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Verfahren zur Gewinnung von jodhaltigen Aminosäuren Es ist bekannt,
daß man durch jodieriuig von Eiweiß unter Sättigung mit Jod und nachfolgender alkalischer
Hydrolyse vermittels Isolierungsmethoden Dijodtyrosin gewinnen kann. Es ist ferner
bekannt, daß. man durch jodierung von Eiweiß, bei schwach alkalischer Reaktion und
mäßig erhöhter Temperatur schilddrüsenwirksame Substanz und bei unvollständiger
Jodierung Thyroxin erhalten kann (Patent 659 497) Es wurde nun gefunden, daß: man
zu neuen jodhaltigen Aminosäuren gelangen kann, wenn man das durch unvollständige
Jodierung von Eiweiß und .alkalische Hydrolyse der hierbei entstandenen Jodproteine
erhaltene Gemisch von jodierten Ammosäuren nach Entfernung eines .etwa, vorhandenen
säureunlöslichen Anteils mit für die Isolierung von Aminosäuren an sich bekannten
Reagentien behandelt.
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Als für das Verfahren geeignetes Ausgangsmaterial hat sich ein alkalisches
Hydrolysat von solchen Jodproteinen erwiesen, welche man erhält, wenn man Eiweiß,
mit einer Jodmenge jodiert, die unterhalb der zur vollständigen jodierung des Proteins
erforderlichen Jodmenge liegt. Z. B. kann die Gewinnung des Jodproteins nach dem
Verfahren des Patents 659 497 oder einem anderen die Herstellung eines unvollständig
jodierten Eiweißkörpers kennzeichnenden Verfahren erfolgen. Je nach der angewandten
Jodmenge wird hierbei der im Eiweiß, eingebaute Tyrosinrest zu einem größeren oder
geringeren Anteil nur zur Monostufe jodiert. Zum Teil wird
er zum
Dijodtyrosinrest jodiert. Daneben entstehen noch andere jodierungsprodukte, da es
verfahrensmäßig gelang, aus dem jodierten Protein nach erfolgter alkalischer Hydrolyse
ein Dijodthyronin zu isolieren.
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Die Isolierung der jodhaltigenAminosäuren kann nach beliebigen, die
Isolierung, von Aminosätiren kennzeichnenden Methoden erfolgen. Ensteht beim Ansäuern
der Hydrolyseprodukte ein Niederschlag wie im Fall des Verfahrens des Patents b59
497, so muß, dieser zunächst entfernt werden. Man kann nun z. B. so verfahren, daß,
man das Hydrolysat nach Entfernung der durch Zusatz von Säure entstandenen Produkte
mit Bleiacetat versetzt und das nach Entfernung des hierbei entstehenden Niederschlages
erhaltene Filtrat schwach ammonialkalisch macht. Der hierdurch entstehende Niederschlag
wird vom Metall befreit und die erzielte Lösung bis zur Isristahabscheidung eingedampft.
Die abgeschiedenen Massen können durch Uml.ösen gereinigt werden. Man kann das Gemisch
von jodierten A minosäuren auch vermittels Phosphorwolframsäure oder Silbersalzen
oder anderer die Isolierung von Aminosäuren kennzeichnender Maßnahmen trennen. Z.
B. hat sich die Fällung mit Phosphorwolframsäure für die Trennung des Monojodtyrosins
vom Dijodtyrosin .als sehr geeignet erwiesen. Ferner kann man auch die verschiedene
Löslichkeit von Aminosäuren in höheren Alkoholen, beispielsweise Butylalkohol, heranziehen.
Man kann ferner Verunreinigungen durch Adsorption entfernen. Vorgereinigte Lösungen
von Monojodtyrosin lassen sich nach der Methode der chromatographischen Adsorptionsanalyse
bis zur Iiristallisierbark.eit reinigen.
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Das gemäß. dem Verfahren der Erfindung erzielte Ergebnis ist völlig
neu und um so bemerkenswerter, als es z. B. nicht gelingt, durch unvollständige
Jodierung von Tyrosin Monojodtyrosin zu erhalten.
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Die erfindungsgemäß, erhältlichen jodhaltigen Aminosäuren sollen wegen
ihrer Fähigkeit, auf das den Stoffwechsel regelnde endoktrine System einzuwirken,
in der Therapie Verwendung finden. Beispiele i. i oo g Casein wurden nach Patent
b59497 mit Zog Jod jodiert, das 6,50,'o Jod enthaltende Jodcasein in Barytlauge
hydrolysiert und Eins dem Hydrolysat, wie dort beschrieben2 der thyroxinhaltige
Anteil durch Ansäuern auf pii 5 ausgefällt. Die vereinigten Filtrate von dieser
Fällung werden mit Bleiacetat im überschuß. versetzt, der entstandene Niederschlag
abgetrennt und verworfen, die Lösung mit Ammoniak schwach phenophth.alein.all:alisch
gemacht und der Niederschlag abgetrennt. Der Niederschlag wird mit Schwefelsäure
vom Blei, mit Bar-,1 von überschüssiger Schwefelsäure befreit, wobei das ausfallende
Bariumsulfat gefärbte Verunreinigungen mitreißt, und abermals in der gleichen Weise
mit Bleiacetat behandelt. Die so gewonnene blei- und schwefelsäurefreie Lösung wird
im Vakuum eingeengt, bis kristallinische Ausscheidung auftritt, die Ausscheidung
anteilweise abgetrennt und jeweils weiter eingeengt, bis keine kristallinische Ausscheidung
mehr zu erzielen ist. Aus den ersten. Anteilen kann man durch fraktionierte Kristallisation
aus 700,'o Alkohol Dijodtyrosin und Dijodthyronin neben Monojodtyrosin erhalten;
die letzten Anteile enthalten Monojodtyrosin. Die Mutterlauge enthält noch Monojodtyrosin,
das durch Ausschütteln mit Butylalkohol oder durch Chromatographie gewannen werden
kann. Ein Teil der Mutterlauge wird dazu auf einen Gehalt von 2n-Schwefelsäure gebracht,
mehrmals mit Butylalkohol ausgeschüttelt, der Butylalkohol mit verdünntem Barytwasser
mehrmals ausgeschüttelt, das Barium mit Schwefelsäure ausgefällt, die Lösung im
Vakuum eingedampft und der Rückstand aus 7 o °'o Alkohol umkristallisiert. Ein anderer
Teil der :Mutterlauge wird durch eine Säule von Frankonit hL bei schwach kongosaurer
Reaktion chromatographiert. Aus einer der farblosen Zonen kann nach Elution mit
verdünntem Ammoniak kristallisiertes Monojodtyrosin gewonnen werden. Ausbeuten:
Aus ioog Jodcasein: etwa i g Monojodtyrosi.n, 0,13-. Eijodtyrosin und o, i g Dijodthyronin.
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2. Monojodtyrosin aus in Ammoniak jodiertem Casein. i oo g Casein
werden in 5 1 Wasser mit 5ooccm 300oigem Ammoniak gelöst, in Eiswasser gekühlt und
unter Rühren i o g Jod allmählich hinzugefügt. Dann -,rird das Jodcasein durch Ansäuern
ausgefällt. abfiltriert, in i 1 Wasser durch Neutralisation mit Natronlauge aufgelöst
und gegen destilliertes Wasser bis zur Jodidfreiheit dialysiert. Dann wird in das
gleiche Volumen mit Eisessig angesäuerter Alkohol einbegossen, die Fällung abgesaugt,
mit Alkohol gewasch; n und im Vakuum getrocknet.
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ioo g dieses Jodcaseins werden mit @.0o,@igrr Barytlauge 2o Stunden
am Rückhuf., gekocht, von einen. Niederschlag abfiltriert, der nach abkühlen auskristallisierte
Baryt abgesaugt, das Filtrat mit Salzsäure angesäuert und von der auftretenden Flocl:ung
abfiltriert. Eas Filtrat wird nun in der gleichen Weise, wie in Beispiel i, mit
Bleiacetat behandelt und die blei- und schwefelsäurefreie Lösung des ersten Blei-Ammoni<tk-Niedersclila#es
ohncweitere Behandlung im Vakuum eingeengt.
Die Ausbeute beträgt
3,O g Rohprodukt mit i, i 5 g Jod. Das Rohprodukt wird in n-Schwefelsäure
;gelöst, mit iog Phosphorwolframsäure in zo%iger Lösung versetzt, aüfgekocht und
über Nacht stehengelassen. Die vor dem Aufkochen sehr fein verteilte Fällung hat
sich als roter kristallinischer Niederschlag abgesetzt. Er wird abgesaugt, in Aceton
gelöst, .die Phosphorwolframsäure mit überschuß: von Baryt gefällt, der überschüssige
Baryt mit Schwefelsäure entfernt und die Lösung im Vakuum eingedampft.
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Das Filtrat von der Phosphorwolframsäurefällung wird mit Baryt im
überschuß, von der überschüssigen Schwefelsäure und Phosphorivolframsäure mit Schwefelsäure
vom Baryt befreit und im Vakuum eingeengt.
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3. Monojodtyrosin aus Serumeiweiß, das in Natronlauge bei o° jodiert
worden war. .3q.09 Sertuneiweißi, das durch Acetonfällung entfettet worden ist,
wird bei o" in ¢ 1 Wasser mit 50 ccm 4. n-Natronlauge gelöst und Sog Jod
in Jod-Kali-Lösung langsam zugetropft. Um locker gebundenes Jod zu entfernen, wird
N.atritunbisulfit zugesetzt, mit Schwefelsäure angesäuert, durch Natronlauge wieder
in Lösung gebracht, mit Schwefelsäure ,ausgefällt und abgeschleudert. Der Niederschlag
wird in i 1 Wasser mit möglichst wenig Natronlauge aufgenommen, durch Dialyse von
Elektrolyten befreit, mit Aceton (z VOI.), gefällt und im Vakuum über Schwefelsäure
getrocknet. Ausbeute: 1719. Jodgehalt: 4"4%.' i oo g des Jodproteins werden in i
ooo ccm .loo,Qiger Barytlauge 2o Stunden am Rückfluß gekocht, vom \iederschlag abgesaugt,
gekühlt, von ausgeschiedenen Barytkrzstallen abgesaugt, mit Schwefelsäure schwach
kongosauer gemacht, das Bariumsulfat abgetrennt und die Lösung mit Bleiacetat im
überschuß, versetzt. Die entstandene orangefarbene Fällung, ein Bleisulfojodid enthaltend,
wird verworfen, das Filtrat davon mit Ammoniak schwach phenolphthaleinalkalisch
gemacht und die Fällung abgeschleudert. Die Fällung wird finit -Schwefelsäure im
hberschuß von Blei befreit, aus dem Filtrat mit Baryt die überschüssige Schwefelsäure
entfernt und das Filtrat vom Ba S 0i im Vakuum auf 25o ccrri eingeengt. Die eingeengte
Lösung wird mit Silbernitrat im überschuß versetzt, mit Ammoniak genau neutralisiert,
der Niederschlag mit verdünnter Salpetersäure zur Lösung der Silbersalze des Monojod-
und Dijodtyrosins aufgenommen, vom Silberjodid abgesaugt, .aus dem Filtrat durch
Neutralisieren mit Ammoniak die Silbersalze wieder ausgefällt, der Niederschlag
in Wasser suspendiert und mit Schwefelwass;erstoif zerlegt. Vom Silbersulfid wird
abfiltriert, das Filtrat mit Schwefelsäure stark kongosauer gemacht und die Lösung
viermal mzt Butylaikohol ausgeschüttelt. Der Butylextrakt wird dann viermal mit
Barytwasser ausgeschüttelt, das Barium mit Schwefelsäure. ausgefällt und das Filtrat
im Vakuum zur Sirupiz:onsistenz eingeengt. Der Sirup wird mit So ccm Wasser aufgenommen,
mit Schwefelsäure bis zur Normalität versetzt, 2o ccm- zo%ige Phosphorwolframlösung
zugesetzt und autgekocht. Nach Abkühlen hat sich ein rotbraunes Harz abgesetzt,
von dem die klare überstehende Lösung sauber abgegossen werden kann. Die klare Lösung
wird mit Baryt im Überschufa von Schwefel- und Phosphorwolframsäure, das Filtrat
von der Bariumfällung durch Schwefelsäure vom überschüssigen Barium befreit. Das
Filtrat von Bariumsulfat wird im Vakuum eingeengt, bis sich Kristalle abscheiden.
Augbeute: o,q.g, Analyse: 39,55°,1o Jod, ö,io;o Wasser (nach Fischer), berechnet
für Monojodtyrosin - mit i -Molekül Wasser (Cs Ijio 0s NJ # H@O) 3921 o,'o
Jod, 5.5°,'o Wasser.
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Das braune Harz wird in Aceton (werd.) gelöst, mit Baryt im überschuß,
die Phosphorwolframsäure ausgefällt, aus dem Filtrat mit Schwefelsäure das Barium
abgeschieden, die Lösung im Vakuum ,auf i o ccm eingeengt. Die zum 1`e,11 .aus.
braunen amorphen Massen, zum Teil aus hellen kristallinen Aggregaten bestehende
Ausscheidung wird mit Wasser ausgekocht. Nach Erkalten scheiden sich 0,399
kristalline Substanz aus, die nach zweimaligem Umkristallisieren in schönen wetzsteinförmigen
Kristallen anfällt und 56, i o'o Jod enthält: Dijodtyrosin.