DE951444C

DE951444C - Process for the preparation of 4-pregnen-8, 17ª ‡, 21-triol-3, 20-dione

Info

Publication number: DE951444C
Application number: DEU1745A
Authority: DE
Inventors: Herbert Charles Murray; Durey Harold Peterson
Original assignee: Upjohn Co
Current assignee: Pharmacia and Upjohn Co
Priority date: 1952-02-23
Filing date: 1952-07-09
Publication date: 1956-10-31

Description

Verfahren zur Herstellung von 4-Pregnen-8,17a, 21-triol-3, 20-dion Zusatz zum Patent 936 207 Gegenstand des Hauptpatents 936 2o7 ist ein Verfahren zur Herstellung von oxydierten Steroiden, nach welchem man Steroide mit einem -oxydierend wirkenden Stamm einer Pilzart der Ordnung Mucorales oder mit den aus derartigen Pilzen erhältlichen oxydierend wirkenden Enzymen behandelt und gegebenenfalls die erhaltenen oxydierten Steroide in bekannter Weise, z. B. durch Extraktion, abtrennt. Auf diese Weise können mit einfachen Mitteln Steroide in hoher Ausbeute in die entsprechenden oxydierten, Steroide umgewandelt werden, die als Heilmittel bekanntgeworden sind. Außerdem können durch das Verfahren nach dem Hauptpatent neue Verbindungen hergestellt werden, welche bisher durch kein anderes Verfahren zugänglich waren.Process for the preparation of 4-pregnen-8,17a, 21-triol-3, 20-dione Addition to patent 936 207 The main subject of patent 936 2o7 is a process for the production of oxidized steroids, after which one steroids with an -oxidierend acting strain of a species of fungus of the order Mucorales or with those from such Oxidizing enzymes obtainable and optionally treated with fungi obtained oxidized steroids in a known manner, e.g. B. by extraction, separated. In this way, steroids can be converted into the corresponding steroids in high yield with simple means oxidized, converted to steroids which have come to be known as remedies. In addition, the process according to the main patent can be used to produce new connections which were previously not accessible by any other method.

Die Erfindung bezieht sich auf eine bevorzugte Ausführungsform des Verfahrens nach dem Hauptpatent, und das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß das 4-Pregnen-8, 17a, 2r-triol-3, 2o-dion durch Behandlung des 4-Pregnen-=7a, 2x-diol-3, 2o-dions oder von dessen Acylaten mit einer Kultur einer: Pilzart der Gattung Helicostylum oder mit aus dieser erhältlichen oxydierenden Enzymen hergestellt und das erhaltene 4-Pregnen-8, 17a, 2=-triol-3, 2o-dion aus dem Reaktionsgemisch abgetrennt wird. Das neue 4-Pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion zeigt eine gute pharmakologische Wirkung vor allem als lokales Anästhetikum. Es ist außerdem für Synthesen verwendbar: Zur Herstellung des 4-Pregnen-8, 17 a, 21-triol-3, 2o-dions aus 4-Pregnen-i7a, 21-diol-3, 2o-dion oder dessen 2i-Acylaten, z. B. den 2i-Acetaten, haben sich gewisse Spezies der Gattung Helicostylum, z. B. Helicostylum piriforme, als besonders geeignet erwiesen.The invention relates to a preferred embodiment of the method according to the main patent, and the method according to the invention consists in that the 4-pregnen-8, 17a, 2r-triol-3, 2o-dione by treating the 4-pregnen- = 7a, 2x-diol-3, 2o-dione or its acylates with a culture of a: Fungal species of the genus Helicostylum or with oxidizing enzymes obtainable therefrom and the 4-pregnen-8, 17a, 2 = -triol-3, 2o- dione is separated from the reaction mixture. The new 4-pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 2o-dione shows a good pharmacological effect, especially as a local anesthetic. It can also be used for syntheses: For the preparation of 4-pregnen-8, 17 a, 21-triol-3, 2o-dione from 4-pregnen-i7a, 21-diol-3, 2o-dione or its 2i-acylates, z. B. the 2i-acetates, certain species of the genus Helicostylum, z. B. Helicostylum piriforme, proven to be particularly suitable.

Es ist zwar schon versucht worden, Steroide unter Zuhilfenahme von Nebennierenrindenhomogenaten bzw. im Wege der Perfusion enzymatisch zu oxydieren, jedoch verläuft dabei die Oxydation in anderer Richtung als bei dem erfindungsgemäßen Verfahren. Dieses 'besitzt aber auch noch den Vorteil, daß die verwendeten enzymliefernden bzw. -haltigen Rohstoffe im Gegensatz zu den nur als Schlachthausabfall in sehr begrenzten Mengen zur Verfügung stehenden Nebennieren industriell herstellbar sind. Das erfindungsgemäße Verfahren kann daher auch in großem Maßstab durchgeführt werden.Although attempts have already been made to use steroids with the aid of To oxidize adrenal cortex homogenates or enzymatically by means of perfusion, however, the oxidation proceeds in a different direction than that of the invention Procedure. This' also has the advantage that the enzyme-supplying used or -containing raw materials in contrast to the only as slaughterhouse waste in a lot limited quantities of available adrenal glands are industrially producible. The process according to the invention can therefore also be carried out on a large scale.

Nach dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise das Steroid mit einem lebensfähigen Pilz unter den Fermentationsbedingungen in Gegenwart einer für den Pilz geeigneten Nährflüssigkeit behandelt, wie in dem folgenden Beispiel näher ausgeführt wird. Beispiel Herstellung von 4-Pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 2o-dion Aus 2o g Laktalbuminauszug (bekannt unter der Handelsbezeichnung »Edamincc), 3 g Maisquellwasser und 50 g technischer Dextrose wurde ein Nährboden hergestellt, mit Leitungswasser auf 1 l verdünnt und auf einen pH-Wert von 4,3 bis 4,5 eingestellt. 121 dieses sterilisierten Nährbodens wurden mit Sporen von Helicostylum piriforme beimpft und 24 Stunden bei einer Temperatur von 28° und einer solchen Belüftung und unter Rühren bebrütet, daß die Sauerstoffaufnahme nach dem von Cooper, Fernstrom und Miller (Ind. Eng. Chem., Bd. 36, 1944, S. 504) beschriebenen Verfahren 6,3 bis 7 Millimol je Stunde und Liter Na2S03 betrug. In diesem Nährboden, der eine 24 Stunden alte Kultur von Helicostylum piriforme enthielt, wurden 2 g 4-Pregnen-17a, 2i-di-01-3, 2o-dion, welches in ioo ccm Äthanol gelöst war, suspendiert. Nach weiterer 24stündiger Bebrütung unter denselben Temperatur- und Belüftungsbedingungen wurden die Würze und das Myzel extrahiert. Das Myzel wurde abfiltriert, zweimal mit je einem seinem Volumen etwa gleichen Volumen Aceton gewaschen und zweimal mit j e einem seinem Volumen etwa gleichen Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die lösungsmittelhaltigen Azeton- und Methylenchloridextrakte wurden dem Würzefiltrat zugesetzt. Das 'Gemisch der Extrakte und des Würzefiltrates wurden erst zweimal j e mit einem ihrem halben Volumen entsprechenden Volumen Methylenchlorid, dann zweimal mit einem j e einem Viertel ihres Volumens entsprechenden Volumen Methylenchlörid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte wurden zweimal mit je einem einem Zehntel ihres Volumens entsprechenden Volumen einer 2°/oigen wässerigen Natriumbicarbonatlösung, dann zweimal mit je einem einem Zehntel ihres Volumens entsprechenden Volumen Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Methylenchloridauszüge mit etwa 3 bis 5 g wasserfreiem Natriumsulfat je Liter Lösungsmittel und nach der Filtration wurde das Lösungsmittel abdestilhert. Der Rückstand wurde in 500 ccm Methylenchlorid gelöst, filtriert und das Lösungsmittel dann verdampft. Die entstehenden Kristalle des Rohproduktes wurden getrocknet und fünfmal mit je 5 ccm Äther je g Rohprodukt gewaschen, wobei ein Rückstand von 5,354 g erhalten wurde. Der Rückstand wurde in io ccm Äthylendichlorid gelöst und über 350 g synthetisches- Magnesiumsilikat (bekannt unter der Handelsbezeichnung »Florisila) mit jeweils 550 ccm der in der Tabelle aufgeführten Lösungsmittel chromatographiert. Helicostylum piriforme Heraus- F%ion Lösungsmittel gg hoffe mg i Äthylendichlorid ..... . . . . ....... 479,5 2 Äthylendichlorid ..... « ........ 403,0 3 Äthylendichlorid zu Aceton 15 : 1 . . 815,5 4 Äthylendichlorid zu Aceton 15: 1 . . 36,5 5 Äthylendichlorid zu Aceton 12-: i . . 36,o 6 Äthylendichlorid zu Aceton i2 : 1 . . 50,0 7 Äthylendichlorid zu Aceton i2 : 1 . . 109,5 8 Äthylendichlorid zu Aceton io : 1 . . 159,0 9 Äthylendichlorid zu Aceton io : i . . 148,o io Äthylendichlorid zu Aceton 8 : 1 . . 145,o ii Äthylendichlorid zu Aceton 8 : 1 . . 1o4,5 i2 Äthylendichlorid zu Aceton 8 : 1 . . 98,o 13 Äthylendichlorid zu Aceton 5 : 1 . . 170,0 14 Äthylendichlorid zu Aceton 5 : 1 . . 123,0 15 Äthylendichlorid zu Aceton 5 : 1 . . 123,5 16 Äthylendichlorid zu Aceton 3 : 1 . . 127,5 17 Äthylendichlorid zu Aceton 3 : 1 . . 2oo,o 18 Äthylendichlorid zu Aceton i : i . . 456,o ig Äthylendichlorid zu Aceton 1: i . . 356;o 2o Aceton ........................ 226,5 Die herausgelösten Fraktionen 18 und i9 wurden vom Lösungsmittel befreit und zweimal mit je 5 ccm Methanol und Aceton (i: i) gewaschen, wobei ein Rückstand von 63 mg erhalten wurde. Zweimaliges Umkristallisieren aus j e 3 ccm Methanol ergab Kristalle des 4-Pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 2o-dions, F.= 248 bis 252°; [a] D = + 107' (c = 0,946 in Dioxan). Die Mutterlaugen der Fraktionen 18 und ig wurden mit den Fraktionen 17 und 2o vereinigt und über synthetisches Magnesiumsilikat (»Florisilu) erneut chromatographiert, wobei weitere 114,3 mg dieser Verbindung erhalten wurden.According to the method according to the invention, the steroid is preferably treated with a viable fungus under the fermentation conditions in the presence of a nutrient liquid suitable for the fungus, as will be explained in more detail in the following example. Example Production of 4-pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 2o-dione A culture medium was made from 20 g of lactalbumin extract (known under the trade name "Edamincc"), 3 g of corn steep liquor and 50 g of technical dextrose, with tap water to 1 l diluted and adjusted to a pH of 4.3 to 4.5. 121 of this sterilized nutrient medium were inoculated with spores of Helicostylum piriforme and incubated for 24 hours at a temperature of 28 ° and such aeration and with stirring that the oxygen uptake according to the method described by Cooper, Fernstrom and Miller (Ind. Eng. Chem., Vol. 36, 1944, p. 504) was 6.3 to 7 millimoles per hour and liter of Na2S03. In this nutrient medium, which contained a 24 hour old culture of Helicostylum piriforme, 2 g of 4-pregnen-17a, 2i-di-01-3, 2o-dione, which had been dissolved in 100 cc of ethanol, were suspended. After incubating for a further 24 hours under the same temperature and ventilation conditions, the wort and the mycelium were extracted. The mycelium was filtered off, washed twice with a volume of approximately equal volume of acetone each time and extracted twice with a volume of methylene chloride each time approximately equal to its volume. The solvent-containing acetone and methylene chloride extracts were added to the wort filtrate. The 'mixture of the extracts and the wort filtrate were extracted twice with a volume of methylene chloride corresponding to half its volume, then twice with a volume of methylene chloride corresponding to a quarter of its volume. The combined methylene chloride extracts were washed twice with a volume corresponding to one tenth of their volume of a 2% aqueous sodium bicarbonate solution, then twice with a volume of water corresponding to one tenth of their volume. After drying the methylene chloride extracts with about 3 to 5 g of anhydrous sodium sulfate per liter of solvent and after filtration, the solvent was removed by distillation. The residue was dissolved in 500 cc of methylene chloride, filtered and the solvent then evaporated. The resulting crystals of the crude product were dried and washed five times with 5 cc of ether per g of crude product, a residue of 5.354 g being obtained. The residue was dissolved in 10 cc of ethylene dichloride and chromatographed over 350 g of synthetic magnesium silicate (known under the trade name "Florisila) with 550 cc each of the solvents listed in the table. Helicostylum piriforme Out- F% ion solvent gg hope mg i ethylene dichloride ...... . . . ....... 479.5 2 ethylene dichloride ..... «........ 403.0 3 ethylene dichloride to acetone 15: 1. . 815.5 4 ethylene dichloride to acetone 15: 1. . 36.5 5 ethylene dichloride to acetone 12-: i. . 36, o 6 ethylene dichloride to acetone i2: 1. . 50.0 7 ethylene dichloride to acetone i2: 1. . 109.5 8 Ethylene dichloride to acetone io: 1. . 159.0 9 ethylene dichloride to acetone io: i. . 148, o io ethylene dichloride to acetone 8: 1. . 145, o ii Ethylene dichloride to acetone 8: 1. . 1o4.5 i2 ethylene dichloride to acetone 8: 1. . 98, o 13 Ethylene dichloride to acetone 5: 1. . 170.0 14 ethylene dichloride to acetone 5: 1. . 123.0 15 ethylene dichloride to acetone 5: 1. . 123.5 16 ethylene dichloride to acetone 3: 1. . 127.5 17 ethylene dichloride to acetone 3: 1. . 2oo, o 18 ethylene dichloride to acetone i: i. . 456, o ig ethylene dichloride to acetone 1: i. . 356; o 2o acetone ........................ 226.5 The leached fractions 18 and 19 were freed from the solvent and washed twice with 5 cc of methanol and acetone (i: i) each time, a residue of 63 mg being obtained. Recrystallization twice from 3 cc of methanol each time gave crystals of 4-pregnen-8, 17a, 2i-triol-3, 2o-dione, m.p. = 248 to 252 °; [a] D = + 107 '(c = 0.946 in dioxane). The mother liquors of fractions 18 and ig were combined with fractions 17 and 20 and chromatographed again over synthetic magnesium silicate (»Florisilu), a further 114.3 mg of this compound being obtained.

Analyse für C21 H3p 0s : Berechnet ..... C = 69,580/a, H = 8,34°/o; gefunden ...... C = 69,46 °/o, H = 8,46 °/o. Die Verwendung anderer Helicostylumaxten und bzw. oder von 2i-Acylaten, z. B. dem zi-Acetat des 4-Pregnen-i7a, 2i-diol-3, 2o-dions, führte zu dem gleichen Ergebnis.Analysis for C21 H3p 0s: Calculated ..... C = 69.580 / a, H = 8.34 ° / o; found ...... C = 69.46 ° / o, H = 8.46 ° / o. The use of other Helicostylumaxten and / or of 2i-acylates, z. B. the zi-acetate of 4-pregnen-i7a, 2i-diol-3, 2o-dione, led to the same result.

Claims

PATENT CLAIM: Process for the production of 4-pregnen-8; i7a, 2i-triol-3, 2o-dione by treating steroids not oxidized in the ii-position with oxidizing fungi of the order Mucorales or with oxidizing enzymes obtainable from such fungi and optionally separating the oxidized steroids obtained, in particular by extraction Patent 936,207, characterized in that DAB is piriforme for the oxidation of 4-pregnene-I7a, 2i-dio13, 2o-dione or its acylates a culture of a species of fungus of the genus Helicostylum, particularly Helicostylum, or the oxidizing of these commercially available enzymes used, the the extracted oxidation product freed from the extractant is absorbed by chromatography in a manner known per se, eluted with solvents of increasing polarity and the eluates obtained with ethylene dichloride to give acetone = i: i are separated off.