EA031325B1

EA031325B1 - Циклические пептидомиметические соединения в качестве иммуномодуляторов

Info

Publication number: EA031325B1
Application number: EA201600235A
Authority: EA
Inventors: Потайил Говиндан Наир Сасикумар; Муралидхара Рамачандра; Сизарамайах Сетти Сударшан Наремаддепалли
Original assignee: Ауриген Дискавери Текнолоджиз Лимитед
Priority date: 2013-09-06
Filing date: 2014-09-05
Publication date: 2018-12-28
Also published as: LT3041468T; CA2922982A1; CY1120747T1; EP3041468B1; MX2016002970A; CU20160027A7; SMT201800433T1; EA201891818A3; EP3041468A1; PH12016500413B1; SI3041468T1; US20170101444A1; HRP20181271T1; JP6474412B2; CN105813640A; CU24363B1; IL244388A0; SG11201601685TA; AU2018271235A1; PT3041468T

Abstract

Изобретение относится к циклическим пептидомиметическим соединениям формулы (I)в которой R, R, [Aaa], R, R, R, R, R, R, Rи L имеют значения, как определено в формуле изобретения. Изобретение также относится к производным этих терапевтических средств. Кроме того, изобретение относится к применению указанных терапевтических средств и их производных для лечения расстройств посредством иммуностимуляции, включающей ингибирование иммуносупрессивного сигнала, индуцированного вследствие PD-1, PD-L1 или PD-L2, а также к терапии или лечению с их помощью.

Description

Изобретение относится к циклическим пептидомиметическим соединениям формулы (I)

031325 Bl

в которой R_b R₂, [Ааа], R₃, R₄, R₄, R_a, R.,. R_b, Ri, и L имеют значения, как определено в формуле изобретения. Изобретение также относится к производным этих терапевтических средств. Кроме того, изобретение относится к применению указанных терапевтических средств и их производных для лечения расстройств посредством иммуностимуляции, включающей ингибирование иммуносупрессивного сигнала, индуцированного вследствие PD-1, PD-L1 или PDL2, а также к терапии или лечению с их помощью.

В заявке на данное изобретение испрашивается приоритет по индийской предварительной заявке 4010/СНЕ/2013, поданной 06 сентября 2013 г., которая включена данной ссылкой полностью.

Область техники

Настоящее изобретение относится к циклическим пептидомиметическим соединениям, пригодным в качестве терапевтически иммуномодуляторов. Изобретение также относится к фармацевтическим композициям, содержащим указанные циклические пептидомиметические соединения в качестве терапевтических средств.

Предпосылки создания изобретения

Белок программируемой смерти клеток-1 (PD-1) является членом суперсемейства CD28, который обеспечивает отрицательный сигнал при взаимодействии с его двумя лигандами, PD-L1 или PD-L2. PD-1 и его лиганды широко экспрессируются и демонстрируют более широкий диапазон иммунорегуляторных влияний в активации Т-клеток и толерантность по сравнению с другими членами CD28. PD-1 и его лиганды участвуют в ослаблении инфекционного иммунитета или иммунитета к подверженности инфекциям и опухолевого иммунитета или иммунитета к образованию опухоли и облегчении хронической инфекции и прогрессирования опухоли. Биологическая значимость PD-1 и его лигандов предполагает терапевтический потенциал манипулирования пути PD-1 против различных заболеваний человека (Ariel Pedoeem et al., Curr Top Microbiol Immunol. (2011); 350:17-37).

Активация и дисфункция Т-клеток зависят от прямых и модулированных рецепторов. На основе их функционального результата совместно сигнальные молекулы могут быть разделены как костимуляторы и коингибиторы, которые положительно и отрицательно контролируют примирование, рост, дифференцировку и функциональное созревание Т-клеточного ответа (Li Shi, et al., Journal of Hematology & Oncology, 2013, 6:74).

Терапевтические антитела, которые блокируют иммунный контрольный путь программируемой смерти клеток-1 (PD-1), предотвращают снижение регуляции Т-клеток и стимулируют иммунные реакции против раковых заболеваний. Несколько ингибиторов пути PD-1 показывают устойчивую активность на различных фазах продолжающихся клинических испытаний (R.D. Harvey, Clinical Pharmacology & Therapeutics (2014); 96 2, 214-223).

Белок программируемой смерти клеток-1 (PD-1) представляет собой корецептор, который экспрессируется преимущественно Т-клетками. Связывание PD-1 с его лигандами, PD-L1 или PD-L2, имеет жизненно важное значение для физиологической регуляции иммунной системы. Основная функциональная роль сигнального пути PD-1 состоит в ингибировании самореактивных Т-клеток, которые служат для защиты от аутоиммунных заболеваний. По этой причине, элиминация пути PD-1 может привести к нарушению иммунологической толерантности, что в конечном итоге может привести к развитию патогенного аутоиммунитета. С другой стороны, раковые клетки могут временами кооптировать путь PD-1 для ухода от иммунологических механизмов. Таким образом, блокада пути PD-1 становится привлекательной целью в лечении раковых заболеваний. Современные подходы включают в себя шесть средств, которые являются или PD-1 или PD-L1 ориентированными нейтрализующими антителами или слитыми белками. Более сорока клинических испытаний продолжают реализовываться с целью лучше определить роль блокады PD-1 в различных типах раковых заболеваний (Hyun-Tak Jin et al., Clinical Immunology (AMCterdam, Netherlands) (2014), 153(1), 145-152).

Международные заявки WO 01/14557, WO 02/079499, WO 2002/086083, WO 03/042402, WO 2004/004771, WO 2004/056875, WO 2006|121168, WO 2008/156712, WO 2010/077634, WO 2011/066389, WO 2014/055897, WO 2014/059173, WO 2014/100079 и патент США № 08735553 описывают ингибирующие PD-1 или PD-L1 антитела или слитые белки.

Кроме того, международные заявки WO 2011/161699, WO 2012/168944, WO 2013/144704 и WO 2013/132317 содержат сведения о пептидных или пептидомиметических соединениях, которые способны подавлять и/или ингибировать сигнальный путь программируемой смерти клеток-1 (PD-1).

Тем не менее, все еще существует потребность в более мощных, лучших и/или селективных иммунных модуляторах пути PD-1. Настоящее изобретение относится к циклическим пептидомиметическим соединениям, которые способны подавлять и/или ингибировать сигнальный путь программируемой смерти клеток-1 (PD-1).

Краткое изложение сущности изобретения

В соответствии с настоящим изобретением представлены циклические пептидомиметические соединения или их фармацевтически приемлемые соли или стереоизомеры, которые способны подавлять и/или ингибировать сигнальный путь или путь передачи сигнала программируемой смерти клеток-1 (PD-1).

- 1 031325

В одном из аспектов настоящее изобретение относится к циклическим пептидомиметическим соединениям формулы (I)

или их фармацевтически приемлемым солям или стереоизомерам;

в которой Rj означает боковую цепь Ala, Ser, Thr или Leu;

R₂ означает боковую цепь Asp, Glu, Gln или Asn;

[Ааа] означает аминокислотный остаток, выбранный из Ser, Asp, Ala, Ile, Phe, Trp, Lys, Glu или Thr;

R₃ означает водород или алкил;

каждый R₄ и R₄ независимо друг от друга означают водород или алкил; каждый R_a и R_a' означают водород или вместе означают оксо(=О)-группу; каждый R_b и R_b' означают водород или вместе означают оксо(=О)-группу; L означает ι

-C(OHCH₂)_m-{X-CH-CH₂)_n-NHX выбирают из СН₂, О или S;

R₅ означает водород или алкил;

m представляет собой целое число от 1 до 3;

n представляет собой целое число от 2 до 20.

В еще одном аспекте настоящее изобретения относится к фармацевтической композиции, включающей соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемую соль или стереоизомер, а также к способам ее получения.

В еще одном аспекте настоящего изобретения предложено применение циклических пептидомиметических соединений формулы (I) и их фармацевтически приемлемых солей или стереоизомеров, которые способны подавлять и/или ингибировать сигнальный путь программируемой смерти клеток-1 (PD1).

Подробное описание изобретения

Настоящее изобретение относится к циклическим пептидомиметическим соединениям в качестве терапевтических средств, пригодных для лечения расстройств посредством иммуностимуляции, включающей ингибирование иммуносупрессивного сигнала, индуцированного благодаря PD-1, PD-L1 или PD-L2, и способам лечения с их помощью.

Каждый из вариантов осуществления изобретения раскрывается ниже с целью объяснения сущности настоящего изобретения, а не для ограничения его указанными вариантами. По сути, как это очевидно для специалистов в данной области техники, различные модификации и вариации могут быть выполнены в настоящем изобретении, не отклоняясь от объема или сущности настоящего изобретения. Например, признаки, показанные или описанные как часть одного варианта, могут быть использованы в другом варианте осуществления для получения в итоге еще одного варианта. Таким образом, предполагается, что настоящее изобретение охватывает такие модификации и вариации, которые входят в объем прилагаемой формулы изобретения, и их эквиваленты. Другие объекты, признаки и аспекты настоящего изобретения раскрыты в или очевидны из следующего ниже подробного описания. Должно быть понятно любому специалисту в данной области техники, что изложенное ниже является описанием только иллюстративных вариантов осуществления изобретения и не должно рассматриваться как ограничение более широких аспектов настоящего изобретения.

- 2 031325

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I)

или их стереоизомерам или фармацевтически приемлемым солям;

R₂ означает боковую цепь Asp, Glu, Gln или Asn;

[Ааа] означает аминокислотный остаток, выбранный из Ser, Asp, Ala, Ile, Phe, Trp, Lys, Glu или Thr; R₃ означает водород или алкил;

каждый R₄ и R₄' независимо друг от друга означает водород или алкил; каждый R_a и R_a' означает водород или вместе означают оксо(=О)-группу; каждый R_b и R_b' означает водород или вместе означают оксо(=О)-группу;

L означает

X выбирают из СН₂, О или S;

R₅ означает водород или алкил;

m представляет собой целое число от 1 до 3;

n представляет собой целое число от 2 до 20.

В еще одном варианте осуществления соединений формулы (I) изобретение включает в себя конкретный ряд соединений формулы (IA)

(1А) в которой R1 означает боковую цепь Ala, Ser, Thr или Leu;

R2 означает боковую цепь Asp, Glu, Gln или Asn;

[Ааа] означает аминокислотный остаток, выбранный из Ser, Asp, Ala, Ile, Phe, Trp, Lys, Glu или Thr; R3 означает водород или алкил;

каждый R₄ и R₄ независимо друг от друга означает водород или алкил;

каждый R_a и R_a означает водород или вместе означают оксо(=О)-группу;

каждый R_b и R_b' означает водород или вместе означают оксо(=О)-группу.

- 3 031325

В следующем варианте осуществления соединений формулы (I) изобретение включает в себя конкретный ряд соединений формулы (IB)

R₂ означает боковую цепь Asp, Glu, Gln или Asn;

[Ааа] означает аминокислотный остаток, выбранный из Ser, Asp, Ala, Ile, Phe, Trp, Lys, Glu или Thr.

В еще одном варианте осуществления соединения формулы (I) данное изобретение включает в себя конкретный ряд соединений формулы (IC)

R2 означает боковую цепь Asp, Glu, Gln или Asn;

В еще одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям формулы (I), в которой

Ri означает боковую цепь Ser или Thr;

R2 означает боковую цепь Asp, Asn или Glu;

[Ааа] означает аминокислотный остаток, выбранный из Ser или Thr;

R₃, R₄ и R₄ независимо означают водород;

каждый R_a и R_a вместе означают оксо(=О)-группу;

каждый R_b и R_b вместе означают оксо(=О)-группу;

L означает -C(O)-(CH2)_m-(X-CH2-CH2)n-NH-;

X означает СН₂ или О;

m представляет собой целое число от 1 до 3;

n представляет собой целое число из 2 до 20, или их фармацевтически приемлемым солям или стереоизомерам.

Описанные ниже варианты осуществления приводятся с целью раскрытия сущности настоящего изобретения и не предназначаются для его ограничения конкретными приведенными ниже примерами осуществления.

В одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формулы (I), в которой L Rs означает -^с(О)-снг-(Х-сн-сн₂)_п -νη-, где χ, n и R₅ имеют такие же значения, как определено в формуле (I).

В другом варианте осуществления, в частности, представлены соединения формулы (I), в которой L Rs 1 означает ^с(°НСН₂)_П1-(0-сн-сн2)_п -νη-, где m, n и R₅ имеют такие же значения, как определено в формуле (I).

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формулы (I), в которой L означает -C(O)-(CH2)m-(X-CH2-CH2)n-NH-, где m, n и X имеют такие же значения, как определено в формуле (I).

- 4 031325

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формулы (I), в котоR₅

I рой L означает ’^с(°Н^сн2)т-(^х-^сн-^сн2)2-К^н-, _Где _т, χ и R₅ имеют такие же значения, как определено в формуле (I).

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формулы (I), в которых L означает -C(O)-(CH2)-(OCH₂CH2)2-NH-. В другом варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA) (IB) и (IC), в которых R, означает боковую цепь Ser.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA), (IB) и (IC), в которых R| означает боковую цепь Thr.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA) и (IB), в которых R₂ означает боковую цепь Asp.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA), (IB) и (IC), в которых R₂ означает боковую цепь Asn.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA), (IB) и (IC), в которых R₂ означает боковую цепь Glu.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA), (IB) и (IC), в которых [Ааа] означает Ser.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA), (IB) и (IC), в которых [Ааа] означает Thr.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA) и (IB), в которых [Ааа] означает Asp.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA) и (IB), в которых [Ааа] означает Lys или Ile.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I), (IA) и (IB), в которых одна, несколько или все аминокислоты являются D аминокислотами.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I) и (IA), в которых R₄ означает С_-5алкил, такой как метил.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I) и (IA), в которых R4 означает С1_-5алкил, такой как метил.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I) и (IA), в которых оба Ra и R_a означают водород.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I) и (IA), в которых оба R_b и R_b' означают водород.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I) и (IA), в которых оба R_a и R_a' вместе означают оксо(=О)-группу.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I) и (IA), в которых оба R_b и R_b вместе означают оксо(=О)-группу.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I) и (IA), в которых оба R₄ и R₄ означают водород.

В еще одном варианте осуществления, в частности, представлены соединения формул (I) и (IA), в которых R₃ означает водород.

В одном варианте осуществления конкретные соединения формулы (I), без каких-либо ограничений, перечислены в табл. 1.

- 5 031325

Таблица 1

Номер соединения	Структурная формула	Номер соединения	Структурная формула
1.	□ а	NH NH \.O	8.	&-Αθ с HN NH он
	о Н₂С	V.		°Д Е
	н₂с	NH3
	О /о н_?с. ЫН ^н °но		НО% >_Ν--^ΝΗ О н : 1 V ⁰NH_?
2.	он		9	0-/^0
An	NH		у уо
	Н₂С Н	NH		HN NH он
	О н_?с Н₂С ч	\лО ΓΥΝΗ, ΝΗθ /о		°Д Е / HN NH ^Н° ^^NHо н~У
	H₂C_S Ηΐο-_Ν_^ Н О	ΝΗ ^J- ОН		Оу ° nh₂
3.	он		10.	O-^~-Q
оул An	NH /	у у°
	н₂с н	N		HN NH ОН
	О Н₂С н₂с	NH 0		с г ^HN. NH
	%	/о		^Н0 >-ы ^^NH <у ΰ’τΎ
	HtC.^ ^H*^C-N^ н о	NH '-OH		о νη₂
4.		.0	11.	О--А'О
HN	NH OH	у Vy
	Ο=ί	...(
	ДΛ° ___^ΖΙ . '—о I	Ao NH . NH 0		нГ^ну _oy—y
	nh₂			Oy ⁰
				OH
5.	0—	0	12.	0~A0
	c	№	у y°
	HN	NH OH		HN NH OH
	¢(..			°4 ./
	> К _^^NHой'1 V ⁰		^Ηθ о^ЛУ oy ⁰
	nh₂			OH

- 6 031325

6.	5 № UN NH ОН “Я к Л HN NH V <^ΝΗ но νη₂	13.	ο-Ν^-ο Λ ^νι° ΗΝ ΝΗ ΟΗ °Д Ε Γ ΗΝ„ ΝΗ ^Η0 ___^-ΝΗ θ Η~^ Ο^^Η and
7.	г <^·° Д ή ( ΗΝ ΝΗ νη₂ Ήν__<^ΝΗ ⁰ ηΤΛ Ογ·· ⁰ νη₂	14.	г'' HN ΝΗ ОН b b

или их фармацевтически приемлемые соли или стереоизомеры.

Соединения, раскрытые в настоящем изобретении, формулируются для фармацевтического введения.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, содержащей по меньшей мере одно соединение по любому из пп.1-8 или его фармацевтически приемлемую соль или стереоизомер и фармацевтически приемлемый носитель или наполнитель.

В другом варианте осуществления изобретения указанная фармацевтическая композиция дополнительно содержит по меньшей мере одно из веществ, выбранных из противоракового средства, химиотерапевтического средства или антипролиферативного вещества.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям, как описано в настоящем изобретении, для применения в качестве лекарственного средства.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям, как описано в настоящем изобретении, для применения в качестве лекарственного средства для лечения раковых заболеваний.

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям, как описано в настоящем изобретении, для применения в качестве лекарственного средства для лечения бактериальных инфекционных заболеваний, вирусных инфекционных заболеваний или грибковых инфекционных заболеваний.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям, как описано в настоящем изобретении, для применения в получении лекарственного средства для лечения рака груди, рака кишечника, рак легких, меланомы, рака предстательной железы, рака почки, костного рака, рака головы или шеи, рака поджелудочной железы, рака кожи, кожной или внутриглазной злокачественной меланомы, рака матки, рака яичников, рака прямой кишки, рака анальной области, рака желудка, рака яичек, рака матки, карциномы фаллопиевых труб, карциномы эндометрия, карциномы шейки матки, карциномы влагалища, карциномы вульвы, болезни Ходжкина, неходжкинской лимфомы, рака пищевода, рака тонкой кишки, рака эндокринной системы, рака щитовидной железы, рака паращитовидной железы, рака надпочечника, саркомы мягких тканей, рака уретры, рака полового члена, хронического или острого лейкоза, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, солидных опухолей детского возраста, лимфоцитарной лимфомы, рака мочевого пузыря, рака почки или мочеточника, карциномы почечной лоханки, опухоли центральной нервной системы (ЦНС), первичной лимфомы ЦНС, ангиогенеза опухоли, опухоли спинного мозга, глиомы ствола головного мозга, аденомы гипофиза, саркомы Капоши, эпидермоидного рака, плоскоклеточного рака, Т-клеточной лимфомы, рака обусловленного факторами окружающей среды, включающими спровоцированного асбестом, а также комбинаций указанных видов рака.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям, как описано в настоящем изобретении, для применения при лечении раковых заболеваний.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к соединениям, как описано в настоящем изобретении, для применения при лечении бактериальных инфекционных заболеваний, вирусных инфекционных заболеваний или грибковых инфекционных заболеваний.

В одном варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу лечения раковых заболеваний, который включает введение эффективного количества соединения по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении.

- 7 031325

В другом варианте осуществления настоящее изобретение относится к способу ингибирования роста опухолевых клеток и/или метастаз путем введения эффективного количества соединения по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении.

Указанные клетки опухоли включают раковые заболевания, такие как, но не ограничиваясь ими, меланому, рак почки, рак предстательной железы, рак груди, рак кишечника, рак легких, костный рак, рак поджелудочной железы, рак кожи, рак головы или шеи, кожную или внутриглазную злокачественную меланому, рак матки, рак яичников, рак прямой кишки, рак анальной области, рак желудка, рак яичек, карциному фаллопиевых труб, карциному эндометрия, карциному шейки матки, карциному влагалища, карциному вульвы, болезнь Ходжкина, неходжкинскую лимфому, рак пищевода, рак тонкой кишки, рак эндокринной системы, рак щитовидной железы, рак паращитовидной железы, рак надпочечников, саркому мягких тканей, рак уретры, рак полового члена, хронический или острый лейкоз, включая острый миелоидный лейкоз, хронический миелоидный лейкоз, острый лимфобластный лейкоз, хронический лимфоцитарный лейкоз, солидные опухоли детского возраста, лимфоцитарную лимфому, рак мочевого пузыря, рак почки или мочеточника, карциному почечной лоханки, опухоль центральной нервной системы (ЦНС), первичную лимфому ЦНС, ангиогенез опухоли, опухоль спинного мозга, глиомы ствола головного мозга, аденому гипофиза, саркому Капоши, эпидермоидный рак, плоскоклеточный рак, Т-клеточную лимфому, рак, обусловленный факторами окружающей среды, включающими спровоцированный асбестом, а также комбинации указанных видов раковых заболеваний.

Тем не менее еще один вариант осуществления настоящего изобретения относится к способу лечения инфекции посредством иммуностимуляции, вызванной ингибированием иммуносупрессивного сигнала, индуцированного PD-1, PD-L1 или PD-L2, причем способ включает введение эффективного количества соединения по настоящему изобретению субъекту, нуждающемуся в лечении.

Инфекционные заболевания включают в себя, но не ограничиваясь ими, ВИЧ, грипп, герпес, лямблии, малярию, лейшманию, патогенные инфекции, вызванные вирусом гепатита (А, В и С), вирус герпеса (например, VZV, HSV-I, HAV-6, HSV-II и CMV, вирус Эпштейна-Барра), аденовирус, вирус гриппа, флавивирусы, ЕСНО-вирус, риновирус, вирус Коксаки, короновирус, респираторно-синцитиальный вирус, вирус эпидемического паротита, ротавирус, вирус кори, вирус краснухи, парвовирус, вирус коровьей оспы, вирус Т-клеточного лейкоза человека (HTLV), вирус денге, вирус папилломы, вирус моллюсков, вирус полиомиелита, вирус бешенства, полиомавирус человека 2 (вирус JC) и вирус арбовирусного энцефалита, патогенные инфекции, вызванные хламидии бактериями, риккетсиозные бактерии, микобактерии, стафилококки, стрептококки, пневмококки, менингококки и конококки, Klebsiella, Proteus, Serratia, Pseudomonas, E.coli, Legionella, дифтерия, сальмонеллез, бациллы, холера, столбняк, ботулизм, сибирская язва, чума, лептоспироз и бактерии болезни Лайма (Lyme), патогенные инфекции, вызванные грибами Candida (Albicans, Krusei, Glabrata, Tropicalis и т.д.), Cryptococcus neoformans, Aspergillus (Fumigatus, Niger и т.д.), рода Mucorahc (Mucor, Absidia, Rhizophus), Sporothrix schenkii, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidioidsc brasiliensis, Coccidioidsc immitis и Histoplasma capsulatum и патогенные инфекции, вызванные паразитами Entamoeba histolytica, Balantidium coli, Naegleriafowleri, Acanthamoeba sp., Giardia lambia, Cryptosporidium sp., Pneumocystis carinii, Plasmodium vivax, ВаЬэаа microti, Trypanosoma brucei, Trypanosoma cruzi, Leishmania donovani, Toxoplasma gondi, Nippostrongylus brasiliensis.

Соединения по настоящему изобретению могут быть использованы отдельно или в виде фармацевтической композиции, в которой соединение смешивают с различными фармакологически приемлемыми веществами.

Фармацевтическая композиция, как правило, вводится перорально или путем ингаляции, но может быть введена парентеральным путем. В практике настоящего изобретения композиции могут быть введены, например, перорально, внутривенным вливанием, местно, внутрибрюшинно, внутрь мочевого пузыря или интратекально. Примеры парентерального введения включают, но не ограничиваясь ими, внутрисуставный (в суставы), внутривенный, внутримышечный, внутрикожный, внутрибрюшинный и подкожный пути введения; включают водные и неводные изотонические стерильные инъекционные растворы, которые могут содержать антиоксиданты, буферы, бактериостатические факторы и растворенные вещества, которые придают композиции изотоничность с кровью предполагаемого реципиента, а также водные и неводные стерильные суспензии, которые могут включать суспендирующие средства, солюбилизаторы, загустители, стабилизаторы и консерванты. Предпочтительными способами введения являются пероральный, парентеральный, подкожный и внутривенный пути введения.

Дозировка соединений по настоящему изобретению варьируется в зависимости от возраста, веса, симптомов, терапевтического эффекта, режима дозирования и/или времени лечения. Как правило, соединения могут быть введены перорально или путем ингаляции в количестве от 1 до 100 мг в течение времени от одного до двух дней, один раз в течение 3 дней, один раз в течение 2 дней, один-два раза в день, в случае взрослого субъекта, или непрерывно вводят перорально или путем ингаляции от 1 до 24 ч в сутки. Поскольку дозировка зависит от различных условий, иногда может потребоваться количество, которое будет меньше указанной выше дозы, или в некоторых случаях могут потребоваться более высокие дозы.

- 8 031325

Соединения по настоящему изобретению могут быть введены в комбинации с другими лекарственными средствами для (1) комплементации и/или усиления профилактической и/или терапевтической эффективности профилактического и/или терапевтического лекарственного средства по настоящему изобретению; (2) динамики, улучшения абсорбции, уменьшения дозировки профилактического и/или терапевтического лекарственного средства по настоящему изобретению и/или (3) снижения побочных эффектов профилактического и/или терапевтического лекарственного средства по настоящему изобретению.

Совместное лечение препаратом, содержащим соединения по настоящему изобретению и другое лекарственное средство, может включать введение его в виде комбинированного препарата, в котором оба компонента содержатся в одной дозировке, или в виде отдельных составов. Введение путем отдельных составов включает в себя одновременное введение и введение с некоторыми временными интервалами. В случае введения с некоторыми интервалами времени соединение по настоящему изобретению можно быть введено первым с последующим введением другого лекарственного средства или первым может быть введено другое лекарственное средство с последующим введением соединения по настоящему изобретению. Способы введения соответствующих препаратов и лекарственных средств могут быть одинаковыми или различными.

Дозировка другого лекарственного средства может быть подобрана на основе клинически ранее использованной дозы. Соотношение компонентов в составе соединения по настоящему изобретению и другого лекарственного средства может быть соответствующим образом выбрано в зависимости от возраста и веса субъекта, подлежащего лечению, способа введения, времени введения, подлежащего лечению заболевания, его симптомов и сочетания всего перечисленного. Например, другое лекарственное средство может быть использовано в количестве от 0,01 до 100 мас.ч. в расчете на 1 мас.ч. соединения по настоящему изобретению. Другое лекарственное средство может быть комбинацией двух или более видов произвольных лекарственных средств в требуемой пропорции. Другое лекарственное средство, которое дополняет и/или усиливает профилактическую и/или терапевтическую эффективность соединения по настоящему изобретению, включает в себя не только известные, но те, которые будут обнаружены в будущем лекарственные средства на основе приведенного выше механизма сочетания.

Болезни, на которые это совместное использование оказывает профилактический и/или терапевтический эффект, конкретно не ограничены. Совместное применение лекарственных средств может быть использовано для любых заболеваний до тех пор, пока оно дополняет и/или усиливает профилактическую и/или терапевтическую эффективность соединения по настоящему изобретению.

Соединение по настоящему изобретению может быть использовано с существующими химиотерапевтическими средствами одновременно или в виде смеси. Примеры химиотерапевтических средств включают алкилирующие, нитрозомочевинные средства, антиметаболиты, противоопухолевые антибиотики, растительные алкалоиды, ингибиторы топоизомеразы, гормональные препараты, гормональные антагонисты, ингибиторы ароматазы, ингибиторы Р-гликопротеина, платиновые комплексные производные, другие иммунотерапевтические препараты и другие противораковые препараты. Кроме того, оно может быть использовано с дополнительными средствами лечения раковых заболеваний, такими как средство лечения лейкопении (нейтропении), средство лечения тромбоцитопении, противорвотное и обезболивающее средство при раке, совместно или в виде смеси.

В одном варианте осуществления соединение(я) по настоящему изобретению может(гут) быть использованщ(ы) с другими иммуномодуляторами и/или усиливающими агентами совместно или в виде смеси. Примеры иммуномодуляторов включают различные цитокины, вакцины и вспомогательные вещества. Примеры таких цитокинов, вакцин и вспомогательных веществ, стимулирующих иммунные реакции, включают, но не ограничиваются ими, GM-CSF (гранулоцито-макрофагоколониестимулирующий фактор), M-CSF (колониестимулирующий фактор макрофагов), G-CSF (гранулоцитарный колониестимулирующий фактор), α, β, или γ интерферон, IL-1 (интерлейкин 1), IL-2 (интерлейкин 2), IL-3 (интерлейкин 3), IL-12 (интерлейкин 12), поли (ЕС) (полиинозиновая кислота:полицитидиловая кислота) и C_pG (цитозин-фосфат-гуанин).

В другом варианте осуществления потенциальные агенты включают циклофосфамид и аналоги циклофосфамида, анти-TGFe (трансформирующий ростовой фактор бета) и иматиниб (Gleevac), ингибиторы митоза, такие как паклитаксел, сунитиниб (Sutent) или другие антиангиогенные средства, ингибиторы ароматазы, такие как летрозол, антагонист А2а аденозинового рецептора (A2AR), ингибиторы ангиогенеза, антрациклины, оксалиплатин, доксорубицин, антагонисты TLR4 (толл-подобного рецептора 4) и антагонисты IL-18 (интерлейкин 18).

Если не указано иное, все используемые в данном описании технические и научные термины имеют те значения, которые обычно используются специалистами в области техники, к которой принадлежит предмет настоящего изобретения. Следующие используемые в данном описании определения приводятся ниже для того, чтобы облегчить понимание настоящего изобретения.

Используемый в данном описании термин алкил относится к углеводородной цепи, которая включает в себя исключительно атомы углерода и водорода в основной цепи, не содержащей ненасы

- 9 031325 щенных связей и содержащей от 1 до 20 атомов углерода (т.е. С1_₂оалкил) или от 1 до 10 атомов углерода, (т.е. С_1-10алкил) или от 1 до 5 атомов углерода (т.е. C1.5алкил), и который присоединен к остальной части молекулы одинарной связью, например, включающий, но не ограниченный ими, метил, этил, пропил, бутил, изобутил, втор-бутил, трет-бутил, изопентил или неопентил. Если не указано иное, все описанные или заявленные алкильные группы могут быть прямой или разветвленной углеводородной цепью, замещенной или незамещенной.

Используемый в данном описании термин аминокислота относится к аминокислотам, имеющим L- или D-стереохимию на альфа-углероде.

Используемый в данном описании термин соединение(я) относится к соединениям, раскрытым в настоящем изобретении.

Используемый в данном описании термин содержать или содержащий, как правило, используется в смысле содержания, т.е. допускающего наличие одного или нескольких признаков или компонентов.

Используемый в данном описании термин включающий, а также другие формы, такие как включают, включает и включенный, не является ограничивающим.

Термин фармацевтически приемлемая соль в данном описании означает активный ингредиент, который содержит соединение формулы (I) в форме одной из его солей, в частности, если указанная форма соли обеспечивает улучшенные фармакокинетические свойства активного ингредиента по сравнению со свободной формой активного ингредиента, или в форме любой другой соли активного ингредиента, используемой ранее. Форма фармацевтически приемлемой соли активного ингредиента может также обеспечить этот активный ингредиент впервые желаемым фармакокинетическим свойством, которым оно не обладало ранее, и может даже оказывать положительное влияние на фармакодинамику этого активного ингредиента в отношении его терапевтической эффективности в организме.

Термин фармацевтически приемлемый означает то, что приемлемо при приготовлении фармацевтической композиции, которая, как правило, является безопасной, нетоксичной и ни биологически, ни иным образом нежелательной, и включает в себя то, что является приемлемым для ветеринарии, а также фармацевтического применения у человека.

Термин стереоизомеры относится к любым энантиомерам, диастереоизомерам или геометрическим изомерам соединений формулы (I), где бы они не являлись хиральными, или когда они несут одну или более двойных связей. Когда соединения формулы (I) и соответствующие формулы являются хиральными, они могут существовать в рацемической или оптически активной форме. Так как фармацевтическая активность рацематов или стереоизомеров соединений в соответствии с изобретением может отличаться, желательным может быть использование энантиомеров. В этих случаях конечный продукт или даже промежуточные продукты могут быть разделены на энантиомерные соединения химическими или физическими способами, известными специалистам в данной области техники, или даже использоваться как таковые в синтезе. В случае рацемических аминов диастереомеры образуются из смеси путем реакции с оптически активным разделяющим веществом. Примерами подходящих разделяющих веществ являются оптически активные кислоты, такие как R- и S-формы винной кислоты, диацетилвинной кислоты, дибензоилвинной кислоты, миндальной кислоты, яблочной кислоты, молочной кислоты, подходящих N-защищенных аминокислот (например, N-бензоилпролина или N-бензолсульфонилпролина) или различные оптически активные камфосульфоновые кислоты. Также предпочтительным является хроматографическое разделение энантиомера с помощью оптически активного разделяющего вещества (например, динитробензоилфенилглицина, триацетата целлюлозы или других производных углеводов или хирально модифицированных полимеров метакрилата, иммобилизованных на силикагеле).

Термин субъект включает млекопитающих (в частности, человека) и других животных, таких как домашние животные (например, домашние прирученные животные, включая кошек и собак) и внедомашние животные (такие как дикие животные).

Фраза терапевтически эффективное количество или эффективное количество относится к количеству соединения(ий) по настоящему изобретению, достаточному для (I) лечения или профилактики конкретного заболевания, расстройства или синдрома; (II) ослабления, облегчения или устранения одного или более симптомов конкретного заболевания, расстройства или синдрома или (III) предотвращения или задерживания начала одного или более симптомов конкретного из описанных выше заболевания, расстройства или синдрома. В случае ракового заболевания терапевтически эффективное количество лекарственного средства может уменьшать число раковых клеток; уменьшать размер опухоли; ингибировать (т.е. замедлить до некоторой степени и в качестве альтернативы остановить) инфильтрацию раковых клеток в окружающие соседние органы; подавлять (т.е. замедлить до некоторой степени и в качестве альтернативы остановить) метастазирование опухоли; ингибировать до некоторой степени рост опухоли и/или облегчить в некоторой степени один или более симптомов, связанных с раковым заболеванием. В случае инфекционных болезненных состояний терапевтическое эффективное количество означает количество, достаточное для уменьшения или ослабления инфекционных заболеваний, симптомов, вызванных бактериальной, вирусной и грибковой инфекциями.

- 10 031325

Встречающиеся в природе аминокислоты обозначены в данном описании с помощью традиционных трехбуквенных сокращений, указанных в табл. 2.

Таблица 2

Наименование	3-буквенный код	Наименование	3-буквенный код
Аланин	Ala	Лейцин	Leu
Аспарагин	Asn	Лизин	Lys
Аспарагиновая кислота	Asp	Фенилаланин	Phe
Глутаминовая кислота	Glu	Серин	Ser
Глутамин	Gln	Треонин	Thr
Изолейцин	ile	Триптофан	Trp

Сокращения, используемые по всему описанию, кратко подытожены ниже с расшифровкой их значений.

°C (градус по Цельсию); δ (дельта); % (процент); соляной раствор (раствор NaCl); bs или brs (широкий синглет); Bzl (бензил); Cbz (карбоксибензил); Cbz-Cl (бензилхлорформиат); ОЫгаг/ДХМ (дихлорметан); Cs₂CO₃ (карбонат цезия); ДМФ (диметилформамид); ДМСО (диметилсульфоксид); DIPEA/DIEA (Ν,Ν-диизопропилэтиламин); ДМСО-б₆ (дейтерированный ДМСО); d (дуплет); EtOAc (этилацетат); Et₂NH (диэтиламин); Fmoc (флуоренилметилоксикарбонила); Fmoc-Cl (хлорид флуоренилметилоксикарбонила); г или гр (грамм); Н или Н₂ (водород); Н₂О (вода); HOBt/HOBT (1-гидроксибензотриазол); HCl (соляная кислота); ч (часы); HATU (2-(2-(1Н-7-азабензотриазол-1-ил)-1,1,3,3тетраметилурангексафторфосфатметан-аминий); Гц (герц); ВЭЖХ (высокоэффективная жидкостная хроматография); ЖХ-МС (жидкостная хроматография-масс-спектроскопия); МеОН/СН₃ОН (метанол); ммоль (миллимоль); М (молярность); мкл/мкл (микролитр); мл (миллилитр); мг (миллиграмм); мин (минуты); m (мультиплет); мм (миллиметр); МГц (мегагерц); МС (ЭС) (масс-спектроскопия-электро спрей); Na (натрий); NaOBu^t (трет-бутоксид натрия); NH2NH2-H2O (гидрат гидразина); Na2SO4 (сульфат натрия); N2 (азот); ЯМР (спектроскопия ядерного магнитного резонанса); NaHCO3 (бикарбонат натрия); Pd-C (паллатий на угле); 10% Pd/C (активированный 10% палладия уголь); Pd(OH)2 (гидроксид палладия); PD-L1 (лиганд 1 программируемой смерти); PD-L2 (лиганд 2 программируемой смерти); препаративная ВЭЖХ/преп-ВЭЖХ (препаративная высокоэффективная жидкостная хроматография); РуВОР (бензотриазол-1-илокси) трипирролидинофосфоний гексафторфосфат); RT/rt (комнатная температура); s (синглет); ^tBU/tBU (третичный бутил) TEA/Et3N (триэтиламин); ТФК (трифторуксусная кислота); ТСХ (тонкослойная хроматография); ТГФ (тетрагидрофуран); ТФК/C’FX’OOH (трифторуксусная кислота); t (триплет);

tR (время удерживания) и т.д.

Экспериментальная часть

Вариант осуществления настоящего изобретения обеспечивает получение соединений формулы (I) в соответствии с процедурами следующих примеров при использовании соответствующих веществ. Специалисты в данной области техники согласятся, что для получения этих соединений могут быть использованы известные вариации условий и процессов следующих препаративных процедур. Кроме того, с помощью описанных подробно процедур средний специалист в данной области может подготовить дополнительные соединения по настоящему изобретению.

Исходные материалы, как правило, доступны из коммерческих источников, таких как фирма Sigma-Aldrich, США или Германии; фирма Chem-Impex, США; фирма G.L. Biochem, Китай и фирма Spectrochem, Индия.

Очистка и характеристика соединений

Метод аналитической ВЭЖХ: Аналитическую ВЭЖХ проводят с использованием колонки ZIC HILIC 200 А (4,6x250 мм, 5 мкм) при скорости потока: 1,0 мл/мин. Используемые условия элюирования: буфер А: 5 ммоль ацетата аммония, буфер Б: ацетонитрил, уравновешивание колонки выполняют с помощью 90% буфера Б и элюирование - градиентом от 90 до 40% буфера Б в течение 30 мин.

Препаративная ВЭЖХ, метод А: Сырой продукт очищают с помощью препаративной ВЭЖХ с использованием колонки ZIC HILIC 200 А (21,2x150 мм, 5 мкм). Используемые условия элюирования: элюент: А: 5 ммоль ацетата аммония и Б: ацетонитрил, скорость потока: 18 мл/мин. Соединение элюируют градиентным элюированием 0-3 мин = 90% буфера Б, 3-20 мин = 90-40% буфера Б при скорости потока 20 мл/мин.

Препаративная ВЭЖХ, метод В: Препаративную ВЭЖХ проводят с использованием колонки SeQuant ZIC HILIC 200 А (10x250 мм, 5 мкм) при скорости потока: 5,0 мл/мин. Используемые условия элюирования: буфер А: 5 ммоль ацетата аммония (доведение до рН-4 с помощью уксусной кислоты), буфер Б: ацетонитрил, уравновешивание колонки выполняют с помощью 90% буфера Б и элюирование градиентом от 90 до 40% буфера Б в течение 20 мин.

- 11 031325

ЖХ-МС проводят на AP1 2000 LC/MC/MC (метод жидкостной хроматографии/тандемной массспектрометрии или метод ЖХ/МС/МС) три четверти (приложенных биосистем) с ВЭЖХ серии Agilent 1100 с G1315 В DAD с использованием колонки Mercury МС, или с помощью Agilent LC/MCD VL одной четверти с ВЭЖХ серии Agilent 1100 с G1315 В DAD с использованием колонки Mercury MC, или с помощью Shimadzu ЖХ-МС 2020 одной четверти с системой Prominence UFLC с SPD-20 A DAD.

Пример 1. Синтез соединения 1.

Стадия 1а.

Гидроксид натрия (12,2 г, 305 ммоль) и Cbz-Cl (12,5 г, 73 ммоль) добавляют к раствору соединения 1а (10,0 г, 61 ммоль) в воде (100 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 3 ч. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Реакционную массу разделяют между раствором лимонной кислоты и этилацетатом. Органический слой промывают водой, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением 11 г соединения 1b (выход: 61,1%).

ЖХ-МС: 298,0 (М+Н)⁺.

Стадия 1b.

DIPEA (3,5 г 26,8 ммоль) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 1b (4,0 г,

13,4 ммоль) и HATU (5,6 г, 14,7 ммоль) в ДМФ (50 мл) и смесь оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение более 5 мин. К вышеуказанной реакционной смеси медленно добавляют L-Ser(^tBu)-OMe-HCl (3,5 г, 20,1 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Реакционную смесь гасят льдом, осажденное твердое вещество отфильтровывают и перекристаллизовывают с помощью CH₂Cl₂ с получением 6 г соединения 1с.

ЖХ-МС: 454,8 (М+Н)⁺.

Стадия 1с.

99% раствор гидразин гидрата (10 мл) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 1с (6 г) в метаноле (50 мл) и перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ. Реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении и получают 5,8 г соединения 1d.

ЖХ-МС: 455,0 (М+Н)⁺.

Стадия 1d.

DIPEA (3,3 г, 25,4 ммоль) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 1d (5,8 г, 12,7 ммоль), HATU (5,8 г, 15,2 ммоль) в ДМФ (50 мл) и оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение 5 мин. Затем к реакционной смеси добавляют Fmoc-L-Asn-OH (4,9 г, 14,0 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Реакционную смесь затем гасят льдом, осажденное твердое вещество отфильтровывают и перекристаллизовывают с помощью CH₂Cl₂ с получением 5,9 г соединения 1е.

ЖХ-МС: 791,0 (М+Н)⁺.

Стадия 1е.

- 12 031325

Защитную Fmoc-группу соединения 1е [(5,9 г в CH₂Cl (60 мл)] удаляют с использованием диэтиламина (60 мл), и завершение реакции подтверждается анализом ТСХ. Реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении и получают 1,6 г соединения 1f.

ЖХ-МС: 568,8 (М+Н)⁺.

Стадия 1f.

Соединение 11 (1,3 г, 3,0 ммоль) и соединение 1f (1,60 г, 2,8 ммоль) растворяют в ТГФ (10 мл) и перемешивают при комнатной температуре. Связывание инициируют добавлением триэтиламина (0,57 г, 5,6 ммоль) в вышеуказанную реакционную смесь и реакционную смесь оставляют перемешиваться в течение 12 ч при комнатной температуре. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Органический слой промывают NaHCO₃, раствором лимонной кислоты, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением 0,45 г соединения 1g.

Стадия 1g.

Удаление защитных Cbz-группы и бензилового эфира на соединении 1g (0,45 г) в метаноле проводят с использованием гидроксида палладия (0,5 г) в течение 1 ч при комнатной температуре. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Гидроксид палладий удаляют фильтрованием через слой целита® и фильтрат выпаривают при пониженном давлении с получением 0,34 г соединения 1h.

ЖХ-МС: 636,0 (М+Н)⁺.

Стадия 1h.

Циклизацию соединения 1h (0,1 г, 0,15 ммоль) проводят с использованием HOBt (0,06 г, 0,47 ммоль) и РуВОР (0,24 г, 0,47 ммоль) в ТГФ (50 мл). Реакцию инициируют путем медленного добавления DIPEA (0,06 г, 0,47 ммоль) и затем перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Реакционную смесь выпаривают и промывают диэтиловым эфиром с получением 0,05 г соединения 1i.

ЖХ-МС: 617,9 (М+Н)⁺.

Стадия 1i.

Кислотно-чувствительную защитную группу на соединении 1i [(0,08 г) в CH₂Cl₂ (0,9 мл)] удаляют при помощи ТФК (0,9 мл). Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч с последующим выпариванием и промыванием диэтиловым эфиром, в итоге получают 0,05 г неочищен

- 13 031325 ного соединения 1. Сырой твердый продукт очищают с помощью препаративной ВЭЖХ, метод-А, описанный в экспериментальной части (выход: 9 мг).

ЖХ-МС: 506,4 (М+Н)⁺; ВЭЖХ: t_R = 12,3 мин.

Синтез соединения 11 (NO₂-C₆H₄-OCO-Thr(^tBu)-OBzl).

1j 1k

К раствору Fmoc-Thr(^tBu)-OH (15,0 г, 37,7 ммоль) в 100,0 мл ДМФ добавляют Cs₂CO₃ (14,8 г, 45,2 ммоль) и полученную смесь охлаждают до температуры 0°C. К охлажденной реакционной смеси добавляют бензилбромид (7,74 г, 345,2 ммоль) и раствор перемешивают в течение 30 мин при температуре льда с последующим доведением до комнатной температуры в течение 12 ч. Реакционную смесь концентрируют при пониженном давлении и разбавляют этилацетатом (150 мл). Органический слой промывают водой (2x100 мл), соляным раствором (1x100 мл) и сушат над Na₂SO₄. Отфильтрованный раствор концентрируют и очищают колоночной хроматографией на силикагеле (элюент: 0-30% этилацетата в гексане), получают 18,5 г промежуточного соединения 1j в виде белого твердого вещества.

ЖХ-МС: 433,1 (M-O^tBu+H)⁺.

Защитную Fmoc-группу на соединении 1j (10,0 г, 20,5 ммоль) в CH₂Cl₂ (40,0 мл) удаляют путем перемешивания его с диэтиламином (40,0 мл) в течение 1 ч при комнатной температуре. Полученный раствор концентрируют в вакууме и густой остаток очищают с помощью колоночной хроматографии на нейтральном оксиде алюминия (элюент: 0-50% этилацетата в гексане, а затем 0-5% метанола в хлороформе) с получением 3,5 г промежуточного соединения 1k (выход: 70%).

ЖХ-МС: 266,5 (М+Н)⁺.

ТЭА (1,2 г, 12,0 ммоль) добавляют к перемешиваемому раствору промежуточного соединения 1k (1,6 г, 6,0 ммоль) в CH₂Cl₂ (30 мл). Раствор 4-нитрофенилхлорформиата (1,3 г, 6,6 ммоль) в CH₂Cl₂(10 мл) добавляют к вышеуказанному раствору при перемешивании и реакцию продолжают в течение 12 ч при комнатной температуре. Завершение реакции подтверждается анализом ТСХ. После завершения реакции реакционную смесь разбавляют с помощью CH₂Cl₂ (50 мл) и промывают 1,0 М бисульфата натрия (2x50 мл) и 1,0 М карбоната натрия 2x50 мл), сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением неочищенного соединения 11, которое дополнительно очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: 0-20% этилацетата в гексане) с получением 0,8 г соединения 11.

Ή-ЯМР (ДМСО-а₆, 300 МГц): δ 1,04 (s, 9H), 1,16 (d, 3Н), 4,11 (m, 1H), 5,11 (m, 3H), 6,91 (d, 2H),

7,40 (m, 5Н), 8,10 (d, 2H), 8,26 (brs, 1H). Пример 2. Синтез соединения 2. Стадия 2а.

DIPEA (2,71 г, 21 ммоль) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 1b (3,12 г,

10,5 ммоль), HATU (4,41 г, 11,6 ммоль) в ДМФ (30 мл) и смесь оставляют перемешиваться при комнатной температуре в течение 5 мин. К вышеуказанной реакционной смеси медленно добавляют D-Thr(^tBu)OMe-HCl (2,0 г, 10,5 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Реакционную смесь затем гасят льдом, осадок отфильтровывают и перекристаллизовывают с помощью CH₂Cl₂ с получением 4,2 г соединения 2а.

ЖХ-МС: 491,2 (M+Na)⁺.

Стадия 2b.

- 14 031325

99% раствор гидразин гидрата (5 мл) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 2а (4,2 г) в метаноле (40 мл), завершение реакции подтверждается анализом ТСХ. Реакционную смесь выпаривают при пониженном давлении и получают 4,2 г соединения 2b (выход: 90%).

ЖХ-МС: 469,4 (М+Н)⁺.

Стадия 2с.

DIPEA (2,7 мл, 20,9 ммоль) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 2b (4,9 г,

10,5 ммоль), HATU (4,8 г, 12,5 ммоль) в ДМФ (50 мл). К полученному выше раствору при перемешивании добавляют Fmoc-D-Asn(Trt)-OH (6,2 г, 10,5 ммоль) и затем перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Реакционную смесь разбавляют EtOAc (30 мл) и промывают 1,0 М карбоната натрия (2x20 мл), 10% лимонной кислотой (2x20 мл), водой (2x20 мл), сушат над Na₂SO₄, выпаривают при пониженном давлении с получением 10 г неочищенного промежуточного продукта 2с и дополнительно очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: 0-5% МеОН (метанола) в EtOAc) с получением 5 г соединения 2с.

ЖХ-МС: 1047,7 (М+Н)⁺.

Стадия 2d.

Удаление защитной Fmoc группы соединения 2с [(3,2 г) в CH₂Cl₂ (10 мл)] проводят с использованием диэтиламина (10 мл). Завершение реакции подтверждается анализом ТСХ. Полученный в результате раствор выпаривают при пониженном давлении и получают 1,2 г соединения 2d.

Стадия 2е.

Триэтиламин (0,32 г, 3,2 ммоль) добавляют медленно, чтобы инициировать взаимодействие соединения 2d (1,3 г, 1,6 ммоль) и соединения 2h (0,79 г, 1,9 ммоль) в ТГФ (20 мл). Полученный раствор дополнительно перемешивают в течение 12 ч при комнатной температуре, завершение реакции подтверждается анализом ТСХ. Органический слой промывают NaHCO3, раствором лимонной кислоты, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением 1,3 г соединения 2е.

Стадия 2f.

Удаление защитных Cbz-группы и бензилового эфира на соединении 2е (1,3 г) в метаноле проводят с использованием гидроксида палладия (1,0 г) в течение 1 ч при комнатной температуре. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Гидроксид палладий удаляют фильтрованием через слой целита® и фильтрат выпаривают при пониженном давлении с получением 0,45 г соединения 2f.

ЖХ-МС: 878,4 (М+Н)⁺.

- 15 031325

Стадия 2g.

DIPE-АГТГФ

PyBoprHOSt

НИТИ

2а

DIPEA (0,2 г, 1,5 ммоль) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 2f (0,45 г, 0,51 ммоль), НОВТ (0,21 г, 1,53 ммоль) и РуВОР (0,8 г, 1,53 ммоль) в ТГФ (200 мл). Реакционную смесь дополнительно перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Завершение реакции подтверждается с помощью ТСХ-анализа. Реакционную смесь выпаривают и промывают диэтиловым эфиром с получением 0,41 г промежуточного соединения 2g. ЖХ-МС: 860,7 (М+Н)⁺.

Стадия 2h.

NH NH

NHTrt CF₃COOH/CH₂C1_s

MH'^j ------------*

А) NH

O’Bu

ОН

Н^й ο

НгС

НзС

О

Н О

МН NH

ИН_г

NH° /о _χΝΗ '-ОН

2д 2

К раствору соединения 2g (0,4 г) в CH₂Cl₂ (5 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (5 мл) и каталитическое количество триизопропилсилана и перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре. Полученный раствор концентрируют в вакууме с получением 0,2 г сырого соединения 2. Сырое твердое вещество очищают (выход: 10 мг) с использованием препаративной ВЭЖХ, метод-В, описанный в экспериментальной части.

ЖХ-МС: 506,6 (М+Н)⁺; ВЭЖХ: t_R = 12,4 мин.

Синтез 2h (NO2-C₆H4-OCO-D-Ser(^tBu)-OBzl).

Соединение синтезируют с использованием аналогичной процедуры, как показано в примере (пример 1, соединение 11) с использованием Fmoc-D-Ser(^tBu)-OH вместо Fmoc-Thr(^tBu)-OH с получением 1 г неочищенного вещества 2h.

Пример 3. Синтез соединения 3.

Стадия 3а.

BocHN

О

За

К перемешиваемому раствору соединения 1а (5,0 г, 30,6 ммоль) в 1,4-диоксане (50 мл) добавляют карбонат натрия (8,12 г, 76,5 ммоль, растворенный в 10 мл воды) и (Вос)₂О (9,98 мл, 45,7 ммоль) и перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Протекание реакции контролируют с помощью ТСХ. Реакционную массу разделяют между диэтиловым эфиром и водой. Затем водный слой подкисляют (рН 3) с помощью раствора 3н. HCl и экстрагируют с использованием ДХМ (2x200 мл). Органический слой промывают водой, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением 50 г чистого 3а (выход: 62,1%).

ЖХ-МС: 263,0 (М+Н)⁺.

Стадия 3b.

X^OtBu

EDCI. HOBt DIPEA, ТГФ

NCbz I

DIPEA (6,5 мл, 37,8 ммоль) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 3b (5 г,

12,6 ммоль), соединения 3с (2,72 г, 15 ммоль), HOBt (2,55 г, 18,9 ммоль) и EDC-HCl (3,62 г, 18,9 ммоль) в ДМФ (75 мл) при температуре 0°C. Реакционную смесь дополнительно перемешивают при комнатной температуре в течение 12 ч. Протекание реакции подтверждается анализом ТСХ. Реакционную массу

- 16 031325 разделяют между этилацетатом и водой. Органический слой промывают водой, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением сырого вещества. Сырое вещество очищают колоночной хроматографией на силикагеле (60-120 меш) с использованием в качестве элюента гексан/этилацетат (40:60) с получением 5,2 г соединения 3d, (выход: 71,0%).

ЖХ-МС: 560,6 (М+Н)⁺.

Стадия 3с.

: Н EtiN.flXM ? Η '7“' RT.24 * 'ΐ^

3d Зе

К перемешиваемому раствору соединения 3d (5 г, 8,9 ммоль) в сухом ДХМ добавляют по каплям диэтиламин (50 мл) при температуре -10°C и перемешивают в течение 1 ч при комнатной температуре. После завершения реакции смесь выпаривают при пониженном давлении с получением неочищенного вещества. Сырой продукт очищают с использованием н-пентана/диэтилового эфира (1:1), промывают и сушат в высоком вакууме с получением 3,5 г соединения 3е.

ЖХ-МС: 338,58 (М+Н)⁺.

Стадия 3d.

NMM (1,4 мл, 14,0 ммоль) медленно добавляют к перемешиваемому раствору соединения 3а (3 г, 11,3 ммоль), соединения 3е (4,3 г, 12,9 ммоль) и HATU (6,5 г, 17,1 ммоль) в ДМФ (75 мл) при температуре 0°C. Реакционную смесь дополнительно перемешивают в течение 6 ч при комнатной температуре. Протекание реакции контролируют с помощью ТСХ. После завершения реакционную массу разделяют между этилацетатом и водой. Органический слой промывают водой, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением неочищенного вещества. Сырой продукт очищают с помощью колоночной хроматографии на силикагеле (элюент: 50% гексана в этилацетате) с получением 4,8 г соединения 3f.

ЖХ-МС: 583,7 (М+Н)⁺.

Стадия 3e.

К перемешиваемому раствору соединения 3f (4,5 г, 7,7 ммоль) в МеОН медленно добавляют Pd/C (2,0 г) и перемешивают в атмосфере Н₂ в течение 4 ч при комнатной температуре. Протекание реакции контролируют с помощью ТСХ. После завершения реакционную массу фильтруют через целит® и промывают МеОН (2x150 мл). Полученный фильтрат выпаривают при пониженном давлении с получением 3 г соединения 3g.

ЖХ-МС: 448,6 (М+Н)⁺.

К перемешиваемым раствору Cbz-D-Asn-OH (1,78 г, 6,7 ммол) и соединения 3g (3,0 г, 6,8 ммоль) в ДМФ (75 мл) медленно добавляют ДЦК (дициклогексилкарбодиимид) (4,12 г, 20,3 ммоль) и НОВТ (1,8 г,

13,5 ммоль) при температуре 0°C. Реакционную смесь перемешивают в течение 48 ч при комнатной температуре. Протекание реакции контролируют с помощью ТСХ. После завершения реакционную массу разделяют между этилацетатом и водой. Органический слой промывают водой, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением сырого вещества. Сырое вещество очищают колоночной хроматографией на силикагеле (60-120 меш) (элюент: 4% МеОН в ДХМ) с получением 2,5 г соединения 3h.

ЖХ-МС: 697,50 (М+Н)⁺.

- 17 031325

Стадия 3g.

К перемешиваемому раствору соединения 3h (2,5 г, 3,6 ммоль) в МеОН (50 мл) добавляют Pd/C (1,2 г) и перемешивают в атмосфере Н₂ в течение 4 ч при комнатной температуре. Протекание реакции контролируют с помощью ТСХ. После завершения реакционную массу фильтруют через целит® и промывают МеОН (2x150 мл). Полученный фильтрат выпаривают при пониженном давлении с получением

1,5 г соединения 3i.

ЖХ-МС: 563,6 (М+Н)⁺.

Стадия 3h.

Соединение 3i (1,3 г, 2,3 ммоль), ТЭА (0,43 мл, 3,5 ммоль) в ДМФ (25 мл) добавляют по каплям медленно к раствору 3j (1,1 г, 2,6 ммоль) при температуре -10°C. Смесь дополнительно перемешивают при комнатной температуре в течение 2 ч. Протекание реакции контролируют с помощью ТСХ. После завершения реакционную массу разделяют между этилацетатом и водой. Органический слой промывают NaHCO3, раствором лимонной кислоты, соляным раствором, затем органический слой сушат над Na₂SO₄и выпаривают при пониженном давлении с получением неочищенного вещества. Сырой продукт очищают колоночной хроматографией на силикагеле (60-120 меш) (гексан/этилацетат (10:90) используют в качестве элюента) с получением 1,2 г соединения 3k.

ЖХ-МС: 840,6 (М+Н)⁺.

Стадия 3i.

& 31

К раствору соединения 3k (1,0 г, 1,2 ммоль) в CH₂Cl₂ (10 мл) добавляют трифторуксусную кислоту (10 мл) и каталитическое количество триизопропилсилана и перемешивают в течение 3 ч при комнатной температуре, чтобы удалить кислотно-чувствительные защитные группы. Полученный раствор концентрируют в вакууме и промывают диэтиловым эфиром с получением 1,0 г неочищенного соединения 3l.

ЖХ-МС: 628,65 (М+Н)⁺.

Стадия 3j.

3m

К перемешиваемому раствору соединения 31 (1,0 г, 1,5 ммоль) в ТГФ медленно добавляют РуВОР (2,4 г, 4,7 ммоль), HOBt (0,6, 4,7 ммоль) и DIPEA (0,8 мл, 4,7 ммоль) и перемешивают в течение 12 ч при комнатной температуре. Реакционную массу разделяют между водой и этилацетатом. Органический слой промывают водой, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄ и выпаривают при пониженном давлении с получением неочищенного вещества. Сырой продукт промывают диэтиловым эфиром с получением 0,8 г соединения 3 m.

ЖХ-МС: 610,5 (М+Н)⁺.

- 18 031325

Стадия 3 k.

К перемешиваемому раствору соединения 3m (0,8 г, 1,3 ммоль) в МеОН (30 мл) добавляют Pd(OH)₂(0,4 г) и перемешивают в атмосфере Н₂ в течение 4 ч при комнатной температуре. Протекание реакции контролируют с помощью ТСХ. После завершения реакционную массу фильтруют через целит® и промывают с использованием МеОН (2x150 мл). Полученный фильтрат выпаривают при пониженном давлении с получением 0,7 г соединения 3.

ЖХ-МС: 520,5 (М+Н)⁺; ВЭЖХ: t_R = 9,9 мин.

Синтез промежуточного соединения 3с.

К перемешиваемому раствору соединения

3n (4 г, 88,3 ммоль) и соединения 3о (10,2 мл, 71,2 ммоль) в ДХМ (150 мл) добавляют по каплям ТЭА (14,4 мл, 105 ммоль) при температуре -78°C. Реакционную смесь оставляют до достижения комнатной температуры и перемешивают в течение 12 ч. Протекание реакции контролируют с помощью ТСХ. После завершения реакционную массу разделяют между водой и ДХМ. Органический слой промывают водой, соляным раствором, сушат над Na₂SO₄, выпаривают при пониженном давлении с получением неочищенного соединения и очищают колоночной хроматографией на силикагеле (60-120 меш) (элюент: 80% этилацетата в гексане) с получением 10 г соединения 3с.

ЖХ-МС: 181,18 (М+Н)⁺.

Синтез 3j (NO₂-C₆H₄-OCO-D-Ser(Bzl)-O^tBu).

Соединение синтезируют с использованием аналогичной процедуры, как показано в примере (пример 1, соединение 1k) с использованием Fmoc-D-Ser(Bzl)-O^tBu вместо Fmoc-Thr(^tBu)-OH с получением

1,5 г соединения 3j.

Пример 4. Синтез соединения 4.

Соединение синтезируют с использованием аналогичной процедуры, как показано в примере 2 (соединение 2) с использованием 7-аминогептановой кислоты вместо соединения 1а с получением 0,3 г неочищенного вещества указанного в заголовке соединения. Сырой твердый продукт очищают с помощью препаративной ВЭЖХ, описанной в экспериментальной части.

ЖХ-МС: 488,2 (М+Н)⁺; ВЭЖХ: t_R = 11,9 мин.

Соединения, приведенные в табл. 3, готовят на основе экспериментальных методик, описанных выше.

- 19 031325

Таблица 3

Номер соединения	Структурная формула	ЖХ-МС (M+H)⁺	ВЭЖХ (t_R в мин.)
5.	0—--^'О г^{7 K}f° HN NH ОН ύ £ 1 HN NH Ογ ⁰ νη₂	518,2	9,7
6.	О— Γ ⁷Ύ° HN NH он °A £ V >N—<^NHно nh₂	534,2	12,4
7.	0-/-^0 A V HN NH OH £ I HN NH NH₂ >-_n___NH 0 H - \ V nh₂	532,9
8.	O—Y'^O r⁷ [ HN NH HO '0 ---^NH ⁰ H ; V ⁰nh₂	520,2	9,03
9.	O—x^O Λ ^Vf° 1 HN NH J °> £ ,/ HN NH ^H° cT\|M V nh₂	492,1	12,9

- 20 031325

10.	О— г ь в г HN NH ^Н0 Ум nh₂	520,2	11,23
11.	О—/~Ό HN NH Ol· Г HN, NH ^HO NH V ° OH	507,2	11.96
12.	p—z^o Λ M HN NH OH У P 1 ^HN. NH ^H0 Xki _^^nh V о OH	493,2	8,35
13.	0—/O Λ V HN NH OH У У Г HN NH ^H0 X_N___NH сД'он	521,3	12,2
14.	0—Z^O <f° b b ,./ HN, NH ^H0 Х_ы___^NH o hTA o^oh	535,4	11,2

Соединения, представленные в табл. 4, которые могут быть получены с помощью следующей методики, как описано выше, с соответствующей модификацией, известной для среднего специалиста в данной области, также включены в объем настоящего описания.

- 21 031325

Таблица 4

Номер соединения	Структурная формула	Номер соединения	Структурная формула
15.		°ч°	21.	О Λν	NH
	HN	ΝΗ ОН		н₂С н	NH
	$ 1 HN	ΝΗ		Н₂С Н₂С	V 1 >NH₂
	^мо ___„.ЫН сΓΒη-ί		Н₂С Н₂С_Ч Н₂С_Х	NH5 Л NH
				^н °но
16.	о—	“О	22.	он
г HN ЫН он £ J HN NH ^Н0 У-м ->^NH <S и—ί	н₂с^н о Н₂С Н₂С	NH NH V. NHO /
	Ο^'ΌΗ	О		Н₂С..	/о ΝΗ -ОН
				н о
17 .	он кЛ	ΝΗ ΝΗ	23.	он Н_гс^н	ΝΗ ΝΗ
	о н₂с Н₂С о	’Унн₂ыю /о		О Н₂С Н₂С о	r*^NH= NH° /о
	H₂C_S ,ΝΗ ^н Оно		нА. ^H=^C'N^rн О	ΝΗ -ОН
18.	О П н₂с%	ΝΗ ΝΗ	24.	ОН н₂с%	/ Ν. ΝΗ
	Н₂С н₂с	1 'Умнг ЫЮ		О н_гс
		/о NH		н_гс R	ΝΗθ /о
	Н₂С.._Г.			Н₂С_Ч	ΝΗ
	^Н Оно		^Н2С'М-<	-ОН
				н о

19.	о а. >ы ^ΝΗ / Н₂С Η 'Ν О \° ^Мг? 1 '¥nh₂ н₂с NHJ °\ /о Н₂С„ ,ΝΗ ₅-< ^н °но	25.	он н₂с% ^ΝΗνη н_гс ί° н₂с Π>νη₂ Н₂С ΝΗ О ИЛ /₀ Н₂С.. он но и
20.	о н_гс^Лй Чн о γ ^н< I ’Унн₂ Н₂С N1-0 R /о н₂с. ,ын н₂с.._м^..< ^н °но	-	-

Пример 5. Восстановление пролиферации спленоцитов мыши в присутствии рекомбинантного PD-L1/PD-L2.

Рекомбинантный PD-L1 (rm-PDL-1, Cat. # 1019-B7-100, R&D Systems) мыши используют в качестве источника PD-L1.

Условия.

Спленоциты мышей, заготовленные от 6-8 недельных мышей С57 BL6; RPMI 1640 (GIBCO, Cat. # 11875); DMEM (модифицированная по способу Дульбекко среда Игла) с высоким содержанием глюкозы (GIBCO, Cat # D6429); фетальная бычья сыворотка [Hyclone, Cat. # SH30071.03]; жидкость пенициллин (10000 ед/мл)-стрептомицин (10000 мкг/мл) (GIBCO, Cat. # 15140-122); 100 мМ MEM (минимальная поддерживающая среда) раствор пирувата натрия (100х), жидкий (GIBCO, Cat. # 11360); заменимая амино

- 22 031325 кислота (GIBCO, Cat. # 11140); L-глутамин (GIBCO, Cat. # 25030); анти-CD3 антитела (eBiosciences - 160032); анти-CD28 антитела (eBiosciences - 16-0281); буфер для ACK лизиса (1 мл) (GIBCO, Cat. # А10492); Histopaque (плотность 1,083 г/мл) (SIGMA 10831); трипановый синий раствор (SIGMA-T8154); 2 мл Norm Ject Luer Lock syringe - (Sigma 2014-12); 40 мкм сетчатый фильтр из нейлона (BD FALCON 35230); гематоцитометр (Bright line-SIGMA Z359629); буфер для клеточного сортера с возбуждением флуоресценции (FACS) (PBS/0,1% BSA): фосфатно-солевой буферный раствор (PBS), рН 7,2 (HiMedia TS1006) с 0,1% бычьим сывороточным альбумином (BSA) (SIGMA A7050) и азид натрия (SIGMA 08591); 5 мМ исходный раствор CFSE: CFSE маточный раствор готовят разбавлением лиофилизированного CFSE 180 мкл диметилсульфоксида (ДМСО C₂H₆SO, SIGMA-D-5879), и разливают аликвотные части в пробирки для дальнейшего использования. Рабочие концентрации титруют от 10 до 1 мкМ (eBioscience-650850-85); 0,05% трипсина и 0,02% ЭДТА (SIGMA 59417C); 96-луночного формата ELISA планшеты (Corning CLS3390); BD FACS калибр (Е6016); рекомбинантный мышиный B7-H1/PDL1 Fc химера, (rm-PD-L1 cat no: 1019-B7-100).

Протокол.

Подготовка и культивирование спленоцитов.

Спленоциты, заготовленные в 50 мл трубке Falcon путем затирания селезенки мышей в 40 мкм сетчатом фильтре, дополнительно обрабатывают 1 мл буфера для ACK лизиса в течение 5 мин при комнатной температуре. После промывания 9 мл полной среды RPMI клетки ресуспендируют в 3 мл 1х PBS в 15 мл трубке. 3 мл Histopaque осторожно добавляют в нижнюю часть трубки, не нарушая покрывающей спленоциты суспензии. После центрифугирования при 800xg в течение 20 мин при комнатной температуре, непрозрачный слой спленоцитов тщательно собирают, не нарушая/не смешивая слои. Спленоциты дважды промывают холодным 1х PBS с последующим полным подсчетом клеток с использованием метода исключения трипановым синим и используют в дальнейшем для основанных на клетках анализах.

Спленоциты культивируют в полной среде RPMI (RPMI + 10% фетальной бычьей сыворотки + 1 мМ пирувата натрия + 10000 ед./мл пенициллина и 10000 мкг/мл стрептомицина) и выдерживают в ТО^инкубаторе с 5% CO₂ при температуре 37°C.

Анализ пролиферации CFSE.

CFSE (карбоксифлуоресцирующий сукцинимидильный эфир) представляет собой краситель, который пассивно диффундирует в клетки и связывается с внутриклеточными белками. 1х 10⁶ клеток/мл заготовленных спленоцитов обрабатывают 5 мкМ CFSE в предварительно подогретой 1х PBS/0,1% раствора BSA в течение 10 мин при температуре 37°C. Избыток CFSE гасят добавлением 5 объемов ледяной культуральной среды на клетки и инкубируют на льду в течение 5 мин. CFSE помеченные спленоциты дополнительно промывают три раза ледяной полной средой RPMI. CFSE меченые 1х10⁵ спленоциты добавляют в лунки, содержащие клетки MDA-MB231 (1х10⁵ клеток, культивируемых в среде DMEM с высоким содержанием глюкозы) или рекомбинантный человеческий PDL-1 (100 нг/мл) и тестируемые соединения. Спленоциты стимулируют посредством антител анти-мышиного CD3 и анти-мышиного CD28 (1 мкг/мл каждый), после чего культуру дополнительно инкубируют в течение 72 ч при температуре 37°C с использованием 5% CO₂. Клетки собирают и промывают трижды ледяным FACS-буфером и % пролиферации анализируют с помощью проточной цитометрии с фильтрами возбуждения при 488 нм и эмиссии при 521 нм.

Сбор, обработка и вывод данных.

Процент пролиферации спленоцитов анализируют с помощью программы FACS поиска клеток и процент восстановления пролиферации спленоцитов соединением оценивают после вычета % значения фоновой пролиферации и нормализации в % пролиферации стимулированных спленоцитов (положительный контроль), принятый за 100%.

Стимулированные спленоциты: спленоциты + анти-CD3/CD28-стимуляция.

Предпосылки пролиферации: спленоциты + анти-CD3/CD28-+ PD-L1.

Пролиферация соединения: спленоциты + анти-CD3/CD28-+ PD-L1 + соединение.

Действие соединения исследуется путем добавления требуемой концентрации соединения к антиCD3/CD28-стимулированным спленоцитам в присутствии лиганда (PDL-1) (табл. 5).

- 23 031325

Таблица 5 Восстановление пролиферации спленоцитов мыши ингибируется рекомбинантным PDL1 мыши с помощью анализа на основе CFSE

Номер соединения	Процент восстановления пролиферации спленоцитов (@ 100 нМ концентрация соединения)
1.	95
2.	94
3.	58
4.	49
5.	53
8.	68
9.	73
10.	89
12.	91

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Соединение формулы (I) или его фармацевтически приемлемая соль, в которой R означает боковую цепь остатка аминокислоты, выбранной из Ala, Ser, Thr или Leu;

R₂ означает боковую цепь остатка аминокислоты, выбранной из Asp, Glu, Gln или Asn;

[Ааа] означает аминокислотный остаток, выбранный из Ser, Asp, Ala, Ile, Phe, Trp, Lys, Glu или Thr; R₃ означает водород или С₁.₁₀алкил;

каждый из R₄ и R₄' независимо друг от друга означает водород или См₀алкил;

каждый R_a и R_a означает водород или вместе означают оксо(=О)-группу;

каждый R_b и R_b означает водород или вместе означают оксо(=О)-группу;

Rs _{L означает} -C(OHCH,)_m-(X-CH-CH₂)_n-NH-_;

X означает СН2, О или S;

R₅ означает водород или С₁.₁₀алкил;

m представляет собой целое число от 1 до 3;

n представляет собой целое число от 2 до 20.
2. Соединение по п.1, в котором X является О.
3. Соединение по п.1, в котором n равно 2.
4. Соединение по п.1, которое представляет собой соединение формулы (IA)

- 24 031325 или его фармацевтически приемлемую соль.
5. Соединение по п.1, в котором R₄ означает О^алкил.
6. Соединение по п.1, в котором R. означает C_1-5алкил.
7. Соединение по п.1, которое представляет собой соединение формулы (IB) или его фармацевтически приемлемую соль.
8. Соединение по п.1, которое представляет собой соединение формулы (IC)

п.1, в котором [Ааа] означает аминокислотный остаток Ser или Thr.

п.1, в котором R3 является водородом.

п.1, в котором R4 и R.₄. каждый, являются водородом.

п.1, в котором Ra и R_a' вместе представляют оксо(=О)-группу.

п.1, в котором R_b и R_b вместе представляют оксо(=О)-группу. п.1, которое представляет собой или его фармацевтически приемлемую соль.
9. Соединение по п.1, в котором R₁ означает боковую цепь аминокислотного остатка Ser или Thr.
10. Соединение по п.1, в котором R₂ означает боковую цепь остатка аминокислоты, выбранной из Asn, Asp или Glu.
11. Соединение по п.1, в котором [Ааа] означает остаток аминокислоты, выбранный из Ser, Asp, Ala, Ile, Phe, Trp, Glu и Thr.
12. Соединение по
13. Соединение по
14. Соединение по
15. Соединение по
16. Соединение по
17. Соединение по

- 25 031325
18. Соединение по п.1, которое представляет собой
19. Соединение по п.1, которое представляет собой
20. Соединение по п.1, которое представляет собой
21. Соединение по п.1, которое представляет собой
22. Соединение по п.1, которое представляет собой
23. Соединение по п.1, которое представляет собой

- 26 031325
24. Соединение по п.1, которое представляет собой
25. Соединение по п.1, которое представляет собой
26. Соединение по п.1, которое представляет собой
27. Соединение по п.1, которое представляет собой
28. Соединение по п.1, которое представляет собой
29. Соединение по п.1, которое представляет собой

- 27 031325
30. Соединение по п.1, которое представляет собой
31. Соединение по п.1, которое представляет собой
32. Соединение по п.1, которое представляет собой