DK175174B1 - Anthracyclinimmunokonjugater med en hidtil ukendt linker og fremgangsmåder til fremstilling deraf - Google Patents

Description

DK 175174 B1

Den foreliggende, opfindelse angår hidtil ukendte anthracyclinimmunokonjugater og fremgangsmåder til fremstilling deraf. Nærmere betegnet angår den foreliggende opfindelse immunokonjugater omfattende et antistof, som er reaktivt med en udvalgt cellepopulation, der skal tilintetgøres, hvilket antistof har et antal cytotoksiske 5 anthracyclinmolekyler covalent bundet til dets struktur. Hvert anthracyclinmolekyle er konjugeret til antistoffet via en linkerarm. idet anthracyclinet er bundet til linkeren via en syresensitiv acylhydrazonbinding i anthracyclinets 13-ketostilling. En foretrukken udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse angår et adriamycinimmunokonjugat, hvor adriamycin er knyttet til linkerarmen via en 10 acylhydrazonbinding i 13-ketostillingen. Endvidere indeholder linkeren en disulfid- eller thiætherbinding som del af antistofbindingen til immunokonjugatet. Ifølge den foreliggende opfindelse fremstilles endvidere hidtil ukendte acylhydrazonderivater af anthracyclinet og anvendes ved fremstillingen af immunokonjugateme ifølge den foreliggende opfindelse.

15

Den syresensitive acylhydrazonbinding i de omhandlede immunokonjugater ifølge opfindelsen tillader frigørelse af anthracyclin fra immunokonjugatet i målcellens syreholdige ydre eller indre miljø. Immunokonjugateme og metoderne ifølge den foreliggende opfindelse er derfor nyttige i antistofmedierede 20 lægemiddelafgivelsessystemer til præferentiel tilintetgørelse af en udvalgt population af celler ved behandling af sygdomme, såsom cancer og andre tumorer, ikke-cytocide virusinfektioner eller andre patogene infektioner samt autoimmunsygdomme.

Anthracycliner er antibiotiske forbindelser, som udviser cytotoksisk aktivitet.

25 Undersøgelser har vist, at anthracycliner kan tilintetgøre celler på forskellig måde, herunder 1) indføjelse af lægemiddelmolekylerne i en celles DNA*til inhibering af DNA-afhængig nukleinsyresyntese, 2) frembringelse ved hjælp af lægemidlet af frie radikaler, som derefter reagerer med cellulære makromolekyler til ødelæggelse af cellerne, eller 3) interaktioner af lægemiddelmolekyleme med cellemembranen (se 30 f.eks. C. Peterson et al., 'Transport and Storage of Anthracyclines in Experimental Systems and Human Leukemia", i Anthracvcline Antibiotics in Cancer Therapy. F.M.

Muggia et al. (eds), side 132 (Martinus Nijhoff Publishers 1982) og N.R. Bachur, "Free Radical Damage", id. side 97-102). På grund af deres cytotoksiske potentiale er anthracycliner blevet anvendt ved behandling af talrige cancersygdomme, såsom 35 leukæmi, brystcarcinom, lungecarcinom, ovarieadenocarcinom og sarcomer (se f.eks.

P.H. Wiernik, "Current Status of Adriamycin and Daunomycin in Cancer Treatment", i 2 DK 175174 B1

Anthracvclines: Current Status and New developments. S.T Crooke et al. (eds ), side 273-294 (Academic Press 1980)). Alment anvendte anthracycliner omfatter adriamycin og daunomycin.

5 Selvom disse forbindelser kan være nyttige ved behandling af neoplasmer og andre sygdomstilstande, hvor en udvalgt cellepopulation søges tilintetgjort, er deres terapeutiske virkning ofte begrænset af den dosisafhængige toksicitet, der er forbundet med administrering deraf. Ved behandling af tumorer er f.eks. myeloundertrykkelse og cardiotoksicitet typiske uønskede bivirkninger (se S.T.

10 Crooke, "Goals for Antra-cycline Analog Development at Bristol Laboratories", i Anthracvclines: Current Status and New Developments, ovenfor side 11). Man har derfor ved behandlingen af tumorer gjort forsøg på at forbedre de terapeutiske virkninger af disse forbindelser ved at binde anthracyclinet til antistoffer rettet mod tumorassocierede antigener. På denne måde kan lægemidlet afgives til eller 15 "målrettes" mod tumorområdet, og dets toksiske bivirkninger på normale celler i legemet kan formindskes. Immunokonjugater omfattende anthracycliner, adriamycin (ADM) eller daunomycin (DAU) bundet til polyklonale eller monoklonale antistoffer rettet mod tumorassocierede antigener, er kendt i teknikken (se f.eks. J. Gallego et al., "Preparation of Four Daunomycin-Monoclonal Antibody 791T/36 Conjugates with Anti-20 Tumor Activity", Int. J. Cancer. 33, side 737-744 (1984) og R. Arnon et al., "In vitro and in vivo Efficacy of Conjugates of Daunomycin with Anti-Tumor Antibodies",

Immunological Rev.. 62, side 5-27 (1982)).

De hyppigst anvendte måder for binde et anthracyclin til et antistof er benyttelse af en 25 binding til anthracyclinets aminosukkerrest. Aminosukkeret er f.eks. blevet oxideret ved natriumperiodatbehandling og direkte knyttet til lysinresterne på antistoffet ved Schiff-basedannelse (se f.eks. E. Hurwitz et al.. The Covalent Binding of Daunomycin and Adriamycin to Antibodies, with Retention of Both Drug and Antibody Activities",

Cancer Res.. 35, side 1182-1186 (1975)). Alternativt er anthracycliner blevet bundet til 30 antistoffer ved carbodiimidmedieret binding af anthracyclinets aminosukker til carboxylgrupper på antistoffet (se f.eks. E. Hurwitz et al., ovenfor). Anthracycliner er også blevet bundet til antistoffer ved tværbinding af lægemidlets aminosukker og aminogrupper på antistoffet med glutaraldehyd (se f.eks. M. Belles-lsles et al., "In vitro Activity of Daunomycin-Anti-AlphaFetoprotein Conjugate on Mouse Hepatoma Cells", 35 Br, J, Cancer. 41, side 841-842 (1980)). Undersøgelser med immunokonjugater, hvor aminosukkerdelen i anthracyclinmolekylet er modificeret ved binding til antistoffet, 3 DK 175174 B1 indikerer imidlertid et tab i cytotoksisk aktivitet hos det konjugerede lægemiddel (se f.eks. R. Arnon et al., ovenfor side 7-8). Undersøgelser af anthracyclinanaloger indikerer endvidere, at modifikationer af anthracycliner i deres aminosukkerdel resulterer i et fald i cytotoksisk aktivitet hos lægemiddelanalogerne i forhold til stam-5 lægemidlet (se f.eks. K. Yamamoto et al., "Antitumor Activity of some Derivatives of Daunomycin at the Amino and Methyl Ketone Functions", J. Med. Chem., 15, side 872-875 (1972)).

Yderligere andre immunokonjugater er blevet fremstillet, hvor anthracyclinet 10 daunomycin er blevet bundet direkte til et antistof i 14-carbon-(C-14)-stillingen i lægemidlet. Den mod tumorceller rettede selektive cytotoksiske aktivitet hos disse immunokonjugater var imidlertid ikke let at reproducere og påvistes kun konsistent ved en koncentration på 20 pg/ml (se J. Gallego et al., ovenfor).

15 I JP-patentansøgning nr. 274.658 beskrives konjugeringen af et anthracyclin til et antistof via en 13-keto-acylhydrazonbinding. Denne konjugation udførtes ved metoder, der omfattede derivatisering af antistoffet og efterfølgende omsætning af derivatet med anthracyclin. Disse metoder er ikke at foretrække, da derivatisering af antistoffet involverer uønskede ikke-specifikke reaktioner, og der opnås meget lave 20 anthracyclin:antistof-forhold.

FR-A-2455595 beskriver bis(anthracyclin)dihydrazoner. EP-A-0243929 beskriver immnokonjugater af proteiner uden at der imidlertid udtrykkeligt beskrives anvendelsen af acylhydrazoner og disulfider eller thioethere i linkeren.

25

Ifølge den første metode behandles antistoffet med carbodiimid Nnærvær af hydrazin til opnåelse af et hydrazidoantistofderivat, som derefter omsættes med anthracyclinet således, at anthracyclinet blev bundet direkte til antistofstrukturen. De resulterende immunokonjugater udviser imidlertid tendens til aggregation af antistofmolekylerne. Da 30 denne metode kræver carboxylsyregrupper på antistofmolekylet, som er begrænset i antal, har disse immunokonjugater endvidere lave anthracyclin:antistof-forhold (ca.

1.1-1,3).

Den anden metode omfatter omsætning af antistoffet med ravsyreanhydrid til 35 opnåelse af et amidsyrederivat af antistoffet. Dette derivat omsættes så med hydrazin til opnåelse af et antistofhydrazidderivat, som derefter omsættes med anthracyclinet , t 4 DK 175174 B1 daunomycin. Denne anden metode har den ulempe, at omsætningen af antistofderivatet med hydrazin ikke er specifik, hvilket fører til fremstilling af en blanding af forskellige antistofderivater udover det ønskede hydrazidderivat. Som beskrevet i ovennævnte JP-patentansøgning nr. 274.658 var molforholdet mellem 5 anthracyclin og antistof således meget lavt (ca 1, se JP-patent-ansøgnig nr. 274.658, side 264, spalte 1).

Andre anthracyclinhydrazoner er beskrevet af G.L. Tong et al.. J. Med. Chem.. 21, side 732-737 (1978), T. Smith et al., J. Med. Chem,. 21, side 280-283 (1978) og 10 R.T.C. Brownlee et al.. J. Chem. Soc.. side 659-661 (1986). I US-patentskrift nr.

4.112.217 beskrives bis-hydrazoner af daunomycin og adriamycin.

I andre undersøgelser er anthracycliner blevet bundet til bærere med høj molekylvægt, såsom dextran eller polyglutaminsyre, for at øge den cytotoksiske aktivitet og 15 formindske toksiciteten af lægemidlet (se f.eks. R. Amon et al., ovenfor, side 5 og E.

Hurwitz et al., "Soluble Macromolecules as Carriers for Daunorubicin", J. AddI,

Biochem.. 2, side 25-35 (1980)). Disse bærer-bundne anthracycliner er også blevet bundet covalent til antistofferne rettet mod tumorassocierede antigener til dannelse af immunokonjugater til målretning af det cytotoksiske lægemiddel, især mod tumorceller.

20 Adriamycin er f.eks. blevet bundet til et sådant "antitumor"-antistof via en carboxymethyl-dextranhydrazidbro, hvor adriamycinmolekylet var bundet til et hydrazinderivat af carboxymethyidextran ved C-13 carbonylsidekæden i adriamycins tetracyclinring til dannelse af et hydrazon. Antistoffet blev så bundet til dextranhydrazidderivatet med glutaraldehyd til dannelse af et adriamycin-dex-25 antistofkonjugat (se R. Amon et al., "Monoclonal Antibodies as Carriers for Immunotargeting of Drugs", i Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy. R.W. Baldwin et al. (eds.), side 365-383 (1985) og E. Hurwitz et al., "A Conjugate of Adriamycin and Monoclonal Antibodies to Thy-1 Antigen Inhibits Human Neuroblastoma Cells in vitro", Ann. ΝΎ. Acad. Sci.. 417, side 125-136 (1983)).

30

Anvendelsen af bærere medfører imidlertid visse ulemper. Bærerholdige immunokonjugater er f.eks. temmelig store og fjernes hurtigt af det retikuloendotele system in vivo (se f.eks. R.O. Dillman et al., "Preclinical Trials with Combinations and Conjugates of T101 Monoclonal Antibody and Doxorubicin", Cancer Res.. 46, side 35 4886-4891 (1986)). Denne hurtige fjernelse af de bærerholdige immunokonjugater er muligvis ikke fordelagtig ved terapi, da det konjugerede lægemiddel måske aldrig når 5 DK 175174 B1 det tilsigtede virkningsområde, dvs. den udvalgte cellegruppe, der skal tilintetgøres.

Derudover kan tilstedeværelsen af bæreren med høj molekylvægt påvirke stabiliteten af immunokonjugatet i negativ retning, og har det vist sig, at bæreren formindsker bindingsaktiviteten af antistoffet til konjugatet (se f.eks. M.J. Embleton et al., "Antibody 5 Targeting of Anti-Cancer Agents", i Monoclonal Antibodies for Cancer Detection and Therapy. R.W. Baldwin et al. (eds ), side 323-324 (1985)). Undersøgelser med ' tumorceller har endvidere vist, at der ikke er noget bevis for at immunokonjugater indeholdende bærere med høj molekylvægt er i stand til at lokalisere sig til tumorcellerne in vivo, se f.eks. C.H.J. Ford et al., "Localization and Toxicity Study of a 10 Vindesine-Anti-CEA Conjugate in Patients with Advanced Cancer", Br. J. Cancer. 47, 35-42 (1983), som beskriver lokalisering af direkte konjugerede lægemiddelantistofkonjugater til tumorceller in vivo.

Konjugeringen af anthracycliner til antistoffer ved brug af specifikke bindinger og 15 bærere er således blevet beskrevet. Som beskrevet ovenfor medfører anvendelsen af disse immunokonjugater klare ulemper afhængig af den specifikke binding eller bærer, der anvendes.

Den foreliggende opfindelse tilvejebringer en hidtil ukendt kemi for binding af et antal 20 cytotoksiske anthracyclinmolekyler via en linkerarm til et antistof rettet mod en udvalgt målcellepopulation, der skal tilintetgøres. Ifølge den foreliggende opfindelse er mindst 1 til ca. 10 anthracyclinmolekyler bundet til antistoffet via en linkerarm, idet anthracyclinet er bundet til denne linker via en acylhydrazonbinding i anthracyclinets 13-ketostilling, idet linkeren yderligere indeholderen disulfid- eller thioetherbinding, til 25 dannelse af de hidtil ukendte immunokonjugater ifølge opfindelsen. En foretrukken udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse omfatter f.eks: syntese af et hidtil ukendt adriamycin-hydrazonderivat (ADM-HZN), som derefter kondenseredes med et thioleret antistof, hvilket resulterer i binding af anthracyclinet til antistoffet via en linkerarm. En acylhydrazonbinding dannet i C-13-stillingen af ADM tjener som 30 bindingsplads for ADM til linkeren. Derudover findes en disulfidbinding i linkeren som plads for binding af antistoffet. Ifølge en anden foretrukken udførelsesform reduceres ÅDM-HZN til frembringelse af en sulfhydrylgruppe, og det resulterende hidtil ukendte hydrazonderivat kondenseredes med et maleimidderivatiseret antistof. Dette førte til dannelse af en linkerarm med en acylhydrazonbinding som plads for linkerbinding til 35 C-13-stillingen i ADM og en thioetherbinding i linkeren som del af linkerbindingen til antistoffet. Som det fremgår af disse udførelsesformer tilvejebringes ifølge den 6 DK 175174 B1 foreliggende opfindelse hidtil ukendte acylhydrazonderivater af anthracycliner, hvilke derivater er nyttige ved fremstilling af immunokonjugaterne ifølge opfindelsen.

Immunokonjugaterne ifølge den foreliggende opfindelse udviser anthracyclin:antistof-5 molforhold på ca. 4-10 og bibeholder både antistofaktivitet og cytotoksisk lægemiddelaktivitet til tilintetgørelse af udvalgte målceller. Den syresensitive hydrazonbinding, der er til stede på pladsen for binding af anthracyclin til immunokonjugatets linkerarm og endvidere disulfid- eller thioetherbindingeme i linkerarmen ifølge foretrukne udførelsesformer for den foreliggende opfindelse, er 10 ideelle til frigørelse af det aktive lægemiddel under sådanne reduktions- og syrebetingelser, der typisk forekommer i celler, f.eks. i lysosomale vesikler.

De omhandlede immunokonjugater kan anvendes i farmaceutiske præparater, f.eks. præparater indeholdende en farmaceutisk virksom mængde af mindst ét 15 immunokonjugat ifølge opfindelsen og en farmaceutisk acceptabel bærer. Den foreliggende opfindelse omfatter også fremgangsmåder til selektiv afgivelse af cytotoksiske lægemidler til en udvalgt population af målceller, som det er ønskeligt at tilintetgøre, samt fremgangsmåder til behandling af et pattedyr på en farmaceutisk acceptabel måde med en farmaceutisk virksom mængde af præparaterne ifølge den 20 foreliggende opfindelse.

Immunokonjugaterne, de farmaceutiske præparater samt fremgangsmåderne beskrevet heri tilvejebringer fordelagtigt en nyttig fremgangsmåde til målretning af cytotoksiske anthracyclinlægemidler mod en udvalgt population af celler til 25 præferentiel tilintetgørelse af disse målceller ved behandling af sygdomme, såsom cancer og andre tumorer, ikke-cytocide virusinfektioner eller andre patogene infektioner samt autoimmunsygdomme.

Fig. 1 afbilder i skematisk form syntesen af det hidtil ukendte ADM-HZN-30 hydrazonderivat anvendt ved fremstillingen af immunokonjugaterne ifølge opfindelsen.

Fig. 2 afbilder i skematisk form syntesen af immunokonjugaterne ifølge en udførelsesform af opfindelsen, hvor et monoklonalt antistof (MAB) først thioleredes ved anvendelse af enten SPDP (N-succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionat) eller 2-IT 35 (2-iminothiolan), og hvor det thiobehandlede antistof derefter omsattes med ADM-HZN

til dannelse af et immunokonjugat ifølge opfindelsen med en hydrazonbinding i 13- keto-stillingen af AOM og en disulfidbinding i linkerarmen.

7 DK 175174 B1

Fig. 3 afbilder et punktdiagram, som sammenligner antallet af reaktive thiolgrupper 5 substitueret på det monoklonale antistof (SH:MAB-forhold) med det endelige ADM:MAB-molforhold opnået i immunokonjugater fremtillet ved kondensering af de SDSP-thiolerede, monoklonale 5E9 og 3A1 antistoffer med ADM-HZN.

Fig. 4 afbilder et punktdiagram, som sammenligner SH:MAB-forholdet med det endelig 10 ADM.MAB-molforhold opnået i immunokonjugater fremstillet ved omsætning af 2-IT-thiolerede 5E9 og 3A1 antistoffer med ADM-HZN.

Fig. 5 afbilder et punktdiagram, som viser forholdet mellem ADM.MAB-molforholdet og proteinudbyttet af immunokonjugater ifølge opfindelsen fremstillet ved anvendelse af 15 enten SPDP-thiolerede anti-stoffer eller 2-IT-thiolerede antistoffer.

Fig. 6. afbilder et punktdiagram, som sammenligner ADM:MAB-molforholdet over for proteinudbyttet opnået ved immunokonjugatfrem-stillinger under anvendelse af monoklonale antistoffer af enten lgG1-isotypen (f.eks. 5E9 eller 3A1) eller lgG2-20 isotypen (f.eks. L6). Disse antistoffer var blevet thioleret med SPDP.

Fig. 7 afbilder også et punktdiagram, som sammenligner ADM.MAB-molforholdet over for proteinudbyttet af immunokonjugater med anti-stoffer af lgG1- eller lgG2-isotypen (som i fig. 6) bortset fra, at disse antistoffer var blevet thioleret under anvendelse af 2-25 IT.

Fig. 8 afbilder i grafisk form bindingskurverne for to immunokonjugater ifølge opfindelsen sammenlignet med bindingskurverne for de respektive ukonjugerede monoklonale antistoffer.

30

Fig. 9 afbilder en HPLC-kromatografisk kurve, som viser stabiliteten af et immunokonjugat ifølge opfindelsen i pH-området 4-7. Denne kromatografiske kurve viser syresensitiviteten af acylhydrazonbindingen ifølge opfindelsen som indikeret ved den stigende frigørelse af frit ADM fra immunokonjugatet, idet pH-værdien bliver mere 35 sur.

8 DK 175174 B1

Fig. 10 afbilder en HPLC-kromatografisk kurve, som viser frigørelsen af en ADM-rest fra et immunokonjugat ifølge opfindelsen efter behandling med DTT.

Fig. 11 afbilder i grafisk form den selektive cytotoksicitet af immunokonjugater ifølge 5 opfindelsen overfor Daudi-cellelinien ved anven-delse af et kolonidannelsesassay i blød agar. Disse immunokonjugater fremstilledes ved anvendelse af 2-IT-thiolerede antistoffer.

Fig. 12 afbilder i grafisk form den selektive cytotoksicitet af immunokonjugater ifølge 10 opfindelsen overfor Namalwa-celler og den stigende styrke af immunokonjugaterne sammenlignet med frit ADM ved anvendelse af et grænsefortyndingsforsøg,

Fig. 13 afbilder i grafisk form den selektive cytotoksicitet af immunokonjugater ifølge opfindelsen overfor Daudi-celler ved anvendelse af et kolonidannelsesassay i blød 15 agar. I dette tilfælde fremstilledes immunokonjugaterne ved anvendelse af SPDP-thiolerede antistoffer,

Fig. 14 afbilder i grafisk form den selektive cytotoksicitet af et andet immunokonjugat ifølge opfindelsen fremstillet med SPDP som det thiolerende middel: Dette 20 immnokonjugat var cytotoksisk overfor antigen-positive Daudi- og Namalwa-celler, men ikke overfor antigen-negative FISB-2-celler ved anvendelse af kolonidannelsesassay i blød agar.

Fig. 15 afbilder den selektive cytotoksicitet af 5E9 og 3A1 immunokonjugater ifølge 25 opfindelsen overfor en human kolon-carcinom-cellelinie (5E9+, 3A1-) ved anvendelse af et kolonidannelsesassay.

Fig. 16 afbilder i grafisk form manglen på cytotoksicitet overfor Daudi-celler af immunokonjugater fremstillet ved binding af ADM til monoklonale antistoffer på ADM's 30 aminosukkerrest via en leu-ala-dipeptidlinker.

Fig. 17 afbilder i skematisk form syntesen af et immunokonjugat ifølge opfindelsen, hvor det hidtil ukendte ADM-HZN-derivat ifølge opfindelsen reduceres og omsættes med et SMPB (succinimidyl-4-(p-maleinidophenyl)butyrat)-behandlet antistof til 35 dannelse af et immunokonjugat med en linkerarm med en thioetherbinding i dets struktur.

9 DK 175174 B1

Fig. 18 afbilder i grafisk form cytotoksiciteten af et immunokonjugat ifølge opfindelsen med et thioetherbinding i linkerarmen udover 13-ketoacylhydrazonbindingen.

Immunokonjugatet viste større styrke i forhold til det fri ADM overfor Namalwa-celler ved anvendelse af et 3H-thymidin inkorporeringsassay.

5

Fig. 19 afbilder i grafisk form cytotoksiciteten af immunokonjugatet ifølge fig. 18 overfor HSB-2-celler ved anvendelse af samme 3H-thymidin inkorporeringsassay.

Fig. 20 afbilder i grafisk form den selektive cytotoksicitet af et immunokonjugat ifølge 10 opfindelsen imod antigen-positive celler over for antigen-negative celler ved anvendelse af nævnte 3H-thymidin inkorporeringsassay, idet immunokonjugatet udover 13-keto-acylhydrazonbindingen også har en thioetherbinding i dets linkerarm.

Fig. 21 afbilder i grafisk form in vivo antitumoraktiviteten af et immunokonjugat ifølge 15 opfindelsen på humane Daudi-tumorxenotransplantater i mus. Immunokonjugatet udviste størst antitumoraktivitet end observeret ved anvendelse af en ækvivalent dosis frit ADM.

Fig. 22 afbilder i grafisk form in vivo antitumoraktiviteten af ADM på humane Daudi-20 tumorxenotransplantater i mus mod tiden og ved forskellige doser ADM under anvendelse af et Q7Dx3-behandlingsskema og i.v. administrering.

Fig. 23 afbilder i grafisk form in vivo antitumoraktiviteten af et immunokonjugat ifølge opfindelsen på humane Daudi-tumorxenotransplantater i mus sammenlignet med 25 antitumoraktiviteten af optimeret frit ADM (indgivet i.v. under anvendelse af et Q7Dx3-behandlingsskema ved en dosis på 10-11 mg/kg/injektion). ImmOnokonjugatet udviste større antitumoraktivitet.

Fig. 24 afbilder i tabelform in vivo antitumoraktiviteten af ADM på humane Ramos-30 tumorxenotransplantater i mus ved i.v. administrering, men ved varierende behandlingsskemaer og -doser.

Fig. 25 afbilder i grafisk form in vivo antitumoraktiviteten af ADM på humane Ramos-tumor-xenotransplantater i mus mod tiden og ved forskellige doser ADM ved 35 anvendelse af et behandlingsskema med en enkelt injektion og i.v. administrering.

10 DK 175174 B1

Fig 26A afbilder i grafisk form in vivo antitumoraktiviteten af et immunokonjugat ifølge opfindelse på humane Ramos-tumorxenotransplantater i mus sammenlignet med antitumoraktiviteten af optimeret frit ADM (indgivet i.v. under anvendelse af et Q1Dx1-behandlingsskema ved 16-18 mg/kg/injektion). Immunokonjugatet udviste større 5 antitumoraktivitet end det fri ADM. Fig. 26B afbilder in vivo antitumoraktiviteten af immunokonjugatet mod tiden ved forskellige doser af konjugatet, hvilket viser den dosisafhængige art af konjugatets antitumorvirkning: Doseringen af de i fig. 26A og 26B testede immunokonjugater er angivet som input af konjugeret anthracyclin, og antistof-input er anført i parentes.

10

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte anthracyclinimmunokonjugater, hidtil ukendte anthracyclin-acylhydrazonderivater, fremgangsmåder til fremstilling deraf samt farmaceutiske præparater og metoder til afgivelse af cytotoksiske anthracycliner til en udvalgt population af celler, der ønskes tilintetgjort ved behandling af sygdomme, 15 såsom cancer og andre tumorer, ikke-cytocide virusinfektioner eller andre patogene infektioner samt autoimmunsygdomme. Den foreliggende opfindelse angår nærmere betegnet immunokonjugater omfattende et antistof rettet mod en udvalgt cellepopulation, hvilket antistof har et antal anthracyclinmolekyler bundet til dets struktur. Anthracyclinmolekylerne er bundet covalent til antistoffet således, at der 20 dannes en linkerarm mellem hvert lægemiddelmolekyle og antistoffet, idet linkeren er bundet til anthracyclinet via en acylhydrazonbinding i 13-keto-stillingen på anthracyclinet. Dette kan opnås på trinvis måde ved indledningsvis dannelse af et hidtil ukendt anthracyclin-hydrazonderivat, som derefter omsættes med et antistof med passende specificitet (se f.eks. R.R. Hardy, "Purification and Coupling of Fluorescent 25 Proteins for use in Flow Cytometry", i Handbook of Experimental Immunology, vol. 1, Immunochemistry, D.M. Weiretal., (eds ), side 31.4-31.12 (4. udgave, 1986) for beskrivelse af konventionel antistofkoblingsteknik). Længden af den linkerarm, der forbinder anthracyclin- og antistofkomponenterne i immunokonjugatet kan variere, sålænge bindingspladsen for linkeren til anthracyclinet er i form af et acylhydrazon i C-30 13-stillingen på anthracyclinet. Linkerarmen kan endvidere indeholde en anden binding, såsom en disulfid-, thioether-, amid-, carbamat-, ether- eller esterbinding, et sted mellem bindingsstedet for lægemidlet til bindingsstedet for antistoffet.

De anthracycliner, der indgår i immunokonjugaterne ifølge opfindelsen, kan være 35 vilkårlige anthracycliner, der indeholder en ketogruppe i 13-carbon (C-13)-stillingen.

Sådanne anthracycliner omfatter, men er ikke begrænset til adriamycin, daunomycin, 11 DK 175174 B1 detorubicin, carminomycin, idarubicin, epirubicin, esorubicin, 4'-THP-adriamycin, AD-32 og 3’-deamino-3'-(3-cyano-4-morpholinyl)doxorubicin (se A,M. Casazza, "Experimental Studies on New Anthracyclines", i Adriamvcin: Its Expandino Role in Cancer Treatment. M. Ogawa et al. (eds.), side 439-452 (Excerpta Medica 1984)).

5

De antistoffer, der indgår i immunokonjugaterne ifølge opfindelsen, kan være vilkårlige antistoffer, der reagerer med en specifik cellepopulation, der ønskes elimineret eller tilintetgjort. Eksempler på sådanne antistoffer omfatter, men er ikke begrænset til antistoffer, som binder til tumorassocierede antigener, såsom antigener, der findes på 10 carcinomer, melanomer, lymphomer, knogle- eller blødtvævssarcomer samt andre tumorer, antistoffer, der binder til virusantigener eller andre patogenassocierede antigener samt antistoffer, der binder til abnormale celleoverfladeantigener. Disse antistoffer kan være polyklonale eller fortrinsvis monoklonale og kan fremstilles ved i teknikken kendte metoder (se f.eks. R.A. DeWeger et al., "Eradication of Murine 15 Lymphoma and Melanoma Cells by Chlorambucil-Antibody Complexes",

Immunological Rev.. 62, side 29-45 (1982) (fremstilling af tumor-specifikke polyklonale antistoffer og anvendelse deraf i konjugater), og M. Yeh et al., "Cell Surface Antigens of Human Melanoma Identified by Monoclonal Antibody", Proc. Natl. Acad. Sci.. 76, side 2927-2931 (1979) samt J.P. Brown et al., "Structural Characterization of Human 20 Melanoma-Associated Antigen p97 with Monoclonal Antibodies", J. Immunol.. 127 (nr.

2), side 539-546 (1981) (fremstilling af tumorspecifikke monoklonale antistoffer).

Eksempelvis kan det monoklonale antistof L6, som er specifikt for humane lungecarcinomceller, eller det monoklonale antistof 791T/36, som er specifikt for østrogene sarcomceller, anvendes. Ikke-intemaliserende eller fortrinsvis 25 internaliserende antistoffer kan anvendes. Udtrykket "antistof' omfatter således som det anvendes i det foreliggende intakte antistofmolekyler eller -fragmenter indeholdende det aktive bindingsområde for antistofmolekylet, f.eks. Fab eller F(ab')2.

Hvis der anvendes monoklonale antistoffer, kan disse være af murin eller human oprindelse eller være kimære antistoffer, men er ikke begrænset dertil.

30

Antistofferne i immunokonjugaterne ifølge opfindelse fremfører således anthracyclinmolekylerne til den særlige cellepopulation med hvilken antistoffet er reaktivt. Et antistof rettet mod et antigen, der findes på overfladen af tumorceller, vil f.eks. binde til og afgive dets anthracycliner til disse tumorceller, eller et antistof rettet 35 mod et protein hos human immundeftciens virus (HIV), som forårsager AIDS, vil afgive dets cytotoksiske anthracycliner til HIV-inficerede celler. Frigørelse af lægemidlet i 12 DK 175174 B1 eller på stedet for den særlige cellepopulation, hvormed antistoffet reagerer, resulterer i præferentiel tilintetgørelse af disse særlige celler. Det er således åbenbart, at immunokonjugaterne ifølge opfindelsen er nyttige ved behandling af en vilkårlig sygdom, hvor en specifik cellepopulation søges tilintetgjort, idet cellepopulationen har 5 et celleoverfladeantigen, som tillader binding af immunokonjugatet. De sygdomme, for hvilke de omhandlede immunokonjugater er nyttige, omfatter, men er ikke begrænset til cancer og andre tumorer, ikke-cytocide virusinfektioner eller andre patogene infektioner, såsom AIDS, herpes, CMV (cytomegalovirus), EBV (Epstein Barr virus) og SSPE (subakut sklerose panencephalitis) samt rheumatoid arthritis.

10

Uden at være bundet af teorien antages det, at de antistofbundne anthracyclinmoleky-ler, dvs. i form af det omhandlede immunokonjugat, afgives til de målceller, der skal tilintetgøres, via antistofspecificitet og derefter trænger ind i cellen ad den samme endocytiske vej, som fører til internalisering af de membranbundne, ukonjugerede 15 antistoffer og ligander (se f.eks. I. Pastan et al., "Pathway of Endocytosis", i Endocvto-sis. I. Pastan et al., (eds ), side 1-44 (Plenum Press 1985)). Når først de er inde i cellen sammensmelter de endocyte vesikler indeholdende immunokonjugatet med primære lysosomer til dannelse af sekundære lysosomer (se. f.eks. M.J. Embleton et al., ovenfor, side 334). Da anthracyclinmolekylerne er bundet til immunokonjugatets 20 antistof via syresensitive acylhydrazonbindinger, resulterer udsættelse af immunokonjugatet for det sure miljø i de endocyte vesikler og lysosomer i frigørelse af anthracyclinet fra immunokonjugatet. Det frigjorte anthracyclin antages endvidere, at være et relativt umodificeret lægemiddel, som er i stand til at udvise fuld cytotoksisk aktivitet. Den syresensitive hydrazonbinding i immunokonjugatet er således meget 25 fordelagtig for frigørelsen af det cytotoksiske lægemiddel i målcellerne, idet den forøger cytotoksiciteten af immunokonjugatet overfor disse celler*. Alternativt kan hydrazonbindingen spaltes under sure og reducerende betingelser i de umiddelbare omgivelser uden for eller omkring målcellerne, f.eks. i området for en tumor, og det frigjorte lægemiddel kan optages af tumorcellerne.

30

Immunokonjugaterne ifølge opfindelsen samt fremgangsmåder til fremstilling deraf er eksemplificeret ved foretrukne udførelsesformer, hvor anthracyclinet, adriamycin, konjugeredes med forskellige antistoffer.

35 Først syntetiseredes et hidtil ukendt adriamycin-hydrazonderivat ved en totrins reaktion. Det heterobifunktionelle reagens SPDP (N-succinimidyl-3-(2- 13 DK 175174 B1 pyridyldithio)propionat) omsattes med hydrazin til dannelse af et 3-(2-pyridyldithio)propionylhydrazid, som derefter omsattes med adriamycin.hydrochlorid (ADM-HCI) til dannelse af et hidtil ukendt acylhydrazonderivat af ADM indeholdende en pyridylbeskyttet disulfidrest. En syrekatalysator, såsom trifluoreddikesyre, kan 5 anvendes for at lette dannelsen af hydrazon. Det dannede derivat benævntes adriamycin-13-{3-(2-pyridyldithio)propionyl}hydrazon,hydrochlorid (ADM-HZN) (se fig.

1).

Dette hidtil ukendte ADM-hydrazonderivat omsattes derefter med et monoklonalt 10 antistof, som forud var thioleret med SDSP, og reduceredes eller thioleredes derefter med 2-IT (2-iminothiolan) (se fig. 2). Det resulterende immunokonjugat bestod af ADM-molekyler konjugeret med det monoklonale antistof ved hjælp afen linkerarm bundet til C-13-stillingen i hvert ADM via en acylhydrazonbinding, idet linkerarmen endvidere indeholdt en disulfidbinding ved hjælp af hvilken, det var bundet til 15 antistoffet (se fig. 2).

En anden udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse omfattede syntesen af et andet hidtil ukendt adriamycin-hydrazonderivat, hvor ovennævnte ADM-HZN yderligere behandledes med reduktionsmidleme DTT (dithiotreitol) eller 20 tributylphosphin til fremstilling af 13-{3-(mercaptopropionyl)}adriamycin-hydrazon (se fig. 17). Dette derivat omsattes derefter med et monoklonalt antistof, hvortil maleimidgrupperne var bundet, f.eks. ved omsætning af antistoffet med SMPB (succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)butyrat). Som vist i fig. 17 dannedes et immunokonjugat med en linkerarm, som via en hydrazonbinding var bundet til C-13-25 stillingen i hvert ADM, og endvidere med en thioetherbinding som en del af bindingen til antistoffet. Det er således åbenbart, at den linkerarm, der forbinder lægemidlet og antistoffet, kan bestå af et antal komponenter og bindinger, sålænge disse bindinger omfatter den syresensitive hydrazonbinding i 13-keto-stillingen i anthracyclinet.

30 Det er også åbenbart, at der ifølge den foreliggende opfindelse tilvejebringes hidtil ukendte acylhydrazonderivater af 13-ketoholdige anthracycliner med formel (I), (II) eller (III) 35 14 DK 175174 B1 o

Mir' -(CV. -i -s 5 10 hvor R1 er CH3, CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3. CH2OCOCH(OC2Hs)2, R2 er jQ)-X eller /O'''’ hvor 20 X er hydrogen, N02 eller halogen, R3 er OCH3l OH eller hydrogen, R4 er NH2, NHCOCF3i 4-morpholinyl, 3-cyano-4-morpholinyl, 1-piperidinyl, 4-methoxy- 1-piperidinyl, benzylamin, dibenzylamin, cyanomethylamin eller 1-cyano-2-methoxyethylamin, 25 R5 er OH, O-THP eller hydrogen, R6 er OH eller hydrogen, under den forudsætning, at R6 ikke er OH, når R5 er OH eller O-THP, og n er et helt tal fra 1-10 inklusive, u 0

30 ch2 ) n —S—H

r3 0 oh é

R5 R

35 15 DK 175174 B1 hvor R1 er CH3. CH2OH. CH2OCO(CH2)3CH3, CH2OCOCH(OC2H5)2, R3 er OCH3, OH eller hydrogen, R4 er NH2l NHCOCF3,4-morholinyl, 3-cyano-4-morpholinyl, 1-piperidinyl, 4-methoxy-1-5 piperidinyl, benzylamin, dibenzylamin, cyanomethylamin eller 1-cyano-2-methoxyethylamin, R5 er OH, O-THP eller hydrogen, R6 er OH eller hydrogen, under den forudsætning, at R6 ikke er OH, når R5 er OH eller O-THP, og 10 n er et helt tal fra 1 -10 inklusive,

π M

O OH C S—S—R2 15 R5 NR^R7 20 hvor .

R1 er CH3. CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3, CH2OCOCH(OC2H5)2i R2 er 25 β11θ,Γ Xh*· hvor X er hydrogen, N02 eller halogen, R3 er OCH3, OH eller hydrogen, 30 R4 og R7 hver især uafhængigt er hydrogen, alkyl, substitueret alkyl, cycloalkyl, substituret cycloalkyl, aryl, substitueret aryl, aralkyl eller substitueret aralkyl, eller R4, R7 og N sammen danner en 4- til 7- leddet ring, der eventuelt kan være substitueret, R5 er OH, O-THP eller hydrogen, R6 er OH eller hydrogen, under den forudsætning, at R6 ikke er OH, når R5 er OH eller 35 O-THP, og n er et helt tal fra 1-10 inklusive.

16 DK 175174 B1

Ovennævnte anthracyclin-acylhydrazoner udgør hidtil ukendte mellemprodukter ved fremstillingen af immunokonjugateme ifølge opfindelsen og er eksemplificeret ved ADM-HZN hhv. 13-{3-(mercapto-propionyl)}adriamycin-hydrazon, som beskrevet i 5 forbindelse med de i det foreliggende omhandlede foretrukne udførelsesformer.

Som det fremgår af ovennævnte formler omfatter acylhydrazon-mellemprodukterne ifølge opfindelsen hydrazoner af et vilkårligt anthracyclin blandt et antal kendte anthracycliner, såsom adriamycin, daunomycin og carminomycin. Derudover omfatter 10 mellemprodukterne acylhydrazoner, der er derivatiseret ved specifikke pladser i anthracyclinstrukturen (f.eks. 4'-THP-adriamycin-hydrazon og 3'-deamino-3'-(3-cyano- 4-morpholinyl)adriamycin-hydrazon). Sidstnævnte mellemprodukter kan fremstilles ved først at derivatisere anthracyclinet til dannelse af en ønsket analog og derefter anvende denne analog til fremstilling af hydrazonmellemproduktet ifølge opfindelsen.

15 Kendte anthracyclinanaloger omfatter de i US-patentskrift nr. 4.464.529 og 4.301.277 beskrevne 3'-deamino-3'-(4-morpholinyl)- eller 3'-deamino-3'-(3-cyano-4-morpholinyl)-anthracyclinanaloger, de i US-patentskrift nr. 4.202.967 og 4.314.054 beskrevne 3'-deamino-3'-(1-piperidinyl)- eller 3'-deamino-3'-(4-methoxy-1-piperidinyl)anthracyclinanaloger, de i US-patentskrift nr. 4.250.303 beskrevne N-20 benzyl- eller Ν,Ν-dibenzyl-anthracyclinanaloger, de i US-patentskrift nr. 4.591.637 beskrevne N-methoxymethyl- eller N-cyanomethyl-anthracyclinanaloger samt de i US-patentskrift nr. 4.303.785 beskrevne acetalanaloger af anthracycliner. Disse kendte anthracyclinanaloger kan således omsættes som beskrevet ovenfor (se fig. 1) til fremstilling af hidtil ukendte acylhydrazoner. som derefter kan konjugeres med et 25 antistof med en ønsket specificitet som beskrevet i det foreliggende.

Alternativt kan et uderivatiseret acylhydrazon-mellemprodukt ifølge opfindelsen først fremstilles som beskrevet i det foreliggende ud fra det uderivatiserede anthracyclin, såsom adriamycin, daunomycin eller carminomycin, og dette hidtil ukendte 30 mellemprodukt kan derefter derivatiseres til fremstilling af et hidtil ukendt acylhydrazon, der er substitueret som ønsket. ADM-HZN kan f.eks. derivatiseres i aminosukkerresten ved reduktiv aminering med 2,Z-oxydiacetaldehyd ved anvendelse af den i US-patentskrift nr. 4.464.529 beskrevne metode til fremstilling af 3'-deamino-3'-(3-cyano-4-morpholinyl)adriamycin-hydrazon. På lignende måde kan ADM-HZN 35 derivatiseres på aminosukkerdelen til fremstilling af hidtil ukendte acylhydrazonderivater, såsom 3’-deamino-3'-(4-morpholinyl)-ADM-hydrazon (se US- 17 DK 175174 B1 patentskrift nr. 4.301.277), 3'-deamino-3'-(1-piperdinyl)-ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4.202.967), 3’-deamino-3'-(4-methoxy-1-piperidinyl)-ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4.314.054), N-benzyl-ADM-hydrazon og N,N-dibenzyl-ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4.250.303) eller N-methoxymethyl-ADM-hydrazon og 5 N-cyanomethyl-ADM-hydrazon (se US-patentskrift nr. 4.591.637. Derudover kan ADM- HZN derivatiseres i Rs-stillingen i formel (I), (II) og (III), som beskrevet i US-patentskrift nr. 4.303.785 til fremstilling af acetalderivater af hydrazonet, såsom 4'-THP-ADM-hydrazon.

10 Det er åbenbart, at der ved disse hidtil ukendte fremgangsmåder til derivatisering af acylhydrazonerne ifølge opfindelse som udgangsmateriale kan anvende hydrazoner af andre anthracycliner end ADM, såsom daunomycin eller carminomycin, til fremstilling af hidtil ukendte forbindelser, såsom N-benzyl-daunomycin-hydrazon eller 3'-deamino-3'-(4-morpholinyl)carminomycin-hydrazon, hvilket også falder ind under den 15 foreliggende opfindelses rammer.

Vurdering af de ifølge opfindelsen fremstillede anthracyclin-antistofimmunokonjugater viste, at immunokonjugateme bibeholdt antistofbindingsaktivitet og udviste antistofrettet celletilintetgørelse af både lymphom- og carcinomceller under forskellige 20 forsøgsbetingelser. Celler, som besad det antigen, mod hvilket antistoffet i konjugatet var rettet, blev således effektivt tilintetgjort af anthracyclinet, hvorimod celler, som ikke besad vedkommende antigen, ikke blev tilintetgjort. I flere forsøg har det antistofafgivne anthracyclin faktisk vist sig, at være kraftigere end ækvivalente mængder af ukonjugeret anthracyclin. Forskelle i optagelsesmekanismer i tumorceller 25 og intracellulære transportmekanismer kan være ansvarlige for de styrkeforskelle, der kan iagttages mellem det fri lægemiddel og det antistofkonjugerede lægemiddel.

Undersøgelser under anvendelse af humane tumorxenotransplantater i mus har endvidere påvist de omhandlede immunokonjugaters evne til at inhibere tumorvækst 30 in vivo, hvilket i nogle tilfælde fører til fuldstændig tumorregression. Det viste sig, at immunokonjugateme var i besiddelse af større styrke og inhiberede tumorvækst i større udstrækning end det ukonjugerede anthracyclin. Immunokonjugateme tolereredes envidere af dyrene i meget større udstrækning end det frie lægemiddel, idet det var mindst 10 gange mindre toksisk end det ukonjugerede anthracyclin alene.

35 18 DK 175174 B1

Bindingsegenskaberne og de cytotoksiske egenskaber hos immunokonjugaterne ifølge opfindelsen synes at udgøre en forbedring i forhold til i litteraturen beskrevne immunokonjugater, hvor anthracycliner er bundet direkte til antistoffet via aminosukkerresten i anthracyclinet. Disse aminosukkerbundne immunokonjugater 5 havde ofte lavere anthracyclin:antistof-molforhold og udviste formindsket cytotoksicitet i forhold til det fri lægemiddel samt formindskede antistofbindingsegenskaber (se f.eks.

R. Arnon et al., Immunological Rev.. 62, ovenfor, E. Hurwitz et al., Cancer Res.. 35, ovenfor og R. Yamamato et al., ovenfor). Stabilitetsundersøgelser udført på immunokonjugaterne ifølge opfindelsen indikerede endvidere, at anthracyclinet blev 10 frigjort fra immunokonjugaterne under reducerende og sure betingelser svarende til de i et cellulært miljø forekommende betingelser. Bibeholdelsen af høj cytotoksisk lægemiddelaktivitet, som iagttages med de i det foreliggende beskrevne immunokonjugater, kan forklares ved den kendsgerning, at et relativt umodificeret lægemidlet afgives til målcellerne.

15

Derudover har det været muligt at gøre reaktionsbetingelserne optimale således, at der opnåedes anthracyclin:antistof-molforhold på ca. 4-10 ved anvendelse af flere antistoffer af forskellige isotyper. Mængden af protein udvundet efter kondensering med ADM-HZN-derivatet faldt bemærkelsesværdigt når molforhold på mere end 10 20 blev forsøgt opnået. Det forkom, at den største begrænsning for at opnå immunokonjugater med molforhold større end 10 skyldtes den formindskede opløselighed af konjugaterne i vandig opløsning og anthracyclins fysiske association med protein.

25 Undersøgelser in vivo, der viser den forøgede antitumoraktivitet af immunokonjugaterne ifølge den foreliggende opfindelse i forhold· til det frie lægemiddel samt deres reducerede systemiske toksicitet, indikerer et forøget terapeutisk index for konjugaterne. Den foreliggende opfindelse angår ligeledes farmaceutiske præparater, kombinationer og fremgangsmåder til behandling af sygdomme, såsom cancer og 30 andre tumorer, ikke-cytocide virusinfektioner eller andre patogene infektioner samt autoimmunsygdomme. Den foreliggende opfindelse omfatter nærmere betegnet fremgangsmåder til behandling af sygdomme hos pattedyr, hvor en farmaceutisk virksom mængde af mindst ét anthracyclinholdigt immunokonjugat administreres på farmaceutisk acceptabel måde til værtspattedyret.

35 19 DK 175174 B1

Alternative udførelsesformer for fremgangsmåderne ifølge den foreliggende opfindelse omfatter administrering, enten samtidigt eller sekventielt, af et antal forskellige immunokonjugater, dvs. immunokonjugater, der bærer forskellige anthracycliner eller forskellige antistoffer, til anvendelse ved metoder til kombinationskemoterapi. En 5 udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse kan f.eks. omfatte anvendelsen af et antal anthracyclin-immunokonjugater, hvor specificiteten af antistofkomponenten i konjugatet varierer, dvs. der anvendes et antal immunokonjugater, som hver især indeholder et antistof, som binder specifikt til forskellige antigener eller til forskellige pladser eller epitoper på det samme antigen, der findes på den cellepopulation, der 10 har interesse. Anthracyclinkomponenten af disse immunokonjugater kan være ens eller forskellige. Denne udførelsesform kan f.eks. være særlig nyttig ved behandlingen af visse tumorer, hvor mængden af de forskellige antigener på overfladen af en tumor er ukendt, eller hvor tumorcellepopulationen er heterogen med hensyn til antigenekspression og hvor det er ønskeligt at have sikkerhed for, at en tilstrækkelig 15 mængde lægemiddel målrettes mod alle tumorceller i tumorområdet. Anvendelsen af et antal konjugater med specificitet for forskellige antigene pladser eller epitope determinanter i tumoren forøger sandsynligheden for at opnå tilstrækkelig lægemiddel i tumorområdet. Denne udførelsesform har endvidere betydning for opnåelse af en høj grad af specificitet for tumoren, idet sandsynligheden for at normalt væv vil være i 20 besiddelse af alle de samme tumorassocierede antigener er lille (se I. Hellstrom et al., "Monoclonal Antibodies to two Determinants of Melanoma-Antigen p97 Act Synergistically in Complement-Dependent Cytotoxicity", J. Immunol.. 127 (nr. 1), side 157-160 (1981)).

25 Alternativt kan anvendes et antal forskellige immunokonjugater, hvor kun anthracyclinkomponenten i konjugatet varierer. Et særligt antistof kan f.eks. være bundet til adriamycin til dannelse af ét immunokonjugat og kan være bundet til daunomycin til dannelse af et andet immunokonjugat. Begge konjugater kan derefter administreres til en vært, der skal behandles, og vil på grund af antistofspecificiteten 30 lokalisere til stedet for den udvalgte cellepopulation, der søges elimineret. Begge lægemidler vil derefter frigøres på dette sted. Denne udførelsesform kan være af betydning, hvor der er usikkerhed med hensyn til lægemiddelresistensen hos en særlig cellepopulation, såsom en tumor, idet denne fremgangsmåde tillader frigørelse af et antal forskellige lægemidler på stedet for eller inden i målcellerne. En yderligere 35 udførelsesform omfatter konjugationen af mere end ét anthracyclin til et særligt antistof til dannelse af et immunokonjugat, der indeholderet antal forskellige 20 DK 175174 B1 anthracyclinmolekyler på overfladen, hvilke molekyler alle er bundet til antistoffet via en 13-keto-acylhydrazonbinding. Administrering af immunokonjugatet ifølge denne udførelsesform resulterer i frigørelsen af et antal forskellige lægemidler på stedet for eller inden i målcellerne.

5

Anthracyclin-immunokonjugateme ifølge den foreliggende opfindelse kan administreres i form af farmaceutiske præparater under anvendelse af konventionelle administreringsmåder, herunder, men ikke begrænset til intravenøs, intraperitoneal, oral eller intralymfatisk administrering eller administrering direkte på stedet for en 10 udvalgt cellepopulation, såsom en tumor. Intravenøs administrering foretrækkes. Til in vivo behandling kan det endvidere være nyttigt at anvende immunokonjugater indeholdende antistoffragmenter, såsom Fab eller F(ab')2 eller kimære antistoffer.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen, der indeholder 15 anthracyclinimmunokonjugateme, kan antage forskellige dosisformer, herunder, men ikke begrænset til faste, halvfaste eller flydende dosisformer, såsom tabletter, piller, pulvere, flydende opløsninger eller suspensioner, suppositorier, polymere mikrokapsler eller mikrovesikler, liposomer samt injicerbare eller infuserbare opløsninger. Den foretrukne form afhænger af administreringsmåden og den 20 terapeutiske anvendelse.

De farmaceutiske præparater kan også omfatte i teknikken kendte, konventionelle, farmaceutisk acceptable bærere, f.eks. serumproteiner, såsom humant serumalbumin, bufferstoffer, såsom phosphater, vand eller salte eller elektrolytter.

25

Den mest effektive administreringsmåde og dosisordinering for immunokonjugatpræparateme ifølge opfindelsen afhænger af alvorligheden og forløbet af sygdommen, patientens helbred og reaktion på behandling og af den behandlende læges vurdering. Dosen af immunokonjugaterne og en hvilken som 30 helst ledsagende forbindelse bør følgeligt bestemmes for den enkelte patient. Ikke desto mindre kan en virksom dosis af anthracyclinimmunokonjugatet ifølge opfindelsen ligge i området fra ca. 1 til ca. 100 mg/m2 anthracyclin eller fra ca. 500 til 5000 mg/m2 antistof.

21 DK 175174 B1

Den foreliggende opfindelse belyses nærmere i de følgende eksempler. Det er klart, at disse eksempler kun er illustrative og på ingen måde skal begrænse omfanget af den foreliggende opfindelse.

5 Eksempel 1 I det følgende eksempel beskrives fremstillingen af et hidtil ukendt anthracyclinimmunokonjugat ifølge den foreliggende opfindelse, i hvilket lægemidlet er bundet direkte til et monoklonalt antistof via en hydrazonbinding i 13-ketostillingen på lægemidlet.

10

Den særlige udførelsesform beskrevet i dette eksempel omfatter konjugeringen af ADM med et monoklonalt antistof til dannelse af et immunokonjugat indeholdende en linkerarm med en acylhydrazonbinding som bindingspunkt til ADM-molekylet i immunokonjugatet, idet linkeren endvidere indeholder en disulfidbinding som del af 15 bindingen deraf til antistoffet. Ifølge denne udførelsesform tilvejebringes endvidere et hidtil ukendt acylhydrazonderivat af ADM (ADM-HZN).

Syntese af et adriamvcin-hvdrazon

Som det indledende trin ved fremstillingen af immunokonjugatet ifølge denne 20 udførelessform syntetiseres først et ADM-hydrazonderivat som følger: 0,3 ml af en 1 M hydrazinopløsning, dvs. NH2NH2 i isopropylalkohol sattes til en afkølet opløsning af SPDP (70 mg, 0,22 mmol) i 3 ml THF (tetrahydrofuran). Efter omrøring i 20 minutter ved 0°C ekstraheredes produktet med CH2CI2, vaskedes med saltvand og tørredes med K2C03. Remanensen, der opnåedes efter afdampning af opløsningsmidlerne,

25 kromatograferedes på neutralt aluminiumoxid (5% MeOH, 95% CH2CI2) til opnåelse af 21 mg (41%) 3-(2-pyridyldithio)propionylhydrazid (forbindelse 2 i fig. 1). Hydrazidet og adriamycin.HCI (opnået fra Sanraku Inc., Japan) (48 mg, 0,083 mmol) opløstes i 5 ml MeOH og omrørtes så i mørke ved stuetemperatur i 6 dage. Omsætningen efterfulgtes af reversfase-tyndtlagskromatografi (TLC) (MeOH:H20 = 2:1, indeholdende 3 30 vægt/volumen% NH4OAc). Efter dette tidsrum afdampedes opløsningsmidlet, og remanensen kromatograferedes på en Cie-søjle (MeOH:H20 = 3:2, indeholdende 3 vægt/volumen% NH4OAc). Fraktionerne kombineredes og lyofiliseredes, og overskydende NH4OAc fjernedes under reduceret tryk. Remanensen opløstes i MeOH og præcipiteredes ved tilsætning af acetonitril til opnåelse af 45 mg (72%) adriamycin-35 13-{3-(2-pyridyldithio)propionyl}hydrazon,hydrochlorid, herefter benævnt ADM-HZN

22 DK 175174 B1 (forbindelse 4 i fig. 1). ADM-HZN karakteriseredes på følgende måde: smp. >125°C giver mørkere farve og er ikke veldefineret.

NMR (acetone-d6) δ 1,25 (s, 3H, J=6Hz), 1,77 (m, 1H), 2,06 (m, 1H), 2,30 (m, 1H), 2,53 (d, 1H, J=15Hz), 2,89-3,18 (m, 6H), 3,71 (m, 1H), 3,85 (m, 1H), 3,97 (m, 1H), 5 4,07 (s. 3H), 4,78 (s, 2H), 5,21 (m,1H), 5,58 (t, 1H, J=7Hz), 7,12 (m, 1H), 7,64 (d, 1H.

J=8Hz), 7,75 (m, 2H), 7,90 (t, 1H, J=8Hz), 7,98 (d, 1H, J=8Hz), 8,37 (d, 1H. J=4HZ), 10,50 (s, 1H), 10,52 (s, 1H), 14,19 (bs, 1H).

IR (KBr): 3438, 1674, 1618, 1579, 1419, 1286, 1016, 988, 698 cm·1.

FABMS (glycerol) mle: 755 (M+1), 737, 645, 625, 609.

10

Thiolerinq af monoklonale antistoffer

Forud for omsætning af ADM-HZN-forbindelsen fremstillet som beskrevet ovenfor med et monoklonalt antistof af interesse, må antistoffet thioleres, dvs. reaktive sulfhydrylgrupper skal introduceres i antistofmolekylet.

15

De anvendte monoklonale antistoffer var 1) 5E9, et IgG,-antistof, som er reaktivt med transferrinreceptoren på alle delende humane celler og krydsreaktivt med forskellige histologiske typer af cancerceller, 2) T33A1 (herefter benævnt "3ΑΓ), et lgGn.antistof, som er reaktivt med det humane 40 Kd T-celleantigen, som også findes på et antal T-20 celleleukæmityper, 3) G28.5, et IgGrantistof, som er reaktivt med det humane 50 Kd B-celleantigen, og som også er reaktivt med humane B-cellelymfomer, 4) G28.1, et IgG^antistof, som er reaktivt med det humane 39 Kd B-celleantigen, og som også er reaktivt med B-cellelymfomer, og 5) L6, et lgG2a.antistof, som er reaktivt med et glycolipidantigen på humane ikke-småcellede lungecarcinomer.

25 Hybridomer, der udskiller monoklonale 5E9- og T33A1-antistoffer, opnåedes fra the American Type Culture Collection (ATCC). De respektive antistoffer oprensedes fra ascitesvæske produceret i BALB/c-mus i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge C. Bruck et al., "One-Step Purifi-cation of Mouse Monoclonal Antibodies from Ascitic Fluid by DEAE-Affigel Blue Chromatography", J. Immun. Methods. 5b, side 30 313-319 (1982). Oprenset G28.5, G28.1 og L6 tilvejebragtes fra Dr. J. Ledbetter og Dr.

I. Hellstrom (Oncogen, Seattle, WA). Hybridomer, der udskiller monoklonale L6- og G28.5-antistoffer, deponeredes ved ATCC hhv. den 6. december 1984 og 22. maj 1986, under ATCC accessionsnummer HB 8677 og HB 9110. Det monoklonale G28.1-antistof er ét af en række antistoffer, der i teknikken er kendt for at være reaktive med 35 en hovedepitop på CD37-antigenet, og som er blevet karakteriseret i A. J. Michael 23 DK 175174 B1 (ed ), Leukocyte Typing III. Oxford University Press (UK 1987). Et antal af disse anti-CD37-antistoffer er kommercielt tilgængelige.

Thiolering af et hvert af disse antistoffer med SPDP udførtes som følger: SPDP 5 (Pierce Chemical Co., IL) (50 mM) opløst i ethanol sattes til det valgte monoklonale antistof, f.eks. 5E9 (5-10 mg/ml) i PBS (phosphatpufferet saltvand, pH 7,2) til opnåelse af en slutkoncentration på 5-10 mM. Reaktionsblandingen inkuberedes i 30 minutter ved 30°C. Uomsat SPDP separedes fra SPDP-derivatiseret antistof ved gelfiltreringskromatografi under anvendelse afen PD-10-søjle (Pharmacia). De 10 thiopyridylbeskyttende grupper fjernedes ved reduktion med overskud af DTT. De reducerede antistoffer ledtes gennem en PD-10-søjle, og de frie thiolholdige antistoffer anvendtes til kondensering med ADM-HZN-derivatet (se fig. 2).

Reaktive thiolgrupper introduceredes ligeledes i antistofproteinet ved anvendelse af 2-15 IT. antistoffet (5-10 mg/ml i 50 mM triethylamin, 50 mM NaCI og 1 mM EDTA ved pH

8,0) blandedes med 2-IT (Pierce Chemical Co., IL) til en slutkoncentration på 5-10 mM. Omsætningen forløb i 90 minutter ved 4eC og thiolerede antistoffer frasepareredes på en PD-10-søjle ækvilibreret med 2 M NaCI/PBS.

20 Antallet af reaktive thiolgrupper inkorporeret i antistofferne bestemtes ved anvendelse af DTNB (5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoesyre)) (E4i2 = 14150) i overensstemmelse med metoden ifølge G.L. Ellman, Arch. Biochem, Biophvs.. 82, side 70-77 (1959).

Konjugation af thiolerede monoklonale antistoffer med ADM-HZN 25 Der udførtes en række konjugationer, hvor de monoklonale antistoffer thioleret som beskrevet ovenfor hver især blev bundet til ADM-HZN (se fig. 2).' ADM-HZN opløstes i methanol og sattes til SPDP-thiolerede antistoffer i PBS eller til 2-IT-thiolerede antistoffer i 2 M NaCI/PBS. I et typisk forsøg sattes 10 ækvivalenter 30 ADM-HZN til monoklonale antistoffer indeholdende 10-20 reaktive thiolgrupper. Konjugationsreaktionsblandingen inkuberedes natten over ved 4°C.

Reaktionsblandingen centrifugeredes ved 10000 x g, og derefter separeredes konjugeret ADM fra uomsat ADM ved at lede blandingen gennem en PD-10-søjle.

Mængden af konjugeret anthracyclin bundet til antistof bestemtes ved absorbans ved 35 495 nm (E4g5 = 8030). Mængden af antistofprotein bestemtes ved absorbans ved 280 24 DK 175174 B1 nm (1 mg/ml =1,4 OD enher). Til korrektion for overlapning af ADM-absorbans ved 280 nm anvendtes følgende formel: A280 (0,72 x A495) 5 Antistof (mg/ml) = -------- 1,4

Immunokonjugater analyseredes for tilstedeværelse af ukonjugeret ADM eller ADM-derlvater ved HPLC-analyse. HPLC udførtes under anvendelse afen Phenomenex-10 søjle pakket med 5 μ IB-SIL C18-perler. Ukonjugeret ADM.HCI, ADM-HZN (0,1 pmol) eller immunokonjugater indeholdende 0,5-5 pmol lægemiddelækvivalenter overførtes til søjlen og elueredes med methanol og 10 mM ammoniumphosphat, pH 4,5 (70:30) ved 1,5 ml/minut. Ingen af de fremstillede immunokonjugater indeholdt signifikante mængder (<1%) ukonjugeret lægemiddel ved HPLC-analyse.

15

Karakterisering af immunokoniuaaterne ifølge opfindelsen

De således fremstillede immunokonjugater bestod af ADM-molekyler konjugeret i 13-ketostillingen til en linkerarm, der dannede en bro mellem lægemidlet og det pågældende monoklonale antistof. Derudover førte tilsætningen af det monoklonale 20 antistof med frie thiolgrupper til ADM-HZN-derivatet, der indeholdt en thiopyridylbeskyttet disulfidbinding, til dannelse af en disulfidbinding i linkeren, der forbandt ADM med antistofferne (se fig. 2). Immunokonjugater fremstillet ifølge denne udførelsesform omfatter, men er ikke begrænset til 5E9-ADM-7.5, 3A1-ADM-7.0, L6-ADM-9,0 og G28.1-ADM-9.0, hvor første del af udtrykket betegner det monoklonale 25 antistof, der anvendes til dannelse af konjugatet, anden del af udtrykket betegner anthracyclinet bundet til antistoffet og tallet i udtrykket beskriver molforholdet mellem ADM og antistof i det pågældende immunokonjugat.

ADM:antistof-molforholdet opnået i overensstemmelse med denne udførelsesform 30 afhænger af det antal thiolgrupper, der introduceres i det monoklonale antistof, og den mængde ADM-HZN-derivat, der sættes til det thiolerede antistof. Punktdiagrammeme i fig. 3 og 4 viser, at der opnås ADM:antistof-forhold på 3-4 ved kondensering af ADM-HZN med enten det monoklonale 5E9-eller 3A1-antistof indeholdende ca. 8 thiolgrupper. Et moloverskud af ADM-HZN på typisk 10 gange i forhold til protein 35 tilsattes ved disse reaktioner. ADM:antistof-forhold steg til 8-10 ved anvendelse af antistoffer med 18-25 thiolgrupper. Der iagttoges ingen signifikante forskelle i 25 DK 175174 B1 ADM:antistof-forholdene ved anvendelse af SPDP sammenlignet med 2-IT til thiolering af det monoklonale antistof (sammenlign fig. 3 og 4). De endelige proteinudbytter efter konjugation af lægemiddel med antistof forekom imidlertid at være noget højere med SPDP-thiolerede antistoffer sammenlignet med 2-IT thiolerede antistoffer (se fig. 5).

5 Proteinudbytter på 50-80% opnåedes almindeligvis for SPDP-thiolerede antistoffer, såsom 5E9 og 3A1, hvorimod udbytter på 20-50% opnåedes for de samme antistoffer thioleret med 2-IT. Noget bedre immunokonjugatudbytter opnåedes endvidere ved anvendelse af monoklonale antistoffer af IgGrisotypen, såsom 5E9 og 3A1, for konjugationer udført med SPDP eller 2-IT (se fig. 6 og 7).

10

Bindingsaktiviteten hos immunokonjugaterne ifølge opfindelsen bestemtes ved et konkurrenceforsøg omfattende anvendelse af l125-mærket antistof. Antigen-positive hhv. antigen-negative celler (1 x 10e) suspenderedes i 0,1 ml RPMI 1640 indeholdende 2% FBS og blandedes med 0,1 ml dobbeltseriefortyndet ukonjugeret 15 monoklonalt antistof eller immunokonjugat i koncentrationer fra 50 pg/ml.

Dobbeltcellesuspensionerne inkuberedes under blanding ved 4°C i 1 time. Cellerne vaskedes derefter to gange og suspenderedes i 0,1 ml indeholdende 5 pg/ml 'ølmærket homologt antistof (specifik aktivitet fra 1-50 x 104 cpm/pg antistofprotein).

Prøver inkuberedes ved 4°C i 1 time og anbragtes på 0,15 ml af en 1:1 blanding af 20 dibutyl:dinonylphthalat, som var afkølet til 4°C. Prøverne centrifugeredes ved 10000 x g i 1 minut ved 4°C, og de cellebundne tællinger (pellet) bestemtes ved anvendelse af en LKB-y-tæller.

Bibeholdelsen af bindingsaktivitet hos immunokonjugaterne ifølge opfindelsen er vist i 25 tabel 1.

DK 175174 B1 26

Tabel 1

Relativ bindinasaffinitetsvurderinoer efter ADM-HZN-koniuoation

[It]a [Tt]b K konj.c Inhibitor Molforhold Spor xlO'^M xlO*^M xlO^ L/M

5 - - 5E9-125I 3,2 3A1-125I - - 5,1 SPDP 1 inker 5E9-ADM 3,5 5E9-225I 4,2 3,4 2,6 4,0 6,7 2,1 1,0 4,9 4,2 4,0 3,0 10 6,8 4,2 2,1 1,6 8,5 0,1 2,1 0,7 3A1-ADM 2,6 3A1-12®ι 4>2 1,3 1,5 3,3 1,3 1,3 5,1 4,2 8,3 1,3 0,8 15 6,7 7,3 1,3 0,9 2-IT linker 5E9-ADM 5,6 5E9-125I 4,1 4,0 3,1 6,7 4,7 4,0 2,7 3A1-ADM 6,0 3A1-125I 4,0 1,3 1,6 20 ...... ...............................................................

[1^] = mol koncentration af antistof-konjugat, der giver 50% inhibering af sporantistof.

b[Tt] = molkoncentration af antistof, der giver 50% inhibering af sporantistof.

C*konj “ Re1ative (K) affiniteter beregnedes ved hjælp af følgende formel » γτ iv '

Kkonj utJ*Ab ϊΰ- ^Ab er ^9evæ9tskonstanten for det ukonjugerede MAb ifølge bestemmelse 2q ved Scatchard-analyse.

Som vist i tabellen bibeholdt 5E9-immunokonjugaterne fremstillet ved anvendelse af SPDP og med molforhold mellem 3,5 og 8,5 mere end 80% af deres oprindelige bindingsaktivitet sammenlignet med ukonjugeret 5E9. 5E9-immunokonjugater 35 fremstillet ved anvendelse af 2-IT bibeholdt ligeledes høje bindingsaktiviteter. 3A1-immunokonjugater fremstillet ved anvendelse af SPDP viste noget tab med hensyn til 27 DK 175174 B1 antistofbindingsaktivitet. Konjugation af ADM med disse og andre antistoffer resulterede almindeligvis i tab af en relativt ringe grad af antistofbindingsaktivitet.

Fig. 8 viser bindingskurverne for to immunokonjugater ifølge opfindelsen 5E9-ADM-7.5 5 og 3A1-ADM-7.0 sammenlignet med bindingskurverne for de ukonjugerede monoklonale 5E9- og 3A1-antistoffer. Til opnåelse af disse kurver inkuberedes immunokonjugaterne ved 4eC i 0.1 ml komplet vækstmedium indeholdende 1 x 106 antigen-positive HSB-2-målceller. Efter 1 time vaskedes cellerne to gange i mediet og inkuberedes i yderligere 30 minutter i 0,1 ml medium indeholdende 1:40 fortynding af 10 FITC-mærket gede-antimus-lgG (Boehringer-Mannheim). Cellerne analyseredes på et Coulter Epics V-fluorescenscelleanalyseapparat. Celleoverfladefluorescens sammenlignedes med fluorescensen opnået for på lignende måde fortyndet ukonjugeret monoklonalt antistof. Som vist i figuren bibeholdtes bindingsaktiviteten af hvert af immunokonjugaterne, hvilket fremgår af det faktum, at den koncentration af 15 immunokonjugat, der var nødvendig til mætning af de antigen-positive celler, højst var en dobbeltfortynding større end den koncentration, der var nødvendig for det ukonjugerede antistof. Forskellene i plateauniveaueme for fluorescensintensitet mellem ukonjugerede antistoffer og immunokonjugaterne skyldtes reduceret binding af det sekundære FITC-gede-antimusreagens til immunokonjugatet sammenlignet med 20 det ukonjugerede antistof.

Stabiliteten af et immunokonjugat ifølge denne udførelsesform - et L6-ADM-konjugat -ved forskellige pH-værdier fra 4,0 til 7,0, undersøgtes ved HPLC-analyse. L6-ADM-9,0-konjugatet inkuberedes i phosphatbuffere ved hver af de indikerede pH-værdier i 25 24 timer ved 37°C. Hver opløsning overførtes derefter til en HPLC-søjle og mængden af ukonjugeret lægemiddel bestemtes. Som vist i fig. 9 havde det enkelte produkt, der kunne påvises efter 24 timers inkubation ved forskellige pH-værdier, en søjleretentionstid, der svarede til retentionstiden for ADM-HCI-standarden. Den mængde materiale, der blev frigjort fra immunokonjugatet efter 24 timer, steg eftersom 30 pH-værdien faldt fra 7 til 4. "Ubehandlet" kontrol angiver kromatogrammet for konjugatet opbevaret ved -20°C i phosphatpuffer med pH 7,4. Det syntes således som om immunokonjugatet var i besiddelse af en syresensitiv bindingsgruppe, hvilket resulterede i frigørelse af ADM fra antistofproteinet. Disse resultater stemmer overens med forekomsten afen hydrazonbinding, der forbinder ADM til linkerarmen som 35 beskrevet i fig. 2.

28 DK 175174 B1 I overensstemmelse med udførelsesformen ifølge dette eksempel blev ADM bundet til antistoffet via en linkerarm, der også indeholdt en disulfidbinding (se fig. 2). Det skulle således være muligt, at frigøre en ADM-rest ved reduktion af et immunokonjugat med denne udformning med DTT. L6-ADM-konjugatet, L6-ADM-9.0, behandledes derfor 5 med et 10-dobbelt overskud af DTT, inkuberedes ved stuetemperatur i 15 minutter og overførtes til en HPLC-søjle ADM-HCI- og ADM-HZN-standarder undersøgtes på samme tid, og toppene fra kromatogrammerne er vist i fig. 10. L6-ADM-9.0 havde ingen påviselig top for ukonjugeret lægemiddel forud for tilsætning af DTT. HPLC-analyse viste tilsynekomsten af en enkelt top, som havde en søjleretentionstid 10 svarende til retentionstiden for ADM-HCI-derivatet fremfor ADM-HZN-derivatet (se fig.

10). Mængden af ADM frigjort efter DTT-behandling var ca. 99% af udgangs-ADM-aekvivalenterne bundet til antistoffet. Forsøgsdata i fig. 9 og 10 viser, at en ADM-lignende rest frigøres fra immunokonjugaterne ifølge opfindelsen under "fysiologiske" betingelser, dvs. sure og reducerede betingelser, der er typiske for de cellulære 15 omgivelser.

Cvtotoksisk aktivitet af immunokonjugaterne ifølge opfindelsen Immunokonjugaterne ifølge opfindelsen testedes in vitro for cytotoksicitet ved hjælp af en række analysesystemer. Ifølge et kolonidannelsesassay i blød agar dyrkedes 20 Daudi- (Burkitt’s lymfom)-celler (fænotype: 5E9+, 3A1-) opnået fra ATCC i komplet medium (RPMI 1640 medium plus 10% føtalt kalveserum). 1 x 105 celler i 1 ml medium udsattes i 1,5 timer for seriefortyndede 5E9-ADM- eller 3A1-ADM-immunokonjugater eller ukonjugeret ADM. Tredobbelte bestemmelser foretoges for hver fortynding. Kontrolgrupper bestod af på lignende måde behandlede celler, der 25 ikke var udsat for lægemidler. Cellerne vaskedes så og suspenderedes i RPMI 1640-medium indeholdende 15% FBS og 0,3% agarose (Marine Colloid). 1 ml af cellesuspensionen (1 x 103 celler) anbragtes derefter på et 0,4% agaroselag i mikrotiterplader med 6 brønde (Costar). Prøverne inkuberedes i 7-10 dage ved 37°C, og de resulterende kolonier farvedes med 0,5 ml 1 mg/ml p-iodnitrotetrazolium-violet 30 (Sigma) i 48 timer. Kolonier taltes ved hjælp af et Optimax 40-10-billedanalyseapparat, og inhiberingen af kolonidannelse bestemtes ved sammenligning af lægemiddelbehandlede eller immunokonjugatbehandlede celler med den ubehandlede kontrolgruppe.

35 I fig. 11 sammenlignes den cytotoksiske aktivitet af 5E9-ADM-konjugatet 5E9-ADM- 7,5, og 3A1-ADM-konjugatet 3A1-ADM-7.0 efter eksponering i 1,5 timer på den 5E9- 29 DK 175174 B1 antigen-positive og 3A1-antigen-negative Burkitt's-lymfomcellelinie, Daudi. Begge disse immunokonjugater var blevet fremstillet via thiolering med 2-IT. Sammenligning af dosisresponskurverne viste, at 5E9-ADM-7,5-konjugatet, som bibeholdt 93% af den oprindelige bindingsaktivitet for antigenbærende målceller (se fig. 8), var signifikant 5 kraftigere end 3A1-ADM-7.0, det ikke-bindende kontrolkonjugat.

Et grænsefortyndingsforsøg, som tilvejebringer et mål for den logaritmiske værdi for celletilintetgørelse, anvendtes til afprøvning af den cytotoksiske lægemiddelaktivitet af de to ovennævnte immunokonjugater ved anvendelse af et længere 10 eksponeringsformat (24 timer). Dette forsøg udførtes med Namalwa-celler (fænotype: 5E9+, 3A1-) i det væsentlige som beskrevet af M. Colombatti et al., "Selective Killing of Target Cells by Antibody-Ricin A Chain orAntibody-Gelonin Hybrid Molecules:

Comparison of Cytotoxic Potency and Use in Immunoselection Procedures”, T Immunol.. 131, side 3091-3095 (1983). Cellerne opnået fra ATCC inkuberedes med 15 immunokonjugaterne i 22 timer og vaskedes, og den logaritmiske værdi for celletilintetgørelse bestemtes. Den logaritmiske værdi for celletilintetgørelse beregnedes på grundlag af pladedyrkningseffektiviteten, der blev bestemt som andelen af brønde uden vækst ved begrænsende cellekoncentrationer.

20 Som vist i fig. 12 frembragte 5E9-ADM-7.5 celletilintetgørelse, der var 1-2 logaritmiske værdier større ved afprøvede koncentrationer i sammenligning med det ikke-bindende 3A1-ADM-7,0-konjugat. Celletilintetgørelse i størrelsesordenen indtil 5 logaritmiske værdier måltes ved den højeste dosis 5E9-ADM-7.5. Selv om den cytotoksiske aktivitet for det ikke-bindende 3A1-immunokonjugat påvistes, var niveauet for 25 cytotoksicitet mindre end for en ækvivalent mængde ukonjugeret ADM. Aktiviteten af 5E9-immunkonjugatet var imidlertid større ved flere koncentrationer end en ækvivalent dosis frit ADM.

Som anført ovenfor syntetiseredes 5E9-ADM-7.5- og 3A1 -ADM-7,0-30 immunokonjugaterne med 2-IT som thioleringsmidlet. Immunospecifik cytotoksicitet jagttoges også med immunokonjugater, som var fremstillet med SPDP som thioleringsmiddel. I fig. 13 vises den selektive cytotoksiske aktivitet af 5E9-ADM- og 3A1-ADM-immunokonjugater fremstillet med SPDP som thioleringsmidlet på Daudi-celler ved anvendelse af ovennævnte kolonidannelsesassay i blød agar. Yderligere 35 tegn på selektiv cytotoksicitet hos immunokonjugater fremstillet med SPDP er vist i fig.

14, hvor G28.1-ADM-9,0-immunokonjugatet afprøvedes på to G28.1-antigen-positive 30 DK 175174 B1 cellelinier, Daudi og Namalwa, og på en G28.1.-antigen-negativ human T-celle leukæmicellelinie HSB-2, ved kolonidannelses-assay i blød agar. HSB-2-cellerne opnåedes fra ATCC. Som vist i figuren var immunokonjugatet cytotoksisk overfor de to antigen-positive cellelinier, men ikke overfor den antigen-negative cellelinie.

5

Præferentiel tilintetgørelse af antigen-positive celler med immunokonjugatet 5E9-ADM- 7,5 iagttoges også ved et kolonidannelsesassay under anvendelse af den forankringsafhængige humane koloncarcinomcellelinie HCT116, opnået som en gave fra Dr. M. Brattain (Bristol-Baylor Labs, Houston, Tx).

10

Monolagskulturer af carcinomcellerne fjernedes fra kulturkolber med trypsin-EDTA (Gibco), vaskedes og ledtes gennem en 22 gauge kanyle til opnåelse af en enkeltcellesuspension. 5E9-ADM-7.5, 3A1-ADM-7.0 eller ukonjugeret ADM seriefortyndedes i 0,2 ml medium indeholdende 1 x 105 carcinomceller. Hver 15 fortynding foretoges tre gange. Koltrolforsøg omfattede ubehandlede eller antistofbehandlede celler. Cellerne inkuberedes i 3 timer og vaskedes én gang i mediet, og 1 x 103 celler i 1 ml anbragtes på mikrotiterplader med 12 brønde (Costar). Pladerne inkuberedes i 7-10 dage ved 37eC og fikseredes med absolut methanol i 10 minutter. Kolonierne farvedes med krystal-violet og taltes ved hjælp af et Optimax 40-10-20 billedanalyseapparat. Som vist i fig. 15 jagttoges større cytotoksicitet ved eksponering af carcinomcellerne for 5E9-ADM-7.5 end ved eksponering for 3A1-ADM-7.0.

Da mange rapporter har vist, at ADM bundet til antistof på aminosukkerdelen i lægemidlet resulterer i immunokonjugater med et signifikant tab af lægemiddelaktivitet, 25 undersøgtes cytotoksiciteten af immunokonjugater fremstillet ved at binde ADM til antistoffet via aminosukkerresten i lægemidlet ved hjælp af en leu-ala-dipeptidlinker under anvendelse af kolonidannelsesassaysystemet i blød agar. Som vist i fig. 16 var hverken de 5E9-ADM-4.0- eller 3A1-ADM-3.9-peptidbundne konjugater cytotoksiske over for Daudi-celler. ADM-leu-ala-derivatet. der anvendes til fremstilling af konjugater, 30 var ca. 2 logaritmiske værdier mindre kraftigt end ækvivalente mængder ukonjugeret ADM.

31 DK 175174 B1

Eksempel 2 I det følgende eksempel beskrives fremstillingen af et anthracyclinimmunokonjugat ifølge den foreliggende opfindelse, hvor ADM konjugeres med et monoklonalt antistof via en linkerarm med en acylhydra-zonbinding som bindingssted til ADM-molekylet og 5 endvidere en thioetherbinding som del af bindingen til antistoffet. Denne udførelsesform tilvejebringer ligeledes et hidtil ukendt acylhydrazidderivat af ADM.

Fremstilling af immunokoniuqater med en thioetherbinding i linkerarmen Monoklonalt antistof, 5E9 (2,5 mg i 2,5 ml phosphatbufret saltvand) omsattes med 10 SMPB (Succinimidyl-4-(p-maleimidophenyl)-butyrat) (59,5 pg i 100 pifter tetråhydrofuran) ved 30eC i løbet af 30 minutter. pH-værdien indstilledes til 6,0 med natriumcitratbuffer. Blandingen ledtes gennem en PD-10-gelfiltreringssøjle (Pharmacia) til fraskillelse af maleimidholdigt antistof fra uomsat materiale. ADM-HZN-derivatet (1 mg) fremstillet som beskrevet i eksempel 1 opløstes derefter i 1 ml 15 MeOH:H20 (9:1), og 0,5 pmol ADM-HZN omsattes med 0,5 pmol tri-n-butylphosphin i 4:1 acetone:H20 til fremstilling af et hidtil ukendt reduceret ADM-HZN (se fig. 17). Efter 10 minutter tilsattes 0,1 ml svovl i toluen til destruktion af resterende phosphin. Det reducerede ADM-HZN blandedes så med det 5E9-maleimidholdige antistof. De således fremstillede immunokonjugater oprensedes ved passage gennem en PD-10-20 gelfiltreringssøjle. Hvis toluenopløsningsmidlet ikke var fuldstændigt fjernet, udskiltes i nogle tilfælde et organisk opløsningsmiddellag, hvilket indeholdt noget protein, som derved var fjernet fra reaktionsblandingen. En svag luftstrøm anvendtes til fjernelse af opløsningsmidlet, og det denaturerede protein fjernedes ved centrifugering af blandingen i 2 minutter ved 16000 x g. Den klare supernatant indeholdende 25 immunokonjugateme gelfiltreredes så og analyseredes i PBS ved pH 7,4.

ADM:antistof-molforholdet bestemtes spektrofotometrisk ved anvendelse af OD28oog OD495 som beskrevet i eksempel 1. En typisk omsætning gav immunokonjugater med molforhold mellem 3 og 4.

30 Cvtotoksisk aktivitet af immunokonjugater indeholdende en thioetherbinding

Et antal immunokonjugater fremstillet i overensstemmelse med en udførelsesform ifølge den foreliggende opfindelse afprøvedes for cytotoksicitet imod antigen-postive tumorcellelinier sammenlignet med antigen-negative tumorcellelinier ved anvendelse af et 3H-thymidininkorporeringsassay, som måler inhibering af DNA-syntese. I 35 overensstemmelse med dette assay foretoges fortyndinger af immunokonjugater eller ukonjugeret ADM i komplet medium, og 100 pliter af hver fortynding sattes til brønde i 32 DK 175174 B1 mikrotiterplader med 96 brønde. Hver fortynding foretoges tre gange. Tumorceller suspenderedes i mediet og 100 pliter indeholdende 1 x 105 celler sattes så til hver brønd. Celler inkuberedes i 24 timer ved 37°C i en fugtig 5% C02-atmosfære. 50 pliter indeholdende 1 μ Ci[6-3H]-thymidin (New England Nuclear, 15 Ci/mmol) sattes til hver 5 brønd og inkuberedes i 4 timer ved 37eC. Celler overførtes til Millititer sv-plader (Millipore) og præcipiteredes med 25% kold trichloreddikesyre (TCA). Præcipitaterne vaskedes 10 gange med 5% kold TCA. Filtrene tørredes, hulledes og taltes i Econofluor liquid-scintillationsvæske (New England Nuclear). Alle tællinger korrigeredes ved subtraktion af baggrundstællinger.

10

Et immunokonjugat ifølge denne udførelsesform - 5E9-ADM-3.9 - var meget cytotoksisk overfor 5E9-antigen-positive Namalwa- og HSB-2-celler (se fig. 18). Immunokonjugatet var kraftigere end ækvivalente koncentrationer af ukonjugeret ADM. I et andet forsøg viste det sig, at et 3A1-ADM-6,0-immunokonjugat ved 15 koncentrationer under 0,1 pg/ml ADM var cytotoksisk overfor 3A1 -antigen-positive HSB-2-celler, men ikke overfor 3A1 -antigen-negative Namalwa-celler (se fig. 20). Cytotoksiciteten af immunokonjugatet var ved højere koncentrationer omtrent ens overfor begge cellelinier.

20 Eksempel 3

In vivo anti-tumoraktivitet af immunokoniugaterne ifølge den foreliggende opfindelse Immunokonjugater ifølge opfindelsen afprøvedes dernæst for deres antitumoraktivitet in vivo. Nærmere betegnet afprøvedes immunokonjugateme for deres evne til at inhibere væksten af humane B-lymfomtumorer i mus.

25

Primære faste Duadi- og Ramos- (Burkitt's lymfom) tumorer etableredes i nøgne BALB/c-mus ved subkutan (s.c.) inokulering af vævskulturopretholdte lymfoide celler. Ramos-cellelinien kan opnås fra ATCC. Daudi- og Ramos-tumorer overførtes derefter successivt in vivo til 4-6 uger gamle BALB/c (nu/nu) hunmus, der vejede 20-25 g 30 (Harlan Sprague-Dawley), under anvendelse af 1 x 107 tumorceller/0,1 ml i PBS til subkutan implantering i musens side. Begge tumorlinier viste en lineær vækstrate mellem 200 og 4000 mm3. Middelfordoblingstiden for tumorvolumenet under eksponentiel vækst var 6,9 ± 0,8 dage for Daudi-tumorer og 4,4 ± 0,6 dage for Ramos-tumorer. Tumorvolumener (V) beregnedes ved følgende formel: 35 33 DK 175174 B1

LxW2 V = ------ 2 5 hvor L = længde (mm), og W = bredde (mm).

Når tumorvolumener nåede 400-600 mm3 for Daudi-tumorer og 250-400 mm3 for Ramos-tumorer randomineredes musene i grupper på 5-10 dyr til behandling med ADM-HCI (dvs. frit lægemiddel), ADM-immunokonjugater ifølge opfindelsen, 10 ukonjugeret monoklonalt antistof eller en blanding af det monoklonale antistof plus ADM. Specificiteten af celletilintetgørelse vistes ved sammenligning af antitumoraktiviteten opnået med de afprøvede immunokonjugater (dvs. hvor antistofkomponenten er reaktiv med de tumorceller, der skal tilintetgøres) overfor den aktivitet, der opnåedes med ikke-bindende konjugater (dvs. konjugater, som ikke er 15 reaktive med denne tumorpopulation). Blandingen af antistof plus frit lægemiddel var et kontrolforsøg, som viste behovet for en covalent kobling af lægemiddel til antistof.

Resultaterne udtryktes som inhibering af tumorvækst (T-C) eller tumorfordoblingsforsinkelse (TDD), som bestemtes ud fra forsinkelsen i 20 fordoblingstiden for tumorvolumenet (TVDT), ved sammenligning af vækstkurver for behandlede grupper med uinokulerede kontrolgrupper. TDD beregnedes ved følgende formel:

T-C

25 TDD = ------- TVDT X 3,3 hvor T = tiden (dage) for at tumorerne i en behandlet gruppe når 3000 mm3, C = tiden (dage) for at tumorerne i en kontrolgruppe når 3000 mm3, og TVDT (fordoblingstid for 30 tumorvolumen) = tiden (dage) for at tumorvolumenet i kontrolmus (ikke-behandlede mus) forøges fra 1500 til 3000 mm3. Hvert punkt angiver middeltumorvolumenet i forsøgsgruppen.

Ved disse undersøgelser sammenlignedes antitumoraktiviteten af ADM-35 immunokonjugaterne på Daudi- eller Ramos-tumorer med: a) aktiviteten opnået ved anvendelse af frit lægemiddel ved ækvivalent dosis, administreringsmåde og -skema, og b) aktiviteten opnået ved anvendelse af det fri lægemiddel ved optimal dosis, administreringsmåde og -skema.

34 DK 175174 B1

Ved alle undersøgelser beskrevet heri udførtes lægemiddelbehandlingen med ADM-5 HCI ved tilsætning af 50-100 g DMSO til det pulveriserede lægemiddel, fortynding af det opløste lægemiddel i PBS til en særlig mg/kg/injektionsdosis på injektionsdagen og inokulering dermed af den tumorbærende mus enten intravenøst (i.v. halevene) eller intraperitonealt (i.p.). De ved disse undersøgelser anvendte ADM-immunokonjugater fremstilledes som beskrevet i eksempel 1, og alle bibeholdt mere end 90% af den 10 oprindelige antistofbindingsaktivitet. Især de monoklonale antistoffer 5E9 og G28.1 anvendtes som antistofkomponenten i immunokonjugatet ved disse undersøgelser. ADM-immunokonjugaterne opbevaredes ved 4eC i PBS og anvendtes ikke senere end to uger efter fremstillingen. Alle afprøvede immunokonjugater samt ukonjugerede antistofkontrolgrupper administreredes i.p.

15

Behandlingsskemaangivelsen "Q7Dx3" angiver i det foreliggende et behandlingskema, hvor hver mus i den lægemiddelgruppe får 3 injektioner, hver injektion med 7 dages mellemrum, dvs. én injektion ugentligt i 3 uger. På lignende måde betegner "Q5Dx2” et behandlingsskema, hvor musen i den gruppe får ialt 2 20 injektioner af lægemidlet eller konjugatat med 5 dages mellemrum. Q1 Dx1 betegner en enkelt injektion. I behandlingsskemabetegnelseme definerer det første tal i betegnelsen således afstanden (i dage) mellem injektioner og det sidste tal det samlede antal injektioner pr. skema.

25 Antitumoraktiviteten af ADM-immunokonjugateme ifølge opfindelsen vurderedes derfor først i sammenligning med det fri ADM-HCI-lægemiddel ved overensstemmende eller ækvivalente doser, administreringsmåde og -skema. Antitumoraktiviteten over for Daudi-tumorer hos et 5E9-ADM-immunokonjugat, 5E9-ADM-1,8 (molforhold = MR = 1,8 ADM-molekyler/MAB), sammenlignedes med aktiviteten af a) ukonjugeret ADM-30 HCI ved en tilsvarende lægemiddeldosis (4,1 mg/kg/injektion), b) monoklonalt 5E9-antistof ved en tilsvarende antistofdosis (630 mg/kg/injektion), c) en blanding af 5E9-antistoffet plus ADM-HCI (4,1 mg ADM + 630 mg 5E9) og d) et ikke-bindende immunokonjugat L6-ADM-8.6 (4,1 mg/kg/injektion ADM) som kontrol.

35 Mus (5 mus pr. gruppe) fik en dosis i.p. på dag 20 og 25 efter tumorimplantation (dvs. et Q5Dx2-skema), når indledningsvise tumorstørrelser var i området fra 800 til 1100 35 DK 175174 B1 mm3. Den ved dette forsøg anvendte dosis udgjorde den maksimalt tolererede dosis (MTD) i.p. for frit lægemiddel, dvs. den via en vilkårlig given vej eller et vilkårligt skema administrerede lægemiddeldosis, som resulterer i en LD10-værdi (10% af dyrene dør) (se tabel 1 ovenfor).

5

Som angivet i fig. 21 opnåedes signifikant antitumoraktivitet med 5E9-ADM-konjugatet.

Denne antitumoraktivitet var ydermere større end aktiviteten iagttaget for en ækvivalent dosis af det frie lægemiddel. Som anført nedenfor i tabel 4 udviste 3 af de 5 mus behandlet med konjugatet fuldstændige tumorregressioner (helbredelse), 10 hvilket svarer til en >1,5 TDD. I modsætning hertil udviste ADM-HCI og ukonjugeret 5E9 så vel som det ikke-bindende L6-ADM-konjugat ingen antitumoraktivitet. Nogen tumorvækstinhibering kunne iagttages med ADM-HCI plus 5E9 blandingen, men denne virkning var kortvarig og udgjorde kun en statistisk usignifikant 0,2 TDD.

15 Ved dette forsøg doseredes det frie lægemiddel i.en mængde på 4,1 mg/kg/injektion på grund af toksiciteten forbundet med i.p.-administreret frit lægemiddel ved doser over 4-5 mg/kg. Ved disse lave doser var både frit ADM og blandinger af ADM plus monoklonalt antistof inaktive. Som det tydeligt fremgår af fig. 21 udviste ADM-immunokonjugatet imidlertid stadig aktiv inhibering af tumorvækst, selv ved denne lave 20 dosis.

Antitumoraktiviteten af AD.M-immunokonjugaterne på Daudi-tumorer sammenlignet med antitumoraktiviteten opnået ved anvendelse af det ukonjugerede lægemiddel under iagttagelse af optimal dosis, administreringsvej og -skema forsøgtes bestemt.

25 Indledningsvis var det derfor nødvendigt at bestemme dosis, vej og skema for frit ADM-HCI, som førte til en maksimal antitumoraktivitet på Daudi-cfeller. Til denne optimeringsundersøgelse behandledes mus med ADM-HCI under anvendelse af forskellige administreringsveje, dosismængder og skemaer. Afstanden mellem inokuleringer var afhængige af det anvendte behandlingsskema. TDD-værdier 30 bestemtes så som beskrevet ovenfor.

Resultaterne af denne optimeringsundersøgelse er opsummeret i tabel 2 nedenfor.

Som det fremgår af tabel 2 gav Q7Dx3-skemaet ved i.v.-administrering en optimal antitumorreaktion, både med hensyn til tumorvækstforsinkelse og 35 tumorregressionshastigheder ved en dosis på 11 mg/kg/injektion, hvilket også var MTD for lægemidlet ved anvendelse af Q7Dx3-skemaet i.v.

Tabel 2 36 DK 175174 B1

Anti-tumoraktivitet af ADH-HC1 på Oaudi-tumor-xenografter 5 Dosis (mq/kq)~ Tumorinhiberinob Toksicitetc

Skema Injek. cum T-C CR Helb. TDD D/T (%) A) i.v. måde 10 QlDxl 20 20 - 7/7 (100) 18 18 ... . 6/8 ( 75) 15 15 - 7/7 (100) 12 12 - 7/7 (100) 15 Q7Dx3 12 36 >62 1 3 >2.0 4/8 ( 50) 11 33 28 0 3 1.1 2/8 ( 25) 11 33 >42 04 >1.3 2/10 ( 20) 11 33 21 1 0 0.7 0/8 10 30 18 0 1 0.7 0/8 20 10 30 13 0 1 0.8 0/8 10 30 27 0 3 0.8 0/7 9 27 23 0 1 0.9 0/10 5 15 6.2 2 0 0.18 1/9 ( 11) 25 B) i.p. måde Q5Dx2 4.5 9 0 0 0 0/5 4.1 8.2 0 0 0 0 1/5 4.5 9 2.2 0 0 .1 0/8 30 5.5 11 2.2 0 0 .1 0/8 Q8Dx2 13 26 - 7/7 (100) 10 20 - 8/8 5 10 ... . 3/8 ( 37) 35 37 DK 175174 B1

Tabel 2 (fortsat)

Anti-tumoraktivitet af ADM-HC1 på Daudi-tumor-xenoorafter

Dosis fmq/kq)- Tumorinhiberino^ Toksicitetc 5 Skema Injek. cum T-C CR Helb. TDD D/T (%) Q4Dx3 5 15 ... - 6/9 ( 67) 10 Q7Dx3 10 30 - 8/8 (100) 5 15 ... . 6/9 ( 67) aResultater fra individuelle lægemiddelgrupper.

15 bT-C: repræsenterer tidsforsinkelsen i dage hos den lægemiddelbehandlede gruppe (T) for at nå 3000 mm3 sammenlignet med ubehandlede kontrolgrupper (C).

Fuldstændig regression (CR): Midlertidig reduktion i tumorvolumen under tydelig tumorstørrelse.

Helbredelse: Fuldstændig regression uden tegn på genvækst af tumor.

20 CD/T: Antal døde dyr i forhold til det samlede antal dyr i en gruppe. Dødsfald i forbindelse med lægemiddel noteredes indtil 55 dage efter sidste lægemiddeldosis.

Antitumoraktiviteten af frit lægemiddel på Daudi-tumorceller er yderligere afbildet i fig.

22. Ved anvendelse af Q7Dx3-skemaet og i.v.-administrering inhiberedes væksten af 25 Daudi-tumorxenotransplantater signifikant på en dosisafhængig måde efter behandling med ADM-HCI ved hhv. 9, 10 eller 11 mg/kg/injektion. Kontrolmus var ubehandlede.

Inhibering af tumorvækst (T-C) ved MTD, som var 11 mg/kg/injektion, var 28 dage, hvilket svarer til en 1,1 TDD.

30 Forskellige skemaer i forbindelse med i.p.-administrering afprøvedes ligeledes. Som beskrevet ovenfor bestemtes MTD for ADM-HCI ved i.p.-administrering til mellem 4 og 5 mg/kg/injektion. Som det fremgår af tabel 2B er det frie lægemiddel inaktivt på Daudi-celler ved dets MTD via i.p.-vejen. Det blev således bestemt, at optimal antitumoraktivitet for det fri lægemiddel kan opnås ved i.v.-administrering, hvor MTD er 35 11 mg/kg/injektion, en lægemiddeldosis, som viser vækstinhibering af Daudi- tumorceller.

38 DK 175174 B1

Ud fra disse forsøg blev det derfor bestemt, at den optimale ADM-HCI-dosis for antitumoraktivitet på Daudi-tumorer var ca. 11 mg/kg/-injektion, det optimale skema var Q7Dx3 og den optimale administreringsvej var i.v.

5 Derefter sammenlignedes antitumoraktiviteten af ADM-immunokonjugaterne ifølge opfindelsen på Daudi-tumorer med antitumoraktiviteten af det fri ADM-HCI-lægemiddel under de ovenfor beskrevne optimale betingelser. Et G28.1-ADM-immunokonjugat, G28.1-ADM-7.6 (MR = 7,6 lægemidler/MAB), doseret ifølge et Q5Dx2 skema ved i.p-administrering, sammenlignedes med ADM-HCI doseret som 10,11 og 12 10 mg/kg/injektion ifølge et Q7Dx3-skema ved i.v.-administrering. Som vist i fig. 23 og nedenfor i tabel 3 var det frie lægemiddel aktivt, idet det gav en 28 dages forsinkelse i tumorvækst ved 11 mg/kg (MTD), og idet 2 ud af 8 mus viste fuldstændig tumorregression (helbredelse). Immunokonjugatet toleredes godt (ingen dødsfald, intet vægttab) ved den højste afprøvede dosis (18,7 mg ADM, Q5Dx2, i.p.) og udviste en 15 noget højere antitumoraktivitet end det frie lægemiddel, idet 3 ud af de 8 behandlede dyr viste fuldstændig tumorregression. Heller ikke denne gang forbandtes nogen antitumoraktivitet med ikke-bindende L6-immunokonjugat, ukonjugeret G28.1 eller en blanding af ukonjugeret G28.1 og ADM-HCI. Det fremgår således, at ADM-immunokonjugaterne inhiberede tumorvækst i større udstrækning end det var 20 opnåeligt med det ukonjugerede lægemiddel ved optimal dosis og skema under i.v.-eller i.p.-administrering 39 DK 175174 B1

Tabel 31

Anti-tumoraktivitet af MAB-konjugeret ADM (Q5Dx2. i.p.) sammenlignet med optimeret ADM-HC1 (Q7Dx3, i.v.) på Daudi-tumor-xenotransplantater 5

Dosis (mg/kg)- Tumorinhiberinab Toksicitet0 ADM MAB T-C CR Helb. TDD D/T (%) 10 ADM-HC1_Q7Dx3. i.v.

12 >33 3 3 >1.5 2/8 11 28 0 2 >1.1 0/8 15 10 18 0 1 0.8 0/8 G28.1-ADM (7.61_Q5Dx2, i.p, 18.7 700 >31 0 3 >1.5 0/8 20 8.1 300 300 0.1 0/8 4.4 165 1 0 0 0 0/8 L6-ADM (5.51_05Dx2. i.p.

25 18.7 965 7 0 0 0.3 0/8 8.1 415 0 0 0 0 0/8 G28.1 + ADM_05Dx2. i.p.

30 4.5 700 6 0 0 0,2 0/8 G28.1_05Dx2. i.p.

700 2 0 0 0,1 0,8 35 se tabel 2 for forklaring.

40 DK 175174 B1

Tabel 4 opsummerer antitumoraktiviteten opnået med forskellige præparater af 5E9-og G28.1-immunokonjugater på Daudi-tumorxenotransplantater i athymiske mus. Den højeste reaktionshyppighed opnåedes konsekvent ved antistofdoser på 500 mg/kg eller mere. Ved disse doser opnåedes antitumoraktivitet under anvendelse af 5 konjugater med molforhold på 1.8 til 8,6. Antitumoraktiviteten syntes at være afhængig af antistofdosen fremfor af dosen af det konjugerede lægemiddel, hvilket kan ses ved, at når dosen af det monoklonale antistof steg. var der en tilsvarende forøgelse i både TDD, dvs. inhibering af tumorvækst og tumorregressionshyppigheder. I intet forsøg iagttoges antitumoraktivitet med de ikke-bindende L6-ADM-konjugater, der afprøvedes 10 parallelt med ækvivalente doser af antistof og konjugeret lægemiddel (resultaterne er ikke vist). Tabel 4 illustrerer endvidere den forøgede styrke af immunokonjugateme ifølge opfindelsen sammenlignet med det fri lægemiddel, som var inaktivt ved ækvivalente doser af lægemiddel (sammenlign med tabel 2 ovenfor).

15 20 25 30 35

DK 175174 B1 I

Tabel 4 I

5 Anti-tumoraktivitet af ADM-immunokoniugater på Paudi-tumor- I

xenotransplantater3 I

10 Cum. Dosis fmg/ka) T-Cb I

Konjugat - MR MAB ADM (Oage) Helb. TOD I

5E9-ADM-4.2d 200 4 10 0/7 0.5 I

5E9-ADM-8.6 260 8.2 8 0/5 0.3 I

5E9-ADM-4.2d 500 5 17 1/7 0.8 I

15 5E9-ADM-5.4 1110 22.8 31 2/5 1.4 I

5E9-ADM-4.2d 1200 18.3 >61 2/7 >1.5f I

5E9-ADM-1.8 1260 8.2 >39 3/5 >1.5 I

G28.1-ADM-4.9 200 4 8 0/7 0.4 I

20 G28.l-ADM-7.6e 330 8.8 10/70 I

G28.l-ADM-7.6e 600 16 3 0/7 0.1 I

G28.l-ADM-4.2 1110 16.8 >37 2/3 >1.7 I

G28.l-ADM-4.9 1200 21.4 >56 2/7 >1.5f I

G28.l-ADM-7.6e 1400 37.4 31 3/8 1.3 I

30 “Skema: Q5Dx2, vej: i.p. MR: molforhold lægemiddelmolekyler/MAB I

‘T-C: repræsenterer tidsforsinkelsen i dage for at den lægemiddelbehandlede gruppe I

(T) når 3000 mm3 sammenlignet med ubehandlede kontrolgrupper (C). I

cHelbredelse: helbredelse/antal behandlede dyr. I

d5E9-ADM-4.2 afprøvet ved tre doser. I

35 eG28.1-ADM-7.6 afprøvet ved tre doser. I

f Døde i kontrolgruppen. I

42 DK 175174 B1

Tabel 5 nedenfor viser den reducerede toksicitet opnået under anvendelse af ADM immunokonjugater ifølge opfindelsen overfor det ukonjugerede lægemiddel. Som det fremgår var immunokonjugaterne mindst 10 gange mindre toksisk end det frie ADM ved i.p.-dosering.

Tabel 5

Toksicitet af frit ADM og MAB-ADM i tumorbærende nøgne musa

APM_(mq/kq)C

5 Compound Nb Skema Vej inj. Kumulativ D/T Dødsfald % ADM 4 QlDxl i.v. 18 18 14/32 44 ADM 3 QlDxl i.v. 16 16 3/31 10 10 ADM 1 QlDxl i.v. 14 14 0/8 0 ADM 1 Q2Dx2 i.v. 15 30 7/7 100 ADM 2 Q2Dx2 i.v. 12 24 10/12 83 ADM 1 Q2Dx2 i.v. 10 20 3/5 60 15 ADM 1 Q2Dx2 i.v. 8 16 1/5 20 ADM 1 Q3Dx2 i.v. 16 32 8/8 100 ADM 1 Q3Dx2 i.v. 14 28 7/8 88 ADM 1 Q3Dx2 i.v. 12 24 6/8 75 20 ADM 1 Q4Dx2 i.v. 14 28 6/7 86 ADM 2 Q4Dx2 i.v. 12 24 7/15 47 ADM 1 Q4Dx2 i.v. 10 20 2/8 25 25 ADM 1 Q7Dx3 i.v. 12 36 4/8 50 ADM 3 Q7Dx3 i.v. 11 33 4/26 15 ADM 3 Q7Dx3 i.v. 10 30 0/24 0 ADM 1 Q8Dx2 i.p. 13 26 7/7 100 30 ADM 1 Q8Dx2 i.p. 10 20 8/8 100 ADM 1 Q8Dx2 i.p 5 10 3/8 38 ADM 1 Q4Dx3 i.p. 5 15 6/9 67 ADM 1 Q5Dx2 i.p. 5.5 11 0/8 0 ADM 1 Q5Dx2 i.p. 4.1 8.2 1/5 20 43 DK 175174 B1

Tabel 5 (fortsat!

Toksicitet af frit ADM og MAB-ADM i tumorbærende nøgne musa 5 ADM (mq/kalc

Compound N° Skema Vej inj. Kumulativ D/T Dødsfald G28.1-ADM 1 Q5Dx2 i.p. 27.2 55.4 0/8 0 10 1 Q5Dx2 i.p. 18.7 37.4 0/8 0 G28.1-ADM 1 QlDx4 i p. 24 96 3/8 38 1 QlDx4 i.p. 14 64 0/8 0 15 GE28.1-ADM 1 QlDx4 i.p. 10.5 42 0/5 0 L6-ADM 1 QlDx4 i.p. 31 124 1/8 13 1 QlDx4 i.p. 18.6 74 0/8 0 20 aMus, der bærer Daudi- eller Ramos-tumorer. bN = Antal forsøg.

CADM = Mængde indgivet frit eller konjugeret til MAB.

25 dDU = Antal døde/samlet antal behandlede.

Slutteligt afbilder fig. 26A og tabel 6 antitumoraktiviteten af G28.1-ADM konjugater på humane Ramos-tumorer. Antitumorvirkningen af immunokonjugateme på Ramos-tumorer sammenlignedes atter med aktiviteten iagttaget for frit ADM-HCI under 30 betingelser, som gav optimale resultater og som tidligere var bestemt til at være en enkeltdosisinjektion ved en dosis på 16-18 mg/kg/injektion (se fig. 24 og 25). Ved den højste, afprøvede dosis af immunokonjugater (10,6 mg/kg) udviste konjugatet en overlegen antitumoraktivitet i forhold til aktiviteten opnået under anvendelse af frit lægemiddel i en dosis på 18 mg/kg (25% dødelig) ved opnåelse af 0,5 TDD og i 35 forhold til aktiviteten af ADM-HCI i en dosis på 16 mg/kg (12% dødelighed) ved opnåelse af 1,0 TDD. Konjugatet ved denne dosis tolereredes godt, idet ingen af de 44 DK 175174 B1 behandlede dyr viste vægttab eller døde. Antitumoraktiviteten af G28.1-ADM viste sig også at være dosisafhængig som det fremgår af fig. 26B. Formindskelse af konjugatdosen resulterede således i formindskelse i TDD og antallet af fuldstændige regressioner. L6-ADM (ikke-bindende) konjugatet ved en sammenlignelig dosis (10,6 5 mg/kg) var inaktivt.

Tabel 6

Anti-tumoraktivitet af MAB-kon jugeret ADM (01Dx4. i.p.) i forhold til 10 optimeret ADM-HC1 (QlDxl. i.v.l ved anvendelse af Ramos-Tumor- xenotransplantater

Dosis (mq/kq)- Tumorinhiberinqb Toksicitet0 ADH MAB T-C CR Helb. TDD D/T (%) 15 ------------------------------------------------- ---------- ADM-HC1_Q7Dx3, i.v.

18 800 0.5 2/8 ( 25) 16 500 0.3 1/8 ( 12) 20 G28.1-ADM (4.8)_QlDx4,„j-lL.

10.6 600 10,5 0 1 1.1 0/5 5.3 300 5 0 0 0.5 0/5 25 2.6 150 3,5 0 1 0.4 0/5 L6-AMD (7.9)_QlDx_4_,-l,P-..

18.2 600 ... . 2/5 ( 40) 30 10.6 360 0 0 1 0 0/5 35 8Dosis pr. injektion bSe tabel 2 for forklaring.

45 DK 175174 B1

Ovennævnte eksempler belyser således fremstillingen af hidtil ukendte anthracyclinimmunokonjugater, hvorved et cytotoksisk anthracyclinlægemiddel konjugeres til et antistof via en hidtil ukendt syresensitiv acylhydrazonbinding. Immunokonjugaterne bibeholder både antistofbindingsaktivitet (dvs.

5 målcellespecificitet) og cytotoksisk lægemiddelaktivitet og tillader frigørelse af frit umodificeret lægemiddel under sure og reducerende betingelser, der er typiske for det cellulære miljø hos en målcelle. Antitumoraktiviteten af disse konjugater er blevet vist både in vitro og in vivo og har vist sig at være større end aktiviteten opnået med det frie ukonjugerede anthracyclin. Immunokonjugaterne tolereredes endvidere in vivo i 10 meget større udstrækning end det ukonjugerede lægemiddel. Immunokonjugaterne ifølge opfindelsen udviser således et forøget terapeutisk index (for antitumoraktivitet overfor toksicitet) og de er derfor særligt nyttige ved fremføring af cytotoksiske lægemidler til en udvalgt cellepopulation til præferentiel tilintetgørelse af disse celler ved behandling af sygdomme, såsom cancer og andre tumorer, ikke-cytocide 15 virusinfektioner eller andre patogene infektioner samt autoimmunsygdomme.

I den foreliggende opfindelse er beskrevet en række udførelsesformer, men det er åbenbart at forskellige ændringer og modifikationer kan udføres uden at afvige fra opfindelsens ånd og rammer. Det er derfor klart, at omfanget af opfindelsen skal 20 defineres af de medfølgende krav fremfor af de specifikke udførelsesformer, der er blevet givet heri ved hjælp af eksempler.

Claims (26)

46 DK 175174 B1

1. Immunokonjugat omfattende mindst 1 til ca.10 anthracyclinmolekyler med en ketogruppe i C-13-stillingen bundet via en linkerarm til et antistof, som kan reagere 5 med en udvalgt cellepopulation, der skal tilintetgøres, hvilken linkerarm er covalernt bundet til anthracyclinet ved en acylhydrazonbinding i 13-ketostillingen i anthracyclinet og yderligere indeholder en disulfid- eller thioetherbinding.

2. Immunokonjugat ifølge krav 1, hvor anthracyclinet er valgt fra en gruppe bestående 10 af adriamycin, daunomycin, detorubicin, carminomycin, idarubicin, epirubicin, esorubicin, A'-THP-adriamycin, AD-32 og 3'-deamino-3'-(3-cyano-4-morpholiny1)-doxorubicin.

3. Immunokonjugat ifølge krav 1, hvor anthracyclinet er adriamycin eller daunomycin. 15

4. Immunokonjugat ifølge krav 1, hvor antistoffet kan reagere med tumorceller.

5. Immunokonjugat ifølge krav 4, hvor antistoffet kan reagere med et antigen, som er associeret med carcinomer, melamomer, lymfomer eller knogle- eller 20 blødvævssarcomer.

6. Immunokonjugat ifølge krav 1, hvor antistoffet kan reagere med det CD37 antigen, der findes på B-cellelymfomer.

7. Immunokonjugat ifølge krav 1, hvor antistoffet er et monoklonalt antistof.

8. Immunokonjugat ifølge krav 1, hvor antistoffet et det monoklonale antistof 5E9, 3A1, L6, G28.1 eller G28.5, og anthracyclinet er adriamycin.

9. Forbindelse med formlen H i?

0 OH N^N“c-(CH2)n — S-S-R2 R3 O OH 0

35 I R5 47 DK 175174 B1 hvor R1 er CH3, CH2OH. CH2OCO(CH2)3CH3 eller CH2OCOCH(OC2H5)2. R2 er X)-* eiier /O-"· hvor X er hydrogen, N02 eller halogen,

10. R hvor R1, R3, R4, R5 og R6 er som defineret ovenfor. 15

10. Forbindelse med formlen 20 Η H O OH CH2) n —S-H R5 hvor

30 R1erCH3,CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 eller CH2OCOCH(OC2H5)2, R3 er OCH3, OH eller hydrogen, R4 er NH2l NHCOCF3l 4-morpholinyl, 3-cyano-4-morphoIinyl, 1-piperidinyl, 4-methoxy- 1- piperidinyl, benzylamin, dibenzylamin, cyanomethylamin eller 1-cyano-2-methoxyethylamin,

35 R5 er OH, O-THP eller hydrogen, 48 DK 175174 B1 R6 er OH eller hydrogen, under den forudsætning, at R6 ikke er OH, når R5 er OH eller O-THP, og n er et helt tal 1-10, inklusive.

10 R3 er OCH3, OH eller hydrogen, R4 er NH2, NHCOCF3,4-morpholinyl, 3-cyano-4-morpholinyl, 1 -piperidinyl, 4-methoxy-1-piperidinyl, benzylamin, dibenzylamin, cyanomethylamin eller 1-cyano-2-methoxyethylamin, R5 er OH, O-THP eller hydrogen,

11. Forbindelse med har formlen J? Jl -S-S-R2 GlOQv' r3 O OH I R NR^R? 15 hvor R1 er CH3l CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 eller CH2OCOCH(OC2H5)2, R2 er xy eiier xh- 25 hvor X er hydrogen, N02 eller halogen, R3 er OCH3, OH eller hydrogen, R4 og R7 hver især uafhængigt er hydrogen, alkyl, substitueret alkyl, cycloalkyl, 30 substitueret cycloalkyl, aryl, substitueret aryl, aralkyl eller substitueret aralkyl, eller R4, R7 og N sammen danner en 4- til 7-leddet ring, der eventuelt kan være substitueret, R5 er OH, O-THP eller hydrogen, R6 er OH eller hydrogen, under den forudsætning, at R6 ikke er OH, når R5 er OH eller O-THP, og 35. er et helt tal fra 1-10, inklusive. 49 DK 175174 B1

12. Adriamycin-13-{3-(2-pyridyldithio)propionyl}hydrazon,hydrochloric! (ADM-HZN).

13. 13-{3-(mercaptopropionyl)}adriamycin-hydrazon.

14. Fremgangsmåde til fremstilling af en forbindelse med formlen hu ,

0 OH R3 O OH δ ZppJ r5 nr4r7 15 hvor R1 er CH3l CH2OH, CH2OCO(CH2)3CH3 eller CH2OCOCH(OC2H5)2l R2 er Ό- ·“" Xh- hvor X er hydrogen, N02 eller halogen, R3 er OCH3i OH eller hydrogen, R4 og R7 hver især uafhængigt er hydrogen, alkyl, substitueret alkyl, cycloalkyl, 25 substitueret cycloalkyl, aryl, substitueret aryl, aralkyl eller substitueret aralkyl, eller R4, R7 og N sammen danner en 4* til 7-leddet ring, der eventuelt kan være substitueret, R5 er OH, O-THP eller hydrogen, R6 er OH eller hydrogen, under den forudsætning, at R6 ikke er OH, når R5 er OH eller O-THP, og 30. er et helt tal fra 1-10 inklusive, hvilken fremgangsmåde omfatter, at man a) omsætter en N-hydroxysuccinimidester af co-(R2dithio)carboxylsyre med hydrazin til dannelse af cu-(R2dithio)carboxylsyrehydrazid, hvor R2 er som defineret ovenfor, og b) omsætter hydrazidet med et anthracyclin med formlen 35 50 DK 175174 B1 O OH £5 NR^R2 10 hvor R1, R3, R4, R5, R6 og R7 er som defineret ovenfor.

15. Fremgangsmåde ifølge krav 14, der omfatter det yderligere trin man behandler 15 forbindelsen med et reduktionsmiddel til dannelse af en 13-{3- (mercaptopropionyl)}anthracyclin-hydrazon.

15 R6 er OH eller hydrogen, under den forudsætning, at R6 ikke er OH, når R5 er OH eller

0- THP, og π er et helt tal fra 1-10, inklusive.

16. Fremgangsmåde til fremstilling af ADM-HZN omfattende de trin, at man a) omsætter SPDP med hydrazin til dannelse af et 3-(2-pyridyl-thio)propionyl-hydrazid, 20 og b) omsætter adriamycin.hydrochlorid med hydrazidet.

17. Fremgangsmåde til fremstilling en forbindelse med formlen o

18. Fremgangsmåde til fremstilling afen forbindelse med formlen H i? , Λ O OH N^N-C-CCH2)n -S-H ΓΊΓΤ Τ’ Ύ*οη R3 O OH 0

19. Fremgangsmåde til fremstilling af immunokonjugatet ifølge krav 1 omfattende de trin, at man a) omsætter antistoffet med et thioleringsmiddel, og 35 b) omsætter det thiolerede antistof med et acylhydrazon ifølge krav 9,10 eller 11. 52 DK 175174 B1

20. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvor acylhydrazonet er ADM-HZN.

21. Fremgangsmåde ifølge krav 19, hvor thioleringsmidlet er SPDP eller 2-IT.

22. Fremgangsmåde til fremstilling af immunokonjugatet ifølge krav 1 omfattende de trin, at man a) omsætter SPDP med hydrazin til dannelse af et 3-(2-pyridyl-thio)propionyl-hydrazid, b) omsætter adriamycin.hydrochlorid med hydrazidet til dannelse af ADM-HZN, og c) omsætter ADM-HZN med et antistof, der kan reagere med en udvalgt 10 cellepopulation, der skal tilintetgøres, til hvilket antistof der er bundet thiolgrupper,

23. Fremgangsmåde til fremstilling af immunokonjugatet ifølge krav 1 omfattende de trin, at man a) omsætter SPDP med hydrazin til dannelse af et 3-(2-pyridyl-thio)propionyl-hydrazid, 15 b) omsætter adriamycin-hydrochlorid med hydrazidet til dannelse af ADM-HZN. c) behandler ADM-HZN med et reduktionsmiddel til dannelse af 13-{3-(mercaptopropionyl)}adriamycin-hydrazon, og d) omsætter hydrazonet med et antistof, der kan reagere med en udvalgt cellepopulation, der skal tilintetgøres, til hvilket antistof, der er bundet 20 maleimidgrupper.

24. Anvendelse af mindst ét immunokonjugat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8 til fremstilling af et farmaceutisk præparat til afgivelse af anthracycliner til en udvalgt cellepopulation, der skal tilintetgøres, til behandling af pattedyrssygdomme valgt fra 25 gruppen bestående af cancersygdomme, ikke-maligne tumorer, ikke-cytocide virale eller patogene infektioner og autoimmunsygdomme samt til behandling af pattedyrstumorer.

25. Anvendelse af mere end ét immunokonjungat, hvor et antistof, som kan reagere 30 med en udvalgt cellepopulation, der skal tilintetgøres, er bundet til mindst ét anthracyclinmolekyle via en linkerarm fastgjort til anthacyclinet med en acylhydrazonbinding ved anthracyclinets 13-ketostilling, idet antistoffet i hvert konjugat kan reagere med det samme antigen eller en andet antigen eller en anden epitop associeret med cellepopulationen, og hvor anthracyclinet i hvert konjugat er det 35 samme eller et andet, til fremstilling af et farmaceutisk præparat til afgivelse af en kombination af anthracycliner til cellepopulationen. 53 DK 175174 B1

25 RS hvor R1, R3, R4, R5 og R6 er som defineret ovenfor, omfattende det trin, at man omsætter produktet opnået ved fremgangsmåden ifølge krav 17 med et 30 reduktionsmiddel.

25. QH N^N-C-(CH2)n —S-S-R2 I II Jl· II I “oh r 5 o oh o » Zpid R5 hvor n, R1, R2, R3, R4, R5 og R6 er som defineret i krav 9, omfattende a) omsætning af en N-hydroxysuccinimidester af u>-(R2dithio)carboxylsyre med 35 hydrazin til dannelse af u)-(R2dithio)carboxylsyrehydrazid, hvor R2 er som defineret ovenfor, og 51 DK 175174 B1 b) omsætning af hydrazidet med et anthracyclin med formlen o OH R3 O OH 0

26. Farmaceutisk acceptabelt præparat, der er nyttigt til behandling af sygdomme, især cancersygdomme, ikke-maligne tumorer, ikke-cytocide virale eller patogene infektioner og autoimmunsygdomme, hvilket præparat omfatter en farmaceutisk 5 effektiv mængde af mindst ét immunokonjugat ifølge et hvilket som helst af kravene 1 til 8 og eventuelt en farmaceutisk acceptabel bærer. 10 15 20 25