DK175738B1

DK175738B1 - Molekylær kloning og ekspression af gener, der koder for proteolytiske enzymer

Info

Publication number: DK175738B1
Application number: DK198805939A
Authority: DK
Inventors: Leonardus Johannes S Mulleners; Christiaan Albertus Ge Eekelen; Johannes Cornelis Van Der Laan
Original assignee: Genencor Int
Priority date: 1987-02-27
Filing date: 1988-10-26
Publication date: 2005-02-07
Also published as: ATE180016T1; WO1988006624A3; FI105483B; DE3856339T2; CN88101681A; HU213220B; FI925413A0; US5217878A; BR8805647A; AU620026B2; LTIP1820A; CA1339100C; DE3856331T2; DE3856331D1; KR890700665A; PT86864B; BG49049A3; DK593988A; FI119028B; AU1398088A

Description

I DK 175738 B1

Denne opfindelse angår produktion af polypepti-der af interesse under anvendelse af rekombinationsteknikker . j

Bacilli er blevet brugt i vid udstrækning til 5 produktionen af industrielt vigtige enzymer som f.eks. a-amylase, neutral protease og alkaliske eller serin-proteaser. I almindelighed kan bakterielle serinpro-teaser opnås fra mange prokaryotiske organismer herun- I

der gramnegative organismer som f.eks. Serratia- eller I

10 Pseudomonas-arter og grampositive bakterier som f.eks. I

Micrococcus- og Baclllus-arter♦ En gruppe af indu- I

I strielt vigtige serinproteaser af særlig interesse er I

dem, der har høj aktivitet i alkaliske medier. Mens in- I

dustrielle serinproteaser produceres af forskellige I

15 Bacillus-arter, omfattende B. subtilis, B. lichenlfor- I

mis, B. amvloliquefaciens, B. alcalophilus og andre I

Bacillus-arter, produceres de høj alkaliske proteaser I

sædvanligvis af Bacillus-stammer, der er i stand til at I

gro ved alkalisk pH-værdi. Et eksempel på en sådan ba- I

20 cillus er Bacillus novo arten PB92. I

Der er betydelig interesse i at udvikle stammer I

af baciller, der er i stand til at producere proteoly- I

tiske enzymer med et stort udbytte, specielt højalka- I

liske proteaser. I

25 En del gener for ekstracellulære enzymer fra I

baciller er blevet klonet med vellykket resultat, som I

f.eks. α-amylasegenerne i B^ amylollquefaclens (Palva I

et al.. Gene 15 (1981) 43-51), B^ llchenlformis (Ort- I

lepp, Gene 23 (1983) 267), B^ stearothermophilus (Mie- I

30 lenz et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 (1983) 5975- I

5979; EPA-0057976) og B^ subtilis (Yang et al., Nucleic I

Acids Res. 11 (1983) 237); levansucrasegenet i B^ sub- I

tills (Gay et al., J. Bacteriol. 153 (1983) 1424); I

2 DK 175738 B1 det neutralproteasekodende enzym i stearothermo-phllus (Fuji et al., J. Bacteriol. 156 (1983) 831), B. amyloliquefaclens (Honjo et al., J. Biotech. 1 (1984) 165) og i subtilis (Yang et al., J. Bacte-5 riol. 160 (1984) 115); det serin- eller alkalisk-pro-tease-kodende gen i B^ subtilis (Wong et al., Proc.

INatl. Acad. Scl. USA 81 (1984) 1184), licheniformls (Jacobs et al., Nucleic Acids Res. 22 (1985) 8913) og B. amyloliquefaciens (Wells et al,, Nucleic Acids Res.

10 xi (1983) 7911).

Produktion af industrielle serinproteaser i forskellig Bacillus-arter er beskrevet i f.eks., U.S. patentskrift nr. 3.674.643; 3.723.250 og 4.480.043.

Produktion af højalkalisk, proteolytisk enzym ved 15 hjælp af Bacillus-stammer, der er i stand til at gro

ved alkalisk pH, er beskrevet i, f.eks., U.S. patent- I

skrift nr. 3.723.250; Re. 30.602 og 4.480.037. En oversigtsartikel vedrørende anvendelsen af baciller til produktion af industrielt vigtige enzymer findes f.eks. j 20 i Debabov, "The Industrial Use of Bacilli", i: The

Molecular Biology of Bacilli, (Acad. Press, New York, 1982).

En fremgangsmåde til protoplasttransformation af B. subtills er beskrevet af Chang og Cohen (Mol. Gen.

25 Genet. 168 (1979) 111-115). Lignende fremgangsmåder er j beskrevet for den vellykkede transformation af B^ meqa- terium-protoplaster (Vorobjeva et al., FEMS Microbiol.

Letters 2 (1980) 261-263), B_^ amyloliquefaclens proto-plaster (Smith et al., Appl. and Env. Microbiol. 51 30 (1986) 634), B2 thurinqlensls protoplaster (Fisher et al., Arch. Microbiol. 139 (1981) 213-217), EU sphaeri-cus protoplaster (McDonald, J. Gen. Microbiol. 130 (1984) 203), og B^ larvae protoplaster (Bakhiet et al., 3 DK 175738 B1

Appl. and Env. Microbiol. 4j> (1985) 577). Dog rapporterede Bakhiet et al. (supra.) om ikke vellykkede resultater med poplllae. Mann et al., Current Microbiol.

13 (1986) 131-135 rapporterede om vellykkede transfor-5 mationer med polymyxa, B. licheniformis, B. mace-rans og B^ laterosporus. Dog var fremgangsmåden ikke vellykket med B^_ coaqulans, B. cereus og Β^_ pumilus, , selvom der blev observeret god protoplastdannelse.

I Andre metoder til indføring af DNA i protoplaster om- 10 fatter sammensmeltning med DNA-holdige liposomer, Holubova, Folia Microbiol. 30 (1985) 97.

Opfindelsen tilvejebringer en ekspressionskassette, der som virkningsmæssigt forbundne komponenter omfatter (a) en transkriptionsregulerende region og 15 translationsinitierende region, som er virksomme i en Bacillus værtscelle, (b) en DNA sekvens, der koder for en højalkalisk serinprotease, hvis sekvens har mindst 70% hbmologi med'følgende aminosyresekvens: 20 H2N-A-Q-S-V-P-W-0-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G-V-A-P-N-A-E-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-25 Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-m-a-t-p-h-v-a-g-a-a-a-l-v-k-q-k-n-p-s-w-s-n-v-q-i-r-n-h-l-k-n- T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH; (c) en translations- og transkriptionsterminationsre-gion, der er virksom i nævnte værtscelle, hvor ekspres-30 sionen af nævnte DNA sekvens reguleres af nævnte initiations- og terminationsregioner, og (d) mindst en blandt et markørgen og et temperaturfølsomt bakterie-

I DK 175738 B1 I

4 I

I plasmidreplikationsorigin, hvor den høj alkaliske pro- I

I tease har aktivitetsoptimum ved en pH-værdi højere end I

9 og bibeholder mindst 80% af den optimale aktivitet I

ved en pH-værdi på 11 eller højere og kan opnås fra en I

5 alkalofil Bacillus-stamme. I

I Opfindelsen tilvejebringer desuden en transfor- I

I meret Bacillus-værtscelle, som er i stand til at danne I

I høj alkalisk serinprotease, omfattende nævnte ekspres- I

I sionskassette, samt en fremgangsmåde til transformation I

I 10 af Bacillus-værtsceller, som omfatter tilvejebringelse I

I af nævnte ekspressionskassette, kombination af en pro- I

I toplast fremstillet ud fra en Bacillus-værtscelle med I

I nævnte kassette under tilstedeværelse af et fusogent I

I middel ved en høj pH-værdi, hvorved nævnte kassette I

15 indføres i nævnte værtscelle, og nucleinsyre kodende I

I for nævnte protease integreres i nævnte værtscelles I

kromosom; og udvælgelse af værtsceller, der stabilt in- I

deholder nævnte proteasegen og som er i stand til at I

danne høj alkalisk protease, hvor den høj alkaliske pro- I

I 20 tease har aktivitetsoptimum ved en pH-værdi højere end I

I 9 og bibeholder mindst 60% af den optimale aktivitet I

I ved en pH-værdi på 11 eller højere og kan opnås fra en I

I alkalofil Bacillus-stamme♦ I

I Opfindelsen tilvejebringer yderligere anvendel- I

I 25 sen af en transformeret Bacillus-vært ifølge opfindel- I

sen til produktion af en højalkalisk serinprotease og I

I en fremgangsmåde til fremstilling af en høj alkalisk se- I

I rinprotease i Bacillus, hvor nævnte fremgangsmåde om- I

fatter dyrkning af en Bacillus-kultur omfattende I

30 Bacillus-cellerne ifølge opfindelsen og eventuelt iso- I

lering af nævnte ekspressionsprodukt. I

I Fig. 1 viser resultaterne af histidin/MOPS-gel- I

elektroforesen udført på supernatanter fra kulturer af I

5 DK 175738 B1 B. subtllls DB104, der indeholder henholdsvis pUBHO og pM58, sammenlignet med en del subtilisiner.

Bånd 1: Carlsberq subtilisin Bånd 2: Bacillus med PB92-protease 5 Bånd 3: Bacillus subtllls subtilisin Bånd 4: Bacillus subtllls DB104 (pM58) Bånd 5: Bacillus subtllls DB104 (pUBHO)

Fig. 2 viser restriktionskortet af plasmid pM58.

Desuden er sekventeringsstrategien vist i den øverste 10 del af figuren. De fuldt optrukne linier med pile repræsenterer fragmenterne, der er klonet i fag M13 vek- ! torerne mplO, mpll og mpl8. Den nederste del af figuren viser sekvenseringsstrategien ved anvendelse af 10 oligonucleotider beliggende med regelmæssig afstand på 15 proteasegenet.

Fig. 3 viser nucleotidsekvensen af den kodende streng korreleret med aminosyresekvensen af Bacillus PB92-serinproteasen. DNA-sekvensens promotorer (Pj,

P2), ribosombindingssted (rbs) og termineringsregio-20 ner (term) er også vist. De nummererede, fuldt optrukne linier repræsenterer placeringen af de ti oligonucleotider, der anvendes ved sekventeringen. I

ί

Fig. 4A viser konstruktionen af plasmid pEl94- neo.

25 Fig. 4B viser konstruktionen af plasmid pMAX-4.

I overensstemmelse med den foreliggende opfindelse tilvejebringes der såvel nye DNA-konstruktioner og Bacillus-stammer til produktion af proteolytiske enzymer med stort udbytte som metoder til deres fremstil-30 ling. Værtsceller transformeres ved at kombinere pro-toplaster, fremstillet fra værts-Bacillus-stammen, med en plasmidkonstruktion, der indeholder en DNA sekvens, der koder for et proteolytisk enzym under sammensmeltende betingelser.

I DK 175738 B1 I

I I

I Høj alkaliske proteaser er serinproteaser eller I

I subtilisiner med høj aktivitet i alkaliske medier. I

I Mere specifikt har høj alkaliske proteaser en optimal I

I aktivitet ved pH-værdier højere end omkring 9 og bibe- I

5 holder mindst 80% af denne optimale aktivitet ved en I

I pH-værdi på omkring 11 eller endog højere. Høj alkali- I

I ske proteaser produceres sædvanligvis af Baclllus-stam- I

mer, der er i stand til at gro ved alkaliske pH-vær- I

I dier. I

I 10 Metoderne, der anvendes ved isolering af protea- I

segenet, omfattende syntetisering, isolering fra genom- I

I DNA, oparbejdning fra cDNA, eller kombinationer heraf, I

I er kendte for gennemsnitsfagmanden, isolering og eks- I

I pression af høj alkaliske proteasegener er beskrevet i I

I 15 prioritetsdokumentet, der ligger til grund for denne I

ansøgning, europæisk ansøgning nr. EP.A.87200358,7, I

hvis indhold er inkorporeret heri ved reference. De I

I forskellige metoder til manipulation af generne er vel- I

I kendte og omfatter restriktion, fordøjelse, resektion, I

20 ligering, iri vitro mutagenese, primerreparation, an- I

vendelse af linkere og adaptorer og lignende. Se I

I Maniatis et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor I

H Laboratory, New York, 1982. I

Generelt sagt omfatter metoden oparbejdning af I

25 et genomisk bibliotek fra en organisme, der udtrykker I

en høj alkalisk protease. Donormikroorganismens genom I

isoleres og skæres med et passende restriktionsenzym. I

Donorstammens resulterende DNA-fragmenter ligeres der- I

efter ind i en kloningsvektor, der er blevet skåret I

30 over med en passende restriktionsendonuklease. I

Kloner, der indeholder det indsatte DNA frag- I

ment, kan identificeres direkte ved hjælp af en re- I

sistensmarkør eller ved anvendelse af en direkte eller I

7 DK 175738 B1 positiv selektionsmetode, som f.eks. den, der er udviklet til subtilis (Gryczan og Dubnow, Gene 20 (1982) 459-469). Yderligere kan kloner, der udtrykker en højalkalisk protease, identificeres ved hjælp af antistof-5 fer, der er rettet mod ekspressionsproduktet, måling af det forbrugte substrat eller dannelse af det proteo-lytiske enzymprodukt. F.eks. kan kolonier, der udtrykker et markørgen, som f.eks. antibiotikaresistens, screenes for proteaseproduktion bestemt ved stigende 10 udfældning af en kaseinring omkring kolonierne, der er udpladet på agarplader indeholdende kasein.

Når et komplet gen er blevet identificeret, en- ' ten som cDNA eller kromosomalt DNA, kan det derefter manipuleres med på forskellige måder for at sørge for 15 ekspression. Bacillus-værter kan anvendes, hvilke f.eks. omfatter alkalofile bakterier, herunder de alka-lofile baciller, der i forvejen er høj alkaliske protea-sedannere. En foretrukken værtsorganisme er Bacillus novo arten PB92. Det er derfor praktisk at bibeholde 20 vildtypesekvensen med regulatoriske signaler og sekre-toriske leadersekvenser, etc., selv om kontrolregioner, der stammer fra andre baciller, der er funktionelle i Bacillus-værtsstammen, også kan anvendes. En passende vektor til transformering af en Bacillus-celle indehol-^ der således et strukturelt gen, der koder for en højalkalisk protease, der kan fås fra en alkalofil Bacillus og indeholder kontrolregioner, som f.eks. en promotorsekvens, en sekvens, der danner ribosombindingsstedet, og sekvenser, der kontrollerer terminering af trans-

Qf) skription og translation af det alkaliske proteasegen, idet omtalte kontrolregioner er funktionelle i en alkalofil Bacillus-værtscelle.

Vektoren kan yderligere indeholde et markørgen, f.eks. for at give resistens overfor et antibiotikum,

I DK 175738 B1 I

I I

I overfor hvilket værtsstammen er sensitiv, og et repli- I

kationsori, der er i stand til autonom replikation I

I i værtscellen. Replikationsoriginet kan være et, der I

I har en mutation, der gør dets funktionsdygtighed tempe- I

I 5 ratursensitiv i værtscellen, hvorved det giver mulighed I

I for selektion efter kromosomal integration som beskre- I

I vet af Ehrlich, Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1978) I

I 1433. I

I Aminosyresekvensen kan anvendes til konstruktion I

I 10 af en probe til screening af et cDNA- eller et genom- I

I bibliotek, oparbejdet ud fra mRNA eller DNA fra inter- I

essante celler som donorceller for høj alkaliske prote- I

I asegener. Ved at anvende højalkalisk-protease-cDNA I

I eller et fragment deraf som en hybridiseringsprobe, I

I 15 kan strukturelt relaterede gener i andre organismer let I

klones. Af særlig interesse er isoleringen af gener fra I

I organismer, der udtrykker høj alkaliske serinproteaser, I

I ved anvendelse af oligonucleotidprober baseret på nu- I

I cleotidsekvenserne af høj alkaliske serinproteasegener, I

I 20 der kan fås fra alkalofile Bacillus-stammer, der omfat- I

I ter Bacillus novo arten PB92. Sådanne prober kan være I

væsentligt kortere end hele sekvensen, men bør være I

I mindst 10, fortrinsvis mindst 15, mere foretrukket 20 I

I nucleotider i længden. Længere oligonucleotider, op til I

25 den totale længde af genet, fortrinsvis ikke mere end I

I 1200 nucleotider i længden er også anvendelige. Både I

I RNA- og DNA-prober kan anvendes. I

I ved anvendelse bliver proberne typisk mærket på I

I en målelig måde (f.eks. med 32P, 3H, biotin eller avi- I

I 3<^ din) og inkuberet med enkeltstrenget DNA eller RNA fra I

I organismen, hvori et gen søges. Hybridisering påvises I

I ved hjælp af mærkningen, efter at enkeltstrenget og I

I dobbeltstrenget (hybridiseret) DNA (eller DNA/RNA) I

Ι· DK 175738 B1 er blevet separeret (typisk ved hjælp af nitrocellulosepapir). Hybridiseringsmetoder, der er egnede til anvendelse med oligonucleotider, er velkendte for fagmanden.

5 Selvom prober normalt anvendes med et sporbart mærke, der tillader let identifikation, er umærkede oligonucleotider også anvendelige, både som precursorer for mærkede prober og til anvendelse i metoder, der tilbyder direkte påvisning af dobbeltstrenget DNA 10 (eller DNA/RNA). Således refererer vendingen oligonu- i I cleotidprobe til både mærkede og ikke mærkede former, i Ligeringsblandingen bruges derefter til transformering af kompetente subtilis-celler. Ved anvendelse af

markørgenet som selekteringsmiddel kan rekombinante I

15 plasmider derefter isoleres og karakteriseres ved I

restriktionsanalyse og sekventering. I

Til høj alkalisk proteaseproduktion er en fore- I

trukket DNA-sekvens til anvendelse ved transformering I

af Bacillus-stammer, der allerede producerer serin- I

20 protease, en sekvens, der stammer fra Bacillus novo ar- I

ten PB92. Serinproteasens aminosyresekvens, der kodes I

for af DNA-sekvensen, er som følger: I

H2N-A-Q-S-V-P-W-G-1-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- I

25 V-L-D-T-G—I—S-T-H-P—D-L-N-I—R-G-G-A-S-F-V—P-G—E—P-S-T-Q-D-G-N- I

G-H-G-T-H-V-A-G-T-I-A-A-L-N-N-S-I-G-V-L-G—V-A-P-H-A-E-L-Y-A-V- I

K-V-L-G—A-S-G-S-G-S-V—S-S-I-A-Q—G-L-E-W-A-G—N-N—G-M-H-V—A-N-L- I

S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- I

S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-O-N-N-N-R-A-S-F-S- I

q-y-g-a-g-l-d-i-v-a-p-o-v-n-v-o-s-t-y-p-g-s-t-y-a-s-l-n-g-t-s· I

30 M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-O-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- I

T-A-T-S -L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH . I

Mens den foretrukne stamme til tilvejebringelse I

af proteasegenet er Bacillus novo arten PB92, kan i I

I DK 175738 B1

I ίο I

I det væsentlige sanune serinprotease opnås fra andre al- I

I kalofile bacilli. Sådanne proteasegener, der har mindst I

I 70% og fortrinsvis fra omkring 80% homologi med amino- I

I syresekvensen i Bacillus PB92, skal forstås som værende I

I 5 indenfor rammen af den foreliggende opfindelse. I

Det er ønskeligt, at det udtrykte produkt bliver I

udskilt. Eftersom den alkaliske protease bliver ud- I

I skilt, kan vildtypens sekretoriske leadersignaler og I

spaltningssignaler anvendes. Yderligere kan et fusions- I

10 gen fremstilles ved at give det strukturelle gen en I

I 5'-sekvens, der koder for et sekretorisk leader- og et I

I spaltningssignal. Illustrative heterologe sekretoriske I

I leadere omfatter de sekretoriske leadere af amylase- og I

I proteasegener i Bacillus, ved sammensmeltning af den I

I 15 sekretoriske leader i den rigtige læseramme med det I

strukturelle gen af interesse kan den færdige alka- I

lofile protease udskilles i kulturmediet. I

Ekspressionskassetten kan stamme helt eller del- I

vist fra naturlige kilder, og stamme enten helt eller I

20 delvist fra kilder, der er homologe med værtscellen, I

eller heterologe med værtscellen. Opfindelsens forskel- I

lige DNA-konstruktioner (DNA-sekvenser, vektorer, plas- I

mider, ekspressionskassetter) er isoleret og/eller I

oprenset, eller syntetiseret og er således ikke "natur- 23 ligt forekommende”.

Afhængigt af om der ønskes integration af det I

strukturelle gen i værtscellens kromosom eller bevarel- se på et ekstrakromosomalt element, kan et replika- tionssystem til Bacillus indeholdes eller ikke indehol- des. Til integration kan der anvendes homologe områder af det konstruerede plasmid med Bacillus-genomet for at forøge sandsynligheden for rekombination. Endvidere tillader inkluderingen af et temperatursensitivt re- DK 175738 B1 11 plikationsori 1 plasmidkonstruktionen selektion efter kromosomal integration. Se f.eks., Ehrlich, Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 75 (1978) 1433.

Der kan indføjes mere end et kopi af det struk-5 tureile gen i værtscellen for at forstærke ekspressionen af det strukturelle gen. Stabil forstærkning af det strukturelle gen kan opnås ved at integrere mindst en yderligere kopi af det strukturelle gen ind i værtscellens genom og selektere efter transformanter, hvori 10 kopierne af det strukturelle gen er separeret ved endogene, kromosomale sekvenser. DNA-konstruktioner og metoder til prokaryotiske systemer er beskrevet i europæisk patentansøgning nr. EP-A-87200356,1, hvis indhold er inkorporeret heri ved reference.

15 Ud over replikationssystemet vil der som regel være indeholdt mindst et markørgen i det konstruerede plasmid. Med markørgen menes et strukturelt gen, der kan udtrykkes i en værtscelle, og giver biocid- eller viral resistens eller resistens overfor tungmetaller, 20 immunitet og lignende. Med hensyn til biocidresistens kan denne omfatte resistens overfor antibiotika, f.eks. neomycin, kanamycin, tetracyclin, etc. Markørgenet udvælges for at give mulighed for selektion ved lavt kopital ved en antibiotikakoncentration, der ikke hæmmer 25 væksten af rekombinante celler væsentligt. Af særlig interesse er neomycinresistens.

De forskellige DNA-sekvenser kan stamme fra forskellige kilder og sættes sammen til opnåelse af en vektor, der omfatter en eller flere bekvemme, fortrins-30 vis entydige, restriktionssteder for at tillade indsættelse eller substitution af de strukturelle gener ved sådannes steder for at opnå plasmid-konstruktionen.

Når først det konstruerede plasmid er fremstillet, kan det anvendes til transformering af en passende

I DK 175738 B1 I

I 12. · I

I værtscelle. Bacillus-værten kan være enhver Bacillus I

I stamme, idet de faktorer, der kan forøge produktionen I

I af høj alkaliske proteaser dog tages i betragtning ved I

I udvælgelsen af en passende stamme. Produktionen kan I

I 5 forbedres på forskellige måder, indbefattet anvendelsen . I

I af en vært i hvilken der er reduceret nedbrydning af I

I det ønskede produkt, genkendelse af regulatoriske sig- I

I naler, let udskilning, etc. Mens en foretrukket I

I Baclllus-vært er en høj alkalisk proteasedanner, enten I

I 10 en vildtype-Bacillus eller en mutant Bacillus, kan I

I Bacillus-værten således også være en høj alkalisk pro- I

teasedannende mutant, der ikke producerer højalkalisk I

I protease. I

Høj alkalisk proteasedannende bacilli er ikke I

I 15 klassificeret godt taxonomisk set og betegnes sædvan- I

I ligvis som alkalofile Bacillus-stammer♦ Eksempler på I

Bacillus-stammer, der er i stand til at gro ved alkali- I

I ske pH-værdier, er beskrevet i, f.eks., US patentskrift I

nr. 3.723.250; Re. 30.602 og 4.480.037. Et eksempel på I

20 en foretrukken alkalofil Bacillus-værtsstamme er stam- I

men Bacillus novo arten PB92 beskrevet inter alia i US I

patentskrift nr. Re. 30.602. I

Industrielle alkalofile Bacillus-stammer kan og- I

så anvendes som værtsceller. Industrielle Bacillus I

25 stammer har sin oprindelse i organismer, der kan isole- I

res fra jorden eller er tilgængelige fra deponeringsin- I

H stitutioner eller andre kilder og er opnået ved gene- I

tisk modifikation af sådanne Bacillus-stammer. De indu- I

strielle Bacillus-stammer er karakteriseret ved at være I

30 resistente mod genetisk udveksling, som f.eks. fagin- I

fektion eller transformation. Stammerne er stabile og I

kan være i stand til eller ikke være i stand til at I

danne sporer. De er sædvanligvis prototrofe og modifice- I

DK 175738 B1 13 ret for at give et højt udbytte af endogene proteinprodukter som f.eks. enzymerne α-amylase og forskellige proteaser. Udbyttet af et endogent proteinprodukt, der opnås i en industriel produktionsproces, kan nå op på 5 mindst 5 g/1 (0,5% vægt/vol). Industrielle stammer udskiller også DNaser, hvilket resulterer i nedbrydning af DNA i mediet, hvilket sørger for beskyttelse mod genetisk udveksling.

Transformation af alkalofile Bacillus-stammer 10 vil fortrinsvis involvere anvendelse af protoplaster fra omtalte stammer. Imidlertid virker den konventionelle protoplasttransformationsmetode, som beskrevet af Cohen et al., supra., ikke på alkalofile Bacillus-stammer. Derfor skulle der udvikles yderligere meto-15 der.

Hos alkalofile bacilli kan dannelsen og regenereringen af protoplaster foregå ved høj pH-værdi, fortrinsvis omkring pH 8. Protoplaster kan fremstilles ved at resuspendere cellerne i et alkalisk holdende medium 20 (AHM), pH 7,8 til 8,5, med efterfølgende inkubering af cellerne i 30-80 minutter ved 37°C. For et eksempel på en AHM, se eksempel 5. De resulterende protoplaster vaskes derefter for at fjerne lysozym og resuspenderes i AHM. Plasmid-konstruktionen og den alkalofile Ba-25 cillus-vartsprotoplast kombineres derefter under tilstedeværelse af et passende fusogen. Mens ethvert fuso-gen, der fremviser den ønskede effektivitet, kan anvendes, har polyethylenglycol (mw 1000-8000) vist sig at give højeffektiv fusion med stor bekvemmelighed.

30 Protoplaster fremstillet ud fra Baclllus-acceptor-stammen blandes med det konstruerede plasmid i højst 5 minutter, fortrinsvis højst 2 minutter, i tilstedeværelsen af polyethylenglycol. Fusogenblandingen erstat-

I DK 175738 B1 I

I 14 I

I tes derefter med et konventionelt næringsstofmedium, i I

I hvilket cellerne inkuberes i op til 5 timer, fortrins- I

I vis 2-3 timer, før de overføres til regenereringspia- I

I der. Regenereringspladerne indeholder et antibiotikum, I

I 5 som f.eks. neomycin, til selektering af transformanter. I

I Kloner med episomal bevarelse af DNA-konstruk- I

I tionen kan identificeres ved påvisning af ekspression I

af den høj alkaliske serinprotease. For at identificere I

I de kloner, der indeholder den udtrykte konstruktion som I

I 10 en integreret del af deres kromosomer, screenes kloner- I

I ne, der fremkommer, ved isolering af hele det cellulære I

DNA og selektering efter de kloner, i hvilke der ikke I

I kan påvises noget frit plasmid-DNA, men hvori markørge- I

I net udtrykkes. Klonerne kan derefter screenes på pas- I

I ; 15 sende måder til påvisning af den høj alkaliske serin- I

I I proteases ekspression. I

Forskellige påvisningsmetoder, herunder anven- I

I delsen af specifikke antistoffer, DNA- og RNA-hybridi- I

I sering, dannelse af enzymprodukt eller faldet i enzym- I

I 20 substratmængde, kan anvendes ved screening af klonerne I

I for at bestemme tilstedeværelsen af den udtrykte kon- I

struktion og ekspressionen af det strukturelle, inter- I

I essante gen, nemlig proteaseproduktion. Den producerede I

protease kan karakteriseres biokemisk, f.eks. ved må- I

I 25 ling af proteasens molekylvægt ved SDS-polyacrylamid- I

gelelektroforese, histidin-MOPS-gelelektroforese og må- I

ling af de kinetiske parametre Km og Vmax, målt på det I

syntetiske substrat succinyl-L-alanyl-L-alanyl-L-pro- I

lyl-L-phenylalanyl-p-nitro-analid. I

30 Baclllus-værten. der indeholder den udtrykte I

I konstruktion episomalt eller kromosomalt integreret, I

dyrkes derefter i et næringsstofmedium under betingel- I

ser, der favoriserer enzymsyntese. Næringsstofmediet I

15 i DK 175738 B1 i vil sædvanligvis indeholde et middel til bevarelse af plasmidet, som f.eks. tilstedeværelsen af et antibiotikum overfor hvilket den utransformerede vært er sensitiv. Fermenteringen kan fortsættes indtil det flyden-5 de næringsmedium er opbrugt. Hvor produktet er blevet udskilt, kan produktet isoleres fra næringsmediet ved konventionelle metoder, f.eks. ved ekstraktion, chroma-tografi, elektroforese, eller lignende. Hvor produktet er bevaret i cytoplasmaet, kan cellerne høstes ved cen-10 trifugering, filtrering, etc., lyseres ved mekanisk ødelæggelse, detergent, lysozym, eller andre metoder, og produktet kan isoleres som beskrevet tidligere. Når den utransformerede værtscelle er en høj alkalisk pro-teasedanner, kan der ved anvendelse af den omtalte me-15 tode opnås meget forbedrede udbytter af høj alkaliske serinproteaser, sædvanligvis på mindst 120% sammenlignet med udbyttet af den ikke-transformerede værtscelle med en enkelt extrakromosomal genkopi.

De følgende eksempler anføres til illustration 20 og ikke til begrænsning af opfindelsen.

Eksempel l

Oparbejdning af et qenom-DNA-blbllotek ud fra den al-25 kalofile Bacillus novo art PB92 og isolering af serin-proteasegenet.

Kromosomalt DNA isoleret fra Bacillus novo arten PB92 (deponeret under nr. OR-60 hos Laboratorium voor 30 Microbiologie, Technical University of Delft, i Holland, se US patentskrift nr. Re. 30.602) ifølge metoden, der er beskrevet af Saito-Miuva, Biochim. Biophys.

Acta 72 (1963) 619-632, blev delvist fordøjet med re- Η Η

I DK 175738 B1 I

16 I

I striktionsenzymet Sau3A og ligeret ind i BamHI-sitet I

I i plasmid pUBllO (Gryczan et al., J. Bacteriol. 134 I

I (1978) 318-329). pUB110-plasmid-DNA'et blev forberedt I

I som beskrevet af Birnboim og Doly (Nucl. Acids. Res. I

I 5 7 (1979) 1513-1523). I

Ligeringsblandingen blev transformeret ind i B.1 I

I .subtilis 1A40 (Bacillus Genetic Stock Center) ifølge I

I metoden fremlagt af Spizizen et al., J. Bacteriol. 81 I

(1961) 741-746, idet der blev anvendt 0,6-1 pg dna pr. I

10 ml af kompetente celler. Cellerne fra transformations- I

I blandingen blev udpladet på minimalplader med: 2,8% I

I K2HP04, 1,2% KH2P04, 0,4% (NH4)2S04, 0,2% tri-Na-ci- I

trat.2H20, 0,04% MgS04.7H20, 0,00005% MnS04· 4H20, 0,4% I

L-glutaminsyre, 0,5% glucose, 0,02% casaminosyrer, 50 I

15 pg/ml tryptophan, 20 pg/ml methionin, 20 pg/ml lysin, I

20 pg/ml neomycin, 0,4% kasein og 1,5% agar. Efter in- I

kubering af pladerne natten over ved 37°C viste en ud I

H af 50.000 neomycinresistente kolonier forhøjet protea- I

seproduktion udtrykt ved en forstørret udfældning af en I

20 ring af kaseinspaltningsprodukter omkring kolonien på I

agarpladen. Plasmid-DNA blev isoleret fra denne koloni I

ifølge metoden, der er beskrevet af Birnboim og Doly, I

Nucleic Acids. Res. J7 (1979) 1513-1523, og navngivet I

pM58. I

I 25 I

Eksempel 2 I

Ekspression af PB92-serlnproteaseqenet I

i 30 Bacillus subtills 1A40, der indeholdt pM58, blev I

dyrket i minimalmedium (Spizizen et al., Proc. Natl. I

Acad. Sci. USA 44 (1958) 1072-1078) til hvilket, der I

var blevet tilsat 0,02% casaminosyrer, 50 pg/ml trypto- I

I DK 175738 B1 17 i phan, 20 yg/ml methlonin, 20 yg/ml lys in og 20 yg/ml neomycin. Efter 24 timer blev kulturen centrifugeret, og supernatanten prøvet for proteaseaktivitet, idet der blev anvendt dimethylkasein som substrat (Lin et al., 5 J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793). En kultur af subtills 1A40, der indeholdt plasmidet pUBHO, anvendt til kontrol, viste mindre end 1/60 af proteaseaktivi-teten, der blev udvist af den med pM58 transformerede kultur. Proteaseaktivitet blev fuldstændig inhiberet 10 ved behandling med 1 mM phenylsulfonylfluorid (PMSF), men ikke ved behandling med 20 mM EDTA.

Lige store dele af den ovenfor nævnte supernatant blev analyseret på proteingel ifølge metoden beskrevet af Laemmli, Nature 227 (1970) 680. Prøver til 15 analyse på disse geler blev forberedt ved behandling af supernatanterne med 5% trichloreddikesyre (TCA). Efter centrifugering af prøven blev den bundfældede pellet af protein vasket to gange med acetone og derefter resus-penderet i 40 yl prøvepuffer (0,5 M tris/HCl pH 7,5, 20 io% v/v 2-mercaptoethanol, 50% v/v glycerol og 0,05% bromphenolblåt) ved kogning i 10 minutter. Efter elek-troforese blev gelerne farvet ved hjælp af Coomassie Brilliant Blue. Kultursupernatantprøver blev derefter analyseret ved elektroforese. Tre forskellige B^ subti-25 lis 1A40 stammer blev anvendt: en stamme, der indeholdt pUBHO; eller pM58; eller intet plasmid; og Bacillus PB92-protease som kontrol. Efter elektroforese blev gelerne farvet med Commassie Brilliant Blue, og overskudsfarven blev fjernet. Prøven fra B^ subtilis stam-30 men 1A40, der indeholdt pM58, indeholdt et 31 kD protein, der vandrede sammen med Bacillus PB92-protease.

Dette protein blev ikke påvist på kontrolbåndet med stammen B^ subtills 1A40 med pUBHO.

I DK 175738 B1 I

I I

I Alle serinproteaser havde ensartede molekylvægte. I

I Den klonede serinprotease 1 Bacillus PB92 skelnedes I

derfor fra kendte serinproteaser (B^ subtilis subtili- I

I sin, Carlsberg subtilisin) ved transformation af pM58 I

I 5 og pUBHO Ind i den proteasenegative B^ subtilis stamme I

I DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444) og I

I analyse af de ekstracellulært producerede proteaser. I

De opnåede transformanter blev dyrket i minimalmedium I

I (Spizizen et al., supra), der indeholdt 0,02% casamino- I

I 10 syrer, 50 pg/ml histidin og 20 yg/ml neomycin. Efter I

I 24 timer blev prøver udtaget, centrifugeret og uden I

I forudgående behandling analyseret på histidin/MOPS-ge- I

I ler, der indeholdt 75 mM KOH, 40 mM histidin, 100 mM I

I MOPS (3-(N-morpholino)-propansulfonsyre), pH 7,5 og I

15 5% polyacrylamid. Elektroforesepufferen indeholdt 40 mM I

histidin, 100 mM MOPS, pH 6,6. Prøverne blev kørt i I

retning mod katoden. Proteasebåndene blev påvist med I

I ' Agfa Pan loo Professional films (Zuidweg et al., Bio- I

I technol. and Bioengin. Ij4 (1972) 685-714). Disse resul- I

I 20 tater er vist i fig. 1. Som vist indeholder pM58 genet, I

der koder for Bacillus PB92 protease. I

Eksempel 3 I

I 25 Sekventerinq af Bacillus PB92 serinproteaseqenet I

I Den fuldstændige sekvens af et Ball-Hpal-frag- I

I ment af pM58 blev bestemt ved hjælp af Sangers metode, I

Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 6463. Restrik- I

I 30 tionsfragmenter af pM58 (se fig. 2) blev klonet ind i I

I fag Ml3 vektorerne mplO, mpll og mpl8 (Messing et al., I

I Nucleic Acids Res. 9 (1981) 309-321). Indføjelserne af I

pM58 fragmenterne blev screenet ved plaquehybridise- I

I DK 175738 B1 ring. Efter sekventering blev der lavet ti oligonucleo-tider med regelmæssig afstand' på genet, og sekventerin-gen blev gentaget, idet sekvensen i fig. 3 blev bekræftet.

Eksempel 4

Konstruktion af plasmid pMAX-4 med serinproteasegen 10 For at konstruere plasmid pl3CN710 (Fig. 4A) blev pUBHO skåret over med Tagl og PvuII. Fragmentet med genet, der giver neomycinresistens blev oprenset på lavtsmeltende agarose og gjort stumpendet med Klenow polymerase og NTP'er (Maniatis, Molecular Cloning; A 15 Laboratory Manual. Cold Spring Harbor 1982). Plasmid pUC7 (Vieira et al., Gene 19 (1982) 259-268) blev li-neariseret med Sall og gjort stumpendet som beskrevet ovenfor. Begge fragmenter blev ligeret med T4 ligase (Maniatis) og transformeret ind i E. coli JM103. Selek-20 tionen blev foretaget på 2 x TY plader (1,6% w/v Bacto-trypton, 1% w/v gærekstrakt, 0,5% NaCl) indeholdende 50 yg/ml ampicillin og 10 yg/ml neomycin. Det resulterende plasmid med navnet pUCN710 blev skåret over med BamHI. Plasmidet pE194 (Jordanescu, Plasmid 1 (1978) 25 468-479) blev skåret over med Bell. Fragmenterne fra begge overskæringer (digestioner) blev ligeret med T4-ligase og transformeret ind i B^ subtilis 1A40. Selektionen blev foretaget på minimalplader med 20 yg/ml neomycin (se eksempel 1). Det opnåede plasmid, 30 pEl94-neo (fig. 4A) indeholder neomycingenet.

Subkloning af proteasegenet i integrationsvektor pE194-neo blev udført som følger: pM58 (se eksempel 1) blev skåret over med Hpal og Ball og Bglll. Plasmid

I DK 175738 B1 I

li 20 I

I | pE194-neo blev skåret over med Hpal. Disse fragmenter I

I blev ligeret med T4-ligase og transformeret ind i ^ I

I I subtilis 1A40. Transformanter blev selekteret på basis I

—" ~· ' *

I af neomycinresistens og en forøget proteaseproduktion I

I 5 målt ved udfældning af kaseinspaltningsprodukter I

(ringdannelse, se eksempel 1), Plasmid pMAX-4, hvis I

I struktur blev bekræftet ved restriktionsenzymanalyse, I

I blev opnået (se fig. 4B). I

10 Eksempel 5 I

Protoplasttransformation af Baclllus-stammen PB92 med I

I pMAX-4 I

I 15 Bacillus stammen PB92 blev dyrket natten over i I

100 ml NBSG-X medium (Thorne et al., J. Bacteriol. 91 I

I (1966) 1012-1020). Kulturen blev centrifugeret i 10 mi- I

nutter ved 4.500 omdrejninger pr. minut i en Sorvall I

model GSA centrifuge. Protoplaster blev frembragt ved I

I 20 inkubering af bacillerne i 1 time ved 37 eC i 10 ml al- I

kalisk holdende medium (AHM) med 0,5 M sucrose, 0,02 Μ I

MgCl2 og 0,02 M tris/maleat, pH 8,0, i sterilt vand I

tilsat 0,4 mg/ml lysozym. Protoplasterne blev pellete- I

ret (10 minutter ved 4.500 omdrejninger pr. minut), re- I

25 suspenderet i 5 ml AHM+ pH 8,0 puffer (AHM puffer til- I

sat 3,5% w/v Bacto Penassay Broth og 0,04% w/v Albumine I

Merieux), blandet, og derefter pelletteret igen som I

ovenfor. Efter resuspendering i 5,0 ml alkalisk hol- I

dende medium blev 0,5 ml af denne suspension af proto- I

H 30 plaster blandet med 5 μg demineraliseret vand med 1 pg I

plasmid-DNA og inkuberet i 2 minutter under tilstede- I

værelse af 30% w/v polyethylenglycol 8.000, pH 8,0. I

Efter fortynding i forholdet 1:3 med AHM+ pH 8,0 og I

21 DK 175738 B1 centrifugering, blev pelleten resuspenderet i et lille volumen (1 ml) AHM+ og inkuberet i 2-3 timer. Portioner af 100 pi blev udpladet på frisk fremstillede regenereringsplader med 0,5 M natriumsuccinat/HCl pH 8,0, 1,5% 5 w/v agar, 0,5% w/v casaminosyrer, 0,5% w/v gærekstrakt, 0,031 M phosphatpuffer pH 8,0, 0,5% w/v glucose, 0,02 M MgCl2 og 0,02% w/v Albumin Merieux. Disse plader indeholdt også 1000 pg/ml neomycin til selektion. Efter in-kubering ved 37eC i mindst 72 timer, blev kolonierne 10 replica-pladespredt på hjerteinfusionagarplader med 20 yg/ml neomycin.

Eksempel 6 15 Integration af pMAX-4 1 Baclllus-stammen PB92's kromo som.

En koloni af Bacillus-stammen PB92 med pMAX-4, der var opdyrket på hjerteinfusionsplader med 20 yg/ml 20 neomycin, blev inokuleret i 100 ml Tryptonsoya Broth (TSB) med 1 pg/ml neomycin og inkuberet i 24 timer ved 37eC. 2 ml af kulturen (omtrent 109 celler/ml) blev fortyndet i 100 ml af det samme medium, der indeholdt 1 pg/ml neomycin, og inkuberet i 24 timer ved 50°C. Efter 25 24 timer blev. 5 ml af kulturen (omtrent 109 celler/ml) fortyndet igen som beskrevet ovenfor og inkuberet i 24 timer ved 50eC under tilstedeværelse af 1 yg/ml neomycin.

Det sidste trin blev gentaget. Cellesuspensionen blev derefter fortyndet 100 gange og udpladet på Heart In-fusion (HI) agar (Difco) plader med 1 yg/ml neomycin. Pladerne blev inkuberet i 16 timer ved 50°C. Neomycin-resistente kolonier blev isoleret og dyrket i 10 ml TSB-medium med 1 pg/ml neomycin i 16 timer ved 37°C.

I DK 175738 B1 I

22 I

I Pra disse kulturer blev total DNA isoleret (Holmes et I

I al., Anal. Biochem. 114 (1981) 193-197) og undersøgt I

I for manglende plasmid ved DNA-elektroforese på agarose- I

gel. Prøver, hvori plasmid-DNA ikke var målelig, blev I

I 5 undersøgt igen ved transformation af total DNA i ^ I

I subtilis 1A40. Prøver, der ikke var i stand til at I

I transformere B^ subtilis 1A40 blev betragtet som væren- I

I de plasmidfrie. En neomycinresistent og plasmidfri I

I stamme af Bacillus PB92 blev navngivet PBT109. Denne I

10 stamme indeholdt et kopi af plasmid pMAX-4 integreret i I

I kromosomet. I

I Integration i stammen PBT109 blev gennemført ved I

en såkaldt Campbell-type mekanisme ved homolog rekom- I

I bination, der førte til to proteasegener placeret efter I

15 hinanden på kromosomet adskilt af plasmidsekvenser. Den I

I genetiske organisation i stammen PBT109 blev bekræftet I

som vist i den samtidigt verserende ansøgning EP-A- I

I 0 284 126, der blev Indleveret samtidig med nærværende I

I ansøgning, og hvis indhold herved er inkorporeret ved I

20 reference. I

Eksempel 7 I

De transformerede stammers proteaseproduktion I

I I

De transformerede stammers proteaseproduktion I

blev testet ved tilsætning af 0,2 ml af en TSB kultur I

med omtrent 109 celler/ml, til 500 ml rystekolber med I

100 ml af produktionsmediet, der er beskrevet i US- I

30 patentskrift nr. Re. 30.602. Når B.subtllis-stammer I

blev testet, blev pH imidlertid justeret til pH 7,0. I

Neomycin blev tilsat til en koncentration på 20 pg/ml I

I ved stammerne DB104 (pUBHO), DB104 (pMAX-4), PB92 I

23 DK 175738 B1 (pMAX-4) og til en koncentration på 1 pg/ml ved PBT109.

Den relative proteaseproduktion for disse cellelinier er vist i tabel 1.

5 Tabel 1 _Proteaseproduktion 1 transformerede Bacilli_

Stamme Relativ protease- Neomycin- -__produktion*_tilsætning

Bacillus PB92 100,0% 10 Bacillus PB92 (pMAX-4) 120,0% +

Bacillus PBT109 120,0% + B. subtilis DB104 (pUB101)‘ 1,5% + B. subtills DB104 (pMAX-4) 10,0%_ +_ 15 1 For at måle proteaseproduktionen fra proteasegenet fra pMAX-4 alene, blev dette plasmid også transformeret (Spizizen et al., (1961) supra) til den exo-proteasenegative B^ subtilis stamme DB104 (R. Doi, J. Bacteriol. 160 (1984) 442-444), som beskrevet i 20 eksempel 2.

* Proteaseaktivitet blev målt ved anvendelse af dime-thylkasein som substrat som beskrevet af Lin et al., J. Biol. Chem. 244 (1969) 789-793.

ved fermenteringer i større skala (10 liter), 25 viste Bacillus PB92 (pMAX-4) ustabilitet og et fald i produktionen sammenlignet med PBT109, hvis der ikke blev tilsat neomycin til fermenteringsmediet.

Det er tydeligt fra de ovenstående resultater, at der tilvejebringes en effektiv fremgangsmåde til produktion af serinprotease ved stabilt at indføre et homologt eller heterologt gen, der koder for serinprotease, i kromosomet hos industrielle Bacillus stammer. Der tilvejebringes også forøget produktion af en

I DK 175738 B1 I

I 24 I

I serinprotease i en Bacillus vært, der allerede produce- I

I rer en serinprotease. Integration af plasmidkonstruk- I

I tioner i værtscellekromosomer resulterer i en mere sta- I

I bil situation for produktionsfermenteringer og i en me- I

5 get forøget proteaseproduktion i forhold til produktio- I

I nen, når der er extrakromosomale plasmidkonstruktioner I

I tilstede. I

I Alle publikationer og patentansøgninger, der er I

I nævnt i denne beskrivelse, angiver niveauet hos de I

I 10 fagfolk indenfor det tekniske område, denne opfindelse I

I angår. I

Idet denne opfindelse nu er fuldstændig beskre- I

vet, vil det være åbenbart for fagmanden, at der kan I

I laves mange ændringer og modifikationer heri uden man I

I 15 afviger fra de tilføjede kravs ide eller rammer. I

Claims

1. Ekspressionskassette, der som virkningsmæssigt forbundne komponenter omfatter (a) en transkrip-tionsregulerende region og en translationsinitierende 5 region, som er virksomme i en Bacillus-værtscelle, (b) en DNA-sekvens, der koder for en høj alkalisk se-rinprotease, hvis sekvens har mindst 70% homologi I med: HjN-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- g-h-g-t-h-v-a-g-t-i-a-a-l-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p-n-a-e-l-y-a-v-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-ir-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-Ij-V-V-A-A-S-G-N-S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-15 Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A'G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-t-O-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH, t (c) en translations- og transkriptionsterminationsre-20 gion, der er virksom i nævnte værtscelle, hvor ekspressionen af nævnte DNA-sekvens reguleres af nævnte initiations- og terminationsregioner; og (d) mindst en blandt et markørgen og et temperaturfølsomt bakte-rieplasmid-replikationsorigin, hvor den højalkaliske 25 protease har aktivitetsoptimum ved en pH-værdi højere end 9 og bibeholder mindst 80% af den optimale aktivitet ved en pH-værdi på 11 eller højere og kan opnås fra en alkalofil Bacillus-stamme.

2. Ekspressionskassette ifølge krav 1, hvor 30 nævnte protease kan opnås fra Bacillus novo arten PB92. Η I DK 175738 B1 I I I I 26 I

3. Ekspressionskassette ifølge krav 1, hvor I I nævnte DNA-sekvens koder for et polypeptid, der i det I væsentlige omfatter følgende aminosyresekvens: I I HjN-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- I

5 V-L-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- I I g-h-g-t-h-v-a-g-t-i-a-a-l-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p-n-a-e-l-y-a-v- I k-v-l-g-a-s-g-s-g-s-v-s-s-i-a-q-g-l-e-w-a-g-n-n-g-m-h-v-a-n-l- I S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- I I 1 S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- I ίο I I q-y-g-a-g-l-d-i-v-a-p-g-v-n-v-q-s-t-y-p-g-s-t-y-a-s-l-n-g-t-s- I I i M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- I T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. I

4. Transformeret Bacillus-værtscelle, som er i I 15 stand til at danne højalkalisk serinprotease, omfat- I I tende ekspressionskassetten ifølge krav 1, 2 eller 3. I Η, 5. Transformeret Bacillus-vært ifølge krav 4, I Η I hvor nævnte kassette er stabilt inkorporeret i værts- I H kromosomet. I H 20 6. Transformeret Bacillus-værtscelle ifølge krav I H 4 eller 5, omfattende mindst to kopier af nævnte DNA- I sekvens integreret i nævnte celles kromosom. I

7. Transformeret Bacillus-værtscelle ifølge krav I 4, hvor en ikke-transformeret forældrecelle til I 25 nævnte værtscelle er en vildtype-Bacillus, som danner I en serinprotease. I

8. Transformeret Bacillus-værtscelle ifølge krav I H 4, hvor en ikke-transformeret forældrecelle til nævn- I te værtscelle hører til en mutant Bacillus-stamme, I 30 som danner en serinprotease. I

9. Transformeret Bacillus-værtscelle ifølge krav I 4, hvor en ikke-transformeret forældrecelle til nævn- I te værtscelle hører til en mutant Bacillus-stamme, I i DK 175738 B1 som ikke danner en serinprotease.

10. Transformeret Bacillus-værtscelle ifølge et hvilket som helst af kravene 4 til 9, hvor nævnte højalkaliske serinprotease kan opnås fra Bacillus novo 5 arten PB92.

11. Transformeret Bacillus-værtscelle ifølge et I hvilket som helst af kravene 4 til 10, hvor nævnte i DNA-sekvens koder for i det væsentlige følgende aminosyre sekvens :

1. H2N-A- Q-S -V-P-W-G-1 -S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-Q-S-G-V-K-V-A-V-L-D-T-G-I-fi-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N-G-H-G- T-H-V-A-G-T-1-A-A-L-N-N-S-I -G-V-L-G-V-A- P-H-A-B-L-Y-A-V-K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-X-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-K-G-M-H-V-A-N-L-S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N-15 S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S-Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-H-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S-M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-X-N-P-S-W-S-N-V-Q-X-R-N-H-L-K-N-T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-B-A-A-T-R-COOH.

12. Fremgangsmåde til transformation af Bacil-20 lus-værtsceller, som omfatter: tilvejebringelse af ekspressionskassetten ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 3, som koder for en høj alkalisk protease; kombination af en protoplast fremstillet ud fra en 25 Bacillus-værtscelle med nævnte kassette under tilstedeværelse af et fusogent middel ved basisk pH, hvorved nævnte kassette indføres i nævnte værtscelle, og nukleinsyre kodende for nævnte protease integreres i nævnte værtscelles kromoson; og 30 udvælgelse af værtsceller, der stabilt indeholder nævnte proteasegen og som er i stand til at danne højalkalisk protease, hvor den højalkaliske protease hat aktivitetsoptimum ved en pH-værdi højere end 9 og I DK 175738 B1 I I 28 I I bibeholder mindst 80% af den optimale aktivitet ved I en pH-værdi på 11 eller højere og kan opnås fra en I I alkalofil Bacillus-stamme I

13. Premgangsmåde ifølge krav 12, hvor nævnte I 5 fusogene middel er polyethylenglycol i en koncentra- I tion på ca. 30% w/v. I

14. Fremgangsmåde ifølge krav 12 eller 13, hvor I nævnte polypeptid af interesse omfatter i det væsent- I I lige følgende aminosyresekvens: I

10 H2N-A-Q-S-V-P-W-G-I-S-R-V-Q-A-P-A-A-H-N-R-G-L-T-G-S-G-V-K-V-A- I I V-Ii-D-T-G-I-S-T-H-P-D-L-N-I-R-G-G-A-S-F-V-P-G-E-P-S-T-Q-D-G-N- I I g-h-g-t-h-v-a-g-t-i-a-a-l-n-n-s-i-g-v-l-g-v-a-p-n-a-e-l-y-a-v- I I K-V-L-G-A-S-G-S-G-S-V-S-S-I-A-Q-G-L-E-W-A-G-N-N-G-M-H-V-A-N-L- I I S-L-G-S-P-S-P-S-A-T-L-E-Q-A-V-N-S-A-T-S-R-G-V-L-V-V-A-A-S-G-N- I I 15 S-G-A-G-S-I-S-Y-P-A-R-Y-A-N-A-M-A-V-G-A-T-D-Q-N-N-N-R-A-S-F-S- I I Q-Y-G-A-G-L-D-I-V-A-P-G-V-N-V-Q-S-T-Y-P-G-S-T-Y-A-S-L-N-G-T-S- I M-A-T-P-H-V-A-G-A-A-A-L-V-K-Q-K-N-P-S-W-S-N-V-Q-I-R-N-H-L-K-N- I H T-A-T-S-L-G-S-T-N-L-Y-G-S-G-L-V-N-A-E-A-A-T-R-COOH. I

15. Anvendelse af en transformeret Bacillus-vært I 20 som defineret i et hvilket som helst af kravene 4 til I 11, eller som opnået ved en fremgangsmåde som define- I ret i et hvilket som helst af kravene 12 til 13, til I fremstilling af en højalkalisk serinprotease. I

16. Fremgangsmåde til fremstilling af en højal- I H 25 kalisk serinprotease i Bacillus, hvor nævnte frem- I H gangsmåde omfatter: I dyrkning af en Bacillus-kultur omfattende Bacillus- I H cellerne ifølge et hvilket som helst af kravene 4 til I I I H 30 17. Fremgangsmåde ifølge krav 15, hvor nævnte I H plasmidkonstruktion yderligere omfatter: I H en anden DNA-sekvens, der koder for en sekretorisk I H leader og et produktionssignal, der er virkningsmæs- I DK 175738 B1 sigt forbundet til 5'-enden af nævnte første DNA-sekvens, hvorved nævnte ekspressionsprodukt sekreteres .

18. Fremgangsmåde ifølge krav 16 eller 17, yder-5 ligere omfattende: isolering af nævnte ekspressionsprodukt.