EA001198B1 - Мультиматричное мультиспецифическое электрохемилюминесцентное испытание - Google Patents

Abstract

Материалы и способы для производства конфигурированных многоматричных мультиспецифических поверхностей, которые электрически возбуждаются для использования в испытаниях, основанных на электрохемилюминесценции. Материалы и способы для химического и физического управления проведением нанесения доменов и рективов для использования в индикаторных панелях и в многочисленных процедурах специфических испытаний.

Description

Настоящее изобретение относится к конфигурированной мультиматричной мультиспецифической поверхности (ΡΜΛΜ8) для испытаний, основанных на электрохемилюминесценции, а также к способам изготовления и использования ΡΜΛΜ8.

Уровень техники, к которой относится изобретение

Диагностический анализ

Имеется острая экономическая необходимость в разработке быстрых чувствительных диагностических технологий. Диагностические технологии пользуются широким спросом на экономических рынках, включая здравоохранение, исследования, ветеринарию, и рынки сельскохозяйственной и промышленной продукции. Усовершенствование чувствительности, временные затраты, легкость использования, надежность или стоимость может открыть совершенно новые рынки диагностических услуг, где раньше никакая технология не могла бы удовлетворить потребность рынка. Некоторые диагностические технологии могут обладать высокой чувствительностью, но являются слишком дорогостоящими для удовлетворения потребностей рынка. Другие технологии могут быть рентабельными, но не достаточно надежными в эксплуатации для различных рынков. Новая диагностическая техника, которая способна объединить эти качества, является значительным прогрессом и имеет перспективу в области диагностики.

Имеется ряд различных аналитических методов, используемых в диагностических применениях. Эти методы включают радиоактивное мечение, иммуноферментный анализ, химический колориметрический анализ, флуоресцентное мечение, хемилюминесцентное мечение и электрохемилюминесцентное мечение. Каждый из этих методов имеет исключительную комбинацию уровней чувствительности, легкости использования, надежности, скорости и стоимости, которые определяют и ограничивают их применимость на различных рынках диагностических услуг. Эти различия частично обусловлены физическими ограничениями, свойственными каждому методу. Радиоактивное мечение, например, является по сути неустойчивым, поскольку метка самопроизвольно распадается, а удаление отработанных радиоактивных отходов приводит к проблемам экономических затрат, безопасности и охраны окружающей среды для многих применений.

Разработка многих из современных чувствительных диагностических методов ограничена существующим рынком прежде всего из-за потребности в квалифицированных лаборантах для осуществления испытаний. Современные технологические методы электрохемилюминесценции требуют не только квалифицированных лаборантов, но и неоднократных промываний и подготовительных процедур. Это увеличивает как стоимость, так и потребность в удалении отходов. Новейшие методы диагностики, которые упрощают испытательные процедуры, а также уменьшают стоимость каждого испытания, будут иметь большое значение и применение в открывающихся новых рынках, а также в усовершенствовании методов, представленных на существующих рынках.

Электрохемилюминесцентный анализ

Электрохемилюминесценция (ЕСЬ) представляет собой явление, при котором электрически возбужденная молекула испускает фотон (см., например, Ье1аиб аиб Ро\\с11. 1990, 1.Е1ес1госйет. 8ос., 137(10), стр.3127-3131). Такие молекулы получили название электрохемилюминесцентных (ЕСЬ) меток, также обозначаемых далее ТАС. Обычно используемыми ЕСЬ метками являются: металлорганические соединения, в которых металлом являются, например, благородные металлы VIII группы, включая металлорганические соединения, содержащие рутений Ки и осмий О§, такие как составляющая Ки (2,2'-бипиридин)³⁺ (также упоминаемая как КиЬру), раскрытая, например, Вагб и соавт., (патент США № 5.238.808). Свет, генерируемый ЕСЬ-метками может использоваться в качестве сигнала-репортера в диагностических процедурах (Вагб и соавт., патент США № 5.221,605). Например, ЕСЬ-метка может быть ко-валентно связана со связывающим агентом, таким, как антитело или нуклеотидный зонд. Комплекс ЕСЬ-метка/связывающий агент может использоваться для анализа ряда веществ (Вагб и соавт., патент США № 5.238.808). Для систем, основанных на детектировании с помощью электрохемилюминесценции (ЕСЬ), совершенно необходимо, чтобы электрический потенциал возбуждал ЕСЬ-метку для излучения фотона. Электрический потенциал с сигналами определенной формы прикладывается к раствору для ЕСЬ-анализа через поверхность электрода, обычно с металлической поверхностью, и противоположный электрод (см., например, патенты США № 5,068,088; 5,093,268; 5,061,445; 5,238,808; 5,147,806;

5,247,243; 5,296,191; 5,310,687; 5,221,605).

В технике хорошо известны различные устройства, доступные для проведения и детектирования ЕСЬ-реакций. Например, Ζ1ι;·ιη§ и соавт., (патент США № 5,324,457) раскрывают образцы электродов для использования в электрохимических ячейках для проведения ЕСЬ. ЬегагИк и соавт., (патент США № 5.093.268) раскрывают электрохимические ячейки для использования в проведении ЕСЬ-реакций. Катш и соавт. (патент США № 5,147,806) раскрывают устройство для проведения и детектирования ЕСЬ-реакций, включая устройства регулирования напряжения. ΖοδΚί и соавт. (патент США № 5,061,445) раскрывают устройство для проведения и детектирования ЕСЬ реакций, включая диаграммы формы кривой электрического потенциала для проведения ЕСЬ реакций, цифроаналоговые преобразователи, регулирующее устройство, детектирующее устройство и методы для обнаружения тока, генерируемого посредством ЕСЬ реакции в рабочем электроде для подачи информации в электронное устройство посредством обратной связи.

Метод ЕСЬ рассматривается подробно, например, в патенте США № 5,093,268. Коротко говоря, метод ЕСЬ является способом обнаружения аналита, представляющего интерес, в объеме образца и присутствующего в образце в относительно небольших концентрациях.

ЕСЬ-молекула, названная меткой (ТАС) в вышеупомянутых опубликованных патентах, может быть или может не быть связана с аналитом, но в любом случае она приводится в возбужденное состояние в результате последовательности химических реакций, индуцируемых электрической энергией, полученной от рабочего электрода. Предпочтительной молекулой, которая стимулирует электрохемилюминесценцию (ЕСЬ) метки, является такая молекула, как оксалат или, более предпочтительно, трипропиламин (см. патент США № 5,310,687).

Промышленный ЕСЬ-анализ

На сегодняшний день, все ЕСЬ-реакции в промышленных условиях проводятся на поверхностях электрода сантиметрового масштаба. Электроды сантиметрового масштаба не дают оптимального решения проблемы увеличения величины ЕСЬ-сигнала, получаемого из больших электродов, и уменьшения полного объема образца, необходимого для каждого анализа. Однако, даже электроды сантиметрового масштаба не позволяют достигать чувствительности, требуемой для многих анализов. Пытаясь преодолеть эту проблему, все стандартные ЕСЬсистемы далее увеличивают чувствительность, используя покрытые магнитные шарики для захвата ЕСЬ аналитов или реактивов. Шарики двигаются вплотную с рабочим электродом, и тем самым, способствуют увеличению чувствительности.

Однако использование магнитных шариков имеет много ограничений. Шарики сами по себе покрыты белками, которые отстают и разрушаются со временем, вызывая изменения сигнала. Из-за сложности обработки и представления данных результатов анализа, основанного на использовании шариков, стандартная ЕСЬ диагностика требует комплексного последовательно выполняемого набора процедур для каждого анализа, проводимого с данным образцом, что увеличивает время и стоимость для каждого выполняемого испытания. Размер шариков 5 микрон препятствует для большинства ЕСЬ меток, связанных с шариками, доступу к тонкой пленке, находящейся возле рабочих электродов, что приводит к неэффективности возбуждения ЕСЬ-метки.

ЬсуспШ и соавт. (патент США №

5,093,268) предложили способ количественного анализа не одного, а нескольких различных аналитов одновременно при помощи различных ЕСЬ-меток для каждого аналита, причем каждый из фотонов испускается на различных длинах волн для каждого из различных аналитов в одном испытании. Однако этот метод ограничен, например, недоступностью достаточного количества эффективных ЕСЬ-меток, излучающих на различных длинах волн и необходимостью оптимизировать химические условия для каждой метки ЕСЬ. Эти практические ограничения препятствовали коммерциализации таких многоволновых, многоаналитных ЕСЬ детектирующих систем.

Другой метод увеличения чувствительности ЕСЬ состоит в том, чтобы улучшить технологию электрода. Ζ1ι;·ιη§ и соавт. (патент США № 5,324,457) осаждали пленку из ЕСЬ-меток непосредственно на поверхности различных металлов и полупроводников. Метод авторов Ζ1ι;·ιη§ и Ватб,использующий объемное насыщение поверхности электрода (как описано авторами), приводит к неровному неоднородному осаждению, непригодному для высокочувствительного анализа.

Существующие способы для проведения ЕСЬ -анализа также требуют, чтобы аналитическая ячейка, включая электроды, была очищена любым из множества способов, включая использование разбавленных кислот, разбавленных щелочей, растворов моющего средства, и т.д., как раскрыто, например, патентом США N5,147,806.

Следовательно, целью настоящего изобретения является обеспечить новейший и рентабельный анализ для проведения множества ЕСЬ-реакций как последовательно, так и одновременно, а в предпочтительном варианте обеспечить встроенные контрольные стандарты для повышения точности.

Другой целью настоящего изобретения является получение кассеты, содержащей одну или более подложек, подходящих для проведения множества одновременных или последовательных ЕСЬ-реакций, которые также доступны.

Следующей связанной с предыдущими целью настоящего изобретения является уменьшение времени и стоимости проведения отдельного анализа для аналитов, представляющих интерес в биологических образцах.

Еще одной и связанной с предыдущими целью настоящего изобретения, является разработка способов и устройства для проведения множества одновременных анализов для множества исследуемых аналитов в одном биологическом образце.

Сущность изобретения

Изобретение относится к кассете для проведения ЕСЬ -реакций и анализа, содержащей множество дискретных связывающих доменов, иммобилизованных на подложке, причем эти дискретные связывающие домены пространственно расположены на одной линии с одним или более электродом и с одним или более противоположным электродом. Кассета предпочтительно включает в себя первую подложку, имеющую множество дискретных связывающих доменов, иммобилизованных на поверхности. Она может иметь один или более электродов и один или более противоположных электродов. Пары электрод и противоположный электрод являются доступными по отдельности для направления сигнала от источника электрической энергии в виде напряжения с определенной формой сигнала, эффективной для стимуляции электрохемилюминесценции. Кассета может также содержать вторую подложку, которая может быть помещена возле первой подложки так, чтобы между ними можно было поместить устройство, содержащее образец, и/или служащее в качестве электрода. Связывающие домены располагают определенным образом на поверхности подложки и подготавливают так, чтобы они связывались с аналитами или реагентами, представляющими интерес.

Кроме того, изобретение относится к устройству для измерения электрохемилюминесценции образца, которое обеспечивает средство обработки подложки или кассеты, регулятор напряжения адаптированный для приложения регулируемого напряжения с определенной формой сигнала, эффективной для стимуляции электрохемилюминесценции, детектор фотонов для детектирования электрохемилюминесценции от образца и средство для подачи образца.

Изобретение далее относится к способам использования кассет для измерения электрохемилюминесценции в образце путем введения множества связывающих доменов кассеты в контакт с образцом, который содержит множество исследуемых аналитов, при условиях ЕСЬанализа, и затем путем прикладывания напряжения с формой, эффективной для стимуляции электрохемилюминесценции в каждой из множества пар электрод/противоположный электрод, и детектирования или измерения стимулированной электрохемилюминесценции. В широком аспекте настоящее изобретение относится к способам ЕСЬ-анализа, в которых образец не входит в контакт с электродом. Кроме того, в качестве альтернативы к использованию пар электрод/противоположный электрод, изобретение предусматривает сканирование электрода и противоположного электрода на связывающие домены.

Изобретение также относится к наборам, содержащим компоненты, включая кассеты, подходящие для одновременного измерения множества электрохемилюминесцентных реакций; поверхности подложек, на которых иммобилизируется множество доменов; среду для осуществления ЕСЬ-анализа с проведением химических реакций.

Изобретение также относится к электродам, изготовленным из графитовых трубочек нанометрового диаметра.

Описание чертежей

Фиг. 1 иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением, где на подложке 10 находится множество связывающих доменов 14, а на подложке 12 находится множество соответствующих электродов 16, так что при сближении подложек пара электродов помещается рядом с каждым связывающим доменом.

Фиг. 1А иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением, где на подложке 10 находится определенное число связывающих доменов 14, а на подложке 12 находится определенное число соответствующих электродов 16, так что при сближении подложек пара электродов помещается рядом с каждым связывающим доменом.

Фиг. 2 иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением, в которой определенное число связывающих доменов 30 на подложке 26 находится рядом с каждым из отдельных электродов 32 так, что при сближении подложек 26 и 28 каждый из противоположных электродов 38 помещается рядом с каждым из связывающих доменов 30.

Фиг. 3 иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением, в которой на подложке 44 определенное число связывающих доменов 48 имеют соответствующие им смежные пары электрод/противоположный электрод 50. Подложка 46 может быть, но не обязательно, помещена возле подложки 44 так, чтобы подложка 46 могла содержать образец, который мог бы находиться возле связывающих доменов 48 и электродов 50.

Фиг. 4 иллюстрирует две подложки, образующие кассету в соответствии с изобретением, в которой определенное число связывающих доменов 64 на подложке 60 входят в контакт с образцом, в котором предполагается содержание аналита. Подложка 62 имеет области 66, содержащие реакционную среду для обнаружения или измерения исследуемого аналита или для проведения желаемой реакции так, чтобы сближение подложки 60 и подложки 62 приводило связывающие домены 64 и области 66 в контакт друг с другом.

Фиг. 5А иллюстрирует вид сверху конфигурированных связывающих доменов для мультиматричной, мультиспецифической связывающей поверхности. Геометрические формы: треугольники, квадраты и круги, представляют собой связывающие домены, характерные для различных аналитов. Связывающие домены могут быть гидрофобными или гидрофильными. Окружающая поверхность может иметь свойство, противоположное свойству связывающих доменов (гидрофильная или гидрофобная), для минимизации растекание связывающих реактивов или аналитов из связывающих доменов.

Фиг. 5В иллюстрирует вид сверху жидкостных микротрубочек для подачи связывающих реагентов и/или аналитов к дискретным связывающим доменам. Каждое пятнышко иллюстрирует поперечное сечение микрофлюидальной трубочки (например, капилляра).

Фиг. 5 С иллюстрирует вид сбоку жидкостных микротрубочек, изображая приближение совмещаемых или наведенных [центрированных] жидкостных микротрубочек для подачи связывающих реагентов и/или аналитов к многокомпонентной матрице нанесенных связывающих доменов. Каждая жидкостная трубочка может подавать отличающийся связывающий реагент к дискретному связывающему домену.

Фиг. 6А иллюстрирует приблизительно модель многокомпонентной матрицы электродов при совмещении с поверхностью, имеющей конфигурированные многоструктурные, мультиспецифические связывающие домены. Между электродной матрицей и матрицей связывающей поверхности изображен съемный барьер для защиты электродов. Полная сборка содержит кассету для проведения множества ЕСЬ реакций.

Фиг. 6В иллюстрирует приблизительную модель матрицы совмещенных или наведенных адресуемых рабочих электродов и противоположных электродов. Электроды могут иметь форму, комплементарную [взаимодополняющую] по отношению к связывающему домену или другие формы (например, переплетающуюся).

Фиг. 7 иллюстрирует вид сбоку аппроксимированной матрицы совмещенных или центрированных адресуемых рабочих электродов и противоположных электродов, и комплементарной связывающей поверхности, где проводящие полимеры наращивают от поверхностей электродов поперек зазора между электродным массивом и связывающими доменами, чтобы расширить потенциальное поле вокруг ЕСЬ-метки образца для увеличения эффективности ЕСЬреакции.

Фиг. 8 иллюстрирует вид сбоку аппроксимированной матрицы совмещенных или центрированных адресуемых рабочих электродов и противоположных электродов и комплементарной связывающей поверхности с проводящими частицами, введенными между обоими компонентами, для расширения потенциального поля. Благодаря расширению потенциального поля вокруг ЕСЬ-метки образца увеличивается эффективность ЕСЬ-реакции. Проводящие частицы могут быть магнитными, что позволяет легко проводить соответствующую манипуляцию.

Фиг. 9 иллюстрирует вид сбоку сближенной матрицы совмещенных или центрированных адресуемых рабочих электродов и противо положных электродов, и комплементарной связующей поверхности, где электроды имеют тонкие проекции, простирающиеся в зазор между электродной поверхностью и связующими доменами, что позволяет расширить потенциальное поле вокруг ЕСЬ-метки образца в целях увеличения эффективности ЕСЬ-реакции.

Фиг. 10 иллюстрирует вид сбоку сближенной матрицы совмещенных или центрированных адресуемых рабочих электродов и противоположных электродов, и комплементарной связывающей поверхности, где поверхности являются не параллельными, а соответствующими друг другу по геометрической форме.

Фиг. 11 иллюстрирует вид сбоку подложки, имеющей металлический слой на ней для обеспечения сборки отдельного электрода и связывающей поверхности в виде кассеты. Матрица самоформирующихся монослоев (8АМ) наносится на металлический слой в заданной форме.

Фиг. 12 иллюстрирует вид сбоку подложки, имеющей нанесенный на нее металлический слой для обеспечения сборки отдельного электрода и связующей поверхности в виде кассеты. Матрица монослоев (8АМ) наносится в заданной форме на металлический слой, а проводящие микрочастицы изображаются вкрапленными среди конфигурированных монослоев (8АМ), что позволяет расширить поле потенциала вокруг ЕСЬ-метки образца в целях увеличения эффективности ЕСЬ-реакции.

Фиг. 13 иллюстрирует вид сбоку подложки, имеющей нанесенный на нее металлический слой для обеспечения сборки отдельного электрода и связующей поверхности в виде кассеты. Матрица самоформирующихся монослоев (8АМ) наносится в заданной форме на металлический слой, и наращивается проводящий полимер и/или волокно от ЕСЬ-метки для расширения поля потенциала вокруг ЕСЬ-метки в целях увеличения эффективности ЕСЬ-реакции.

Фиг. 14 изображает схему подложки, имеющей матрицу электродных пар, управляемых компьютером.

Фиг. 15 изображает схему подложки, имеющей матрицу электродных пар.

Фиг. 16 изображает схему подложки, имеющей матрицу электродных пар, и компьютерную систему для регулирования подачи энергии к каждой электродной паре.

Фиг. 17 изображает схему подложки, имеющей матрицу электродных пар, и компьютерную систему с множеством источников напряжения и мультиплексоров для регулирования подачи энергии к каждой электродной паре.

Фиг. 18 изображает схему подложки, имеющей матрицу электродных пар, и компьютерную систему с множеством переключаемых источников напряжения для регулирования подачи энергии к каждой электродной паре.

Фиг. 19(а)-(д) изображает общий вид нескольких альтернативных комбинаций пар электрод/противоположный электрод.

Фиг. 20 иллюстрирует подложку с завершенным сэндвич-анализом.

Фиг. 21 иллюстрирует две противоположные ΡΜΛΜ8 на подложках.

Фиг. 22А иллюстрирует матрицу микрофлюидальных трубочек (2201) и тонковолокнистую прослойку (2200).

Фиг. 22Б иллюстрирует связующие домены (2202).

Фиг. 23А иллюстрирует устройство для формирования тонковолокнистой прослойки путем вакуумной фильтрации.

Фиг. 23Б иллюстрирует тонковолокнистую прослойку (2304) на фильтровальной мембране (2303).

Фиг. 24 иллюстрирует использование роликов для производства тонковолокнистой прослойки.

Фиг. 25 изображает структурную схему многослойной тонковолокнистой прослойки, в которой верхний слой имеет связывающие домены, используемые для испытания.

Фиг. 26 изображает структурную схему волокна, дериватизированного структурами, увеличивающими неспецифическое связывание и несколько молекул, как биологических, так и не биологических, которые связаны с поверхностью.

Фиг. 27 изображает структурную схему фибриллы, дериватизированной структурами, увеличивающими неспецифическое связывание и несколько молекул, связанных с дериватизованной фибриллой, причем некоторые молекулы дополнительно связаны с лигандами.

Фиг. 28 иллюстрирует несколько молекул, ковалентно связанных с фибриллой, и некоторые молекулы, которые, в свою очередь, связаны с дополнительными структурными элементами.

Фиг. 29 иллюстрирует использование многослойной тонковолокнистой прослойки в качестве оптического фильтра, который, в зависимости от положения источника света, находящегося на или внутри прослойки, может пропускать свет и/или поглощать свет, и/или его рассеивать.

Фиг. 30 А иллюстрирует циклические вольтамперограммы, полученные из электрохимических измерений на углеродных электродах волокнистых прослоек.

Фиг. 30Б иллюстрирует циклические вольтамперограммы, полученные из электрохимических измерений на электродах из золотой фольги.

Фиг. 31 иллюстрирует сравнение электрохимических свойств тонковолокнистой прослойки как функцию толщины прослойки и от скорости сканирования.

Фиг. 32 изображает график, который иллюстрирует, что неспецифическое связывание на фибриллах обычно увеличивается по мере увеличения концентрации волокон в растворах белков.

Фиг. 33 демонстрирует, что использование поверхностно-активных веществ может уменьшать неспецифическое связывание между ЕС ЬТАС 1 - меченым белком и углеродными фибриллами.

Фиг. 34 схематично изображает вид сверху экспериментальной камеры, используемой для измерения электрохимических свойств и ЕСЬ на электроде тонковолокнистой прослойки.

Фиг. 35 изображает ЕСЬ сигнал, полученный при использовании тонковолокнистой прослойки в качестве электрода 1000 пикомоль метки ТАС1 (сплошная линия) в растворе; и сигнал от буфера для анализа (без метки ТАС1) (пунктирная линия).

Фиг. 36 изображает структурную схему устройства из двух поверхностей ΡΜΑΜ8, в котором две матрицы электродов на подложке отделяются конфигурированным диэлектрическим слоем.

Фиг. 37 иллюстрирует устройство с множеством связывающих доменов (3702) на одной подложке, и с электродом и с противоположным электродом на другой подложке.

Фиг. 38 изображает кассету, в которой связывающие домены находятся на поверхностях отдельных объектов, поддерживаемых на противоположном электроде.

Фиг. 39 изображает гель в контакте с рабочим электродом и противоположным электродом.

Фиг. 40 изображает график ЕСЬ интенсивности и циклическую вольтамперограмму от ЕСЬ-меченого геля в контакте с рабочим электродом и противоположным электродом.

Фиг. 41 изображает график ЕСЬинтенсивности и циклическую вольтамперограмму от ЕСЬ-немеченого геля в контакте с рабочим электродом и противоположным электродом.

Фиг. 42 изображает структурную схему для двухповерхностной кассеты, используемой для ЕСЬ.

Фиг. 43 демонстрирует, что тонковолокнистые прослойки могут использоваться в качестве электродов для ЕСЬ антитела-ТАС1 адсорбированного на прослойки.

Фиг. 44А изображает ЕСЬ-интенсивность ТАС1-меченого белка, иммобилизованного на электроде.

Фиг. 44Б изображает циклическую вольтамперограмму покрытого электрода.

Фиг. 45А изображает квазиобратимую многократную генерацию ЕСЬ-сигнала от иммобилизованного ЕСЬ меченого меткой ТАС1 белка.

Фиг. 45Б изображает циклическую вольтамперограмму покрытого электрода, указывающую на частичное сохранение покрытия.

Фиг. 46А изображает необратимую генерацию ЕСЬ-сигнала от зафиксированного ЕСЬ ТАС1 -меченого белка.

Фиг. 46Б изображает циклическую вольтамперограмму покрытого электрода, указывающего на существенную потерю покрытия.

Фиг. 47 изображает мультиматричное

ЕСЬ-устройство и микропроцессор, содержащий контроллер для генерации и анализа ЕСЬ сигналов.

Подробное описание изобретения

В соответствии с вышеуказанным, изобретение, в широком аспекте, относится к кассетам для проведения множества электрохемилюминесцентного анализа. Кассеты образуются из подложек, на которых присутствует множество связывающих доменов, способных специфически связываться с одним или более аналитов, представляющих интерес. Связывающие домены изготавливают в виде конфигурированных мультиматричных мультиспецифических поверхностей (РМАМ8) на подложке. Поверхности РМАМ8 предлагают существенное усовершенствование известных ранее способов ЕСЬ-анализа, например, многократное увеличение плотности анализов, которые могут быть выполнены, и создание возможности проведения множества различных анализов, которые могут выполняться быстро или одновременно. Кассета может включать в себя множество электродов, способных селективно стимулировать ЕСЬ-эмиссию света от ЕСЬ-меченых реагентов, связанных со связывающим доменами. Фиг. 47 изображает многоструктурное ЕСЬ устройство, имеющее электроды 4700, 4704, матрицу 4702 со связывающими доменами 4706 и микропроцессор, содержащий контроллер 4720 для генерации и анализа ЕСЬ-сигнала, соединяемый посредством подводящих проводов 4710-4716.

В варианте осуществления изобретения, проиллюстрированном на фиг. 1, кассета содержит две подложки 10,12, в которой множество связывающих доменов 14 находится на поверхности первой подложки 10, а множество пар электрод/противоположный электрод 16 находится на поверхности второй подложки 12. Связывающие домены и пары электрод/противоположный электрод выстраиваются так, чтобы при совмещении первой и второй подложек 10,12 каждая из множества пар электрод/противоположный электрод 16 помещалась смежно с одним из множества связывающих доменов 14. Первая подложка 10, поддерживающая связывающие домены 14, предпочтительно является поверхностью РМАМ8 с тонкопленочным золотым покрытием и прозрачными связывающими доменами. Вторая подложка 12 предпочтительно является плоским прозрачным пластмассовым листом, имеющим на себе пары прозрачных электрода/противоположного электрода 16. Связывающие домены 14 предпочтительно изготавливаются микроштамповкой органическо го монолитного монослоя (состоящего из отдельных мономеров), конфигурированного на поверхности подложки, где мономер имеет биотин или связывающую составляющую. Авидин или стрептавидин затем связывается с экспонированным биотином (см., например, патент США № 5,093,268). Затем связывающие реагенты накладываются путем нанесения дискретного количества подходящего связывающего реагента, помеченного биотином, такого, как антитело, меченое биотином, который способен селективно связываться с исследуемым аналитом, на те участки поверхности подложки, где штамповался монослой. Фиг. 1А иллюстрирует систему, содержащую кассету (фиг. 1), заключенную в корпус (11).

В некоторых вариантах осуществления изобретения, желательно обратимо иммобилизировать на поверхности указанное или заранее заданное количество одного или более реагентов. Такая иммобилизация широко применяется в любом способе, посредством которого реагент связывается с поверхностью, включая, но не ограничиваясь ими; ковалентные химические связи, неспецифическая адсорбция; осушка реактива на поверхности; электростатические взаимодействия; гидрофобные и/или гидрофильные взаимодействия; удержание или унос в жидкостях или гелях; биологическое специфическое связывание (например, взаимодействия типа лиганд/рецептор или гибридизация олигонуклеотидов); связи металл/лиганд; хелатообразование, и/или включение в полимеры.

Количество реагента, иммобилизированное на поверхности, может быть предварительно определено несколькими способами. Например, количество реагента на поверхности может быть определено одним или более объемом и/или элементом площади, в которых находится реактив. Оно может быть также определено числом отдельных молекул реагента, которые иммобилизируются на поверхности. Количество реагента может быть определено в единицах плотности конкретного реагента в данной области. Количество реагента может быть определено как процент поверхности, несущей конкретный реагент, либо по отношению к количеству других реагентов, находящихся на поверхности. Количество реагента может также быть определено как такое количество реагента, которое должно присутствовать на конкретной поверхности, чтобы дать достаточную интенсивность ЕСЬ, позволяющую достичь нужную специфичность анализа. В конкретном примере золотая поверхность площадью в 1 см² может быть покрыта монослоем алкантиолов.

Реагенты могут также быть обратимо иммобилизованы на покрытых поверхностях. Покрытие может служить для усиления иммобилизации для некоторых реагентов и/или для ослабления или запрещения иммобилизации для других реагентов. Поверхность может быть полностью покрыта, либо она может быть частично покрыта (то есть конфигурированное покрытие). Покрытие может быть однородно по составу, или оно может включать элементы различного состава. В данном примере, покрытие может быть конфигурированной пленкой монослоя, которая иммобилизирует иммуноглобулин С посредством ковалентных химических связей на некоторых участках, и препятствует его иммобилизации на других участках.

Покрытие может также служить для предварительного определения количества (-в) одного или более реагентов, иммобилизованных на поверхности в последующих стадиях или реакциях. Или же, количество конкретного реагента может регулироваться ограничением количества реагента, который осаждается.

Наличие поверхности, которая имеет реактивы (или покрытие), иммобилизованные количественным, восстанавливаемым образом, дает возможность обратимо и количественно измерять ЕСЬ-сигнал от образца, в результате чего может быть осуществлена калибровка.

Предпочтительно, пары электрод/противоположный электрод 16, имеют субсантиметровый размер, и изготавливаются вместе с электродными подводящими проводами 20 (например, из прозрачной металлической пленки) способами, хорошо известными для изготовления жидкокристаллических дисплеев и электрохромных панелей дисплеев. Электродные подводящие провода 20 соединены электрическими проводами 19 к генератору сигнала специальной формы 18. Предпочтительно, чтобы пары электрод/противоположный электрод были доступны по отдельности при компьютерном управлении так, чтобы электрический потенциал мог выборочно прикладываться к дискретным связывающим доменам. Фотоэлектрический приемник 22 и цифровой компьютер 24 обеспечивают регистрацию и анализ результатов, после того стимуляции ЕСЬ-эмиссии подходящей метки, связанной со связывающим доменом.

Фиг. 1А иллюстрирует систему, содержащую кассету, подводящие электрические провода, генератор сигналов специальной формы, средство детектирования света и цифровой компьютер, как описано на фиг. 1, заключенную в корпус (11). Кассета вставляется в корпус через отверстие (15).

В другом варианте осуществления изобретения используется один рабочий электрод для одновременного генерирования ЕСЬ-сигнала во множестве связывающих доменов. В этом варианте изобретения ЕСЬ-сигнал от каждого связывающего домена идентифицируется с помощью формирователя светового изображения.

Вообще говоря, преимущество анализа проводимого с использованием кассет в соответствии с настоящим изобретением, заключается в использовании множества дискретных связывающих доменов. Например, использова ние таких кассет делает возможным быстродействующее и/или параллельное детектирование, или измерение широкого разнообразия аналитов, представляющих интерес. В предпочтительном варианте настоящего изобретения, анализ в соответствии с изобретением также предусматривает эффективное использование ЕСЬмеченого реагента, аналита или связывающей поверхности. ЕСЬ-анализ в соответствии с настоящим изобретением предусматривает контактирование множества связывающих доменов с образцом, в котором предполагается содержание исследуемого аналита и стимуляцию ЕСЬэмиссии от связанной ЕСЬ-метки, где ЕСЬметка находится на аналите, или аналита; на реагенте, который связывается с аналитом, или на множестве связывающих доменов.

Изобретение также относится к способам ЕСЬ-анализа для детектирования или измерения исследуемого аналита, предусматривающим

а) контактирование одного или более из множества дискретных связывающих доменов, причем упомянутое множество связывающих доменов являются иммобилизованными на поверхности одной или более подложек, в которых упомянутое контактирование происходит с образцом, содержащим молекулы, связанные с электрохемилюминесцентной меткой, причем упомянутый образец не контактирует с какимилибо электродами или противоположными электродами в процессе указанной стадии контактирования;

б) введение электрода в непосредственную близость к упомянутому одному или нескольким из множества связывающих доменов;

в) приложение напряжения со специальной формой сигнала, эффективной для стимуляции ЕСЬ в упомянутом одном или более из множества связующих доменов; и детектирование или измерение ЕСЬ.

В другом варианте своего осуществления, изобретение относится к способам ЕСЬ-анализа, предусматривающим:

а) контактирование одного или более из множества дискретных связывающих доменов, причем упомянутое множество связывающих доменов (ί) является иммобилизованным на поверхности одной или более подложек, и (ίί) является пространственно центрированным с и находится в близости с множеством пар электрод/противоположный электрод, где имеет место упомянутое контактирование с образцом, содержащим молекулы, связанные с электрохемилюминесцентной меткой,

б) приближение электрода и противоположного электрода вплотную к упомянутому одному или более из множества связывающих доменов;

в) приложение напряжения со специальной формой сигнала, эффективной для стимуляции ЕСЬ в упомянутом одном или более из множества связующих доменов; и

г) детектирование или измерение электрохемилюминесценции.

Множество связывающих доменов на подложке получают возможность взаимодействовать с анализируемыми образцами. Поверхности РМАМ8 могут далее приводиться в контакт с растворами, содержащими реагенты, необходимые для выполнения анализа. Затем, связывающая поверхность приводится в контакт (например, прессуется) с поверхностью электрода (предпочтительно чистого, или не бывшего в употреблении электрода), к которому затем прикладывается электрический потенциал для стимуляции ЕСЬ.

В предпочтительном способе проведения анализа с использованием устройства фиг. 1, образец, в котором предполагается содержание аналита, представляющего интерес, наносят на многочисленные связывающие домены 14 вместе с ЕСЬ-мечеными реагентами, подходящими для детектирования аналита. Подложка 11 и подложка 12 затем совмещаются так, чтобы каждый из многочисленных связующих доменов 14 расположился между электродом и противоположным электродом одной из многочисленных пар 16 электрод/противоположный электрод, и чтобы образец оказался заключенным между ними. Следует отметить, что пара электрод/противоположный электрод не обязательно должна создавать механический контакт с связывающим доменом, чтобы стимулировать ЕСЬ, когда соответствующий потенциал прикладывается к паре электрод/противоположный электрод. Электрический потенциал со специальной формой сигнала, подходящей для стимуляции ЕСЬ-эмиссии, прикладывается посредством электрических проводов 19 от генератора сигналов специальной формы к многочисленным парам электрод/противоположный электрод 16. Любой сигнал, испускаемый ЕСЬ-меткой, находящейся на многочисленных связывающих доменах 14, детектируется фотоприемником 22, и записывается и анализируется цифровым компьютером 24.

Изобретение относится к способу детектирования в объеме многокомпонентного жидкого образца множества аналитов, представляющих интерес, которые могут присутствовать в образце в различных концентрациях.

Вообще говоря, множество аналитов может детектироваться от многокомпонентного образца в молярных концентрациях менее 10^-3. Предпочтительно, чтобы множество аналитов могло детектироваться в молярных концентрациях менее 10^-12 из многокомпонентного образца.

Изобретение относится к детектированию в многокомпонентном образце, которое может быть выполнено как гетерогенный анализ, то есть, анализ, в котором множество несвязанных меченых реагентов отделяется от множества связанных меченых реагентов перед тем, как связанные меченные реагенты будут подвергнуты воздействию электрохимической энергии и как гомогенный анализ, то есть, анализ, в котором множество несвязанных меченых реагентов и связанных меченых реагентов вместе подвергаются воздействию электрохимической энергии.

В анализах настоящего изобретения, электромагнитное излучение, используемое для детектирования конкретного аналита, может быть дифференцировано от электромагнитного излучения, соответствующего другим аналитам, путем идентификации его положения и/или локализации как одной или более отличительных особенностей конфигурации, причем упомянутая конфигурация соответствует конфигурации связывающих доменов в ΡΜΆΜ8.

В гомогенном анализе настоящего изобретения детектируется электромагнитное излучение, испускаемое связанными мечеными реагентами, которое может либо увеличиваться, либо уменьшаться по величине электромагнитного излучения, испускаемого связанными мечеными реагентами, по сравнению с несвязанными реактивами, или детектируется электромагнитное излучение, испускаемое от источников, соответствующих в пространстве одной или более особенностям конфигурации, по отношению к конфигурации связывающих доменов в ΡΜΆΜ8.

В конкретном примере способа изобретения, проиллюстрированного на фиг. 20, сэндвич-анализ проводится на подложке (5) с множеством связывающих доменов (ΒΌ) на ее поверхности, которые являются специфичными для связывания конкретного аналита (Ап). Когда образец, в котором предполагается содержание аналита, наносят на связующие домены, то аналит связывается с этими доменами. Антитела (АЬ), которые являются подходящими для избирательно связывающихся аналитов (Ап) и которые были помечены ЕСЬ-меткой (ТАС), для образования конъюгата АЬ-ТАС, затем наносят на аналит на связующих доменах. После этого излишек несвязанного конъюгата АЬ-ТАС смывается со связующих доменов, и потенциал с формой сигнала, подходящей для стимуляции электрохемилюминесценции, прикладывается к ТАС посредством (не показанных) электродов, в результате чего стимулируется ЕСЬ-эмиссия от любой метки ТАС на связывающих доменах. Сигнал ЕСЬ детектируется фотоприемником и регистрируется цифровым компьютером (например, как показано позициями 22 и 24 на фиг. 1).

Другие варианты осуществления изобретения, его отличительные признаки и модификации описаны ниже.

5.1. Получение связывающей поверхности.

Чтобы лучше понять изобретение, ниже дается более подробное описание приготовления связующих доменов на подложке. Конфигу рированная матрица связывающих доменов на поверхности, которые являются специфичными для множества аналитов, упоминается здесь как конфигурированная, мультиматричная, мультиспецифичная поверхность, или ΡΜΛΜ8. ΡΜΆΜ8 приготавливается на подложке, например, посредством конфигурирования самоформирующихся монослоев (8ΛΜ) ( Регдикоп и соавт., 1993, Μас^ото1еси1ек, 26(22), стр. 58705875; Рпте и соавт. 1991, Заемее, 252, стр. 1164-1167; ЬшЫшк и соавт. 1989, Заепее. 245, стр. 845-847; Китаг и соавт., 1984., Ьапдтшг, 10 (5),стр. 1498-1511; Ват и соавт., 1989, Апде\\\ Сйет., 101, стр. 522-528). Способы конфигурирования поверхности также предусматривают использование физического травления (например, механической микрообработки) (АЬЬой и соавт., 1992, Заемее, 257, стр. 1380-13827, АЬЬой, 1994, Сйет.Μаΐе^., 6(5), стр. 596-602), микролитографию (ЬшЫшк и соавт., 1989, Заемее, 245, стр. 845-847), связывание химических групп с поверхностью посредством фотоактивационной химии (ЗипбЬетд и соавт., 1995, РАт. Сйет. Зое., 117(49), стр. 12050-12057) и осуществление микроштамповки (Китаг и соавт., 1994,Ьапдтшг, 10(5), стр. 1498-1511; Китаг и соавт., 1993, Арр1.Рйук.Ьей., 63 (14), стр. 20022004). Другие способы конфигурирования поверхности предусматривают процедуры для пространственно регулируемого распределения текучих сред или частиц (например, нанесение микроручкой (например, использование микрофлюидальной трубочки для перенесения на поверхность, используя Х-У-перемещение)), микрокаппилярное нанесение (Кт и соавт., 1995, ИаШте, 376, стр. 581), струйная технология, или нанесение шприцем-дозатором. Для получения сложных поверхностных конфигураций могут использоваться комбинации этих методов. Фиг. 5А изображает подложку 600 со связывающими доменами независимой формы, которые просто в целях иллюстрации представлены как геометрические формы 602, чтобы показать, что на одной подложке могут присутствовать домены с различными специфичностями связывания.

Поверхность 604 между связывающими доменами может быть альтернативно гидрофобной или гидрофильной, что позволяет установить границы нанесения связывающего реагента для образования связывающих доменов. Связывающие домены и/или поверхности между связывающими доменами могут альтернативно иметь тенденцию и быть устойчивыми к неспецифическому связыванию, и/или они могут иметь тенденцию и быть устойчивыми к присоединению связывающих реагентов посредством ковалентного или нековалентного взаимодействия. В случае, если неспецифическое связывание посредством гидрофобных взаимодействий не является способом, желательным для присоединения связывающих химических молекул к поверхности, то для предотвращения слу чайного неспецифического связывания может быть добавлено моющее средство.

Вообще говоря, связывающие домены по ширине или диаметру составляют от 0,1 мкм до 1 мм, или более, в зависимости от геометрии домена. Поверхности селективно дериватизируются для того, чтобы компоненты для специфического связывания подвергались воздействию, например, раствора для ЕСЬ-анализа. Кроме того, неспецифические взаимодействия в связывающих доменах уменьшаются в присутствии агента специфического связывания, что может быть достигнуто путем введения таких компонентов, как полиэтиленгликоли на доступной поверхности дискретных связывающих доменов (Рпте и соавт., 1993, 1. Сйет. Зое, 115, стр. 10714-10721; Рпте и соавт., 1991 Заемее, 252, стр. 1164-11677; Ра1е-Стокбета1пде и соавт., 1991, 1. Сйет. Зое., 113, стр. 12-20).

Вообще говоря, ΡΜАΜЗ может содержать от 2 до 10⁸ связывающих доменов. Предпочтительно, число связывающих доменов составляет от 50 до 500. В других вариантах осуществления изобретения число связывающих доменов составляет от 25 до 100.

Подложка может быть сделана из различных материалов широкого ряда, включая, но не ограничиваясь ими, таких как: стекло, пластмасса, керамика, полимерные материалы, эластомерные материалы, металлы, сплавы, составная фольга, полупроводники, диэлектрики, кремниевые и/или слоистые материалы, и т. д. Дериватизированные эластомерные подложки могут быть получены, например, как описывает Регдикоп и соавт., 1993, Μас^ото1еси1ек, 26, стр. 5870-5875; Регдикоп и соавт., 1991, Заемее, 253, стр. 776-778; Сйаибйшу и соавт., 1992, Заемее, 255, стр. 1230-1232.

Поверхность подложки, на которой приготовлены ΡΜАΜЗ, может содержать различные материалы, например, сита, войлоки, высокоэластичные материалы, гели, твердые вещества (например, полученные из металлов) эластомеры, и т.д. Поверхность подложки может обладать различными структурными, химическими и/или оптическими свойствами. Например, поверхность может быть жесткой или гибкой, плоской или деформированной, прозрачной, полупрозрачной, частично или полностью отражающей свет или непрозрачной и может обладать сложными свойствами, областями с различными свойствами, а также может быть составлена из более чем одного материала. Поверхность может иметь связывающие области конфигурированной поверхности и/или конфигурированные области, где может происходить катализ, в соответствии с изобретением, на одной или более поверхностях, и/или адресную матрицу электродов на одной или более поверхностях. Поверхности подложен могут быть конфигурированы в любых подходящих формах, включая плоскую, шарообразную, кубообразную и ци линдрическую. В одном из вариантов изобретения подложка, несущая ΡΜΆΜ8, является стержнем. В другом варианте изобретения, подложка, несущая РМАМ8, содержит углерод, например, графит, стеклоуглерод или сажу.

В одном варианте осуществления изобретения, подложка, несущая ΡΜΆΜ8, содержит одно или более углеродных волокон. Эти волокна могут быть аморфным или графитовым углеродом. Они могут также быть углеродными нанометровыми трубочками, трубчатыми кластерами атомов углерода или членами семейства фуллеренов.

В предпочтительном варианте изобретения, подложка, несущая РМАМ8, содержит одну или более углеродных фибрилл (Гиперионные фибриллы торговая марка) (патент США № 4,663,230). Отдельные тонкие волокна (как раскрыто в патентах США № 4,663,230, 5,165,909, и 5,171,560) могут иметь диаметры, составляющие приблизительно от 3,5 нм до 70 нм, и длину более чем 10² диаметров, внешнюю область из множества в основном, непрерывных слоев упорядоченных углеродных атомов и отличающуюся внутреннюю центральную область. Лишь для иллюстрации, например, типичный диаметр для углеродной фибриллы может приблизительно составлять между 7 и 25 нм, а типичная длина может составлять от 1 мкм до 10 мкм.

Углеродные материалы могут быть изготовлены так, чтобы они образовали агрегаты. Как раскрыто в патенте США № 5,110, 693 и в приведенных там ссылках, две или более отдельных углеродных фибриллы могут образовывать микроскопические агрегаты из спутанных фибрилл. Эти агрегаты могут иметь размеры в пределах от 5 нм до нескольких см. Просто в целях иллюстрации, один тип микроскопического агрегата (сахарная вата, или СС) напоминает шпиндель или прут запутанных волокон с диаметром, который может находиться в диапазоне от 5 нм до 20 мкм, с длиной, которая может находиться в диапазоне от 0,1 мкм до 1000 мкм. Снова в качестве иллюстрации другой тип микроскопического агрегата из фибрилл (птичье гнездо, или ΒΝ) может быть почти сферическим с диаметром, который может составлять в диапазоне от 0,1 мкм до 1000 мкм. Могут быть образованы большие агрегаты каждого типа (СС и/или ΒΝ) или из смесей каждого типа (см. ниже).

Фибриллами, которые могут использоваться в подложке, являются, но не ограничиваются ими: отдельные фибриллы, агрегаты из одной или более фибрилл, суспензии из одной или более фибрилл, дисперсионные системы фибрилл, смеси фибрилл с другими материалами (например, с маслами, парафинами, воском, полимером, гелем, пластмассой, адгезивом, эпоксидной смолой, тефлоном, металлами, органическими жидкостями, органическими твердыми веществами, неорганическими твердыми веще ствами, кислотами, щелочами, керамикой, стеклом, резиной, эластомерами, биологическими молекулами и среды, и т.д.) также как и их комбинации.

Фибриллы могут быть магнитными в некоторых случаях и немагнитными в других. Степень, до которой фибриллы могут быть сделаны магнитными или немагнитными, зависит от количества катализатора, который оказывается в фибрилле в результате процесса производства фибриллы, такой процесс раскрывается в американских патентах № 4,663,230, 5,165,909, и 5,171,560. Поверхности ΡΜΆΜ8 располагаются на подложках, в подложках, или вблизи подложек, описанных выше.

Поверхности РМАМ могут быть продуцированы из различных типов групп, связывающихся с поверхностью. Самоформирующимися монослоями, которые могут быть использованы, чтобы формирования монослоя на поверхности, с которой они связываются, являются, но не ограничиваются ими: алкантиолы (которые связывают золото и другие металлы), алкилтрихлорсилан (который, например, связывает кремний, двуокись кремния), алканкарбоновые кислоты (например, которые связывают окиси алюминия), а также их комбинации. Сначала может быть сформирован монослой, а затем используется химическое сшивание для присоединения связывающих реагентов. В результате дериватизации после самосборки монолита получают более правильную двухмерную кристаллическую упаковку монослоя на поверхности подложки, с меньшим количеством точечных отверстий или дефектов. Монослой может быть дериватизирован с помощью связывающих реагентов до или после самосборки. Регулярные дефекты в монослое могут быть желательными, и могут быть получены путем дериватизации до самосборки монослоя или поверхности подложки. Если дериватизируемая группа (например, экспонируемая связывающая группа на связывающем реактиве является стерически незатрудненной, то она может создавать плотноупакованную поверхность на экспонируемом конце, но с регулярными зазорами на металлической поверхности. Это благоприятствует протеканию заряда через указанные регулярные зазоры к ЕСЬ-меченым компонентам, связанным с частями, контактирующими с раствором образца.

Формирование дефектных монослоев известно в технике. Другими способами формирования дефектных монослоев являются, но не ограничиваются ими, формирование монослоев из разбавленных растворов связывающего реагента; прекращение реакции, формирующей монослой, перед завершением; повреждение более цельных монослоев радиацией (например, ионными частицами), светом или химическими реагентами. В одном из вариантов, многократная штамповка без ремаркировки штампа может давать ряд дефектных монослоев (^ИЬиг и соавт., 1995, Ьапдтшг, 11, стр. 825).

Поверхность РМАМ8 может быть генерирована на поверхности матриц. Матрицы могут быть высоко проводящими, например, металлические электроды или проводящие полимерные пленки;

или матрицы могут быть диэлектриками; или матрицы полупроводниковые и/или из проводящих сред. Материал для матрицы может быть ионным проводником или пористым материалом. Такие пористые материалы могут применяться в качестве материала для подложки, и/или проводящего материала, и/или фильтрующего материала, и/или материала, образующего каналы (например, пропускающего текучие среды, ионные объекты и т.д.).

Пористый материал может быть объединен с добавками. Например, составные структуры могут быть изготовлены из пористых материалов с дополнительными пористыми материалами, из проводящих материалов, полупроводящих материалов, структур, образующих каналы и/или растворов (например, ионными текучими средами). Такие композиты могут быть слоистыми структурами, структурами типа сэндвича и/или композитами с вкрапленными другими соединениями. Может использоваться твердая матрица, которая является пористым материалом, нанесенным на металлический электрод. Альтернативно, пористый материал наслаивается по типу сэндвича между проводящими материалами, полупроводящими материалами или комбинациями полупроводящих и проводящих материалов. Один или более связывающих доменов могут находиться на одной сплошной плите из пористого материала, и/или они могут быть расположены на множестве дискретных элементов на подложке, каждый из которых имеет один или более связывающих доменов. Поверхность пористого материала (например, геля) может быть плоской, полусферической или принимать любую правильную или неправильную форму, и/или она может обладать различными физическими свойствами (например, быть эластичной, жесткой, низкой плотности, высокой плотности, градиентной плотности, сухой, влажной и т.д.), и/или она может обладать различными оптическими свойствами (например, быть прозрачной, полупрозрачной, непрозрачной, отражающей, преломляющей и т.д.), и/или может обладать различными электрическими свойствами (например, быть проводящей, полупроводящей, изолирующей, переменно проводящей, например в зависимости от того, является ли она сухой или влажной и т.д.).

Конфигурация каналов может быть сформирована в матрице. Слои из пористого материала могут быть толщиной от 5 микрон до 2000 микрон. Толщина слоев из пористого материала может также превышать 2 мм.

Поры могут частично и/или полностью пронизывать материал, или они могут быть частью сети из пор. Эти поры могут иметь размеры, составляющие в широком интервале от 50 А до 10000 мкм. В предпочтительном варианте осуществления изобретения, материал может иметь некоторые поры с размерами в пределах от 200 до 500 А, а некоторые поры с размерами в пределах от 0,5 мкм до 100 мкм.

Пористость материала может быть постоянной по всему материалу или она может увеличиваться или уменьшаться в зависимости от положения в материале. Материал может иметь широкое разнообразие пор различного размера, распределенных хаотически и/или случайно.

Пористый материал может быть составлен из более, чем из одного материала.

Например, материал может иметь некоторые поры, которые являются достаточно большими, чтобы пропускать молекулы такого размера, как биологические клетки; некоторые поры, которые могут пропускать биологические среды такого размера, как белки или антитела; а некоторые поры, которые могут пропускать только небольшие с молекулярной массой <1000 органические молекулы, и/или их комбинации.

Пористость материала может быть такой, что одна или несколько молекул, жидкостей, твердых веществ, эмульсий, суспензий, газов, гелей и/или дисперсных систем могут диффундировать в этот материал, внутри этого материала и/или через него. Пористость материала является такой, что биологические среды могут диффундировать (активно или пассивно) или могут быть внедрены определенными способами в-, внутрь-и/или через материал. Примерами биологических сред являются, но не ограничиваются ими: цельная кровь, фракционированная кровь, плазма, сыворотка, моча, растворы белков, антител или их фракции, клетки, субклеточные частицы, вирусы, нуклеиновые кислоты, антигены, липопротеины, липосахариды, липиды, гликопротеиды, углеводы, пептиды, гормоны или фармакологические агенты. Пористый материал может иметь один или более слоев различной пористости так, что биологические среды могут проходить через один или более слоев, и не проходить через другие слои.

Пористый материал может быть способен поддерживать ток благодаря потоку ионов. Более усовершенствованным пористым материалом является пористый набухающий в воде гель, например, полиакриламид, или агар. Существует множество других гелевых композиций (например, см. 8оапе Ό.8., Ро1ут1ег Αρρ1ίсайоп Юг Вю1есйпо1о§у (Применение полимеров для биотехнологии), под редакцией 8оапе Ό.8., 81топ и 8сйик1ег: Епд1е\\'оо6 СйГГк, N1, 1992; Ну6годе1к т МеФсте апб Рйагтасу (Гидрогели в медицине и фармацевтике), Уо1. Ι-ΙΙΙ, под редакцией Реррак Ν.Α., СК.С Ргекк, Воса К.а1оп, ЕЬ,

1987). Связывающие домены могут быть связаны с матрицами ковалентными и нековалентными связями. (По этой теме было написано много обзоров и книг; некоторыми примерами которых являются: Ташрюп 1. и Татрюп Μ.Ό. 1ттоЬШхеб се1к: Рг1пс1р1с5 апб АррНсаИоик (Фиксированные клетки: принципы и применения) Сатбпбде ИшуегШу Ргекк: ΝΥ. 1987; Зойб Рйаке Вюсйетщйу: Аиа1уйса1 апб ЗупШейс Акрес18 (Биохимия твердой фазы: аналитический и синтетический аспекты) под редакцией Зсои1еп. \ν.Η.. 1ойп ^Неу апб Зопк. ΝΥ. 1983; Ме1йоб§ ίη Епхуто1оду. 1ттоЫНхеб Епхутек апб Се1к (Способы в ферментологии, фиксированные ферменты и клетки) Р1.В. под редакцией МокЬас11 К., Е15еу1ег Аррйеб Заепсе. Ьопбоп. 1988; МеШобк 1п Епхуто1оду. 1ттоЫНхеб Епхутек апб се118, Р1. С., под редакцией МокЬасй К., ЕкеУ1ег Аррйеб Заепсе. Ьопбоп, 1987; Ме1йоб§ ш Епхуто1оду. 1птоЬШхеб Епхутек апб Се 115. Р1. С. под редакцией МокЬасй К., Е15су1сг Аррйеб Заепсек. Ьопбоп. 1987; см. также НубгодеН т Мебкте апб Рйагтасу. выше). Например, белок может быть прикреплен к структурированному сополимеру полиакриламида и Ν-акрилоилсукцинимида путем обработки раствором белка. Связывающие домены могут также быть интегрированы в пористую матрицу в стадии до полимеризации или гелеобразовании. В одном из вариантов изобретения, связывающие домены могут быть связаны с неструктурированными полимерами и посредством множества сшивающих химических агентов. Полимеры могут быть затем структурированы (например, с использованием, которые включают амидные связи, дисульфиды, нуклеотиды, вступающие в реакцию с эпоксидными полимерами, и т.д.) (см. например: Ро11аск и соавт., 1980. 1. Ат.Сйеш.Зос.. 102(20). стр. 6324-36). Связывающие домены могут быть присоединены к мономерным звеньям, которые потом внедряются в полимерные цепи во время полимеризации (см. АбаШетккоп О., 1979. 1. Мо1. Са1а1.. 6(3). стр. 199-225). В другом варианте осуществления изобретения, связывающие домены могут быть включены в гели, захвата связующих доменов в поры во время полимеризации/гелеобразования или проникновения связывающих доменов в пористую матрицу и/или пленку. Кроме того, связывающие домены могут адсорбироваться на поверхности пористых матриц (например, полимерных гелей и пленок) посредством неспецифической адсорбции, вызванной, например, гидрофобным и/или ионным взаимодействием. В качестве сшивающего или связывающего агента может успешно использоваться биотин. В связывающие домены могут быть введены авидин, стрептавидин или другие связывающие агенты на основе биотина.

Поверхности РМАМЗ могут быть продуцированы на пористых материалах (например, гели) с различным размером пор и содержанием растворителя. Например, полиакриламидные гели, с различными размерами пор, могут быть получены путем изменения концентрации акриламида и степени поперечной связи.

На такой поверхности РМАМЗ с размерами пор меньше, чем аналит. реакции связывания будут происходить в основном на поверхности геля. В этом случае может использоваться фильтрация и/или гель-электрофорез, чтобы концентрировать аналиты на поверхности геля и модулировать кинетику (например, увеличивать скорость) реакции связывания. Более быстрая кинетика предпочтительна в быстродействующем анализе (например, короткие промежутки времени до получения результатов). и может индуцировать повышенную чувствительность за более короткий промежуток времени.

На поверхностях РМАМЗ с размерами пор больше, чем аналит, реакции связывания могут происходить на поверхности также, как в большем объеме геля. В этом случае для повышения кинетики связывания и для удаления несвязанных объектов с поверхности, может использоваться фильтрация и/или электрофорез.

Поверхности РМАМЗ. сформированные на гелях, могут храниться влажными, и/или они могут храниться в высушенном состоянии и восстанавливаться во время анализа. Реагенты, необходимые для ЕСЬ-анализа, могут быть введены в гель перед хранением (посредством проникновения в гель или посредством введения во время формирования геля) и/или они могут быть добавлены во время анализа.

Конфигурированные связывающие домены поверхности РМАМЗ могут быть генерированы посредством нанесения на подложку капель или микрокапель в жидком виде, каждая из которых заключает связующий домен в матрице. Отвердение и/или гелеобразование жидкости может быть затем индуцировано хорошо известными методами такими, как полимеризация, перекрестное сшивание, охлаждение до температуры ниже гелеобразования. нагрев). Агенты, которые вызывают отвердение или гелеобразование. могут быть включены в капли так, чтобы в некоторое время после их нанесения, капли затвердевали и/или образовывали гель. Последующая обработка (например, экспонирование воздействием света, излучения и/или окислительно-восстановительного потенциала) может использоваться,чтобы вызвать отвердение и/или гелеобразование. В других вариантах, такие капли или микрокапли могут быть взвесями, форполимерными смесями, группами частичек, и/или по существу твердыми каплями. Кроме того, может применяться осаждение из газовой фазы.

Формирование конфигурации может быть достигнуто, посредством формирования слоистой структуры матриц, каждая из которых заключает один или несколько связующих доменов. Например, агарозу, конъюгированную (стандартными химикатами) с антителом можно было бы налить в контейнер и дать зажелероваться посредством охлаждения. Затем, на первый слой могут быть нанесены последующие слои и слои, содержащие другие.

Поперечное сечение этой слоистой структуры дает сплошную поверхность, представляющую множество различных связывающих доменов. Такие поперечные сечения могут быть уложены в стопку и эта стопка может быть разрезана образованием другого поперечного сечения, в результате чего может быть получена поверхность ΡΜΆΜ8 с еще большей плотностью связующих доменов. Альтернативно линии матрицы, содержащей данный связывающий элемент, пролегают смежно друг с другом и/или накладываются друг на друга. Такие структуры могут также разрезаться в поперечном сечении и использоваться в качестве РМАМ поверхности.

Формирование конфигурации может также быть достигнуто, благодаря преимущественной способности некоторых матриц к разделению. Например, смесь нуклеотидных зондов может быть разделена посредством электрофореза в полиакриламидной пластинке, производящей поверхность, представляющую множество различных связывающих доменов.

Жидкостные микротрубочки могут также использоваться для приготовления связывающих доменов ΡΜΑΜ8 на подложке. Частичный перечень жидкостных микротрубочек включает полые капилляры, капилляры, сделанные и/или заполненные матриксом (например, пористая или набухшая в растворителе среда), твердые подложки, на которые могут быть нанесены тонкие пленки или капли жидкости. Капилляр может быть твердым, и реагенты могут протекать по внешней поверхности капилляра, резервуар с текучей средой реагента может быть обращен к той стороне пористого матрикса, который приводится в контакт с поверхностью ΡΜΑΜ8. Например, резервуар с реактивом может непрерывно или периодически снова наполняться так, чтобы данная сторона пористого матрикса могла периодически наносить реактивы (например, алкантиолы, чтобы формировать монослои и/или связывающие реактивы и т.д.) многократно. Кроме того, может использоваться изменение пористости матрикса для регулирования потока реактива к поверхности. Различные или идентичные связывающие реагенты могут присутствовать в множестве капилляров, и/или многочисленные отличающиеся связывающие агенты могут присутствовать в данном капилляре. Капилляры приводятся в контакт с поверхностью ΡΜΑΜ8 (например, конфигурированный монослой 8ΑΜ) так, чтобы некоторые домены подвергались воздействию связывающих реагентов с образованием дискретных связывающих доменов. Если необходимо, то различные связывающие реагенты, каждый из ко торых находится в отдельной микрофлюидальной трубочке, могут подводиться одновременно из матрицы жидкостных трубочек на металлическую поверхность, 8ΑΜ и т.д. Микрофлюидальные трубочки могут также использоваться для нанесения микропечати с желательной молекулой перед нанесением на поверхность подложки. Например, отдельные микрофлюидальные подающие трубочки могут использоваться для нанесения различных связывающих реагентов, связанных с компонентом, стимулирующим адсорбцию на поверхности подложки (например, свободный тиол на углеводородном линкере, который способствует адсорбции на золото), для формирования ΡΜΑΜ8. Таким образом, например, микропечать, нанесенная посредством использования микрофлюидальных подводящих трубочек с антителами различной специфичности, которые включают линкер со свободным тиолом, могут использоваться, чтобы наносить такие антитела на желательные участки на золотой поверхности, в целях формирования дискретных связывающих доменов из ΡΜΑΜ8.

Другим методом конфигурированной подачи текучей среды является использование устройств микропечати, которые подают микрокапли текучей среды посредством эжекции [выбрасывания] капли через маленькое отверстие (например, струйный принтер). Эжекция капель в этих устройствах может вызываться посредством различных механизмов, включая нагревание, электростатический заряд и/или давление от пьезоэлектрического устройства. Конфигурирование более, чем одной жидкости может быть достигнуто с помощью многочисленных отверстий и/или одного отверстия и соответствующего переключения оптических модуляторов.

В одном из способов приготовления поверхности ΡΜΑΜ8 микрофлюидальные подающие трубочки используются для подачи (предпочтительно одновременно) непосредственно на дискретные области на поверхности капли, содержащие желательные связывающие реагенты для формирования дискретных связывающих доменов. Связывающие реагенты могут содержать функциональную химическую группу, которая образует связь с химической группой на поверхности, на которую он наносится. В другой модификации связывающие реагенты в капле неспецифически адсорбируются или связываются с поверхностью (например, осушиваются на поверхности).

В другом случае, капля (-и), осажденная на поверхность, содержит реагенты, которые могут формировать матрицу. Эта матрица может быть твердым телом, полимером или гелем. Формирование матрицы может быть осуществлено путем выпаривания растворителя. Оно может происходить посредством полимеризации мономерных звеньев. Оно может происходить по средством поперечного сшивания уже сформированных полимеров. Оно может происходить посредством модуляции температуры (например, охлаждением и/или нагреванием). Оно может быть осуществлено другими способами. Например, полимерные соединения могут охлаждаться путем охлаждения или путем добавления реагента, который вызывает гелеобразование. Формирование твердой матрицы может быть стимулировано путем генерирования реакционноспособных соединений на электроде (включая подложку) путем воздействия светом (или другим излучением), путем добавления реактивов, которые стимулируют отверждение или гелеобразование при прохождении или нагревании. Кроме того, поверхность может содержать катализаторы, способные к инициации формирования матрицы (например, гелеобразование или полимеризация).

В предпочтительном методе, для предотвращения растекания нанесенных текучих сред или гелей, могут использоваться конфигурированные гидрофильные/гидрофобные домены. Такая текучая среда или гель могут содержать связывающие реагенты, для связывания с поверхностью на подложке для формирования связывающих доменов РМАМ8. В этом случае, использование такой гидрофильно/гидрофобной границы способствует ограничению продуцированного связывающего домена дискретной областью. Альтернативно, текучая среда содержит реагенты, которые могут формировать матрицу на поверхности, и связывающие реагенты будут заключаться внутри заданной области при осаждении на поверхности. Например, гидрофильный/гидрофобный барьер может применяться для удержания капли в заданной области. Кроме того, либо гидрофильные, либо гидрофобные участки могут представлять группы, которые могут быть введены (например, посредством ковалентной или нековалентной связи) в матрицу, что позволяет достичь более устойчивую адгезию [прилипание] матрицы к подложке (Йауа и Ватб, 1978, Апа1. Сйет., 50(11), стр. 14871489). В другом методе наносимая текучая среда или гель представляет собой образец, содержащий исследуемый аналит, и образец наносится на приготовленную поверхность РМАМ8. В одном предпочтительном примере капилляры, содержащие гидрофильные растворы, могут использоваться для осаждения раствора на дискретные участки, создавая гидрофильные домены, окруженные гидрофобными областями. С другой стороны, гидрофобные связывающие домены, окруженные гидрофильными областями, могут использоваться с гидрофобной текучей средой, содержащей связывающие реагенты или аналит (-ы). Гидрофобный и гидрофильный являются относительными понятиями, по отношению друг к другу и/или по отношению к наносимому образцу то есть, может регулироваться распространение или смачивание текучей средой или гелем образца, наносимого на связывающие домены. Далее, регулируемое нанесение раствора из микрофлюидальной матрицы может быть осуществлено с использованием физических особенностей поверхности (например, лунки или каналы на поверхности). Микрофлюидальные подающие трубочки могут быть включены в кассету, или, более предпочтительно, использоваться для нанесения специфических реагентов на подложку перед использованием.

Больше чем один связывающий химический агент может быть нанесен на ту же самую поверхность подложки и/или, может быть создана поверхность как с гидрофильными, так и с гидрофобными связывающими доменами с использованием многочисленных штампов. Например, участок, где желательно, чтобы гидрофильный связывающий домен был в положении

1, а гидрофобный связывающий домен в положении 2 может быть приготовлен следующим образом. Делается первый гидрофильный штамп, который имеет диск в положении 1 и больший круг в положении 2. Второй гидрофобный штамп делается с диском в положении

2, который подгоняется внутри круглого монослоя, оставленного штампом 1. Наконец, поверхность промывается гидрофобным раствором компонентов монослоя.

В частности, поверхность РМАМ8 производится микроконтактной печатью, то есть штамповкой. Монослой, приложенный таким образом, состоит из связывающихся с поверхностью групп, например, для золотой поверхности предпочтительно использовать тиольную группу с алкановым спейсером (например, (СН₂)_п). Спейсерная группа связывается (предпочтительно ковалентной связью) с линкерной группой А. Группой А может быть, например, авидин, стрептавидин или биотин или любой другой подходящий связывающий реагент с доступным комплементарным связывающимся партнером В. Связь А:В может быть ковалентной или нековалентной, и некоторые связывающие химические агенты, известные специалистам, которые можно использовать, раскрыты Ватб и соавт., (в патенте США № 5,221,605 и 5,310,687). В далее связывается со связывающим реагентом, таким, как антитело, антиген, нуклеиновая кислота, фармацевтическое или другое вещество, подходящее для формирования связывающего домена, который может связываться с одним или несколькими из исследуемых аналитов в испытуемом образце. Группа В может также быть связана с ЕСЬ-ТАО или меткой. Сшивающая группа В может подаваться в монослой 8АМ посредством капилляра или матрицы микрофлюидальных подающих трубочек (фиг. 5А-5В), способных поместить множество реагентов В с различными специфичностями к связывающим поверхностям на связь А монослоя. А и В могут быть также связаны прежде, чем прикрепиться к монослою. Как уже обсуждалось, на фиг. 5А, представлены формы независимых связывающих доменов, просто в целях иллюстрации, в виде геометрических форм 602, чтобы показать, что на одной подложке 600 могут присутствовать элементы с различными специфичностями связывания. Фиг. 5Б представляет вид сверху матрицы 606 микрофлюидальных трубочек (например, капилляров). Пятнышки 610 представляют собой микрофлюидальные трубочки в поперечном сечении. Фиг. 5В представляет вид сбоку матрицы 608 микрофлюидальных трубочек. Линии, изображенные сверху вниз являются отдельными микрофлюидальными трубочками 610. Геометрические формы 612 на нижней плоскости представляют характерные связывающие домены, образованные при нанесении связующих реагентов из каждого отдельного капилляра.

Например, после первой штамповки, обсуждаемой ниже, области голой поверхности (например, золотой) могут реагировать со вторым алкантиолом, который не имеет сшивающую химическую группу А и по своим свойствам гидрофобности /гидрофильности противоположен первому верхнему монослою. Таким образом, на поверхности формируются специфически связывающиеся домены.

Связывающий реагент, который является специфичным для одного исследуемого аналита, может использоваться для каждого связывающего домена, либо может использоваться такой связующий реактив, который специфически связывается с многочисленными аналитами, представляющими интерес.

Еще в одной модификации поверхность подложки может быть проштампована многократно материалами (например, связующими реактивами, ЕСЬ-метками, 8АМ), имеющими различные химические сшивающие агенты и/или связующие составляющие, как показано выше на фиг. 5А.

Связывающие конфигурируемые реагенты могут быть стабильными и/или стойкими химическими группами (например, переносящими условия, которым они подвергаются), которые позже соединяются с менее стабильными или стойкими связывающими группами. Многочисленные связывающие соединения могут быть использованы для оптимизации условий каждой стадии в получении РМАМ8-поверхности и/или для облегчения получения РМАМ8 поверхностей. Например, первая РМАМ8 поверхность может быть изготовлена обычным способом и затем модифицирована для создания различных РМАМ8 поверхностей. В другом примере, обычная РМАМ8 поверхность может вступать в реакцию со смесью растворов связывающих реагентов, которые сами по себе содержат связывающие домены, направляющие их к конкретным областям (например, к связывающим доменам) на РМАМ8 поверхности. Например, конфигурация связывающих доменов, каждый из которых представляет различную олигонуклетидную последовательность, присоединяется к поверхности. Эту поверхность затем обрабатывают раствором, содержащим смесь вторичных связывающих реагентов, каждый из которых присоединен к олигонуклеотидной последовательности, комплементарной последовательности, присутствующей на поверхности. Таким образом, может быть достигнуто конфигурирование этих вторичных связующих элементов. Предпочтительно, олигонуклеотидные последовательности представляют собой 6-30 меры ДНК. Некоторые наборы из 6-30 мерных последовательностей могут содержать в основном комплементарные последовательности, чтобы приближенные константы связывания для гибридизации были подобны в пределах данного набора и заметно отличимы от менее комплементарных последовательностей. В другом варианте осуществления изобретения вторичные связующие элементы представляют собой белки (например, антитела).

Способы, описанные для ингибирования смачивания или растекания нанесенных на поверхность реагентов образца, как описано в части 5.13 ниже, могут также использоваться в приготовлении РМАМ8 (и/или в прикладывании образца). Приложенный потенциал (например, от пары электрод/противоположный электрод) может использоваться для последующего регулирования осаждения и/или распыления реагентов и/или образцов (см., например, АЬЬоН и соавт., 19894, Баидшии, 10(5), стр. 1493-1497).

РМАМ8-связывающие реагенты могут быть расположены на материалах, которые содержат углерод. Они могут также быть расположены на отдельных углеродных фибриллах, либо РМАМ8-связывающие реагенты могут быть расположены на агрегатах из одной или более фибрилл. Во многих вариантах воплощения связующие РМАМ8 реактивы могут быть расположены на суспензиях одной или более фибрилл, дисперсиях фибрилл, смесях фибрилл с другими материалами (описано на примере выше), а также их комбинаций.

РМАМ8-связывающие реагенты могут быть расположены на множестве отдельных фибрилл и/или на агрегатах фибрилл, расположенных на подложке или в подложке или возле подложки. В одном из примеров, связующие реактивы расположены на рассеянных отдельных тонких фибриллах или агрегатах фибрилл. Эти фибриллы или агрегаты фибрилл могут быть пространственно локализованы в отдельных доменах на подложке, и могут составлять связывающие домены, как определено в настоящем описании.

В другом примере, отдельные такие связывающие домены или множество таких связывающих доменов расположены в пространственно разделенных областях подложки. В не ограничивающем примере отдельные такие связывающие домены или скопления связывающих доменов могут быть расположены в углублениях, ямках и/или отверстиях в подложке. В еще одном примере, отдельные связывающие домены или множество доменов могут находиться в каплях воды, гелях, эластомерах, пластмассах, маслах, и т.д., которые локализованы на поверхности подложки. Еще в одном примере, отдельные связывающие домены могут быть локализованы на подложке посредством покрытия (которое может быть конфигурировано), которое имеет различные аффинности связывания для различных связывающих реагентов и/или связывающих комплексов реактив/фибрилла.

Связывающие домены, если необходимо, могут располагаться на множестве отдельных фибрилл, и/или агрегаты фибрилл могут быть приготовлены на подложке посредством одной или более жидкостных подающих трубочек (например, капилляра). Различные или идентичные связывающие реагенты могут находиться в или на множестве жидкостных подающих трубочек, и/или многочисленные отдельные связывающие агенты могут находиться в или на заданной жидкостной подающей трубочке. Капилляры могут быть приведены в контакт с подложкой точечным нанесением и/или через них могут подавать реактивы, в то время как либо микрофлюидальная подающая трубочка, и/или поверхность сканируется или перемещается друг относительно друга (то есть, способ нанесения, подобно письму ручкой). Жидкостная подающая трубочка может подавать связывающие реагенты, расположенные на фибриллах, к подложке так, чтобы некоторые области подвергались воздействию волокно-связующего комплекса реагента в целях создания дискретного связывающего домена(-ы). В предпочтительном аспекте различные связывающие реагенты, каждый из которых находится в различных жидкостных подающих трубочках, подаются одновременно из этой направляющей матрицы трубочек на подложку. В одном из примеров, связывающие реагенты и/или фибриллы, на которых они локализуются, подвергают дериватизации с помощью химической функциональной группы, которая образует связь (например, ковалентную или нековалентное взаимодействие) с поверхностью подложки. В некоторых вариантах связывающие реагенты и фибриллы нехарактерно связаны или адсорбируются на поверхности. Еще в одном аспекте, связывающие реагенты, локализованные на фибриллах, могут подаваться в углубления, лунки и/или отверстия в поверхности подложки.

В другом примере, связующие реактивы подаются на поверхность, которая покрыта материалом, имеющим более сильную или более слабую аффинность связывания, для некоторых связывающих реагентов или связующих ком плексов реактив/фибрилла, в результате чего создаются домены реагентов, которые локализованы по всему пространству и отдельно от других связывающих реактивов.

Связывающие реагенты локализованы на одной или более отдельных фибрилл или агрегатах фибрилл, которые являются магнитными. В таком случае, магнитная подложка может притягивать к подложке связывающие реагенты, локализованные на магнитных фибриллах.

Подложка может содержать несколько раздельных областей, которые являются магнитными и окруженными областями, не являющимися магнитными. Связывающие реактивы, локализованные на магнитных фибриллах, могут быть локализованы на магнитных областях подложки. В одном из примеров, подложка может содержать одну или более раздельных областей, которые являются магнитными, и окружены областями, которые являются немагнитными, а напряженность магнитного поля в магнитных областях может модулироваться или переключаться. В этом аспекте использование такого модулируемого или переключаемого магнитного поля способствует присоединению или освобождению связывающих реагентов, локализованных на фибриллах, от поверхности подложки, что дает возможность размешивать или смешивать упомянутые домены.

Вообще говоря, имеется от 2 до 10 связывающих доменов и, предпочтительно, от 25 до 500 доменов.

Связывающие домены могут быть расположены на рабочем электроде и/или противоположном электроде.

Различные варианты, описанные здесь для различных типов ΡΜΑΜ§, подложек, электродов и их конфигураций, могут быть также реализованы в комбинации друг с другом.

Подложки РМАМ8 могут быть помещены на хранение (например, посредством защитных поверхностных покрытий, сушки поверхности, прочной упаковки в вакууме или в инертной атмосфере, охлаждения, и другими способами) для последующего использования.

5.2. Связывающие реагенты.

Связывающие домены настоящего изобретения получают таким образом, чтобы они содержали связывающие реагенты, которые специфически связываются, по крайней мере, с одним исследуемым аналитом (лигандом). Связывающие реагенты в дискретных связывающих доменах отбираются так, чтобы связывающие домены имели нужную специфичность связывания. Связывающие реагенты могут быть отобраны из числа любых молекул, которые, как известно, способны или предположительно способны специфически связываться с исследуемым аналитом. Исследуемый аналит может быть выбран из числа тех, которые описаны в разделе 5.10 ниже, анализ ЕСЬ, который может быть проведен. Так, например, связывающими реагентами являются, но не ограничиваются ими: рецепторы, лиганды для рецепторов, антитела или их связывающие части (например, ТаЬ, (РаЬ)'₂), белки или их фрагменты, нуклеиновые кислоты, олигонуклеотиды, гликопротеины, полисахариды, антигены, эпитопы, клетки и клеточные компоненты, субклеточные частицы, составляющие углеводов, ферменты, ферментные субстраты, лектины, белок А, белок С, органические соединения, металлоорганические соединения, вирусы, прионы, вироиды, липиды, жирные кислоты, липополисахариды, пептиды, клеточные метаболиты, гормоны, фармакологические агенты, транквилизаторы, барбитураты, алкалоиды, стероиды, витамины, аминокислоты, сахара, небиологические полимеры, биотин, авидин, стрептавидин, органические сшивающие соединения, такие, как полимерные смолы, липопротеины, цитокины, лимфокины, гормоны, синтетические полимеры, органические и неорганические молекулы, и т.д. Нуклеиновые кислоты и олигонуклеотиды можно относить к ДНК, РНК и/или олигонуклеотидным аналогам, включая, но не ограничиваясь следующими: олигонуклеотиды, содержащие модифицированные основания или модифицированные сахара, олигонуклеотиды, содержащие основные химические, отличные от фосфодиэстерных связей (см., например, №екеи, Р.Е. (1995) Лили Неу, Вюрйук. Вютс1. 81гее1. 24, стр. 167-183), и/или олигонуклеотиды, которые были синтезированы или модифицированы для введения химических групп, которые могут быть использованы для образования связей (ковалентных или нековалентных) с другими молекулами (где мы определяем нуклеиновую кислоту или олиго(нуклеотид), как содержащий два или более нуклеотидных основания и/или производные нуклеотидных оснований).

Поверхность РМАМ8 настоящего изобретения может иметь множество дискретных связывающих доменов, которые включают, по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты, которые идентичны друг другу и по своей специфичности отличаются от связывающих реагентов, содержащихся в других связывающих доменах, в результате чего обеспечивается связывание различных исследуемых аналитов различными связывающими доменами. Например, такая РМЛМ8 включает связывающий домен, содержащий антитело к тиреотропному гормону ТТГ (Т8Н); связывающий домен, содержащий олигонуклеотид, гибридизирующийся с вирусом гепатита С(НСУ); связующий домен, содержащий олигонуклеотиды, гибридизирующийся с вирусом иммунодефицита человека, ВИЧ (Н1У); связывающий домен, содержащий антитело к ВИЧ-белку или гликопротеину, связывающий домен, содержащий антитело к антигену, специфичному для предстательной железы (Р8Л); и связывающий домен, содержащий антитело к вирусу гепатита В (НВУ); или любую их субпопуляцию.

Поверхность РМЛМ8 может иметь множество дискретных связывающих доменов, которые включают, по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты, которые отличаются по своей специфичности связывания, так, что один связывающий домен может связывать многочисленные исследуемые аналиты. Например, такая РМАМ8 включает связывающий домен, содержащий как антитело к рецептору Т-клеточного антигена, так и антитело к антигену Т-клеточной поверхности, такому как СЭ4 [антигенный маркер хелперных Т-лимфоцитов].

Поверхность РМЛМ8 может иметь множество дискретных связывающих доменов, которые включают (ί) по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты, которые идентичны друг другу и которые по своей специфичности отличаются по крайней мере, от одного из связывающих реагентов, содержащихся в других связывающих доменах; и (и) по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты, которые отличаются по специфичности связывания. Например, изготавливают РМАМ8, которая имеет а) по крайней мере, один связывающий домен, содержащий связывающие реагенты единого свойства, например, антитело к рецептору Т-клеточного антигена (например, к α-, β-рецептору Т-клеточного антигена, или к γ-, δ-рецептору Т-клеточного антигена), благодаря чему, по крайней мере, один связывающий домен связывает все клетки, экспрессирующие этот рецептор Т-клеточного антигена; и (б) по крайней мере, один связывающий домен, содержащий два различных связывающих реагента, например, антитело к рецептору Тклеточного антигена и антитело к ί.Ό4. благодаря чему, по крайней мере, один связывающий домен связывает ί.Ό4'-Т-лимфоциты. экспрессирующие этот рецептор Т-клеточного антигена (то есть, субпопуляцию Т-лимфоцитов).

В другом варианте осуществления изобретения, по крайней мере один связующий домен содержит связывающие реагенты, которые являются различными молекулами, но которые имеют одинаковые специфичности связывания (например, связывающие реагенты, такие как эпидермический фактор роста и антитело против рецептора эпидермического фактора роста).

Множество связывающих реагентов могут быть выбраны так, что даже если связывающие реагенты отличаются друг от друга, и имеют различные специфичности связывания, то они будут распознавать один и тот же аналит (в альтернативном варианте, они будут распознавать различные аналиты). Так, например, если аналит имеет многочисленные связывающие компоненты (например, клетку, которая имеет раз личные антигены поверхности клетки), то различные связывающие реагенты, которые связываются с различными связывающими компонентами, будут распознавать один и тот же аналит. Или, например, антитела к различным антигенам поверхности клетки на одной клетке, будут распознавать ту же клетку. И еще один пример, антитела к различным эпитопам одного антигена могут быть использованы в качестве связывающих реагентов для распознавания антигена.

В еще одном варианте осуществления изобретения только тот связывывающий реагент(ы), который специфически связывает один исследуемый аналит, находится в одном или более связывающих доменов. Альтернативно, связывающие реагенты, которые специфически связывают больше чем один исследуемый аналит, находятся в одном или более связывающих доменах (например, перекрестно реагирующее антитело). В конкретном проекте могут использоваться связывающие реагенты, которые связываются с классом аналитов, имеющих, например, подобные свойства.

Связывающие домены могут также быть включены в поверхность РМАМ8, которая содержит связывающие реагенты, являющиеся специфичными для нужного стандартного аналита, и использующиеся в качестве внутреннего стандарта (например, связующий домен, который может контактировать с образцом, содержащим определенное количество аналита, с которым связываются связывающие реагенты). Многочисленные связывающие домены, содержащие связывающие реагенты, специфичные для одного и того же аналита(-ов), могут также быть включены в поверхность РМАМ8 так, чтобы сделать возможным статистическое усреднение аналитических результатов. Связывающие реагенты могут быть не только специфичными для одного и того же аналита, но могут быть и идентичными, распознавая тем самым одну и ту же связывающую часть на аналите. Таким образом, может быть получено множество связующих доменов (например, в диапазоне от 2 до 10⁸), которые специфически связываются с одной и той же связывающей частью, так, чтобы данные электрохемилюминесценции (ЕСЬ) могли быть статистически усреднены для контроля за вариациями и для повышения точности. Множество связывающих доменов на поверхности РМАМ8 может быть специфичными для контрольного аналита или исследуемого аналита, или для обоих, на одной подложке.

В качестве другого примера, может быть получен один или более дискретных связывающих доменов с известной начальной величиной концентрации ЕСЬ-меток. Встроенный ЕСЬслой служит в качестве контроля для отслеживания, например, деградации метки и температурных эффектов.

Можно использовать связывающий реагент, который является ферментом, специфич ным для субстрата (упомянутый субстрат является исследуемым аналитом), где продукт ферментативной реакции на подложке является агентом-репортером (агент, который можно обнаруживать), например, продукт, который стимулирует ЕСЬ-реакцию: флуоресцентная молекула;

субстрат, который изменяет цвет после контакта с соответствующим ферментом (например, хромогенный субстрат для пероксидазы хрена), и т.д. Например, в таком варианте осуществления, ферментом, используемым в качестве связывающего реагента, может быть глюкозодегидрогеназа ((СОН), которую можно использовать для обнаружения или измерения глюкозы в образце. ЕСЬ-метка располагается внутри или возле связующего домена, содержащего СОН. Никотинамидадениндинуклеотид (ΝΑΌΗ) продуцируется посредством действия ферменте на глюкозу, ΝΑΌΗ способен вступать в реакцию с ЕСЬ-метками для стимулирования ЕСЬ (Магйи и соавт., 1993, Аиа1.СЫт. Ас1а. 281, стр. 475).

Связывающие домены, содержащие связывающие реагенты, которые увеличивают фоновое связывание (то есть, которые связываются со связывающим участком, присутствующем на исследуемом аналите, а также на других аналитах в образце), могут использоваться для увеличения отношения сигнал/шум во время детектирования или измерения электрохемилюминесценции. Так, например, если исследуемый аналит представляет собой определенную субпопуляцию клеток (например, СЭ4 '-клетки), а образец является жидким, например, кровь, которая содержит клетки пациента, то в качестве связывающего реагента может быть использовано антитело против сиаловой кислоты для того, чтобы увеличить фоновую связь фактически со всеми клетками в образце (так как сиалокислота является компонентом фактически всех гликопротеинов поверхности клетки), а затем в качестве связующего реактива (в одном и том же или в другом связующем домене, поскольку он содержит антитело против сиаловой кислоты) может быть использовано антитело к поверхностному антигену клетки, специфичному для данной клеточной субпопуляции (например, антитело против СЭ4).

5.3. Форма кривой напряжения.

Форма кривой напряжения (изменение электрического потенциала в зависимости от времени), прилагаемого к множеству пар электрод/противоположный электрод ЕСЬ - камеры, должна быть достаточной, чтобы вызвать ЕСЬреакцию. Эта форма кривой напряжения обычно бывает в виде однородной развертки напряжения, начинающейся с первого напряжения, перемещающейся равномерно ко второму напряжению, перемещающейся обратно через первое напряжение к третьему напряжению и затем возвращающейся опять к первому напряжению.

Например, форма кривой напряжения может начинаться в первом напряжении в диапазоне от -0,5 до 0,5 В, вплоть до второго напряжения в диапазоне от 1 до 2,5 В, и перемещаясь назад через первое напряжение к третьему напряжению, находящемуся в диапазоне от 0,0-до -1 В. Если взять другой пример, для более простых волн, то напряжение может изменяться от 0,0 до +3,5 В и до 0,0 В. Формы кривой напряжения могут включать зависимости с линейным наклоном, ступенчатые функции и/или другие функции. Формы кривой напряжения могут включать периоды времени, в течение которого напряжение остается установившимся на одном потенциале. Приложенный потенциал может управляться относительно одного или более электродов сравнения или, можно вообще не использовать электроды сравнения. Кроме того, может использоваться отрицательный потенциал. Таким образом напряжения, используемые для того, чтобы стимулировать ЕСЬ-эмиссию из кассеты настоящего изобретения, будут легко подобраны для оптимальной интенсивности сигнала ЕСЬ и оптимальных характеристик ЕСЬ-метки и анализируемой среды.

В некоторых применениях напряжение предпочтительно изменяется по мере того, как измеряется свет, испускаемый из связывающего домена. Особенно важно определить пороговое значение электрического поля, необходимого для того, чтобы заставить связывающий домен испускать свет. В этом случае электрический потенциал, прикладываемый к связующему домену, начинается со значения, которое, как надеются, ниже порога, требуемого для испускания света, и делается первое измерение испускаемого света. Если световой сигнал не зарегистрирован, или если световой сигнал - ниже заданного порога, то электрический потенциал, прикладываемый к паре электродов, увеличивается под управлением компьютера так, как это делается при компьютерном управлении источником напряжения или других измерениях света. Этот процесс может повторяться до тех пор, пока не будет получено заданное подходящее количества света. Таким образом, прикладываемое напряжение может использоваться в качестве сигнала анализа.

ЕСЬ сигнал можно генерировать от переменного напряжения, приложенного к электродным парам.

Обычный техник, который знаком с установками напряжения и тока, как раскрыто, например, в патентах США № 5,324,457 и 5,068,088, будет способен легко выбрать оптимальные значения рабочих напряжений и развертку напряжения для стимуляции ЕСЬ-эмиссии.

Потенциал, требуемый для генерации ЕСЬ, может генерироваться посредством освещения поверхности рабочего электрода, если рабочий электрод является полупроводником или содер жит другую составляющую, которая генерирует электрический ток в ответ на действие света.

5.4. Электроды раздельного доступа и способы их использования.

Для раздельного доступа к множеству пар электрод/противоположный электрод могут использоваться многочисленные способы. Фиг. 14-18 иллюстрируют несколько таких иллюстративных методов. Для примера эти фигуры изображают четыре пары электрод/противоположный электрод 101, 102, 103, 104 и генератор сигналов специальной формы, который обычно является цифровым компьютером и который предпочтительно является тем же самым компьютером, который используется для обработки ЕСЬ, обнаруженной средством детектирования.

На фиг. 14 каждая пара электрод/противоположный электрод 101-104 имеет отдельный доступ посредством пары линий, связанных с генератором сигналов. Например, линии 105, 106 обеспечивают доступ к паре электрод/противоположный электрод 101. Соответствующий сигнал может прикладываться генератором сигналов в любой заданный момент времени к любой одной или более пар линий, соединенных с различными парами электрод/противоположный электрод.

Чтобы уменьшить число связей, требуемых, чтобы обеспечить раздельный доступ к электродным парам, обеспечиваются варианты, альтернативные к схеме прямого соединения фиг.14. Например, фиг. 15 иллюстрирует схему раздельного доступа к элементам строки/столбца, для подачи электроэнергии к некоторым или ко всем электродам. В этой схеме один из электродов 201, 202 в каждом столбце из множества пар электрод/противоположный электрод связан с общим электрическим проводом 205 на подложке 200, и каждый из противоположных электродов в каждой строке из множества пар электрод/противоположный электрод связан с проводом 207, 208 на подложке 200. Провода 205, 206 соединяются с соединениями С1, С2, соответственно, на краю подложки 200, и провода 207, 208 соединяются с соединениями К1, К2, соответственно. Каждое из этих соединений потом соединяется отдельной линией с генератором волновой формы. В результате, в конфигурации фиг. 15 количество требуемых связей и сигнальных линий из генератора импульсов уменьшилось с 8 до 4.

Чтобы сделать возможной быструю и последовательную подачу энергии каждой электродной паре, предпочтительно использовать переключающее устройство, управляемое компьютером. Конфигурация, представленная на фиг. 16 изображает множество электродов, соединенных с первым мультиплексором [устройство уплотнения/разуплотнения линий связи] 310. Множество противоположных электродов соединяется со вторым мультиплексором 320.

Первый мультиплексор также соединяется с первым полюсом источника напряжения 330, который обычно подает электрический потенциал, изменяемый во времени, описываемый ниже. Второй мультиплексор, также соединяется со вторым полюсом источника напряжения. Используя линии доступа А0-А3, электрически соединенные с каждым из мультиплексоров и соединенные со схемой защелки 340, процессор компьютера 350 может управлять мультиплексорами, чтобы они выборочно соединяли любой или все первые электроды к первому полюсу источника напряжения, и любой или все вторые электроды к второму полюсу источника напряжения.

Как показано на фиг. 17, множество источников напряжения соединяется через отдельные наборы мультиплексоров с каждым из электродов. Если первый электрический потенциал или область значений электрических потенциалов запрашивается на конкретную электродную пару, то мультиплексоры 410, 420, соединенные с источником напряжения 430, обеспечивающим этот потенциал, адресуются процессором компьютера 350, обычно через схему защелки 340, таким образом присоединяя этот конкретный источник напряжения к рассматриваемой паре электродов. Если отличающийся электрический потенциал или область значений электрических потенциалов требуется для другой электродной пары, то мультиплексоры 440, 450, связанные с тем отличающимся источником напряжения 460, адресуются процессором компьютера, таким образом соединяя этот источник напряжения через связанные мультиплексоры 440, 450 к паре электродов.

Если матрица электродов в этом варианте осуществления изобретения имеет, по крайней мере, часть электродных пар, независимо приводимых в действие, как показано на фиг. 14 или 15, то тогда, например, одну электродную пару можно приводить в действие одним источником напряжения, в то время как другая электродная пара одновременно приводится в действие другим источником напряжения. С другой стороны, два источника напряжения фиг. 17 могут быть заменены одним источником напряжения, соединенным параллельно с обоими наборами мультиплексоров, позволяя приводить в действие две электродных пары из того же источника напряжения.

Вместо двойного набора мультиплексоров для каждого источника напряжения, как показано на фиг. 17, можно обеспечить множество источников напряжения 520, 530, как показано на фиг. 18. Эти источники напряжения могут быть соединены посредством электрического переключателя 510, управляемого компьютером, или переключателями к отдельному набору мультиплексоров 310, 320. Как показано на фиг. 18, компьютер направил бы переключатель 510, чтобы соединить конкретный источник напря жения с мультиплексорами, и также направил бы мультиплексоры (сообщая их адресные линии А0-А3), чтобы соединить выбранный источник напряжения с конкретной желательной электродной парой.

С другой стороны, электрический потенциал, прикладываемый к каждой из электродных пар в любом варианте может быть изменен. Это особенно выгодно, когда используется кассета, имеющая множество различных связывающих доменов. Такая кассета может требовать различной области значений прикладываемого электрического потенциала в различных связывающих доменах. Рассматривается несколько различных вариантов, способствующих изменению электрического потенциала, приложенного к каждому электроду.

Предпочтительно, если можно использовать источник напряжения, управляемый компьютером. Это такой источник, который может управляться компьютером в целях отбора конкретного электрического потенциала, который будет подан. С другой стороны, он может быть запрограммирован на последовательное приложение электрических потенциалов в конкретном интервале в течение заданного времени. В такой системе адресные линии, электрически соединенные с компьютером и источником напряжения, позволяют компьютеру программировать источник напряжения так, чтобы он производил конкретный электрический потенциал, который нужно прикладывать к электродной паре, чтобы подавать ей энергию.

Можно также использовать дополнительные способы для адресации множества электродных пар. Например, можно поместить множество контрольных электродов вплотную к каждому из множества пар электрод/противоположный электрод, чтобы они воспринимали напряжение, приложенное к ним. Таким образом можно осуществить дополнительное управление формой сигнала напряжения.

Фиг. 36 изображает другой вариант осуществления изобретения; матрицы электродов (3600, 3601) поддерживаются на каждой из двух поверхностей (3602, 3603), отделенных конфигураций зазоров в изоляторе 3604 (например, пластмассовый лист с перфорированными отверстиями 3605). Каждый электрод может пересекать множество зазоров. Если потенциал прикладывается между одним электродом на каждой поверхности, то ток может проходить только через зазор, контактирующий с обоими электродами, таким образом ограничивая местоположение любого процесса электрохимической реакции или ЕСЬ, которые могут происходить. В предпочтительном варианте изобретения, показанном на фигуре, электроды (3600, 3601) представляют собой матрицы линий на подложке. Два набора электродов на двух поверхностях ориентированы перпендикулярно друг к другу. Зазоры в изолирующем листе расположены только в местах пересечения электродов с каждой поверхностью.

Этот вариант изобретения имеет то преимущество, что он требует меньше электрических проводов для раздельного доступа к электродным парам.

В другом варианте изобретения, изолятор 3604 опускается, и поверхности помещаются вплотную так, чтобы только узкий зазор оставался между двумя поверхностями. В этом варианте изобретения потенциал, приложенный между электродами, находящимися на каждой поверхности, будет преимущественно вызывать ток, проходящий в местах пересечения электродов (то есть, где расстояние между электродами минимально), ограничивая, тем самым, локализацию любого процесса электрохимической реакции или ЕСЬ, которые могут происходить.

5.5. Детектирование света.

Свет, генерированный посредством стимуляции ЕСЬ-эмиссии, детектируется подходящим или расположенными возле устройства настоящего изобретения. Световым детектором может быть, например, пленка, фотоэлектронный умножитель [ФЭУ], фотодиод, лавинный фотодиод, прибор с зарядовой связью (ПЗС, ССЭ) или другой световой детектор или камера. Световой детектор может быть отдельным детектором для детектирования последовательных эмиссий, или он может состоять из множества (набора) детекторов, чтобы детектировать и пространственно разрешать одновременные эмиссии на одной или многих длинах волн испускаемого света. Испускаемый и детектируемый свет может быть видимым светом или может испускаться как невидимое излучение, такое как инфракрасное или ультрафиолетовое излучение. Детектор или детекторы могут быть неподвижными или подвижными. Испускаемый свет или другое излучение может проводиться к детектору или детекторам посредством линз, зеркал и волоконнооптических световодов или кабелей световодов (одиночных, многожильных, фиксированных или подвижных), помещенных на или смежных со связующей поверхностью кассеты, или детектор может прямо принимать свет. Кроме того, подложки, поверхности РМАМ8 и поверхности электрода сами по себе могут использоваться для напряжения или пропускания света.

Поверхность РМАМ8 может быть сформирована на поверхности множества детекторов света так, чтобы каждый детектор принимал свет только от одного связывающего домена. Матрица детекторов света может быть ПЗС чипом [микросхемой], и связывающие домены могут быть связаны (используя стандартную химию связывания) с поверхностью полупроводникового прибора.

Капли, нанесенные на связывающие домены, или возле них, на вторую поверхность, могут использоваться как микролинзы, для регу лирования или направления испускаемого света. Альтернативно, детектор света может ориентироваться прямо перед кассетой; а различные устройства, фокусирующие свет, такие как параболические отражатели или линзы могут применяться вместо световодных кабелей, чтобы направлять свет от любого множества связывающих доменов к детектору. Свет, испускаемый, по крайней мере, из двух дискретных связывающих доменов, может быть измерен одновременно или последовательно.

Ошибка из-за теплового дрейфа, старения устройства, или собственные электрические шумы в световых детекторах могут управляться с помощью средства прерывателя между световым измерительным прибором и измеряемым связывающим доменом. Прерыватель может быть любым из обычных механических прерывателей, хорошо известных специалистам, таких как крутящийся диск с щелями или вырезами, которые позволяют проходить свету. Альтернативно, свет может прерываться затвором ЬСЭ [жидкокристаллическим затвором, ЖК-затвором], массивом из ЖК-затворов, твердотельных оптического модулятора или оптических модуляторов или подобных. Альтернативно, может использоваться плоский массив ЖК-затворов или твердотельных световых оптических модуляторов типа известных в технике оптических вычислений. Эти устройства предпочтительно располагаются между плоскостью кассеты и световода (или световодов) или светофокусирующих приборов, которые направляют свет из связывающих доменов в детектор света. В одном из вариантов изобретения, затвор располагается выше каждого из связывающих доменов. При использовании ЖК-затвора или оптического модулятора затворы могут модулироваться на различных частотах, чтобы одновременно обеспечить различные скорости прерывания для различных связывающих доменов, испускающих свет. При использовании этого метода множество различных световых сигналов могут накладываться и одновременно измеряться одним детектором. Электронный полосовой фильтр, электрически соединенный со световым детектором, может потом использоваться для разделения одного электрического сигнала на несколько электрических составляющих, каждая из которых соответствует одной из множества отдельных световых составляющих. Прерывая свет, как описано выше, или используя другой механизм, хорошо известный в технике, создается импульс света переменной составляющей (АС), что позволяет с помощью электроники отфильтровывать шумовую составляющую постоянного тока (ОС).

Также, ЕСЬ-сигнал может быть калиброван путем сравнения с результатами, предварительно определенными со стандартными реактивами, чтобы корректировать модуляцию сигнала из-за истощения реактива.

5.6. Анализ ЕСЬ-сигналов.

Сигналы, исходящие от заданного связывающего домена, могут иметь определенный диапазон значений, и эти значения коррелируют с количественным измерением, что обеспечивает аналоговый сигнал. В другом методе цифровой сигнал получают от каждого домена, что свидетельствует о присутствии или отсутствии аналогов.

Статистический анализ используется для обоих методов, а особенно для передачи множества цифровых сигналов так, чтобы обеспечить количественный результат. Некоторые аналиты, однако, требуют присутствия/отсутствия цифрового сигнала, указывающего на пороговую концентрацию. Аналоговые и/или цифровые представления данных могут использоваться отдельно или в комбинации. Можно использовать другие статистические способы для работы с РМАМ8. Например, возможно создать градиенты концентрации РМАМ8 на поверхности (Сйаибйигу и соавт., 1992, 8с1епсе (Наука), 256, стр. 1539-1541). Этот метод используется для того, чтобы определить концентрации посредством статистического анализа связывания в зависимости от градиента концентрации. Могут быть получены многочисленные линейные матрицы РМАМ8 с градиентами концентрации и с разнообразием различных специфических связывающих реагентов. Градиенты концентрации могут образовываться благодаря тому, что дискретные связывающие домены представляют различные концентрации связующих реактивов.

Присутствие систем контроля анализа на связующей поверхности кассеты также важно для гарантии единообразия каждого анализа, в целях контроля изменения сигнала (например, изменения в результате деградаций, флуктуаций, старения кассет и других деталей, тепловых изменений, шумов в электронной схеме и шумов в фотодетекторе, и т.д.). Например, для одного и того же аналита могут использоваться многочисленные избыточные связывающие домены (содержащие идентичные связывающие реагенты или различные связывающие реагенты, которые характерны для одного и того же аналита). В другом примере, используются аналиты известной концентрации или используются контрольные домены поверхности РМАМ8, которые ковалентно связаны с известным количеством ЕСЬ-метки или с известным количеством ЕСЬ-метки в растворе.

Анализ, проводимый в соответствии с настоящим изобретением, позволяет быстро и эффективно собрать большое количество данных, которые могут быть сохранены, например, в виде базы данных, состоящей из совокупности клинической или исследовательской информации. Собранные данные могут также использоваться для быстрой судебной или персональной идентификации. Например, множество нуклеотидных зондов, после того, как они подверга лись воздействию образца ДНК человека, могут быть использованы в качестве ДНК-фингериринта, который можно легко использовать для идентификации клинических и исследовательских образцов.

5.7. Приготовление многоэлектродных матриц.

Электроды, вообще говоря, могут составлять по диаметру или по ширине от 0,001 до 10 мм. Предпочтительный диапазон размеров электродных пар составляет от 0,01 до 1 мм (ширина, диаметр или самое широкое измерение зависят от геометрии электродных пар).

Предпочтительно, электроды изготавливают из подходящих проводящих материалов, таких как прозрачные металлические пленки или полупроводники (например, золото или окись индия-олова, соответственно), хорошо известные в технике, например, для изготовления ЖКИ - жидких кристаллических индикаторов [дисплеев] и т.п. В кассете в собранном виде, между первой и второй подложками, остается место, достаточное для того, чтобы поместить туда анализируемый образец, например, тонкую пленку или смоченную поверхность.

Электроды могут быть изготовлены из материалов, которые содержат углерод, углеродное волокно, углеродные нанометровые трубочки и/или их комбинаций.

Электроды могут быть изготовлены из углеродных фибрилл. Одна или более отдельных фибрилл и/или одна или более совокупностей фибрилл, могут быть сформированы в больший агрегат совокупность (патент США № 5,124,075).

Этот больший агрегат представляет собой прослойку или сеть (в дальнейшем упоминается как тонковолокнистая прослойка), в которой фибриллы могут быть спутаны или переплетены. Тонковолокнистые прослойки обычно имеют поверхностную площадь между 50 и 400 м²/г.

Например, тонковолокнистая прослойка может использоваться как рабочий электрод, противоположный электрод или контрольный электрод в аналитической и/или препаративной электрохимии. В одном из примеров, тонковолокнистая прослойка используется как электрод для электрохемилюминесценции (ЕСЬ).

Связывающие домены поверхности РМАМ8 могут поддерживаться тонковолокнистой прослойкой. Поверхность РМАМ8 настоящего изобретения имеет множество дискретных связывающих доменов, из которых два или более могут быть идентичны друг другу или могут отличаться. Тонковолокнистая прослойка поддерживает один или более связующих доменов.

Для получения множества связывающих доменов на тонковолокнистой прослойке могут использоваться одна или более микрофлюидальных подающих трубочек. Различные или идентичные связывающие реагенты могут нахо диться в множестве микрофлюидальных подающих трубочек, и/или многочисленные отличающиеся связывающие агенты могут находиться в микрофлюидальной подающей трубочке.

Фиг. 22А и 22Б изображают множество микрофлюидальных подающих трубочек 2201, предпочтительно в матрице, которые используются для того, чтобы подавать, предпочтительно одновременно, на домены тонковолокнистой прослойки 2200 капли, содержащие желаемые связывающие реактивы, чтобы образовать дискретные связывающие домены 2202. Связывающие реагенты образуют связь с компонентами, находящимися на тонковолокнистой прослойке. Связующие реактивы могут нехарактерно адсорбироваться на прослойке или высыхать на поверхности.

Желаемые связывающие реагенты подаются на тонковолокнистую прослойку во время вакуумной фильтрации, применяемой к прослойке. В этом случае, вакуумная фильтрация втягивает несколько-, ни одного-, или все связывающие реагенты в- или через прослойку, и при этом уменьшается величина бокового распространения связывающих реагентов на поверхности прослойки во время процесса конфигурирования.

Тонковолокнистые прослойки приготавливаются посредством надавливания суспензий углеродных фибрилл на подложке, через которую может проходить жидкость суспензии (например, фильтр). Примерами фильтров, которые могут использоваться для образования тонковолокнистых прослоек, являются: фильтровальная бумага, фильтры, образованные из полимерных (например, нейлон) мембран, металлические микросетки, керамические фильтры, стеклянные фильтры, эластомерные фильтры, стекловолоконные фильтры и/или комбинации двух или более из таких материалов фильтра. Специалисту должно быть понятно, что эти материалы просто примеры многих возможных материалов, подходящих для фильтрации суспензий твердых веществ.

Фиг. 23А и 23Б иллюстрируют вариант изобретения, в котором тонковолокнистые прослойки могут быть изготовлены посредством фильтрации под разряжением. Дисперсные системы и/или суспензии углеродных фибрилл 2301 фильтруют, используя фильтр 2300, оборудованный, но необязательно мембранным фильтром 2303 и/или фильтровальной подложкой 2302. Суспензию фильтруют, используя всасывание, прикладываемое источником вакуума 2305 к фильтру, например, колбой фильтра 2306. Тонковолокнистая прослойка 2304 собирается либо и на мембране фильтра 2303 и на подложке фильтра 2302, либо на чем-то одном из них. Тонковолокнистая прослойка 2304 с мембранным фильтром 2303, или без него, может быть снята с фильтра.

В другом варианте изобретения, суспензии фибрилл пропускаются через фильтр при помощи давления. В одном из примеров, давление подается на сжатую суспензию фибрилл, посредством уплотнения поршнем сжатого слоя воздуха и/или жидкости над суспензией. В конкретном примере, суспензия фибрилл набирается в шприц, поршень представляет собой поршень [плунжер] шприца, а фильтр представляет собой фильтр одноразового шприца (специалистам известно много таких фильтров).

Суспензия фибрилл пропускается через фильтр посредством капиллярного действия или фильтруется посредством дренажа суспензии вили через фильтр.

В другом варианте изобретения, отдельные фибриллы или агрегаты фибрилл ковалентной связью перекрестно связываются с прослойкой. Фибриллы дериватизируют с использованием фоточувствительных компонентов, которые полимеризуются под действием света.

Фильтр может быть использован для захвата фибрилл в поры, в результате чего формируется составная прослойка, в которой фильтр действует как подложка. Фиг. 24 иллюстрирует, как может быть приготовлена тонковолокнистая прослойка 2400, а именно, путем пропускания жидкого раствора фибрилл 2401, подаваемого источником 2402, между двумя большими роликами 2403. В этом процессе, который может быть аналогичен процессам, используемым в изготовлении бумаги или полимерных листов, ролики выжимают жидкость из суспензии, в результате чего образуется большая, сплошная прослойка из фибрилл, из которой могут быть вырезаны меньшие прослойки.

Тонковолокнистые прослойки могут быть свободными (например, неподдерживаемыми) или поддерживаемыми.

Скорость фильтрации можно варьировать для достижения желаемых свойств прослойки. Такими свойствами, которые могут варьироваться, являются однородность или неоднородность структуры, степень спутанности фибрилл или агрегатов фибрилл, толщина, пористость прослойки и/или комбинацию этих свойств.

Суспензия углеродных фибрилл зажимается, а жидкость, в которой фибриллы суспендированы, удаляется. В одном из примеров жидкости, в которой суспендированы фибриллы, выпаривают. В другом примере жидкость удаляют путем нагревания. Еще в одном примере суспензию подвергают центрифугированию, а полученную жидкость (например, супернатант) удаляют. В другом примере жидкость удаляют путем откачки.

Суспензия может быть помещена в один или несколько фильтров, описанных ранее, и суспензию осушают путем выпаривания. Суспензия может быть осушена путем нагревания или обжигом в печи, либо жидкость может быть удалена путем вымораживания или экстрагиро вания жидкости. Еще в одном примере жидкость удаляется откачкой насосом. Для удаления жидкости из суспензии могут быть использованы многие другие методы, которые хорошо известны специалистам.

Суспензии фибрилл, подходящие для формирования тонковолокнистой прослойки путем фильтрации, могут быть получены путем диспергирования одной или более углеродных фибрилл в подходящей жидкости, полутвердом веществе или геле. Примерами подходящих жидкостей являются, но не ограничиваются ими, вода, этанол, метанол, гексан, метиленхлорид, буферные растворы, поверхностноактивные вещества [ПАВ], органические растворители, растворы, содержащие биологические среды (например, такие как: белки, антитела или их фрагменты, клетки, субклеточные частицы, вирусы, нуклеиновые кислоты, антигены, липопротеины, липосахариды, липиды, гликопротеины, углеводы, пептиды, гормоны или фармакологические агенты, растворы небольших молекул, полимерные предшественники, растворы кислот или щелочей, масел и/или их комбинаций).

Суспензия фибрилл может быть приготовлена путем диспергирования углеродных фибрилл в водном растворе путем обработки ультразвуком. В другом варианте изобретения, можно добавлять поверхностно-активное вещество и/ или моющее средство.

Тонковолокнистая прослойка, вообще говоря, может иметь толщину в диапазоне между 0,01 мкм и 10,000 мкм.

В предпочтительных вариантах тонковолокнистая прослойка имеет толщину между 1 мкм и 100 мкм. В особенно предпочтительных вариантах тонковолокнистые прослойки находятся в диапазоне от 10... до 200... по ширине или диаметру.

Тонковолокнистую прослойку можно неоднократно промывать и повторно фильтровать, чтобы удалить остаточные материалы, остающиеся от суспензии.

Тонковолокнистые прослойки путем фильтрации или путем выпаривания нагревают (например, в печи) для удаления из суспензии остаточной жидкости, не удаленной при фильтрации.

Последовательные стадии фильтрации могут использоваться, для получения прослойки из фибрилл, составленные из одного или более раздельных слоев, которые находятся либо в контакте или непосредственной близости к одному или более других слоев. Слои могут различаться по своим свойствам, включая, но не ограничиваясь ими, пористость, плотность, толщину, распределению размеров отдельных фибрилл и/или микроскопических агрегатов фибрилл, по типу, количеству и/или размерам тонковолокнистых агрегатов, по химической дериватизации фибрилл (см. ниже), и/или по наличию других веществ, связанных с фибриллами.

Фиг. 25 изображает многослойную тонковолокнистую прослойку 2500, приготовленную в последовательных стадиях фильтрации. Толстый слой 2501 толщиной от 0,5 до 100 мкм из плоских фибрилл образует первый слой; толстый слой 2502 толщиной от 0,5 до 10 мкм, включающий составляющие, такие как поли(этиленгликоли), которые устойчивы к адсорбции белков и других молекул, образует второй слой; толстый слой 2503 толщиной от 0,5 до 5 мкм, который включает один или более связывающих доменов (см. выше), содержит третий слой. Связывающие домены содержат одно или более антител 2504, которые могут связывать аналит 2505. Этот комплекс антитело/аналит может связывать меченное антитело 2506. Метка может быть ЕСЬ-меткой. В других вариантах меткой может быть одна или несколько из множества меток, описанных в другом месте в настоящем описании. Такая многослойная прослойка может быть автономной [свободной] или поддерживаться на одной из множества возможных подложек, описанных выше.

Могут быть образованы многослойные прослойки, в которых имеются комбинации слоев, в которых некоторые или все слои могут быть различны.

Фильтр, используемый для формирования тонковолокнистой прослойки, фибриллы и/или тонковолокнистая прослойка могут быть покрыты. В конкретных вариантах эти покрытия могут быть металлическими. Эти покрытия могут быть нанесены так, чтобы некоторые части были покрыты, а другие части - нет. В одном из примеров, покрытие наносится электроосаждением. В другом примере покрытие наносится электролизным осаждением.

Фильтр покрывают металлом, и фибриллу дериватизируют с химической функциональной группой, которая образует связь с упомянутым металлом. Фильтр представляет собой металлический экран или металлический лист.

Тонковолокнистая прослойка может быть плоской или искривленной, регулярной или нерегулярной, круглой, овальной, прямоугольной или одной из многих форм, жесткой или гибкой, прозрачной, полупрозрачной, частично или полностью непрозрачной и может иметь различные свойства или области с различными отдельными или сложными свойствами.

Прослойка может быть диском или пластиной, вырезанной из листа.

Множество тонковолокнистых прослоек может быть изготовлено, предпочтительно одновременно, и предпочтительно в матрице. В одном из примеров, матрица микрофлюидальных подающих трубочек образует множество тонковолокнистых прослоек на подложке, как описано выше. В другом примере, множество фильтров, или конфигурированный фильтр (на пример, с областями различной пористости) используют для получения матрицы тонковолокнистых прослоек.

Маска с множеством отверстий (например, экран) используется, чтобы покрыть некоторые части фильтра или подложки, и множество дискретных тонковолокнистых прослоек делаются одновременно или путем фильтрации и/или путем выпаривания.

Тонковолокнистые прослойки могут иметь плотность от 0,1 до 3,0 г/см². Прослойка может иметь переменную плотность. Например, чтобы увеличить или уменьшить плотность, к прослойке в разное время могут прикладываться механическая сила или давление.

Тонковолокнистые прослойки могут иметь поры. Эти поры могут простираться частично и/или полностью через прослойку или могут быть частью сети пор. Вообще говоря, эти поры могут иметь размеры в диапазоне от 50 А до 1000 мкм. В предпочтительном варианте, тонковолокнистая прослойка имеет поры с размерами в диапазоне от 200 до 500 А. Пористость прослойки может зависеть от плотности прослойки, наряду с другими факторами.

Пористость прослойки может быть постоянна по всей прослойке или может увеличиваться или уменьшаться как функция положения в прослойке. Тонковолокнистая прослойка может иметь широкое разнообразие пор различного размера, распределенных хаотическим и/или случайным образом.

Тонковолокнистая прослойка может содержать отличающиеся области различной пористости. Например, тонковолокнистая прослойка может иметь один или более слоев, каждый из которых имеет различную пористость. Тонковолокнистые прослойки могут иметь столбцы различной пористости, которые проходят через прослойку.

Пористость прослойки может варьироваться путем включения различных количеств агрегатов углеродных фибрилл, где агрегаты имеют различный размер, форму, состав, или комбинации. В конкретном примере, прослойка приготовлена от отдельных фибрилл, СС фибрилл (описано выше) и ΒΝ фибрилл (описано выше), или различных комбинаций. Например, тонковолокнистая прослойка может иметь некоторые поры, которые являются достаточно большими, чтобы пропускать предметы такого размера, как биологические клетки; некоторые поры, которые могут пропускать биологические среды такого размера, как белки или антитела; некоторые поры, которые могут пропускать только небольшие (с молекулярной массой < 1000) органические молекулы и/или их комбинации.

Пористость прослойки может быть такой, что одна или более молекул, жидкостей, твердых тел, эмульсий, суспензий, газов, гелей и/или дисперсных систем могут диффундировать в-, внутрь- и/или через прослойку. Пористость тон коволокнистой прослойки такова, что биологические среды могут диффундировать (активно или пассивно) или вдавливаться определенным образом в прослойку, внутри прослойки и/или через прослойку. Примерами биологических сред являются, но не ограничиваются ими: цельная кровь, фракционированная кровь, плазма, сыворотка, моча, растворы белков, антитела или их фрагменты, клетки, субклеточные частицы, вирусы, нуклеиновые кислоты, антигены, липопротеины, липосахариды, липиды, гликопротеины, углеводы, пептиды, гормоны или фармакологические агенты. Тонковолокнистая прослойка может иметь один или более слоев различной пористости так, что материал может проходить через один или более слоев, но не через другие слои.

Тонковолокнистая прослойка поддерживается материалом или на другом материале. Например, таким материалом подложки может быть металл, пластики, полимер, эластомер, гель, бумага, керамика, стекло, жидкость, воск, масло, парафин, органическое твердое тело, углерод или смесь двух или более каждого из материалов. Материал может быть твердым или жидким. Если он твердый, то он может содержать одно или множество отверстий или пор. В конкретных примерах, подложка может быть металлическим ситом, нейлоновой фильтровальной мембраной или фильтровальной бумагой. Подложка может быть проводником, полупроводником и/или диэлектриком.

В варианте изобретения, раскрытом в патентах США № 5,304,326 и 5,098,771, фибриллы могут быть диспергированы в другом материале. Например, фибриллы могут быть диспергированы в масле, воске, парафине, пластиках (например, (АВЗ), полистирол, полиэтилен, акрилонитрил, и т.д.), в керамике, тефлоне, полимерах, эластомерах, гелях и/или в их комбинациях. Проводится диспергирование фибрилл в других материалах. Дисперсии фибрилл в других материалах могут формоваться, прессоваться, отливаться, скручиваться, переплетаться и/или скручиваться для получения желаемой формы и/или вида. Тонковолокнистая прослойка может включать другой материал, например, тонкое волокно, чешуйки или металлические шарики для увеличения проводимости прослойки. В другом примере тонковолокнистая прослойка может включать другие углеродные, стеклянные и/или металлические волокна различных размеров, формы и плотности для создания пористости, отличной от той, которая может быть достигнута с одной фибриллой. В другом аспекте прослойка может включать магнитные шарики (например, шарики типа ΌΥΝΑΣ). В последнем примере, шарики могут служить либо для изменения свойства прослойки, либо они могут быть самостоятельно использованы в качестве подложек для иммобилизации связывающих доменов.

Другие углеродные фибриллы (например, углеродные нанометровые структуры, углеродные структуры в виде нанометровых трубочек, фуллерены в виде сферических кластеров из 60 атомов углерода, фуллерены в виде трубчатых кластеров атомов углерода, фуллерены или их комбинации) могут использоваться вместо углеродных фибрилл.

Углеродные фибриллы могут быть получены с использованием химических функциональных групп, ковалентно связанных с их поверхностью. Как описано в международной публикации № XVО 90/14221, такими химическими функциональными группами являются, но не ограничиваются ими, следующие группы: СООН, ОН, ΝΗ₂Ν - гидроксисукцинимид (ΝΗ8) - сложные эфиры, поли-(этиленгликоли), тиолы, алкильные группы ((СН₂)_п) и/или их комбинации. Эти и другие химические функциональные группы могут использоваться для связывания других материалов с поверхностью фибрилл.

Некоторые химические функциональные группы (например, СООН, ΝΗ₂, 8Н, ΝΗ8 сложные эфиры) могут использоваться для присоединения других небольших молекул к фибриллам. Имеется множество возможных комбинаций таких химических функциональных групп и небольших молекул.

Во многих вариантах осуществления изобретения, ΝΗδ-сложноэфирные группы используются для присоединения других молекул или материалов, несущих нуклеофильную химическую функциональную группу (например, амин). В предпочтительном варианте, нуклеофильная химическая функциональная группа присутствует на и/или в биомолекуле, или натуральной и/или химически дериватизированной. Примерами подходящих биомолекул являются, но не ограничиваются ими: аминокислоты, белки и их функциональные фрагменты, антитела, связывающие фрагменты антител, ферменты, нуклеиновые кислоты и их комбинации. Этот метод является одним из многих возможных методов и, в общих чертах применим к материалам, приведенным в вышеуказанных примерах и многим другим аналогичным материалам и/или биомолекулам. В предпочтительном варианте реагенты, которые могут использоваться для ЕСЬ, могут быть присоединены к волокнам посредством ΝΗ8 - сложноэфирных групп.

Антитело, которое может использоваться в ЕСЬ-анализе, может быть присоединено к одной или нескольким фибриллам посредством ковалентных связей (например, путем реакции с ΝΗ8 - сложноэфирной группой), реакцией с соответствующим линкером (см. выше), путем неспецифического связывания, и/или их комбинацией. Нуклеиновые кислоты и/или клетки могут присоединяться к фибриллам или тонковолокнистым прослойкам посредством ковалентных связей с ΝΗ8 - сложноэфирными группами, связанными с фибриллами.

Может оказаться предпочтительным регулировать степень неспецифического связывания материалов с фибриллами и/или прослойками из фибрилл. В качестве простого, но не ограничивающего примера, можно указать случаи, когда желательно уменьшать или предотвращать неспецифическую адсорбцию белков, антител, фрагментов антител, клеток, субклеточных частиц, вирусов, сыворотки и/или одного или более их компонентов, ЕСЬ-меток (например, производные от Ки¹¹ (бипиридин)₃ и Ки^ш (бипиридин)₃), оксалатов, триалкиламинов, антигенов, аналитов, и/или их комбинаций. В другом примере, может оказаться желательным увеличить связывание биомолекул.

Одна или более из химических групп, которые уменьшают и предотвращают неспецифическое связывание, могут находиться в, на-, или вблизи к одной или более фибрилле, одному или более тонковолокнистому агрегату и/или тонковолокнистой прослойке. Неспецифическое связывание может регулироваться путем ковалентного присоединения РЕО-звеньев к одной или более фибрилле и/или тонковолокнистой прослойке. Заряженные остатки (например, фосфаты, ионы аммония) могут ковалентно присоединяться к одной или более фибрилле или к тонковолокнистой прослойке.

Материалы, используемые в подложке, электродах и/или связывающих доменах могут быть обработаны с помощью поверхностноактивных веществ для уменьшения неспецифического связывания. Например, фибриллы или тонковолокнистые прослойки можно обрабатывать с помощью поверхностно-активных веществ и/или моющих средств, которые хорошо известны специалистам (например, серия Т\\ееп. ТгПоп. 8рап, Вгу [названия]). Фибриллы или тонковолокнистые прослойки промывают, пропитывают, инкубируют с, и/или обрабатывают ультразвуком в растворах поверхностно-активных веществ и/или моющих средств. Растворы РЕО и/или молекул, которые ведут себя так же, как РЕО (например, олиго- или полисахариды, другие гидрофильные олигомеры или полимеры) (Ро1уе!йу1епе д1усо1 сНетМгу: В|о1ес11шса1 апб Ыотеб1са1 аррйсайопк, Катк, ЕМ. Ебйог, 1992, Р1епит Ргекк) могут использоваться вместо и/или в сочетании с поверхностно-активными веществами и/или моющими средствами.

Нежелательная неспецифическая адсорбция некоторых структурных элементов типа вышеперечисленных, может быть блокирована конкурентной неспецифической адсорбцией. Такой конкурентносвязывающейся молекулой может быть бычий сывороточный альбумин (В8А) и иммуноглобулин О(1дО).

Неспецифическое связывание ЕСЬ-метки может быть уменьшено путем химической модификации этой метки. Например, метку ТАО можно модифицировать, чтобы увеличивалась ее гидрофильность (например, добавляя гидрофильное, полярное, водородное соединение, и/или заряженные функциональные группы к бипиридиновым лигандам в Ки (бипиридин)₃), и таким образом уменьшать неспецифическое связывание метки с другими поверхностями.

Может оказаться желательным иммобилизировать биомолекулы или другие среды на фибриллах или тонковолокнистых прослойках. Можно присоединять антитела, фрагменты антител, белки, ферменты, ферментные субстраты, ингибиторы, кофакторы, антигены, гаптены, липопротеины, липосахариды, клетки, субклеточные компоненты, клеточные рецепторы, вирусы, нуклеиновые кислоты, антигены, липиды, гликопротеиды, углеводы, пептиды, аминокислоты, гормоны, белок-связывающие лиганды, фармакологические агенты, и/или их комбинации.

Также может оказаться желательным присоединять к фибриллам небиологические структурные элементы, такие как, например, полимеры, эластомеры, гели, покрытия, ЕСЬ-метки, окислительно-восстановительные активные вещества (например, трипропиламин, оксалаты), неорганические материалы, хелатообразующие агенты, сшивающие агенты и т.д.

Одна или более или множество различных молекул может неспецифически связываться (например, адсорбироваться) с поверхностью фибриллы или тонковолокнистой прослойки.

Биологические молекулы или другие среды могут связываться с фибриллами или тонковолокнистыми прослойками путем неспецифической адсорбции. Степень неспецифической адсорбции для любой данной фибриллы, тонковолокнистой прослойки и/или биомолекулы определяется определенными свойствами каждой из перечисленных. Некоторые химические функциональные группы или биологические молекулы, присутствующие на фибриллах, могут уменьшать или увеличивать неспецифическое связывание. Присутствие гидрофобных и/или гидрофильных участков на поверхности белка может увеличивать или уменьшать неспецифическое связывание белка с фибриллами или тонковолокнистыми прослойками. Гидрофильные и/или гидрофобные участки используются для регулирования неспецифического связывания в контролируемых областях.

Фибриллы могут быть дериватизированы с помощью алкильных цепей (СН₂) и/или карбоновокислотных групп в целях увеличения неспецифического связывания биологических молекул, или сред, или других материалов.

Фиг. 26 схематически иллюстрирует вышеупомянутый вариант осуществления изобретения в случае одной фибриллы.

Фибриллу 2600 дериватизируют посредством алкильных цепей 2601. Биомолекулы 2602, 2603, и 2604 неспецифически связываются с алкильными цепями. Полимер/эластомер 2605 также может быть связан.

Для иммобилизации биомолекул, биологических сред и других материалов путем неспецифического связывания используются недериватизированные фибриллы, тонковолокнистые агрегаты и/или тонковолокнистые прослойки.

ЕСЬ-метка содержит заряженные остатки. ЕСЬ-метку получают так, чтобы она селективно связывалась с подложкой и/или электродом. Например, дериватизированная ЕСЬ-метка, которая имеет определенный суммарный отрицательный заряд; может иметь относительно низкое сродство с электродом при более восстановительном потенциале, и затем имеет более высокое сродство с электродом, поскольку потенциал электрода становится более окислительным. Сродство ЕСЬ-метки и/или связывающих реагентов с электродом делается так, чтобы его можно было модулировать (например, уменьшать сродство во время связывания и/или стадий промывания и увеличивать сродство ЕСЬметки и/или связывающих реагентов так, чтобы увеличивать эффективный потенциал, воспринимаемый посредством ЕСЬ-метки во время считывания результатов ЕСЬ).

Молекулы (как биологические, так и не биологические), изображенные на фиг. 28, могут присоединяться к фибриллам посредством ковалентной связи. Фибриллы 2800, несущие химические функциональные ΝΗδ-сложноэфирные группы могут образовывать ковалентные связи 2801 с биомолекулами или биологическими средами 2802, 2803. Эти биологические среды могут использовать аминогруппы для образования ковалентной связи посредством реакции с ΝΗ8 - сложноэфирной группой. Полимер 2808 является иммобилизованным. Универсальность ΝΗ8 -сложноэфирных групп в качестве связывающих агентов для молекул очевидна для каждого специалиста, и специалист сам может выбрать подходящие биомолекулы, и подходящие реакционные условия для осуществления иммобилизации.

Пара частиц и/или молекул Μ1 и 81, из которых одна или более прикрепляются к фибрилле, обладают взаимным сродством или способностью к связыванию. Такими парами Μ1/81 могут быть антитело/антиген, антитело/гаптен, фермент/субстрат, фермент/кофактор, фермент/ ингибитор, лектин/углевод, рецептор/гормон, рецептор/эффектор, нуклеиновая кислота/нуклеиновая кислота, белок/нуклеиновая кислота, вирус/лиганд, клеткаклеточный рецептор, и т. д. Существует много комбинаций связывающихся пар Μ1/81, и можно выбрать соответствующие комбинации, подходящие для достижения желаемого связывания. Любая или обе из Μ1 и 81 могут быть прикреплены к одной или нескольким фибриллам.

Фиг. 27 и 28 иллюстрируют некоторые из многих возможных конфигураций, которые возможны в данном варианте изобретения. На фиг. 27 фибрилла 2700, дериватизированная посредством алкильных цепей 2701, неспецифически связывается с молекулой 2702, которая обладает взаимным сродством или способностью к связыванию с другой молекулой 2703. Молекула 2703 также связывается с другой молекулой 2704. Блокирующая молекула 2705 может быть неспецифически адсорбирована на фибрилле. Блокирующий полимер 2706 и/или полимер 2707, который имеет лиганд (2708), обладающий сродством к молекуле 2709, являются неспецифически адсорбированными.

На фиг. 28 фибрилла 2800 ковалентно связана посредством 2801 с биомолекулами 2802 и 2803 и с линкерной молекулой 2804. Линкерная молекула 2804 имеет взаимное сродство или способность к связыванию с другой биомолекулой 2805. Биомолекула 2803 обладает взаимным сродством или способностью связываться с другой линкерной молекулой 2806, которая ковалентно связана с 2807. Полимер 2808 с лигандом 2812, который является специфичным для связывающегося партнера 2809, ковалентно связан с фибриллой. Блокирующие молекулы (например, В8А) 2811 и блокирующие полимеры 2810 являются ковалентно связанными.

Фибрилла может быть дериватизирована биотином и/или биотинилированным линкером, а авидин и/или стрептавидин может связываться с этим линкером. Авидин и/или стрептавидин могут связываться с фибриллой, может связываться биотинированное антитело и/или белок. Авидин и/или стрептавидин могут быть иммобилизованы на фибрилле либо путем неспецифического связывания, либо посредством ковалентной связи, другой или той же самой связывающейся пары, или их комбинации. Использование (стрепт-) авидина и биотина в качестве связывающейся пары является широко применяемым методом связывания биомолекул или биологических сред с другими материалами и хорошо известным специалистам (8р1пке и соавт., 1993, Ьапдтшг, 9, стр. 1821).

Связывающаяся пара может быть моноклональным антителом и антигеном, который связывается с этим антителом.

Могут образовываться многочисленные связывающиеся пары. (например, М1/81/М2). М1-моноклональное антитело, 81-антиген по отношению к М1, и М2 - антитело, которое связывается с 81. Этот комплекс может составлять антитело/антиген/ антитело - сэндвич - комплекс (такие антитела могут быть или могут не быть моноклональными). М2 может быть антителом, меченым ЕСЬ-активной меткой (см. выше), флуоресцентной меткой, радиоактивной меткой, ферментной меткой, и/или их комбинациями.

М1 может быть молекулой, которая может образовывать комплекс с металлом, ионом металла, или с металлоорганическим соединением (хелатообразующим агентом), 81 - представляет собой металл, ион металла, или металлоорганическое соединение (хелат), который образует комплекс с М1, а М2 - часть на биологической молекуле, которая связывается с М1/81комплексом (Сегкйоп и КЫко, 1995, 1оигпа1 о£ 1ттипо1одюа1 МеШобк, 7371).

Изготовление металлических электродных конфигураций и проводящих элементов для распределения электрического тока к таким электродам на поверхности, осуществляется способами, хорошо известными в технике (см., например, БегепЩ и соавт., патент США № 5,189,549). Приготовление металлических пленок на прозрачных поверхностях используется для производства ЖКИ - жидкокристаллических дисплеев и может быть адаптировано к изготовлению электродов в соответствии с настоящим изобретением. Напеко, 1987, Ыс.|шб Сгуь1а1 ТУ О1ьр1ауь, Рг1пс1р1ек апб Аррйсайопк о£ Ыс.|шб СгуЫа1 О18р1ауь [ЖК - телевизионные дисплеи, принципы действия и применение ЖКдисплеев, КТК 8с1епППс РиЫШегк, Токуо, О.Ке1бе1 РиЫЫппд. Прозрачные электродные поверхности могут быть также изготовлены, например, в соответствии со способом автора И1МШа и соавт., 1994, ТАт.Сйет.8ос., 116 (5), стр. 2225-2226. Пленки из титана толщиной 0,5 нм и из золота толщиной 5 нм осаждаются на прозрачных подложках (стекло или пластмасса). Тонкий золотой слой, приготовленный способом И1МШа (см. ранее), может использоваться для изготовления прозрачной электрической структуры способом Китаг (см. выше). Желательны модификации этой процедуры с целью увеличения толщины слоев проводника для улучшения способности проводить ток при предпочтительном сохранении прозрачности, и эти модификации совершенно очевидны обычному специалисту. Такие методы могут использоваться для изготовления поверхностей электродов, которые выстраиваются с- или вблизи с дискретными связующими доменами РМАМ8.

Кроме того, пленки и/или монослои могут быть образованы из компонентов, которые облегчают перенос электрического потенциала с поверхности электрода к ЕСЬ-метке в отличие от использования изолирующих компонентов (например, алкиловых цепей), как описано 211апд и Вагб. Например, для переноса электронов может использоваться перекрытие пиорбиталей в экстенсивно сопряженных системах. Такой перенос пи-орбитальных электронов обеспечивается полипиролом или другими сопряженными кольцами, или структурами, связанными двойной связью.

Можно использовать олигонуклеотиды, для модуляции переноса электронов. Например, чтобы увеличить скорости переноса электронов можно использовать перекрывание пи-связей в двухцепочечной ДНК. Олигонуклеотиды, связанные с поверхностью электрода, можно ис пользовать в качестве связывающего агента в связывающем домене. После связывания комплементарной олигонуклеотидной последовательности образуется двойная нить с организованным перекрыванием пи-связей. В конкретном варианте осуществления изобретения, первый или первично иммобилизованный (например, ковалентно связанный с подложкой) олигонуклеотид помечается ЕСЬ-меткой. В другом варианте, второй комплементарный олигонуклеотид или олигонуклеотид с последовательностью, частично комплементарной первому олигонуклеотиду, помечаются ЕСЬ-меткой. Третий олигонуклеотид комплементарный, или частично комплементарный второму олигонуклеотиду, также помечается (например, сэндвичанализ). Можно также использовать разветвленные цепи олигонуклеотидов. Можно также использовать олигонуклеотиды и/или олигонуклеотидные аналоги (например, олигонуклеотиды с модифицированными основаниями, и/или с модифицированными остовами, содержащими, например, азот и/или серу). Могут быть осуществлены различные исследования. Переменная стабильность пи-перекрывания в олигонуклеотидах и/или в олигонуклеотидных комплексах может отслеживаться посредством модуляции электронного переноса. Сигнал (например, свет, генерированный ЕСЬ и/или измерение импеданса, генерированный от пи-связи, стабилизированной ЕСЬ-меченой двухспиральной олигонуклеотидной парой, может быть коррелирован относительно сигнала и/или ожидаемого сигнала от более неупорядочного, одноцепочечного олигонуклеотида. Можно кореллировать вариацию ЕСЬ-сигнала между полностью комплементарным, ЕСЬ-меченым, двухцепочечными олигонуклеотидом и частично комплементарным, ЕСЬ-меченым, двухцепочечным олигонуклеотидом. Кроме того, могут быть использованы олигонуклеотидные комплексы из множества олигонуклеотидов. Например, можно использовать тройные спирали.

Модуляция скоростей переноса электронов может быть измерена с использованием ЕСЬдетектирования, а также электронных средств. ЕСЬ-метки могут быть ковалентно связаны с олигонуклеотидными нитями и/или нековалентно связаны (например, включены прослойками). ДНК может связана с электродом без использования линкера (например, адсорбция 5'тиолированной ДНК, на золоте) или с использованием короткого (<10 атомов) линкера для гарантии низкого сопротивления переносу электронов с ДНК на электрод. Может использоваться связывающаяся цепь, которая может эффективно переносить электроны с электрода на нить ДНК (например, цепь полиацетилена).

Могут использоваться смешанный монослой и/или пленка, где имеется, по крайней мере, один элемент монослоя или пленки, поскольку, в этом случае может быть облегчен перенос электрического потенциала. Альтернативно, молекула или частица, которая облегчает перенос электрического потенциала, адсорбируется на монослое или пленке. Так, например, могут использоваться пи-конъюгированные монослои и/или проводящие микрочастицы, которые адсорбируются на-, и/или локализуются у поверхности электрода. В монослое и/или пленке создаются конфигурированные регулярные промежутки. При использовании регулируемых конфигураций промежутков в,по существу, упорядоченном перпендикулярно, монослое 8ΑΜ, состоящем из длинной цепи алкантиолов (то есть, изолирующих), к которому впоследствии присоединяется ЕСЬ-метки, может регулироваться эффективный потенциал, приложенный к ЕСЬ-меткам. Например, фиг. 11 изображает кассету 1200, сформированную из одной подложки 1202 с металлическим слоем 1204, конфигурация 8АМ 1206 и промежутков 1208 между элементами конфигурации 8ΑΜ.

ЕСЬ-меченые белки, могут быть нековалентно связанными с поверхностью монослоя. ЕСЬ-меченый белок может адсорбироваться на золотой поверхности, дериватизированной алкантиолом с концевой метильной группой. Золотая поверхность может действовать как рабочий электрод или как противоположный электрод. Множество связывающих доменов может присутствовать на одной подложке,как показано на фиг. 11-13. В предпочтительных вариантах, связывающие домены содержат меченные и/или немеченные белки и/или нуклеиновые кислоты и/или клетки и/или химические молекулы.

Альтернативно, длина компонентов монослоя (например, длина алкановой цепи в монослоях алкантиола), может варьироваться и тем самым может регулироваться эффективный потенциал на экспонируемой поверхности монослоя.

Вообще говоря, алкантиолы могут иметь углеродные цепи с длиной от одного атома углерода до 100 атомов углерода. В предпочтительном варианте длина углеродной цепи алкантиола составляет от 2 до 24 атомов углерода. Длина углеродной цепи алкантиола составляет от 2 до 18 атомов углерода. Длина углеродной цепи составляет от 7 до 11 атомов углерода. Такими алкантиолами могут быть разнообразные головные группы, подвергаемые воздействию анализируемых сред, включая метильные группы, гидроксильные группы, амины, карбоновые кислоты, олиго(этиленгликоли), фосфатные группы, фосфорильные группы, биотин, нитрилтрехуксусную кислоту, глутатион, эпоксиды динитрофенил и/или ΝΗ8 - сложные эфиры. Другими головными группами являются лиганды, обычно используемые для очистки и иммобилизации рекомбинантных гибридных белков (например, 8а55СпГс1й. 1990, Т1ВТЕСН, 8, стр. 88-93). Связывающие домены могут быть в различной степени дериватизированы для полу чения различных плотностей связывающих реагентов. Например, могут использоваться различные плотности активируемых химических соединений и/или может быть осуществлена дериватизация в различной степени. Для достижения нужной плотности связывания могут быть использованы смешанные химические соединения. Смешанные монослои могут быть использованы для регуляции плотности активируемых групп и/или связывающих реагентов. Плотность связывающих групп регулируется в целях оптимизации отношения ЕСЬ-сигнал/ шум. Полное количество сайтов связывания внутри связывающего домена(-ов) регулируется для оптимизации интенсивности светового сигнала ЕСЬ по отношению к другим световым сигналам ЕСЬ из другого связующего домена(ов), независимо от того, детектируются ли такие световые сигналы ЕСЬ последовательно или одновременно; и/или по отношению к детектированию света.

Импульс напряжения может прикладываться так, чтобы активизировать ЕСЬ-меткой, связанной с связывающим доменом (-ами) в пределах поверхности РМАМ8 один или более раз. Электронный потенциал, достаточный для того, чтобы активизировать генерацию света ЕСЬ, может прикладываться многократно к одной и той же поверхности, дериватизированной алкантиолом, со связанным ярлыком ЕСЬ, в результате чего генерируются многочисленные сигналы света ЕСЬ. Электронный потенциал прикладывается достаточным, чтобы обратимо генерировать ЕСЬ. Потенциал прикладывается так, чтобы генерировать ЕСЬ квазиобратимо. В квазиобратимой последовательности импульсов напряжения, связывающий домен, внутри которого ассоциируется ЕСЬ-метка (например, связывается), может быть химически и/или физически изменен. Последовательность импульсов прикладываемого напряжения может производить необратимую генерацию ЕСЬ-света.

Далее, может прикладываться электрический потенциал, достаточный для освобождения компонентов монослоя. Желательно освобождать такие компоненты монослоя, где объем над поверхностью электрода мал (например, другая подложка или пластина, опирающаяся на поверхность электрода). Таким образом, как только монослой разрывается, даже те ЕСЬ-метки, которые эффективно не возбуждены, могут возбуждаться поверхностью электрода, и генерировать электрохемилюминесцентный сигнал, при этом ЕСЬ-метки ограничиваются небольшим объемом, ограничивая диффузию с электрода. Могут использоваться различные композиции монослоя, для регулирования степенью разрыва монослоя для данного потенциала. Монослои с компонентами, имеющими высокую степень сродства, будут более резистентными к разрыву монослоя. Более длинная цепь алкантиолов более устойчива к разрыву, чем короткая цепь ал кантиолов. Варьируя длину цепи, можно достичь желаемой стабильности.

Для модуляции ЕСЬ-сигнала может использоваться модификация связывающих доменов в пределах поверхности РМАМ8. Серия импульсов напряжения прикладывается так, чтобы генерировать множество ЕСЬ-сигналов. Упомянутое множество ЕСЬ-сигналов может использоваться для того, чтобы получить дополнительные и/или улучшенные результаты. Статистический анализ скорости модуляции ЕСЬ-сигнала может быть коррелирован с общим качеством одного или более связывающих доменов. Кроме того, упомянутое множество ЕСЬсигналов может использоваться для того, чтобы увеличить отношение сигнал/шум, например, путем фильтрации некоторых ЕСЬ-сигналов последовательности. Кроме того, множество импульсов электронного потенциала с определенной формой сигнала могут использоваться для уменьшения нежелательной модуляции сигнала из-за неспецифического связывания. Электронный потенциал может прикладываться, для предотвращения неспецифического связывания некоторых заряженных объектов. Кроме того, электронный потенциал может прикладываться так, чтобы способствовать локализации возле связывающего домена(-ов) некоторых исследуемых аналитов или химических объектов. Импульс прикладываемого напряжения, подает большее перенапряжение (например, более высокий потенциал чем требуется, чтобы генерировать ЕСЬ). Перенапряжение может быть использовано для модуляции ЕСЬ -сигналов в серии импульсов напряжения или в единичном импульсе напряжения. Кроме того, перенапряжение можно использовать, чтобы модулировать кинетику реакции ЕСЬ и/или модулировать связывающий потенциал химически и/или физически. Далее, один или несколько импульсов напряжения и/или других электронных зондов, известных специалистам можно использовать для оценки и/или корреляции и/или экстраполяции данных качества и/или электронных свойств электрода(-ов).

Предпочтительно, эффективность ЕСЬ реакции может быть увеличена путем расширения площади поверхности рабочего электрода, путем приведения в контакт с электродами дополнительных проводящих средств. Могут использоваться проекции или удлинения от электрода (например, провода или нитевидные кристаллы) из проводящих материалов или проводящих частиц, чтобы увеличить площадь поверхности электрода так, чтобы электрическое поле стало ближе к ЕСЬ-метке. Альтернативно выемки или углубления в электродных структурах могут служить для той же цели.

В частности, проводящие частицы могут заполнять промежутки на поверхности электрода и/или покрывать подложку или монослой так, чтобы электрическое поле вокруг ЕСЬ-метки увеличивалось по абсолютной величине, как показано на фиг. 12. Эти проводящие частицы расширяют площадь поверхности электрода и таким образом увеличивают эффективность ЕСЬ реакции. Фиг. 12 изображает кассету 1300, имеющую подложку 1302, несущую конфигурированный монослой 8АМ 1306 на металлическом слое 1304, и показывает проводящие микрочастицы, заполняющие промежутки (например, 1208 на фиг. 11), и простирающиеся над металлической поверхностью между элементами конфигурации 8АМ. Для магнитных проводящих частиц, магнит или магнитное поле может использоваться для того, чтобы притягивать частицы к поверхности. Проводящие частицы могут также использоваться как описано, для расширения поля электрического потенциала между поверхностями электрода и связывающим доменом поверхности РМАМ8 с двумя сближенными подложками. Как изображено на фиг. 8, кассета 900 состоит из первой подложки 902, которая имеет многокомпонентную матрицу электродов, и второй подложки 904, которая имеет поверхность РМАМ8. Проводящие микрочастицы 906 расположены между противостоящими поверхностями, чтобы расширить электрический потенциал до ЕСЬ-метки на связывающих доменах (не показаны).

Альтернативно проводящие полимеры наращивают экспонируемые промежутки на поверхности электрода, чтобы облегчить расширение электрического потенциала вокруг ЕСЬметки образца, как показано на фиг. 13. Фиг. 13 изображает кассету 1400, имеющую подложку 1402, несущую металлический слой 1404 на конфигурированной поверхности 8АМ 1406. Проводящие полимеры 1408 наращивают над поверхностью 8АМ, чтобы расширить электрическое поле, обеспечиваемое многокомпонентной матрицей электродов (не показан), к связывающим доменам (не показаны) на поверхности 8АМ. Проводящие полимеры могут также использоваться как описано, для расширения электрического поля между поверхностями электрода и связующими доменами РМАМ8 двух приближенных подложек, как иллюстрируется фиг. 7. На фиг. 7 кассета 800 состоит из сближенных подложек 802 и 804. Проводящие полимеры 806 наращивают между противоположными поверхностями для расширения электрического поля к ЕСЬ-метке на связывающем домене (не показано).

Фиг. 9 иллюстрирует кассету 1000, образованную с помощью первой подложки 1002, имеющую некую многоэлектродную матрицу, вторую подложку 1004, имеющую РМАМ8 связующую поверхность, в которой проводящие проекции (1006) (например, тонкий провод или другие выступы) рабочего электрода продлевают электрическое поле вокруг ЕСЬ-метки в связывающих доменах РМАМ8.

Электродные пары могут быть созданы в различных конфигурациях. Простейшие конфигурации, изображенные на фигурах, сопровождающих настоящее описание, сделаны из металлических и/или металлоокисных пленок и/или полупроводниковых пленок, нанесенных на непроводящую плоскую поверхность. Электроды этих электродных пар предпочтительно задают между собой область относительно постоянной ширины, обеспечивая, тем самым, относительно постоянное электрическое поле.

Обеспечиваются и другие конфигурации электродов. Несколько из этих конфигураций изображены в общем виде на фиг. 19(а)-(д). Фиг. 19(а) изображает встречно-штыревую электродную пару, подобную гребенке. В этой структуре каждый электрод имеет множество пальцев, простирающихся от проводника, создавая форму подобную гребенке. Пара электрод/противоположный электрод может быть помещена вплотную к связывающему домену, или связывающий домен может быть помещен между электродом и противоположным электродом. Фиг. 19(б) изображает пару концентрических электродов, один - круглый, и одинполукруглый. Фиг. 19(в) изображает два полукруглых электрода с их прямыми гранями, обращенными друг к другу. Фиг. 19(г) изображает пару прямоугольных электродов. Фиг. 19(д) изображает пару встречно-штыревых электродов, имеющих комплементарно противостоящие изогнутые поверхности, образующие между собой извилистый промежуток.

Пары электрод/противоположный электрод могут также быть сформированы в специфические формы, комплементарные к формам на связывающей поверхности РМАМ8 в целях выравнивания.

Для примера формы изображены на фиг. 6Б. Изображена подложка 712, несущая электродные пары 714-720. Электродные пары могут быть, например, круглыми 714, встречноштыревыми 716, встречно-штыревыми, в форме 718 или много встречно-штыревых электродов 720.

В вариантах изобретения, показанных на фиг. 14-19, обсуждавшихся ранее, электродные пары расположены на одной подложке. Альтернативно, электродные пары расположены на первой и второй противостоящих подложках, как изображено на фиг. 2.

5.8. Кассеты.

Кассеты содержат одну или более подложек настоящего изобретения. Кассеты могут включать множество связывающих доменов и один или более рабочих электродов.

Фиг. 2 изображает кассету, где каждый из многочисленных связывающих доменов 30 на подложке 26 является смежным с одним из многочисленных электродов 32. Противоположные электроды 38 расположены на второй подложке 28. ЕСЬ-анализ проводится как описано ранее, путем помещения образца на связывающих доменах 30, а затем путем совместного перемещения подложек 26 и 28 так, чтобы каждый из противоположных электродов 38 оказывался смежным с каждым из связующих доменов 30, и ЕСЬ-реакция может стимулироваться, как описано выше, генератором сигналов определенной формы 39, посредством подводящего провода 34, и ЕСЬ-сигнал детектируется и регистрируется с помощью светового детектора 40, провода 41 и цифровым компьютером 42.

Фиг. 3 иллюстрирует кассету, где каждый из многочисленных связывающих доменов 48 на подложке 44 имеет каждую из многочисленных пар 50 электрод/противоположный электрод, смежных друг с другом на подложке 44. Подложка 46 может быть, но необязательно помещена смежно с подложкой 44 так, чтобы подложка 46 образовывала образец - содержащее средство, смежное с связывающими доменами 48 и многочисленными электродами 50. Таким образом, ЕСЬ-реакция может стимулироваться генератором определенных импульсов через электрические провода 52, и ЕСЬ-сигнал, детектированный световым детектором 56, регистрируется и анализируется цифровым компьютером 58.

Изготавливается кассета, которая содержит одну или более пар подложек, как изображается на фиг. 21, причем каждая пара подложек располагается так, чтобы поверхность первой подложки 1501, которая содержит связывающие домены, была обращена лицом к поверхности, содержащей связывающие домены на второй подложке 1502, в которой каждая поверхность содержит электроды 1504 и связывающие домены 1506; так, что каждый связывающий домен на первой подложке обращен ки центрирован с электродом на второй подложке, и каждый связующий домен на второй подложке был обращен к- и центрирован с электродом на первой подложке.

Фиг. 4 изображает кассету, в которой ЕСЬэлектроды могут быть, но необязательно, такими как это показано. Связывающие домены 64 на подложке 60 контактируют с образцом, в котором предполагается содержание аналита. Области 66 на подложке 62 содержат реакционную среду для детектирования или измерения исследуемого аналита или для проведения желаемой реакции. Подложка 60 и подложка 62 подводятся вплотную друг к другу так, чтобы связывающие домены 64 и домены 66 вошли в контакт, и, чтобы присутствие аналита или продукта определялось системой-репортером, например сигналом колориметрической хемилюминесценции или флуоресценции, который может быть обнаружен фотодетектором 68 и зарегистрирован и проанализирован цифровым компьютером 70.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения кассета или устройство на стоящего изобретения содержит средство для введения образца на множество дискретных связывающих доменов (см., например, элемент 1 на фиг. 1 патента США № 5,147,806; элемент 1 на фиг. 1 патента США № 5,068,088, каждый из которых полностью вводится в настоящее описание посредством ссылки. Средства для введения образца могут быть неподвижными или подвижными, и любое из них может быть известно специалистам, включая, но не ограничиваясь, одно или несколько из следующих средств: входные отверстия, отверстия, поры, каналы, трубки, микрофлюидальные подающие трубочки (например, капилляры), трубки, втулки и т. д. Текучие среды могут быть пропущены через систему разнообразными хорошо известными способами, например, такими, как насосы, пипетки, шприцы, течение под действием силы тяжести, капиллярное действие, дренаж, электрофорез, давление, вакуум и т.д. Средство для перемещения текучей среды может быть расположено на кассете или в отдельном блоке. Образец может быть помещен на все связывающие домены вместе. Альтернативно, образец может быть помещен на конкретные связывающие домены капиллярным средством переноса текучей среды. Альтернативно, образцы могут помещаться на подложку автоматической системой пипеток для подведения образцов текучих сред непосредственно к поверхности РМАМ8 на подложке, или в резервуар в кассете или в держателе кассеты для последующего подведения непосредственно к связующей поверхности.

Подложки могут быть изготовлены из материалов, включая но не ограничиваясь ими, стекло, пластмассы, керамика, полимерные материалы, эластомерные материалы, металлы, углерод или углеродсодержащие материалы, сплавы, составные фольги, кремниевые и/или слоистые материалы. Подложки могут иметь широкое разнообразие структурных, химических и/или оптических свойств. Они могут быть жесткими или гибкими, плоскими или искривленными, прозрачными, полупрозрачными, частично или полностью отражающими или непрозрачными, и могут иметь различные свойства, области с различными свойствами, и могут быть композитами из более чем одного материала.

Реагенты для проведения анализа могут храниться на кассете и/или в отдельном контейнере. Реагенты могут храниться в сухом и/или влажном состоянии. В одном варианте изобретения, сухие реактивы в кассете повторно гидратируются путем добавления испытуемого образца. В другом варианте воплощения, реактивы хранятся в растворе в пузыре [блистерная упаковка], который открывается путем разрыва из-за давления подвижного ролика или поршня. Кассеты могут содержать отделение для отходов, или губку для хранения жидких отходов после завершения анализа. В одном из вариантов изобретения, кассета включает устройство для приготовления биологического образца, подлежащего испытанию. Может быть включен фильтр для удаления клеток из крови. В другом примере, кассета может включать устройство типа прецизионного капилляра для измерения образца.

Множество связывающих доменов и множество пар электрод/ противоположный электрод на подложках обычно помещают в регистрируемой близости к друг другу механическими средствами, например, с использованием направляющих штырей, центрирующих оправок, стержней (между каждой подложкой), или направляющих кромок. Для размещения как подложек, так и электронных средств, можно использовать оптические направляющие средства, использующие оптические отметки, заданные на подложках. Имеются также и другие системы, использующие электрические или магнитные средства регистрации.

Подложки кассеты могут быть конфигурированы так, чтобы они предохраняли электродные пары от контакта с образцом до того, как потребуется запустить ЕСЬ-реакцию. Например, электроды могут сохраняться отдельно от поверхности связывающего домена, пока не потребуется контакт электрода с образцом; для этого можно использовать различные механические средства, такие, как сменное средство предохранения электрода,

Кассета или устройство изобретения содержит контрольные электроды, например, Ад/АдС1 или пропитанный каломелем электрод (8СЕ).

Подложки могут скрепляться зажимами, клеем, заклепками, оправками или любым другим подходящим механическим закреплением. Они могут также скрепляться поверхностным натяжением жидкого образца, или сжимающим средством, подвижно расположенным на противоположных сторонах двух подложек.

Кассета может также содержать более чем две подложки, например, с чередующимися слоями связывающих доменов и электродов, или многочисленные подложки, содержащие как связывающую поверхность, так и поверхность электрода на одной подложке. Это сформирует трехмерную матрицу ячеек для ЕСЬанализа. Все вышеупомянутые компоненты кассеты прозрачны, кроме, произвольно выбранных, некоторых участков между связывающими доменами. Например, многочисленные прозрачные связывающие поверхности, поверхности электрода, и подложки могут быть сложены в стопку.

Первая и вторая подложки могут быть плоскими и расположенными друг против друга, что позволяет определить объем образца между ними. С другой стороны, первый и второй слои подложки могут быть конфигурированы в других подходящих формах, включая шарообразную, кубообразную, цилиндрическую, при условии, что две подложки и любые другие их компоненты соответствуют по форме. Например, фиг. 10 изображает кассету 1100, образованную из двух смежных не плоских подложек 1102 и 1104. Каждая подложка имеет поверхность, согласованную комплементарно с другой. Либо подложка может иметь ΡΜΑΜδ-поверхность, либо многоэлектродную матрицу, либо то и другое. Одна или обе из подложек могут быть эластичными так, чтобы по форме они соответствовали друг другу. Подложки или кассеты могут также быть изготовлены по заранее вырезанному трафарету, или отмерены до подходящей длины с помощью устройства для мерной отрезки. Кроме того, кассета может включать средство приема образца, такое как объем, удерживающий образец, и распределительные канавки, каналы, углубления и т. п.

Фиг. 37 изображает кассету, в которой связывающие домены (3702) в- и/или на матрице (3703) находятся на поверхности (3701). Вторая поверхность (3700), удерживающая рабочий электрод (3704) и противоположный электрод (3705), размещается так, чтобы связывающие домены находились вплотную к рабочему электроду. При условиях, которые приводят к генерации света от ЕСЬ-метки, связанной со связывающими доменами, свет может детектироваться через любую одну или обе поверхности. Матрица световых детекторов (3706, например, ПЗС-матрица, ПЗС-матрица с усилением сигналов или матрица лавинных фотодиодов) используется для одновременного измерения множества световых сигналов от каждого из связывающих доменов. Матрица световых детекторов отображает свет, генерируемый от связывающих доменов. Для увеличения изображения могут использоваться линзы, отражатели и/или световоды. В других примерах свет, детектируемый из зон или областей детекторов света (например, пикселей [элементов изображения], детектирующих свет), коррелируется со связывающими доменами). Для корреляции детектируемого света со связывающими доменами, может использоваться анализ изображения. В одном из предпочтительных вариантов осуществления изобретения поверхность является эластичной или податливой, в результате чего может создаваться близкий контакт с поверхностями электрода. Связывающие домены связываются с полимерами, способными к переносу потоков ионов с противоположного электрода на рабочий электрод. В более предпочтительном варианте изобретения такими полимерами являются набухающие в воде полимеры, способные к переносу ионного тока с противоположного электрода на рабочий электрод.

Фиг. 38 изображает кассету, в которой связывающие домены (3805, 3806, 3807) находятся на поверхностях различных объектов (3808, 3809, 3810), поддерживаемых на противоположном электроде (3800). Рабочий электрод (3801) помещается вплотную к поверхности объектов. При условиях, которые приводят к ЕСЬ от ТАС-меченных групп, связанных со связывающими доменами, свет может детектироваться через любой из двух или через оба электрода (если один или оба из электродов прозрачны или полупрозрачны) и/или извне. Матрица детекторов света (3802) используется для одновременного измерения множества световых сигналов от каждого из связывающих доменов. Объекты могут быть высокоэластичными и/или податливыми, в результате чего может быть создан тесный контакт с рабочим электродом. Такими объектами могут быть полимеры, способные к переносу ионного потока с противоположного электрода на рабочий электрод. Этими объектами могут быть набухающие в воде полимеры, способные к переносу ионного тока с противоположного электрода на рабочий электрод.

Прозрачная подложка, содержащая один или более из связывающих доменов, приводится в контакт с электродом тонковолокнистой прослойки. Реагенты могут протекать либо между подложкой со связывающими доменами и тонковолокнистой прослойкой, либо через прослойку к связывающим доменам. Свет может проходить от связывающих доменов через прозрачную подложку к детектору.

В другом предпочтительном варианте изобретения, электрод покрыт оптически полупрозрачным или прозрачным слоем из углеродных фибрилл в целях увеличения эффективной площади поверхности электрода.

Предпочтительно, чтобы подложки РМАМЗ и/или кассеты настоящего изобретения могли быть упакованы как комплекты. Комплект содержит одну или более РМАМЗ подложек, изготовленных в соответствии с изобретением для проведения ЕСЬ-реакции, включая анализ, контроль и т. п.

В комплект могут быть включены, но не обязательно, реагенты, включая, реагенты для контроля, реагенты для ЕСЬ-анализа и калибровки и т. п. Может быть включена смесь реагентов, которая содержит множество связывающих реагентов, специфичных для множества различных аналитов.

5.9. Устройство для проведения ЕСЬреакций.

В одном из вариантов осуществления изобретения, поверхности РМАМЗ на подложках и кассеты, их содержащие, разработаны так, чтобы они вставлялись в устройство, которое содержит средство для нанесения одного или более испытуемых образцов на связывающие домены поверхности РМАМЗ. и средство для инициирования множества ЕСЬ-реакций. Такое устройство может быть получено из обычного устройства, модифицированного подходящим образом в соответствии с изобретением, для проведения множества видов ЕСЬ-анализа, про водимых на подложке или кассете. Изобретение относится к различным устройствам, адаптированным для проведения ЕСЬ-анализа с использованием каждого из конкретных вариантов РМАМЗ. описанных в предшествующих разделах. Устройство для проведения ЕСЬ-реакций раскрыто 2окк1 и соавт., (патент США № 5.061.445). Требуемые модификации включают обеспечение технического обслуживания подложки и/или кассеты, подачу множества образцов, доступ для подачи импульсов напряжения к множеству электродов, обнаружение и обработка множественного ЕСЬ-сигнала.

Элементы иллюстративного устройства в соответствии с настоящим изобретением изображаются на фиг. 6А. Такое устройство 700 содержит верхнюю и нижнюю подложки 702. 704 и электродный кожух 710. Верхняя подложка несет множество пар электрод/противоположный электрод (не иллюстрируются). Нижняя подложка несет связывающие домены 706. Устройство позволяет вынимать электродный кожух из кассеты и располагать пары электрод/противоположный электрод так, чтобы они контактировали с аналитом, связанными со связывающими доменами. Между реактивом или потоком текучей среды 708. которые находятся рядом с подложкой, несущей связывающие домены, имеется некоторое пространство. Устройство также способно одновременно или последовательно посылать идентичные или отдельно заданные импульсы напряжения к каждой из множества пар электрод/противоположный электрод для стимуляции ЕСЬ-реакции в кассете, и потом измерять испускаемое ЕСЬизлучение фотоприемником, например, детектором светового излучения. Кроме того, устройство может содержать терморегулятор для поддержания температуры подложки и/или кассеты, или окружающей их среды, и регулировки температуры, необходимой для оптимизации условий ЕСЬ-реакции. Терморегулирующими устройствами, предпочтительно, являются средства нагрева и охлаждения, например, электрические резистивные нагревательные элементы, охлаждающие вентиляторы, рефрижераторы и любой другой подходящий источник нагревания или охлаждения. Терморегулирующими средствами также являются датчики температуры, например, термостат или термопара, и средство для переключения в условиях нагревания или охлаждения в положение включено или выключено в ответ на обнаруженные температурные изменения.

Устройство также обеспечивает средства для поддержания, перемещения или управления одной или несколькими подложками или кассетами для проведения ЕСЬ-реакции. Устройство может кроме того, содержать стационарное или подвижное средство подачи образца для помещения образца на связывающие домены РМАМЗ. как описано ранее для кассет.

Устройство также содержит электродный контакт, для электрического соединения матрицы электродов раздельного доступа в кассете с электронным генератором импульсов напряжения, например, стабилизатор напряжения (см., например, фиг. 5 из американского патента 5.068.088). Генератор импульсов подает сигналы последовательно или одновременно, что обеспечивает независимую стимуляцию множества ЕСЬ -реакций в кассете.

Во время ЕСЬ-анализа, ионный ток между рабочим и противоположным электродами может течь через жидкость с ионной проводимостью (например, вода, содержащая ионные соли), через тонкую пленку такой жидкости, и/или через кристаллическую решетку с ионной проводимостью.

Таким образом, устройство для измерения электрохемилюминесценции в образце может содержать множество ячеек для удерживания, по крайней мере, одного образца, где ячейка может быть образована из одного или более электродов, и из одного или более противоположных электродов и первой подложки, которая содержит множество дискретных связывающих доменов. Электроды и противоположные электроды можно обеспечивать на поверхности первой подложки или на поверхности второй подложки, где вторая подложка находится вплотную к связывающим доменам на первой подложке. Электроды и противоположные электроды могут быть в парах. Ячейка может, кроме того, содержать множество чувствительных электродов, чтобы воспринимать напряжение у рабочего электрода. Кроме того, кассета может содержать ячейку, содержащую электрод сравнения.

Устройство, кроме того, содержит средство для детектирования света, способное обнаружить ЕСЬ-реакции, проводимые в кассете, например, одним или несколькими детекторами. Такое детектирующее средство включает, например, матрицу волоконнооптических каналов, согласованную с электродной матрицей, и помещенное смежно с ними средство, связанное с матрицей фотодетекторов, или с одним детектором света, способным сканировать массив ЕСЬсигналов по мере испускания.

Устройство необязательно содержит цифровой компьютер или микропроцессор для управления функциями различных компонентов устройства.

Устройство также содержит средство обработки сигнала. В одном из вариантов изобретения, и просто для примера, средство обработки сигнала содержит цифровой компьютер для передачи, регистрации, анализа и/или отображения результатов каждого ЕСЬ-анализа.

Альтернативно, устройство содержит средство переноса электрода, например, чтобы сканировать одну или более пар электрод/ про тивоположный электрод по связывающей поверхности, для последовательного запуска ЕСЬ.

Могут использоваться фильтры исключения размера в параллельной матрице РМЛМ8.

5.10. Анализ ЕСЬ, который может быть проведен.

ЕСЬ-метки для использования в соответствии с настоящим изобретением могут быть выбраны из известных ЕСЬ-меток (см. раздел 2.2, выше, и патент США № 5,310,687). ЕСЬ-метка может содержать, например, металлоорганическое соединение, в котором металл выбирают из группы, состоящей из рутения, осмия, рения, иридия, родия, платины, палладия, молибдена, технеция и вольфрама. Подходящие сшивающие химические агенты для приготовления ЕСЬметок хорошо известны и раскрыты, например, Вагй и соавт. (патент США. №№ 5,310,687 и 5,221,605). Связывание ЕСЬ-метки со связующим реагентом может быть ковалентным и/или нековалентным. ЕСЬ-метка может нековалентно связываться со связывающим реагентом (например, посредством гидрофобных эффектов или ионных взаимодействий). В других примерах нековалентного связывания, ЕСЬ-метка(-и) связывается (ковалентно или нековалентно) с комплексом, который, в свою очередь, нековалентно связывается со связывающим реагентом. Более конкретным примером может служить ковалентное связывание Ви(бипиридин)3 с комплексом №(П)-тринитрилотриуксусная кислота посредством линкера. Эта молекула будет присоединяться к связывающим реагентам, которые включают пептидную последовательность, содержащю множество гистидинов. Имеются другие известные пары рецепторлиганд, которые можно использовать подобным образом (8а88еи£е1й, 1990, Т1ВТЕСН, 8,стр.8893). Кроме того, можно использовать ЕСЬметку, которая содержит множество металлорганических соединений (например, Кисодержащих), имеющих разветвленную сетчатую структуру (например, сетчатую структуру, сшитую посредством углеводородных линкеров). Такие разветвленные сети, содержащие множество металлоорганических составлящих, способных к ЕСЬ, могут прикрепляться в одном или множестве положений на молекуле, которая должна помечаться ЕСЬ-меткой. В другом варианте ЕСЬ-метка, содержащая множество металлоорганических соединений, является линейным полимером с металлоорганическими группами, присоединенными во множестве положений по длине полимерной цепи (например, линейный, разветвленный или циклический полимеры).

Множество связывающих доменов может быть использовано в ряде дополнительных ЕСЬ-анализов, хорошо известных специалистам. В количественном анализе используется известное количество ЕСЬ-меченых реагентов, и количество измеренной ЕСЬ коррелируется с известными стандартами для определения количества присутствующего аналита. Прямой, обратный, конкурентный сэндвич -анализы могут быть осуществлены способами, хорошо известными специалистам. В конкурентном анализе, например, способ количественного определения количества исследуемого аналита в объеме многокомпонентного жидкого образца выполняется следующим образом. Связывающую поверхность подвергают контакту одновременно: (а) с известным количеством ЕСЬмеченого лиганда, который способен конкурировать с исследуемым аналитом в связывании со связывающим реагентом, находящемся на связывающих доменах, и (б) с образцом, в котором предполагается содержание исследуемого аналита; причем такой контакт осуществляют при подходящих условиях так, чтобы исследуемый аналит и лиганд конкурентно связывались со связывающим реагентом. Присутствие аналита в образце уменьшает количество конкурирующего ЕСЬ-меченого лиганда, который связывается со связывающимися доменами, таким образом уменьшая (относительно того условия, когда в образце нет никакого аналита) результирующую величину ЕСЬ. ЕСЬ индуцируется в конечном связывающем домене, и количественно определяется величина испускаемого света; таким образом, количественно определяется количество исследуемого аналита, находящегося в образце. Альтернативно, образец может приводиться в контакт со связывающей поверхностью прежде, чем связывающая поверхность будет контактировать с ЕСЬ -меченым лигандом; а ЕСЬ-меченый лиганд будет затем конкурировать с предварительно связанным аналитом из образца на поверхности ΡΜΛΜ8 и заместит некоторое количество предварительно связанного аналита. В другом варианте изобретения, для осуществления конкурентного анализа образец может быть обработан так, что он будет содержать ЕСЬ-меченые вещества/молекулы, и стандартное количество немеченого исследуемого аналита может входить в контакт со связывающей поверхностью до, или одновременно с контактированием связывающей поверхности с образцом.

В сэндвич-анализе ЕСЬ-меченый лиганд является связывающим партнером, который специфически связывается с вторым связывающим компонентом на исследуемом аналите. Таким образом, когда аналит, который специфически связывается со связывающимся реагентом в связывающемся домене ΡΜАΜ§, присутствует в образце, то формируется сэндвич, состоящий из связывающего реагента на связывающем домене, который связан с аналитом из образца, связанного с ЕСЬ-меченым связывающим партнером. В другом конкурентном сэндвичанализе, копии самого аналита связываются к связывающим доменам мультиматричной связывающей поверхности до того, как ее подвер гают воздействию образца. Потом образец приводится в контакт со связывающей поверхностью. ЕСЬ-меченый связывающий партнер (который может специфически связываться с аналитом) будет связывать аналит в отсутствии свободного аналита (из образца) в анализируемом растворе, но будет конкурентно ингибироваться в присутствии свободного аналита (из образца) в анализируемом растворе.

В альтернативных вариантах изобретения осуществляют последовательное мечение. Например, в конкретном варианте осуществления сэндвич-анализа аналит, связанный со связывающим доменом, последовательно входит в контакт с множеством ЕСЬ-меченых связывающих партнеров аналита. Измерения ЕСЬ и необязательные стадии промывания проводятся между контактированием связывающихся партнеров друг с другом. Таким образом, может быть осуществлено ЕСЬ-измерение множества различных связывающих компонентов аналита (например, Т-клетки, экспрессирующие СИ8⁺, и Т-клеточные рецепторы, а, Ь для антигена. Кроме того, каждая из многочисленных ЕСЬ-меток, испускающих свет на различной длине волны, могут быть связаны с различными связывающими реагентами, характерными для различных компонентов на аналите. Кроме того, может использоваться множество различных средстврепортеров (например, ЕСЬ-метка, флуоресцентная метка и иммуноферментная метка), каждое из которых связывается с различным связывающим реагентом, специфичным для различных связывающих компонентов аналита, например, для того, чтобы отличать Т-клетки, экспрессирующие СЭ4'. и Т-клеточные рецепторы а, Ь для антигена, от Т-клеток, экспрессирующих СИ8⁺, и Т-клеточные рецепторы а, Ь для антигена.

В предпочтительных вариантах связывающие домены содержат меченые белки и/или нуклеиновые кислоты и/или клетки и/или химические соединения. Такие меченые компоненты (например, ЕСЬ-метки) могут быть добавлены к связывающему домену во время изготовления, до начала анализа, во время анализа и/или в конце анализа. Например, многочисленные меченые компоненты могут быть добавлены в разное время, и последующие данные могут быть считаны. Такие данные могут обеспечивать совокупную информацию. В другом варианте изобретения связывающие домены ΡΜАΜ§ могут повторно использоваться много раз. После того, как данный анализ выполнен, поверхность можно промывать при условиях, которые восстанавливают активность одного или более связывающих доменов поверхности ΡΜΛΜ§. Например, некоторые реакции связывания могут быть подвергнуты обратному процессу путем изменения ионной силы реакционного раствора. Альтернативно, можно использовать нагревание для диссоциации связывающих комплексов.

Некоторые связывающие домены могут сами по себе восстанавливаться.

Связывающие домены, которые содержат в себе каталитические (например, ферментные) функциональные группы, могут использоваться более одного раза. Связывающие домены используются непрерывно, и таким образом, они могут использоваться в качестве биосенсора.

Кроме того, анализ можно представить в таком виде, чтобы связывающий реактив, связанный с мультиматричной мультиспецифической конфигурированной поверхностью, был ЕСЬ-помечен. ЕСЬ-сигнал будет количественно модулироваться при связывании с некоторыми исследуемыми аналитами в образце. Например, ЕСЬ-меченый связывающий реагент, связанный с поверхностью, может обладать специфичностью к аналиту на поверхности клетки, например, антигены, такие как антигены Т-клеточного рецептора и/или СЭ4- или СЛ8-антигены. При экспонировании смеси клеток, клетки, связанные с поверхностью, будут пространственно препятствовать способности поверхности электрода, помещенной вплотную к мультиматричной мультиспецифической поверхности, возбуждать ЕСЬ-меченый связывающий реагент, что приводит к субмодуляции ЕСЬ-сигнала.

Может проводиться гомогенный и гетерогенный анализ. В гетерогенном анализе несвязанный меченый реагент отделяется от связанного меченого реагента (например, путем промывки) перед воздействием электрического потенциала на связанный или несвязанный меченый реагент. В гомогенном анализе несвязанный меченый реагент и связанный меченый реагент вместе подвергаются воздействию электрического потенциала. В гомогенном анализе интенсивность или спектральные характеристики сигнала, испускаемого связанным меченым реагентом, является либо больше, либо меньше чем интенсивность сигнала, испускаемого несвязанным меченым реагентом. Присутствие или отсутствие соответствующих связанных и несвязанных компонентов можно определить путем измерения разницы в интенсивности.

После завершения нужных стадий приведения в контакт связывающих реагентов с аналитом или с его конкурентом и с его любыми партнерами по связыванию можно затем будет гарантировать, что ЕСЬ-метка подвергается воздействию окружающей среды, способствующей ЕСЬ. Специалистам известна подходящая среда ЕСЬ-анализа. Такая среда для анализа преимущественно включает молекулу, которая стимулирует электрохемилюминесценцию ЕСЬметки, например, оксалаты, КАЛН [никотинамид-адениндинуклеотид], и наиболее предпочтительно трипропиламин. Такой молекулой стимулятором может быть свободная молекула в растворе, либо она может быть предварительно связана РМАМ8, или она может быть связана при изготовлении (например, как про дукт химической реакции) с поверхностью РМАМ8, с монослоем на поверхности, со связывающим доменом, с поверхностью электрода, со связывающим реагентом и/или с ЕСЬ-меткой и т.д. Если среда, окружающая ЕСЬ-метку, связанную со связывающим доменом, в результате проведения стадий контактирования, является проводящей для ЕСЬ, то никаких изменений к среде не требуется. Альтернативно, среда может быть скорректирована или заменена средой, проводящей ЕСЬ. Электрод и противоположный электрод уже находится возле связывающего домена, или приводится вплотную к-, или в контакт со связывающим доменом; прикладывается импульс напряжения и детектируется или измеряется ЕСЬ-сигнал.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения вышеописанные стадии приведения в контакт связывающих реагентов с аналитом или его конкурентом и его любыми связывающимися партнерами проводятся в отсутствии электродов и противоположных электродов, т. е. так, что образец не входит в контакт с электродом или противоположным электродом. Вслед за этими стадиями контактирования, электроды и противоположные электроды подводятся достаточно близко к ЕСЬ-метке, связанной со связывающим доменом, чтобы индуцировать ЕСЬ-реакцию.

Подложка, имеющая РМАМ8, может использоваться для секвенирования нуклеиновокислотных цепей. Например, РМАМ8 с множеством связывающих доменов получают с использованием различных олигонуклеотидных зондов с известной нуклеотидной последовательностью в качестве связывающих реагентов в различных связывающих доменах. То есть различные связывающие домены будут содержать связывающие реагенты с различными известными нуклеотидными последовательностями. Олигонуклеотидная цепь или фрагменты олигонуклеотидной цепи, подвергаемые секвенированию, затем связывают (гибридизируют) со связывающими доменами РМАМ8. Нуклеиновые кислоты, подвергаемые секвенированию, помечаются ЕСЬ. Проводится анализ связывания на РМАМ8, и для секвенирования олигонуклеотидной цепи используется распределение ЕСЬ-сигналов от дискретных связывающих доменов на РМАМ8.

Вышеописанный способ основан на способности коротких олигонуклеотидов гибридизироваться комплементарными или в основном, комплементарными последовательностями в другой нуклеиновокислотной молекуле (см., например, 81гс/05ка и соавт., 1991, Рго1. №111. Асай.8ск, И8А, 88, стр. 1089-1093; Ватк, 1992, Вю/Тсс1то1оду. 10, стр.757-58, которые вводятся в настоящее описание посредством ссылки). Условия могут быть подобраны так, чтобы желаемая степень комплементарности последовательности являлась необходимой для успешной гибридизации. Гибридизация молекулы ДНК неизвестной последовательности с нуклеотидным зондом с заранее известной последовательностью свидетельствует о присутствии комплементарной последовательности в молекуле ДНК. Способ предпочтительно осуществляют так, что реакцию гибридизации проводят с олигонуклеотидными зондами, связанными со связывающими доменами и с образцом ДНК в растворе.

Поверхности РМАМ8 могут быть также использованы для выделения скрининга и/или отбора новой молекулы или комплекса с нужной функцией (например, связывание или катализ). Поверхности РМАМ8 могут использоваться, для выделения соединений и/или для терапевтических целей. Поверхность РМАМ8, содержащая множество пептидов, нуклеиновых кислот, вирусных векторов, или полимеров, синтезированных разнообразными способами комбинаторной химии, может быть изготовлена способами настоящего изобретения. Широкое разнообразие таких подложек с обработанными поверхностями РМАМ8 может быть использовано для быстрого скрининга на связывание, например, с ЕСЬ-меченым клеточным рецептором. В одном способе первая РМАМ8 с большим разнообразием неродственных пептидных последовательностей используется для выделения главных связывающихся пептидных последовательностей. Затем используются РМАМ8 с пептидами, имеющими родственные последовательности, по отношению к тем последовательностям, которые обнаруживали связывание с нужной молекулой (например, клеточным рецептором) на первой РМАМ8. Процесс повторяется до тех пор, пока не будет найден пептид с желаемыми связывающими свойствами.

Исследуемый аналит может быть, например, целой клеткой, субклеточной частицей, вирусом, прионом, вироидом, нуклеиновой кислотой, белком, антигеном, липопротеином, липополисахаридом, липидом, гликопротеидом, углеводной молекулой, производным целлюлозы, антителом или его фрагментом, пептидом, гормоном, фармакологическим агентом, клеткой или клеточными компонентами, органическими соединениями, небиологическим полимером, синтетической органической молекулой, металлорганическими соединениями, или неорганической молекулой, присутствующими в образце.

Образец может быть получен, например, из твердого вещества, эмульсии, суспензии, жидкости или газа. Кроме того, образец может быть получен, например, из физиологических жидкостей или тканей, воды, пищи, крови, сыворотки, плазмы мочи, фекалий, ткани, слюны, масел [нефти], органических растворителей или воздуха. Образец может содержать восстановительный агент или окислительный агент.

В соответствии с настоящим изобретением можно проводить анализ путем введения связывающего реагента, специфичного для упомянутых веществ, в связывающие домены связывающих поверхностей изобретения в целях обнаружения или измерения таких веществ, как альбумин, щелочная фосфатаза, аИ/8СРТ, аммиак, амилаза, аспартат-трансминаза/глутаматоксалоацетат аминотрансфераза сыворотки крови ( А8Т/8СОТ). общий билирубин, азот, кальций, двуокись углерода, хлорид, холестерин общее количество, креатинин, гаммаглутамил транспептидаза (ССТ), глюкоза, липопротеиды высокой плотности (НОЬ), холестерин, железо, лактатдегидрогеназа (ЬИН), магний, фосфор, калий, белок - общее количество, натрий, триглицериды, мочевая кислота, наркотики, гормоны, модуляторы сердечно-сосудистой системы, маркеры опухоли, антигены инфекционных болезней, антигены, вызывающие аллергию, иммунопротеины, карбамазепин, дигоксин, гентамицин, литий, фенобарбитал, фенитоин, прокаинамид, хинидин, теофилин, тобрамацин уа1рго1с кислота, ванкомицин, амфетамины, антидепрессанты, барбитураты, бензодиазепины, каннабиноиды, кокаин, диэтиламид лизергиновой кислоты (ЛСД ), метадон, метахалон, опиаты, фенилиндин, пропоксифен, этанол, салицилат, ацетоминофен, эстрадиол, прогестерон, тестостерон, человеческий хорионический гонадотропин ( ЬСС/ЬйСС), фолликулостимулирующий гормон, лютеинизированный гормон, пролактин, тиреоидинит гормон, такой как тиреотропный гормон, Т4, ТОР, полный-ТЗ, свободный - Т4, свободный - ТЗ, кортизол, креатинкиназан-МБ, креатинкиназа - общее количество, РТ, АРТТ/РТТ, ΕΌΙ8Ο, креатинкиназа ИСО [Международная организация по стандартизации], миоглобин, легкая цепь миоглобинов, тропонин 1, тропонин Т, хламидии, гонорея, вирус герпеса, болезнь Лайма, вирус ЭпштейнаБара, иммуноглобулин Е, Краснуха-С, Краснуха-М, цитомегаловирус - С (СМУ-С), цитомегаловирус М (СМУ- М), токсо-6, токсо-М., НВкАд [поверхностный антиген вируса гепатита В] ВИЧ1, ВИЧ2, анти-НВс [антитело против ядерного антигена], анти-НВк [антитело против поверхностного антигена гепатита В], вирус гепатита С (НСУ), анти-НАУ 1дМ [иммуноглобулин М против вируса гепатита А], анти-НВс 1дМ [иммуноглобулин М против ядерного антигена анти-НАУ, [антитело против вирусного гепатита А], НВеАд [антиген е вирусного гепатита В], анти-НВеАд [антитело против антигена е вирусного гепатита В], ТВ [туберкулезная бацилла, антиген предстательной железы, карциноэмбриональный антиген (СЕА), АРР альфа-фетопротеин, РАР СА-125, СА15-3, СА19-9,2-микроглобулинн гемоглобин, эритроциты, НЬсАЬ [НТОУ [Т-лимфотропный вирус человека], АЪТ аланин-аминотрансфераза, 8Т8 сифилис, антигены типа крови группы АВО и антигены, представляющие другие группы крови, цитомегаловирусы, ферритин витамин В-12, фолат, гликолированный гемоглобин, амфетамин, антидепрессанты и другие психотропные фармацевтические препараты.

Измерения ЕСЬ в различных связывающих доменах могут быть выполнены последовательно или одновременно.

Поверхность ΡΜΑΜЗ, специфичная для исследуемого аналита, которым является белок поверхности клетки, сначала подвергается воздействию образца, содержащего клетки, в которых желательно подсчитать клетки. В предпочтигельном варианте известный объем образца и/или разведенный образец подвергается воздействию ΡΜΑΜЗ, которая имеет множество связывающих доменов, специфичных, по крайней мере, для одного антигена поверхности клетки. Количество связанных клеток может быть затем определено посредством второй связывающей группой, связанной с ЕСЬ-меткой. Эта группа способна взаимодействовать с широким диапазоном типов клеток, например, ЕСЬ-метка, связанная с гидрофобной группой, способной к проникновению в клеточную мембрану или в лектин, направленный против сахаров поверхности клетки. Метка ЕСЬ-ТАС соединяется со вторым антителом, направленным против антитела поверхности клетки. В более конкретном варианте изобретения несколько типов клеток, связанных с тем же самым доменом, могут различаться путем использования многочисленных вторых ЕСЬ меченных антител. Желательно убедиться, что число дискретных связывающих доменов, специфичных для данного аналита на поверхности клетки, превышает среднее число связывающихся клеток, которые присутствуют в образце. Далее, чтобы определить число клеток в объеме образца, могут использоваться статистические методы. Этот метод также можно использовать, например, для того, чтобы подсчитать другие частицы, такие как вирусы, где связывающий реагент распознает антиген на вирусе. Домены могут быть маленькими по сравнению с размерами клетки, так что только одна клетка могла бы связываться с одним доменом, что приводило бы к цифровому сигналу для каждого домена, который может потом быть проанализирован по сумме доменов с использованием статистических методов. По сравнению с размерами клетки домены велики, так что с доменом может связываться много клеток. В таком случае, уровень сигнала от каждого домена может быть прокалиброван так, чтобы получить число клеток в объеме образца. Анализ изображения, использующий матрицу световых детекторов (например, ПЗС-камеру или матрицу лавинных фотодиодов), мог бы использоваться для того, чтобы подсчитать клетки и определять морфологию клетки.

Изобретение также предпочтительно относится к способам проведения ЕСЬ-реакций, например, анализов со скоростью 1000 ЕСЬ реакций в интервале времени от 5 до 15 мин.

5.11. ΡΜΑΜЗ для использования с другими аналитическими способами и/или ЕСЬ.

Методы, описанные выше для детектирования, основанного на ЕСЬ, могут использоваться в сочетании с другими методами анализа, например, с использованием доменов, в которых могут происходить катали и другие химические реакции. Дискретные связывающие домены в соответствии с изобретением могут использоваться в других методах анализа, таких как клинический химический анализ, например, определение электролита, клиническое определение фермента, определение белка в крови, определение глюкозы, мочевины, креатинина и т.п. Другие методы анализа, которые могут быть объединены с ЕСЬ-анализом и/или использоваться отдельно с ΡΜΑΜЗ настоящего изобретения, включают анализ систем на основе хемилюминесцентной метки, анализ на основе флуоресценции, системы иммуноферментного анализа, электрохимические испытания (см., например, Н|сктап и соавт., 1991, Зшепсе, 252. 688691), и/или резонансное детектирование (например, методы поверхностных плазмонов и акустические методы).

Могут использоваться подложки поверхности ΡΜΑΜЗ с каплями, на которых имеется множество различных химических соединений в матрице капель. Каждая капля может содержать различные связывающие реагенты и/или различные химические анализы (то есть, реакционную среду для анализа). Например, капли могут быть гидрофильными, находящимися на гидрофильных поверхностях связывающих доменов, окруженных гидрофобными областями поверхности. Капли защищены гидрофобным раствором, покрывающим поверхность. Анализируемый гидрофильный раствор наносится на вторую поверхность ΡΜΑΜЗ с гидрофильными связывающими доменами, окруженными гидрофобными областями. Две поверхности заметно сближают так, чтобы привести в контакт гидрофильные домены на противоположных поверхностях, и проводят спектральный анализ для обнаружения продуктов реакции химического анализа.

Тонковолокнистые прослойки могут быть конфигурированы так, чтобы было множество дискретных гидрофобных и/или гидрофильных доменов, окруженных гидрофильными и/или гидрофобными областями. Капли водных растворов, содержащих связывающие реагенты, могут находиться на гидрофильных доменах и удерживаться от растекания окружающими гидрофобными областями. Эти капли могут содержать, например, фибриллы, агрегаты фибрилл, связывающие реагенты, ЕСЬ-реагенты, реагенты для анализа, поверхностно-активные вещест ва, полиэтиленгликоли (БЕС). моющие средства, множество биологических молекул, упомянутых выше в качестве примера, и/или их комбинации.

Гидрофобный раствор, покрывающий первую поверхность ΡΜΑΜ8, регулируемым образом удаляют (например, испарением, дренажом), так, чтобы воздействию окружающей среды подвергалась только верхняя часть гидрофильных капель. Гидрофильный раствор, который должен анализироваться на оптическую химическую реакцию, затем подвергается воздействию поверхности ΡΜΑΜ8; анализируемые гидрофильные микрокапли и анализируемый раствор смешивают, и осуществляют анализ (например, спектральный).

Связывающие домены поверхности ΡΜΑΜ8 могут также использоваться в качестве фильтра или предварительного фильтра. Например, клеточно-специфическая поверхность ΡΜΑΜ8 может использоваться в некоторых случаях отдельно в качестве фильтра для некоторых типов клеток, а также в сочетании с просеивающим фильтром. Полученный раствор аналита затем подвергается воздействию поверхности ΡΜΑΜ8, специфичной к субклеточному веществу макрочастиц (например, вирусов). Поверхность ΡΜΑΜ8, специфичная к субклеточной макрочастице и/или просеивающий фильтр используется для продуцирования раствора аналита с небольшими молекулами (например, белком, маленькими химическими структурными элементами). Используя систему серийного РМАМ8-анализа, раствор аналита может быть затем очищен, для уменьшения неспецифических взаимодействий аналита.

Оптическая непрозрачность материала, используемого для подложки электрода и/или связующего домена, может варьироваться для достижения желаемых свойств. Такой материал может быть полупрозрачным, прозрачным или в значительной степени непрозрачным, в зависимости от толщины, состава и/или оптической плотности материала.

Оптическая непрозрачность тонковолокнистых прослоек увеличивается с возрастанием толщины прослойки. Очень тонкие прослойки оптически полупрозрачны. Более толстые прослойки могут быть в значительной степени непрозрачными. Например прослойки, с толщиной в пределах от 0,01 мкм до 0,5 мкм, в основном, полупрозрачны. В других примерах прослойки с толщиной более, чем 20 мкм, в основном непрозрачны. Прослойки с толщиной между 0,5 мкм и 20 мкм имеют варьирующуюся непрозрачность, которая увеличивается с увеличением толщины тонковолокнистой прослойки. Оптическая непрозрачность конкретной толщины прослойки может зависеть от состава, плотности, дериватизации, числа слоев, типа и количества материалов, диспергированных в прослойке, и/или их комбинаций. Она может также зависеть от длины волны используемого света.

Если материал в основном полупрозрачен при данной толщине и в основном непрозрачен для другой толщины, то свет, испускаемый с определенной глубины материала, может выходить из материала, в то время как свет, испускаемый с другой (например, большей) глубины, может в значительной степени поглощаться или рассеиваться материалом. В одном из примеров, варьируемая непрозрачность материала позволяет использовать материал в качестве оптического фильтра.

Свет, испускаемый с некоторой глубины в тонковолокнистой прослойке, может в основном проходить через прослойку, и наблюдаться с помощью детектора, помещенного на поверхности тонковолокнистой прослойки или вблизи нее. Свет, испускаемый с другой глубины, может в основном поглощаться и/или рассеиваться прослойкой, и не регистрироваться детектором, помещенным на поверхности прослойки или вблизи нее.

Это свойство тонковолокнистой прослойки (и/или материалов с подобными оптическими свойствами) может использоваться для установления различия между связанными и несвязанными реагентами в ЕСЬ-анализе.

Некоторые реагенты могут диффундировать (активно или пассивно), втягиваться (например, всасывающей фильтрацией и/или действием капилляра), проникать с помощью дренажа, или продвигаться давлением на достаточную глубину в пористом материале, так что излучение света от этих реагентов в значительной степени или полностью поглощается или рассеивается прослойкой. В одном из примеров, тонковолокнистая прослойка действует и как физический, и как оптический фильтр, через который некоторые реагенты проходят, некоторые реагенты оседают на ней, и/или некоторые реактивы связываются с очень тонким слоем как на поверхности прослойки, так и вблизи нее. Реагент, связанный с одним или несколькими из связывающих доменов, и/или образцы, связанные с одним или несколькими из связывающих доменов (причем эти домены располагаются либо на поверхности тонковолокнистой прослойки, либо в очень тонком слое около поверхности прослойки на ΡΜΑΜ8 поверхности), предохраняются от диффузии, втягивания и т.д., вовнутрь или через прослойку. Реагенты и/или другие растворы протекают или находятся во взвешенном состоянии на- и/или по поверхности тонковолокнистой прослойки так, что реагенты связываются только с очень тонким слоем на поверхности прослойки. Реагенты могут промываться через прослойки один или много раз, в одном или в нескольких направлениях. Реагенты могут связываться с тонковолокнистой прослойкой, с одним или несколькими из связывающих доменов, с другими или теми же самыми реагентами, связанными с одним или несколькими из связывающих доменов, могут увлекаться внутрь прослойки, проходить через прослойку или комбинацией вышеперечисленных.

Пористые материалы, используемые в подложках и/или электродах, могут иметь более, чем один слой, в котором верхний слой имеет связывающие домены, а другие слои внутри прослойки не имеют связывающих доменов. В одном из примеров тонковолокнистой прослойки (иллюстрируемая схематично на фиг. 29), верхний слой 2900 достаточно толст, чтобы препятствовать прохождению света, который возникает в слое(-ях) 2901, 2902 из прослойки ниже этого слоя. Свет 2903, который продуцируется от источников 2904, 2905, связанных с этим верхним слоем, может обнаруживаться детектором 2906, расположенным на поверхности прослойки или вблизи нее. Свет, продуцируемый от источников 2907, 2908, 2909 в более низких слоях 2902, 2901, поглощается и/или рассеивается любым из слоев или всеми слоями, и не может быть обнаружен детекторами 2906, 2910.

Стадия предварительной фильтрации может использоваться для выбора конкретных размеров, типов, производных фибрилл и/или агрегатов фибрилл перед изготовлением прослойки. Фильтрующий агент, используемый для фильтрации суспензии фибрилл, представляет собой прослойку из фибрилл с определенной пористостью или многопористой.

Пористый материал (например, тонковолокнистая прослойка), может действовать как подложка для связывающих доменов, как электрод, который может использоваться для ЕСЬ или других электрохимических применений, и как фильтр, который может использоваться для регулирования подачи реагентов, и/или как оптический фильтр, который может пропускать, поглощать и/или рассеивать свет в различной степени.

5.12. Электрохромные электрохемилюминесцентные индикаторные панели.

Изобретение также относится к изготовлению изолированных электрохимических элементов изображения для использования в плоских дисплеях. Для использования в электрохромных индикаторных панелях и в индикаторных панелях, основанных на электрохемилюминесценции, были предложены методы литографии, чтобы создавать пикселы, которые, при их электронной адресации, имеют ограниченное влияние на соседние пикселы (то есть, ограниченное наложение) (см. американский патент № 5,189,549). Ограничением метода литографии для сокращения таких перекрестных помех является то, что материал электролита должен быть способен к изменению проводимости под действием света. Отличительный признак настоящего изобретения состоит в том, что оно позволяет уменьшить перекрестные наложения между пикселами без необходимости использования материалов, способных к модуляции фотоиндуцированной проводимости, и в связи с этим, оно позволяет использовать широкий диапазон различных растворов, гелей или пленок.

Поверхности двух электродов, которые являются активными областями пиксела, находятся на двух поверхностях, обращенных друг к другу в конфигурации сэндвича. Поверхности электрода покрываются, например, комплементарными электрохромными материалами. Чтобы уменьшить перекрестные помехи, проводящая электролитическая пленка помещается между поверхностями электродов с непроводящими областями между различными электродными парами (то есть между элементами пикселов). Если покрытые поверхности электродов являются гидрофильными, то участки поверхности вокруг электродов делаются гидрофобными (например, посредством штамповки или нанесения через маску), и гидрофильные проводящие капельки помещаются на электроде на первой поверхности (например, посредством флюидальной матрицы), а затем вторая поверхность автоматически наводится и приводится в контакт с первой поверхностью так, чтобы электроды оказались в задвижке. Электролитические капельки могут таким образом быть ограничены участками в пределах одного пиксела без какого-либо проводящего материала между пикселами. Электродные пары пиксела располагаются рядом в тесной близости на одной поверхности. Если покрытые электродные пары являются гидрофильными, то участок, охватывающий оба электрода, делается гидрофильным, с гидрофобным кольцом вокруг гидрофильного электродного участка (например, посредством штамповки или нанесения через маску). Капельки, описанные выше в двух вариантах изобретения, стабилизируют, используя гидрофобные растворы. Вязкость растворов может быть увеличена для увеличения стабильности матриц капелек. Гидрофильность и гидрофобность можно использовать в обращенном порядке. В других вариантах изобретения капельки могут включать растворы, способные к полимеризации, в целях увеличения стабильности и/или проводимости (например, проводящие полимеры) пленок между или над электродными парами. Кроме того, могут использоваться структурные особенности, для ограничения наложения между пикселами. Например, чтобы изолировать электролитические растворы, гели, или пленки между пикселами можно использовать эластомерный штамп (например, поли (диметилсилоксан)), с кольцеобразным выступом штампа, способный обводить (чертой) расположенные рядом на поверхности электродные пары пикселов. Альтернативно, расположенные бок о бок электродные пары пикселов можно поместить в электрически изолирующие лунко образные структуры, на поверхности; электролитические растворы, гели или пленки можно поместить в лунках над электродами, а поверхность можно целиком закрыть или покрыть для изоляции и удерживания электролитических компонентов каждого пиксела.

5.13. ΡΜΑΜ8 для использования в других химических реакциях.

Поверхность ΡΜΑΜ8, в соответствии с изобретением, может также использоваться для проведения химических реакций не в комбинации с ЕСЬ. Например, могут использоваться все методы и не- ЕСЬ-анализ, обсужденные выше в разделе 5.11.

Изготавливают кассету для детектирования или измерения исследуемого аналита в образце, содержащую:

(а) первую подложку, имеющую множество дискретных связывающих доменов на ее поверхности для формирования, по крайней мере, одной связующей поверхности, причем, по крайней мере, некоторые из дискретных связывающих доменов имеют специфичности связывания, отличающиеся от специфичностей связывания других связывающих доменов, причем каждый из множества дискретных связывающих доменов является гидрофильным и окружен гидрофобными областями; и (б) вторую подложку, имеющую множество гидрофильных доменов, содержащих реакционную среду, подходящую для проведения в ней химического анализа для сформирования поверхности анализа, в которой множество дискретных связывающих доменов и множество реакционных сред способны приводиться в контакт так, чтобы анализируемый образец, находящийся на каждом связывающем домене, контактировал с реакционной средой для детектирования и измерения исследуемого аналита. Альтернативно, связывающие домены могут быть гидрофобными, а вторая подложка может иметь множество гидрофобных доменов, содержащих реакционную среду.

Изобретение также относится к способу детектирования или измерения исследуемых аналитов в образце, предусматривающему:

(а) помещение капель образца, содержащих аналит, который необходимо обнаружить или измерить, на множество дискретных связывающих доменов на поверхности подложки, в которой множество дискретных связывающих доменов содержит, по крайней мере, один связывающий домен, включающий связывающие реагенты, которые идентичны друг другу и которые по своим специфичностям отличаются от связывающих реагентов, содержащихся внутри других связывающих доменов; причем каждый из дискретных связывающих доменов характеризуется либо как гидрофобный, либо как гидрофильный, при условии, что область поверхности подложки, окружающая каждый связующий домен, является:

(ί) гидрофобной, если связующий домен гидрофильный, и (ίί) гидрофильной, если связующий домен гидрофобный, так, чтобы один или несколько исследуемых аналитов в образце могли связываться со связывающимися доменами, и (б) контактирование капель на первой подложке с поверхностью второй подложки, имеющей множество дискретных гидрофильных доменов, содержащих реакционную среду, подходящую для проведения на ней химического анализа; и (в) определение присутствия исследуемых аналитов, привязанных к связующим доменам.

Изобретение также относится к способу детектирования или измерения исследуемых аналитов в образце, предусматривающему:

(а) помещение капель образца, содержащего аналит, который необходимо обнаружить или измерить, на множество дискретных связывающих доменов на поверхности подложки, в которой множество дискретных связующих доменов содержит, по крайней мере, один связующий домен, включающий связывающие реагенты, которые являются идентичными друг другу и которые по своей специфичности отличаются от связывающих реагентов, содержащихся внутри других связывающих доменов; причем, каждый из дискретных связывающих доменов, характеризуется либо как гидрофобный, либо как гидрофильный, при условии, что область поверхности подложки, окружающая каждый из связывающих доменов, является:

(ί) гидрофобной, если связующий домен гидрофильный, и (ίί) гидрофильной, если связующий домен гидрофильный, так, чтобы один или несколько исследуемых аналитов в образце могли связываться с связывающими доменами;

(б) - помещение капель реакционной среды на капли образца; и (в) - определение исследуемых аналитов, связанных со связывающими доменами.

В конкретном примере этого аспекта изобретения, связывающие домены, каждый из которых включает какой-то отличный от других фермент, который используется в качестве субстрата, как промежуточного звена в химической реакции, располагаются на ΡΜΑΜ8-поверхности так, что продукт данной ферментной реакции, который является реагентом для последующего фермента, протекает к следующему ферменту в каскаде ферментных реакций. Изобретение также относится к объемной иммобилизации ферментов на самоформирующихся монослоях, например, для промышленного применения с использованием вышеописанных методов.

Например, листы с такими иммобилизованными ферментами на одной или обеих сторонах можно складывать в стопки в целях достичь высоких отношений площади поверхности к объему раствора. Альтернативно, такие иммобилизованные ферменты могут быть присоединены к пористым материалам. Кроме того, такие иммобилизованные ферменты могут быть на стержнях, которые размешивают агенты, на стенках трубочек или капилляров, или на стенках контейнеров, таких, как камера инкубатора.

В другом аспекте настоящего изобретения, не-ЕСЬ-анализ, типа описанного выше, может быть реализован на РМАМ8-аналогах, причем упомянутые РМАМ8-аналоги, отличаются от вышеописанных РМАМ8 в том, что РМАМ8аналоги содержат дискретные домены для проведения не-ЕСЬ-реакций, при этом дискретные домены не обязательно включают некий связывающий реагент и поэтому не обязательно являются связывающими доменами. Такие РМАМ8-аналоги имеют дискретные домены для проведения реакций и изготавливаются так, чтобы препятствовать распространению и/или диффузии текучей среды, прикладываемой к дискретным доменам. В одном варианте изобретения домены являются либо гидрофобными, либо гидрофильными относительно окружающих областей на поверхности подложки, что способствует удерживанию реакционной среды и/или образца на дискретных доменах. Использование лунок, нанесение реакционной среды или образца на войлоки или пористые материалы, осаждение и осушка реакционной среды или образца на гелях, пленках и т. д., могут применяться в целях предупреждения растекания и/или диффузии. Каждый из таких дискретных доменов, в диаметре или по ширине, составляет менее 1 мм предпочтительно от 50 нм до 1 мм, наиболее предпочтительно от 1 микрона до 1 мм. Такая же или другая реакционная среда может осаждаться на каждый из дискретных доменов перед нанесением образца, или каждое нанесение образца может предшествовать осаждению реакционной среды.

В предпочтительном аспекте использования РМАМ8-аналогов, для проведения не-ЕСЬанализа, капли реакционной среды помещаются на множество дискретных доменов, предпочтительней подаются одновременно из матрицы микрофлюидальных подающих трубочек; и затем, необязательно, для увеличения стабильности и/или защиты капли, поверх реакционной среды наносят более вязкий раствор (например, масло) или, альтернативно, между дискретными доменами; и затем образец, содержащий аналит, который должен обнаруживаться или измеряться, наносят на каждый домен, либо дискретным нанесением на каждый дискретный домен, либо целиком, путем обработки жидким образцом всей поверхности РМАМ8 аналога, содержащего домены. После прохождения любой реакции в связующих доменах, результаты регистрируют при помощи системы сообщения и детектирования, выбранной из числа известных в технике.

Изобретение далее описывается на следующих примерах, которые никоим образом не ограничивают объем изобретения.

6. Примеры.

6.1. Приготовление МАВ РМАМ8-поверхности с помощью микроштамповки.

Экспонированный и проявленный фотошаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона готовят в соответствии с хорошо известными процедурами в конфигурации двухмерной матрицы. Смесь 10:1 эластомера силикона 8ΥΣ6ΛΚΌ 184 (поли(диметилсилоксан), доступный от фирмы Эо\у Согшпд) и соответствующего 8Υ^СΛК^ 184 отверждающего агента разливают по модели и отверждают. Полимеризированный 8УБСАКО 184 тщательно удаляют с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования гидрофильным ОН-концевым алкалтиолом 8Н(СН₂)₁₁ (ОСН₂СН₂)₆ОН, в растворе этилового спирта (110 миллимоль), автоматически приводят в точечный совмещенный контакт с наведенной золотой поверхностью, и удаляют. Подложка затем промывается за несколько секунд (например, 2-10 с) с помощью раствора гидрофобного алкан тиола с группой СН3 на конце, 8Н(СН2)10СН3 (1-10 миллимоль в этаноле) (Китаг и соавт., см. выше, и Рпте и соавт., 8аепсе, 252, стр. 1164-7). Готовую поверхность потом слегка осушают потоком азота. Капиллярную матрицу, содержащую гидрофильные растворы, затем автоматически приводят в точечный совмещенный контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами 8Н(СН2)11 - (ОСН2СН2)6ОН. Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит моноклональные антитела (МАВ), специфичные к исследуемому аналиту, способного ковалентно связываться с реакционноспособной группой ОН на гидрофильных доменах посредством амидной связи.

6.2. Приготовление микроштамповкой поверхности РМАМ8 с МАВ и нуклеиновой кислотой.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона готовят в соответствии с хорошо известными процедурами в конфигурации двухмерной матрицы. Смесь 10:1 эластомера силикона 8¥Ь6АКВ 184 и соответствующего 8Υ^СΛК^ 184 отверждающего агента разливают по модели и отверждают. Полимеризованный 8Υ^СΛК^ 184 тщательно удаляют с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования гидрофильным алкантиолом с группой ОН на конце, 8Н(СН2)11 - (ОСН2СН2)6ОН в растворе этилового спирта (1-10 миллимоль), автоматически приводят в точечный совмещенный контакт с наведенной золотой поверхностью и удаляют. Подложку затем промывают за несколько секунд (например, 2-10 с) раствором гидрофобного алкантиола с группой СН3 на конце, 8Н(СН₂)1₀СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле) (Китаг и соавт., см. выше, и Рпшс и соавт., 8с1епсе 252, стр. 1164-7). Полученную поверхность потом слегка осушают потоком азота. Капиллярную матрицу, содержащую гидрофильные растворы, затем автоматически приводят в точечный совмещенный контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами 8Н(СН₂)_П - (ОСН₂СН₂)₆ОН. Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит антитела или модифицированные нуклеиновые кислоты, специфичные к исследуемому аналиту, способному ковалентно связываться с реакционноспособной группой ОН на гидрофильных доменах посредством амидных связей.

6.3. Приготовление поверхности РМАМ8 травлением.

Чистая золотая поверхность подвергается воздействию гидрофильного алкантиола с группой ОН на конце, 8Н(СН₂)_П -(ОСН₂СН₂)₆ОН (Рпте и соавторы, 8с1епсе 252, стр. 1164-1167) в растворе этилового спирта (1-10 миллимоль). Линейная матрица тонко заточенных путем травления инструментов автоматически приводится в оптически совмещенный контакт с наведенной золотой поверхностью, и линейная матрица используется для травления в обоих направлениях Х и Υ поверхности, создавая двухмерную решетчатую матрицу 8Н(СН₂)_П (ОСН2СН2)6ОН-доменов. Подложку затем промывают за несколько секунд (например, 2-10 с) с раствором гидрофобного 8Н(СН₂)₁₀СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле). Готовую поверхность потом слегка осушают потоком азота. Капиллярную матрицу, содержащую гидрофильные растворы, затем автоматически приводят в точечный совмещенный контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами 8Н(СН₂)_П -(ОСН₂СН₂)₆ОН. Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит антитела или нуклеиновые кислоты, специфичные для исследуемого аналита, способного ковалентно связываться с реактивной группой ОН на гидрофильных доменах.

6.4. Сэндвич-анализ на РМАМ8-поверхности.

Вышеописанным способом делается прозрачная РМАМ8-поверхность, которая является в значительной степени прозрачной вместе с конфигурированной комплексной матрицей первичных антител, связанных с поверхностью. Подложку, электроды для анализа, используемую однородную поверхность выбирают так, чтобы они были прозрачными. Поверхность РМАМ8 потом подвергают воздействию образца раствора, в котором предполагается содержание аналита, представляющего интерес, который следует анализировать. Образец потом смывают, оставляя на поверхности аналиты, связанные антителом, РМАМ8-поверхность потом подвергают воздействию раствора, содержащего вторые ЕСЬ-меченые антитела, специфичные к связанным на поверхности аналитам. Этот раствор потом смывают с РМАМ8поверхности, оставляя ЕСЬ-меченые вторые антитела, связанные с доменами, в которых находится аналит.

Анализ электрода защищается сменным барьером, чтобы предотвратить преждевременный контакт образца с поверхностью электрода, чтобы избежать эффектов загрязнения. Барьер потом удаляется и массив электродов, который смочен буферным раствором анализа, приводится в соответствующий контакт с РМАМ8поверхностью. Матрица электродов соединяется с электронным генератором импульсов напряжения, и потенциал прикладывается к парам рабочий электрод/противоположный электрод. Затем ПЗС выводит информацию об испускаемом свете, и сигнал посылается в микропроцессор, который преобразует сигнал в желаемую форму считанных данных.

Считанные данные сравнивают со считанными данными, полученными при использовании контрольных образцов в виде известных количеств исследуемого аналита для вычисления фактического количества аналита.

6.5. Анализ на первой и второй поверхностях РМАМ8.

Прозрачная РМАМ8-поверхность делается, как описано выше, с конфигурированным комплексным массивом первых антител, связанных с поверхностью. Поверхность РМАМ8 потом подвергают воздействию образца раствора, в котором предполагается содержание исследуемого аналита, который следует анализировать. Образец потом промывают, оставляя на поверхности аналиты, связанные антителом.

Вторую РМАМ8, под защитным покрытием, изготавливают чередованием гидрофобной/гидрофильной конфигурации, на которой конфигурированы микрокапли множества вторых антител, помеченных ЕСЬ-меткой.

Барьер, предохраняющий вторую поверхность РМАМ8, и находящийся в задвижке с первой поверхностью РМАМ8, вынимают, и на задвижку со связывающими доменами первых антител на первой РМАМ8 наносят микрокапли. Вторая РМАМ8 поднимается вместе с электродной матрицей и приводится в соответствующий контакт с первой поверхностью РМАМ8.

Матрица электродов соединяется с электронным генератором импульсов потенциала, и потенциал прикладывается к парам рабочий электрод/противоположный электрод. Затем фотоумножитель ФЭУ выводит информацию об испускаемом свете, и сигнал посылается в микропроцессор, который преобразует сигнал в желаемую форму считанных данных.

Считанные данные сравнивали со считанными данными, полученными при использовании контрольных образцов в виде известных количеств исследуемого аналита, и вычисляли фактическое количество аналита.

6.6. Анализ нуклеиновой кислоты на РМАМ8-поверхности.

Прозрачную РМАМ8 поверхность изготавливали, как описано выше, с конфигурированной мультиспецифической матрицей одноцепочечных нуклеиновокислотных зондов, связанных с поверхностью. Зонды являются комплементарными 5' области исследуемого нуклеиновокислотного аналита. Поверхность РМАМ8 потом подвергают воздействию образца раствора, в котором предполагается содержание исследуемого нуклеиновокислотного аналита, способного к гибридизации, причем образец предварительно был денатурирован, то есть, был обработан так, чтобы исследуемый аналит был одноцепочечным. Образец потом промывали, оставляя гибридизированные аналиты на поверхности. Поверхность РМАМ8 затем подвергали воздействию раствора, содержащего вторичные ЕСЬ-меченые нуклеиновокислотные зонды, специфичные для 3'-конца нуклеиновокислотных аналитов, связанных на поверхности. Этот раствор затем смывается с РМАМ8 поверхности, оставляя ЕСЬ-меченые нуклеиновокислотные зонды, связанные с доменами, в которых присутствует аналит.

Барьер, предохраняющий вторую поверхность РМАМ8 и находящийся в задвижке с первой поверхностью РМАМ8, вынимали и на задвижку со связывающими доменами первых антител на первой РМАМ8 наносили микрокапли. Вторая РМАМ8 поднимается вместе с электродной матрицей, и приводится в соответствующий контакт с первой поверхностью РМАМ8.

Матрицу электродов соединяли с электронным генератором импульсов потенциала, и потенциал прикладывали к парам рабочий электрод/противоположный электрод. Затем ПЗС выводит информацию об испускаемом свете, и сигнал посылается в микропроцессор, который преобразует сигнал в желаемую форму считанных данных.

Считанные данные сравнивают со считанными данными, полученными при использовании контрольных образцов в виде известных количеств исследуемого аналита, и вычисляют фактическое количество аналита.

6.7. Сравнительный анализ на РМАМ8поверхности с фотоумножителем в качестве детектора.

Прозрачную РМАМ8-поверхность изготавливали, как описано выше, с конфигурированной мультиспецифической матрицей первых антител, специфических к исследуемому аналиту, связанному с поверхностью. РМАМ8поверхность затем подвергали воздействию образца раствора, который нужно анализировать, и который является смесью образца, в котором предполагается содержание исследуемого ана лита, и известного количества ЕСЬ-меченых молекул, конкурентных с исследуемым аналитом относительно закрепления с антителами. Образец потом смывали, оставляя на поверхности аналиты, связанные антителом, и/или меченые конкурентные связывающие вещества на поверхности.

Матрица электродов защищается сменным барьером, чтобы предотвратить контакт образца с поверхностью электрода, во избежание эффектов загрязнения. Барьер затем удаляли и матрицу электродов, смоченную буферным раствором анализа, приводили в соответствующий контакт с РМАМ8 -поверхностью.

Матрицу электродов соединяли с электронным генератором импульса потенциала и потенциал прикладывается к парам рабочий электрод/противоположный электрод. Затем фотоумножитель ФЭУ выводит информацию об испускаемом свете, и сигнал посылается в микропроцессор, который преобразует сигнал к желаемому виду считанных данных.

Считанные данные сравнивали со считанными данными, полученными при использовании контрольных образцов в виде известных количеств исследуемого аналита, и вычисляли фактическое количество аналита.

6.8. Сравнительный анализ на РМАМ8-поверхности с ПЗС детектором.

Прозрачную РМАМ8-поверхность изготавливали, как описано выше, с конфигурированной мультиспецифической матрицей первых антител, связанных с поверхностью. Поверхность РМАМ8 потом подвергали воздействию образца раствора, в котором предполагается содержание исследуемого аналита, который следует анализировать. Образец потом смывали, оставляя на поверхности аналиты, связанные антителом.

Вторую РМАМ8 под защитным покрытием изготавливали с чередованием гидрофобной/гидрофильной конфигурации, на которой конфигурированы микрокапли множества известного количества ЕСЬ-меченых молекул, конкурирующих с исследуемым аналитом.

Барьер, предохраняющий вторую поверхность РМАМ8 и находящийся в задвижке с первой поверхностью РМАМ8 вынимали и на задвижку со связывающими доменами первых антител на первой РМАМ8 наносили микрокапли. Вторую РМАМ8 поднимали вместе с электродной матрицей, и приводили в соответствующий контакт с первой поверхностью РМАМ8. Матрицу электродов соединяли с электронным генератором импульса потенциала, и потенциал прикладывали к парам рабочий электрод/противоположный электрод. Затем ПЗС выводит информацию об испускаемом свете, и сигнал посылается в микропроцессор, который преобразует сигнал в желаемую форму считанных данных.

Считанные данные сравнивали со считанными данными, полученными при использовании контрольных образцов в виде известных количеств исследуемого аналита, и вычисляли фактическое количество аналита.

6.9. Приготовление МАВ РМАМЗ-поверхности микроштамповкой с алкантиолом ЗН(СН2)юСН₃.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами в конфигурации двухмерной матрицы. Смесь 10:1 силиконового эластомера ЗУЬСАКО 184 (поли(ди-метилсилоксан). доступный от фирмы Эо\у Согшпд) и соответствующего ЗУЬСАКЭ 184 отверждающего агента разливали по шаблону и отверждали. Полимеризированный ЗУЬСАКО 184 тщательно удаляется с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования гидрофильным алкантиолом с ОН на конце, ЗН(СН₂)цОН в растворе этилового спирта (1-10 миллимоль). автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенной золотой поверхностью и удаляли. Субстрат затем промывали за несколько секунд (например, 2-10 с) раствором гидрофобного алкантиола с группой СН₃ на конце, ЗН(СН₂)_!0СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле) (Китаг и соавт., см. выше). Готовую поверхность затем слегка осушали потоком азота. Капиллярную матрицу, содержащую гидрофильные растворы, затем автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами ЗН(СН₂)₁₁ОН. Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит моноклональные антитела (МАВ). специфические для исследуемого аналита, способного ковалентно связываться с реакционно-активной группой ОН на гидрофильных доменах посредством амидной связи.

6.10. Изготовление РМАМЗ-поверхности с МАВ и нуклеиновой кислотой, путем микроштамповки алкантиолом ЗН(СН₂)₁₀СН₃.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами в конфигурации двухмерной матрицы. Смесь 10:1 силиконового эластомера ЗУЬСАКО 184 и соответствующего ЗУЬСАКО 184 отверждающего агента разливали по модели и отверждали. Полимеризированный ЗУЬСАКО 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования гидрофильным алкантиолом с группой ОН на конце, ЗН(СН₂)₁₁ОН в растворе этилового спирта (1-10 миллимоль). автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенной золотой поверхностью, и удаляли. Субстрат затем промывали за несколько секунд (например, 2-10 с) раствором гидрофобного алкантиола с группой СН3 на конце, ЗН(СН₂)1₀СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле) (Китаг и соавт., см. выше). Готовую поверхность потом слегка осушали потоком азота. Капиллярную матрицу, содержащую гидрофильные растворы, затем автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами ЗН(СН₃)₁₁ОН, для помещения специфических антител или модифицированных нуклеиновых кислот в каждый домен. Каждый капилляр в капиллярном массиве содержит антитела или модифицированные нуклеиновые кислоты, специфичные для исследуемого аналита, способного ковалентно связываться с реакционноспособной группой ОН на гидрофильных доменах посредством амидных связей.

6.11. Приготовление РМАМЗ-поверхности, использующей соединитель стрептавидин-биотин.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами в конфигурации двухмерной матрицы. Смесь 10:1 силиконового эластомера ЗУЬСАКО 184 и соответствующего ЗУЬСАКО 184 отверждающего агента разливали по шаблону и отверждали. Полимеризированный ЗУЬСАКО 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования смеси меркаптоундеканола и 12-меркапто (8-биотинамид-3.6-диоксаоктил)додеканамида, в которой молярная доля биотинированного тиола составляет 0.1 (см. Зршке и соавт., 1993. Ьапдтшг. 9. стр. 1821-5 и Зршке и соавт. 1993. ГСйет.Рйук.. 99(9). стр. 7012-9).). Подложку затем промывали за несколько секунд (например, 2-10 с) раствором гидрофобного алкантиола с группой СН3 на конце, ЗН(СН₂)1₀СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле) (см. Китаг и соавт., выше, В1еЬиуск. νΐιίΕ 81бе8). Готовую поверхность потом слегка высушивали потоком азота. Капиллярную матрицу, содержащую раствор стрептавидина в каждом капилляре, затем автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенной поверхностью. Каждый капилляр в капиллярном массиве выстраивали и приводили в контакт с биотинированным доменом, и капиллярный массив удаляли, а поверхность промывали. Вторую капиллярную матрицу, содержащую множество биотинированных антител и биотинированных растворов нуклеиновых кислот, потом автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенной поверхностью, для помещения специфических антител и нуклеиновых кислот на каждый домен.

6.12. Изготовление единичной поверхности с МАВ.

Электродную матрицу со встречноштыревыми парами рабочий электрод/ противоположный электрод на золоте на кремниевой поверхности изготавливали способами, извест ными в технике (например, см. Китаг и соавт., выше). В этом примере электродная матрица и матрица дискретных связывающих доменов находятся на той же самой поверхности подложки. Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами в конфигурации рабочих электродов. Смесь 10:1 эластомера силикона ЗУЬСАКЭ 184 (поли(диметилсилоксан (ΡΌΜ8), доступный от фирмы Ωο\ν Согшид) и соответствующего 8УЬСАКЭ 184 отверждающего агента разливали по шаблону и отверждали. Полимеризированный 8УЬСАКЭ 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования гидрофильным алкантиолом с группой ОН на конце, 8Н(СН₂)_п - (ОСН₂СН₂)₆ОН в растворе этилового спирта (1-10 миллимоль), автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с согласованными рабочими электродами на золотой поверхности, и удаляли. Капиллярную матрицу, содержащую гидрофильные растворы, затем автоматически приводили в точечный совмещенный контакт путем выстраивания капилляров с 8Н(СН₂)_п - (ОСН₂СН₂)₆ОН доменами на поверхности электродной матрицы, для помещения специфического антитела на каждый домен. Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит моноклональные антитела (МАВ), специфичные для исследуемого аналита, способного ковалентно связываться с реакционными группами ОН на гидрофильных доменах посредством амидной связи.

6.13. Анализ, проводимый на единичной поверхности с МАВ.

Изготавливали подложку, как описано в разделе 6.12., выше. Штамп ΡΌΜ8 изготавливали, как предварительно описывалось, из шаблона фоторезиста, конфигурированного в виде колец, каждое из которых независимо окружает чертой пару рабочий электрод/противоположный электрод. Поверхность электродной матрицы потом подвергали воздействию образца, который нужно анализировать, промывали смесью ЕСЬ-меченых вторых антител, а затем промывали анализируемым буферным раствором, содержащим трипропиламин. Штамп ΡΌΜ8 потом наводили и приводили в совмещенный контакт, выстраивая кольца штампа ΡΌΜ8 так, чтобы обводить границей и задавать отдельные элементы объема буферного раствора для анализа над каждой электродной парой. Перенапряжение прикладывали к электродным парам так, чтобы освободить монослой с поверхности, экспонирующей рабочий электрод ЕСЬ-меченым вторым антителом. Затем фотоумножитель выводит информацию об испускаемом света, и сигнал посылается в микропроцессор, который преобразует сигнал в желаемую форму считанных данных.

Считанные данные сравнивали со считанными данными, полученными при использовании контрольных образцов в виде известных количеств исследуемого аналита, и вычисляли фактическое количество аналита.

6.14. Приготовление одиночной поверхности с рабочими и противоположными электродами.

Электродную матрицу взаимно перемежающихся пар рабочий электрод/противоположный золотой электрод с золотыми связывающими доменами в промежутках между встречно-штыревыми электродами на золоте на кремниевой поверхности изготавливали способами, известными в технике (например, см. Китаг и соавт., выше). В этом примере, электродная матрица и массив дискретных связывающих доменов находятся на той же самой поверхности подложки. Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрон, готовили в соответствии с хорошо известными процедурами в конфигурации связывающих доменов в промежутках между встречно-штыревыми электродными парами. Смесь 10:1 силиконового эластомера 8УЬСАКЭ 184 (поли(диметилсилоксан)(Ρ^Μ8), доступный от фирмы Ωο\ν Согшид) и соответствующего 8УЬСАКЭ 184 отверждающего агента разливали по шаблону и отверждали. Полимеризированный 8УЬСАКЭ 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования гидрофильным алкантиолом с группой ОН на конце, 8Н(СН₂)_п - (ОСН₂СН₂)₆Он в растворе этилового спирта (1-10 миллимоль), автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенными золотыми связывающими доменами на поверхности электродной матрицы, и удаляли. Капиллярный массив, содержащий гидрофильные растворы, затем автоматически приводили в точечный совмещенный контакт путем центрирования капилляров с 8Н(СН₂)_п (ОСН₂СН₂)₆ОН доменами на поверхности электродной матрицы для помещения специфических антител на каждый домен.

Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит антитела, специфичные для исследуемого аналита, способного ковалентно связываться с реакционными группами ОН на гидрофильных доменах посредством амидной связи.

6.15. Анализ, проводимый на отдельной поверхности с рабочими и противоположными электродами

Поверхность подложки, как описано в разделе 6.1 4. выше, изготавливали описанными способами. Приготовленную поверхность подвергали воздействию образца, который нужно анализировать, промывали смесью ЕСЬмеченых вторых антител, а затем промывали анализируемым буферным раствором, содержащим трипропиламин. Матрицу электродов соединяли с электронным генератором потен95 циала волновой формы, и потенциал прикладывали к парам рабочий электрод/противоположный электрод. Затем фотоумножитель выводит информацию об испускаемом свете, и сигнал посылается в микропроцессор, который преобразует сигнал в желаемую форму считанных данных.

Считанные данные сравнивали со считанными данными, полученными при использовании контрольных образцов в виде известных количеств исследуемого аналита, и вычисляли фактическое количество аналита.

6.16. Приготовление поверхности с противоположными электродами.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона готовили в соответствии с хорошо известными процедурами в конфигурации двухмерного массива. Смесь 10:1 силиконового эластомера 8УЬСАКЭ 184 и соответствующего 8УЬСАКЭ 184 отверждающего агента разливали по шаблону и отверждали. Полимеризированный 8УЬСАКЭ 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования гидрофильным алкантиолом с группой ОН на конце, 8Н(СН₂)_П (ОСН₂СН₂)₆ОН в растворе этилового спирта (110 миллимоль), автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенным конфигурированным противоположным электродом и квадратом связывающим доменом на золотой поверхности, и удаляли. Конфигурированная золотая поверхность состоит из адресуемых кольцевых противоположных электродов, охватывающих связывающие домены, в которых штамповали 8Н(СН₂)_П - (ОСН₂СН₂)₆ОН. Промежуток или разделяющее пространство существует между каждым золотым противоположным электродом и каждой квадратной золотой подложкой для каждого монослойного связывающего домена. Капиллярную матрицу, содержащую растворы связывающегося реагента, затем автоматически приводили в точечный совмещенный контакт с наведенной поверхностью, совмещающей капилляры с доменами 8Н(СН₂)_п - (ОСН₂СН₂)₆ОН, для помещения специфических антител или нуклеиновых кислот на каждом домене. Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит антитела или нуклеиновые кислоты, специфичные для исследуемого аналита, способного ковалентно связываться с реакционными группами ОН на гидрофильных доменах.

6.17. Анализ, проводимый на одиночной поверхности с рабочими и противоположными электродами на различных поверхностях.

Поверхность подложки, описанную выше в примере 6.16, подвергали воздействию раствора анализируемого образца. Поверхность подложки потом промывали и обрабатывали раствором, содержащим множество ЕСЬ-меченых моноклональных антител, или ЕСЬ-меченых нуклеи новых кислот различной специфичности, а затем промывали буферным раствором для анализа, содержащим трипропиламин. Матрицу прозрачных адресуемых рабочих электродов изготавливали с каждым рабочим электродом в массиве, соответствующем дискретной связывающей области домен/ противоположный электрод на подложке, как описано выше в разделе 6.16. Две подложки смачивали буферным раствором для анализа и автоматически приводили в совмещаемый согласующийся контакт. Электродные матрицы соединяли с электронным генератором импульсов потенциала формы, и потенциал прикладывали к выстроенным парам рабочий электрод/противоположный электрод, создающим поле потенциала между двумя подложками.

Затем ПЗС выводит информацию об свете, испускаемом через прозрачный рабочий электрод, и сигнал посылается в микропроцессор, который преобразует сигнал в желаемую форму считанных данных.

Считанные данные сравнивали со считанными данными, полученными при использовании контрольных образцов в виде известных количеств исследуемого аналита, и вычисляли фактическое количество аналита.

6.18. изготовление СС (дисперсной) тонковолокнистой прослойки путем вакуумной фильтрации.

Была приготовлена водная суспензия СС фибрилл, с отношением 1 мг фибрилл/1 мл раствора путем смешивания 0,1 мас.% СС фибрилл/деионизованной воды. СС фибриллы были диспергированы (большие агрегаты микронного масштаба были диспергированы в маленькие агрегаты или отдельные фибриллы) в суспензии, посредством погружения ультразвукового рупорного излучателя мощностью 400 Вт в суспензию на время от 10 мин до 1 ч. Степень дисперсии проверяли с помощью оптической микроскопии.

Мембрана нейлонового фильтра (с размером пор 0,47 мкм, диаметром 25 мм) была помещена в стеклянный подогнанный фильтр диаметром 25 мм. Диспергированную суспензию фибрилл фильтровали через установку мембрана/фильтр путем вакуумной фильтрации (фиг. 23А). Аликвоты суспензии (5 мл) были растворены в 20 мл деионизованной воды, затем фильтровались через установку мембрана/фильтр. Средняя прослойка составляла приблизительно 0,25 - 0,3 г/куб.см, прослойка приблизительно размером 100 мкм требовала 6 аликвот.

Вакуумную фильтрацию продолжали до тех пор, пока вся вода дисперсии не была удалена из прослойки (по визуальной оценке). Прослойку снимали (вручную) непосредственно с мембраны фильтра.

Затем прослойку осушали в сушильном шкафу приблизительно 10-15 мин при 60°С.

Прослойку разрезали, перфорировали или иначе разделяли на части для использования.

6.19. Изготовление тонковолокнистой прослойки на подложке из металлического сита путем испарения

Была приготовлена водная суспензия СС фибрилл, с отношением 1 мг фибрилл/1 мл раствора путем смешивания 0,1 мас.% СС фибрилл/деионизованной воды. СС фибриллы были диспергированы (большие агрегаты микронного масштаба были измельчены в маленькие агрегаты или отдельные фибриллы) в суспензии, посредством погружения ультразвукового рупорного излучателя мощностью 400 Вт в в суспензию на время от 10 мин до 1 ч. Степень дисперсии проверялась с помощью оптической микроскопии.

Часть площадью в 1 см³ сита из нержавеющей стали (номер 400) помещали на бумажный фильтр диаметром 25 мм. Аликвоту суспензии (5 мл) наносили пипеткой на поверхность сита фильтровальной бумаги. Для испарения воды суспензию оставляли либо при комнатной температуре, либо в нагретом сушильном шкафу.

Как только тонковолокнистая прослойка высыхала, добавляли дополнительные аликвоты. Тонковолокнистую прослойку и экран снимали с фильтровальной бумаги как единое целое. Прослойку разрезали, перфорировали или иначе разделяли на части для использования.

6.20. Иммобилизация авидина на фибриллах, несущих функциональные ΝΗ8сложноэфирные группы.

Фибриллы, дериватизированные группой СООН (от фирмы Нурепоп Са(а1у8(8) суспендировали в безводном диоксане при ~10 мг/мл при постоянном размешивании. Добавляли 20кратный молярный избыток Ν-гидроксисукцинимида и ему давали раствориться. Затем добавляли 20-кратный молярный избыток этилдиаминопропилкарбодиимида (ЕОАС), и смесь размешивали в течение 2 ч при комнатной температуре.

После размешивания супернатант отсасывали, а твердые части промывались три раза безводным диоксаном, один раз безводным метанолом, и фильтровали на 0,45 мкм полисульфоновой мембране. Фильтрат промывали дополнительным количеством метанола и помещали в стеклянный сосуд под вакуумом до тех пор, пока не наблюдалось дальнейшее уменьшение массы.

Фибриллы из ΝΗ8 [Ν-гидрокси сукцинимид] - сложных эфиров в количестве 10,4 мг промывали раствором РВ8 -1 (~70 миллимоль фосфата, 150 миллимоль №1С1) (реагент ОШОЕN 402-130-01, рН=7,8, от компании ЮЕЩ. Промытые фибриллы были суспендированы в 2.3 мл раствора авидина (8,3 мг авидин /1 мл РВ8-1).

Суспензию оставляли при комнатной температуре в течение 1,5 ч, при постоянном вращении колбы, чтобы обеспечить взбалтывание.

После 1,5 ч суспензию оставляли на 16 ч при 4°С, а затем переносили в условия комнатной температуры, промывали с РВ8-1, и оставляли на хранение 4°С в виде суспензии в РВ8-1.

6.21 . Иммобилизация моноклонального антитела (анти-АРР) на углеродных фибриллах

Углеродные фибриллы, функционализированные посредством ΝΗδ-сложных эфиров, получали, как описано в примере 6.20.

Фибриллы с ΝΗδ-сложными эфирами в количестве 14 мг были смешаны с 500 мл буферного раствора РВ8-1. Смесь подвергали воздействию ультразвука в течение 20 мин, пока она не становилась вязкой суспензией. Потом добавляли еще 500 мл буферного раствора РВ81.

Анти-ЛРР (альфафето-протеин-АФП) антител в общем количестве 1,6 мг в 80 мл раствора РВ8-1 было добавлено к вышеупомянутой суспензии. Смесь оставляли при комнатной температуре в течение 2,5 ч для прохождения реакции.

Добавляли 6 мл буферного раствора РВ81, и реакционную смесь центрифугировали при 4°С, в течение 5 мин. Супернатант удаляли пипеткой. Эту процедуру повторяли 9 раз.

После окончательного промывания, супернатант удаляли, и продукт фибриллы-анти-АФП хранили при 4°С.

6.22. Циклические вольтамперограммы тонковолокнистых прослоек: сравнение тонковолокнистой прослойки с электродом из золотой фольги.

Были измерены циклические вольтамперограммы 6 миллимолей Ее^3+/2+(С^₆ в 0,5 моль К₂8О₄. На фиг. 30А приведены СУ-циклические вольтамперограммы для плоской тонковолокнистой прослойки из СС (диспергированного связанного углерода), которые были измерены при 0,10 мА/см при 10,25 и 50 мВ/с. Прослойка была изготовлена, как описано в примере 6,18. На фиг. 30Б приведены циклические вольтамперограммы, которые были измерены для электрода из золотой фольги при 0,05 мА/см при 10,25 и 50 мВ/с. Все потенциалы приведены в вольтах относительно Ад/АдС1.

6.23. Электрохимические свойства электродов тонковолокнистой прослойки: сравнение максимального анодного тока с толщиной прослойки.

Были измерены циклические вольтамперограммы 6 миллимолей Ре^3+/2+(С^₆ в 0,5 моль К₂8О₄ для тонковолокнистых прослоек одинаковой геометрической площади (0,20 см²), но с различными толщинами. Анодный максимальный ток (фиг. 31) увеличивается с увеличением толщины прослойки для толщин в диапазоне от 24 мкм до 425 мкм. Для каждой толщины анодный максимальный ток также увеличился с уве

100 личением скорости сканирования (для скоро стей в диапазоне от 10 мВ/с до 150 мВ/с). Скорость увеличения максимального анодного тока, как функция толщины, также увеличивается с увеличением толщины. Тонковолокнистые прослойки, которые были толщиной 24 мкм, проявляли себя подобно электродам из золотой фольги.

6.24. Неспецифическое связывание белков с фибриллами.

Неспецифическое связывание белков с углеродными фибриллами (сс) было измерено следующим образом:

ί) раствор Ви (бипиридин)₃ ²⁺ (ТАС1)меченых белков подвергали воздействию известного количества углеродных фибрилл, пока не было достигнуто равновесие;

ίί) раствор меченого белка/фибриллы был центрифугирован и супернатант был собран, и

ш) количество меченого белка, остающегося в супернатанте, анализировали, используя электрохемилюминесценцию (ЕСЬ).

Чтобы получить кривую, изображенную на фиг. 32, анти-СЕА антитело, связанное с дериватизированной меткой ТАС1 (антитело к канцеро-эмбриональному антигену, связанное с дериватизированной ЕСЬ-метки ТАС1) в количестве 3 микрограмм/мл, было добавлено к серийным разведениям СС (плоских) фибрилл в 0,1 моль калиево-фосфатно-буферного раствора с рН 7. Фибриллы были удалены путем центрифугирования с помощью центрифуги, после встряхивания в течение 20 мин. ЕСЬ-анализ, в котором измеряли количество белка (несвязанного), остающегося во всплывающей части, проводили в анализаторе ОН IСЕН 1,5 (компания 1СЕЫ) на аликвотах супернатанта реакционной смеси, разбавленной 5 раз с буферным раствором анализа ОВ1СЕЫ. Уменьшение ЕСЬсигнала (относительно ЕСЬ-сигнала для объекта реакционной смеси, которая не подвергалась воздействию фибрилл) происходит в результате увеличения связывания белка, меченого дериватизированной меткой ТАС1, когда присутствовали более высокие концентрации углеродных фибрилл.

6.25. Уменьшение неспецифического связывания белков с фибриллами с помощью моющих средств/поверхностно-активных веществ.

Используя способ, описанный в примере 6.24., было проанализировано влияние поверхностно-активного вещества на связывание белка с фибриллами. Моющее средство ТгПоп Х-100 было добавлено к антителу против СЕА, связанному со смесью дериватизирования ТАС1/ фибрилла, раствор инкубировали в течение 20 мин, пробирки центрифугировали с помощью центрифуги, и аликвоты супернатанта, разбавленные 5-кратно буферным раствором ОВЮЕЫ анализа, были проанализированы с помощью

ЕСЬ. Результаты показаны ниже в таблице и на фиг. 33.

Номер трубки	[ТгПоп X- 100], млн.д.	Интенсивность пика	Белок ТАС1 мкг/мл	[СР], млн. д.
19	1674	1611	2,65	52
18	837	1634	2,65	52
17	418	1697	2,65	52
16	209	1583	2,65	52
15	105	1772	2,65	52
14	52	1463	2,65	52
13	26	627	2,65	52
12	13	23	2,65	52

На фиг. 33 показана кривая, которая была получена путем построения графика ЕСЬинтенсивности белка в растворе, меченого дериватизированной меткой ТАС1, в зависимости от концентрации ТгПоп Х-100. Больший ЕСЬсигнал соответствует большему количеству белка, меченого дериватизированной меткой ТАС1, в супернатанте, что соответствует меньшему связыванию белка, меченого дериватизированной меткой ТАС1, с фибриллами. Концентрация ТгПоп Х-100, которая составляла в пределах 10 млн.д. до 100 млн.д., снижала степень связывания; дальнейшее увеличение концентрации от 100 до 2000 частей на миллион не снижало степень связывания.

6.26. ЕСЬ свободной метки ТАС в растворе с электродом тонковолокнистой прослойки.

Тонковолокнистую прослойку, приготовленную так же, как в примере 6.18, устанавливали в монтажном участке 3403 держателя рабочего электрода 3401 крепления фибрилльной ячейки, показанного на фиг. 34. Держатель 3401 вставляли (скользящей посадке) в основание отсека 3400 электрохимической ячейки. Контрольный электрод с 3 молями Ад/АдС1 (Сурп.15 # ЕЕ008) был установлен в отсек электрохимической ячейки через подающее отверстие 3402 ячейки. Ячейку заполняли буферным раствором для анализа (1СЕЫ # 402-005-01, партия #5298) и прикрепляли к дрежателю фотоумножителя (РМТ) 3404. При использовании универсального программирующего устройства ЕС&С РАВС, модель 175, и стабилизатора напряжения/тока ЕС&С, модель 175, потенциал сканировался (изменялся) в диапазоне от 0 В до +3 В относительно Ад/АдС1 со скоростью 100 мВ/с. Сигнал ЕСЬ измерялся фотоумножителем типа Натата18и В5600И-01, на который подавалось напряжение питания 900 В от источникаРасШс 1п51гнтеп15 модель 126 Ео1оте1ег. Аналоговые данные переводились в цифровую форму с частотой 10 Гц схемой аналого-цифрового А/Ό преобразователя С10-ЭА81601, который запускался устройством НЕМ 8пар-Ма§1ег. Фибрилльную ячейку осушали, промывали раствором 1000 пикомоль ТАС1 (1СЕЫ # 402-004-С, партия # 4297) и заполняли раствором 1000 пико-моль ТАС1. Напряжение сканировали так, как с буферным раствором для

101

102 анализа. На фиг. 35 показаны записи сигнала ЕСЬ (измеренного при 297,15К [24,0°С] ±0,2°): 3501 - для буферного раствора анализа, и 3502 для концентрации 1000 пикомоль ТАС1. Темная скорректированная максимальная площадь ЕСЬ составила 22,10 нА с для буферного раствора для анализа, и 46,40 нА с для раствора 1000 пикомоль ТАС1.

6.27. ЕСЬ адсорбированных меченых антител с электродом тонковолокнистой прослойки.

Тонковолокнистые прослойки были изготовлены толщиной 0,0089 см (0,0035 дюйма) из плоских, сс-диспергированных фибрилл способом, описанным в примере 6,18. Затем высушенные прослойки были перфорированы в 3 мм диски и установлены на подложки. Подложки, используемые в этом эксперименте, были изготовлены из полиэфирного листа толщиной 0,076 см (0,030 дюйма), конфигурированного посредством трафаретной печати токопроводящей золотой пастой. Этой токопроводящей золотой пастой формировались противоположный электрод, контрольный электрод, и обеспечивались соединения для рабочего и других электродов. Два диска из тонковолокнистых прослоек были установлены к каждой конфигурированной подложке, используя двустороннюю токопроводящую ленту, содержащую углерод (АбНеккек Векеасй). После установки, диски покрывали 0.5 мл раствора с концентрацией 10 мкг/мл антиТЗН [тиреотропин]антител, присоединенных к дериватизированной метке ТАС1 в деионизованной воде (Ви-ТЗН моно 1:2, 26 июня 95, комп. ЮЕN или 0,5 мкл раствора с концентрацией 10 мкг/мл анти-ТЗН немеченого меткой ТАС1 захваченного антитела в деионизованной воде поли ТЗН 25 июня 95, комп. ЮЕЦ), и высушивали. После осушки, прослойки заполняли буферным раствором для анализа ЮЕК Заполненные прослойки на подложках погружали в базовый инструмент типа ЮЕN Опдеп 1,5, ЕСЬсигнал считывали в интервале от 0 до 4500 мВ, используя скорость сканирования 500 мВ/с. На фиг. 43 приводится сравнение максимальных ЕСЬ-сигналов от прослоек, содержащих ТАС1антитела, 4301, и от прослоек, содержащих не меченые меткой ТАС1 - захваченные антитела 4302.

6.28. ЕСЬ, использующая электрод из тонковолокнистой прослойки для сэндвич - анализа.

Захваченное антитело против АРР [альфафетопротеина АФП] было иммобилизовано на фибриллах, как описано выше. Фибриллы с анти-АФП смывали в деионизованную воду (б1) и повторно суспендировали при плотности 1 мг/мл. Четырехслойная тонковолокнистая прослойка была продуцирована, с использованием вакуумной фильтрации, как описано в примере 6.18. Два миллиграмма фибрилл с антителом против АФП добавляли к 3 мг плоских СС диспергированных фибрилл, и смесь разбавляли в деионизованной воде до полного объема 20 мл. Разбавленную смесь фильтровали через найлоновый фильтр в 0,45 мкм. За этим начальным слоем прослойки потом следовали два средних слоя, каждый из которых состоял из 5 мг плоских СС [связанный углерод] диспергированных фибрилл. Середину прослойки потом покрывали сверху смешанным тонковолокнистым слоем, идентичным начальному слою. В результате этого получали тонковолокнистую прослойку, которая была на ~40% из фибрилл с антителом против АФП на верхней и нижней поверхностях, и на ~100% из плоских фибрилл в середине. Эта смешанная прослойка была высушена под вакуумом и перфорирована на диски диаметром 3 мм. Эти диски потом устанавливали на подложки, как описано в примере 6.27. Сухие, поддерживаемые прослойки из анти-АФП заливали градуировочными растворами АФП- А, С, и Р (комп. ЮЕЦ), и их оставляли для инкубирования на 15 мин при комнатной температуре на вершине стеллажа. После инкубирования поддерживаемые электроды промывали потоком деионизованной воды в течение 10 с, и затем промокали насухо хлопчатобумажной салфеткой. Тонковолокнистые прослойки потом заливали анти-АФП, связанным с антителом, меченому дериватизированной меткой ТАС1 (комп. ЮЕЫ) и оставляли для инкубирования на 15 мин при комнатной температуре на вершине стеллажа. После инкубирования, поддерживаемые электроды промывали потоком деионизованной воды, и затем высушивали путем вытирания. Тонковолокнистые прослойки потом заливали буферным раствором для анализа и анализировали так же, как описано в примере 6.27.

6.29. ЕСЬ-детектирование ТЛ61-меченого авидина на полиакриламидной поверхности

Перекрестносшитый полиакриламидный гель, содержащий ковалентно связанный биотин, был приготовлен путем сополимеризации акриламида, бис-акриламида, и Ы-акрилоил-Ыбиотинил-3,6-диоксаоктан-1,9-диамина (биотин, связанный с акриламидной частью посредством линкера из три(этиленгликоля), используя известные условия (инициирование с персульфатом аммония и ТЕΜЕ^ [тетраметилендиамином]). В этом эксперименте, концентрации трех мономерных звеньев составляли 2,6 молей, 0,065 молей, и 0,023 моля, соответственно (как сообщалось, эти концентрации акриламида и бис-акриламида приводят к гелям с порами, размеры которых меньше, чем большинство белков). Полимеризация раствора, содержащего мономеры между двумя стеклянными пластинами, удерживаемыми на расстоянии приблизительно 0,7 мм друг от друга, ведет к формированию пластин геля той же самой толщины. После того, как реакция полимеризации была закончена, весь не включенный биотин смывали путем пропитывания геля четырехкратной сменой РВЗ [фосфатно-буферного раствора]. Ави

103

104 дин, меченный дериватизированной меткой ТАС1 (где авидин относится к №и1г Авидину модифицированному авидину, т.е. в этом эксперименте использовался модифицированный авидин, разработанный так, чтобы он имел уменьшенный Ν8Β), был связан с поверхностью геля путем пропитки геля в течение 20 мин в растворе, содержащем белок при концентрации 50 мкг/мл в ΡΒ8. Затем избыточный авидин, меченый ТАС1, промывали пропитыванием геля при четырехкратной смене буферного раствора для ЕСЬ-анализа (200 миллимоль фосфата натрия, 100 миллимоль трипропиламина, 0,02% (вес/объем) Т\уссп -20, рН = 7,2). Затем, как показано на фиг. 39, гель (3900) был помещен в контакт с рабочим (3901) и противоположным (3902) золотыми электродами, конфигурированными на стеклянной подложке (3903). Изменение по линейному закону напряжения между двумя электродами от 0,0 до 3,0 В, и обратно до 0,0 В, со скоростью 500 мВ/с, приводит к световому ЕСЬ-сигналу, который измерялся на выходе фотоумножителя (3904), помещенного над гелем (фиг. 40). Гель, приготовленный без включения биотина, содержащего производные акриламида, не давал никакого ЕСЬ-сигнала (рис. 41). Этот сигнал, полученный для биотинсодержащего полимера, свидетельствовал о том, что на поверхности геля присутствует полный монослой белка.

6.30. Сэндвич - иммуноанализ на полиакриламидной поверхности с помощью ЕСЬ.

Перекрестносшитый полиакриламидный гель, содержащий ковалентно связанный биотин, был приготовлен способом, описанным в примере 6.29. Стрептавидин адсорбировали на поверхности геля, чтобы сформировать связывающий домен, способный захватывать молекулы, меченые биотином. Поверхность обрабатывалась раствором, содержащим: трипропиламин, неизвестную концентрацию аналита, антитело, меченое биотином против аналита, и отличающееся меченое ТАС1 ЕСЬ-антитело против аналита. Присутствие аналита вызывает образование комплекса из аналита и двух антител, который затем захватывался на стрептивидиновой поверхности. ЕСЬ-метка, связанная со вторым антителом, присутствующим на поверхности, измерялась так же, как было описано в примере 6.29.

6.31. Многократный ЕСЬ сэндвич- иммуноанализ на полиакриламидных поверхностях, нанесенных на электрод.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами для того, чтобы создать структуру круглых отпечатков, расположенных в матрице. Смесь 10:1 силиконового эластомера 184 8УЬСАКЭ и соответствующего отвердителя 184 8УЬСАКО заливали на оригинал и отверждали. Полимеризованный 8УЬСАКО тщательно сни мали с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп закрашивали путем экспонирования раствором, содержащим тиол с радикалом ОН на конце, Н8(СН₂)_П - (ОСН₂СН₂)₃-ОН в количестве (1-10 миллимоль) в растворе этилового спирта и приводили в контакт с наведенной золотой поверхностью, а затем удаляли. Субстрат промывали в течение нескольких секунд раствором, содержащим тиол Η8 -(СН₂)₁₀ - СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле). Затем готовую поверхность промывали этанолом и высушивали в потоке азота. Обработка поверхности с помощью раствора, содержащего акрилоил хлорид и триэтиламин в диоксане, приводит к функционали-зации доменов с группой ОН на конце акрилатными группами. Капиллярную матрицу, содержащую смеси акриламида, бис-акриламида, Ν-акрилоилсукцинимида, азо-бис-циановалериановой кислоты и антитела, презентирующие аминогруппы, потом приводили в контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами, имеющими акрилатные группы на конце, для помещения форполимерных растворов, содержащих специфические антитела, на каждый домен.

Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит антитела, специфичные для отличающегося от других исследуемого аналита. Экспонирование конфигурированных форполимерных капелек УФ-светом приводит к формированию структурированных гелей на подложке, каждая из которых представляет связывающий домен на поверхности. Анализ проводили посредством обработки подложки смесью аналитов, способных к связыванию с одним, или более связывающихся доменов, присутствующих на поверхностях геля в буферном растворе, содержащем трипропиламин и ЕСЬ-ТАС1 меченые вторые антитела. Связывающие домены (4200, 4201, 4202) (на полиакриламидных каплях (4203) на золотом электроде (4232) потом помещали вплотную к рабочему электроду (от 1ТО-Международной организации торговли)) (4204) как показано на фиг. 42А-Б. Свет, испускаемый из каждого из связывающих доменов, количественно определяли, используя ПЗС камеру (4205), и сравнивали со связывающими доменами в отношении внутренних стандартов, включенных в раствор образца.

6.32. Многократный ЕСЬ конкурентный иммуноанализ на полиакриламидных поверхностях, поддерживаемых на электроде.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона готовили в соответствии с хорошо известными процедурами, чтобы сделать конфигурацию круглых углублений, расположенных в матрице. Смесь 10:1 силиконового эластомера 8УЬСАКО 184 и соответствующего 8УЬСАКО 184 отверждающего агента разливали по модели и отверждали. Полимеризированный 8УЬСАКЭ 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый

105

106 эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования раствором, содержащим тиол с группой ОН на конце, Н8(СН₂)ц - (ОСН₂СН₂)₃ОН в количестве (1-10 миллимоль) в растворе этилового спирта, приводили в контакт с наведенной золотой поверхностью и удаляли. Подложку промывали в течение нескольких секунд раствором, содержащим тиол Н8-(СН₂)₁₀-СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле). Затем готовую поверхность промывали этанолом и сушили потоком азота. Обработка поверхности с помощью раствора, содержащего акрилоилхлорид и триэтиламин в диоксане, приводит к функционализации доменов с группой ОН на конце с акрилатными группами. Капиллярную матрицу, содержащую смеси акриламида, бис-акриламида, Ν-акрилоилсукцинимида, азо-бис-циановалериановой кислоты и антитела, потом приводили в контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами, имеющими акрилатные группы на конце, чтобы поместить предполимерные растворы, содержащие специфические антитела, на каждый домен. Капилляры в капиллярной матрице содержат антитела, специфичные для различных исследуемых аналитов. Экспонирование конфигурированных форполимерных капелек УФ-светом приводит к формированию перекрестносшитых гелей на подложке, каждая из которых представляет связывающий домен на поверхности. Анализ проводили посредством обработки подложки смесью аналитов, способных к связыванию с одним или несколькими связывающими доменами, присутствующими на поверхностях геля в буферном растворе, содержащем трипропиламин и ЕСЬ-ТАС1-меченые аналоги аналитов (то есть, устанавливая условия конкуренции меченых ЕСЬ-ТАС1 и немеченых аналитов за связывание со связывающими доменами). Связывающие домены (4200, 4201, 4202) (на полиакриламидных каплях (4203) на золотом электроде (4232) потом помещали вплотную к рабочему электроду (от 1ТО) (4204) как показано на фиг. 42. Свет, испускаемый из каждого из связывающих доменов, количественно определяли, используя ПЗС камеру (4205), и сравнивали со связывающими доменами для внутренних стандартов, включенных в раствор образца.

6.33. Многократный ЕСЬ-анализ на связывание клеток на полиакриламидных поверхностях, нанесенных на электрод.

Экспонированный и проявленных шаблон фоторезистра толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами, чтобы сделать конфигурацию круглых лунок, расположенных в массиве. Смесь 10:1 силиконового эластомера ЗУЬСАКО 184 и соответствующего ЗУЬСАКО 184 отверждающего агента разливали по модели и отверждали. Полимеризированный ЗУЬСАКО 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования раствором, содержащим тиол с радикалом ОН на конце, Н8(СН₂)_П-(ОСН₂СН₂)₃ОН в количестве (1-10 миллимоль) в растворе этилового спирта, приводили в контакт с наведенной золотой поверхностью и удаляли. Подложку промывали в течение нескольких секунд с раствором, содержащим тиол Н-(СН₂)₁₀-СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле). Затем готовую поверхность промывали этанолом и сушили в потоке азота. Обработка поверхности раствором, содержащим акрилоилхлорид и триэтиламин в диоксане, приводит к функционализации доменов с группой ОН на конце акрилатными группами. Капиллярную матрицу, содержащую смеси акриламида, бис-акриламида, Ν-акрилоилсукцинимида, азо-бис-циановалериановой кислоты и антитела, направленные против клеточных поверхностей, потом приводили в контакт с наведенной поверхностью, центирующей капилляры с доменами, имеющими акрилатные группы на конце, чтобы поместить форполимерные растворы на каждый домен. Экспонирование конфигурированных предполимерных капелек УФ-светом приводит к формированию перекрестносшитых гелей на подложке, каждая из которых представляет связывающий домен на поверхности. Анализ проводится посредством обработки связывающих доменов сначала суспензией клеток, потом смесью связывающих реагентов, способных связываться с одной или несколькими клетками, связанными с поверхностями геля в буферном растворе, содержащем трипропиламин и ЕСЬ-ТАС1 меченые вторичные антитела и/или другие связывающие реагенты, характерные для аналитов. Связывающие домены (4200, 4201 и 4202) (на полиакриламидных каплях (4203) на золотом электроде (4232) потом помещали вплотную к рабочему электроду (от 1ТО) (4204) как показано на фиг. 42. Свет, испускаемый из каждого из связывающих доменов, количественно определяли, с использованием ПЗС камеру (4205), и сравнивали со связывающими доменами для внутренних стандартов, включенных в раствор образца.

6.34. Многократный ЕСЬ-анализ на связывание аналитов с клетками на полиакриламидных поверхностях, нанесенных на электрод.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами для получения конфигураций круглых лунок, расположенных в матрице. Смесь 10:1 силиконового эластомера ЗУЬСАКО 184 и соответствующего ЗУЬСАКО 184 отверждающего агента разливали по шаблону и отверждали. Полимеризированный ЗУЬСАКЭ 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования раствором, содержащим тиол с группой ОН на конце, Н8(СН₂)_П-(ОСН₂СН₂)₃ОН в количестве (1-10 миллимоль) в растворе этилового спирта, приводили в контакт с наве

107

108 денной золотой поверхностью, и удаляли. Подложку промывали в течение нескольких секунд раствором, содержащим тиол Н8-(СН₂)1₀-СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле). Затем готовую поверхность промывали этанолом и сушили под потоком азота. Обработка поверхности с помощью раствора, содержащего акрилоилхлорид и триэтиламин в диоксане, приводит к функционализации доменов с группой ОН на конце акрилатными группами. Затем капиллярную матрицу, содержащую смесь акриламида, бисакриламида, Ν-акрилоилсукцинимида, азо-бисциановалериановой кислоты и клетки приводили в контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами, имеющими акрилатные группы на конце, в целях помещения форполимерных растворов, содержащих специфические типы клеток на каждом домене. Экспонирование конфигурированных форполимерных капелек УФ-светом приводит к формированию перекрестносшитых гелей на подложке, каждая из которых представляет связывающий домен на поверхности. Анализ проводится посредством обработки гелей с образцом, содержащим смесь аналитов, способных к связыванию одного или более связывающих доменов, присутствующих на поверхностях геля в буферном растворе, содержащем трипропиламин и ЕСЬ-ТЛС1-меченые антитела и/или другие связывающие реагенты, специфичные к аналиту. Связывающие домены (4200, 4201 и 4202) (на полиакриламидных каплях (4203) на золотом электроде (4232)) затем помещали вплотную к рабочему электроду (от 1ТО) (4204) как показано на фиг. 42. Свет, испускаемый из каждого из связывающих доменов, количественно определяли, используя ПЗС камеру (4205), и сравнивали со связывающими доменами для внутренних стандартов, включенных в раствор образца.

6.35. Многократный конкурентный ЕСЬанализ на гибридизацию на полиакриламидных поверхностях, нанесенных на электрод.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами, для получения конфигурации круглых углублений, расположенных в матрице. Смесь 10:1 силиконового эластомера δΥΕΟΑΒΌ 184 и соответствующего δΥΕΟΑΒΌ 184 отверждающего агента разливали по модели и отверждали. Полимеризированный δΥΕΟΑΒΟ 184 тщательно удаляли с кремниевой модели. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем обработки раствором, содержащим тиол с группой ОН на конце, Н8(СН₂)_П - (ОСН₂СН₂)₃ОН в количестве (1-10 миллимоль) в растворе этилового спирта, приводили в контакт с наведенной золотой поверхностью, и удаляли. Подложку промывали в течение нескольких секунд раствором, содержащим тиол Н8-(СН₂)₁₀-СН₃ (1-10 миллимоль в этаноле). Затем готовую поверхность промывали этанолом и сушили пото ком азота. Обработка поверхности с помощью раствора, содержащего акрилоилхлорид и триэтиламин в диоксане, приводит к функционализации доменов с группой ОН на конце акрилатными группами. Капиллярную матрицу, содержащую смеси акриламида, бис-акриламида, Νакрилоилсукцинимида, азо-бис-циановалериановой кислоты и нуклеиновокислотных зондов функционализированных аминогруппами, потом приводили в контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами, имеющими акрилатные группы на конце, чтобы поместить форполимерные растворы, содержащие специфические зонды, на каждый домен. Капилляры в капиллярной матрице содержат зонды, специфичные для исследуемой нуклеиновокислотной последовательности. Экспонирование конфигурированных форполимерных капелек УФ-светом приводит к формированию перекрестносшитых гелей на подложке, каждая из которых представляет связывающий домен на поверхности. Анализ проводится посредством обработки подложки смесью, которая может содержать ряды, способные к связыванию на одном, или более из связывающих доменов, присутствующих на поверхностях геля в буферном растворе, содержащем трипропиламин и Ε0Ε-ΤΑΟ1-меченые ряды, которые могут конкурировать с исследуемыми аналитами за связывание с поверхностью. Связывающие домены (4200, 4201, 4202) (на полиакриламидных каплях (4203) на золотом электроде (4232) затем помещали вплотную к рабочему электроду (от 1ТО) (4204), как показано на фиг. 42. Свет, испускаемый из каждого из связующих доменов, количественно определяли, используя ПЗСкамеру (4205), и сравнивали со связывающими доменами для внутренних стандартов, включенных в раствор образца.

6.36. Многократный конкурентный сэндвич- ЕСЬ-анализ на гибридизацию на полиакриламидных поверхностях, нанесенных на электроде.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами, чтобы сделать конфигурацию круглых углублений, расположенных в матрице. Смесь 10:1 силиконового эластомера δΥΣΟΑΚΌ 184 и соответствующего δΥΣΟΑΚΌ 184 отверждающего агента разливали по модели и отверждали. Полимеризированный δΥΕΟΑΚΌ 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования раствором, содержащим тиол с группой ОН на конце, Н8(СН₂)_П(ОСН₂СН₂)₃-ОН в количестве (1-10 миллимоль) в растворе этилового спирта, приводили в контакт с наведенной золотой поверхностью и удаляли. Подложку промывали в течение нескольких секунд раствором, содержащим тиол Н8(СН2)10-СН3 (1-10 миллимоль в этаноле). Затем

109

110 готовую поверхность промывали этанолом и сушили потоком азота. Обработка поверхности с помощью раствора, содержащего акрилоилхлорид и триэтиламин в диоксане, приводит к функционализации доменов с группой ОН на конце акрилатными группами. Капиллярную матрицу, содержащую смеси акриламида, бисакриламида, Ν-акрилоилсукцинимида, азо-бисциановалериановой кислоты и нуклеиновокислотных зондов, функционализированных с помощью аминогрупп, потом приводили в контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами, имеющими акрилатные группы на конце, чтобы поместить форполимерные растворы, содержащие специфичные зонды, на каждый домен. Капилляры в капиллярной матрице содержат зонды, специфичные для различных исследуемых аналитов. Экспонирование конфигурированных форполимерных капелек УФ-светом приводит к формированию перекрестносшитых гелей на подложке, каждая из которых представляет связывающий домен на поверхности. Анализ проводится посредством обработки подложки смесью образца, который может содержать последовательности, способные к связыванию на одном, или более из связывающих доменов, присутствующих на поверхностях геля в буферном растворе, содержащем трипропиламин и ЕСЬ-ТАС1-меченые последовательности, которые могут связывать аналиты на последовательностях, не комплиментарных зондам, связанным с поверхностью. Связывающие домены (4200, 4201, 4202) (на полиакриламидных каплях (4203) на золотом электроде (4232) потом помешали вплотную к рабочему электроду (от 1ТО) (4204), как показано на фиг. 42. Свет, испускаемый из каждого из связывающих доменов, количественно определяли, используя ПЗС камеру (4205), и сравнивали со связывающими доменами для внутренних стандартов, включенных в раствор образца.

6.37. Многократный анализ различных типов на полиакриламидных поверхностях, нанесенных на электрод.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами, для получения конфигурации круглых углублений, расположенных в матрице. Смесь 10:1 силиконового эластомера 8УЬСАКЭ 184 и соответствующего 8УЬСАВО 184 отверждающего агента разливали по модели и отверждали, Полимеризированный 8УЬСАВО 184 тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп, закрашенный путем экспонирования раствором, содержащим тиол с группой ОН на конце, Н8(СН₂)_П(ОСН₂СН₂)₃-ОН в количестве (1-10 миллимоль) в растворе этилового спирта, приводили в контакт с наведенной золотой поверхностью и удаляли. Подложку промывали в течение нескольких секунд раствором, содержащим тиол Н8 (СН2)10-СН3 (1-10 миллимоль в этаноле). Затем готовую поверхность промывают этанолом и сушат потоком азота. Обработка поверхности раствором, содержащим акрилоилхлорид и триэтиламин в диоксане, приводит к функционализации доменов с группой ОН на конце акрилатными группами. Капиллярную матрицу, содержащую смеси акриламида, бис-акриламида, N акрилоилсукцинимида, азо-бис-циановалериановой кислоты и любого из связывающих реагентов, описанных в примерах с 6,31 по 6,36, потом приводили в контакт с наведенной поверхностью, центрирующей капилляры с доменами, имеющими акрилатные группы на конце, для помещения форполимерных растворов, содержащих специфичные зонды, на каждый домен. Каждый капилляр в капиллярной матрице содержит связывающие домены, специфичные к различным исследуемым аналитам. Экспонирование конфигурированных форполимерных капелек УФ-светом приводит к формированию перекрестносшитых гелей на подложке, каждая из которых представляет связывающий домен на поверхности. Анализ проводили посредством обработки подложки смесью образцов, которые могут содержать аналиты, способные к связыванию одним, или более из связывающих доменов, присутствующих на поверхностях геля в буферном растворе, содержащем трипропиламин и любой из ЕСЬ-ТАС1-меченых аналогов аналитов, которые конкурируют с аналитами за связывание со связывающими доменами и/или ЕСЬ-ТАС1-мечеными вторичными связывающими реагентами к исследуемым аналитам. Связывающие домены (4200, 4201 и 4202) (на полиакриламидных каплях (4203) на золотом электроде (4232)) потом помещали вплотную к рабочему электроду (от 1ТО) (4204), как показано на фиг. 42. Свет, испускаемый из каждого из связующих доменов, количественно определяли с использованием ПЗС камеры (4205), и сравнивали со связывающими доменами для внутренних стандартов, включенных в раствор образца.

6.38. Высокообратимая ЕСЬ.

Поликристаллические золотые электроды (от фирмы Βίο Апа1уйса1 8егу1се§, 2 мм²) очищали полировкой вручную последовательно с 0,5 мкм и 0,03 мкм пастой из окиси алюминия [глинозема] , после чего проводили химическое травление в 1:32 Н₂О₂/Н₂8О₄, и циклы электрохимической обработки разбавленной Н₂8О₄ между -0,2 В и 1,7 В относительно Ад/АдС1. Чистые электроды потом сразу же погружали в разбавленный раствор октилтиола (С₈8Н), растворенный в этаноле. Адсорбцию белка проводили посредством покрытия Сд8Н -модифицированных электродов 20 мкмл ТАС1-меченого бычьего сывороточного альбумина (В8А), растворенного в фосфатно-буферном солевом растворе (РВ8, 0,15 моль №С1/0,1 моль рН 7,2), и посредством промывания поверхности экстен

111

112 сивно тем же самым буферным раствором после десятиминутного инкубирования.

ЕСЬ была выполнена в трехэлектродной ячейке с контрольным электродом Ад/АдС1, с противоположным электродом из платинового провода и стабилизатором напряжения Е6&6 283. Интенсивность света была измерена фотоумножителем Наташами, помещенным на дно электрохимической ячейки. Электрод с адсорбированным белком, был погружен в раствор 0,1 моль ТРА и 0,2 моль фосфата, рН 7,2. Высокообратимый ЕСЬ-отклик (фактически, подобная интенсивность при прямом и обратном сканировании) наблюдался, когда потенциал электрода периодически изменялся между 0,0 В и 1,2 В, как изображено на фиг. 44А, что указывало на обратимый характер процесса ЕСЬ и стабильность слоев тиола и белка на электроде.

Циклические вольтамперметрические эксперименты проводили на тех же самых приборах, что и в случае ЕСЬ, без использования фотоумножителя и фотометра. В эксперименте электрод (без белка), покрытый соединением С₈8Н, был помещен в раствор 1 миллимоль ферицианида калия (в РВ8), и электрод сканировали от +0,5 В до 1,2 В и обратно, с последующим другим циклом между +0,5 В и -0,3 В. Показательно, что монослой все еще оставался неповрежденным и не десорбировал при 1,2 В, так как в вольтамперограмме фарадический ток имелся только между +0,5 В и -0,3 В, и не было никакого фарадического тока ферицианида (фиг. 44Б).

6.39. Квазиобратимая ЕСЬ.

Модификация электрода и адсорбция белка были выполнены таким же образом, как описано выше. В экспериментах с ЕСЬ, напряжение сканировалось между 0,0 В и 1,5 В, и регистрировалась соответствующая интенсивность света. Как показано на фиг. 45А, имелась некоторая потеря сигнала ЕСЬ между прямым и обратным сканированием в одном и том же цикле, также как и между различными циклами. Циклические вольтамперограммы тиол/Аи в ферицианиде после окисления при 1,5 В показали значительное количество фарадического тока, указывающего, по крайней мере, на частичную десорбцию монослоя тиола при 1,5 В (фиг. 45Б).

6.40. Необратимая ЕСЬ.

В этих экспериментах модификация электрода и адсорбция белка проводились таким же образом, как в примере 6.38. Чтобы измерять сигнал ЕСЬ потенциал электрода сканировался полностью до 2,0 В и назад к 0,0 В. Интенсивный свет наблюдался при прямом сканировании (больше света, чем наблюдалось при обратимых условиях в примере 6,38), но снижался до уровня фона при обратном сканировании, как показано на фиг. 46А. Циклические вольтамперограммы модифицированного электрода в ферицианиде после окисления при 2,0 В указывают на то, что большая часть монослоя тиола была десорбирована (фиг. 46Б).

6.41. ЕСЬ-сэндвич - иммуноанализ с использованием первого антитела, иммобилизованного на конфигурированном золотом электроде.

В этом примере антитело против антигена предстательной железы (Р8А) было иммобилизовано на конфигурированном золотом электроде для использования в иммуноанализе для Р8А.

Экспонированный и проявленный шаблон фоторезиста толщиной 1-2 микрона изготавливали в соответствии с хорошо известными процедурами, чтобы сделать слой фоторезиста на кремниевой подложке с небольшим квадратным участком 1ммх1мм, на котором фоторезист удаляли. Смесь 10:1 силиконового эластомера ЗУЬСАЕЬ 184 и соответствующего отверждающего агента разливали по модели и отверждали. Полимеризированный 8УЬСАКЛ тщательно удаляли с кремниевого шаблона. Готовый эластомерный штамп закрашивали путем обработки раствором, содержащим тиол с группой ОН на конце, Н8-(СН₂)_П - (ОСН₂СН₂)₃ОН, и тиол с нитрилотрехуксусной кислотой (ΝΤΆ) на конце, НЗСОДп - (ОСН2СН2)₃ОС(О)КН(С1 ГуСН-(СО)_;11) \(С1 ГССЫ 1)_; в растворе этилового спирта. Закрашенный штамп приводили в контакт с золотой подложкой и удаляли, чтобы образовать 8АМ [монолитный монослой] размером 1 мм х 1 мм. Подложку промывали в течение нескольких секунд раствором, содержащим лишь тиол с гидроксильной группой на конце в этаноле, для предотвращения неспецифического связывания белков с областями, лежащими снаружи штампованной фигуры. Затем, готовую поверхность промывали этанолом и сушили в потоке азота. После обработки поверхности раствором Νίί’Γ обрабатывали раствором, содержащим гибридный белок, презентирующий сайты связывания мышиного моноклонального антитела против Р8А и пептида (Νίδ)₆, что приводит к регулируемой иммобилизации гибридного белка на поверхности. Этот процесс позволяет получать воспроизводимое заранее определяемое количество иммобилизованного белка на поверхности. Ориентация белка на поверхности регулируется локализацией последовательности (Νίδ)₆ в первичной структуре гибридного белка. Абсолютное количество иммобилизованного белка регулируется отношением тиола с КЕА на конце к тиолу с гидроксильной группой на конце в штампованном 8АМ, и площадью поверхности штампованной фигуры. Калибровочную кривую для Р8А определяли путем приготовления растворов, содержащим известные концентрации Р8А в сыворотке (при концентрациях в диапазоне от 1 фемтомоля до 1 микромоля*. Некоторое число поверхностей, приготовленных как описано выше, обрабатывали с помощью стандартов калибровки Р8А, а затем раствором, со

113

114 держащим второе антитело против Ρ8Α (меченое производной ТАС1) при оптимизированной концентрации. Кривую калибровки определяли путем погружения поверхностей в раствор, содержащий 0,1 моль ТРА и 0,2 моля фосфата (рН 7,2), и проводили периодическое измерение максимальной интенсивности испускаемого света, когда электрический потенциал на золотой поверхности циклически изменялся между 0,0 и 2,0 В при скорости сканирования 0,5 В/с. Определение неизвестных концентраций Р8А в сыворотке в образце проводили такими же процедурами, за исключением того, что концентрацию Ρ8Α вычисляли из максимального ЕСЬ сигнала относительно кривой калибровки.

7. Объединение ссылок.

Настоящее изобретение не ограничивается в рамках конкретных вариантов изобретения, описанных здесь. Действительно, различные модификации настоящего изобретения в дополнение к тем, которые здесь описаны, станут очевидными специалистам из предшествующего описания и сопровождающих чертежей. Эти модификации не должны выходить за рамки формулы изобретения. Здесь цитируются различные публикации, содержание которых включены в настоящее описание посредством ссылки.

Claims (24)

1. Устройство для детектирования аналита посредством электрохемилюминесценции, содержащее два расположенных противоположно один другому электрода, один из которых имеет иммобилизованный на своей поверхности связывающий домен с заданным количеством реагента, способного к связыванию компонента анализа электрохемилюминесцентного связывания.

2. Устройство по п.1, в котором электрод содержит пористый материал.

3. Устройство для детектирования аналита посредством электрохемилюминесценции, содержащее два расположенных противоположно один другому электрода, причем одна сторона указанных электродов имеет иммобилизованное на своей поверхности множество связывающих доменов, имеющих заданные количества реагентов, способных к связыванию компонентов анализа электрохемилюминесцентного связывания.

4. Устройство для детектирования аналита посредством электрохемилюминесценции, содержащее (а) электрод, (б) подложку, имеющую иммобилизованное на ней множество дискретных связывающих доменов, каждый из которых содержит заданное количество реагента, способного к связыванию компонента анализа электрохемилюминесцентного связывания, (в) противоположный электрод, (г) средство для доставки образца к связывающим доменам, (д) средство для запуска электрохемилюминесценции и (е) средство для детектирования электрохемилюминесценции.

5. Устройство по п. 4, в котором множество доменов находится в электрохимическом контакте с электродом.

6. Устройство по п. 4, в котором упомянутый электрод выполнен пористым.

7. Устройство по п. 6, в котором упомянутый электрод содержит углеродистый материал.

8. Устройство по п.4, в котором упомянутый электрод содержит материал, имеющий форму фибрилл.

9. Устройство по п.4, в котором средство детектирования электрохемилюминесценции детектирует электрохемилюминесценцию от одного или более упомянутых дискретных связывающих доменов.

10. Устройство по п. 4, в котором подложка является пористой матрицей.

11. Устройство по п. 4, в котором подложка является пористой матрицей, а электрод является пористым.

12. Устройство по п. 4, в котором подложка является пористой матрицей, причем матрица помещена между электродом и противоположным электродом.

13. Устройство для детектирования аналита посредством электрохемилюминисцентного анализа, содержащее множество дискретных связывающих доменов, специфичных для исследуемых аналитов, на подложке, содержащей пористый материал, причем каждый из доменов имеет отличную от других специфичность связывания для связывания множества отличающихся от других, представляющих интерес, аналитов в электрохемилюминисцентном анализе.

14. Устройство по п.13, в котором пористый материал содержит углерод.

15. Устройство по п.13, в котором пористый материал содержит материал, имеющий форму фибрилл.

16. Способ детектирования наличия аналита или измерения концентрации аналита в анализе электрохемилюминесцентного связывания, предусматривающий (а) контактирование множества дискретных связывающих доменов, иммобилизованных на поверхности одной или более подложек, с образцом, содержащим множество аналитов и компонент анализа, связанный с меткой электрохемилюминесценции, (б) прикладывание напряжения определенной формы, эффективной для запуска электрохемилюминесценции в одном или более доменах в присутствии реакционной среды, подхо

115

116 дящей для проведения электрохемилюминесцентного анализа, (в) детектирование наличия электрохемилюминесценции множества доменов или измерение электрохемилюминесценции множества доменов.

17. Набор для выполнения множества электрохемилюминесцентных анализов для множества аналитов, содержащий (а) подложку с множеством дискретных связывающих доменов, причем связывающие домены имеют различные специфичности связывания для множества различных аналитов, представляющих интерес в электрохемилюминесцентном анализе, и (б) сосуд, содержащий реагент, необходимьй для проведения упомянутых анализов.

18. Набор по п.17, дополнительно включающий устройство для выполнения упомянутых анализов.

19. Набор по п.18, дополнительно содержащий один или более сосудов, содержащих несвязывающие компоненты для множества электрохемилюминесцентных анализов.

20. Кассета, содержащая (а) множество дискретных связывающих доменов на подложке, образующих, по меньшей мере, одну связывающую поверхность, (б) множество пар электрод/противоположный электрод, в которых дискретные связывающие домены пространственно центрированы относительно множества пар электрод/ противоположный электрод, и (в) средство для подачи образца на множество дискретных связывающих доменов.

21. Кассета по п.20, в которой подложка содержит от 2 до 500 связывающих доменов.

22. Кассета по п.20, в которой множество связывающих доменов содержит связывающие домены, имеющие различные специфичности связывания, чтобы обеспечить одновременное связывание многочисленных различных исследуемых аналитов, присутствующих в образце.

23. Кассета по п.20, в которой дискретные связывающие домены дополнительно содержат домен, заключающий в себе свойства контроля.

24. Кассета по п.20, в которой подложка содержит эластомерный материал.