DK165314B - Farmaceutiske praeparater i form af liposomdispersioner indeholdende acylerede phospholipider, fremgangsmaade til fremstilling deraf samt blandinger til fremstilling af liposomdispersioner - Google Patents

Description

i

DK 165314 B

Den foreliggende opfindelse angår farmaceutiske præparater i form af liposomdispersioner indeholdende acylerede phosphatidylethanolaminderivater, phosphatidylethanolamin 5 og forbindelser med farmakologiske egenskaber. Opfindelsen angår endvidere blandinger af de acylerede phosphatidyl-ethanol aminder ivater og phosphatidylethanolamin, en fremgangsmåde til fremstilling af de farmaceutiske præparater og en anvendelsesmåde for de farmaceutiske 10 præparater.

Farmaceutiske administrationssystemer på liposombasis er beskrevet i oversigtsværket udgivet af G. Gregoriadis, Liposome Technology, bind II, Incorporation of Drugs, Proteins and Genetic Material, CRC Press 1984. Sådanne 15 systemer har den fordel, at biologisk aktivt materiale kan optages i væv ved fagocytose, særligt i væv tilhørende det retikuloendoteliale system. Eksempelvis kendes en trans-portmekanisme til indføring af antibiotika i inficeret væv ved fagocytose, hvorved man opnår en bedre fjernelse eller 20 ødelæggelse af den inficerende mikroorganisme. Endocytose er også en værdifuld mekanisme ved bekæmpelsen af inflammationscentre. Antirheumatika indkapslet i liposomer trænger fortrinsvis ind i angrebne væv i sammenligning med "raskt" væv. Endvidere kan cytostatika, almindeligt kendt 25 som "anticancermidler", når de er indkapslet i liposomer, indføres i specifikke organer i det retikuloendoteliale system (lever, milt eller marv). På grund af filtrering i lungekapilærerne og efterfølgende transport med migrerende monocyter kan biologisk aktivt materiale, f.eks.

30 forbindelser med immunmodulatoriske egenskaber, endvidere koncentreres i alveolære makrofager. Dette resulterer i en forbedret virkning over for metastatiske lungetumorer og i en samtidig reduktion af toksiciteten.

I J. of Immunological Methods 65 (1983) 295-306 er beskre-35 vet liposomdispersioner med N-succinylphosphatidylethanol-aminderivater, hvori N-succinylgruppen er blokeret med

DK 165314B

2 beskyttelsesgrupper. N-succinylphosphatidylethanolamin-derivatet bindes i liposomer til haptener som dinitro-phenyllysin, som in vivo kan udløse en immunstimulation.

5 Det har overraskende vist sig, at immunstimulationen såsom optagelsen af liposomer og deres endocytose ved hjælp af makrofager, især alveolære makrofager, forøges, når acylerede phosphatidylethanolaminderivater med frie carboxygrupper er indarbejdet i liposomernes skal-10 struktur uden binding til haptener.

Det farmaceutiske præparat ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at det består af a) et phospholipid med formlen sn 1 CHg-0-Ri 2 R2O-CH 0 p Q (X)

3 CH2-0-P-0-(CH2) -NH-C-X-C-OH

OH m 15 hvor m er to eller tre, R^ og R2 uafhængigt af hinanden er alkyl, alkenyl eller acyl, hver indeholdende 10-20 carbon-atomer, og X er en direkte binding, Ci_4-alkylen eller C2_4-alkenylen eller Ci_4-alkylen substitueret med hydroxy, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, 20 b) et phospholipid med formlen snjl CH2—0—Rj 2 R„0-6h 0 Φ (II), 3 CH2-0-Pq0-CH2-CH2-NH3 hvor R3 og R4 er acyl gruppen af en mættet eller en umættet carboxylsyre indeholdende fra 10 til 20 carbonatomer og 1-2 dobbeltbindinger, hvor forholdet mellem phospholipid-

DK 165314B

3 komponenten (I) og phospholipidkomponenten (II) er 10:90 til 50:50 mol%, c) en forbindelse eller en blanding af forbindelser med 5 farmakologisk virkning og eventuelt d) et lipid valgt blandt phosphatidylcholin, phosphatidyl-serin, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardio-lipin og cholesterol og dets derivater, og en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH 10 7,0-7,8 og eventuelt farmaceutisk acceptable tilsætnings stoffer.

De ovenfor og i det følgende anvendte almene begreber har inden for rammerne af den foreliggende opfindelse fortrinsvis følgende betydninger: 15 Udtrykket "lav" anvendt i sammenhæng med definitioner af organiske grupper, f.eks. lavalkyl, lavalkylen, lavalkoxy og lavalkanoyl, betyder, at disse organiske grupper indeholder højst 7, fortrinsvis højst 4, carbonatomer, medmindre andet udtrykkeligt er anført.

20 Nomenklaturen for phospholipiderne med formlerne I og il følger anbefalingerne fra IUPAC og IUB Commision on . Biochemical Nomenclature (CBN) jfr. Eur. J. of Biochem.

79, 11-21 (1977) "Nomenclature of Lipids" (sn-nomenklatur, stereospecifik nummerering).

25 Medmindre andet er anført, anvendes de generiske navne foreslået af World Health Organisation (WHO) (Recommended International Non-properietary Names) til betegnelse af de ative komponenter, som er anført i standardværket "Pharmazeutische Chemie" (E. Schrøder, C. Rufer og 30 R. Schmiechen, Thieme Verlag Stuttgart, 1982) og i Merck Index (10. udgave). 1 de syntetiske phospholipider med formlen I (komponent a) er m fortrinsvis to.

DK 165314 B

4

Alkyl Ri og/eller R2 er fortrinsvis ligekædet med et lige antal, fra 10 til 20, carbonatomer, f.eks. n-decyl, n-dodecyl, n-tetradecyl, n-hexadecyl, n-octadecyl eller 5 n-icosyl.

Alkenyl og/eller R2 er hensigtsmæssigt ligekædet med et lige antal, fra 12 til 20, carbonatomer og en dobbeltbinding, f.eks. 9-cis-dodecenyl, 9-cis-tetradecenyl, 9-cis-hexadecenyl, 6-cis-octadecenyl, 6-trans-octadecenyl, 10 9-cis-octadecenyl, 9-trans-octadecenyl eller 9-cis-icosenyl.

Acyl Ri og/eller R2 er fortrinsvis ligekædet med et lige antal, fra 10 til 20, carbonatomer, f.eks. 010-20-31^11^1 eller Cio-^O”3·^®11^1· 15 Alkanoyl Ri og/eller R2 er fortrinsvis n-decanoyl, n-do-decanoyl, n-tetradecanoyl, n-hexadecanoyl, n-octadecanoyl og n-icosanoyl.

Alkenoyl Ri og/eller R2 er fortrinsvis 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetradecenoyl, 9-cis-hexadecenoyl, 6-cis-octa-20 decenoyl, 6-trans-octadecenoyl, 9-cis-octadecenoyl, 9-trans-octadecenoyl, 11-cis-octadecenoyl og 9-cis-icosenoyl.

Når X er Ci-4-alkylen, er dette ligekædet eller forgrenet Ci_4-alkylen, f.eks. methylen, 1,1-ethylen, 1,1-, 1,2- 25 eller 1,3-propylen eller fortrinsvis 1,2-ethylen.

Når X er C2-4~alkenylen, er dette fortrinsvis ligekædet alkenylen, f.eks. vinylen, propylen eller 1,2- eller 2,3-butylen.

Når X er Ci_4~alkylen eller C2-4~alkenylen substitueret 30 med hydroxy, er dette fortripsvis ligekædet Ci_4-alkylen substitueret med 1 eller, afhængigt af antallet af

DK 165314B

5 carbonatomer, op til 4 hydroxygrupper, f.eks. 1-hydroxy-1, 2, -ethylen, 1,2-dihydroxy-l,2-ethylen, 1- eller 2-hydroxy-l,3-propylen eller 1,2-dihydroxy-l,3-propylen.

' 5 Et farmaceutisk acceptabelt salt af phospholipidet (I) dannes hensigtsmæssigt ved reaktion med en eller to ækvivalenter fortyndet, vandigt alkalimetalhydroxid, f.eks. natrium- eller kaliumhydroxid, og er fortrinsvis mono- eller dinatriumsaltet.

10 Andre farmaceutisk acceptable salte dannes ved reaktion med aminer, såsom trimethyl-, ethyl-, diethyl- eller triethylamin, piperidin, piperazin, 2-hydroxyethyl-piperazin, cyclohexylamin, pyrrolidin eller cholin.

I de syntetiske phospholipider (I) er og R2 hensigts-15 mæssigt ligekædet alkenoyl med et lige antal, fra 10 til 20, carbonatomer, f.eks. 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetra-decenoyl, 9-cis-hexadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 9-trans- eller 11-cis-octadecenoyl eller 9-cis-icosenoyl, X er C2_4~alkylen, f.eks. 1,2-ethylen eller 1,3-propylen 20 eller C2_4~alkenylen, f.eks. vinylen.

Særligt foretrækkes natrium- eller dinatriumsaltet af N-[l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolJ-N-hydroxysuccinylamin og N-[ l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxyglutarylamin.

25 I phospholipidet med formlen II (komponent b) er acyl-grupperne R3 og R4 fortrinsvis ligekædede med et lige antal, fra 10 til 20, carbonatomer, f.eks. Cio-20“alIcanoyl eller Cio-20"alkenoYi' især 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetra-decenoyl, 9-cis-hexadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 30 9-trans- eller 11-cis-octadecenoyl.

Der foretrækkes især l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin.

DK 165314 B

6

Forbindelser eller blandinger af forbindelser med farmakologisk aktivitet (komponent c) er fortrinsvis stoffer hørende til gruppen af antiphlogistika og/eller anti-5 inflammatoriske midler, antibiotika, antileishmania, antimycotika, antineoplastika og forbindelser med immun-modulatorisk virkning.

Antiphlogistika og/eller antiinflammatoriske stoffer er fortrinsvis glucocorticoider, f.eks. cortison, hydro-10 cortison, prednison, prednisolon, fluocortolon, tri-amcinolon, methylprednisolon, prednyliden, paramethason, dexamethason, betamethason, beclomethason, fluprednyliden, desoximethason, fluocinolon, flumethason, diflucortolon, clocortolon, clobetazol eller fluorcortinbutylester, salte 15 af substituerede phenyleddikesyrer eller 2-phenyl-propionsyrer, f.eks. alclofenac, ibufenac, ibuprofen, clindanac, fenclorac, ketoprofen, fenoprofen, indoprofen, fenclofenac, . diclofenac, flurbiprofen, pirprofen, naproxen, benoxaprofen, carprofen eller cicloprofen, 20 analgetiske anthranilsyrederivater, f.eks. med formlen

A /C00H

i 8 y> „ (ud R\ A Λ i 11 *v « hvor Rj_, R2 og R3 uafhængigt af hinanden er hydrogen, methyl, chlor eller trifluormethyl, f.eks. mefenaminsyre, flufenaminsyre, tolfenaminsyre eller meclofenaminsyre, 25 analgetiske anilinosubstituerede nico tinsyrederi vater, f.eks. mifluminsyre, clonixin eller flunixin, analgetiske heteroaryleddikesyrer eller 2-heteroarylpropionsyrer med en 2-indol-3-yl- eller pyrrol-2-yl-gruppe, f.eks. indo-methacin, oxmetacin, intrazol, acemetazin, cinmetacin, zomepirac, tolmetin, colpirac eller tiaprofensyre, anal- getiske indenyleddikesyrer, f.eks. sulindac, analgetiske heteroaryloxyeddikesyrer, f.eks. benzadac.

DK 165314B

7 5 Antibiotika er fortrinsvis tetracyclinderivater med formlen:

Rsv IU. yRa?2 N(CH3)2

A /\/\/\/0H

j δ i ! II (IV), V Y XCONHRi oh fl 6h 6 hvor er hydrogen eller pyrrolidin-l-ylmethyl, R2 er hydrogen eller hydroxy, R3 er hydrogen, hydroxy eller 10 methyl, R4 er hydrogen eller methyl, og R5 er hydrogen, chlor eller dimethylamino, f.eks. chlortetracyclin, oxy-tetracyclin, tetracyclin, demethylchlortetracyclin, meta-cyclin, doxycyclin, minocyclin eller rolitetracyclin, aminoglycosider, f.eks. kanamycin, amikacin, gentamicin 15 Ci, Cia, C2 eller C2br sisomicin, netilmicin, spectino-mycin, streptomycin, tobramycin, neomycin B, dibecacin eller kanendomycin, makrolider, f.eks. maridomycin eller erythromycin, lincomyciner, f.eks. clindamycin eller lincomycin, penicillansyre- og cephalosporansyrederivater 20 med antibiotisk aktivitet med 60- eller 70-acylamino-grupper, som findes i fermentativt, semisyntetisk eller syntetisk fremstillede 60-acy1aminopenici11ansyre- eller 70-acylaminocephalosporansyrederivater eller i 3-stil-lingen omdannede 70-acylaminocephalosporansyrederivater, 25 f.eks. penicillansyrederivater, der kendes under navnene penicillin G eller V, phenethicillin, propicillin, naf-cillin, oxacillin, cloxacillin, dicloxacillin, flucloxa-cillin, cyclacillin, epicillin, mecillinam, methicillin, azlocillin, sulbenicillin, ticarcillin, mezlocillin, 30 piperacillin, carindacillin, azidocillin eller ciclazillin eller cephalosporinderi vater, der kendes under navnene

DK 165314B

8 cefaclor, cefuroxim, cefazlur, cephacetril, cefazolin, cephalexin, cefadroxil, cephaloglycin, cefoxitin, cepha-loridin, cephsulodin, cefotiam, ceftazidin, cefonicid, 5 cefotaxim, cefmenoxim, ceftizoxim, cephalothin, cephradin, cefamandol, cephanon, cephapirin, cefroxadin, cefatrizin, cefazedon, ceftrixon eller ceforanid, samt andre /3-lac tam-antibiotika af clavam-, penem- eller carbapenemtypen, f.eks. moxalactam, clavulansyre, nocardicin A, sulbactam, 10 aztreonam eller thienamycin, eller andre antibiotika af bicomycin-, novobiocin-, chlor- eller thiamphenicol-, rifampicin-, fosfomycin-,· colistin- eller vancomycintypen.

Antileishmania er fortrinsvis antimonforbindelser, f.eks. kaliumantimonyltartrat, stibophen, natriumstibocaptat 15 eller natriumstibogluconat.

Antimycotika er f.eks. thiokulsyrederivater, f.eks. di-benzthion, tolnaftat eller tolcidat, imidazolderivater, f.eks. clotrimazol, miconazol, econazol, -iconazol eller ketoconazol, eller polyenderivater, såsom nystatin, 20 natamycin eller amphotericin B.

Antineoplastika er fortrinsvis alkylerende midler indeholdende bis-(2-chlorethyl)-amingruppen, såsom chlor-methin, chlorambucil, melphalan, uramustin, mannomustin, extramustinphosphat, mechlorethaminoxid, cyclophosphamid, 25 ifosfamid eller trifosfamid, alkylerende stoffer med en substitueret aziridingruppe, f.eks. tretamin, thiotepa, triaziquon eller mitomycin, alkylerende stoffer af methansulfonestertypen, såsom busulfan, alkylerende N-alkyl-N-nitrosurinstofderivater, f.eks. carmustin, 30 lomustin, semustin eller streptozotocin, alkylerende stoffer af mitobronitol-, dacarbazin- eller procarbazin-typen, kompleksdannende stoffer, såsom cis-platin, antimetaboliter af folinsyretypen, f.eks. methotrexat, purinderivater, såsom mercaptopurin, thioguanin, aza-35 thioprin, tiamiprin, vidarabin eller puromycin,

DK 165314 B

9 pyrimidinderivater, f.eks. fluorouracil, floxuridin, tegafur, cytarabin, idoxuridin, flucytosin, antibiotika, såsom dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mithra-5 mycin, bleomycin A2 eller B2 eller etoposid eller vinca-alkaloider, eventuelt i kombination med chlormethamin, prednisolon, prednison eller procarbazin.

Forbindelser eller blandinger af forbindelser med immun-modulatoriske egenskaber er eksempelvis muramylpeptider 10 med formlen

R3Q

Hyl °\ rJ>?_{/<"· 0H (V)- y ’ NHC0CH3 r2-ch 'CORj hvor Ri er L-Ala-D-isoGln-L-Ala-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid-, L-Ala-D-Glu-(Cgamma-L“Ala“2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-15 phosphoryloxy)-ethylamid-, L-Ala-D-isoGln-OH-, L-Ala-D-Gln-NH2-a-n-butylester-, L-Ala-D-isoGln-L-(stearoyl)-Lys-, L-Val-D-Gln-NH2-a-n-methylester-, L-Ala-D-isoGln-L-Ala-l,2-dipalmitoyl-sn-glycerolester- eller L-Ala-D-isoGln-L-Ala-cholesterolester-gruppen, R2 er hydrogen, 20 methyl eller n-propyl, R3 er hydrogen, n-stearoyl, 10-(2,3-dimethoxy-l, 4-dioxo-5-methyl) -2,5-cyclohexadienoyl, 2-behenoyloxy-2-methyl-propanoyl eller n-octanoyl, og R4 er hydrogen eller n-octanoyl, samt 2-palmitoylthioderiva-tet deraf, lipopeptider, såsom n-lauroyl-L-Ala-D-isoGln-25 (m-DAP-Gly)-NH2, n-lauroyl-L-Ala-D-isoGln-(L-DAP-Gly)- NH2, n-lauroyl-L-Ala-D-isoGln-(L-Lys-D-Ala)-NH2^ n-octa-noyl-L-Ala-D-isoGln-(L-Lys-D-Ala)-NH2 eller palmitoyl-Cys- ((2R) -2,3-dilauroyloxy-propyl)-Ala-D-Glu-(Gly-taurin-Na)-NH2, eller lymphokiner, som er produceret af lymfo-30 cyter, monocyter eller makrofager efter stimulering med antigener eller mitogener.

DK 165314B

10

Lymphokiner er fortrinsvis gamma-interferon, særligt naturligt eller rekombineret, humant gamma-interferon, især humant gamma-interferon, som kan fremstilles ifølge 5 europæisk patentansøgning 63.482, 77.670, 83.777, 88.540, 89.676, 95.350, 99.084, 110.044 og 112.967 og de internationale ansøgninger (PCT) WO 83/04.053 og WO 84/02.129.

Der foretrækkes humant gamma-interferon med følgende aminosyresekvenser: foN-Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Gln-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lys-Ile-Met-Gln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu-Thr-Ile-Lys-Glu-Asp-Met-Asn-Val-Lys-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Glu-Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val-Gln-Arg-Lys-Ala-Ile-His-Glu-Leu-Ile-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Glu-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Het-Leu-Phe-Gln-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH, 10 ifølge EP-patentansøgning 121.157 og H2N-Cys-Tyr-Cys-Gln-Asp-Pro-Tyr-Val-Lys-Glu-Ala-Glu-Asn-Leu-Lys-Lys-Tyr-Phe-Asn-Ala-Gly-His-Ser-Asp-Val-Ala-Asp-Asn-Gly-Thr-Leu-Phe-Leu-Gly-Ile-Leu-Lys-Asn-Trp-Lys-Glu-Glu-Ser-Asp-Arg-Lys-Ile-Ket-Gln-Ser-Gln-Ile-Val-Ser-Phe-Tyr-Phe-Lys-Leu-Phe-Lys-Asn-Phe-Lys-Asp-Asp-Gln-Ser-Ile-Gln-Lys-Ser-Val-Glu-Thr-Ile-Lys-Glu-Asp-Het-Asn-Val-Lys-Phe-Phe-Asn-Ser-Asn-Lys-Lys-Lys-Arg-Asp-Asp-Phe-Glu-Lys-Leu-Thr-Asn-Tyr-Ser-Val-Thr-Asp-Leu-Asn-Val-Gln-Arg-Ly s-Ala-I le-Hi s-Glu-Leu-I le-Gln-Val-Met-Ala-Glu-Leu-Ser-Pro-Ala-Ala-Lys-Thr-Gly-Lys-Arg-Lys-Arg-Ser-Gln-Met-Leu-Phe-Arg-Gly-Arg-Arg-Ala-Ser-Gln-OH,

DK 165314 B

11 ifølge GB-patentansøgning 2.107.718, humant interleukin 2 kan fremstilles f.eks. fra kulturfiltraterne fra cellekulturer af leukæmi- eller lymfomceller efter aktivering 5 eller stimulering med humane T-cellemitogener og ved rensning med omvendt fase højtryksvæskekromatografi, hvilke kulturfiltrater indeholder blandinger af forbindelser, der er kendt under begreberne migrationsinhi-beringsf aktor (MIF), leukocytmigrationsinhiberingsf aktor, 10 makrofagaktiveringsfaktor (MAF), kolonistimulerende faktor samt interleukin 1 og 2 og gamma-interferon, og som fremstilles fra kulturer af humane T-lymfocyter fra milt eller fra perifert blod efter stimulering med antigener eller mitogener eller eksempelvis humane T-celle-leukæmi-15 lymfom-virus (HTLV-I eller -II), phytohæmagglutinin eller concanavalin, især sådanne kulturfiltrater eller isolater med et højt procentvis indhold af makrofag-aktiverende faktor (MAF).

Der foretrækkes N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-20 L-alanin-2- (1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-oxy)-ethyl amid, natrium-N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D- isoglutamin eller natrium-N-acetyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin med formlen V, eventuelt i kombina-. tion med renset, naturligt eller rekombineret humant 25 gamma-interferon.

Lipider (komponent d) valgt blandt gruppen af phosphat-idylcholin, phosphatidylserin, phosphatidyl inositol, phosphatidylglycerol og cardiolipin er syntetiske phospholipider eller er blandinger af phospholipider med 30 forskellige acylgrupper med forskellig molekylvægt og struktur, f.eks. sojabønne- eller hønseægphosphatidyl-cholin eller phosphatidylquinolin fra oksehjerner, okselever eller svinelever, phosphatidylserin fra oksehjerne, phosphatidylinositol fra sojabønne eller fra gær, 35 phosphatidylglycerol fra æggeblomme eller cardiolipin fra oksehjerte.

DK 165314B

12

Cholesterolderivater er eksempelvis cholestan, coprostan, ergosterol eller stigmasterol.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er karak-5 teriseret ved deres udmærkede phagocytose. Eksempelvis er phagocytosen af multilamellare liposomer bestående af en 3:7-molær blanding af natrium-N-[ 1,2-di-(9-cis-octa-decenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinyl-amin (I) og dioleoylphosphatidylethanolamin (II) eller 10 natrium-N-[1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phospho-ethanol ]-N-hydroxyglutarylamin (I) og dioleoylphosphat-idylethanolamin (II) hos muse-peritoneal-makrofager højere end phagocytosen af multilamellare liposomer bestående udelukkende af phosphatidylethanolamin eller af 15 en 3:7-molær blanding af phosphatidylserin og phosphat-idylcholin. Dette kan eftervises in vitro ved inkubation af muse-peritoneal-makrofager med multilamellare liposomer. indeholdende spormængder af 125χ som liposommarkør. Med regelmæssige intervaller vaskes kulturerne, og omfanget af 20 celleassocieret stråling bestemmes. Endvidere udviser liposomer, der består af phospholipider med formlerne I og II i et molært forhold på 3:7, indeholdende immunmodula-torer, såsom MDP og gamma-interferon, en højere aktivering af makrofager til den tumorocide tilstand ved låve 25 doser end liposomer, der består af phosphatidylcholin og phosphatidylserin, indeholdende den samme mængde MDP og gamme-interferon. Dette kan også vises in vitro ved pladedyrkning af peritoneale musemakrofager i dyrkningshuller og aktivering af makrofagerne med multilamellare 30 liposomer bestående af natrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octa-decenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinyl-amin (I) og dioleoylphosphatidylethanolamin (II) i et molært forhold på 3:7 og indeholdende MDP og gammainterferon og med multilamellare liposomer bestående af 35 phosphatidylcholin og phosphatidylserin i det samme molære forhold og indeholdende MDP og gamma-interferon. Liposomtilberedningerne anvendes ved en koncentration på

DK 165314B

13 100 nmol af totalt phospholipid pr. hul og indeholder 6 enheder rekombineret immun-gamma-interferon og 0,2 g MDP.

Efter vaskning tilsættes hullerne 10^ [ 125χ ]iododeoxy- 5 uridin-mærket BL6 melanomceller. Cytotoksiciteten bestemmes efter 72 timers cokultivering ved måling af radioaktiviteten, der er forbundet med de vedhængende, levedygtige målceller efter vaskning af kulturerne tre gange med Hank's afstemte saltopløsning. Den procentvise 10 cytotoksicitet kan beregnes over for antal counts pr.

minut i kontrolkulturer indeholdende ikke-aktiverede makrofager og målceller.

De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er tillige karakteriseret ved deres udmærkede afgivelsesegenskaber 15 ved lave pH-værdier. Afgivelsesegenskaberne af liposomer bestående af dinatrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinylamin og 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol-amin i et molært forhold af 3:7 er analyseret ved 20 fluorescensmetoden til måling af udsivningen fra liposomer ved lave pH-værdier, som beskrevet af Ellens et al.

Biochemistry 1984, 23, 1532-1538. For at undersøge udsivningens pH-afhængighed indsprøjtes liposomer i pufferopløsninger med pH fra 4,0 til 7,4, og den 25 procentvise mængde af indesluttet 8-amino-naphthalen- 1,3,6-trisulfonsyre (ANTS) og p-xylylen-bis-pyridinium-dibromid (DPX), som erstatter det indkapslede farma-ceutika i denne prøve, bestemmes. Fuldstændig indkapsling af det vandopløselige, fluorophore ANTS, der er 30 kompleksbundet med "slukningsmidlet" DPX, slukker hovedparten af ANTS-fluorescensen. Udsivning af ANTS fra liposomerne kan følges ved øgningen i fluorescensen på grund af afgivelsen af DPX-"slukningen".

Det har vist sig, at der så godt som ikke er nogen udsiv-35 ning over pH 6,0. Når pH aftager, er der imidlertid en samtidig forøgelse i mængden af ANTS/DPX-afgivelse fra

DK 165314 B

14 liposomerne med en halv maksimal afgivelse ved ca. pH 4,5 og fuldstændig afgivelse ved ca. 4,0.

Det er kendt, at patologiske væv har en omgivende pH-5 værdi, der er væsentligt lavere end hos normalt væv. F.eks. har primære tumorer, metastaser, inflammation og infektion reducerede, lokale pH-omgivelser. Præparatet ifølge opfindelsen vil derfor afgive deres indhold, f.eks. antiinflammtoriske midler eller immunmodulatorer, 10 specifikt til det sted, hvor der er inflammation, primær tumor eller metastase og frigive midlerne i det sure miljø hos disse patologiske væv. Eksempelvis afgiver liposomer bestående af en 3:7-molær blanding af dinatrium-N-[ 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydr-15 oxysuccinylamin (I) og dioleoylphosphatidylethanolamin mere af deres indhold, f.eks. en effektiv mængde rekombineret humant gamma-interferon, ved lave pH-værdier, f.eks. pH 4, · end ved højere eller neutrale pH-værdier.

Dette kan eftervises in vitro i pufferopløsninger med pH 20 7,4 og pH 4 ved bestemmelse med regelmæssige tids intervaller af strålingen fra mærket l^Si-i^erferon afgivet fra lipiderne. Eksempelvis er ved pH ca. 4 mere end 25% af indesluttet gamma-interferon afgivet fra liposomerne efter 180 minutter.

25 De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er derfor udmærkede administrationssystemer til aflevering af aktive stoffer til patologiske vævs omgivelser med reduceret lokal pH. De er derfor særligt velegnede ved cancerkemoterapi til bekæmpelse af metastatiske 30 tumorceller.

Vandige liposomdispersioner, hvor phospholipiderne med formlerne I og II er det omsluttende materiale og forbindelser eller en blanding af forbindelser med farmakologisk aktivitet, er indesluttet, er eventuelt 35 efter koncentrering eller isolering af liposomerne, f.eks.

DK 165314B

15 i (ultra)centrifuge, egnede til terapeutisk anvendelse til parenteral (bukkal, lingual, sub-lingual, i.v., i.c., topikal, s.c., i.m. eller nasal) administrering.

5 Til parenteral administrering (topikal) kan den liposom-holdige vandige dispersion blandes med sædvanlige fortykningsmidler, f.eks. hydroxypropylmethylcellulose, egnede konserveringsmidler, antioxidanter og parfumestoffer, og de kan anvendes i form af en lotion eller en 10 gel til applikation på hud eller slimhinder.

Til parenteral administrering kan den vandige dispersion af de berigede liposomer suspenderes i en egnet bærevæske, f.eks. steril, calciumfri, isotonisk natriumchlorid- eller glucoseopløsning, eventuelt pufret til pH 7,2-7,4.

15 Doseringen af den aktive, administrerede komponent ligger sædvanligvis mellem højeste og laveste dosis, der er angivet, f.eks. i Deutsches Arzneimittelbuch [vesttysk pharmacopé ] for den pågældende, aktive komponent ved den pågældende administrationsform, patientens alder og 20 patientens helbredstilstand. Imidlertid har vandige liposomdispersioner også den fordel, at aktive komponenter, der administreres i mindre doser, ikke desto mindre kan passere hen til receptorerne og fremkalde en terapeutisk virkning eller, ved administrering af højere 25 doser, at uønskede sidevirkninger kan undgås.

Den foretrukne dosering af de liposom-indkapslede immun-modulatorer af muramylpeptid- eller lipopeptidtypen er ca.

0,001 op til 10 mg/kg legemsvægt pr, dosis. For humant gamma-interferon eller blandinger indeholdende MAF er den 30 foretrukne dosering ca. 0,01 ml liposomdispersion pr. kg legemsvægt indeholdende 100-1000 enheder gamma-interferon eller MAF. Såfremt muramylpeptider administreres i kombination med gamma-interferon, anslås det, at den største dosis appliceret til et menneske på ca. 70 kg legemsvægt

DK 165314B

16 er ca. 10 mg liposomer pr. kg legemsvægt indeholdende 3 mikrogram af muramylpeptidet og 1500 enheder gammainterferon. Den højeste og den laveste dosis af det 5 indkapslede materiale, koncentrationen af phospholipi-derne i den vandige fase samt koncentrationen af de indkapslede forbindelser kan varieres under hensyntagen til eksperimentelt fremkomne resultater ved kliniske undersøgelser.

10 Den foreliggende opfindelse angår fortrinsvis farmaceutiske præparater bestående af a) et phospholipid med formlen I, hvori m er to, R^ og R2 er defineret som ovenfor, X er Ci_4-alkylen eller C2-4~alkenylen eller et farmaceutisk acceptabelt salt 15 deraf, b) et phospholipid med formlen II, hvor R3 og R4 uafhængigt af hinanden er ligekædet Ciø_20-alkanoyl eller ^10-20-31^11^1 r c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser med 20 farmakologisk virkning, og

en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH

7.2- 7,4.

Opfindelsen angår især farmaceutiske præparater bestående af 25 a) et phospholipid med formlen I, hvor m er to, R^ og R2 er defineret som ovenfor, X er C2-4~alkylen eller C2-4-alkenylen, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, b) et phospholipid med formlen II, hvor R3 og R4 uafhængigt af hinanden er ligekædet CiQ_20~alkanoyl eller 30 C4ø_2ø-alkenoyl, c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser valgt blandt gruppen af antiphlogistika og/éller anti-inflammatoriske midler, antibiotika, antileishmania, antineoplastistika og immunmodulatorer, og

35 en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH

7.2- 7,4.

DK 165314B

17

Opfindelsen angår specielt farmaceutiske præparater bestående af a) et phospholipid med formlen I, hvor m er to, Ri og R2 5 uafhængigt af hinanden er ligekædet alkanoyl eller alkenoyl med et lige antal, fra 10 til 20 carbonatomer, X er C2_4-alkylen, f.eks. 1,2-ethylen eller 1,3-propylen, eller C2_4~alkenylen, f.eks. vinylen, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, 10 b) et phospholipid med formlen II, hvor R3 og R4 er ligekædet 010-20-31^110^1 med et li9© antal, fra 10 til 20, carbonatomer, c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser .valgt blandt gruppen af antiphlogistika og/eller anti-15 inflammatoriske midler, antibiotika, antineoplastika og immunmodulatorer, og

en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH

7.2- 7,4.

Opfindelsen angår mere specielt farmaceutiske præparater 20 bestående af a) et phospholipid med formlen I, hvor m er to, R^ og R2 uafhængigt af hinanden er 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetra-decenoyl, 9-cis-hexadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 9-trans- eller 11-cis-octadecenoyl eller 9-cis-icosenoyl, 25 X er 1,2-ethylen, 1,3-propylen eller vinylen, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, b) et phospholipid med formlen II, hvor R3 og R4 uafhængigt af hinanden er 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetra-decenoyl, 9-cis-hexadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 30 9-trans- eller 11-cis-octadecenoyl eller 9-cis-icosenoyl, c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser valgt blandt gruppen af antiphlogistika og/eller anti-inflammatoriske midler, antibiotika, antineoplastika og immunmodu1atorer, og

35 en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH

7.2- 7,4.

DK 165314B

18

Specielt angår opfindelsen farmaceutiske præparater bestående af a) natrium- eller dinatrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octa-5 decenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinyl- amin eller natrium- eller dinatrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxy-glutarylamin, b) 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosph0-10 ethanolamin, c) en forbindelse eller· en kombination af forbindelser valgt blandt gruppen af antiphologistika og/eller anti-inflammatoriske midler, antibiotika, antineoplastika og immunmodulatorer, og

15 en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH

7,2-7,4.

Der foretrækkes farmaceutiske præparater bestående af a) natrium- eller dinatrium-N-[ 1,2-di-(9-cis-octa-decenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinyl- 20 amin eller natrium- eller dinatrium-N-[l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxy-glutarylamin, b) 1,2-di- (9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phospho-ethanolamin, 25 c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser valgt blandt gruppen af diclofenac, pirprofen, mitomycin, cytarabin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, etoposid, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L- alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-30 oxy)-ethylamid, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre-(CY-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)-ethylamid-dinatriumsalt, N-acetyl-D- muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt, N-acetyl- desmethyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt, 35 N-acetyl-murarnyl-L-alanyl-D-glutamin-a-n-butylester, Na-(N-acetyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl)-NY-ste aroy1-L-lysin, 6-0-stearpy1-N-acetylmuramyl-L-

DK 165314B

19 alanin-D-isoglutamin og lymfokin, og

en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH

7.2- 7,4.

5 Særligt foretrækkes farmaceutiske præparater bestående af a) natrium- eller dinatrium-N-[ 1,2-di-(9-cis-octa-decenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinyl-amin eller natrium- eller dinatrium-N-[ 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxy- 10 glutarylamin, b) 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phospho- ethanolamin, c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser tilhørende gruppen af diclofenac, pirprofen, mitomycin, 15 cytarabin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, etoposid, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamihyl-L- alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryl-oxy) -ethylamid, natrium-N-acetyl-D-muramyl-Ii-alanyl- D-isoglutamin, natrium-N-acetyldesmethyl-muramyl-L-alanyl-20 D-isoglutamin, renset, naturligt eller rekombineret humant gamma-interferon, interleukin 2 og forbindelser fremstillet fra kulturer af humane T-lymfocyter fra milten eller fra perifert blod efter stimulering med antigener eller mitogener, og som er karakteriseret ved et højt procentvis 25 indhold af makrofag-aktiverende faktor (MAF), og

en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH

7.2- 7,4.

Særligt foretrækkes farmaceutiske præparater bestående af a) natrium- eller dinatrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octa-30 decenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinyl- amin eller natrium- eller dinatrium-N-[1,2-di-(9-cis-octadecenoyl )-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxy-glutary1amin, b) 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phospho-35 ethanolamin, c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser

DK 165314 B

20 bestående åf N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(l,2-dipalmitoyl-sn-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, natrium-N-acetyl-D-muramy1-L-alany1-D-iso- 5 glutamin, natrium-N-acetyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D- glutamin, og renset, naturligt eller rekombineret humant gamma-interferon, og

en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH

7,2-7,4.

10 Opfindelsen angår tillige blandinger af syntetiske phospholipider med formlerne I og IX og eventuelt et lipid valgt blandt gruppen af phosphatidylcholin, phosphatidyl-serin, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardio-lipin og eventuelt cholesterol og derivater deraf, hvor 15 forholdet mellem phospholipid (I) til phospholipid (II) er fra 10:90 til 50:50 mol-%. Forholdet 30:70 mol-% er særligt foretrukket. Blandingerne er egnede til fremstilling af liposomer i en vandig fase indeholdende komponenten c), forbindelser eller en kombination af 20 forbindelser med farmakologisk virkning.

Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at man a) fremstiller en homogen blanding bestående af phospho-lipiderne med formlen I og II i forholdet 10:90 til 50:50 25 mol% og de nævnte yderligere lipider og en lipofil forbindelse eller blandinger af forbindelser med farmakologiske egenskaber og dispergerer den dannede homogene blanding i vandig fase, eller b) fremstiller en homogen blanding bestående af phospho-30 lipider med formlen I og II i forholdet 10:90 til 50:50 mol% og de nævnte yderligere lipider og dispergerer den dannede homogene blanding i vandig fase indeholdende en vandopløselig forbindelse eller blanding af forbindelser med farmakologiske egenskaber og, 35 om nødvendigt, indstiller den dannede vandige dispersion på pH 7,0-7,8 og, om ønsket, koncentrerer og/eller

DK 165314 B

21 separerer de fremstillede liposomer.

Den homogene blanding fremstilles ved dannelse af en film eller et lyofilisat.

5 Filmdannelsen gennemføres ifølge fremgangsmåde a) ved opløsning af phospholipiderne (I) og (II) og den lipofile forbindelse eller blandingen af forbindelser og eventuelt et ovenfor omtalt lipid af naturlig oprindelse eller ifølge måden b) ved opløsning af phospholipiderne (I) og 10 (II) og eventuelt et ovenfor omtalt lipid af naturlig oprindelse i et organisk opløsningsmiddel og fjernelse af opløsningsmidlet.

Egnede opløsningsmidler er f.eks. usubstituerede eller substituerede, f.eks. halogenerde, aliphatiske eller 15 cycloaliphatiske carbonhydrider, f.eks. n-hexan, cyclo-hexan, methylenchlorid eller chloroform, alkoholer, f.eks. methanol eller ethanol, lavalkancarboxylsyreestere eller -amider, f.eks. eddikesyresyreethylester eller dimethyl-formamid, eller ethere, f.eks. diethylether, tetrahydro-20 furan eller dioxan, eller blandinger af disse opløsningsmidler. Det organiske opløsningsmiddel fjernes derpå i vakuum, fortrinsvis højvakuum, eller det fjernes med en indifferent gas, f.eks. nitrogen.

Lyofilisatdannelsen gennemføres, ifølge, fremgangsmåde a) 25 ved opløsning af phospholipiderne (I) og (II) og de lipofile forbindelser eller blandingen af forbindelser, eller ifølge fremgangsmåde b) ved opløsning af phospholipiderne (I) og (II) i et organisk opløsningsmiddel i henhold til metoden beskrevet i US-patentskrift nr.

30 4.311.712. Egnede opløsningsmidler foreligger på fast form sammen med phospholipiderne (I) og (II) ved lyofilisa-tionsprocessens temperatur, og de har et smeltepunkt over 0°C, f.eks. iseddikesyre, benzen eller dioxan, især tert-butanol.

DK 165314B

22

En homogen blanding kan også fremstilles ved spray-tørring af en opløsning af phospholipiderne (I) og (II) og af det omsluttende materiale i et organisk opløsningsmiddel med 5 et lavt kogepunkt, såsom chloroform. Ved denne fremgangsmåde opnås et pulver.

Forholdet mellem phospholipidkomponenten (I) og phospho-lipidkomponenten (II) i den homogene blanding er som nævnt 10:90 til 50:50 mol-%. Der foretrækkes et forhold på 10 30:70 mol-%.

Det omtrentlige forhold af de molære mængder af det indesluttede materiale (gamma-interferon) og den samlede mængde af phospholipiderne (I) og (II) er ca. 0,0001 til 0,1:1,0, fortrinsvis 0,005 til 0,01:0,1.

15 Dispergeringen gennemføres ved mekanisk omrøring (omrystning, omrøring, Vortex-blander) af den vandige fase, til hvilken der ifølge fremgangsmåde a) er tilsat den homogene blanding af phospholipiderne (I) og (II) og de lipofile forbindelser eller den lipofile blanding af 20 forbindelser med farmakologisk virkning. Ifølge fremgangsmåde b) sættes den vandige fase indeholdende de hydrofile forbindelser eller blandingen af forbindelser med farmakologisk aktivitet til den homogene blanding af phospholipiderne (I) og (II).

25 En blanding af små og store, unilamellare eller multi-lamellare. liposomer dannes spontant med stor hastighed uden tilførsel af energi udefra. Der kan dispergeres fra ca. 0,1 til 40 vægt-%, fortrinsvis 2-20 vægt-%, af den homogene blanding (beregnet på den samlede vægt af den 30 vandige dispersion) i den vandige fase. Sådanne dispersioner kan yderligere fortyndes til ca. 1 mikromol lipid pr. ml. Sådanne liposom-dispersioner indeslutter ca.

2,5 mikroliter vandig fase pr. mikromol lipid.

DK 165314 B

23

Surt eller basisk reagerende, vandige dispersioner pufres til en omtrentlig pH på 7,0-7,8, fortrinsvis 7,2-7,4. Fortrinsvis foretages dispergeringen i en vandig fase med 5 pH 7,2-7,4.

Fremgangsmåde a) foretrækkes, når lipofile, vanduopløse-lige forbindelser indesluttes i liposomer, f.eks. lipofile muramyltripeptider.

Fremgangsmåde b) foretrækkes, når hydrofile, vanduopløse-10 lige forbindelser indesluttes i liposomer, f.eks. cytarabin eller cytostatika, såsom trifosfamid.

Fremstillingen af de farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen i form af liposomer kan også gennemføres ved anvendelse af andre inden for teknikken kendte fremgangs-15 måder til fremstilling af liposomer, f.eks. ved påvirkning med ultralydbølger, ved infusionsmetoder eller omvendt fase-fordampning.

Dispergeringstrinnet foretages ved temperaturer under 60°C, fortrinsvis ved stuetemperatur. Såfremt materialet, 20 der skal indkapsles, er temperaturfølsomt, gennemføres dispergeringen under afkøling og eventuelt under en indifferent gasatmosfære, f.eks. nitrogen- eller argonatmosfære.

De dannede liposomer kan gøres opbevaringsstabile i den 25 vandige fase i op til flere uger eller måneder ved tilsætning af stabilisatorer, f.eks. mannitol eller lactose.

Størrelsen af de dannede liposomer er bl.a. afhængig af strukturen af det aktive stof og lipidkomponenten, blan-30 dingsforholdet mellem komponenterne og koncentrationen af disse komponenter i den vandige dispersion. Således kan man eksempelvis ved at hæve eller sænke koncentration af

DK 165314 B

24 lipidkomponenterne fremstille vandige faser med et stort indhold af små eller store liposomer.

Adskillelsen af små liposomer fra store liposomer gennem-5 føres ved hjælp af gængse adskillelsesmetoder, f.eks. sedimentering af de store liposomer i en ultracentrifuge, ved gelfiltrering eller ekstrudering gennem lige-porede filtre. Eksempelvis giver centrifugering, i f.eks. fia 5 til 60 minutter, i et rotationsfelt anledning til en 10 inertial kraft svarende til et tyngdefelt på 5000-40000 x G, og store liposomer aflejres på bunden af beholderen, medens små liposomer forbliver dispergeret og kan dekanteres fra. Efter gentagen centrifugering opnås fuldstændig adskillelse af store og små liposomer.

15 Liposomer adskilles fortrinsvis fra den vandige fase, når den vandige fase ifølge fremgangsmåde b) indeholder ikke-indkapslede, vanduopløselige forbindelser eller farmaceutiske stoffer. Især bør vandopløselige antineo-plastika, f.eks. alkylerende forbindelser, såsom cyclo-20 fosfamid, separeres fra ved filtrering, ultrafiltrering, dialyse eller centrifugering for at undgå eventuelle sidevirkninger fremkaldt af ikke-indkapslede forbindelser. Liposomfraktionen kan blandes med en bæreopløsning pufret til pH 7,2-7,4, f.eks. isotonisk, steril natriumchlorid-25 opløsning pufret til pH 7,2-7,4.

Liposomer i den vandige fase har en diameter større end 6,0 x 10~8 m, f.eks. kan store, multilamel1are liposomer separeres fra ved gelfiltrering, f.eks. med Sepharose eller Sephacryl som bærematerialer.

30 Ved presning gennem lige-porede filtre, f.eks. membranfiltre af typen "Acrodisc"®, "Nucleopore"® eller af poly-carbonat-typen med en porediameter på ca. 1,0 x 10~6 - 1,0 x 10“8 m, ved et tryk på ca. 0,1 til 1,5 bar og en filtreringshastighed på ca. 20 ml/time opnås en særlig 35 ensartet størrelsesfordeling af liposomerne.

DK 165314B

25

Dannelsen af liposomer og indholdet heraf i den vandige fase kan påvises på i og for sig kendt måde ved hjælp af forskellige fysisk analytiske metoder, f.eks. ved mikro-5 skopi af frysebrudprøver (freeze-fracture samples) og tyndtlagssnit i et elektronmikroskop eller ved røntgenrefraktion, ved dynamisk lysspredning, ved massebestemmelse af filtratet i en analytisk ultracentrifuge og først og fremmest spektroskopisk, f.eks. i det kernemagnetiske 10 resonansspektrum (^H, °9 31p),

Syntetiske phospholipider med formlen I er kendte. Deres fremstilling som mellemprodukter er beskrevet i EP-patent-ansøgning nr. 56.992.

Phospholipiderne med formlen II er alle kendte. Nogle af 15 dem er handelsgængse (Avanti, Fluka, Serva, Sigma).

De ovenfor omtalte farmaceutisk virksomme forbindelser, især antiphlogistika, antirheumatika, antileishmania, antimycotika, antibiotika eller antineoplastika, er alle kendte, jævnfør f.eks. Merck Index, 10. udgave.

20 Fremstillingen af muramylpeptider med formlen V er beskrevet i GB-patentspecifikation nr. 1.570.625, og i EP-patentansøgninger nr. 25.495 og nr. 21.367. Immun-modulatorer af lipopeptidtypen er også kendte, se EP-patentansøgning nr. 114.787 og EP-patentskrift nr. 330.

25 Fremstillingen af renset, naturligt eller rekombineret gamma-interferon er beskrevet i EP-patentansøgninger nr. 63.482, nr. 77.670, nr. 83.540, nr. 89.676, nr. 95.350, nr. 99.084, nr. 110.044, nr.' 112.976 eller nr. 121.157, i GB-patentskrift nr. 2.107.718 samt i de internationale 30 (PCT) ansøgninger nr. (WO) 83/04053 eller WO 84/02129.

Fremstillingen af renset interleukin 2 er beskrevet i EP-patentansøgning nr. 106.179 og i US-patentskrift nr.

DK 165314B

26 4.448.879.

Pufferopløsningerne med pH 7,0 til 7,8 er fortrinsvis sterile phosphatpufferopløsninger baseret på dihydrogen-5 phosphat/hydrogenphosphat-ligevægten (K^PC^/NagHPC^).

Fremstillingen af disse pufferopløsninger er beskrevet i standardværker, f.eks. ."Hager's Handbuch der Pharmazeu-tischen Praxis", Springer Verlag, bind 1, side 357-359.

Især anvendes steril, isotonisk, calciumfri pufferopløs-10 ning med pH 7,2 (Dulbecco) eller Hank's afstemte saltopløsning (M.A. Bioproducts, Walkersville MD USA).

Opfindelsen illustreres i de følgende eksempler.

Eksempel 1 a) I en rundkolbe opløses 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-15 N-[ 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]- N-hydroxysuccinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin i en tilstrækkelig mængde tert-butanol, indtil begge lipider er opløst. Opløsningen filtreres tinder sterile betingelser 20 gennem "Acrodisc"©-filter (2,0 x 10“7 m) og påfyldes et sterilt hætteglas. Hætteglasset fryses ved -45°C. Et vakuum påføres det frosne hætteglas, og opløsningsmidlet fjernes, indtil stuetemperatur er nået. Hætteglasset forsegles under indifferent gasatmosfære, f.eks. argon-25 atmosfære.

Til dette hætteglas indeholdende et lyofilisat af de ovenfor omtalte lipidkomponenter sættes ved hjælp af en steril sprøjte 2,5 ml steril, phosphatpufret (pH 7,2-7,4), calciumfri natriumchloridopløsning (Dulbecco) indehol-30 dende doxorubicin i en koncentration på 4 g/1. Hætteglasset omrystes derpå i 10 minutter på en standardiseret laboratorierystebord (Vortex, hastighed 6) og

DK 165314B

27 anbringes i en centrifuge. Efter centrifugering i et tyngdefelt på ca. 40000 x G i ca. 60 minutter dekanteres supernatanten. Liposomdispersionen suspenderes igen i 5 2,5 ml 0,85% steril, phosphatpufret (pH 7,2-7,4) natrium- chlqridopløsning (Dulbecco). Centrifugeringen og resus-penderingen gentages, indtil supernatanten ikke indeholder doxorubicin. Den fremstillede liposomdispersion kan anvendes til parenteral administrering.

10 b) Fremstilling af natrium-N-Tl,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol 1-N-hydroxysuccinylamin 200,6 mg (270 mikromol) l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin tørres under nitrogen og anbringes i højvakuum i 2 timer. Det tørre lipid opløses i 15 10 ml frisk destilleret pyridin indeholdende 54 mg (540 mikromol) ravsyreanhydrid. Reaktionsblandingen omrøres i 2 timer under nitrogenatmosfære ved 55eC. Den overskydende mængde pyridin fjernes ved fordampning under reduceret tryk, og den overskydende mængde ravsyre-20 anhydrid hydrolyseres ved suspendering af remanensen i en blanding af chloroform-methanol-0,58% vandig natrium-chloridopløsning (1:2:0,8 r/r). Produktet ekstraheres ved fordeling efter tilsætning af én rumfangsdel chloroform og én rumfangsdel 0,58% vandig natriumchloridopløsning. Den 25 nederste fase vaskes tre gange med en blanding af chloro-form-methanol-0,58% vandig natriumchloridopløsning (3:48:47 r/r). Opløsningsmidlet fjernes ved rotationsfordampning, og remanensen suspenderes igen i chloroform.

Rf (Merck silicagel 60 plader): 0,375 (chloroform, 30 methanol, vand 65/25/4), UV: 254,6 nm (bredt), smp. 154°C.

Eksempel 2

Analogt med den ovenfor i eksempel 1 beskrevne fremgangsmåde fremstilles vandige liposomdispersioner indeholdende 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[ 1,2-di-(9-cis-octa-

DK 165314 B

28 decenoyl )-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin og 0,1 mg op til 10 mg 5 N- acetyl -L -mur amyl-L- al any 1 -D-isoglutamin-natriumsalt eller 0,1 mg op til 10 mg N-acetyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt eller 1000-100000 enheder rekombineret humant immun-gamma-interferon fremstillet som beskrevet i EP-A-121.157 (Kyowa Hakko Kogyo Co.) 10 eller en kombination af 1000-1000000 enheder af dette rekombinerede humane immun-gamma-interferon med 50-200 mikrogram natrium-N-acetyl-D-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin eller natrium-N-acetyldesmethyl-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin.

15 Eksempel 3 a) I en rundkolbe opløses 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin i en 20 tilstrækkelig mængde tert-butanol, indtil begge lipider er opløst. Opløsningen filtreres under sterile betingelser med "Acrodisc"®-filter (2,0 x 10“7 m) og påfyldes et sterilt hætteglas. Hætteglasset roteres ved 1750 o/m (omdrejninger pr. minut), og opløsningsmidlet fjernes i en 25 strøm af renset, filtreret (ved et tryk på 1 bar), tørt nitrogen. Hætteglasset evakueres i høj vakuum på 6,0 x 10-2 mbar og er stabilt under indifferent argonatmosfære.

Til dette hætteglas indeholdende en tynd film af de ovenfor nævnte lipidkomponenter sættes med en steril sprøjte 30 2,5 ml steril, phosphatpufret (pH 7,2-7,4), calciumfri · natriumchloridopløsning (Dulbecco) indeholdende diclofenac i en koncentration på 2 g/1. Hætteglasset rystes derpå i 10 minutter på et standardiseret laboratorierystebord (Vortex, hastighed 6) og anbringes i en centrifuge. Efter 35 centrifugering i et tyngdefelt på ca. 40000 x G i ca. 60

DK 165314B

29 minutter dekanteres supernatanten. Liposomdispersionen

suspenderes igen i 2,5 ml 0,85% steril, phosphatpufret (pH

7,2-7,4) natriumchloridopløsning (Dulbecco), og blandingen 5 kan anvendes til parenteral administrering.

Eksempel 4 I en rundkolbe opløses 0,1 mg N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-( 1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)ethylamid (fremstilling ifølge ΕΡΙΟ patentskrift nr. 25.495), 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanolamin i en tilstrækkelig mængde sterilt tert-butanol, indtil alle 15 komponenter er opløst. Opløsningen filtreres under sterile betingelser med "Acrodisc"®-filter (2,0 x 10“7 m) og påfyldes et sterilt hætteglas. Hætteglasset roteres ved 1750 o/m, og opløsningsmidlet blæses væk i en strøm af renset, filtreret (ved et tryk på 1 bar), tørt nitrogen.

20 Hætteglasset evakueres i høj vakuum på 6,0 x 10“2 mbar og forsegles på ny under indifferent argongasatmosfære.

Til dette hætteglas indeholdende en tynd film af de ovenfor nævnte komponenter sættes 10 ml steril, phosphatpufret (pH 7,2-7,4), calciumfri natriumchloridopløsning 25 (Dulbecco) med en steril sprøjte. Hætteglasset rystes derpå i 10 minutter på et standardiseret laboratorie-rystebord (Vortex, hastighed 6). Den fremstillede liposomdispersion er opbevaringsstabil ved 4°C og kan anvendes til parenteral administrering.

30 Eksempel 5 I en rundkolbe opløses 0,1 mg N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid (fremstilling ifølge EP-

DK 165314 B

30 patentskrift nr. 25.495), 84,70 mg (0,098 mmol) dinatri-um-N-[ 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phospho-ethanol]-N-hydroxysuccinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 5 1,2-di- (9-cis-octadecenoyl)'-sn-glycero-3-phosphoethanolamin i en tilstrækkelig mængde sterilt tert-butanol, indtil alle komponenter er opløst. Opløsningen filtreres under sterile betingelser med "Acrodisc"®-filter (2,0 x 10~7 m) og påfyldes et sterilt hætteglas. Hætteglasset fryses ved 10 -45°C. Et vakuum påføres det frosne hætteglas, og opløs ningsmidlet fjernes, indtil stuetemperatur er nået. Hætteglasset forsegles under indifferent argonatmosfære.

Til dette hætteglas indeholdende et lyofilisat af de ovenfor nævnte komponenter sættes 10 ml steril, phosphatpufret 15 (pH 7,2-7,4), calciumfri natriumchloridopløsning (Dulbec-co) med en steril sprøjte. Hætteglasset rystes i 10 minutter på et standardiseret laboratorierystebord (Vortex, hastighed 6). Den fremstillede liposomdispersion er opbevaringsstabil ved 4°C og kan anvendes til parenteral 20 administrering.

Eksempel 6

Ved en tilsvarende fremgangsmåde som ovenfor beskrevet i eksemplerne · 4 eller 5 fremstilles liposomdispersioner indeholdende 0,1 mg til 10 mg N-acetylmuramyl-L-alanyl-25 D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero- 3-hydroxyphosphoryloxy)-ethylamid, 84,70 mg (0,098 mmol) dinatrium-; N-[ 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinylamin og 168,10 mg (0,226 mmol) 1,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-30 phosphoethanolamin.

Eksempel 7 På tilsvarende måde som ovenfor beskrevet i eksempel 1 fremstilles liposomdispersioner indeholdende 86,3 mg 31

UIV IDOJIH-D

(0,098 mmol) dinatrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxyg 1 utary 1 amin og 168,1 mg (0,026 mmol) l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-5 glycero-3-phosphoethanolamin og 0,1 mg op til 10 mg N-acetyl-L-muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt eller 0,1 mg op til 10 mg N-acetyldesmethylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt.

Claims (11)

1. Farmaceutisk præparat i form af en liposom- dispersion, kendetegnet ved, ,at det består af 5 a) et phospholipid med formlen sn 1 CH2-0-IU

2 R20> 0 0 0 (I), 3 ch2-o-p-o-(chz) -nh-c-x-c-oh Ih m hvor m er to eller tre, og R2 uafhængigt af hinanden er alkyl, alkenyl eller acyl, hver indeholdende 10-20 carbon-atomer, og X er en direkte binding, Ci_4-alkylen eller 10 C2-4-alkenylen eller Ci_4-alkylen substitueret med hydroxy, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, b) et phospholipid med formlen sn 1 CH2-0—R3

2 Ri»0-CH 0 Θ (II),

3 CH2-0-Pg0-CH2-CH2-NH3 hvor R3 og R4 er acylgruppen af en mættet eller en umættet 15 carboxylsyre indeholdende fra 10 til 20 carbonatomer og 1-2 dobbeltbindinger, hvor forholdet mellem phospholipid-komponenten (I) og phospholipidkomponenten (II) er 10:90 til 50:50 mol%, c) en forbindelse eller en blanding af forbindelser med 20 farmakologisk virkning og eventuelt d) et lipid valgt blandt phosphatidylcholin, phosphatidyl-serin, phosphatidylinositol, phosphatidylglycerol, cardio-lipin og cholesterol og dets derivater, og en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH 25 7,0-7,8 og eventuelt farmaceutisk acceptable tilsætnings- DK 165314B stoffer.

2. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af 5 a) et phospholipid med formlen I, hvor m er to, Ri og R2 er defineret som i krav 1, X er Ci_4-alkylen eller C2-4-alkenylen, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, b) et phospholipid med formlen II, hvor R3 og R4 uafhængigt af hinanden er ligekædet Cio-20~alkanoyl eller 10 c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser med farmakologisk virkning, og en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH 7.2- 7,4.

3. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af a) et phospholipid med formlen I, hvor m er to, Ri og R2 er defineret som i krav 1, X er C2-4~alkylen eller C2-4-alkenylen, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, 20 b) et phospholipid med formlen II, hvor R3 og R4 uafhængigt af hinanden er ligekædet ci0-20“alkan°Yl eller c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser valgt blandt antiphlogistika og/eller anti-inflammato-25 riske midler, antibiotika, antileishmania, antineoplastika og immunmodulatorer og en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH 7.2- 7,4. 1 2 Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet 30 ved, at det består af 2 a) et phospholipid med formlen I, hvor m er to, Ri og R2 uafhængigt af hinanden er ligekædet alkanoyl eller alkenoyl med et lige antal, fra 10 til 20, carbonatomer, X er C2-4-alkylen eller C2-4~alkenylen, eller et farmaceu-35 tisk acceptabelt salt deraf, DK 165314 B b) et phospholipid med formlen II, hvor R3 og R4 er lige-kædet 0^0-20-611^110^ med et iige antal, fra 10 til 20, carbonatomer, 5 c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser valgt blandt antiphlogistika og/eller anti-inflammato-riske midler og immunmodulatorer, og en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH 7.2- 7,4.

5. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af a) et phospholipid med formlen I, hvor m er to, R^ og R2 uafhængigt af hinanden er 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetra-decenoyl, 9-cis-hexadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 15 9-trans- eller ll-cis-octadecenoyl eller 9-cis-icosenoyl, og X er 1,2-ethylen, 1,3-propylen eller vinylen, eller et farmaceutisk acceptabelt salt deraf, b) et phospholipid med formlen II, hvor R3 og R4 uafhængigt af hinanden er 9-cis-dodecenoyl, 9-cis-tetra- 20 decenoyl, 9-cis-hexadecenoyl, 6-cis-, 6-trans-, 9-cis-, 9-trans- eller ll-cis-octadecenoyl eller 9-cis-icosenoyl, c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser valgt blandt antiphlogistika og/eller anti-inflammato-riske midler, antibiotika, antineoplastika og immun- 25 modulatorer, og en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH 7.2- 7,4. 1 2 Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af 30 a) natrium- eller dinatrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octa-decenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinylamin eller natrium- eller dinatrium-N-[ l,2-di-(9-cis-octa-decenoyl )-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxyglutarylamin, b) l,2-di-(9-cis-octadecenoyl)-sn-glycero-3-phospho-35 ethanolamin, 2 c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser DK 165314 B valgt blandt antiphlogistika og/eller anti-inflammato-riske midler, antibiotika, antineoplastika og immunmodul atorer, og 5 en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH 7,2-7,4.

7. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1, kendetegnet ved, at det består af a) natrium- eller dinatrium-N-[ 1,2-di-(9-cis-octa-10 decenoyl)-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxysuccinylamin eller natrium- eller dinatrium-N-[ 1,2-di-(9-cis-octa-decenoyl )-sn-glycero-3-phosphoethanol ]-N-hydroxyglutarylamin, b) 1,2-di- (9-cis-octadecenoyl) -sn-glycero-3-phospho-ethanolamin, 15 c) en forbindelse eller en kombination af forbindelser valgt blandt diclofenac, pirprofen, mitomycin, cytarabin, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, etoposid, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxyphosphoryloxy) -20 ethylamid, N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-glutaminsyre- (CT-L-alanin-2-(1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-hydroxy-phosphoryloxy)-ethylamid-dinatriumsalt, N-acetyl-D- muramyl-L-alanyl-D-isoglutamin-natriumsalt, N-acetyl- desmethyl -muramyl -L-alanyl -D-isoglutamin-natriumsalt,

25 N- acetylmuramyl -L-alanyl -D-glut amin-ar-n-butyl ester, Na- (N-acetylmuramyl-L-alanyl-D-isoglutaminyl) -N7-s t earoy 1 -L - lysin, 6 -0- stearoyl -N- acetylmuramyl -L - alanin-D-isoglutamin og lymfokin, og en farmaceutisk acceptabel bæreopløsning pufret til pH 30 7,2-7,4. 1 2 3 4 5 6 Blandinger egnet til fremstilling af liposom- 2 dispersioner bestående af phospholipider med formlen I og 3 II og en forbindelse eller blanding af forbindelser med 4 farmakologiske egenskaber ifølge krav 1, hvor blandings- 5 35 forholdet mellem phospholipiderne med formlen I og II er 6 10:90 til 50:50 mol%. DK 165314 B

9. Fremgangsmåde til fremstilling af farmaceutiske præparater ifølge et af kravene 1-7, kendetegnet ved, at man 5 a) fremstiller en homogen blanding bestående af phospho-lipiderne med formlen I og II i forholdet 10:90 til 50:50 mol% og de nævnte yderligere lipider og en lipofil forbindelse eller blandinger af forbindelser med farmakologiske egenskaber og dispergerer den dannede homogene blanding i 10 vandig fasé, eller b) fremstiller en homogen blanding bestående af phospho-lipider med formlen I og II i forholdet 10:90 til 50:50 mol% og de nævnte yderligere lipider og dispergerer den dannede homogene blanding i vandig fase indeholdende en 15 vandopløselig forbindelse eller blanding af forbindelser med farmakologiske egenskaber og, om nødvendigt, indstiller den dannede vandige dispersion på pH 7,0-7,8 og, om ønsket, koncentrerer og/eller separerer de fremstillede liposomer. 1

10. Farmaceutisk præparat ifølge krav 1 til anvendelse ved behandling af menneskers eller dyrs legemer.