DE69920943T2

DE69920943T2 - Verfahren zur herstellung von optisch aktiven 3-hydroxy-pyrrolidinderivaten durch enzymatische hydroxylierung

Info

Publication number: DE69920943T2
Application number: DE69920943T
Authority: DE
Inventors: Bernard Witholt; Zhi Li
Original assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Current assignee: Eidgenoessische Technische Hochschule Zurich ETHZ
Priority date: 1998-11-17
Filing date: 1999-11-15
Publication date: 2005-10-13
Anticipated expiration: 2019-11-16
Also published as: DE69920943D1; US20020106763A1; US20030219883A1; EP1131460B1; ATE278798T1; WO2000029606A1; AU1273000A; EP1002871A1; EP1131460A1; US7141412B2

Description

Gebiet der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Herstellen optisch aktiver 3-Hydroxypyrrolidinderivate, worin ein Sauerstoffatom stereoselektiv in entsprechende Pyrrolidine unter Verwendung von Biokatalysatoren eingeführt wird. Derartige optisch aktive 3-Hydroxypyrrolidinverbindungen sind als Zwischenprodukte nützlich zur Herstellung mehrerer pharmazeutischer Produkte und landwirtschaftlicher Chemikalien.
Beschreibung des Standes der Technik:
Optisch aktives 3-Hydroxypyrrolidin und N-substituiertes 3-Hydroxypyrrolidin sind nützliche Zwischenprodukte für die Synthese mehrerer Pharmazeutika, Agrochemikalien und dergleichen.
In der Praxis ist es oft vorteilhaft, falls nicht erforderlich, optisch aktives 3-Hydroxypyrrolidin in seiner N-geschützten Form zu verwenden.
Ein Verfahren zum Herstellen von (R)-3-Hydroxypyrrolidin, das die Decarboxylierung von (2S,4R)-4-Hydroxy-L-prolin umfasst, ist bekannt [JP 05/255204 (1993); JP 60/23328 (1985); Hashimoto, M., et al., Chem. Lett., 1986, 893; Mehler, Th., et al., Synthetic Commun. 1993, 23, 2691]. Jedoch ist das Ausgangsmaterial sehr teuer.
Es ist bekannt, dass (S)-3-Hydroxypyrrolidin und sein N-substituiertes Derivat aus L-Äpfelsäure kann durch ein Verfahren hergestellt werden, das die Reduktion von (S)-N-substituierten-3-Hydroxy-2,5-pyrrolidindion mit Lithiumaluminiumhydrid (Bhat, K.J., et al., Synth. Common. 1985, 15, 587], Natriumborhydrid-bortrifluorid-etherat [Chem. Ber. 1986, 119, 3327], Natriumaluminiumhydrid [JP 03/200762A2, 1991], Natrium-bis(2-methoxyethoxy)aluminiumhydrid [JP 01/254657A2, 1989] und Natriumborhydrid [ EP 692471 (1996)] umfasst. All diese Reduktionsmittel sind teuer und schwierig zu handhaben; die Schritte der Gewinnung des Produktes und des Vernichtens der Reagenzien nach der Reaktion sind kompliziert und kostenintensiv; und es findet etwas Racemisierung während der Reduktion statt.
(S)-3-Hydroxypyrrolidin und sein N-substituiertes Derivat können aus L-Glutaminsäure [Harris, B.D., et al., Synthetic Commun., 1986, 16, 1815] beziehungsweise L-Asparaginsäure [Shibata, T. et al., Heterocycles, 1986, 24, 1331] synthetisiert werden. Jedoch sind diese Verfahren nicht für eine Herstellung im großen Maßstab geeignet, da 6-Schritt-Synthesen in beiden Verfahren involviert sind, einschließlich eines teuren Reduktionsschrittes.
Optisch aktives 3-Hydroxypyrrolidin und sein N-substituiertes Derivat können durch Reduktion von optisch aktiven 4-Hydroxy-2-pyrrolidinonen [JP 01/207266 (1989); JP 01/45360 (1989)], Zyklisierung eines optisch aktiven 4-Halogen-3-hydroxybutanderivats [ EP 452143 (1991)] und Zyklisierung eines optisch aktiven 4-Halogen-3-hydroxybutylnitrilderivats [ EP 431521 (1991); JP 03/176463 (1991); EP 347818 (1989); EP 269258 (1988)] hergestellt werden. Neben anderen Nachteilen sind die optisch aktiven Ausgangsmaterialien nicht leicht erhältlich und viele Schritte werden für ihre Herstellung benötigt.
Verfahren zum Herstellen optisch aktiven 3-Hydroxypyrrolidins und seines N-substituierten Derivats durch klassische Spaltung sind bekannt [JP 05/279326 (1993); JP 05/279325 (1993); JP 05/32620 (1993); JP 04/13659 (1992); JP 04/164066 (1992); JP 61/63652 (1986)], aber die Ausbeute ist sehr gering.
Verfahren unter Verwendung einer enzymatischen Spaltung via Hydrolyse [WO 95/03421 (1995); US 5187094 (1993); JP 01/141600 (1989); Hasegawa, J., et al., Enantiomer, 1997, 2, 311; Tomori, H., et al., Bull. Chem. Soc. Jpn., 1996, 69, 207] und Veresterung [WO 95/03421 (1995); JP 05/227991 (1993); JP 04/131093 (1992); Horiguchi, A., et al., Biosci. Biotech. Biochem., 1995, 59, 1287] sind auch bekannt. Jedoch ist die Ausbeute geringer als 50% der maximal theoretischen Ausbeute der Spaltung; die Abtrennung des Produktes ist schwierig. Ein großer Nachteil für alle Spaltungsverfahren ist das Fehlen einer praktischen Synthese der racemischen Ausgangsmaterialien.
Optisch aktives N-substituiertes 3-Hydroxypyrrolidin kann durch Hydroborierung von N-substituiertem 3-Pyrrolidin mit Diisopinocampheylboran gefolgt von Oxidation mit alkalischem Wasserstoffperoxid hergestellt werden [Brown, H.C., et al., J. Am. Chem. Soc., 1986, 108, 2049; Brown, H.C., et al., J. Org. Chem, 1986, 51, 4296]. Dieses Verfahren ist jedoch für die industrielle Produktion wegen der Verwendung des speziellen Boranreagens nicht geeignet.
Es ist bekannt, dass die enzymatische Reduktion von N-Benzyl-3-pyrrolidinon optisch aktives N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin erfordert [JP 06/141876 (1994); WO 98/23768 (1998)], aber das Fehlen einer praktischen Synthese der Ausgangsmaterials bleibt einer der Nachteile dieses Verfahrens.
Ein direkteres und ökonomischeres Verfahren zum Herstellen von optisch aktivem 3-Hydroxypyrrolidin und N-substituierter Derivate davon würde die stereoselektive Einführung eines Sauerstoffs in die entsprechenden Pyrrolidine, die leicht erhältlich sind, sein. Jedoch ist diese Reaktion nicht mit klassischen chemischen Verfahren möglich.
Die enzymatische Hydroxylierung von Pyrrolidinen ist schwierig. Man weiß nicht viel über eine derartige Hydroxylierung: es gibt nur einige Berichte über die Hydroxylierung von N-Acylpyrrolidin, die auf die Verwendung einiger spezifischer Pilze beschränkt sind.
GB 1140055 (1970) bezieht sich auf die Hydroxylierung von heterozyklischen N-Acylverbindungen mit Sporotrichum sulphurescens ATCC 7159. Es ist zweifelhaft, ob das Verfahren auf die Hydroxylierung von N-Acylpyrrolidinen anwendbar ist. Die Hydroxylierung von N-Acylpyrrolidin mit Sporotrichum sulphurescens ATCC 7159 ist in GB 1140055 nicht als Beispiel dargestellt. Es ist bekannt, dass die Hydroxylierung von N-Benzoylpyrrolidin mit ATCC 7159 keinerlei Menge des N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidins ergibt [Srairi, D. et al., Bull. Soc. Chem. Fr. 1897, 297]. Es ist auch bekannt, dass ATCC 7159 die Hydroxylierung von N-Aryl- oder N-Benzylpyrrolidin nicht katalysieren kann [Floyd, N. et al., J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1, 1993, 881]. Es ist bekannt, dass die Hydroxylierung von N-Benzoylpyrrolidin mit Cunninghamella verticillat oder Aspergillus niger N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin ergibt (Chemical Abstracts, 1993, 118: 6835c). Jedoch sind diese Verfahren nicht praktisch, da derartige Hydroxylierungen mit Pilzen zu einer geringen Ausbeute, einer geringen Konzentration und einem geringen enantiomeren Überschuss (e.Ü.) des Produktes, einer geringen Geschwindigkeit der Biotransformation und der Bildung von Nebenprodukt führen.
Zusammenfassung der Erfindung
Diese Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven 3-Hydroxypyrrolidins oder N-substituierter 3-Hydroxypyrrolidine bereit, worin ein Sauerstoffatom stereoselektiv in die jeweiligen entsprechenden Pyrrolidine unter Verwendung eines Bakteriums mit Hydroxylierungsaktivität oder eines prokariotischen Wirtsorganismus mit dem/den Gen/Genen, die für die Hydroxylierung nötig sind, oder eines Enzyms mit Hydroxylierungsaktivität, das daraus abgeleitet ist, eingeführt wird.
Insbesondere ist das verwendete Bakterium aus der Gruppe ausgewählt, die besteht aus Stämmen mit Alkanhydroxylasen, Stämmen, die Alkane oder monoalicyclische Verbindungen abbauen, oder Stämmen der Gattungen Pseudomonas, Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia, Sphingomonoas, Gordona, Rhodococcus, Bacillus, Streptomyces, Sebekia und Methylococcus. Bevorzugt sind n-Alkan-abbauende Stämme, wie die Isolate HXN-200 und HXN-1100, Pseudomonas oleovorans- und Pseudomonas putida-Stämme, wie Pseudomonas oleovorans GPo1 (ATCC 29347) und Pseudomonas putida P1. Die Erfindung umfasst die Verwendung von rekombinanten Bakterien mit dem/den Gen/Genen, die für die Hydroxylierung nötig sind, wie eines oder mehrerer der Alkanhydroxylasegene, und insbesondere der Multikomponenten-Alkanhydroxylasegene eines Alkan-abbauenden Bakteriums (z.B. von Pseudomonas oleovorans GPo1). Bevorzugt sind rekombinante Escherichia coli-Stämme, wie Escherichia coli GEc137 (pGEc47).
Die Biotransformation wird in vivo mit Ruhezellen als Biokatalysatoren, in vivo mit wachsenden Zellen als Biokatalysatoren oder in vitro mit rohen Zellextrakten oder Enzympräparationen ausgeführt, die als Biokatalysatoren gereinigt oder teilweise gereinigt sind.
Die Biokatalysatoren können auf oder in einem wasserunlöslichen Carrier oder Trägersystem immobilisiert sein.
Die Biotransformation wird in wässrigem Medium oder in Multiphasenmedien ausgeführt, die möglicherweise zwei oder mehr der folgenden enthalten: eine feste Phase, eine wässrige Phase, eine organische Phase oder eine gasförmige Phase.
Die Reaktionstemperatur beträgt 5 bis 50°C, vorzugsweise 20 bis 40°C, und der pH-Wert des Mediums beträgt 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8.
Die Isolierung der optisch aktiven 3-Hydroxypyrrolidinderivate kann mittels einer Extraktion oder durch Trenntechniken, wie Chromatographie unter Verwendung eines anorganischen, organischen oder synthetischen Adsorbens als einen Träger, oder durch Membranfiltration ausgeführt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurde optisch aktives N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin durch stereoselektive Einführung eines Sauerstoffatoms in N-Benzylpyrrolidin unter Verwendung von Pseudomonas oleovorans GPo1 oder Pseudomonas putida P1 oder des Isolats HXN-200 oder des Isolats HXN-1100 oder von anderen Bakterien mit Alkanhydroxylase oder die 4 oder mehr C-Atome enthaltende Alkane oder monoalicyclische Verbindungen abbauen, oder eines prokariotischen Wirtsorganismus mit dem/den Gen/Genen, die für die Hydroxylierung nötig sind, wie der rekombinante Stamm Escherichia coli GEc137 (pGEc47), oder eines davon abgeleiteten Enzyms hergestellt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wurden optisch aktives N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin, N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin, N-Phenyoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin und N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch stereoselektive Einführung eines Sauerstoffatoms in N-Benzoyl-pyrrolidin, N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin, N-Phenoxycarbonylpyrrolidin beziehungsweise N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin durch die Verwendung des Isolats HXN-200 oder eines anderen Bakteriums mit Alkanhydroxylase oder Alkane oder monoalicyclische Verbindungen abbaut, wie Kohlenwasserstoffe, die 4 oder mehr C-Atome enthalten, oder eines prokariotischen Wirtsorganismus mit dem/den Gen/Genen, die für die Hydroxylierung nötig sind, oder eines Enzyms mit Hydroxylierungsaktivität, das daraus abgeleitet ist, hergestellt.
Optisch aktives N-substituiertes 3-Hydroxypyrrolidin, das durch dieses Verfahren erhalten wird, kann einfach in optisch aktives 3-Hydroxypyrrolidin durch Schutzentfernung umgewandelt werden.
Daher stellt die hier beschriebene Erfindung ein nützliches Verfahren für die Herstellung eines optisch aktiven 3-Hydroxypyrrolidins und N-substituierten 3-Hydroxypyrrolidins bereit.
Beschreibung der Erfindung
Es wurde ein Verfahren für die Herstellung eines optisch aktiven 3-Hydroxypyrrolidins oder N-substituierter 3-Hydroxypyrrolidine entwickelt, worin ein Sauerstoffatom stereoselektiv in die jeweiligen entsprechenden Pyrrolidine unter Verwendung eines Bakteriums mit Hydroxylierungsaktivität oder eines prokariotischen Wirtsorganismus mit dem/den Gen/Genen, die für die Hydroxylierung nötig sind, oder eines Enzyms mit Hydroxylierungsaktivität, das davon abgeleitet ist, eingeführt wird.
Zum Finden geeigneter Biokatalysatoren, die diese Reaktion katalysieren, wurden viele Mikroorganismen gescreent. In einer typischen Screeningprozedur wurde ein Mikroorganismus in ein für Wachstum geeignetes Nährmedium geimpft, und die Kultur wurde unter Schütteln bei 25 bis 35°C für 1 bis 3 Tage inkubiert. Die Zellen wurden in der späten exponentialen Wachstumsphase geerntet und auf 4 bis 6 g/l in 50 mM Phosphatpuffer (pH=7-8) resuspendiert. Ein Substrat wurde auf eine Konzentration von 0,5-10 mM zugegeben. Die Mischung wurde bei 25 bis 35°C für 0-2 Tage geschüttelt. Der Biotransformation folgte eine Bestimmung des gebildeten Produkts und des verschwundenen Substrats. Proben wurden aus der Reaktionsmischung genommen und direkt durch Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit einer Umkehrphasensäule analysiert, oder die Proben wurden mit Ethylacetat extrahiert und die organische Phase mit Gaschromatographie (GC) analysiert.
Es wurde auch eine Screeningprozedur unter Verwendung einer Mikrotiterplatte entwickelt: man ließ 96 Mikroorganismen in einer Mikrotiterplatte wachsen, was ein effizientes Screening auf einer Mikroskala ermöglichte.
Es wurde gefunden, dass viele Bakterien fähig sind, die Hydroxylierung von Pyrrolidinen zu katalysieren, um die entsprechenden optisch aktiven 3-Hydroxypyrrolidine in hoher Ausbeute und hohem e.Ü. zu ergeben. Beispiele dieser Bakterien sind Bakterien mit Alkanhydroxylasen, Bakterien, die Alkane oder monoalicyclische Verbindungen abbauen, und Bakterien von den Gattungen Pseudomonas, Mycobacterium, Corynebacterium, Nocardia, Sphingomonas, Gordona, Rhodococcus, Bacillus, Streptomyces, Sebekia und Methylococcus. Das Bakterium kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus Bakterien besteht, die n-Alkane abbauen, die 4-20 Kohlenstoffatome enthalten, oder aus der Gruppe, die aus Bakterien besteht, die monoalicyclische Verbindungen abbauen, die 4-20 Kohlenstoffatome enthalten.
Es wurde auch gefunden, dass die Biokatalysatoren prokariotische Wirtsorganismen sein können, die Gene) besitzen, welche für die Hydroxylierung nötig sind. Der rekombinante Stamm Escherichia coli GEc137 (pGEc47) ist zum Beispiel ein geeigneter Katalysator.
Es wurde gefunden, dass die Hydroxylierung von Pyrrolidinen durch ein Enzym katalysiert werden kann, das Hydroxylierungsaktivität besitzt und von den Bakterien abgeleitet ist, um die entsprechenden optisch aktiven 3-Hydroxypyrrolidine zu ergeben.
Die Biotransformation kann in vivo mit Ruhezellen als Biokatalysatoren, in vivo mit wachsenden Zellen als Biokatalysatoren oder in vitro mit gereinigten Enzymen oder rohen Zellextrakten als Biokatalysatoren ausgeführt werden.
Die Biokatalysatoren können auf oder in einem wasserunlöslichen Carrier oder Trägersystem immobilisiert sein.
Die Biotransformation kann in wässrigem Medium ausgeführt werden. Sie kann auch in Multiphasen-Medien ausgeführt werden, die möglicherweise zwei oder mehrere der folgenden enthalten: eine feste Phase, eine wässrige Phase, eine organische Phase und eine gasförmige Phase. Organische Lösungsmittel mit hohen LogP-Werten können als organische Phase verwendet werden. Dies schließt Alkane mit 5 oder mehr C-Atomen, Dialkylether mit 4 oder mehr C-Atomen und aromatische oder heteroaromatische Kohlenwasserstoffe ein. Ein Beispiel eines geeigneten organischen Lösungsmittels ist Hexadecan.
Die enzymatischen Hydroxylierungen können, obwohl dies kein kritischer Parameter ist, bei einer Temperatur von 5-50°C ausgeführt werden, bevorzugt bei 20-40°C. Der Druck kann innerhalb weiter Grenzen variieren. In Praxis wird die Biotransformation bei Atmosphärendruck ausgeführt. Der pH des Reaktionsmediums kann zwischen 4 und 10, bevorzugt zwischen 6 und 8 liegen.
Das Produkt kann durch chromatographische Techniken mit einem anorganischen, organischen oder synthetischen Adsorbens, das als ein Träger verwendet wird, getrennt werden. Die geeigneten Adsorbenzien sind beispielsweise Aluminiumoxid und Silicagel. Das Produkt kann auch durch Membranfiltration isoliert werden.
Das Produkt kann auch mittels Extraktion abgetrennt werden, wobei das Substrat zuerst aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion mit einem weniger polaren Lösungsmittel gewonnen, die verbleibende Reaktionsmischung auf pH=10-12 eingestellt und das Produkt mit einem höher polaren Lösungsmittel extrahiert werden. Das Extraktionsmittel ist bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Alkanen mit 5 oder mehr C-Atomen, Dialkylether mit 4 oder mehr C-Atomen, chlorhaltigen Alkanen mit 3 oder weniger C-Atomen, aromatischen Alkylen mit 7-10 C-Atomen und Carbonsäureestern mit 3 oder mehr C-Atomen ausgewählt.
Es wurde gefunden, dass optisch aktives N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin durch stereoselektive Einführung eines Sauerstoffatoms in N-Benzylpyrrolidin unter Verwendung von Pseudomonas oleovorans GPo1 (Stamm ATCC 29347) hergestellt werden kann. Die Biotransformation kann mit Ruhezellen, rohen Zellextrakten beziehungsweise wachsenden Zellen von Pseudomonas oleovorans GPo1 ausgeführt wurden, gezeigt in Beispiel 1-3. Die Kultur von Pseudomonas oleovorans GPo1 kann entweder durch Wachsen in E2-Medium mit Octan als Kohlenstoffquelle oder durch Wachsen in E2-Medium mit Pyruvat als Kohlenstoffquelle gefolgt von Induktion des Alkanoxidationssystems mit Dicyclopropylketon (DCPK) hergestellt werden.
Der Reaktion folgte eine analytische HPLC (Verfahren A, Säule: Spherisorb ODS2 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 7:3; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin: 6,5 min; Retentionszeit von N-Benzylpyrrolidin: 25 min; Verfahren B, Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 1:9; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin: 2,7 min; Retentionszeit von N-Benzylpyrrolidin: 3,7 min).
Ein Verfahren für die Reinigung des Produktes wurde ermittelt. Es umfasste entweder Lösungsmittelextraktion oder Chromatographie. In dem Falle der Lösungsmittelextraktion wird das Substrat zuerst durch Extraktion der Reaktionsmischung mit einem unpolaren Lösungsmittel gewonnen, und das Produkt dann mit einem polaren Lösungsmittel aus der verbleibenden Reaktionsmischung nach Einstellen des pH auf pH=12 extrahiert. Geeignete Extraktionsmittel sind Alkane mit 5 oder mehr C- Atomen, Dialkylether mit 4 oder mehr C-Atomen, Chlor-enthaltende Alkane mit 3 oder weniger C-Atomen, Alkylaromaten mit 7-10 C-Atomen und Carbonsäureester mit 3 oder mehr C-Atomen. Beispiele besonders geeigneter Extraktionsmittel sind Hexan und Ethylacetat, als unpolares beziehungsweise polares Lösungsmittel. In dem Falle der Chromatographie wurde die Reaktionsmischung mit Ethylacetat extrahiert, das nicht-reagierte Substrat zunächst aus einer Säule aus Aluminiumoxid mit Hexan/Ethylacetat (1:1) eluiert und das Produkt dann durch Waschen mit Methanol erhalten.
Das reine Produkt wurde als N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der -GC-MS- und NMR-Spektren mit den entsprechenden Spektren der authentischen Verbindung identifiziert.
Der enantiomere Überschuss (e.Ü.) von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule gemessen [Chiracel OB-H (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (98:2); Durchflussgeschwindigkeit: 0,5 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 26,1 min für die (R)-form und 43,5 min für die (S)-Form]. N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin, das aus der Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin katalysiert durch Pseudomonas oleovorans GPo1 erhalten wurde, besitzt einen 52%-igen e.Ü. (R).
In den Ruhezell-Experimenten mit Pseudomonas oleovorans GPo1 (Stamm ATCC 29347) vergrößerte sich die Ausbeute von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin bei höheren Zellkonzentrationen (Tabelle 1). Sie hängt auch von der Konzentration des Substrats ab. Mit einer Zellkonzentration von 26,2 g/l wurden 49% und 62% Ausbeute durch Hydroxylierung von 2 mM beziehungsweise 0,5 mM N-Benzylpyrrolidin erhalten.
Wie in Beispiel 2 gezeigt ist, ist die Reaktion mit rohen Zellextrakten von Pseudomonas oleovorans GPo1 (Stamm ATCC 29347) ziemlich schnell. Die Ausbeute hängt von der Konzentration der rohen Zellextrakte ab. Unter Verwendung der rohen Zellextrakte, die aus Zelldichten von 26,2 g/l erhalten wurden, wurden 50% N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in 4 h erhalten.
In Beispiel 3 wurde 12% N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin mit wachsenden Zellen von Pseudomonas oleovorans GPo1 (Stamm ATCC 29347) als Biokatalysatoren erhalten.
Es wurde gefunden, dass Escherichia coli GEc137 (pGEc47) [beschrieben von Eggink, G. et al., in J. Biol. Chem. 1987, 262, 17712; in der Stammsammlung des Biotechnologieinstituts ETH Zürich], ein rekombinanter Stamm, der die Gene für eine Multikomponenten-Alkanhydroxylase von Pseudomonas oleovorans GPo1 trägt, die Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin katalysiert. 7% (R)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin mit 52% e.Ü. wurden durch Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin (0,5 mM) mit Ruhezellen (2,5 g/l) von Escherichia coli GEc137 (pGEc47) erhalten, wie in Beispiel 4 gezeigt ist.
Es wurde gefunden, dass Alkan-abbauende Mikroorganismen ausgezeichnete Biokatalysatoren für die Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin zu optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin sind. Beispiele sind Bakterien, die 4 oder mehr C-Atome enthaltendes n-Alkan abbauen. Durch Screenen mit einer Mikrotiterplatte wurde gefunden, dass 25 eines Satzes von 70 Stämmen, die n-Hexan, n-Octan, n-Decan oder n-Dodecan abbauen, fähig sind, diese Hydroxylierung zu katalysieren (Beispiel 5). Die Enantioselektivität und relative Aktivität von 14 ausgewählten Alkan-abbauenden Stämmen sind in Tabelle 3 gezeigt (Beispiel 6). Die Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit Pseudomonas putida P1 ergab (R)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in 62%-igem e.Ü.; die Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit dem Isolat HXN-1100 ergab (R)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in 70%-igem e.Ü.; überraschenderweise ergab die Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit dem Isolat HXN-200 (S)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in 53%-igem e.Ü. (Pseudomonas putida P1 wurde mit n-Octan als Kohlenstoffquelle von van Beilen, J., ETH Zürich isoliert; die Isolate HXN-1100 und HXN-200 wurden mit n-Hexan als Kohlenstoffquelle von Engesser, K.-H. und Plaggemeier, Th., Universität Stuttgart isoliert; all diese Stämme sind in der Stammsammlung des Biotechnologieinstituts, ETH Zürich.)
Die Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit Ruhezellen des Isolats HXN-1100 ist schneller als jene mit P. oleovorans GPo1. Die höchsten Ausbeuten von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin wurden mit höchsten Zellkonzentrationen erhalten, wie in Tabelle 4 gezeigt ist (Beispiel 7). Die Hydroxylierung von 0,5, 2 und 5 mM Benzylpyrrolidin mit 26,3 g/l Zellen ergab (R)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin mit 70%-igem e.Ü. in 67%-iger, 49%-iger beziehungsweise 33%-iger Ausbeute.
Die Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit Ruhezellen des Isolats HXN-200 ergab eine hohe Aktivität. Wie in Tabelle 5 gezeigt ist (Beispiel 8), erreicht die durchschnittliche Aktivität in den ersten 30 min 8,2-9,4 U/g CDW (Masse der handelsüblich trockenen Substanz), beginnend mit 10-20 mM N-Benzylpyrrolidin. Es wurde gefunden, dass die Zugabe von 2% Glukose in der Reaktionsmischung die Ausbeute vergrößerte. Tabelle 5 zeigt die Ergebnisse mit 2% Glukose und 5,3 g/l Zellen: die Ausbeute bei 5 h beträgt 62%, 48%, 35%, und 27% beginnend mit 5 mM (0,81 g/l), 10 mM (1,61 g/l), 15 mM (2,42 g/l) beziehungsweise 20 mM (3,22 g/l) N-Benzylpyrrolidin. Das Produkt besaß 53%-igen e.Ü. des (S)-Enantiomers in allen Fällen.
Es wurde gefunden, dass die geernteten Zellen von HXN-200 bei –80°C mehrere Monate lang ohne Verlust der Hydroxylierungsaktivität gelagert werden können.
Es wurde gefunden, dass optisch aktives N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin durch stereoselektives Einführen eines Sauerstoffatoms in N-Benzoylpyrrolidin unter Verwendung von Alkan-abbauenden Stämmen hergestellt werden kann. Die Hydroxylierung von N-Benzoylpyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200 ist in Beispiel 9 gezeigt. Der Biotransformation folgte eine analytische HPLC [Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 3:7; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin: 1,4 min; Retentionszeit von N-Benzoylpyrrolidin: 2,9 min].
Ein Verfahren für die Reinigung des Produktes wurde ermittelt: das nicht-reagierte Substrat wurde durch Extraktion der Reaktionsmischung mit Hexan entfernt; das Produkt wurde durch Extraktion der verbleibenden wässrigen Reaktionsmischung mit Ethylacetat erhalten. Das Produkt kann auch durch Extraktion der Reaktionsmischung mit Ethylacetat gefolgt von Chromatographie auf Aluminiumoxid isoliert werden. Das nicht-reagierte Substrat wurde zuerst mit Ethylacetat eluiert, und dann wurde das Produkt mit Methanol/Ethylacetat (15/85) eluiert. Das resultierende Produkt wurde als N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert.
Es wurde gefunden, dass die Hydroxylierung von N-Benzoylpyrrolidin mit Ruhezellen von HXN-200 bei einem pH zwischen 5,2 und 10,0, bevorzugt zwischen 6-9, ausgeführt werden kann, wie in Tabelle 6 gezeigt.
Es wurde gefunden, dass das Vorhandensein von 2-3% Glukose in der Reaktionsmischung die Ausbeute vergrößert. Wie in Tabelle 7 gezeigt ist, kann 73% N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzoylpyrrolidin (2 mM) mit 3,9 g/l der Zellen von HXN-200 bei Vorhandensein von Glukose (3%) erhalten werden.
Es wurde auch gefunden, dass optisch aktives N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzoylpyrrolidin in vivo mit wachsenden Zellen von HXN-200 hergestellt werden kann. Wie in Beispiel 10 gezeigt ist, wurde die Biotransformation im 2 l-Maßstab mit wachsenden Zellen von HXN-200 ausgeführt; 88% Umwandlung und 80% isolierte Ausbeute wurden ausgehend von 1,5 mM des Substrats erreicht. Der e.Ü. des Produktes wurde als >99%-iger e.Ü. (R) durch Vergleichen seiner optischen Drehung mit derjenigen einer synthetischen Probe von N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin hergestellt aus (R)-3-hydroxypyrrolidin und Benzoesäureanhydrid abgeleitet.
Es wurde gefunden, dass optisch aktives N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch stereoselektives Einführen eines Sauerstoffatoms in N-Benzyloxycarbonyl pyrrolidin durch Verwenden von Alkan-abbauenden Stämmen hergestellt werden kann. Die Hydroxylierung von N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200 ist in Beispiel 11 gezeigt. N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin (2-10 mM) und Glukose (0 oder 2%) wurden zu einer Suspension von 4,3 g/l der Zellen in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,5) gegeben. Die Mischung wurde bei 30°C 5 h lang geschüttelt. Der Reaktion folgte eine analytische HPLC [Säule: Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 35:65; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin: 2,3 min; Retentionszeit von N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin: 8,8 min].
Ein Verfahren für die Reinigung des Produktes wurde ermittelt: die Reaktionsmischung wurde auf pH=8-12 eingestellt, gefolgt von einer Extraktion mit Ethylacetat; das Produkt wurde durch Chromatographie auf Aluminiumoxid abgetrennt: das nichtreagierte Substrat wurde zuerst mit Ethylacetat/Hexan (1:9) eluiert und dann das Produkt mit Ethylacetat eluiert. Das reine Produkt wurde als N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert.
Wie in Tabelle 8 gezeigt ist, wurde eine 100%-ige Ausbeute durch Hydroxylierung von 3,5 mM (0,72 g/l) N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin bei einer Zelldichte von 4,3 g/l erreicht.
Der e.Ü. von N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule ermittelt [Chiralpak AS (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (100:4); Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 32,9 min für die (S)-Form und 36,7 min für die (R)-Form]. Das erhalte N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin hatte einen 85%-igen e.Ü. (R).
Die Herstellung von optisch aktivem N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin kann auch in vivo mit wachsenden Zellen von HXN-200 ausgeführt werden. Wie in Beispiel 12 gezeigt ist, wurde die Hydroxylierung von N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin (1,23 g, 3 mM) mit wachsenden Zellen von HXN-200 in einem 2 l-Maßstab ausgeführt. Eine 100%-ige Umwandlung wurde bei 2 h erreicht (Eintrag 9 in Tabelle 8), und 95% (1,26 g) des reinen Produkts wurden als weißes Pulver isoliert. Das Produkt wurde als N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert. Das Produkt hat einen durch chirale HPLC bestimmten 85%-igen e.Ü. (R).
Es wurde gefunden, dass optisch aktives N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch stereoselektives Einführen eines Sauerstoffatoms in N-Phenoxycarbonylpyrrolidin unter Verwendung von Alkan-abbauenden Stämmen hergestellt werden kann. Die Hydroxylierung von N-Phenoxycarbonylpyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200 ist in Beispiel 13 gezeigt. Die Biotransformation wurde mit N-Phenoxycarbonylpyrrolidin (2-10 mM), Glukose (0 oder 2%) und einer Suspension von 4,6 g/l der Zellen in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,5) ausgeführt. Der Reaktion folgte eine analytische HPLC (Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 35:65; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin: 1,8 min; Retentionszeit von N-Phenoxycarbonylpyrrolidin: 6,0 min]. Das Produkt wurde durch Chromatographie auf Aluminiumoxid isoliert: das nicht-reagierte Substrat wurde zuerst mit Ethylacetat/Hexan (1:9) eluiert und dann das Produkt mit Ethylacetat eluiert. Das reine Produkt wurde als N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert.
Wie in Tabelle 9 gezeigt ist, wurde eine 100%-ige Ausbeute durch Hydroxylierung von 2 mM N-Phenoxycarbonylpyrrolidin bei einer Zelldichte von 4,6 g/l bei Vorhandensein von 2% Glukose erreicht. Eine 80%-ige Ausbeute konnte beginnend mit 5 mM (0,96 g/l) Substrat, 2% Glukose und 4,6 g/l Zellen erreicht werden.
Der e.Ü. von N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule gemessen [Chiralpak AS (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (100:4); Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 37,3 min für die (S)-Form und 41,1 min für die (R)-Form]. Das erhalte Produkt hat einen 36%-igen e.Ü. (S).
Es wurde gefunden, dass optisch aktives N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch stereoselektives Einführen eines Sauerstoffatoms in N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin unter Verwenden von Alkan-abbauenden Stämmen hergestellt werden kann. Die Hydroxylierung von N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200 ist in Beispiel 14 gezeigt. Die Hydroxylierung von N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin (5-20 mM) wurde mit 5,3 g/l Zellen von HXN-200 in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,5) bei Vorhandensein von Glukose (0 oder 2%) ausgeführt. Der Reaktion folgte eine analytische HPLC [Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 3:7; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin: 2,3 min; Retentionszeit von N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin: 11,6 min]. Das Produkt wurde durch Extraktion der Reaktionsmischung mit Ethylacetat gefolgt von einer Chromatographie auf Aluminiumoxid mit Hexan/Ethylacetat (1:1) isoliert. Das reine Produkt wurde als N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert.
Wie in Tabelle 10 gezeigt ist, ergab die Hydroxylierung von 5 mM (0,86 g/l) Substrat mit 5,3 g/l Zellen von HXN-200 und 2% Glukose eine 100%-ige Ausbeute von N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin; 82% Ausbeute wurde ausgehend von 10 mM (1,71 g/l) Substrat erreicht.
Der e.Ü. von N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule bestimmt [Chiralpak AS (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (98:2); Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 16,0 min für die (S)-Form und 17,9 min für die (R)-Form]. Das erhalte Produkt hat einen 33%-igen e.Ü. (R).
Es wurde gefunden, dass optisch aktives N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit wachsenden Zellen von HXN-200 hergestellt werden kann. In Beispiel 15 wurde das Isolat HXN-200 in 2 l E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C auf eine Zelldichte von 4,0 g/l wachsen gelassen. Glukose (80 ml, 50%) wurde zugegeben, die Zufuhr von Octandampf beendet und N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin (3,505 g) zugegeben. Die Reaktion wurde 3 h lang bei pH=7,9-8,0 fortgesetzt. Eine 100%-ige Umwandlung wurde bei 3 h erreicht und 95% (3,61 g) reines Produkt als weißes Pulver erhalten.
Es wurde gefunden, dass optisch aktives N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin, N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin, N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin beziehungsweise N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin aus den entsprechenden Pyrrolidinen mit zellfreien Extrakten eines Alkan-abbauenden Stammes hergestellt werden kann. Beispiele sind mit zellfreien Extrakten von HXN-200 gegeben. Es wurde auch gefunden, dass das Enzym, das diese Reaktion in HXN-200 katalysiert, nicht Membrangebunden ist. Wie in Beispiel 16 gezeigt ist, wurden die zellfreien Extrakte durch Durchleiten der Zellen (12,3 g/l) von HXN-200 in Tris-HCl-Puffer (pH=8,0) durch eine French-Press und Entfernung der Zelldebris durch Zentrifugieren bei 45.000 g während 45 min hergestellt. Die Behandlung dieser rohen Zellextrakte ohne Membranproteine und NADH (5 mM) mit N-Benzylpyrrolidin (5 mM), N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin (5 mM) beziehungsweise N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin ergab die entsprechenden 3-Hydroxypyrrolidine in 17%-iger, 7%-iger beziehungsweise 26%-iger Ausbeute.
Es wurde gefunden, dass N-Acetyl-3-hydroxypyrrolidin durch stereoselektives Einführen eines Sauerstoffatoms in N-Acetylpyrrolidin unter Verwenden von Stämmen, die monoalicyclische Verbindungen abbauen, welche 4 oder mehr C-Atome enthalten, hergestellt werden kann. Ein Beispiel ist mit einem Cyclohexan abbauenden Stamm gegeben (isoliert von Li, Z. et al., ETH Zürich; in der Stammsammlung des Biotechnologieinstituts, ETH Zürich). In Beispiel 17 wurden 4% N-Acetyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von 2 mM N-Acetylpyrrolidin mit Ruhezellen (5 g/l) eines Cyclohexan-abbauenden Stammes erhalten. Der Reaktion folgte eine ana lytische HPLC [Säule: Spherisorb ODS2 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 5/95; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Acetyl-3-hydroxypyrrolidin: 2,3 min; Retentionszeit von N-Acetylpyrrolidin: 7,9 min]. Das Produkt wurde identifiziert durch Vergleichen der GC-MS- und NMR-Spektren mit den entsprechenden Spektren der authentischen Verbindung.
Die hier gegebenen speziellen Beispiele sind lediglich als eine Veranschaulichung der Erfindung beabsichtigt und sollten nicht als eine Beschränkung des Umfangs der Erfindung aufgefasst werden.
Beispiele
Beispiel 1: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von Pseudomonas oleovorans GPo1.
Für den Eintrag 1-6 in Tabelle 1 wurde Pseudomonas oleovorans GPo1 (Stamm ATCC 29347) in E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C 10 h wachsen gelassen, die Zellen bei einer Zelldichte von 1-2 g/l geerntet und auf 3 bis 30 g/l in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. N-Benzylpyrrolidin wurde auf eine Endkonzentration von 0,5-2 mM zugegeben und die Mischung bei 30°C für 0-2 Tage geschüttelt.
Für den Eintrag 7 in Tabelle 1 wurde Pseudomonas oleovorans GPo1 (Stamm ATCC 29347) in E2-Medium mit 0,4% Pyruvat als Kohlenstoffquelle bei 30°C 3 h lang geimpft und dann mit 2 mM DCPK weitere 3 h auf eine Zelldichte von 0,6 g/l induziert. Die Zellen wurden geerntet und auf 3,7 g/l in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. N-Benzylpyrrolidin wurde auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben und die Mischung bei 30°C für 0 bis 2 Tage geschüttelt.
Der Reaktion folgte eine analytische HPLC: Proben wurden direkt aus der Reaktionsmischung zu verschiedenen Zeiten entnommen, die Zellen wurden durch Zentrifu gieren entfernt und die Überstände wurden durch eine analytische HPLC analysiert: Verfahren A, Säule: Spherisorb ODS2 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 7:3; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin: 6,5 min; Retentionszeit von N-Benzylpyrrolidin: 25,0 min. Verfahren B, Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 1:9; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin: 2,7 min; Retentionszeit von N-Benzylpyrrolidin: 3,7 min.
Das Produkt wurde gemäß dem folgenden Verfahren isoliert: die Reaktionsmischung wurde mit Hexan extrahiert, um das nicht-reagierte Substrat zu entfernen, die verbleibende wässrige Reaktionsmischung auf pH=12 durch die Zugabe von KOH eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Dies ergab reines N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin.
Das Produkt kann auch wie folgt isoliert werden: die Reaktionsmischung wurde auf pH=12 durch die Zugabe von KOH eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde einer Chromatographie auf Aluminiumoxid mit einer kurzen Säule unterzogen. Das nicht-reagierte Substrat wurde zuerst mit Hexan/Ethylacetat (1:1) eluiert, und dann das Produkt mit Methanol eluiert. Das reine Produkt wurde als N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgelistet.
Tabelle 1: Herstellung von (R)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit Ruhezellen von Pseudomonas oleovorans GPo1
Der e.Ü. von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin wurde durch eine analytische HPLC mit einer chiralen Säule gemessen [Chiracel OB-H (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (98:2); Durchflussgeschwindigkeit: 0,5 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 26,1 min für die (R)-Form und 43,5 min für die (S)-Form]. Das hier erhaltene N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin hat einen 52%-igen e.Ü. (R).
Beispiel 2: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in vitro mit rohen Zellextrakten von Pseudomonas oleovorans GPo1
Pseudomonas oleovorans GPo1 (Stamm ATCC 29347) wurde in E2-Medium mit Octan als Kohlenstoffquelle bei 30°C unter Schütteln für 10 h geimpft. Die Zellen wurden geerntet und in Tris-HCl-Puffer (pH=7,5) auf eine Konzentration von 5-30 g/l resuspendiert. Nach dem Durchleiten durch die French-Press wurde die Zelldebris durch Zentrifugieren bei 4.000 g entfernt. Zu diesen rohen Zellextrakten, die Membranproteine enthielten, wurde N-Benzylpyrrolidin beziehungsweise NADH auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben. Die Mischung wurde bei 30°C für 4 h geschüttelt. Analytische und Isolier-Verfahren waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgelistet.
Tabelle 2: Herstellung von (R)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit Zellextrakten (CE) von Pseudomonas oleovorans GPo1
Beispiel 3: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit wachsenden Zellen von Pseudomonas oleovorans GPo1
Pseudomonas oleovorans GPo1 (Stamm ATCC 29347) wurde in E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C auf eine Zelldichte von 0,3 g/l wachsen gelassen. N-Benzylpyrrolidin wurde auf eine Endkonzentration von 0,5 mM zugegeben und die Zellen für 3 Tage weiter wachsen gelassen. Ungefähr 12% N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin wurde erhalten.
Beispiel 4: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von Escherichia coli GEc137 (pGEc47)
Escherichia coli GEc137 (pGEc47) (beschrieben von Eggink, G. et al., in J. Biol. Chem. 1987, 262, 17712; in der Stammsammlung des Biotechnologieinstituts ETH Zürich) wurde in M9-Medium mit Glukose als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 37°C für 10 h auf eine Zelldichte von 0,2 g/l wachsen gelassen. Eine Induktion wurde dann durch Zugeben von DCPK auf eine Konzentration von 2 mM durchgeführt. Die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 0,3 g/l geerntet und auf 2,5 g/l in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,0) resuspendiert. N-Benzylpyrrolidin (0,5 mM) wurde zugegeben und die Mischung bei 30°C für 16 h geschüttelt. Analytische und Isolier-Verfahren waren wie oben beschrieben. 7% N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin wurde erhalten. Das Produkt hat einen 52%-igen e.Ü. (R).
Beispiel 5: Screening von Alkan-abbauenden Stämmen für die Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin zu N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin
Siebzig (70) Alkan-abbauende Stämme, die mit n-Hexan, n-Octan, n-Decan oder n-Dodecan als Kohlenstoffquelle (alle in der Stammsammlung des Instituts für Biotechnologie, ETH Zürich) isoliert waren, wurden in einer tiefwannigen Mikrotiterplatte bei Raumtemperatur in 750 μl Medium, das aus 20 mM Glukose, 20 mM L-Aspartat, 100 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,0) und 50% der Konzentrationen aller Nährstoffe des Evans-Mediums mit Nitrilotriessigsäure als Komplexiermittel bestand, wachsen gelassen. Nach 3 Tagen wurde der Dampf einer Mischung von n-Octan, n-Decan und n-Dodecan (20:30:50) als Kohlenstoffquelle bereitgestellt. Die Zellen wurden zusätzliche 3 Tage wachsen gelassen und durch Zentrifugieren geerntet. 70 μl N-Benzylpyrrolidin (2 mM) in K-Phosphatpuffer (50 mM, pH 7,0) wurden zu den Zellen gegeben und die Mischung bei 30°C für 24 h geschüttelt. Die Biotransformation wurde durch HPLC analysiert. Es wurde gefunden, dass fünfundzwanzig (25) Alkanabbauende Stämme fähig waren, die Biotransformation von N-Benzylpyrrolidin zu N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin zu katalysieren. Zwölf (12) Alkan-abbauende Stämme wurden für eine weitere Studie ausgewählt.
Beispiel 6: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von Alkan-abbauenden Stämmen
Zwölf (12) Alkan-abbauende Stämme wurden individuell in E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C auf eine Zelldichte von 1-2 g/l wachsen gelassen, die Zellen wurden geerntet und auf 3,6 g/l in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. N-Benzylpyrrolidin wurde auf eine Konzentration von 2 mM zugegeben und die Mischung bei 30°C für 30 Minuten geschüttelt. Verfahren für die Analyse und Isolierung waren wie oben beschrieben. Der e.Ü. des resultieren den N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidins wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule wie oben beschrieben bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgelistet.
Tabelle 3: Enantioselektivität und Aktivität der Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin zu N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin mit ausgewählten Alkan-abbauenden Stämmen.
Beispiel 7: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-1100
Das Isolat HXN-1100 (isoliert mit n-Hexan als Kohlenstoffquelle von Engesser, K.-H. und Plaggemeier, Th., Universität Stuttgart; in der Stammsammlung des Instituts für Biotechnologie, ETH Zürich) wurde in E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C für 10 h wachsen gelassen, die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 1-2 g/l geerntet und auf 5-30 g/l in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) resuspendiert. N-Benzylpyrrolidin wurde auf eine Endkonzentration von 0,5-5 mM zugegeben und die Mischungen bei 30°C für 24 h geschüttelt. Verfahren für die Analyse und Isolierung waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. Der e.Ü. von N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin: 70% (R).
Tabelle 4: Herstellung von (R)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit Ruhezellen von HXN-1100
Beispiel 8: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200
Das Isolat HXN-200 (isoliert mit n-Hexan als Kohlenstoffquelle von Engesser, K.-H. und Plaggemeier, Th. et al., Universität Stuttgart; in der Stammsammlung des Instituts für Biotechnologie, ETH Zürich) wurde in 2 l E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C wachsen gelassen, die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 2,8 g/l geerntet und bei -80°C gelagert. N-Benzylpyrrolidin (5-20 mM) und Glukose (0 oder 2%) wurden zu einer Suspension von 5,3 g/l der Zellen in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) gegeben und die Mischung bei 30°C für 5 h geschüttelt. Verfahren für Analyse und Isolierung waren wie oben beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 aufgelistet, das resultierende N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin besitzt einen 53%-igen e.Ü. (S).
Tabelle 5: Herstellung von (S)-N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzylpyrrolidin mit Ruhezellen (5,3 g/l) von HXN-200
Beispiel 9: Herstellung von optisch aktivem N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200
Das Isolat HXN-200 wurde in 2 l E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C wachsen gelassen, die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 2,8 g/l geerntet und bei -80°C gelagert. N-Benzoylpyrrolidin (2-5 mM) und Glukose (0 oder 2%) wurden zu einer Suspension von 3-5 g/l der Zellen in 50 mM K-Phosphatpuffer, 50 mM Tris-HCl-Puffer beziehungsweise NaHCO₃/NaOH-Puffer bei unterschiedlichen pH gegeben. Die Mischung wurde bei 30°C für 5-24 h geschüttelt.
Der Reaktion folgte eine analytische HPLC: die Proben wurden direkt aus der Reaktionsmischung zu verschiedenen Zeiten entnommen, die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände durch analytische HPLC analysiert [Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 3:7; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin: 1,4 min; Retentionszeit von N-Benzoylpyrrolidin: 2,9 min].
Das Produkt wurde gemäß dem folgenden Verfahren isoliert: die Reaktionsmischung wurde mit Hexan extrahiert, um das nicht-reagierte Substrat zu entfernen, und die verbleibende wässrige Reaktionsmischung dann mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Dies ergab das reine Produkt.
Das Produkt kann auch wie folgt isoliert werden: die Reaktionsmischung wurde auf pH=8-12 durch die Zugabe von KOH eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde einer Chromatographie auf Aluminiumoxid mit einer kurzen Säule unterzogen. Das nicht-reagierte Substrat wurde zuerst mit Ethylacetat eluiert und dann das Produkt mit Methanol/Ethylacetat (15/85) eluiert. Das reine Produkt wurde als N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 6-7 aufgelistet.
Tabelle 6: Herstellung von (R)-N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzoylpyrrolidin (2 mM) mit Ruhezellen von HXN-200 in unterschiedlichem pH
Tabelle 7: Herstellung von (R)-N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzoylpyrrolidin mit Ruhezellen (3,9 g/l) von HXN-200
Beispiel 10: Herstellung von optisch aktivem N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit wachsenden Zellen von HXN-200
Das Isolat HXN-200 wurde in 2 l E2-Medium in einem 3 l-Bioreaktor mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C auf eine Zelldichte von 3,0 g/l wachsen gelassen. Glukose (80 ml, 50%) wurde zugegeben, die Zufuhr von Octandampf beendet und N-Benzoylpyrrolidin (570 mg) zugegeben. Die Reaktion wurde 9 h lang fortgesetzt und der pH zwischen 7,2-7,4 während dieses Zeitraumes gehalten. Die HPLC-Analyse zeigte, dass 88% Umwandlung bei 9 h erreicht wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände mit Ethylacetat extrahiert, nachdem der pH auf 9,0 eingestellt wurde. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde einer Chromatographie auf Aluminiumoxid mit einer kurzen Säule unterzogen. Das nicht-reagierte Substrat wurde zuerst mit Ethylacetat eluiert und dann das Produkt mit Methanol/Ethylacetat (15/85) eluiert. Ausbeute: 80% (498 mg) des reinen Produktes als weißes Pulver. Weiße Kristalle wurden durch Kristallisation aus Ethylacetat erhalten. Das Produkt wurde als N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert. [α]_D ²⁵ des Produktes beträgt –94,1 (c=1,047, CHCl₃), was einen >99%-igen e.Ü. des (R)-Enantiomers anzeigt, da eine synthetische Probe von N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin, hergestellt aus (R)-3-Hydroxypyrrolidin und Benzoesäureanhydrid, ein [α]_D ²⁵ von –94,1 (c=1,02, CHCl₃) hat.
Beispiel 11: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200
Das Isolat HXN-200 wurde in 2 l E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C wachsen gelassen, die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 2,8 g/l geerntet und bei -80°C gelagert. N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin (2-10 mM) und Glukose (0 oder 2%) wurden zu einer Suspension von 4,3 g/l der Zellen in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,5) gegeben. Die Mischung wurde bei 30°C für 5 h geschüttelt.
Der Reaktion folgte eine analytische HPLC: Proben wurden direkt aus der Reaktionsmischung zu verschiedenen Zeiten entnommen, die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände durch analytische HPLC analysiert [Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 35:65; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin: 2,3 min; Retentionszeit von N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin: 8,8 min].
Das Produkt kann wie folgt isoliert werden: die Reaktionsmischung wurde auf pH=8-12 durch die Zugabe von KOH eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde einer Chromatographie auf Aluminiumoxid mit einer kurzen Säule unterzogen. Das nicht-reagierte Substrat wurde zuerst mit Ethylacetat/Hexan (1:9) eluiert und dann das Produkt mit Ethylacetat eluiert. Das reine Produkt wurde als N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und der NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert. Die Ergebnisse sind in Eintrag 1-8 in Tabelle 8 aufgelistet.
Der e.Ü. von N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin wurde durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule gemessen (Chiralpak AS (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (100:4); Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 32,9 min für die (S)-Form und 36,7 min für die (R)-Form]. (R)-N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin wurde in 85%-igem e.Ü. erhalten.
Tabelle 8: Herstellung von (R)-N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin mit Ruhezellen (4,3 g/l) von HXN-200
Beispiel 12: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit wachsenden Zellen von HXN-200
Das Isolat HXN-200 wurde in 2 l E2-Medium in einem 3 l-Bioreaktor mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C auf eine Zelldichte von 4,0 g/l wachsen gelassen. Glukose (80 ml, 50%) wurde zugegeben, die Versorgung mit Octandampf beendet und N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin (1,23 g) zugegeben. Die Reaktion wurde für 2 h fortgesetzt und der pH zwischen 7,9-8,0 während dieses Zeitraumes gehalten. HPLC-Analyse zeigte, dass 100% Umwandlung bei 2 h erreicht wurde (Eintrag 9 in Tabelle 8). Die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände mit Ethylacetat extrahiert, nachdem der pH auf 9,0 eingestellt war. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Dies ergab 95% (1,26 g) des reinen Produkts als weißes Pulver. Das Produkt wurde als N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert. Das Produkt hat einen 85%-igen e.Ü. (R), bestimmt durch analytische HPLC mit einer chiralen Säule wie oben beschrieben.
Beispiel 13: Herstellung von optisch aktivem N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200
Das Isolat HXN-200 wurde in 2 l E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C wachsen gelassen, die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 2,8 g/l geerntet und bei -80°C gelagert. N-Phenoxycarbonylpyrrolidin (2-10 mM) und Glukose (0 oder 2%) wurden zu einer Suspension von 4,6 g/l der Zellen in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,5) gegeben. Die Mischung wurde bei 30°C für 5 h geschüttelt.
Der Reaktion folgte eine analytische HPLC: Die Proben wurden direkt aus der Reaktionsmischung zu verschiedenen Zeiten entnommen, die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände durch analytische HPLC analysiert [Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 35:65; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin: 1,8 min; Retentionszeit von N-Phenoxycarbonylpyrrolidin: 6,0 min].
Das Produkt wurde wie folgt isoliert: die Reaktionsmischung wurde auf pH=8-12 durch die Zugabe von KOH eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde einer Chromatographie auf Aluminiumoxid mit einer kurzen Säule unterzogen. Das nicht-reagierte Substrat wurde zuerst mit Ethylacetat/Hexan (1:9) eluiert und dann das Produkt mit Ethylacetat eluiert. Das reine Produkt wurde als N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und der NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 9 aufgelistet.
Der e.Ü. von N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin wurde durch analytische HPCL mit einer chiralen Säule gemessen [Chiralpak AS (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (100:4); Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 37,3 min für die (S)-Form und 41,1 min für die (R)-Form]. Das erhalte Produkt hat einen 36%-igen e.Ü. (S).
Tabelle 9: Herstellung von (S)-N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-Phenoxycarbonylpyrrolidin mit Ruhezellen (4,6 g/l) von HXN-200
Beispiel 14: Herstellung von optisch aktivem N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von HXN-200
Das Isolat HXN-200 wurde in 2 l E2-Medium mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C wachsen gelassen, die Zellen wurden bei einer Zelldichte von 2,8 g/l geerntet und bei –80°C gelagert. N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin (5-20 mM) und Glukose (0 oder 2%) wurden zu einer Suspension von 5,3 g/l der Zellen in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,5) gegeben. Die Mischung wurde bei 30°C für 5 h geschüttelt.
Der Reaktion folgte eine analytische HPLC: Die Proben wurden direkt aus der Reaktionsmischung zu verschiedenen Zeiten entnommen, die Zellen durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände durch analytische HPLC analysiert [Säule: Hypersil BDS-C18 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 3:7; Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin: 2,3 min; Retentionszeit von N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin: 11,6 min].
Das Produkt wurde wie folgt isoliert: die Reaktionsmischung wurde auf pH=8-12 durch die Zugabe von KOH eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Der Rückstand wurde einer Chromatographie auf Aluminiumoxid mit einer kurzen Säule mit Hexan/Ethylacetat (1:1) unterzogen. Das reine Produkt wurde als N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und der NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert. Die Ergebnisse sind in Tabelle 10 aufgelistet.
Der e.Ü. von N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin wurde durch eine analytische HPLC mit einer chiralen Säule gemessen [Chiralpak AS (Daicel), 250 mm × 4,6 mm; Eluent: Hexan/Isopropanol (98:2); Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeiten: 16,0 min für die (S)-Form und 17,9 min für die (R)-Form]. Das erhalte Produkt hat einen 33%-igen e.Ü. (R).
Tabelle 10: Herstellung von (R)-N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin durch Hydroxylierung von N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin mit Ruhezellen (5,3 g/l) von HXN-200
Beispiel 15: Herstellung von optisch aktivem N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit wachsenden Zellen von HXN-200
Das Isolat HXN-200 wurde in 2 l E2-Medium in einem 3 l-Bioreaktor mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C auf eine Zelldichte von 4,0 g/l wachsen gelassen. Glukose (80 ml, 50%) wurde zugegeben, die Versorgung mit Octandampf beendet und N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin (3,505 g) zugegeben. Die Reaktion wurde für 3 h fortgesetzt und der pH zwischen 7,9-80 während dieses Zeitraums gehalten. Die HPLC-Analyse zeigte, dass 100% Umwandlung bei 3 h erreicht wurde. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände mit Ethylacetat extrahiert, nachdem der pH auf 9,0 eingestellt war. Die organische Phase wurde über MgSO₄ getrocknet und das Lösungsmittel verdampft. Dies ergab 95% (3,61 g) des reinen Produkts als weißes Pulver.
Beispiel 16: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin, N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin und N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin in vitro mit rohen Zellextrakten von HXN-200
Das Isolat HXN-200 wurde in 2 l E2-Medium in einem 3 l-Bioreaktor mit Octandampf als Kohlenstoffquelle geimpft und bei 30°C auf eine Zelldichte von 4,0 g/l wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und in Tris-HCl-Puffer (pH=8,0) auf eine Konzentration von 12,3 g/l resuspendiert. Nach dem Durchleiten durch eine French-Press wurde die Zelldebris durch Zentrifugieren bei 45.000 g für 45 Minuten entfernt. Zu diesem rohen Zellextrakt ohne Membranproteine wurde NADH (5 mM) gegeben. N-Benzylpyrrolidin, N-Benzyloxycarbonylpyrrolidin beziehungsweise N-tert.-Butoxycarbonylpyrrolidin wurde auf eine Endkonzentration von 5 mM zugegeben. Die Mischung wurde bei 30°C für 2 h geschüttelt. Analytische und Isolier-Verfahren waren wie zuvor beschrieben. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgelistet.
Tabelle 11: Herstellung von optisch aktivem N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin, N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin und N-tert.-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin mit Zellextrakten (CE) von HXN-200
Beispiel 17: Herstellung von N-Acetyl-3-hydroxypyrrolidin in vivo mit Ruhezellen von Cyclohexan-abbauendem Stamm
Ein Cyclohexan abbauender Stamm (isoliert mit Cyclohexan als Kohlenstoffquelle von Li, Z. et al., ETH Zürich; in der Stammsammlung des Instituts für Biotechnologie, ETH Zürich) wurde in 1/4 des Evans-Mediums ohne Kohlenstoffquelle geimpft und auf 10 Mal mit Luft verdünntem Cyclohexandampf als Kohlenstoffquelle bei Raumtemperatur für 3 Tage wachsen gelassen. Die Zellen wurden geerntet und auf 5 g/l in 50 mM K-Phosphatpuffer (pH=7,0) resuspendiert. N-Acetylpyrrolidin wurde auf eine Konzentration von 2 mM zugegeben und die Mischung bei 30°C für 1 Tag geschüttelt. Um der Reaktion zu folgen, wurden die Proben aus der Reaktionsmischung zu einer unterschiedlichen Zeit entnommen, die Zellen wurden durch Zentrifugieren entfernt und die Überstände durch analytische HPLC analysiert [Säule: Spherisorb ODS2 (5 μm), 125 mm × 4 mm; Eluent: Acetonitril/10 mM K-Phosphatpuffer (pH 7,0) 5/95; Durchflussgeschwindigkeit; 1 ml/min; Detektionswellenlänge: 210 nm; Retentionszeit von N-Acetyl-3-hydroxypyrrolidin: 2,3 min; Retentionszeit von N-Acetylpyrrolidin: 7,9 min]. 4% Produkt wurde nach 1,5 h erhalten. Das Produkt wurde als N-Acetyl-3-hydroxypyrrolidin durch Vergleichen der GC-MS-Spektren und NMR-Spektren mit jenen der authentischen Verbindung identifiziert.

Claims

Verfahren zur Herstellung eines optisch aktiven 3-Hydroxypyrrolidins oder N-substituierten 3-Hydroxypyrrolidins, worin ein Sauerstoffatom stereoselektiv in die entsprechende nicht-hydroxylierte Pyrrolidinverbindung unter Verwendung eines Bakteriums mit Hydroxylierungsaktivität oder eines Enzyms mit Hydroxylierungsaktivität, das aus diesem Bakterium abgeleitet ist, als Biokatalysator eingeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus Alkan abbauenden Bakterien ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus n-Alkan mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen abbauenden Bakterien ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus n-Octan abbauenden Bakterien ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 2, worin das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus n-Hexan abbauenden Bakterien ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus monoalicyclischen Verbindungen mit 4 bis 20 Kohlenstoffatomen abbauenden Bakterien ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus Bakterien mit Alkanhydroxylase(n) ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus den Gattungen Pseudomonas, Mycobakterium, Corynebakterium, Nokardia, Spingomonas, Gordona, Rhodococcus, Bacillus, Streptomyces, Sebekia und Methylococcus ausgewählt ist.
Verfahren nach Anspruch 8, worin das Bakterium aus der Gruppe bestehend aus Pseudomonas oleovorans-Stämmen und Pseudomonas putida-Stämmen ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, worin der Biokatalysator ein rekombinantes Bakterium ist, das das(die) zur Hydroxylierung notwendige(n) Gene) aufweist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das(die) zur Hydroxylierung notwendige(n) Gene) ein oder mehr Alkanhydroxylasegen(e) aus einem Alkan abbauenden Bakterium umfasst umfassen).
Verfahren nach Anspruch 11, worin das Alkan abbauende Bakterium ein Pseudomonas oleovorans-Stamm ist.
Verfahren nach Anspruch 10, worin das rekombinante Bakterium ein rekombinanter Escherichia coli-Stamm ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin inaktive Bakterienzellen, wachsende Bakterienzellen oder beide als Biokatalysator verwendet werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 13, worin ein roher Zellextrakt oder eine gereinigte oder teilweise gereinigte Enzympräparation als Biokatalysator verwendet wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 15, worin der Biokatalysator auf oder in einem wasserunlöslichen Carrier oder Trägersystem immobilisiert ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die biokatalytische Reaktion in einem wäßrigen Medium ausgeführt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 16, worin die biokatalytische Reaktion in einem Multiphasen-Medium, das zwei oder mehr der folgenden Phasen: eine feste Phase, eine wäßrige Phase, eine organische Phase und eine gasförmige Phase enthält, ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 18, worin eine organische Phase verwendet wird, die ein oder mehr Alkan(e) mit 5 oder mehr C-Atomen, Dialkylether mit 4 oder mehr C-Atomen oder aromatische oder heteroaromatische Kohlenwasserstoffe enthält(enthalten).
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 19, worin die Reaktionstemperatur 5 bis 50°C, vorzugsweise 20 bis 40°C, beträgt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 20, worin der pH des Mediums 4 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8, ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Produkt durch Säulenchromatographie mit einem anorganischen, organischen oder synthetischen Absorbens als Träger abgetrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Produkt durch Extraktion abgetrennt wird, wobei das Substrat zuerst aus dem Reaktionsgemisch durch Extraktion mit einem weniger polaren Lösungsmittel gewonnen, die verbleibende Reaktionsmischung auf pH 10 bis 12 eingestellt und das Produkt mit einem höher polaren Lösungsmittel extrahiert wird.
Verfahren nach Anspruch 23, worin das verwendete Extraktionsmittel aus der Gruppe bestehend aus Alkanen mit 5 oder mehr C-Atomen, Dialkylethern mit 4 oder mehr C-Atomen, chlorhaltigen Alkanen mit 3 oder weniger C-Atomen, aromatischen Alkylen mit 7 bis 10 C-Atomen und Carbonsäureestern mit 3 oder mehr C-Atomen ausgewählt ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, worin das Produkt durch Verwendung einer Membranfiltration abgetrennt wird.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, worin das optisch aktive N-substituierte 3-Hydroxypyrrolidin N-Benzoyl-3-hydroxypyrrolidin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, worin das optisch aktive N-substituierte 3-Hydroxypyrrolidin N-Benzyloxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, worin das optisch aktive N-substituierte 3-Hydroxypyrrolidin N-Phenoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, worin das optisch aktive N-substituierte 3-Hydroxypyrrolidin N-tert-Butoxycarbonyl-3-hydroxypyrrolidin ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 25, worin das optisch aktive N-substituierte 3-Hydroxypyrrolidin N-Benzyl-3-hydroxypyrrolidin ist.