO:25).

Константная область тяжелой цепи IgG ₁ человека может кодироваться следующей нуклеотидной последовательностью: GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCT GGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGAC GGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCT ACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTT GGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGG ACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCA GCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGAC ACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCAC GAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGC CAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGGGTGGTCAGCGTC CTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTC CAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGGCAGC CCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAAC CAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAG TGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGA CTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCA

- 19 043376

GCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACAC

GCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAA. (SEQ ID NO:26)

В конкретном варианте осуществления антитело, которое иммуноспецифически связывается с B7H4 (например, B7-H4 человека) в фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, включает домен VH и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность любого VH и VL доменов, описанных в настоящем документе, и при этом константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей молекулы иммуноглобулина IgG (например, IgG человека). В другом конкретном варианте осуществления антитело, которое иммуноспецифически связывается с B7H4 (например, B7-H4 человека), для использования в фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, включает домен VH и домен VL, содержащий аминокислотную последовательность любого VH и VL доменов, описанных в настоящем документе, и при этом константные области содержат аминокислотные последовательности константных областей молекулы иммуноглобулина IgG1 (например, IgG1 человека).

Антитела с пониженным содержанием фукоз, как сообщалось, обладают повышенной аффинностью к рецепторам Fc, таким как, например, FcyRIIIA. Соответственно, в определенных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, имеет пониженное содержание фукозы или не содержит фукозы (то есть является афукозилированным). Такие антитела или их антигенсвязывающие фрагменты могут быть получены с использованием методик, известных специалисту в данной области техники. Например, они могут быть экспрессированы в клетках с дефицитом или отсутствием способности к фукозилированию. В конкретном примере клеточные линии с нокаутом обоих аллелей гена а1,6-фукозилтрансферазы (FUT8) могут быть использованы для получения антител или их антигенсвязывающих фрагментов с пониженным содержанием фукозы. Potelligent ® система (Lonza) является примером такой системы, которая может быть использована для получения антител и антигенсвязывающих их фрагментов с пониженным содержанием фукозы. Альтернативно, антитело или антигенсвязывающие фрагменты с пониженным содержанием фукозы или не содержащие фукозу, могут быть получены, например (i) культивирование клетки в условиях, которые предотвращают или уменьшают фукозилирование; (ii) посттрансляционным удалением фукозы (например, с помощью фермента фукозидазы); (iii) посттрансляционным добавление желаемых углеводов, например, пострекомбинантной экспрессией негликозилированного гликопротеина; или (iv) очисткой гликопротеина для отбора антител или их антигенсвязывающих фрагментов, которые не являются фукозилированными. См., например, Longmore GD & Schachter H (1982) Carbohydr Res 100: 365-92 и Imai-Nishiya H et al., (2007) BMC Biotechnol. 7: 84 для способов получения антител не содержащих фукозу или с пониженным содержанием фукозы.

В некоторых вариантах осуществления афукозилированное B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент обладает повышенной ADCC активностью in vitro по сравнению с фукозилированными B7-H4 антителами или их антигенсвязывающими фрагментами, имеющими одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления афукозилированные антитела B7-H4 или их антигенсвязывающие фрагменты вызывают специфический лизис, который на по меньшей мере 10, по меньшей мере 15, по меньшей мере 20, по меньшей мере 25, по меньшей мере 30, по меньшей мере 35, по меньшей мере 40, по по меньшей мере 45, по меньшей мере 50, по меньшей мере 60, по меньшей мере 65, по меньшей мере 70 или по меньшей мере 75 процентов больше, чем специфический лизис вызванный фукозилированными антителами B7-H4.

В некоторых вариантах осуществления B7-H4 антитело или его антигенсвязывающий фрагмент имеет усиленное сродство к Fc гамма RIIIA по сравнению с фукозилированными антителами B7-H4 или их антигенсвязывающими фрагментами, имеющими одинаковую аминокислотную последовательность. В некоторых вариантах осуществления афукозилированные антитела B7-H4 или их антигенсвязывающие фрагменты связываются с Fc гамма RIIIA по меньшей мере в 2 раза, по меньшей мере в 3 раза, по меньшей мере в 4 раза, по меньшей мере в 5 раз, по меньшей мере в 7 раз, по меньшей мере в 10 раз, по меньшей мере в 12 раз, по меньшей мере в 15 раз, по меньшей мере в 17 раз или по меньшей мере в 20 раз с большим сродством, чем фукозилированные антитела B7-H4 или их антигенсвязывающие фрагменты. В некоторых вариантах осуществления аффинность к Fc гамма RIIIA определяют с использованием поверхностного плазмонного резонанса. В некоторых вариантах осуществления Fc гамма RIIIA выбран из Fc гамма RIIIA (V158) и Fc гамма RIIIA (F158). В некоторых вариантах осуществления Fc гамма RIIIA представляет собой Fc гамма RIIIA (V158).

В некоторых вариантах осуществления присутствие фукозы может быть определено способом, включающим высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ), капиллярный электрофорез или масс-спектрометрию MALDI-TOF.

В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент (i) содержат последовательности CDR 20502, последовательности VH и VL 20502 или последовательности тяжелой и легкой цепей 20502 и (ii) являются афукозилированными.

В конкретных вариантах осуществления композиция содержит антитела или их антигенсвязываю- 20 043376 щие фрагменты, которые (i) содержат последовательности CDR 20502, последовательности VH и VL

20502 или последовательности тяжелой и легкой цепей 20502 и (ii) являются афукозилированными, например, в которых по меньшей мере 95% антител в композиции являются афукозилированными или при этом фукозилирование является не обнаруживаемым в композиции.

Инженерные гликоформы могут быть полезны для различных целей, включая, но не ограничиваясь, усиление или уменьшение эффекторной функции. Способы получения сконструированных гликоформ в антителе или его антигенсвязывающем фрагменте, описанные в настоящем документе, включают, но не ограничиваются ими, те, которые описаны, например, в Umana P et al., (1999) Nat Biotechnol 17: 176-180; Davies J et al., (2001) Biotechnol Bioeng 74: 288-294; Shields RL et al., (2002) J Biol Chem 277: 26733-26740; Shinkawa T et al., (2003) J Biol Chem 278: 3466-3473; Niwa R et al., (2004) Clin Cancer Res 1: 6248-6255; Presta LG et al., (2002) Biochem Soc Trans 30: 487-490; Kanda Y et al., (2007) Glycobiology 17: 104-118; патентах США № 6602684; 6946292; и 7214775; патентных публикациях США № US 2007/0248600; 2007/0178551; 2008/0060092; и 2006/0253928; международных патентных публикациях № WO 00/61739; WO 01/292246; WO 02/311140; и WO 02/30954; технологии Potelligent™ (Biowa, Inc. Принстон, Нью Джерси); и технологии конструирования гликозилирования GlycoMAb® (Glycart biotechnology AG, Цюрих, Швейцария). См. также, например, Ferrara C et al., (2006) Biotechnol Bioeng 93: 851-861; международные патентные публикации № WO 07/039818; WO 12/130831; WO 99/054342; WO 03/011878; и WO 04/065540.

В определенных вариантах осуществления любые из мутаций или модификаций константной области, описанных в настоящем документе, могут быть введены в одну или обе константные области тяжелой цепи антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанного в настоящем документе, имеющего две константные области тяжелой цепи.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, который иммуноспецифически связывается с B7-H4 (например, B7-H4 человека), содержит тяжелую и легкую цепь, причем (i) тяжелая цепь содержит домен VH, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 VH, CDR2 VL и CDR3 VL антитела 20502, перечисленные в табл. 1; (ii) легкая цепь содержит домен VL, содержащий аминокислотные последовательности CDR1 VL, CDR2 VH и CDR3 VH антитела 20502, перечисленные в табл. 2; (iii) тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена тяжелой цепи IgG 1 человека; и (iv) легкая цепь дополнительно содержит константный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена легкой цепи каппа человека.

В другом конкретном варианте осуществления изобретения, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанный в настоящем документе, который иммуноспецифически связывается с B7-H4 (например, B7-H4 человека), содержит тяжелую и легкую цепь, причем (i) тяжелая цепь содержит домен VH, содержащий аминокислотную последовательность домена VH антитела 20502, перечисленную в табл. 3; (ii) легкая цепь содержит домен VL, содержащий аминокислотную последовательность домена VL антитела 20502, перечисленную в табл. 4; (iii) и тяжелая цепь дополнительно содержит константный домен тяжелой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена тяжелой цепи IgG 1 человека; и (iv) легкая цепь дополнительно содержит константный домен легкой цепи, содержащий аминокислотную последовательность константного домена легкой цепи каппа человека.

В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), проявляют активность по отношению к блокаде активности контрольной точки T-клеток. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), увеличивают выработку интерферона гамма (IFNy) в T-клетках. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), усиливают пролиферацию T-клеток. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), усиливают пролиферацию CD4+ T-клеток. В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), усиливают пролиферацию CD8+ T-клеток.

В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), демонстрируют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), демонстрируют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) на клеточных линиях с по меньшей мере 300000 молекул B7-H4 на поверхности клетки (например, клетки SK-BR-3). В

- 21 043376 конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), демонстрируют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) на клеточных линиях с по меньшей мере 100000 молекул B7-H4 на поверхности клетки (например, клетки HCC1569). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), демонстрируют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) на клеточных линиях с по меньшей мере 50000 молекул B7-H4 на поверхности клетки (например, клетки ZR-75-1). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), демонстрируют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) на клеточных линиях с по меньшей мере 30000 молекул B7-H4 на поверхности клетки (например, клетки MDA-MB468). В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, описанные в настоящем документе, которые иммуноспецифически связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека), демонстрируют антителозависимую клеточноопосредованную цитотоксичность (ADCC) на клеточных линиях с по меньшей мере 15000 молекул B7-H4 на поверхности клетки (например, клетки HCC1964).

В конкретном аспекте антигенсвязывающий фрагмент, как описано в настоящем документе, который иммуноспецифически связывается с B7-H4 (например, B7-H4 человека), выбран из группы, состоящей из Fab, Fab', F(ab')2, и ScFv, причем Fab, Fab', F(ab')₂ или ScFv содержит последовательность вариабельной области тяжелой цепи и вариабельной области легкой цепи последовательности антитела к B7H4 или его антигенсвязывающего фрагмента, как описано в настоящем документе. Fab, Fab', F(ab')2 или scFv могут быть получены любым способом, известным специалистам в данной области техники. В некоторых вариантах осуществления Fab, Fab', F(ab')2 или ScFv дополнительно содержат фрагмент, который увеличивает период полураспада антитела in vivo. Фрагмент также называют фрагмент, увеличивающий период полураспада. Могут быть использованы любые фрагменты, известные специалистам в данной области техники для увеличения периода полураспада Fab, Fab', F(ab')₂ или ScFv in vivo. Например, фрагмент, увеличивающий период полураспада, может включать Fc область, полимер, альбумин или альбумин-связывающий белок или соединение. Полимер может включать природный или синтетический, необязательно замещенный полиалкилен с прямой или разветвленной цепью, полиалкенилен, полиоксилалкилен, полисахарид, полиэтиленгликоль, полипропиленгликоль, поливиниловый спирт, метоксиполиэтиленгликоль, лактозу, амилозу, декстран, гликоген или их производное. Заместители могут включать одну или более гидрокси, метил или метоксигруппы. В некоторых вариантах осуществления Fab, Fab', F(ab')2 или ScFv могут быть изменены путем добавления одной или более С-концевых аминокислот для прикрепления фрагмента, увеличивающего период полураспада. В некоторых вариантах осуществления изобретения фрагмент, увеличивающий период полураспада, представляет собой полиэтиленгликоль или сывороточный альбумин человека. В некоторых вариантах осуществления Fab, Fab', F(ab')₂ или ScFv слит с Fc областью.

5.4 Производство антител и полинуклеотидов.

Антитела и их антигенсвязывающие фрагменты, которые иммуноспецифично связываются с B7-H4 (например, B7-H4 человека) могут быть получены любым способом, известным в данной области техники для синтеза антител и антигенсвязывающих их фрагментов, например, химическим синтезом или методами рекомбинантной экспрессии. Способы, описанные в настоящем документе используют, если не указано иное, обычные методы молекулярной биологии, микробиологии, генетического анализа, рекомбинантной ДНК, органической химии, биохимии, ПНР, синтеза олигонуклеотидов и их модификации, гибридизации нуклеиновых кислот, и методы смежных областей в пределах области техники. Эти методики описаны, например, в ссылках, цитируемых в настоящем документе, и полностью объяснены в литературе. См., например, Sambrook J et al., (2001) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubel FM et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates); Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (1987 and annual updates) Gait (ed.) (1984) Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IRL Press; Eckstein (ed.) (1991) Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, IRL Press; Birren B et al., (eds.) (1999) Genome Analysis: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press.

В определенных аспектах в настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, содержащие антитело к B7-H4 или антигенсвязывающий фрагмент, причем антитела или фрагменты продуцируются рекомбинантной экспрессией полинуклеотида, содержащего нуклеотидную последовательность, в соответствующей клетке-хозяине.

В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную в табл. 9 (то есть SEQ ID NO: 27). В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, содержит

- 22 043376 вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную в табл. 9 (то есть SEQ ID NO: 27), и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область тяжелой цепи гамма (γ) человека. В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную в табл. 9 (то есть SEQ ID NO: 27), и константный домен тяжелой цепи, кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 26.

Таблица 9

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область тяжелой цепи

Антитело	Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область тяжелой цепи (SEQ Ш NO)
20502	CAGCTGCAGCTGCAGGAGTCGGGCCCAGGACTGGTGAAGCCTTCGGAG ACCCTGTCCCTCACCTGCACTGTCTCTGGTGGCTCCATCAAAAGTGGTA GTTACTACTGGGGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAAGGGGCTGGAGT GGATTGGGAACATCTATTATAGTGGGAGCACCTACTACAACCCGTCCCT CAGAAGTCGAGTCACCATATCCGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTC CCTGAAGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCAGACACGGCGGTGTACTACTG CGCCAGAGAAGGATCTTACCCCAATCAGTTTGATCCATGGGGACAGGG TACATTGGTCACCGTCTCCTCA (SEQ ID NO:27)

В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, содержит вариабельную область легкой цепи, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную в табл. 10 (то есть SEQ ID NO: 28). В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, содержит вариабельную область легкой цепи, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную в табл. 10 (то есть SEQ ID NO: 28), и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область легкой цепи лямбда человека. В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, содержит вариабельную область легкой цепи, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, представленную в табл. 10 (то есть SEQ ID NO: 28), и константный домен легкой цепи, кодируемый полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность SEQ ID NO: 24.

Таблица 10

Полинуклеотидные последовательности, кодирующие вариабельную область легкой цепи

Антитело	Полинуклеотидная последовательность, кодирующая вариабельную область легкой цепи (SEQ Ш NO)
20502	GAAATAGTGATGACGCAGTCTCCAGCCACCCTGTCTGTGTCTCCAGGG GAAAGAGCCACCCTCTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTAGCAGCAA CTTAGCCTGGTACCAGCAGAAACCTGGCCAGGCTCCCAGGCTCCTCAT CTATGGTGCATCCACCAGGGCCACTGGTATCCCAGCCAGGTTCAGTGG CAGTGGGTCTGGGACAGAGTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGTC TGAAGATTTTGCAGTTTATTACTGTCAGCAGTACCACTCCTTCCCTTTC ACTTTTGGCGGAGGGACCAAGGTTGAGATCAAA (SEQ Ш NO:28)

В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, содержит вариабельную область тяжелой цепи, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, представленную в табл. 9 (т.е. SEQ ID NO: 27) и вариабельную легкую цепь, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную легкую цепь, представленную в табл. 10 (то есть, SEQ ID NO: 28).

В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, включает (i) тяжелую цепь, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область

- 23 043376 тяжелой цепи, представленную в табл. 9 (т.е. SEQ ID NO: 27) и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область тяжелой цепи гамма (γ) человека, и (ii) легкую цепь, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную легкую цепь, представленную в табл. 10 (т.е. SEQ ID NO: 28) и нуклеотидную последовательность, кодирующую константную область легкой цепи лямбда человека.

В определенных аспектах антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, включает (i) тяжелую цепь, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную область тяжелой цепи, представленную в табл. 9 (т.е. SEQ ID NO: 27) и нуклеотидную последовательность, кодирующую константный домен тяжелой цепи SEQ ID NO:26, и (ii) легкую цепь, кодируемую полинуклеотидом, содержащим нуклеотидную последовательность, кодирующую вариабельную легкую цепь, представленную в табл. 10 (т.е. SEQ ID NO: 28) и нуклеотидную последовательность, кодирующую константный домен легкой цепи SEQ ID NO:24.

В некоторых аспектах, антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе кодируются полинуклеотидами, кодирующими антитела к B7-H4 или их антигенсвязывающие фрагменты или домены, которые оптимизированы, например путем оптимизации кодонов/РНК, замены гетерологичными сигнальными последовательностями и удаления элементов нестабильности мРНК. Способы для генерирования оптимизированных нуклеиновых кислот, кодирующих антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент или домен (например, тяжелую цепь, легкую цепь, домен VH, или домен VL) для рекомбинантной экспрессии путем внесения изменений в кодоны (например, изменение кодона, кодирующего ту же аминокислоту из-за вырожденности генетического кода) и/или устранение ингибирующие области в мРНК может быть осуществлено путем адаптации способов оптимизации описанных, например, патентах США № 5965726; 6174666; 6291664; 6414132; и 6 794498, соответственно.

Полинуклеотиды могут быть, например, в форме РНК или в форме ДНК. ДНК включает кДНК, геномную ДНК и синтетическую ДНК. ДНК может являться двухцепочечной или одноцепочечной. Будучи одноцепочечной, ДНК может являться кодирующей цепью или некодирующей (антисмысловой) цепью. В некоторых вариантах осуществления полинуклеотид представляет собой кДНК или ДНК, в которой отсутствует один или более интронов. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид представляет собой не встречающийся в природе полинуклеотид. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид продуцируется рекомбинантно. В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды являются изолированными. В определенных вариантах осуществления полинуклеотиды являются по существу чистыми. В определенных вариантах осуществления полинуклеотид очищают от природных компонентов.

В некоторых аспектах, векторы (например, векторы экспрессии) содержат нуклеотидные последовательности, кодирующие антитела к B7-H4 и их антигенсвязывающие фрагменты или домен, для рекомбинантной экспрессии в клетках-хозяевах, предпочтительно в клетках млекопитающих. В некоторых аспектах, клетки, например, клетки-хозяева, включают в себя такие векторы для рекомбинантной экспрессии антитела к B7-H4 или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем документе (например, человеческие или гуманизированные антитела или антигенсвязывающие фрагменты). Таким образом, способ получения антитела или его антигенсвязывающих фрагментов для применения в фармацевтической композиции, описанной в настоящем документе, может включать экспрессию такого антитела или его антигенсвязывающего фрагмента в клетке-хозяине.

Вектор экспрессии может быть перенесен в клетку (например, клетку-хозяин) с помощью обычных методик и полученные клетки могут быть затем культивированы с помощью обычных методов для получения антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанных в настоящем документе (например, антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, содержащих шесть CDR, VH, VL, VH и VL, тяжелую цепь, легкую цепь, или тяжелую и легкую цепь 20502) или их домена (например, VH, VL, VH и VL, тяжелую и легкую цепь 20502).

В некоторых вариантах осуществления, антитела к B7-H4 или антигенсвязывающий фрагмент (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий CDR из 20502) в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе производятся в клетках Potelligent® CHOK1SV.

В некоторых вариантах осуществления, антитела к B7-H4 или антигенсвязывающие фрагменты (например, антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, включающий CDR из 20502) в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе производятся в клетке-хозяине, в которой не хватает функционирующего гена альфа-1,6-фукозилтрансферазы (FUT8). В некоторых вариантах осуществления клетка-хозяин представляет собой клетку CHO.

В конкретных вариантах осуществления антитело или его антигенсвязывающий фрагмент в фармацевтических композициях, представленных в настоящем документе, выделяют или очищают. Обычно изолированное антитело или его антигенсвязывающий фрагмент представляет собой такое, которое

- 24 043376 по существу не содержит других антител или их антигенсвязывающих фрагментов с антигенной специфичностью, отличной от выделенного антитела или его антигенсвязывающего фрагмента. Например, в конкретном варианте осуществления состав антитела или его антигенсвязывающего фрагмента, описанный в настоящем документе, по существу не содержит клеточного материала и/или химических предшественников.

5.5 Терапевтические применения и способы.

В одном аспекте в настоящем документе предлагаются способы модуляции одной или более иммунных функций у субъекта, включающие введение субъекту, нуждающемуся в этом, фармацевтической композиции, представленной в настоящем документе, содержащей антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент.

В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержащая антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент, вводится пациенту (например, пациенту-человеку) для усиления пролиферации T-клеток, CD4+ T-клеток или CD8+ T-клеток у пациента. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержащая антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент, вводится пациенту (например, пациенту-человеку) для увеличения выработки интерферона-гамма (IFNy) у пациента. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержащая антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент, вводится пациенту (например, пациенту-человеку) для блокирования ингибирующей активности B7-H4 в отношении T-клеток у пациента. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержащая антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент, вводится пациенту (например, пациенту-человеку) для удаления экспрессирующих B7-H4 раковых клеток у пациента. В другом варианте осуществления фармацевтическая композиция, представленная в настоящем документе, содержащая антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент, вводится для достижения двух или более из указанных выше эффектов.

В определенном варианте осуществления в настоящем документе предлагаются способы лечения рака, например рака, экспрессирующего B7-H4, включающие введение фармацевтической композиции, содержащей антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем документе, пациенту (например, пациенту-человеку), нуждающемуся в этом. В определенном варианте осуществления в настоящем документе предлагаются способы лечения солидной опухоли, например солидной опухоли, экспрессирующей B7-H4, включающие введение фармацевтической композиции, содержащей антитело к B7-H4 или его антигенсвязывающий фрагмент, предложенные в настоящем документе, пациенту (например, пациенту-человеку), нуждающемуся в этом.

В определенном варианте осуществления настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции для лечения рака, выбранного из группы, состоящей из: рака молочной железы (например, рак молочной железы, тройной негативный рак молочной железы, положительный на рецептор гормона (HR) рак молочной железы или рак протоков), рака эндометрия, рака яичника, рака уротелия, немелкоклеточного рака легкого (например, плоскоклеточный рак), рака поджелудочной железы, рака щитовидной железы, рака почки (например, почечно-клеточный рак) и рака мочевого пузыря (например, уротелиальноклеточный рак). В определенном варианте осуществления настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции для лечения прогрессирующего рака молочной железы (в том числе тройного негативного рака молочной железы и положительного на рецептор гормона (HR) рака молочной железы), рака яичников, рака эндометрия, или уротериального рака. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции для лечения рака молочной железы. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции для лечения рака яичников. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения предложены фармацевтические композиции для лечения рака эндометрия. В определенном варианте осуществления настоящего изобретения предложены фармацевтическими композициями для лечения уротериального рака.

В некоторых вариантах осуществления рак представляет собой рак, экспрессирующий B7-H4.

В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию, предложенную в настоящем описании, вводят пациенту (например, пациенту-человеку) с диагнозом рак, чтобы усилить пролиферацию T-клеток, CD4+ T-клеток, или CD8+ T-клеток у пациента. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию, представленную в настоящем документе, вводят пациенту (например, пациенту-человеку), с диагнозом рак, для увеличения выработки интерферона-гамма (IFNy) у пациента. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию, представленную в настоящем документе, вводят пациенту (например, пациенту-человеку), с диагнозом рак, чтобы блокировать ингибирующую активность B7-H4 в отношении T-клеток у пациента. В другом варианте осуществления фармацевтическую композицию, представленную в настоящем документе, вводят пациенту (например, пациенту-человеку), с диагнозом рак, чтобы истощить экспрессирующие B7-H4 раковые клетки у пациента.

Фармацевтические композиции, описанные в настоящем документе, могут быть доставлены паци- 25 043376 енту с помощью внутривенного введения. Обычно пациент является человеком, но могут поддаваться лечению млекопитающие, не являющиеся человеком, включая трансгенные млекопитающие.

6. Примеры

Примеры в этом разделе (то есть в разделе 6) предлагаются в качестве иллюстрации, а не в качестве ограничения.

Пример 1. Способы, использованные в исследованиях составов.

I. Производство антител.

Антитела 20502 были получены в клеточной линии CHO, в которой отсутствует ген FUT8 (α1,6фукозилтрансфераза), поэтому антитела 20502, используемые во всех Примерах 2-9, являются афукозилированными. У них отсутствует концевая фукоза при ASN297 в Fc-части антитела.

II. Общая процедура составления.

Образцы моноклонального антитела (mAb) получали в различных составах путем диализа лекарственного вещества, не содержащего полисорбата (афукозилированное 20502), с использованием диализных мембранных устройств с отсечением по молекулярной массе в 20 кДа (MWCO). После диализа концентрацию моноклональных антител измеряли с помощью УФ-спектроскопии с использованием коэффициента экстинкции 1,47 смДг/л]’¹. Концентрации белка в образцах, с замененным буфером, доводили до желаемых значений с помощью буфера для диализа, и 10% PS20 маточного раствора добавляли в каждый состав до конечной концентрации 0,05% (мас./об.) PS20. Составы стерильно фильтровали с использованием фильтровальных блоков 0,22 мкм и помещали в соответствующие системы контейнеров/укупорочных средств в вытяжном шкафу с ламинарным потоком. Образцы помещали в различные условия хранения в соответствии с дизайном исследования, и их стабильность анализировали с использованием различных способов в определенные моменты времени.

III. Аналитические способы.

Визуальный осмотр (AD-Gen-002/00): Визуальная оценка проводилась как на черном, так и на белом фоне при флуоресцентном освещении. Образцы были исследованы на цвет, прозрачность и наличие видимых частиц.

Концентрация белка (TM-150-001/00): Концентрацию белка определяли с помощью УФ-поглощения при длине волны 280 нм с использованием теоретических коэффициентов поглощения 1,47 см’¹[г/л]’¹. Образцы разбавляли до линейного диапазона поглощения с помощью фосфатно-солевого буфера Дульбекко (DPBS) и измеряли относительно DPBS в виде холостого раствора. Поглощение измеряли с использованием УФ-видимого спектрофотометра Agilent Сагу 8454 (Agilent Technologies, Калифорния).

pH (AD-GEN-001/00): pH буфера определяли с помощью калиброванного устройства Beckman Coulter pHi560 (Beckman Coulter, Inc., Калифорния).

Осмоляльность (TM-GEN-004/00): Осмоляльность буфера измеряли по давлению пара с использованием системы Wescor VAPRO (Wescor, Inc., Юта).

Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК).

Измерения ДСК проводились на платформе MicroCal VP-Capillary DSC (GE Healthcare, Великобритания). Образцы mAb разводили в различных буферах составов до концентрации 1 мг/мл. В качестве эталона использовали буфер соответствующего состава. Образцы сканировали при температуре от 15 до 110°C со скоростью 1°С/мин. Данные сначала были нормализованы по концентрации белка, затем скорректированы по исходному уровню и значения для буфера были вычтены с помощью программного обеспечения Origin 7.0 (OriginLab, Массачусетс). Переходы плавления были проанализированы с помощью инициируемой курсором функции подгонки пика DSC с использованием модели развертывания без двух состояний в исходном программном обеспечении.

Температура развертывания™ по системе UNIT: Температура развертывания (Tm) белка обеспечивает измерение физической стабильности молекулы. Температура развертывания определяется как температура, при которой в равновесии существуют равные количества нативного и денатурированного белка. Система UNIT от Unchained Labs (Калифорния) использует собственные флуоресцентные спектроскопические изменения для определения температуры, при которой происходит тепловое развертывание белка. Образцы в концентрации 1 мг/мл сканировали при температуре от 20 до 90°C со скоростью 1°С/мин. Tm определяли с использованием программного обеспечения Uncle от Unchained Labs (Калифорния).

Изоэлектрическое фокусирование под визуализационным контролем (iCE) (TM-150-003/02): Варианты заряда были проанализированы с помощью изоэлектрического фокусирования под визуализационным контролем (iCE) на приборе Protein Simple iCE3 с автоматическим пробоотборником 720 NV (ProteinSimple, Калифорния). Данные анализировали с использованием программного обеспечения iCE CFR, и относительные количества главных, кислых и основных пиков определяли путем интегрирования площади пиков, наблюдаемых в профиле, и использовали для расчета процентного содержания кислых и основных вариантов.

Эксклюзионная хроматография (SEC), (TM-150-004/00): Образцы были проанализированы на Agilent 1100 Series ВЭЖХ, снабженном детектором с диодной матрицей, и оптическую плотность измеряли

- 26 043376 при 280 нм. Образцы разбавляли до 1 мг/мл в подвижной фазе (100 мМ фосфата натрия, 400 мМ хлорида натрия, pH 6,8) и 50 мкл вкалывали в предварительно уравновешенную колонку Sepax Zenix SEC-300 7,8x200 мм (Sepax Technologies, Inc., Делавэр). Разделительные SEC и защитные колонки использовались при 25°C. Скорость потока 1,0 мл/мин использовалась при длительности анализа 12 мин. Пики агрегатов, мономеров и фрагментов определяли количественно с использованием программного обеспечения для анализа данных.

Капиллярный электрофорез с гелем и додецилсульфатом натрия (CE-SDS) (TM-150-002/00): CESDS использовали для определения чистоты антитела B7-H4 20502 при восстановительных и не восстановительных условиях. Образцы анализировали на системе Beckman Coulter PA800 plus (Beckman Coulter, Калифорния) с использованием капилляра с внутренним диаметром 50 мкМ без покрытия. Поглощение наблюдали при 220 нм. Чистоту 20502 в восстановительных условиях определяли путем измерения площади пиков тяжелых и легких цепей и сравнения с общей площадью всех обнаруженных пиков. Чистоту 20502 в не восстановительных условиях определяли путем измерения площади главного пика интактного белка и сравнения с общей площадью всех обнаруженных пиков.

Частицы не видимые невооруженным глазом по HIAC (AD-GEN-006).

Счетчик частиц HIAC 9703+ (Hach, Колорадо), оборудованный детектором HRDL-150 и шприцем на 1 мл. Перед использованием система была промыта не содержащей частиц водой Milli-Q (Millipore, Массачусетс) для создания чистой базовой линии. Четыре последовательных аликвоты по 0,4 мл были взяты из образцов, и количество частиц из трех последних аликвот было усреднено и зарегистрировано.

Пример 2. Биохимический анализ аминокислотных остатков антитела 20502.

Антитело к B7-H4 20502 представляет собой моноклональное антитело. Основанный на знаниях подход к составлению составов использовался для определения подходящих композиций, которые обеспечивают максимальную стабильность белка. Для этого учитывались как внутренние свойства молекулы, так и свойства компонентов состава, которые могут влиять на стабильность белка.

Аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи и легкой цепи антитела 20502 показаны в табл. 11.

Таблица 11

Первичные аминокислотные последовательности полноразмерной тяжелой цепи и легкой цепи антитела 20502

Обозначение последователь ности	Последовательность (SEQ Ш NO)
Тяжелая цепь	QLQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSIKSGSYYWGWIRQPPGKGLE WIGNIYYSGSTYYNPSLRSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYC AREGSYPNQFDPWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAAL GCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSS SLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPS VFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHN AKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIE KTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWE SNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMH EALHNHYTQKSLSLSPGK (SEQ Ш NO:21)
Легкая цепь	EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQAPRLLIY GASTRATGIPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSEDFAVYYCQQYHSFPFTFG GGTKVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQ WKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYAC EVTHQGLSSPVTKSFNRGEC (SEQ Ш NO:22)

Анализ первичной последовательности 20502 показал, что некоторые аминокислотные остатки потенциально могут подвергаться биохимическим модификациям. К ним относятся дезамидирование при аспарагине, изомеризация при аспарагиновой кислоте и окисление при метионине, цистеине, гистидине, триптофане, фенилаланине и тирозине. Аспарагины, аспарагиновые кислоты и метионины, поддающиеся деамидированию, изомеризации и окислению, соответственно, указаны жирным и серым квадратами в последовательностях в табл. 11. Потенциальные сайты биохимической деградации в 20502 отмечены в табл. 12. Эти потенциальные сайты деградации находятся вне областей CDR.

- 27 043376

Таблица 12

Потенциальные аминокислотные остатки в 20502 _______для путей химической деградации___________________

Пути деградации	Сайты	Количество сайтов
Дезамидирование	Аспарагин-глицин	2
Аспарагин-серин	3
Аспарагин-аспарагин	2
Изомеризация	Аспарагиновая кислотаглицин	2
Аспарагиновая кислотасерин	3
Окисление	Метионин	3
Г истидин	12
Триптофан	И
Цистеин	16 (четное число)
Тирозин	30
Фенилаланин	22

Чтобы разработать жидкий состав, который мог бы обеспечить хорошую стабильность для 20502, были оценены различные условия, такие как pH, типы буферов и вспомогательные вещества. Стабильность белка контролировали на основе биофизических и биохимических свойств 20502 в каждом примере. Детали исследований и их результаты описаны в настоящем документе.

Пример 3. Начальное скрининг pH.

pH состава влияет на стабильность белка. pH состава может влиять на пути биохимического разложения, такие как дезамидирование, изомеризация и окисление, а также на биофизическое разложения, такое как агрегация и фрагментация, вследствие взаимодействия между белками и окружающей их средой.

Скрининг pH был проведен для определения диапазона pH, который обеспечивает максимальную стабильность для 20502, и для понимания механизмов деградации белка в этих условиях. Детали состава, определяемые в исследовании, приведены в табл. 13.

Таблица 13

Составы, оцененные по влиянию pH на стабильность белка________

№	20502 (мг/мл)	Состав ингредиентов и концентрации	% PS20 (масс./об.)	pH
1	1,0	20 мМ Цитрат, 270 мМ сахароза	0,05	4,0
2	1,0	20 мМ Цитрат, 270 мМ сахароза	0,05	5,0
3	1,0	20 мМ гистидин, 270 мМ сахароза	0,05	6,0
4	1,0	20 мМ фосфат, 270 мМ сахароза	0,05	7,0
5	1,0	20 мМ Трис, 270 мМ Сахароза	0,05	8,0

Чтобы определить термостабильность белка при различных pH, температуру развертывания измеряли по изменению во внутренней флуоресценции при другой температуре с использованием прибора UNit. Сдвиг длины волны флуоресцентного излучения триптофана (среднее барицентрическое значение, BCM) указывает на то, что при нагревании образцов происходит событие развертывания. Фиг. 1 показывает измеренную температуру развертывания (Tm1) 20502 при различных условиях pH. Результаты показывают, что Tm1 зависит от pH. При более высоком pH (например, pH >7) наблюдалась температура развертывания в 74°C. При pH 5 и 6 температуры развертывания составляли 66°C и 70°C соответственно. При pH 4 температура развертывания составляла 55°C. Кроме того, температура начала, по-видимому, составляла ~ 50°C с использованием pH 4, но температура начала составляла 62°C или выше с использованием pH 5-8. Эти результаты демонстрируют, что составы с pH >5 будут обеспечивать лучшую термическую стабильность, чем составы с pH 4.

Стабильность 20502 при различных значениях pH также оценивали в условиях стресса при 40°C в течение до четырех недель. Все образцы оставались прозрачными и бесцветными без каких-либо частиц, наблюдаемых на протяжении всего исследования. Изменения в агрегатах и фрагментах определяли с помощью эксклюзионной ВЭЖХ. В нулевой момент времени (T0) в исследуемых составах не было обна- 28 043376 ружено видимых агрегатов для 20502 при концентрации 1 мг/мл. Через четыре недели при 40°C количество растворимых агрегатов заметно увеличилось в составах с pH 4, 7 и 8; только небольшое увеличение количества агрегатов наблюдалось в композициях с pH 5 или 6 (фиг. 2). Аналогичное влияние pH наблюдалось на образование фрагментов (фиг. 3). Результаты этого исследования показали, что 20502 наиболее стабильно при pH 5-6, как показано измерением эксклюзионной ВЭЖХ указанных свойств.

Пример 4. Детальный скрининг pH.

Результаты предварительного скринингового исследования pH показали, что антитело 20502 наиболее стабильно при pH 5-6. Было проведено детальное исследование pH для определения pH, которое обеспечивает максимальную стабильность в диапазоне от 4,5 до 6,5. Детали составов приведены в табл. 14. Это исследование было проведено с использованием цитратного буфера, чтобы минимизировать возможное влияние типов буферов на стабильность mAb. Стабильность антитела 20502 при 10 мг/мл исследовали на основе внешнего вида, агрегации, фрагментации (с помощью эксклюзионной ВЭЖХ) и вариантов заряда (iCE) в условиях стресса (40°C) в течение до трех недель.

Таблица 14

Составы, оцененные на детальное влияние pH на стабильность белка

№	Составы	% PS20 (масс./об.)	pH	Концентрация антител (мг/мл)
1	20 мМ цитрат, 270 мМ сахароза	0,05	4,5	10
2	20 мМ цитрат, 270 мМ сахароза	0,05	5,0	10
3	20 мМ цитрат, 270 мМ сахароза	0,05	5,5	10
4	20 мМ цитрат, 270 мМ сахароза	0,05	6,0	10
5	20 мМ цитрат, 270 мМ сахароза	0,05	6,5	10

Все образцы оставались прозрачными и бесцветными без каких-либо частиц, наблюдаемых на протяжении всего исследования. Результаты эксклюзионной ВЭЖХ показали, что низкий уровень агрегатов наблюдался для 20502 при концентрации 10 мг/мл в начале исследования (T0). Термический стресс в течение трех недель при 40°C приводил к зависящему от pH увеличению агрегации в порядке 4,5<5,0<5,5<6,0<6,5, в то время как фрагментация показала противоположную тенденцию (фиг. 4 и 5).

Данные iCE показали, что количество кислых вариантов увеличилось через 3 недели при 40°C. Увеличение количество кислых вариантов зависело от pH, причем порядок возрастания pH составлял 6,5/6,0/5,5<5,0<4,5 (фиг. 6).

Тот факт, что более высокие pH были связаны с повышенной агрегацией, а более низкие pH были связаны с повышенной фрагментацией, усложняло определение желаемого фармацевтического состава. В совокупности результаты исследования показывают, что составы с pH 5-6 обеспечивают наилучший общий профиль стабильности для 20502.

Пример 5. Скрининг буферов.

Как и pH, типы буферов в различной степени влияют на стабильность белка. Ускоренную стабильность 20502 при 10 мг/мл оценивали в ацетатном, цитратном, сукцинатном и гистидиновом буферах от pH 5,0 до 6,5 с шагом 0,5 единицы на основе их pKa с целью определения буфера, который обеспечит максимальную стабильность при pH 5,0 - 6,5. Подробные составы представлены в табл. 15. Эти буферы были исследованы на их влияние на стабильность белка на основе внешнего вида, агрегации, фрагментации и заряда.

Таблица 15

Виды буферов для составов, оцененные на их влияние на стабильность белка

№	Составы	% PS20 (масс./об.)	pH	Концентрация (мг/мл)
1	20 мМ ацетат, 270 мМ сахароза	0,05	5,0	10
2	20 мМ цитрат, 270 мМ сахароза	0,05	5,5	10
3	20 мМ сукцинат, сахароза 270 мМ	0,05	6,0	10
4	20 мМ гистидин, 270 мМ сахароза	0,05	6,5	10

Все образцы оставались прозрачными и бесцветными без каких-либо частиц, наблюдаемых на протяжении всего исследования. Результаты эксклюзионной ВЭЖХ, показанные на фиг. 16 показывают увеличение количества агрегатов в зависимости от буфера (pH) в этом исследовании. Агрегаты образовывались с более высокими скоростями при более высоком pH по сравнению со скоростью при более низким pH; в порядке гистидин (pH 6,5)> сукцинат (pH 6)> цитрат (pH 5,5)> ацетат (pH 5). С другой стороны, в ацетатном (pH 5) и цитратном (pH 5,5) буферах было обнаружено слегка меньшее количество фрагментов по сравнению с таковым в гистидиновых (pH 6,5) и сукцинатных (pH 6) буферах, хотя общие уровни

- 29 043376 фрагментов были низкими (0,5% - 0,7%) в течение 3 недель при 40°C (фиг. 8).

Результаты iCE показали, что буферы оказали некоторое влияние на профиль заряда 20502, как показано на фиг. 9 и фиг. 10. Но общая разница между ними составляла чуть более 10% в кислых вариантах и около 2% в основных вариантах при хранении при 40°C в течение трех недель.

Антитело 20502 было испытано в двух других стандартных составах, содержащих гистидин, но ни один из них не привел к композиции с желаемой стабильностью. На основании этих результатов был сделан вывод о том, что 20502 наиболее стабильно в ацетатном буфере при pH 5 среди всех протестированных условий составов. Нитратный буфер при pH 5,5 также обеспечивает относительно стабильный буфер для 20502.

Пример 6. Скрининг вспомогательных веществ.

Вспомогательные вещества, такие как наполнители, могут влиять на стабильность продукта. Чтобы оценить влияние вспомогательных веществ на стабильность антитела 20502, антитело в концентрации 20 мг/мл готовили в виде ацетатного и цитратного составов, содержащих хлорид натрия (NaCl), трегалозу, сорбит или сахарозу в изотонических концентрациях. Цитратные составы были составлены при pH 5,5, а ацетатные составы были составлены при pH 5,0. Два дополнительных ацетатных состава с сахарозой также готовили при pH 4,5 и 5,5. Подробные составы представлены в табл. 16. Вспомогательные вещества были исследованы на их влияние на стабильность белка на основе внешнего вида, агрегации, фрагментации и вариантов заряда при условиях хранения 40°C, 25°C и 5°C.

Таблица 16

Вспомогательные вещества для составов, оцененные на их влияние на стабильность белка

ID	Буфер	В спомогател ьные вещества	pH	% PS20 (масс./об.)	Концентрация (мг/мл)
1	20 мМ цитрат	0,9% NaCl	5,5	0,05%	20,0
2	20 мМ цитрат	10% трегалозы	5,5	0,05%	20,0
3	20 мМ цитрат	4,7% сорбита	5,5	0,05%	20,0
4	20 мМ цитрат	270 мМ сахароза	5,5	0,05%	20,0
5	20 мМ ацетат	0,9% NaCl	5,0	0,05%	20,0
6	20 мМ ацетат	10% трегалозы	5,0	0,05%	20,0
7	20 мМ ацетат	4,7% сорбита	5,0	0,05%	20,0
8	20 мМ ацетат	270 мМ сахароза	5,0	0,05%	20,0
9	20 мМ ацетат	270 мМ сахароза	4,5	0,05%	20,0
10	20 мМ ацетат	270 мМ сахароза	5,5	0,05%	20,0

Все образцы оставались прозрачными и бесцветными без каких-либо частиц, наблюдаемых в течение 4-недельного периода исследования. Результаты эксклюзионной ВЭЖХ, показанные на фиг. 11 показывают, что агрегаты 20502 образуются с более высокими скоростями в цитратных составах по сравнению с ацетатными составами. Скорость агрегации была самой высокой в составах с NaCl, и это было справедливо как для цитрата, так и для ацетата. Составы с сорбитом, трегалозой и сахарозой показали сходные изменения в агрегации как в цитратном, так и в ацетатном буферах. Что касается фрагментов, все составы были аналогичными, за исключением состава, содержащего ацетат и NaCl, который показал немного большее количество фрагментов (фиг. 12). Таким образом, хотя NaCl широко используется в фармацевтических композициях, он приводил к увеличению агрегации и фрагментации 20502. Количество фрагментов, наблюдаемых в этом исследовании, было выше, чем в предыдущих исследованиях. Это может быть связано с более высокой концентрацией белка (20 мг/мл), использованной в этом исследовании.

Вспомогательные вещества составов оказывали меньшее влияние на профиль заряда 20502 при хранении. Как показано на фиг. 13, разница в количестве кислых вариантов среди всех составов составляла менее чем 10%. Подобным образом, разница в количестве основных вариантов в пределах каждого типа буфера во всех составах составляла менее чем 2% (фиг. 14).

На основании результатов исследования вспомогательных веществ, выбрали сахарозу вместо NaCl из-за наблюдаемого уровня агрегатов. Сахароза показала схожий профиль агрегации и заряда, как и сорбит, и трегалоза. Тем не менее, сахароза является более надежной с точки зрения поставок сырья с лучшим качеством и опытом регулирования.

В совокупности результаты исследований pH, видов буферов и скрининга вспомогательных веществ показывают, что антитело 20502 было наиболее стабильным в составе, содержащем 20 мМ ацетата, 270 мМ сахарозы и 0,05% PS20 при pH 5,0. Состав, содержащий 20 мМ цитрата, 270 мМ сахарозы, 0,05% PS20 при pH 5,5, также обеспечивал хорошую стабильность.

Профиль дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК) антитела 20502 в составе, содержащем 20 мМ ацетата, 270 мМ сахарозы, 0,05% PS20 при pH 5,0, показан на фиг. 15. Наблюдалось два пика: Tm1 = 69°C и Tm2 = 84°C.

Пример 7. Устойчивость к замораживанию-оттаиванию 20502.

Исследование замораживания/оттаивания проводили путем замораживания лекарственного вещества 20502, составленного в виде 20 мг/мл белка, в 20 мМ ацетата, 270 мМ сахарозы, 0,05% PS20 при pH

- 30 043376

5,0 в количестве 500 мл при -70°C и оттаивания при температуре окружающей среды в течение 5 циклов.

Никаких видимых изменений внешнего вида, растворимых агрегатов или твердых частиц не было обнаружено (табл. 17).

Таблица 17

Стабильность состава 20502 после замораживания-оттаивания

Временные точки (месяцы)	Температура (°C)	Внешний вид	% вмм	SEC	Не видимые невооруженным глазом Материя (всего
Прозрачно сть	Цвет	% Основ ной	% нмм	/1,7 мл флакон)	>25 мкм
>2 мкм	>5 мкм	> ю мкм
0FT		Прозрачная	бесцветная	од	99,9	н/д	68	30	17	2
1FT	Заморожена при-70 ° С и	Прозрачная	бесцветная	0,1	99,9	н/д	38	11	2	0
2FT	оттаивала при	Прозрачная	бесцветная	0,1	99,9	н/д	23	2	0	0
3FT	комнатной температуре	Прозрачная	бесцветная	0,1	99,9	н/д	34	9	0	0
4FT		Прозрачная	бесцветная	0,1	99,9	н/д	34	2	0	0
5FT		Прозрачная	бесцветная	0,1	99,9	н/д	25	2	0	0

Пример 8. Стабильность при перемешивании 20502.

На 20502 создавалось перемешивающее напряжение путем заполнения лекарственного вещества 20502 в стеклянные флаконы объемом 3 см³, размещения флакон с образцами горизонтально на орбитальном шейкере и встряхивания образцов при 300 об/мин в течение 72 часов при комнатной температуре. 20502 составляли в виде 20 мг/мл белка в 20 мМ ацетата, 270 мМ сахарозы, 0,05% PS20 при pH 5,0. В образцах состава 20502 не было обнаружено видимых изменений внешнего вида, растворимых агрегатов, профилей вариантов заряда или невидимых невооруженным глазом твердых частиц (табл. 18). Все исследования проводились при комнатной температуре 20±5°C. Все образцы были прозрачны и бесцветны, и без видимых частиц.

Таблица 18

Стабильность состава 20502 после перемешивания в течение 72 ч

Время Точки	Состояние	SEC	iCE	Не видимые невооруженным глазом Материя (всего/1,7 мл флакон)
% ВММ	% Основ -ной	% НММ	% Кислотных	% Основной	% Основ- ных	>2 мкм	>5 мкм	> ю мкм	>25 мкм
0	Контроль	0,1	99,9	н/д	44,3	32,9	22,8	55	21	5	0
Т24х	Контроль	0,1	99,9	н/д	44,7	31,5	23,8	68	18	2	0
Стресс	0,1	99,9	н/д	44,7	31,5	23,8	105	9	2	0
Т48ч	Контроль	0,1	99,9	н/д	45,4	32,9	21,7	106	45	19	0
Стресс	0,1	99,9	н/д	43,3	34,3	22,4	123	23	11	0
Т72ч	Контроль	0,1	99,9	н/д	44,1	32,7	23,1	94	23	2	0
Стресс	0,1	99,9	н/д	44,9	34,5	20,6	62	9	2	0

Пример 9. Подтверждение исследований по стабильности.

Исследование стабильности было выполнено для оценки стабильности 20502 в двух составах (i) состава, содержащего 20 мг/мл белка в 20 мМ ацетата, 270 мМ сахарозы и 0,05% PS20 при pH 5,0, и (ii) состава, содержащего 20 мг/мл белка в 20 мМ цитрата, 270 мМ сахарозы и 0,05% PS20 при pH 5,5. 1,5 мл приготовленных растворов помещали в стеклянные флаконы объемом 3 см³ типа 1 с 13 мм горлышками, закрывали серыми бромбутиловыми пробками West 4023/50 для сыворотки толщиной 13 мм и герметизировали алюминиевыми уплотнениями. Совместимость системы контейнера/укупорки с антителом 20502 оценивали, помещая флаконы в перевернутые положения. Условия хранения при 5°C, 25°C и 40°C были использованы для этого исследования стабильности. Данные о стабильности за шесть месяцев, показанные в табл. с 19 по 21 для ацетатного состава и в табл. с 22 по 24 для цитратного состава.

- 31 043376

Таблица 19

Стабильность лекарственного продукта 20502 в ацетатном составе при 5°C

Анализ	Критерий приемлемости	ТО	2-8°С
1 месяц	2 месяца	3 месяца	6 месяца
Визуальный внешний вид	От прозрачного до слегка опалесцирующег о, от бесцветного до слегка желтоватого, может содержать несколько белковоподобных частиц	Соответст вует требовани ям	Соответств ует требования м	Соответств ует требования м	Соответст вует требовани ям	Соответст вует требовани ям
pH	4,5-5,5	4,9	4,9	5,0	4,9	5,0
Осмоляльность	270-370 мОсм/кг	321	325	337	324	323
Концентрация	18-22 мг/мл	19	19	20	20	20
iCIEF	% кислых пиков	37,8	37,9	36,4	35,3	37,2
% Главных пиков	51,2	49,4	51,3	49,5	47,1
% Основных пиков	11,0	12,7	12,2	15,2	15,8
SE-ВЭЖХ	<5% агрегатов	0,2	0,1	0,1	0,2	0,2
>90% мономера	99,9	99,9	99,8	99,6	99,6
% Низкомолекулярных	0	0	0,1	0,3	0,3
восстановленны й CE-SDS	>90% Тяжелой цепи и легкой цепи цепи	98,8	99,4	99,5	99,2	99,4
невосстано вленный CE-SDS	Значение(% главного пика)	94,0	93,6	93,8	93,8	93,7
Активность по ИФА связыванию	50-150% контрольного материала	100	102	NT	99	106
Активность по ADCC	Результат (% контрольного материала)	107	NP	NP	NP	95

Сокращения: NP = не планировали; NT = не проверяли; T0 = время ноль.

Таблица 20 _______Стабильность лекарственного продукта 20502 в ацетатном составе при 25°C_______

Анализ	Критерий приемлемости	ТО	25°С
1 месяц	2 месяца	3 месяца	6 месяца
Визуальный Внешний вид	От прозрачного до слегка опалесцирующего, от бесцветного до слегка желтоватого, может содержать несколько белковоподобных частиц	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
pH	4,5-5,5	4,9	5,0	54,9	4,9	5,0
Осмоляльность	270 - 370 мОсм/кг	321	330	340	329	330
Концентрация	18-22 мг/мл	19	19	20	20	20

- 32 043376

iCIEF	% кислых пиков	37,8	40,7	41,0	44,8	52,0
% Главных пиков	51,2	47,0	47,2	41,3	35,5
% Основных пиков	11,0	12,4	11,8	13,9	13,5
SE-ВЭЖХ	<5% агрегатов	0,2	0,2	0,2	0,3	0,4
>90% мономера	99,9	99,7	99,5	99,0	99,6
% Низкомолекулярных	0	0,1	0,3	0,7	ι,ο
Восстановленный СЕ- SDS	>90% Тяжелой цепи и легкой цепи	98,8	99,1	99,4	98,8	98,6
невосстано вленный CE-SDS	Значение (% главного пика)	94,0	93,3	92,8	92,1	91,2
Активность по ИФА связыванию	50-150% контрольного материала	100	101	NT	89	107
Активность по ADCC	Результат (% контрольного материала)	107	NP	NP	NP	80

Таблица 21

Стабильность лекарственного продукта 20502 в ацетатном составе при 40°С_______

Анализ	Критерий приемлемости	ТО	40°С
2 недели	1 месяц	2 месяца	3 месяца
Визуальный Внешний вид	От прозрачного до слегка опалесцирующего, от бесцветного до слегка желтоватого, может содержать несколько белковоподобных частиц	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
pH	4,5-5,5	4,9	5,0	5,0	5,0	5,0
Осмоляльность	270 - 370 мОсм/кг	321	325	330	356	350
Концентра ция	18-22 мг/мл	19	19	19	20	20
iCIEF	% кислых пиков	37,8	50,1	61,8	76,4	85,1
% Главных пиков	51,2	37,6	28,5	16,3	7,5
% Основных пиков	11,0	12,3	9,7	7,3	7,5
SE-ВЭЖХ	<5% агрегатов	0,2	0,3	0,4	0,6	1,3
>90% мономера	99,9	99,3	98,8	97,6	95,0
% Низкомолекулярных	0	0,4	0,8	1,9	3,7
восстан овленн ый CESDS	>90% Тяжелой цепи и легкой цепи	98,8	98,0	97,1	94,3	81,9
невосстано вленный CE-SDS	Значение (% главного пика)	94,0	92,7	90,2	87,0	69,7
Активность по ИФА связыванию	50-150% контрольного материала	100	88	93	NT	73
Активность по ADCC	Результат (% контрольного материала)	107	NP	NP	NP	31

-33 043376

Таблица 22

Стабильность лекарственного продукта 20502 в цитратном составе при 5°C

Анализ	Критерий приемлемости	ТО	2-8°С
1 месяц	2 месяца	3 месяца	6 месяца
Визуальный Внешний вид	От прозрачного до слегка опалесцирующего, от бесцветного до слегка желтоватого, может содержать несколько белковоподобных частиц	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
pH	5,0-6,0	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5
Осмоляльность	270 - 370 мОсм/кг	330	333	343	329	326
Концентрация	18-22 мг/мл	21	21	21	20	21
iCIEF	% кислых пиков	37,6	38,0	36,8	35,7	37,3
% Главных пиков	51,5	49,4	51,8	49,6	47,2
% Основных пиков	11,0	12,6	Н,4	14,6	15,5
эксклюзионная ВЭЖХ	<5% агрегатов	0,2	0,3	0,3	0,4	0,5
>90% мономера	99,8	99,8	99,7	99,6	99,3
% Низкомолекулярных	0	0	0,1	0	0,2
восстановленн ый CE-SDS	>90% Тяжелой цепи и легкой цепи цепи	99,1	99,5	99,7	98,8	99,3
невосстано вленный CE-SDS	Значение (% главного пика)	94,1	93,5	93,6	93,9	93,3
Активность по ИФА связыванию	50-150% контрольного материала	105	114	NT	110	102
Активность по ADCC	Результат (% контрольного материала)	97	NP	NP	NP	94

Таблица 23

Стабильность лекарственного продукта 20502 в цитратном составе при 25°C______

Анализ	Критерий приемлемости	ТО	25°С	3 месяца	6 месяца
1 месяц	2 месяца
Визуальный Внешний вид pH Осмоляльность Концентрация	От прозрачного до слегка опалесцирующего, от бесцветного до слегка желтоватого, может содержать несколько белковоподобных частиц 5,0-6,0 270 - 370 мОсм/кг 18-22 мг/мл % кислых пиков	Соответствует требованиям 5,5 330 21 37,6	Соответствует требованиям 5,5 333 21 39,8	Соответствует требованиям 5,5 345 21 41,6	Соответствует требованиям 5,5 334 20 45,2	Соответствует требованиям 5,5 328 21 53,3
iCIEF	% Главных пиков	51,5	48,2	47,0	40,7	33,4
	% Основных пиков	11,0	12,0	Н,5	14,1	13,4
	<5% агрегатов	0,2	0,6	0,7	1,0	1,3
эксклюзионная	>90% мономера	99,8	99,3	99,1	98,5	97,9
ВЭЖХ	% Низкомолекулярных	0	0,1	0,2	0,5	0,9
восстановленн ый CE-SDS	>90% Тяжелой цепи и легкой цепи цепи	99,1	99,1	99,5	98,9	98,8
невосстанов ленный CESDS	Значение (% главного пика)	94,1	93,5	93,5	92,2	91,6
Активность по ИФА связыванию	50-150% контрольного материала	105	111	NT	106	97
Активность по ADCC	Результат (% контрольного материала)	97	NP	NP	NP	62

- 34 043376

Таблица 24

Стабильность лекарственного продукта 20502 в цитратном составе при 40°C

Анализ	Критерий приемлемости	ТО	40°С
2 недели	1 месяц	2 месяца	3 месяца
Визуальный Внешний вид	От прозрачного до слегка опалесцирующего, от бесцветного до слегка желтоватого, может содержать несколько белковоподобных частиц	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям	Соответствует требованиям
рн	5,0-6,0	5,5	5,5	5,5	5,5	5,5
Осмоляльность	270-370 мОсм/кг	330	334	336	359	344
Концентрация	18-22 мг/мл	21	20	21	19	20
iCIEF	% кислых пиков	37,6	50,6	59,5	74,5	82,9
% Главных пиков	51,5	38,1	30,6	18,2	10,0
% Основных пиков	11,0	11,3	9,9	7,3	7,2
эксклюзионная ВЭЖХ	<5% агрегатов	0,2	1,0	1,3	1,8	2,7
>90% мономера	99,8	98,7	98,0	96,8	94,7
% Низкомолекулярны X	0	0,4	0,6	1,4	2,7
Восстановленный CE-SDS	>90% Тяжелой цепи и легкой цепи	99,1	97,9	97,5	96,2	87,1
невосстановленный CE-SDS	Значение(% главного пика)	94,1	93,1	91,0	88,0	77,3
Активность по ИФА связыванию	50-150% контрольного материала	105	104	101	NT	82
Активность по ADCC	Результат (% контрольного материала)	97	NP	NP	NP	40

Данные о стабильности лекарственного средства 20502 в условиях длительного хранения при 2-8°C собирали в реальном времени в ацетатных и нитратных составах в течение 6 месяцев. Все данные о стабильности соответствовали критериям приемлемости (табл. 19 и табл. 22). Никакой четкой тенденции изменений стабильности не наблюдалось ни в одном из протестированных признаков. Результаты показывают, что лекарственное средство 20502 является стабильным в обоих составах в условиях длительного хранения при 2-8°C в течение по меньшей мере 6 месяцев.

Данные о стабильности при ускоренных условиях 25°C собирали в ацетатных и цитратных составах в течение 6 месяцев. В целом, хранение в ускоренных условиях в течение 6 месяцев привело к увеличению количества кислотных пиков и уменьшению главного пика, что определено с помощью iCE; небольшому увеличение количества агрегатов и фрагментов, что определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ; незначительному снижению чистоты, определяемое по восстановленному и не восстановленному CE-SDS; и небольшому снижению активности, что определено анализом ADCC в клетках. Никаких изменений в других свойствах продукта не наблюдалось. Все данные о стабильности были в пределах приемлемых критериев.

Данные об устойчивости при стрессовых условиях при 40°C собирали в течение 3 месяцев. Некоторые изменения были более заметны в данных, собранных с течением времени. Тенденции были аналогичны тем, которые были показаны в условиях ускоренного хранения (25°C). Наблюдали количества увеличение кислых пиков и уменьшение главного пика и количества основных пиков по iCE. Увеличение количества агрегатов и фрагментов с уменьшением количества мономера наблюдали с помощью SEВЭЖХ. Кроме того,в этих условиях снижалась чистота, что продемонстрировано в результате анализа с восстановленным и не восстановленным CE-SDS. Также наблюдалось снижение активности в анализе ADCC в клетках. Эти результаты согласуются с ожидаемыми изменениями для белковых лекарственных средств, которые хранят в указанных условиях.

Вышеуказанные исследования были проведены для определения составов, которые обеспечивают максимальную стабильность для 20502. К ним относятся скрининг pH, выбор видов буферов и исследования выбора вспомогательных веществ. 20502 было наиболее стабильным в диапазоне pH 5-6 в ацетатном или цитратном буфере. 20502 также было стабильным, когда в качестве вспомогательного вещества использовалась сахароза. Был выбран состав, содержащий 20 мг/мл белка в 20 мМ ацетата, 270 мМ саха- 35 043376 розы и 0,05% PS20 при pH 5,0. Также была выбран резервный состав в виде 20 мг/мл белка в 20 мМ цитрата, 270 мМ сахарозы, 0,05% PS20, pH 5,5.

Антитело 20502 также стабильно в ацетатном составе в условиях замораживания-оттаивания и перемешивания. Ожидается, что 20502 в ацетатном составе будет стабильным как в качестве лекарственного средства при хранении при -70°C, так и в качестве лекарственного средства при хранении при 2-8°C в течение по меньшей мере 12 месяцев.

Изобретение не должно быть ограничено в объеме конкретными вариантами осуществления, описанными в настоящем документе. Действительно, различные модификации представленного в настоящем документе описания, в дополнение к описанным, будут очевидны специалистам в данной области техники из вышеуказанного описания и сопроводительных фигур. Подразумевается, что такие модификации входят в объем прилагаемой формулы изобретения.

Все ссылки (например, публикации или патенты или патентные заявки), цитированные в настоящем документе, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте и для всех целей в той же степени, как если бы каждая отдельная ссылка (например, публикация или патент или заявка на патент) была конкретно и индивидуально включена посредством ссылки во всей своей полноте для всех целей. Другие варианты осуществления находятся в пределах следующей формулы изобретения.

Перечень последовательностей.

< 110> ФАЙВ ПРАЙМ ТЕРАПЬЮТИКС, ИНК.

< 120> СОСТАВЫ АНТИТЕЛА B7-H4 < 130> 3986.013PC01/EKS/CLD/M-S <150> US 62/633 537 <151> 21.02.2018 <160>28 <170> PatentIn версия 3.5 <210>1 <211>282 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> человеческий B7-H4 <400> 1

Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu 1 5

Phe Trp Ser Ile Ile Ser Ile Ile

15

Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala 20

Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile Ser 25 30

Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr

40

Thr Val Ala Ser Ala Gly Asn Ile 45

Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys

55

Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu 60

Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu 65 70

Lys Glu Gly Val Leu Gly Leu Val

80

- 36 043376

Glu

Phe

Lys

Glu 85

Gly

Lys

Asp

Glu

Leu 90

Ser

Glu

Gln

Asp

Phe

Arg

Gly

Arg 100

Thr

Ala

Val

Phe

Ala

105

Asp

Gln

Val

Ile

Val

110

Gly

Ala

Ser

Leu

115

Arg

Leu

Lys

Asn

Val

120

Gln

Leu

Thr

Asp

Ala

125

Gly

Thr

Lys

Cys

130

Tyr

Ile

Thr

Ser

135

Lys

Gly

Lys

Gly

Asn

140

Ala

Asn

Leu

Tyr 145

Lys

Thr

Gly

Ala

Phe

150

Ser

Met

Pro

Glu

Val

155

Asn

Val

Asp

Tyr

Ala

Ser

Glu

Thr

165

Leu

Arg

Cys

Glu

Ala

170

Pro

Arg

Trp

Phe

Pro

175

Pro

Thr

Val

180

Trp

Ala

Ser

Gln

Val

185

Asp

Gln

Gly

Ala

Asn

190

Phe

Glu

Val

Ser

195

Asn

Thr

Ser

Phe

Glu

200

Leu

Asn

Ser

Glu

Asn

205

Val

Thr

Lys

Val

210

Val

Ser

Val

Leu

Tyr

215

Asn

Val

Thr

Ile

Asn

220

Asn

Thr

Tyr

Cys

225

Met

Ile

Glu

Asn

Asp 230

Ile

Ala

Lys

Ala

Thr

235

Gly

Asp

Ile

Lys

Thr

Glu

Ser

Glu

Ile

245

Lys

Arg

Ser

His

250

Leu

Gln

Leu

Asn

255

Lys

Ala

Ser

Leu

260

Cys

Val

Ser

Phe

265

Phe

Ala

Ile

Ser

Trp 270

Ala

Met

Asn

Tyr

Glu

Asn 160

Gln

Ser

Met

Ser

Val 240

Ser

Leu

Pro

Leu

275

Ser

Pro

Tyr

Leu

Met

280

Leu

Lys <210>

<211>

<212>

<213>

282

Белок

Искусственная последовательность <220>

<223>

B7-H4 яванского макака

- 37 043376 <400> 2

Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Leu Phe 1 5

Phe Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu 20 25

Gly Arg His Ser Ile Thr Val Thr Thr

40

Gly Glu Asp Gly Ile Leu Ser Cys Thr 50 55

Ser Asp Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys 65 70

His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Glu 85

Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala

100 105

Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln

115 120

Lys Cys Tyr Ile Ile Thr Ser Lys Gly

130 135

Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro 145 150

Ala Ser Ser Glu Thr Leu Arg Cys Glu

165

Pro Thr Val Val Trp Ala Ser Gln Val

180 185

Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu

195 200

Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val

210 215

Ser Ile Ile Ser Ile Ile

Ile Gly Phe Gly Ile Ser 30

Ala Ser Ala Gly Asn Ile 45

Glu Pro Asp Ile Lys Leu 60

Gly Val Ile Gly Leu Val 75 80

Ser Glu Gln Asp Glu Met 95

Gln Val Ile Val Gly Asn

110

Thr Asp Ala Gly Thr Tyr

125

Gly Asn Ala Asn Leu Glu 140

Val Asn Val Asp Tyr Asn

155 160

Pro Arg Trp Phe Pro Gln

175

Gln Gly Ala Asn Phe Ser

190

Ser Glu Asn Val Thr Met

205

Ile Asn Asn Thr Tyr Ser

220

Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys

Thr Gly Asp Ile Lys Val

- 38 043376

225

230

235

Thr Glu Ser Glu

Ile Lys Arg Arg Ser His Leu Gln Leu Leu Asn

245 250 255

Lys Ala Ser Leu

260

Cys Val Ser Ser Phe Leu Ala Ile Ser Trp Ala

265 270

240

Ser

Leu

Leu Pro Leu Ala

275

Pro Tyr Leu Met Leu Lys

280 <210> 3 <211> 283 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> B7-H4 мыши < 400> 3

Met Ala Ser Leu Gly Gln Ile Ile Phe Trp Ser Ile Ile Asn Ile 1 5 10 15

Ile Ile Leu Ala Gly Ala Ile Ala Leu Ile Ile Gly Phe Gly Ile

25 30

Gly Lys His Phe Ile Thr Val Thr Thr Phe Thr Ser Ala Gly Asn 35 40 45

Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys 50 55 60

Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys Glu Gly Ile Lys Gly Leu 65 70 75

His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp Leu Ser Gln Gln His Glu 85 90 95

Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala Asp Gln Val Val Val Gly

100 105 110

Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln Leu Thr Asp Ala Gly Thr

115 120 125

Thr Cys Tyr Ile Arg Thr Ser Lys Gly Lys Gly Asn Ala Asn Leu

130 135 140

Ile

Ser

Ile

Leu

Val 80

Met

Asn

Tyr

Glu

- 39 043376

Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met

145 150

Pro Glu Ile Asn Val Asp Tyr Asn

155 160

Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys

165

Glu Ala Pro Arg Trp Phe Pro Gln

170 175

Pro

Thr Val Ala Trp Ala 180

Ser Gln Val Asp Gln Gly Ala Asn Phe Ser

185 190

Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu Asn

195 200

Ser Glu Asn Val Thr Met

205

Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val Thr

210 215

Ile Asn Asn Thr Tyr Ser

220

Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys Ala

225 230

Thr Gly Asp Ile Lys Val

235 240

Thr Asp

Gly Pro

Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser Gln Leu Gln Leu Leu Asn Ser

245 250 255

Ser Pro Cys Val Phe Ser Ser Ala Phe Val Ala Gly Trp Ala

260 265 270

Leu Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu Arg

275 280 <210> 4 <211> 282 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> B7-H4 крысы <400> 4

Met Ala Ser Leu 1

Gly Gln Ile Ile Phe Trp 5 10

Ser Ile Ile Asn Val Ile

Ile Ile Leu Ala

Gly Ala Ile Val Leu Ile

Ile Gly Phe Gly Ile Ser 30

Gly Lys His Phe

Ile Thr Val Thr Thr Phe

Thr Ser Ala Gly Asn Ile 45

Gly Glu Asp Gly Thr Leu Ser Cys

Thr Phe Glu Pro Asp Ile Lys Leu

- 40 043376

Gly Ile Lys Gly Leu Val

80

55

Asn Gly Ile Val Ile Gln Trp Leu Lys 65 70

His Glu Phe Lys Glu Gly Lys Asp Asp 85

Phe Arg Gly Arg Thr Ala Val Phe Ala

100 105

Ala Ser Leu Arg Leu Lys Asn Val Gln

115 120

Thr Cys Tyr Ile His Thr Ser Lys Gly

130 135

Tyr Lys Thr Gly Ala Phe Ser Met Pro 145 150

Ala Ser Ser Glu Ser Leu Arg Cys Glu

165

Pro Thr Val Ala Trp Ala Ser Gln Val

180 185

Glu Val Ser Asn Thr Ser Phe Glu Leu

195 200

Lys Val Val Ser Val Leu Tyr Asn Val

210 215

Cys Met Ile Glu Asn Asp Ile Ala Lys

225 230

Thr Asp Ser Glu Val Lys Arg Arg Ser

245

Gly Pro Ser Pro Cys Val Ser Ser Val

260 265

Leu Ser Leu Ser Cys Cys Leu Met Leu

275 280

Ser Gln Gln His Glu Met

Gln Val Val Val Gly Asn

110

Thr Asp Ala Gly Thr Tyr

125

Gly Asn Ala Asn Leu Glu 140

Ile Asn Val Asp Tyr Asn

155 160

Pro Arg Trp Phe Pro Gln

175

Gln Gly Ala Asn Phe Ser

190

Ser Glu Asn Val Thr Met

205

Ile Asn Asn Thr Tyr Ser

220

Thr Gly Asp Ile Lys Val

235 240

Leu Glu Leu Leu Asn Ser

255

Ala Ala Gly Trp Ala Leu

270 <210> 5

- 41 043376 < 211> 11 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VH CDR1 < 400>5

Gly Ser Ile Lys Ser Gly Ser Tyr Tyr Trp Gly

510 < 210>6 < 211>16 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VH CDR2 < 400>6

Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr

510

Asn Pro Ser Leu Arg Ser < 210>7 < 211>12 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VH CDR3 < 400>7

Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Pro Asn Gln Phe Asp Pro

510 <210>8 <211>11 <212> Белок <213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL CDR1 <400>8

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala

510 <210>9 <211>7 <212> Белок <213> Искусственная последовательность

- 42 043376 <220>

<223> VL CDR2 <400>9

Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr 15 <210>10 < 211>9 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL CDR3 <400>10

Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Phe Thr <210>11 <211>120 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

<223>

Вариабельный домен тяжелой цепи (VH) <400>11

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 1 5 1015

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Lys Ser Gly 20 2530

Ser Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu 35 4045

Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser 50 5560

Leu Arg Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe 65 70 7580

Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr 85 9095

Cys Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Pro Asn Gln Phe Asp Pro Trp Gly Gln

100 105110

- 43 043376

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115

120 < 210> 12 < 211> 107 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Вариабельный домен легкой цепи (VL) < 400> 12

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro 1 5

Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly

15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg 20

Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Asn

30

Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro

40

Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile 45

Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr

55

Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly 60

Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr 65 70

Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser

80

Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 85

Gln Gln Tyr His Ser Phe Pro Phe

95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val

100

Glu Ile Lys 105 < 210> 13 < 211> 26 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность < 220>

< 223> VH FR1 < 400>13

Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu

5 1015

Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly

2025

- 44 043376 <210> 14 < 211> 14 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VH FR2 < 400>14

Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly

510 <210>15 <211>30 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> VH FR3 <400>15

Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys

5 1015

Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 20 2530 < 210>16 < 211>11 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VH FR4 < 400>16

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

510 < 210>17 < 211>23 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VL FR1 < 400> 17

Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15

- 45 043376

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys 20 <210> 18 <211> 15 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL FR2 <400>18

Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile Tyr

5 1015 <210>19 <211>32 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

<223> VL FR3 <400> 19

Gly Ile Pro Ala

Arg Phe Ser Gly 5

Ser Gly Ser Gly

Thr Glu Phe Thr

Leu Thr Ile

Ser Ser Leu Gln Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys 20 2530 < 210>20 < 211>10 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> VL FR4 < 400>20

Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 510 < 210>21 < 211>450 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> Полноразмерная аминокислотная последовательность тяжелой < 400> 21 цепи

- 46 043376

Gln 1

Thr

Ser

T rp

Leu 65

Ser

Cys

Gly

Phe

Leu 145

Trp

Leu

Ser

Pro

Lys 225

Leu

Tyr

Gln

Ser

Tyr 35

Leu

Leu 20

Trp

Gln 5

Thr

Gly

Ile Gly Asn Ile 50

Arg Ser Arg Val

Leu Lys Leu Ser 85

Ala Arg Glu Gly

100

Thr

Pro 130

Gly

Asn

Glu

Cys

Trp

Ser

Thr

Ile

Gly

Pro

Gly 10

Leu

Val

Lys

Pro

Ser 15

Val

Arg 40

Ser 25

Gly

Ser

Ile

Lys 30

Ser

Gln

Pro

Gly

Lys 45

Gly

Leu

Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro

60

Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln 70 75

Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr

95

Ser Tyr Pro Asn Gln Phe Asp Pro Trp Gly

105 110

Leu Val Thr Val Ser 115

Leu Ala Pro Ser Ser

135

Cys Leu Val Lys Asp

150

Ser Gly Ala Leu Thr 165

Gln Ser

Ser Ser

195

Ser Asn

210

Thr His

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

120 125

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

140

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

155

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

170 175

Ser Gly Leu Tyr 180

Leu Gly Thr Gln

Thr Lys Val Asp 215

Thr Cys Pro Pro 230

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

185 190

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

200 205

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

220

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly

235

Glu

Gly

Glu

Ser

Phe 80

Tyr

Gln

Val

Ala

Ser 160

Val

Pro

Lys

Asp

Gly 240

- 47 043376

Pro

Ser

Val

Phe

Leu

245

Phe

Pro

Lys

Pro

250

Lys

Asp

Thr

Leu

Met

255

Ser

Arg

Thr

Pro

260

Glu

Val

Thr

Cys

Val

265

Val

Asp

Val

Ser

270

His

Asp

Pro

Glu

275

Val

Lys

Phe

Asn

Trp 280

Tyr

Val

Asp

Gly

Val

285

Glu

Val

Asn

Ala

290

Lys

Thr

Lys

Pro

Arg 295

Glu

Gln

Tyr

Asn

300

Ser

Thr

Tyr

Val

305

Val

Ser

Val

Leu

Thr

310

Val

Leu

His

Gln

Asp 315

Trp

Leu

Asn

Gly

Glu

Tyr

Lys

Cys

Lys 325

Val

Ser

Asn

Lys

Ala

330

Leu

Pro

Ala

Pro

Ile

335

Lys

Thr

Ile

Ser

340

Lys

Ala

Lys

Gly

Gln

345

Pro

Arg

Glu

Pro

Gln

350

Val

Thr

Leu

Pro

355

Pro

Ser

Arg

Asp

Glu

360

Leu

Thr

Lys

Asn

Gln

365

Val

Ser

Thr

Cys

370

Leu

Val

Lys

Gly

Phe

375

Tyr

Pro

Ser

Asp

Ile

380

Ala

Val

Glu

385

Ser

Asn

Gly

Gln

Pro

390

Glu

Asn

Tyr

Lys 395

Thr

Pro

Leu

Asp

Ser

Asp

Gly 405

Ser

Phe

Leu

Tyr 410

Ser

Lys

Leu

Thr

Val

415

Lys

Ser

Arg

Trp 420

Gln

Gly

Asn

Val

425

Phe

Ser

Cys

Ser

Val

430

Met

Glu

Ala

Leu

435

His

Asn

His

Tyr

Thr

440

Gln

Lys

Ser

Leu

Ser

445

Leu

Ser

Ile

Glu

His

Arg

Lys 320

Glu

Tyr

Leu

Trp

Val 400

Asp

His

Pro

Gly

Lys

450 <210>

<211>

<212>

214

Белок

- 48 043376 <213> Искусственная последовательность <220>

<223> Полноразмерная аминокислотная последовательность <400> 22

Glu Ile 1

Val Met

Thr Gln 5

Ser Pro

Ala Thr

Leu Ser

Val Ser

Glu Arg

Ala Thr

Leu Ser

Cys Arg

Ala Ser 25

Gln Ser

Val Ser

Leu Ala

Trp Tyr 35

Gln Gln

Lys Pro 40

Gly Gln

Ala Pro

Arg Leu 45

Tyr Gly 50

Ala Ser

Thr Arg

Ala Thr 55

Gly Ile

Pro Ala

Arg Phe легкой цепи

Pro Gly 15

Ser Asn

Leu Ile

Ser Gly

Ser Gly 65

Ser Gly

Thr Glu

Phe Thr

Leu Thr

Ile Ser 75

Ser Leu

Gln Ser

Glu Asp

Phe Ala

Val Tyr 85

Tyr Cys

Gln Gln

Tyr His

Ser Phe

Pro Phe 95

Thr Phe

Gly Gly

100

Gly Thr

Lys Val

Glu Ile 105

Lys Arg

Thr Val

110

Ala Ala

Pro Ser

Val Phe 115

Ile Phe

Pro Pro

120

Ser Asp

Glu Gln

Leu Lys 125

Ser Gly

Thr Ala

130

Ser Val

Val Cys

Leu Leu 135

Asn Asn

Phe Tyr

140

Pro Arg

Glu Ala

Lys Val 145

Gln Trp

Lys Val

150

Asp Asn

Ala Leu

Gln Ser 155

Gly Asn

Ser Gln

160

Glu Ser

Val Thr

Glu Gln 165

Asp Ser

Lys Asp

170

Ser Thr

Tyr Ser

Leu Ser 175

Ser Thr

Leu Thr

180

Leu Ser

Lys Ala

Asp Tyr 185

Glu Lys

His Lys

190

Val Tyr

Ala Cys

Glu Val 195

Thr His

Gln Gly

200

Leu Ser

Ser Pro

Val Thr 205

Lys Ser

Phe Asn

Arg Gly

Glu Cys

- 49 043376

210 <210> 23 < 211> 107 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> константная область легкой цепи каппа человека <400>23

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser 1 5

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala 20

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val 35

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser

55

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr 65 70

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys 85

Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

1015

Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

2530

Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln 4045

Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser 60

Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu 7580

Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

9095

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn 100

Arg Gly Glu Cys 105 <210>24 <211>321 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> нуклеотидная последовательность константной области легкой цепи каппа человека < 400> 24 cggaccgtgg ctgcaccatc tgtcttcatc ttcccgccat ctgatgagca gttgaaatct 60 ggaactgcct ctgttgtgtg cctgctgaat aacttctatc ccagagaggc caaagtacag 120 tggaaggtgg ataacgccct ccaatcgggt aactcccagg agagtgtcac agagcaggac 180

- 50 043376 agcaaggaca gcacctacag cctcagcagc accctgacgc tgagcaaagc agactacgag 240 aaacacaaag tctacgcctg cgaagtcacc catcagggcc tgagctcgcc cgtcacaaag 300 agcttcaaca ggggagagtg t

321 <210> 25 <211> 330 < 212> Белок < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> константная область тяжелой цепи IgG1 человека < 400> 25

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 1 5 10 15

Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr 65 70 75 80

Tyr Ile Cys Asn Val Asn His 85

Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

95

Lys Val Glu Pro Lys

100

Ser Cys Asp Lys Thr His Thr 105

Cys Pro Pro Cys

110

Pro Ala Pro Glu Leu

115

Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe

120

Leu Phe Pro Pro 125

Lys Pro Lys Asp Thr 130

Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro

135 140

Glu Val Thr Cys

Val Val Val Asp Val 145

Ser His Glu Asp Pro Glu Val

150 155

Lys Phe Asn Trp

160

- 51 043376

Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala

165 170

Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val

180 185

His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr

195 200

Lys Thr Lys Pro Arg Glu 175

Ser Val Leu Thr Val Leu 190

Lys Cys Lys Val Ser Asn 205

Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile

210 215

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly

220

Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

225 230

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu

235 240

Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

245

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr

250 255

Pro Ser Asp

Ile Ala Val Glu Trp 260

Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn

265 270

Asn Tyr Lys

275

Thr Thr Pro Pro Val

280

Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe

285

Leu Tyr Ser 290

Lys Leu Thr Val Asp

295

Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn

300

Val Phe Ser 305

Cys Ser Val Met His

310

Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr

315 320

Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

325 330 <210> 26 <211> 990 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> нуклеотидная последовательность константной области тяжелой цепи IgG1 человека < 400> 26 gcctccacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg 60 ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 120

- 52 043376 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gggtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag 720 ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa

990 <210> 27 <211> 360 <212> ДНК <213> Искусственная последовательность <220>

<223> полинуклеотидная последовательность кодирующая вариабельную область тяжелой цепи 20502 <400> 27 cagctgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

-

Claims

acctgcactg tctctggtgg ctccatcaaa agtggtagtt actactgggg ctggatccgc 120 cagcccccag ggaaggggct ggagtggatt gggaacatct attatagtgg gagcacctac 180 tacaacccgt ccctcagaag tcgagtcacc atatccgtag acacgtccaa gaaccagttc 240 tccctgaagc tgagttctgt gaccgccgca gacacggcgg tgtactactg cgccagagaa 300 ggatcttacc ccaatcagtt tgatccatgg ggacagggta cattggtcac cgtctcctca 360 <210> 28 <211> 321 < 212> ДНК < 213> Искусственная последовательность <220>

< 223> полинуклеотидная последовательность кодирующая вариабельную область легкой цепи 20502 < 400> 28 gaaatagtga tgacgcagtc tccagccacc ctgtctgtgt ctccagggga aagagccacc 60 ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc agcaacttag cctggtacca gcagaaacct 120 ggccaggctc ccaggctcct catctatggt gcatccacca gggccactgg tatcccagcc 180 aggttcagtg gcagtgggtc tgggacagag ttcactctca ccatcagcag cctgcagtct 240 gaagattttg cagtttatta ctgtcagcag taccactcct tccctttcac ttttggcgga 300 gggaccaagg ttgagatcaa a 321

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Фармацевтическая композиция, содержащая (i) антитело или его антигенсвязывающий фрагмент, который специфически связывается с B7-H4 человека и содержит последовательности CDR1 VH, CDR2 VH, CDR3 VH и CDR1, CDR2 и CDR3 VL SEQ ID NO: 5-10 соответственно, (ii) буфер и (iii) pH композиции составляет от около 4,5 до около 6.
2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что композиция содержит от около 30% до около 40% кислых вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C.
3. Композиция по п.1 или 2, отличающаяся тем, что композиция содержит от около 10% до около 17% основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев хранения при 5°C.
4. Композиция по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что композиция содержит не более чем 55% кислых и основных вариантов антитела или его антигенсвязывающего фрагмента через 6 месяцев

-