DE956953C

DE956953C - Process for the biological oxidation of steroids

Info

Publication number: DE956953C
Application number: DEF12795A
Authority: DE
Inventors: Dr Rudolf Junk; Dr Hildegard Kehl; Dr Fritz Lindner; Dr Adolf Mager; Dr Joachim Stauff
Original assignee: Hoechst AG
Current assignee: Hoechst AG
Priority date: 1953-09-08
Filing date: 1953-09-08
Publication date: 1957-01-24

Description

Verfahren zur biologischen Oxydation von Steroiden Durch die U S A. - Patentschriften 2 6o2 769, 2 649 400, 2 649 401 und 2 649 402 ist bekanntgeworden, daß eine ganze Reihe von Mikroorganismen die Oxydation von Steroiden, insbesondere in ii-Stellung, bewirken kann. Bei der Durchführung dieses Verfahrens wird so vorgegangen, daß die Mikroorganismen in den dafür üblichen Nährböden hauptsächlich unter submersen Bedingungen gezüchtet werden und daß nach Zugabe der Steroide eine weitere Inkubation unter aerdben Bedingungen erfolgt.Process for the biological oxidation of steroids by the U S A. - Patents 2 6o2 769, 2 649 400, 2 649 401 and 2 649 402 have become known, that quite a number of microorganisms cause the oxidation of steroids, in particular in the ii position, can cause. The procedure for carrying out this procedure is as follows: that the microorganisms mainly submerged in the usual nutrient media Conditions are grown and that after the addition of the steroids, a further incubation takes place under severe conditions.

Es ist auch unter anderem beschrieben, daß zur Züchtung Nährböden mit einem geringen Nährstoffgehalt benutzt werden können. Bei der Nacharbeitung zeigt sich jedoch, daß unter diesen Bedingungen nur geringe Ausbeuten erzielt werden.It is also described, among other things, that culture media are used for cultivation can be used with a low nutrient content. When reworking However, it is found that only low yields are achieved under these conditions.

Weiterhin wurde beschrieben, daß das gewachsene Mycel vom Nährboden abgetrennt und dann in Wasser oder in Salzlösungen suspendiert mit den Steroiden zur Reaktion gebracht wird. Auch in, diesem Fall sind die Ausbeuten unbefriedigend, obwohl Mycelmengen zur Anwendung kommen, die auf einer verhältnismäßig großen Menge eines guten Nährbodens gewachsen waren. Für den Umsatz von i g Steioid ist zur Erreichung guter Ausbeuten in allen beschriebenen Fällen mindestens 11 der Mikroorganismenkulturen notwendig, die -etwa 504 Zucker und 2 bis 5 °/o einer organischen Stickstoffquelle, wie beispielsweise Proteinhydrolysate oder Maisquellwasser, enthalten. Neben den hohen Kosten dieser Nährbodenbestandteile ergeben sich bei dieser Arbeitsweise Schwierigkeiten bei der Aufarbeitung und Reindarstellung der Endprodukte, die durch die verhältnismäßig großen Mengen von Mycel und die organischen Bestandteile der Kulturen bedingt sind. Es wurde nun ein Verfahren zur biologischen Oxydation von Steroiden durch Behandlung mit Kulturen von Rhizopus nigricans gefunden, die auf üblichen reichen Nährböden vorgezüchtet wurden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die Kulturen des Rhizopus nigricans vor dem Zusatz des zu oxydierenden Steroids. weitgehend mit einer wäßrigen Lösung, die außer geringen Mengen anorganischer Salze geringe Mengen Kohlenstoff- und Stickstoffverbindungen enthält, verdünnt werden und vorzugsweise die Zugabe des -- oxydierenden Steroids nach einer Bebrütungszeit ein-oder mehrfach wiederholt wird. Die vorgezüchtete Kultur kann bis zum etwa 40fachen, vorzugsweise bis zum etwa 20fachen ihres Volumens verdünnt werden. Zweckmäßig verwendet man Maisquellwasser, das etwa 500/, feste Bestandteile enthält, in der Verdünnung von i : ioo bis = : io ooo oder wäßrige Erde-oder Torfauszüge als Verdünnungsflüssigkeit.It has also been described that the mycelium that has grown is separated from the nutrient medium and then suspended in water or in saline solutions and made to react with the steroids. In this case too, the yields are unsatisfactory, although quantities of mycelium are used which were grown on a relatively large quantity of a good nutrient medium. For the conversion of Ig Steioid to achieve good yields in all the above cases, at least 1 1 of the microorganism cultures is necessary to -about 504 sugar and 2 to 5 ° / o of an organic nitrogen source such as protein hydrolysates or corn steep liquor, contained. In addition to the high costs of these nutrient components, this method of working results in difficulties in the processing and purification of the end products, which are caused by the relatively large amounts of mycelium and the organic components of the cultures. A method has now been found for the biological oxidation of steroids by treatment with cultures of Rhizopus nigricans which have been pre-grown on customary rich nutrient media, which is characterized in that the cultures of Rhizopus nigricans before the addition of the steroid to be oxidized. largely with an aqueous solution, in addition to small amounts of inorganic salts containing small amounts of carbon and nitrogen compounds, are diluted and, preferably, the addition of - oxidizing the steroid after incubation once or is repeated several times. The pre-grown culture can be diluted up to about 40 times, preferably up to about 20 times, its volume. It is expedient to use corn steep water which contains about 500 % solid constituents in a dilution of 1: 100 to =: 10,000 or aqueous soil or peat extracts as the diluting liquid.

Man erreicht dadurch optimale Ausbeuten an oxydierten Steroiden. Die Mycelmengen und organischen Inhaltsstoffe der Kulturen betragen hingegen nur einen Bruchteil der Mengen, die bei der bisher üblichen Arbeitsweise anfielen. Dadurch ergeben sich neben der Ersparnis an Nährstoffen ganz erhebliche Vorteile bei der Aufarbeitung und Reindarstellung der End-Produkte.This achieves optimal yields of oxidized steroids. the On the other hand, the amount of mycelium and organic constituents of the cultures is only one Fraction of the quantities that were incurred in the previously usual way of working. Through this In addition to the savings in nutrients, there are considerable advantages in the Processing and pure presentation of the end products.

Es kann die j e Volumeinheit der-Kulturlösung umzusetzende Steroidmenge im präparativen Maßstab erheblich über das bisher bekannte Maß hinaus- gesteigert werden, wenn nach einer gewissen Bebrütungszeit eine zweite oder eventuell mehrfache Nachgabe der Steroide erfolgt. Wie aus den Beispielen hervorgeht, können je Liter Kultur mindestens 2 g Steroide .umgesetzt werden, während die bisher bekanntgewordene Höchstmenge etwa i g betrug.The amount of steroid to be converted can be the unit volume of the culture solution on a preparative scale considerably increased beyond the previously known level if, after a certain incubation time, a second or possibly multiple Submission of the steroids takes place. As can be seen from the examples, per liter Culture at least 2 g of steroids. Converted, while the previously known Maximum amount was about i g.

Die Aufarbeitung der Fermentationsansätze erfolgte bisher durch getrennte Extraktion des Mycels und der Kulturflüssigkeit und erforderte einen großen apparativen Aufwand und Verbrauch an Lösungsmitteln. Es wurde gefunden, daß auch die Aufarbeitung bei dem neuen Verfahren sich erheblich vereinfachen und verbilligen läßt.The fermentation batches have so far been worked up separately Extraction of the mycelium and the culture fluid and required a large amount of equipment Effort and consumption of solvents. It was found that work-up with the new process can be considerably simplified and made cheaper.

Infolge des geringen Gehaltes an Fremdsubstanzen ist es nämlich möglich, die gesamten noch in der Lösung befindlichen Endprodukte an verhältnismäßig geringen Mengen an Adsorptionsmitteln, z. B. Tierkohle, zu adsorbieren. Die Mischungen aus Mycel und Adsorbens können in einfacher Weise abgetrennt und gegebenenfalls nach ihrer Trocknung in kontinuierlichen Extraktionsapparaten extrahiert werden, was eine ganz erhebliche Vereinfachung und Verbesserung der Wirtschaftlichkeit bedeutet. .Because of the low content of foreign substances, it is possible all of the end products still in the solution at relatively low levels Amounts of adsorbents, e.g. B. animal charcoal to adsorb. The mixes off Mycelium and adsorbent can be separated off in a simple manner and, if necessary, after their drying can be extracted in continuous extraction apparatus, what means a very considerable simplification and improvement in economic efficiency. .

Die als Stand der Technik in Betracht kommende USA.-Patentschrift 2 6o2 769, insbesondere Spalte 8, Zeile 68 bis 75, enthält keinen Hinweis, daß die Konzentrationen der Kulturflüssigkeit beliebig sein können. Es findet sich an der angegebenen Stelle lediglich ein Hinweis über die Konzentration des Steroids. Das erfindungsgemäß beanspruchte Verdünnen der Rhizopus-nigricans-Kulturen vor' dem Zusatz der Steroide mit einer wäßrigen Lösung der angegebenen Art wurde daher durch die genannte Literaturstelle weder vorweggenommen noch nahegelegt. Insbesondere enthält der Stand der Technik keine Angaben über die Verwendung von Maisquellwasser oder von wäßrigen Erde- oder Torfauszügen als Verdünnungsflüssigkeit, auch nichts über die günstige Wirkung einer wiederholten Zugabe des zu oxydierenden Steroids nach einer Bebrütungszeit. Beispiel i In einem Anzuchtkolben vön i l Inhalt werden Sporen, die aus drei Schrägagarröhrchen von Kulturen des Pilzes Rhizopus nigricans gewonnen worden sind, eingeimpft. Der Kolben enthält Zoo ccm eines Nährbodens, der im Liter 5o g Dextrose, 2o g Pepton und 5 g Maisquellwasser sowie ioo ccm einer Lösung enthält, die io g Ca(N 03)2, 5 g K Cl, io g K HZ P 04, 5 g Mg S 04 ' 7 H,0, i g Fe S 04 und 3 g Mn S 04 im Liter enthalten. Durch 24stündiges Schütteln auf einer Schüttelmaschine von Zoo Umdreh./Min. bei- 25° wird eine Submerskultur des Pilzes hergestellt.US Pat. No. 2,6o2,769 , in particular column 8, lines 68 to 75, which is considered to be prior art, does not contain any indication that the concentration of the culture fluid can be any. There is only an indication of the concentration of the steroid at the point indicated. The dilution of the Rhizopus nigricans cultures, which is claimed according to the invention, before the addition of the steroids with an aqueous solution of the specified type was therefore neither anticipated nor suggested by the cited reference. In particular, the prior art does not contain any information on the use of corn steep water or of aqueous soil or peat extracts as a diluting liquid, nor on the beneficial effect of repeated addition of the steroid to be oxidized after an incubation period. EXAMPLE 1 Spores which have been obtained from three inclined agar tubes from cultures of the fungus Rhizopus nigricans are inoculated into a cultivation flask of the contents. The flask contains zoo ccm of a nutrient medium which contains 50 g dextrose, 20 g peptone and 5 g corn steep water per liter as well as 100 ccm of a solution containing 10 g Ca (N 03) 2.5 g K Cl, 10 g K HZ P 04 , 5 g Mg S 04 '7 H, 0, ig Fe S 04 and 3 g Mn S 04 contained in the liter. By shaking for 24 hours on a shaking machine from Zoo rev / min. at -25 ° a submerged culture of the fungus is produced.

Diese Kultur wird in einen mit Rührer und Lufteinleitungsrohr versehenen Fermentierungskolben von 6 1 Inhalt gegeben. Der Kolben enthält'3,8 1 Wasser, in dem 6 g Kahumdihydrogenphosphat und 6 g Maisquellwasser gelöst sind. Kolben und Inhalt werden vor der Zugabe der Kultur sterilisiert. Dann wird durch ein am Kolben fest angebrachtes Bakterienfilter mit Entkeimungsschicht eine Lösung von 3,5 g Progesteron, gelöst in 50 ccm Aceton, zugegeben. Die Oxydation wird bei 28° unter Rühren (etwa Zoo Umdr./Min.) undEinleitenvonLuft (etwa ioo 1/Std.) 4o bis 48 Stunden durchgeführt.This culture is placed in a fermentation flask with a capacity of 6 liters which is provided with a stirrer and an air inlet tube. The flask contains 3.8 l of water in which 6 g of potassium dihydrogen phosphate and 6 g of corn steep liquor are dissolved. The flask and contents are sterilized before the culture is added. A solution of 3.5 g of progesterone, dissolved in 50 cc of acetone, is then added through a bacterial filter with a germicidal layer that is firmly attached to the flask. The oxidation is carried out at 28 ° with stirring (about zoo revolutions per minute) and the introduction of air (about 100 1 / hour) for 40 to 48 hours.

Zur Aufarbeitung wird der gesamte Kolbeninhalt durch ein Filter gesaugt. Das abgetrennte Mycel wird zunächst dreimal mit j e 8o ccm Aceton und danach sechsmal mit je 8o ccm Methylenchlorid unter heftigem Rühren extrahiert. Der Acetonextrakt wird gesondert abgedampft und die zurückbleibende wäßrige Suspension mehrmals mit Methylenchlorid ausgeschüttelt.For work-up, the entire contents of the flask are sucked through a filter. The separated mycelium is first washed three times with every 80 cc of acetone and then six times extracted with 80 ccm of methylene chloride each time with vigorous stirring. The acetone extract is evaporated separately and the remaining aqueous suspension several times with Shaken out methylene chloride.

Das Filtrat wird sechsmal mit je ioo ccm Methylenchlorid ausgeschüttelt. Alle Methylenchloridextrakte werden vereinigt und mit 1/3 gesättigter Natriumbicarbonatlösung und danach mit destilliertem Wasser gewaschen. Nach Trocknen mit geglühtem Natriumsulfat wird filtriert und das Filtrat im Vakuum eingedampft. Es verbleibt. ein Rückstand, der völlig durchkristallisiert ist.The filtrate is extracted six times with 100 ccm of methylene chloride each time. All methylene chloride extracts are combined and washed with 1/3 saturated sodium bicarbonate solution and then washed with distilled water. After drying with calcined sodium sulfate is filtered and the filtrate evaporated in vacuo. It remains. a residue, which is completely crystallized.

Nach Waschen des kristallinen Rückstandes mit einem kalten Gemisch aus 3 Teilen Petroläther und i Teil Äthylacetat werden Kristalle von ii-a-Oxyprogesteron erhalten, die bei 164 bis i66° (unkorrigiert) schmelzen und eine Drehung [a]-'0 = 176 bis i80° besitzen. Die Ausbeute beträgt 8o bis 85 °/p des eingesetzten Progesterons.After washing the crystalline residue with a cold mixture from 3 parts of petroleum ether and 1 part of ethyl acetate are crystals of ii-a-oxyprogesterone which melt at 164 to 166 ° (uncorrected) and a rotation [a] - '0 = 176 to i80 °. The yield is 80 to 85 ° / p of the progesterone used.

Beispiel e Der im Beispiel i beschriebene Fermentierungskolben wird mit 41 .eines stark verdünnten Torfauszuges beschickt, und 6 g Kaliumdihydrogenphosphat werden zugegeben. Nach Sterilisieren wird eine 24-Stunden-Kultur des Pilzes Rhizopus.nigricans wie im Beispiel i zugegeben. Es werden danach 3,6g Progesteron in.5o ccm Aceton gelöst und durch das Bakterienfilter in den Kolben filtriert. Zum Nachwaschen werden 25 ccm Aceton in zwei Portionen zugegeben. Die Oxydation wird 40 Stunden bei 28° mit einer Luftgeschwindigkeit von ioo bis i20 1/Std. durchgeführt.Example e The fermentation flask described in Example i is charged with 41% of a very dilute peat extract, and 6 g of potassium dihydrogen phosphate are added. After sterilization, a 24-hour culture of the fungus Rhizopus.nigricans is added as in example i. Then 3.6 g of progesterone are dissolved in 50 cc of acetone and filtered through the bacterial filter into the flask. For rewashing, 25 cc of acetone are added in two portions. The oxidation is carried out for 40 hours at 28 ° with an air speed of 100 to 120 liters / hour. carried out.

Die Aufarbeitung erfolgt in gleicher Weise wie im Beispiel i. Es werden 85°/o kristallisiertes ii-a-Oxyprogesteron mit einem Schmelzpunkt von 162, bis i65° und einer Drehung von [a] ö = i75° erhalten. Beispiel 3 Wie im Beispiel i wird ein Fermentierungskolben mit 3,8 1 Wasser, 6 g Kaliumdihydrogenphosphat und 6 g Maisquellwasser sterilisiert. In gleicher Weise wird der Kolben mit einer 24 Stunden alten Kultur des Pilzes Rhizopus nigricans beschickt. Es werden 3,5 g Progesteron, in Aceton gelöst, zugegeben und 24 Stunden mit ioo 1/Std. Luft bei 28° und Zoo Umdr./Min. gerührt. Danach werden nochmals 3,5 g Progesteron in 50 ccm Aceton zugegeben; die Fermentierung wird weitere 40 Stunden unter den gleichen Bedingungen fortgeführt.Working up is carried out in the same way as in example i. 85% crystallized ii-a-oxyprogesterone with a melting point of 162 to 165 ° and a rotation of [a] δ = 175 ° are obtained. Example 3 As in Example i, a fermentation flask is sterilized with 3.8 l of water, 6 g of potassium dihydrogen phosphate and 6 g of corn steep water. In the same way, the flask is charged with a 24 hour old culture of the fungus Rhizopus nigricans. There are 3.5 g of progesterone, dissolved in acetone, added and 24 hours at 100 1 / hour. Air at 28 ° and zoo rev / min. touched. Then another 3.5 g of progesterone in 50 cc of acetone are added; fermentation is continued for a further 40 hours under the same conditions.

Nach Zugabe von 50 g Aktivkohle in den Kolben wird 2 Stunden weitergerührt. Der Inhalt des Kolbens wird durch eine Glasfilternutsche abgesaugt. Der Filterrückstand wird nun mit vier Portionen zu je 8o ccm Aceton verrührt und jedesmal abgesaugt. Der trockene Rückstand wird hiernach in einem Soxhlet-Extraktionsapparat 3o bis 35 Stunden mit Methylenchloridextrahiert. Die Acetonfiltrate werden im Vakuum eingeengt; die zurückbleibende wäßrige Suspension wird viermal mit je 50 ccm Methylenchlorid ausgeschüttelt. Die Methylenchloridextrakte werden vereinigt, mit Natriumbicarbonat und Wasser, wir im Beispiel i angeführt, gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum zur Trockne eingedampft.After adding 50 g of activated charcoal to the flask, stirring is continued for 2 hours. The contents of the flask are sucked off through a glass suction filter. The filter residue is now mixed with four portions of 80 ccm of acetone each time and suctioned off each time. The dry residue is then extracted with methylene chloride in a Soxhlet extraction apparatus for 30 to 35 hours. The acetone filtrates are concentrated in vacuo; the remaining aqueous suspension is extracted four times with 50 cc of methylene chloride each time. The methylene chloride extracts are combined, washed with sodium bicarbonate and water, as mentioned in Example i, dried with sodium sulfate and evaporated to dryness in vacuo.

Die mit Petroläther-Äthylacetat-Gemisch gewaschenen Kristalle erwiesen sich als ii-a-Oxyprogesteron mit einem Schmelzpunkt von 162 bis i64° und einer Drehung von [a] ö = i75°. Die Ausbeute beträgt 8o °/o des eingesetzten Progesterons. Beispiel 4 In einen Anzuchtkolben von i 1 Inhalt werden Sporen, die aus drei Schrägagarröhrchen von Kulturen des Pilzes Rhizopus nigricans gewonnen worden sind, eingeimpft. Der Kolben enthält Zoo ccm eines Nährbodens, der im Liter 50 g Dextrose, 2o. g Pepton und 5 g Maisquellwasser enthält. Außerdem werden 14 ccm einer Lösung zugesetzt, die 5 g KCl, io g KH,PO4, 59 MgSO4. 7 H20, i g Fe S 04 und 3 g Mn S 04 im Liter enthält. Durch 24stündiges Schütteln auf einer Schüttelmaschine von Zoo Umdr./Min. bei 25° wird eine Submerskultur des Pilzes hergestellt.The crystals washed with a mixture of petroleum ether and ethyl acetate were found to be ii-a-oxyprogesterone with a melting point of 162 to 164 ° and a rotation of [a] δ = 175 °. The yield is 80% of the progesterone used. EXAMPLE 4 Spores which have been obtained from three inclined agar tubes from cultures of the fungus Rhizopus nigricans are inoculated into a cultivation flask with a volume of i 1. The flask contains zoo cc of a nutrient medium which contains 50 g of dextrose, 2o per liter. Contains g peptone and 5 g corn steep liquor. In addition, 14 cc of a solution containing 5 g of KCl, 10 g of KH, PO4, 59 MgSO4. Contains 7 H20, ig Fe S 04 and 3 g Mn S 04 per liter. By shaking for 24 hours on a shaking machine from Zoo revs / min. a submerged culture of the fungus is produced at 25 °.

Diese Kultur wird in einen wie im Beispiel i beschriebenen Fermentierungskolben gegeben. Der Kolben enthält 3,8 1 Leitungswasser, in dem 6 g Kaliumdihydrogenphosphat und 6 g Maisquellwasser gelöst sind. Man gibt o,8 g 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 2o-dion (Reichsteins Verbindung S), die in ioo ccm Aceton gelöst ist, zu und bebrütet bei 28° 24 Stunden.This culture is placed in a fermentation flask as described in example i given. The flask contains 3.8 l of tap water in which 6 g of potassium dihydrogen phosphate and 6 g corn steep liquor are dissolved. 0.8 g of 4-pregnene-17a, 2i-diol-3, 2o-dione are added (Reichstein's compound S), which is dissolved in 100 cc of acetone, and incubates with 28 ° 24 hours.

Die Aufarbeitung erfolgt wie im Beispiel i. In einer Probe wurden 52 °/o Oxydationsprodukt gemessen. Nach dem Eiengen der Hauptlösung kristallisiert 4-Pregnen-6ß, 17 a, 2i-triol-3, 2o-dion aus; F.=230°; [a] D = 6o,5° (Äthanol).The work-up is carried out as in Example i. Were in a rehearsal 52% oxidation product measured. After taking the main solution, it crystallizes 4-pregnen-6β, 17 a, 2i-triol-3, 2o-dione from; M.p. = 230 °; [a] D = 60.5 ° (ethanol).

Claims

PATENT CLAIMS: i. Process for the biological oxidation of steroids by treatment with cultures of Rhizopus nigricans on usual rich media were pre-bred, characterized in that the cultures of Rhizopus nigricans before adding the steroid to be oxidized largely with an aqueous solution, the small amounts of carbon and nitrogen compounds in addition to small amounts of inorganic salts contains, are diluted and preferably the addition of the steroid to be oxidized is repeated one or more times after an incubation period.

2. Procedure according to Claim i, characterized in that the pre-grown culture up to about 40 times, preferably up to about 20 times their volume.

3. Procedure according to claim 1 and 2, characterized in that corn steep water, which is about Contains 50% solids, diluted from i: ioo to i: io ooo or aqueous earth or peat extracts used as a diluting liquid.