DE69529514T2

DE69529514T2 - Verfahren zur herstellung von (r)-2-amino-1-phenylethanol oder seinen halogenierten derivaten, verfahren zur herstellung von optisch aktivem phenylserin und seinen halogenierten derivaten, und die neuartige verbindung 3-(3-chlorophenyl)serin

Info

Publication number: DE69529514T2
Application number: DE69529514T
Authority: DE
Inventors: Takeshi Hamatani; Naoki Kawada; Teruyuki Nikaido; Yoichiro Ueda
Original assignee: Daicel Chemical Industries Ltd
Current assignee: Daicel Corp
Priority date: 1994-03-03
Filing date: 1995-03-02
Publication date: 2003-11-20
Anticipated expiration: 2015-03-03
Also published as: JP3532922B2; WO1995023869A1; US5846792A; EP0751224B1; US5731175A; EP0751224A4; US5874613A; DE69529514D1; EP0751224A1

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seiner Halogensubstitutionsprodukte und von optisch aktivem Phenylserin und seiner Halogensubstitutionsprodukte, die durch die Formel (2) dargestellt sind, wobei ein Enzym oder Mikroorganismus verwendet wird. Die vorliegende Erfindung betrifft ebenfalls eine chemische Verbindung 3-(3-Chlorphenyl)serin, das ein Substrat für die Reaktion des Enzyms oder des Mikroorganismus ist. (R)- 2-Amino-1-phenylethanol oder seine Halogensubstitutionsprodukte, die durch die Formel (2) dargestellt sind, sind industriell als Rohmaterialien für medizinische und landwirtschaftliche Chemikalien, insbesondere für Antifettsuchtmedikamente geeignet. Das optisch aktive Phenylserin und seine Halogensubstitutionsprodukte sind als Rohmaterialien für Medikamente, insbesondere Antibiotika, geeignet. Formel (2)
worin X, H, F, Cl, Br oder I bedeutet und an jeder der ortho-, meta- und para-Stellungen lokalisiert sein kann.

Hintergrund der Erfindung

Es gab bereits im Stand der Technik verschiedene Verfahren zur Herstellung von (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seiner Substitutionsprodukte, die durch die Formel (2) dargestellt sind. Die folgenden Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 2- Amino-1-phenylethanol oder seiner Halogensubstitutionsprodukte sind bekannt:
(1) Die optische Auflösung mit Lipase (J. Chem. Soc. Perkin Trans., 1, 1759-1762 (1992));
(2) Die Herstellung von (R)-Mandelonitril mit (R)- Oxynitrilase und dann Reduzieren mit LiAlH&sub4; (Synthesis, (7), 575-578 (1990));
(3) Die asymmetrische Reduktion von α-Chloracetophenon mit Bäckerhefe und dann Aminieren des Produkts (Indian J. Chem., Sect. B 31B(12), 821-823 (1992));
(4) Das Aminieren eines optisch aktiven Styroloxids (Japanese Patent Laid-Open Publication No. Sho. 61-85197);
(5) Die selektive Kristallisation der (R)-Form eines 3- Aminobenzoats (Nippon Kagaku Kaishi (5), 910-913 (1985));
(6) Die asymmetrische Reduktion von Benzoylcyanid in Gegenwart von Alpinboran, um die R-Form zu erhalten (J. Org. Chem., 50, 3237-3239 (1985));
(7) Die asymmetrische Reduktion in Gegenwart eines Binaphthylphosphin-Katalysators mit einer Alkalisulfonatsubstitution (Japanese Patent Laid-Open Publication No. Hei 5-170780).
Das folgende Verfahren zur Herstellung von (R)-2-Amino-1-(3- chlorphenyl)ethanol ist die einzige bekannte Methode:
(8) Vermischen einer Lösung aus N-tert.-(Butoxycarbonyl)-D- alanin und einer Lösung aus 2-Amino-1-(3-Chlorphenyl)- ethanol-Racemat, das ein Diasteroisomerensalz bildet und anschließende optische Auflösung des Salzes mit einer vorzugsweisen Kristallisation eines Salzes von (R)- 2-Amino-1-(3-chlorphenyl)ethanol und N-(tert.- Butoxycarbonyl)-D-alanin (offengelegte Europäische Patentveröffentlichung Nr. 294995).
Die folgenden Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem Serin und seiner Halogensubstitutionsprodukte sind bekannt:
(9) Die Durchführung einer Aldolkondensation von 3-Formyl- 3-hydroxy[2.2]para-cyclophan (Angew. Chem., 106 (1), 106-108 1994));
(10) Die Durchführung einer Aldolkondensation mit Aldolase oder wechselseitige Behandlung eines Racemats mit Aldolase und Zurücklassen eines Enantiomeren (offengelegte japanische Patentveröffentlichungen Nr. Hei 6-165693 und Nr. Hei 6-125786; Japanische Patentveröffentlichung Nr. Sho 52-46313; Can. J. Chem., 72 (1), 114-117 (1994));
(11) Die Verwendung eines künstlichen Enzyms, das ein Lipid mit (S)-Binaphthol und (S)-Alanin, ein Pyridoxalderivat und Kupfer(II) umfasst, (Chem. Lett., (1), 55-58 (1994));
(12) Die optische Auflösung eines N-phenylacetylierten Derivats unter Verwendung von Penicillinacylase (Bioorg. Khim., 19 (4), 478-483 (1993));
(13) Die Verwendung von Serinhydroxymethyltransferase (Tetrahedron, 48(12), 2507-2514 (1992));
(14) Die Bromierung eines N-Phthaloyl-α-aminosäureesters unter Verwendung von N-Bromsuccinimid und anschließende Umsetzung mit AgNO&sub3; (Tetrahedron Lett., 31 (48), 7059- 7062 (1990));
(15) Das Kondensieren einer Isocyanocarbonsäure und eines Aldehyds in Gegenwart eines optisch aktiven Ferrocens und eines Goldkomplexes unter Bildung von optisch aktivem Oxazolin und anschließende Hydrolyse des optisch aktiven Oxazolins (offengelegte japanische Patentveröffentlichung Nr. Sho 63-60977);
(16) Die Durchführung einer Aldolkondensation eines Aldehyds und eines Ni(II)-Komplexes einer Schiff'schen Base aus (S)-o-[N-Benzylprolyl) amino]benzophenon und Glyzin (J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 (24), 3143-3155 (1993)).
In der DE-OS 25 05 154 ist ein Verfahren für die Herstellung einer Fungidecarboxylase (Pilzdecarboxylase) für aromatische Aminosäuren und ihre Verwendung zur Gewinnung aromatischer Amine beschrieben. Durch die Wirkung der Fungidecarboxylase wird die L-Form in das Amin umgewandelt, während die D- Aminosäure unumgesetzt verbleibt. Ein Beispiel für 3- Phenylserin ist in Tabelle 1 beschrieben.
Für das 3-(3-Chlorphenyl)serin, ein Substrat für die Umsetzung in der vorliegenden Erfindung, ist bereits seine Erythroform beschrieben worden (R. J. Ulevitch und R. G. Kallen, Bioche¬ mistry, 16(24), 5355-5363 (1977)), allerdings ist keine de¬ taillierte Synthesemethode beschrieben.
Die herkömmlichen Verfahren zur Herstellung von (R)-2-Amino-1- phenylethanol oder seiner Halogensubstitutionsprodukte weisen die folgenden Probleme auf:
Bei der Methode (1) ist das verwendete Enzym teuer, die Abtrennung des Produktes ist nicht so einfach und die Ausbeute ist nicht hoch.
Ebenfalls ist bei der Methode (2) das Enzym teuer und es muss bei hoher Konzentration von 10.000 U/l eingesetzt werden.
Bei der Methode (3) sind sowohl die Reaktionsausbeute als auch die Substratkonzentration gering.
Bei der Methode (4) ist die Menge des durch die mikrobielle Reaktion hergestellten optisch aktiven Ethylenoxids sehr ge¬ ring, was zu hohen Kosten führt.
Bei der Methode (5) ist die Löslichkeit des Benzoats gering, und die Menge der in einem Batch erhaltenen Kristalle ist klein, was wiederum nicht wirtschaftlich ist.
Bei der Methode (6) ist das Alpinboran teuer, und seine opti¬ sche Reinheit ist nicht ausreichend hoch.
Bei der Methode (7) ist der Binaphthylphosphin-Katalysator sehr teuer.
Bei der Methode (8) erfordert das sehr teuere N-Boc-D-alanin eine effiziente Gewinnungsmethode, wodurch sich die industrielle Anwendung ausschließt.
Wie oben beschrieben wurde, können die herkömmlichen Methoden keine industrielle und wirtschaftliche Herstellung von (R)-2- Amino-1-phenylethanol und seinen Halogensubstitutionsprodukten, die durch die Formel (2) dargestellt sind, ermöglichen. Deswegen gibt es einen Bedarf dahingehend, eine Methode für die Herstellung von (R)-2-Amino-1-phenylethanol und seinen Ha¬ logensubstitutionsprodukten, die auch industriell eingesetzt werden können, zu entwickeln.
Die herkömmlichen Methoden für die Herstellung von optisch ak¬ tivem Serin und seinen Halogensubstitutionsprodukten weisen die folgenden Probleme auf:
Bei den Methoden (9), (11), (15) und (16) muss eine große Men¬ ge an optisch aktivem Katalysator synthetisiert werden. Somit wird diese Synthese von Schwierigkeiten und hohen Kosten begleitet. Deswegen sind diese Methoden nicht praktisch. Die Konfiguration der beiden aufeinanderfolgenden asymmetrischen Zentren kann nicht vollständig gesteuert werden. Demzufolge muss das Produkt weiterhin mit anderen Mitteln, wie der Säulenchromatographie, gereinigt werden. Außerdem erfordert diese Reaktion zeitweise eine sehr geringe Temperatur von -80ºC.
Bei den Methoden (10) und (13) ist die Konzentration des erhaltenden Produkts niedrig, und das eingesetzte Aldehyd kann die Inaktivierung des Enzyms verursachen. Bei diesen Synthesereaktionen kann die Konfiguration an der Stellung 3 nicht gesteuert werden.
Bei der Methode (12) ist das Enzym selbst teuer.
Bei der Methode (14) beträgt das Verhältnis der (2S,3R)-Form zu (2S,3S)-Form 5 : 1. Die Stereoselektivität ist nicht zufriedenstellend, und des weiteren erfordert die Umsetzung viele Schritte.
Wie oben gezeigt wurde, ermöglichen die herkömmlichen Methoden keine industriell wirtschaftliche Produktion von optisch aktivem Phenylserin und seinen Halogensubstitutionsprodukten.
Die Tyrosindecarboxylase (EC 4.1.1.25) kommt in Mikroorganismen vor, und sie bereits als Enzym bekannt, das die Reaktion katalysiert, bei der L-Tyrosin in Tyramin umgewandelt wird. Pyridoxal-5'-phosphat ist ein Coenzym dieses Enzyms (E. A. Boeker und E. E. Snell, "The Enzyme" Band 6, Seiten 217-253, Academic Press, New York, (1972)). Die Aktivität von Tyrosincarboxylase wird bei den Genuses Lactobacillus, Pseudomonas und Enterococcus beobachtet. Insbesondere ist Enterococcus faecalis im großen Umfang dafür bekannt, dass er eine hohe Aktivität aufweist. Verschiedene Studien zur Substratspezifität dieser Enzyme sind bereits veröffentlicht worden. Bei den meisten wurden die Substrate, worin das Wasserstoffatom der Phenylgruppe in den Tyrosinmolekülen an der para-Stelle oder an den para- und meta-Stellen ersetzt ist, untersucht (beispielsweise R. Ferrini und A. Glasser, Biochem. Pharmacol., 13, 798- 801 (1964)). Es ist überhaupt kein Substrat, bei dem das Wasserstoffatom durch eine Hydroxylgruppe in der β-Position ersetzt ist, untersucht worden. Die japanische Patentveröffentlichung Nr. Sho 52-31428 beschreibt, dass eine aromatische Aminosäuredecarboxylase aus Mikroorganismen des Genus Micrococcus schwach auf DL-3-Phenylserin wirkt. Allerdings ist weder die optische Reinheit noch die genaue Konzentration des Produkts beschrieben. Es wurde bereits berichtet, dass ein Mikroorganismus des Genus Fusarium die Aktivität von Phenylalanindecarboxylase (M. Ferencik und K. Ladzianska, Folia Microbiology, 13, 414-418 (1968)) aufweist. Allerdings ist nicht geklärt worden, welche Spezies die Phenylalanin-Decarboxylaseaktivität aufweist, noch ist beschrieben worden, ob der Mikroorganismus auf ein Substrat, das durch die vorliegende Erfindung zur Verfügung gestellt wird, wirkt. Es gab bisher keine Untersuchungen dahingehend, ob ein Mikroorganismus des Genus Gibberella die Aktivität einer Aminosäuredecarboxylase aufweist.
Demzufolge waren bisher die folgenden Sachverhalte noch nicht bekannt:
Die Tyrosindecarboxylase oder Mikroorganismen der Genuses Enterococcus, Lactobacillus, Providencia, Fusarium und Gibberella wirken auf Enantiomerenmischungen aus threo-3-Phenylserin oder seinen Substitutionsprodukten, um (R)-2-Amino-1- phenylethanol oder seine Halogensubstitutionsprodukte herzustellen. Zur gleichen Zeit bleibt einer der Enantiomere von threo-3-Phenylserin oder von seinen Halogensubstitutionsprodukten selektiv übrig, um optisch aktives threo-3-Phenylserin und seine Halogensubstitutionsprodukte zu produzieren.

Offenbarung der Erfindung

Um die oben erwähnten Probleme zu lösen, haben sich die Erfinder darauf konzentriert, die Substratsynthese, die Wirtschaftlichkeit, die Stereoselektivität einer Reaktion durch Mikroorganismen und die stereoselektive Decarboxylierungsreaktion durch Enzyme zu vereinfachen, und sie haben darüber intensive Untersuchungen durchgeführt. Die Erfinder haben festgestellt, dass die Tyrosindecarboxylase oder die Mikroorganismen der Genuses Enterococcus, Lactobacillus, Providencia, Fusarium und Gibberella auf eine Mischung der Enantiomeren von threo-3- Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten, die durch die Formel (1) dargestellt sind, wirkten und (R)-2- Amino-1-phenylethanol oder seine Halogensubstititionsprodukte in den ortho-, meta- und para-Stellungen des aromatischen Rings, die durch die Formel (2) dargestellt sind, mit einer optischen Reinheit von fast 100% produzierten. Sie haben außerdem festgestellt, dass eines der Enantiomeren von threo-3- Phenylserin oder seiner Halogensubstitutionsprodukte gleichzeitig selektiv verblieben war, um das optisch aktive threo-3- Phenylserin oder seine Halogensubstitutionsprodukte zu produzieren. Auf diese Weise wurde die vorliegende Erfindung vollendet. Formel (1) Formel (2)
worin X, H, F, Cl, Br oder I bedeutet und an jeder der ortho-, meta- und para-Stellungen lokalisiert sein kann.
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seiner halogensubstituierten Produkte, von optisch aktivem Phenylserin und von seinen Halogensubstitutionsprodukten und eine neue chemische Verbindung 3-(3-Chlorphenyl)serin zur Verfügung. Nach der vorliegenden Erfindung wird eine Mischung aus den Enantiomeren von threo-3-Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten, die durch die Formel (1) dargestellt sind, mit Tyrosindecarboxylase oder Mikroorganismen der Genuses Enterococcus, Lactobacillus, Providencia, Fusarium und Gibberella, die in der Lage sind, die obigen Verbindungen stereospezifisch zu decarboxylieren, um (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seine Halogensubstitutionsprodukte in den ortho-, meta- und para-Stellungen des aromatischen Rings, die durch die Formel (2) dargestellt sind, behandelt und gesammelt. Gleichzeitig bleibt eines der Enantiomere von threo-3-Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten selektiv übrig, und das optisch aktive threo- 3-Phenylserin oder seine Halogensubstitutionsprodukte werden gesammelt.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Tyrosindecarboxylase kann aus jeder Quelle stammen. Tyrosindecarboxylase aus einem Mikroorganismus, wie Enterococcus faecalis oder Enterococuss hirae wird leicht hergestellt, und daher auch bevorzugt eingesetzt. (Streptococcus faecalis ist der frühere Name von Enterococcus faecalis. Die Tyrosindecarboxylase von Streptococcus faecalis ist tatsächlich ein Enzym aus einem Organismus des Genus Enterococcus. Nach der 1981 revidierten Klassifikation ist der Genus Enterococcus vom Genus Streptococcus abgekoppelt worden. Nach "Bergey's Manual of Systematic Bacteriology (1986)" wird der frühere Streptococcus faecalis als Enterococcus faecalis klassifiziert).
Der in der vorliegenden Erfindung verwendete Mikroorganismus ist aus einer Gruppe von Mikroorganismen gewählt, die zu den Genuses Enterococcus, Lactobacillus, Providencia, Fusarium und Gibberella gehört, und jeder davon, der in der Lage ist, auf threo-3-Phenylserin oder seine Halogensubstitutionsprodukte zu wirken, um (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seine Halogensubstitutionsprodukte, die durch die Formel (2) dargestellt sind, zu wirken, können verwendet werden. In der Erfindung werden sie beispielhaft als Enterococcus faecalis (NRIC 1141) oder Enterococcus hirae (IFO 3181), Lactobacillus brevis (NRIC 1037), Providencia stuatii (IFO 12930), Fusarium anguioides (IFO 4467), Gibberella fujikuroi (IFO 9977, IFO 30336, IFO 30337, IFO 31251, NRIC 1240), Gibberella zeae (IFO 7772), Gibberella lateritium (IFO 7188) oder Gibberella acuminata (IFO 30307) erwähnt. Ein Wildtypstamm, ein Mutantenstamm oder ein durch Zellfusion oder Genmanipulation induzierter rekombinanter Stamm dieser Organismen kann bevorzugt verwendet werden.
Mikroorganismen mit IFO-Nummern sind in der "List of Cultures, 9th ed. (1992)" veröffentlicht durch das The Institute for Fermentation Osaka, beschrieben, und können vom Institut erhalten werden. Mikroorganismen mit NRIC-Nummern sind in "Microbial Strain Catalog, 2. Ausgabe (1992)", veröffentlicht durch die Tokio University of Agriculture beschrieben und können von der Universität erhalten werden.
Nach den Beschreibungen auf den Seiten 312-320 der "List of Cultures, 9. Ausgabe (1992)", veröffentlicht durch das The Institute for Fermentation Osaka und den Seiten 518-522 (Bd. 1) und den Seiten 1055-1059 (Bd. 2) von "Illustratet Referece Book of Fungi", geschrieben von Shunichi Udagawa et al., Kodansha (1978) wird die konidiale Generation von Gibberella fujikuroi als Fusarium moniliforme identifiziert und diejenige von Gibberella zeae als Fusarium graminearum und diejenige von Gibberella lateritium als Fusarium lateritium. Deswegen ist klar, dass die Spezies, die durch die Namen der vollständigen Generation der obigen Mikroorganismen angegeben sind, denen entsprechen, die durch die Namen ihrer entsprechenden konidialen Generation angegeben sind. Die Verwendung von Fusarium moniliforme, Fusarium graminearum oder Fusarium lateritium ist ebenfalls eindeutig im Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen.
Das Medium, das für die Kultivierung der Mikroorganismen der vorliegenden Erfindung verwendet wird, unterliegt keinen besonderen Einschränkungen, so lange die Mikroorganismen im Medium proliferieren können. Als Kohlenstoffquelle für die obigen Mikroorganismen können beispielsweise Saccharide, wie Glukose, Fruktose, Saccharose und Dextrin; Alkohole, wie Sorbit und Glyzerin; organische Säuren, wie Fumarsäure, Zitronensäure, Essigsäure und Propionsäure und deren Salze; Kohlenwasserstoffe, wie Paraffin oder Mischungen aus diesen Chemikalien verwendet werden. Als Stickstoffquelle können beispielsweise Ammoniumsalze von anorganischen Säuren, wie Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat, Ammoniumsalze von organischen Säuren, wie Ammoniumfumarat und Ammoniumcitrat, anorganische oder organische Chemikalien, die Stickstoff enthalten, wie Fleischextrakt, Hefeextrakt, Maisquellflüssigkeit, Caseinhydrolysate und Harnstoff oder Mischungen aus diesen Chemikalien eingesetzt werden. Nährstoffquellen, die im Allgemeinen für eine Mikroorganismuskultur verwendet werden, wie anorganische Salze, Salze von essentiellen Spurenmetallelementen, und Vitamine, können in geeigneter Weise zum Medium hinzugegeben werden. Faktoren, die die Proliferation der Mikroorganismen fördern, Aminosäurequellen, die die Produktivität des jeweiligen, von der vorliegenden Erfindung zur Verfügung gestellten Produkte vergrößern, wie Serin, Tyrosin, Valin, Leucin, Alanin, Isoleucin, Glycin, Phenylalamin, Tryptophan, threo-3- Phenylserin oder seine Halogensubstitutionsprodukte, Vitamin B&sub6;-assoziierte Faktoren, wie Pyridoxal-5'-phosphat und Pyridoxalhydrochlorid oder CaCO&sub3; zur effektiven Aufrechterhaltung des pH-Werts des Mediums, können hinzugegeben werden. Beispielsweise ist ein Bouillonmedium für Bakterien, MRS- Medium oder GYP-Medium für Milchsäurebakterien und YM-Medium oder Kartoffel/Saccharose-Medium für Schimmelpilze (siehe Seiten 452-453 von "List of Cultures 9. Ausgabe (1992)", Veröffentlichung durch das The Institut for Fermentation Osaka, oder Seiten 51-52 von "Microbial Strain Catalog, 2. Ausgabe, (1992)" Veröffentlichung durch die Tokyo University of Agriculture) geeignet.
Die Mikroorganismen werden in einem pH-Bereich von 3,0 bis 11,0, bevorzugt 4 bis 8, im Temperaturbereich von 20-45ºC, bevorzugt 25 bis 37ºC und unter Bedingungen, die in geeigneter Weise für anaerobe oder aerobe Bakterien gewählt sind, über 5 bis 120 Stunden, bevorzugt 24 bis 96 Stunden kultiviert.
DL-threo-3-Phenylserin oder seine Halogensubstitutionsprodukte können ohne weiteres nach einem bekannten Verfahren (siehe beispielsweise K. N. F. Shaw und S. W. Fox, J. Amer. Chem. Soc., 75, 3421-3423 (1953)) synthetisiert werden. Literatur, die die tatsächliche Synthese von 3-(3-Chlorphenyl)serin beschreibt, ist bisher noch nicht bekannt gewesen.
Ein Substrat, eine Mischung aus den Enantiomeren von threo-3- Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten, die durch die Formel (1) dargestellt sind, wird in einem Konzentrationsbereich hinzugegeben, wobei eine Substratinhibierung nicht auf einmal, in Abständen oder kontinuierlich vorkommt. Die Endkonzentration des hinzugegebenen Substrats beträgt in der Regel 0,01 bis 20% (W/W). Das Substrat kann hinzugegeben werden, nachdem es in Wasser gelöst oder dispergiert, in einem organischen Lösungsmittel, das die Reaktion nicht negativ beeinträchtigt, gelöst oder in einem oberflächenaktiven Mittel dispergiert worden ist.
Wenn Tyrosindecarboxylase verwendet wird, variiert ihre Konzentration für die Umsetzung in Abhängigkeit der Konzentration des Substrats, und sie beträgt normalerweise 0,005 bis 5,0 Einheiten/ml. (Eine Einheit Enzymaktivität bedeutet, dass ein Mikromol eines Substrats bei einem pH von 5,5 bei 37ºC für 1 Minute decarboxyliert werden kann). Ein im Handel erhältliches Enzym, ein Enzym, das weiterhin aus einer im Handel verfügbaren Präparation gereinigt ist, oder ein Enzym, das aus einem Bakterium durch eine Kombination bekannter Reinigungsverfahren hergestellt ist, kann eingesetzt werden. Die Reaktion kann durchgeführt werden, indem das Enzym in einem Reaktionsgemisch dispergiert oder gelöst verwendet wird, oder man verwendet das Enzym, das auf Carrageenangel, Alginatgel, Polyacrylamidgel, Cellulose, Agar oder dergleichen nach einer bekannten Methode immobilisiert ist. Die Enzymreaktion kann in einem Bioreaktor, der mit einer Ultrafiltrationsmembran ausgerüstet ist, durchgeführt werden.
Wenn die Mikroorganismen verwendet werden, kann eine Mischung aus den Enantiomeren des threo-3-Phenylserins oder seiner Halogensubstitutionsprodukte direkt in das Medium, das für die Kultivierung der Mikroorganismen verwendet wurde, gegeben werden. Alternativ werden die Mikroorganismen durch Zentrifugation abgetrennt und in einer gepufferten Lösung oder Wasser, mit oder Nachwaschen, dispergiert. Die Mischung aus den Enantiomeren von threo-3-Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten wird in die Dispersion gegeben. Lebende Organismen und auch Homogenate der Mikroorganismen und Aceton behandelte, Toluol behandelte oder lyophilisierte Zellen der Mikroorganismen können verwendet werden. Lebende oder behandelte Zellen der Mikroorganismen können auf Carrageenangel, Alginatgel, Polyacrylamidgel, Cellulose, Agar oder dergleichen nach einem bekannten Verfahren immobilisiert sein, um damit die vorliegende Erfindung auszuführen. Die lebenden oder behandelten Zellen der Mikroorganismen sind in der Lage, in einem Reaktor mit einer Ultrafiltrationsmembran zu wirken. Die Zugabe eines oberflächenaktiven Mittels, wie Cetylpyridiniumchlorid, Cetyltrimethylammoniumbromid, Triton X® oder Tween, bei einer Konzentration von 0,001 bis 0,5% kann zu einem verbesserten Permeationsvermögen des Substrats. der Enantiomeren von threo- Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten in den mikrobiellen Körper führen.
Die folgenden Bedingungen sind bei der Anwendung von Mikroorganismen (entweder lebende oder behandelte Zellen) und den Enzyms üblich:
So kann der Austausch des Gases über dem Reaktionsgemisch durch Stickstoff oder das Abdichten der Reaktionsflüssigkeit durch Aufbringen von flüssigem Paraffin auf der oberen Oberfläche, um zu verhindern, dass Sauerstoff mit dem Reaktionsgemisch in Kontakt gerät, zu einem günstigen Ergebnis führen. Die Reaktion wird in der Regel im Temperaturbereich von 5 bis 70ºC, bevorzugt 20 bis 40ºC für die Genuses Lactobacillus und Providencia, 45 bis 60ºC für die Genuses Enterococcus, Gibberella und Fusarium und 25 bis 60ºC für Tyrosindecarboxylase durchgeführt. Der pH des Reaktionsgemisches wird in geeigneter Weise auf einen Wert in einem Bereich gesetzt, wo das Enzym das Substrat decarboxylieren kann. Der pH wird in der Regel bei 4 bis 11, bevorzugt 5 bis 9 mit einer gepufferten Lösung oder pH-Stat gehalten. Die Mischung kann unter statischen, geschüttelten oder gerührten Bedingungen durchgeführt werden. Das für die Reaktion verwendete Lösungsmittel ist normalerweise Wasser. Ein organisches Lösungsmittel, wie Alkohol, kann verwendet werden, solange seine Zugabe nicht die Umsetzung negativ beeinflusst. Der hergestellte (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seine Halogensubstitutionsprodukte können gesammelt werden und durch eine Kombination üblicher Methoden, wie Ultrafiltration, Einengung, Säulenchromatographie, Extraktion und Kristallisation, gereinigt werden. Das verbleibende optisch aktive throe-3-Phenylserin oder seine Halogensubstitutionsprodukte können gesammelt werden und nach einer ähnlichen Methode aufgereinigt werden.

Beschreibung der bevorzugten Ausführungsform

Nachfolgend wird nun eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung beschrieben, allerdings sollte der Umgang der vorliegenden Erfindung nicht auf die bevorzugte Ausführungsform eingeschränkt sein. Die optischen Reinheiten von (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seinen Halogensubstitutionsprodukten und vom optisch aktiven threo-3-Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten wurden durch HPLC [Säule: CROWNPAK (+) (Daicel Chemical Industries, Ltd.; Innendurchmesser: 4,6 mm, Länge: 15 mm, mobile Phase: Perchlorsäurelösung bei pH 2,0 (pH 1,0)), Fließrate: 1,0 ml/Min., Temperatur: 10ºC (5ºC), Nachweis: UW bei 254 nm (die Messung für das optisch aktive threo-Phenylserin oder seine Halogensubstitutionsprodukte wurden unter den in den Klammern beschriebenen Bedingungen durchgeführt.)] gemessen. Die Quantifizierung von (R)-2- Amino-1-phenylethanol und seinen Halogensubstitutionsprodukten und des optisch aktiven threo-3-Phenylserins und seiner Halogensubstitutionsprodukte wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter Verwendung einer ODS-Säule [Säule: Wakosil ODS II HG (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.; Innendurchmesser: 4,6 mm, Länge: 250 mm, mobile Phase: 50 mMol Kaliumphosphat gepufferte Lösung bei pH 2,5/Acetonitril (9/1, V/V)), Fließrate: 1,0 ml/Min. Temperatur: 50ºC, Nachweis: UV bei 254 nm] durchgeführt.
Die in den Beispielen dieser bevorzugten Ausführungsform verwendeten Kulturmedien "Mikroorganismuskulturmedium 1A", "Mikroorganismuskulturmedium 1B", "Mikroorganismuskulturmedium 2", "Mikroorganismuskulturmedium 3", "Mikroorganismuskulturmedium 4", "Mikroorganismuskulturmedium 5" und "YM-Medium" wurden wie folgt hergestellt:

Mikroorganismuskulturmedium 1A:

Vermischen von 5 g Glukose, 5 g Hefeextrakt (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.), 5 g Polypepton (Nihon Seiyaku Co., Ltd.), 1 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,2 g DL-threo-3-(3-Chlorphenyl)- serin und 0,1 g Pyridoxalhydrochlorid bis zu einem Gesamtvolumen bis zu 1.000 ml mit deionisiertem Wasser und Einstellen des pH auf 7,0.

Mikroorganismuskulturmedium 1B:

Mischen von 5 g Glukose, 5 g Hefeextrakt (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.), 5 g Polypepton (Nihon Seiyaku Co., Ltd.), 1 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,2 g L-Tyrosin und 0,1 g Pyridoxalhydrochlorid bis zu einem Gesamtvolumen bis 1.000 ml mit deionisiertem Wasser und Einstellen des pH auf 7,0.

Mikroorganismuskulturmedium 2:

Mischen von 5 g Glukose, 0,7 g KH&sub2;PO&sub4;, 1,3 g (NH&sub4;)&sub2;HPO&sub4;, 0,5 g MgSO&sub4; 7H&sub2;O, 3 g Hefeextrakt (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.), 5 g Polypepton (Nihon Seiyaku Co., Ltd.) und 0,2 g DL-threo-3-(3-Chlorphenyl)serin, wobei das Gesamtvolumen auf 1.000 ml mit deoinisiertem Wasser gebracht wurde, und Einstellen des pH auf 7,2.

Mikroorganismuskulturmedium 3:

Mischen von 20 Glyzerin, 3 g Hefeextrakt (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.), 5 g Polypepton (Nihon Seiyaku Co., Ltd.), 3 g Malzextrakt (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.) und 0,1 g Pyridoxalhydrochlorid und 1.000 ml deionisiertem Wasser, und Einstellen des pH auf 7,0.

Mikroorganismuskulturmedium 4:

Mischen von 5 g Glyzerin, Kartoffelextrakt von 200 g Kartoffeln (hergestellt durch Schneiden von 200 g geschälten Kartoffeln in Würfel von 1 cm, Kochen derselben in 1.000 ml hinzugegebenem Wasser über 20 Minuten und anschließendes Filtrieren mit Gaze) und 0,1 g Pyridoxalhydrochlorid, wobei das Gesamtvolumen auf 1000 ml mit deionisiertem Wasser gebracht wurde und Einstellen des pH auf 5,6.

Mikroorganismuskulturmedium 5:

Mischen von 24 g Glukose, 19,2 g Hefeextrakt (Asahi Breweries, Ltd.), 1,3 g KH&sub2;PO&sub4;, 2,4 g (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 7H&sub2;O, 1,3 g MgSO&sub4;·7H&sub2;O, 0,016 g FeSO&sub4; 7H&sub2;O, 0,016 g ZnSO&sub4; 7H&sub2;O und 0,3 g FS Antischaum 028 (Dow Corning Inc.), wobei das Gesamtvolumen auf 1.000 ml mit deionisiertem Wasser gebracht wurde und Einstellen des pH auf 6,0.

YM-Medium:

10 g Glukose, 3 g Hefeextrakt (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.), 3 g Malzextrakt (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.) und 5 g Polypepton (Nihon Seiyaku Co., Ltd.), wobei das Gesamtvolumen auf 1.000 ml mit deionisiertem Wasser gebracht wurde und Einstellen des pH auf 6,0.

[Beispiel 1]

Synthese von threo-3-(3-Chlorphenyl)serin

Es wurden Natriumhydroxid (80 g, 2,0 Mol), Glyzin (100 g, 1,33 Mol), und Wasser (330 ml) in einen 2 Liter Trennkolben gegeben und auf 15ºC in einem kalten Wasserbad abgeschreckt. In diese Mischung wurde auf einmal m-Chlorbenzaldehyd (375 g, 2,66 Mol) gegeben und der Inhalt wurde heftig gerührt. Es erschienen allmählich weiße Feststoffe, und es wurde schwierig, den Inhalt nach etwa 1 Stunde zu rühren. Das Reaktionsgemisch ließ man für 24 Stunden bei Raumtemperatur stehen, nachdem das Rühren angehalten wurde. Nach dem Abschrecken auf 15ºC wurde konzentrierte Schwefelsäure (36%, 202,6 g, 2,0 Mol, 176 ml) langsam tropfenweise in das Reaktionsgemisch über etwa 1 Stunde gegeben. Nach Vervollständigung der tropfenweisen Zugabe wurde Toluol (370 ml) in das Produktgemisch gegeben, das dann für etwa 1 Stunde gerührt wurde. Das Produktgemisch wurde durch Ansaugen gefiltert, und die erhaltenen weißen Feststoffe wurden mit Toluol (500 ml) gewaschen. Der gewaschene weiße Feststoff wurde zu Isopropanol (1 l) gegeben und dann für 1 Stunde unter Rückfluss gehalten. Nach dem Abkühlen wurde das Produkt saugfiltriert und dann sorgfältig mit Isopropanol (etwa 500 ml) gewaschen. Die gewaschenen weißen Feststoffe wurden bei 50ºC für 2 Tage im Vakuum getrocknet, und man erhielt 229,4 g (Ausbeute: 79,9%) der gewünschten chemischen Verbindung mit den folgenden Eigenschaften in einer Ausbeute von 79, 9%.
Schmelzpunkt: 169ºC (zersetzt):
IR (KBr): 3094, 2896, 1634, 1600, 1574, 1479, 1434, 1401, 1338, 1200, 1055, 871, 786 und 685 cm&supmin;¹;
¹H-NMR (D&sub2;O-TMSPNa); δ 7,52 (br s, 1H), 7,45-7,38 (m, 3H), 5,30 (d, J = 4,39 Hz, 1H), 3,92 (d, J = 4,36 Hz, 1H);
Referenzwerte für die Erythroform ¹H-NMR (D&sub2;O-TMSPNa): δ 5,36 (d, J = 4,01 Hz, 1H), 4,10 (d, J = 4,09 Hz, 1H).

[Beispiel 2]

Mikroorganismuskulturmedium 1A (30 ml) wurde in jede der drei 100-ml Erlenmeyer-Kolben eingefüllt. Nach der Sterilisation wurden die jeweiligen Erlenmeyer-Kolben mit Enterococcus faecalis (NRIC 1141), Enterococcus hirae (IFO 3181) und Lactobacillus brevis (NRIC 1037) geimpft. Nach der Drehschüttelkultivierungsmethode wurden Enterococcus faecalis und Enterococcus hirae bei 37ºC kultiviert, und Lactobacillus brevis wurde bei 30ºC für 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und dann in 100 mMol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) suspendiert. Die optische Dichte (OD) der Suspension bei 660 nm wurde auf 60 eingestellt. Die eingestellte Suspension (1,0 ml) wurde in eine Teströhre mit einem Innendurchmesser von 21 mm eingegeben. Eine Substratlösung (1,0 ml), die 60 mMol DL-threo-3-(3-Chlorphenyl)serin/ 0,4 mMol Pyridoxal-5'-phosphat in 100 mMol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) enthielt, wurde in die Suspension gegeben. Die Suspension, die Enterococcus faecalis (NRIC 1141) oder Enterococcus hirae (IFO 3181) enthielt, wurde unter Schütteln bei 37ºC geimpft und diejenige, die Lactobacillus brevis (NRIC 1037) enthielt, bei 30ºC für 96 Stunden, um eine Reaktion zu induzieren. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt, und dann wurden die optische Reinheit und die Konzentration des hergestellten 2-Amino-1-(3-chlorphenyl)ethanols im Überstand durch HPLC gemessen.
Es wurde aus der HPLC-Bestimmung festgestellt, dass der Enterococcus faecalis (NRIC 1141) (R)-2-Amino-1-(3-chlorphenyl)- ethanol) bei einer Konzentration von 3,38 mMol mit einer optischen Reinheit von 100%e.e. produzierte. Die Ausbeute der Reaktion betrug 11,3% (= 3,38/(60/2)) · 100). Es wurde ebenfalls festgestellt, dass der Enterococcus hirae (IFO 3181) (R)-2-Amino-1-(3-chlorphenyl)ethanol bei einer Konzentration von 8,92 mMol mit einer optischen Dichte von 100%e.e. produzierte. Die Ausbeute der Reaktion betrug 29,7% (= (8,92/(60/2)) · 100). Es wurde ebenfalls festgestellt, dass der Lactobacillus brevis (NRIC 1037) (R)-2-Amino-1-(3- chlorphenyl)ethanol bei einer Konzentration von 1,98 mMol mit einer optischen Reinheit von 100%e.e. produzierte. Die Ausbeute der Reaktion betrug 6,6% (= (1,98/(60/2)) · 100).

[Beispiel 3]

Es wurden wie in Beispiel 2 Zellen von Enterococcus faecalis (NRIC 1141) und Enterococcus hirae (IFO 3181) hergestellt. Die Reaktion wurde unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass das Substrat nunmehr DL-threo-3-Phenylserin war. Die optische Reinheit und Konzentration des hergestellten 2-Aminophenolethanols im Überstand wurde mit HPLC gemessen.
Es wurde aus der HPLC-Bestimmung festgestellt, dass der Enterococcus faecalis (NRIC 1141) (R)-2-Amino-1-ethanol bei einer Konzentration von 2,55 mMol mit einer optischen Dichte von 100 %e.e. produzierte. Die Ausbeute der Reaktion betrug 8,5% (= (2,55/(60/2)) · 100). Es wurde ebenfalls festgestellt, dass der Enterococcus hirae (IFO 3181) (R)-2-Amino-1-ethanol bei einer Konzentration von 6,50 mMol mit einer optischen Dichte von 100%e.e. produzierte. Die Ausbeute der Reaktion betrug 21,6% (= (6,50/(60/2)) · 100.

[Beispiel 4]

Mikroorganismuskulturmedium 2 (10 ml) wurde in eine Teströhre mit einem Innendurchmesser von 21 mm eingegeben. Nach der Sterilisation wurde dieses Medium mit Providencia stuatii (IFO 12930) (ein Loop) geimpft und unter Schütteln bei 30º für 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation abgetrennt und in 100 mMol NH&sub4;OH-NH&sub4;Cl gepufferter Lösung (pH 7,5) (2 ml) suspendiert. Diese Suspension (1,0 ml) wurde in eine Teströhre mit einem Innendurchmesser von 21 mm eingegeben, und dann wurden 60 mMol DL-threo-3-(3-Chlorphenyl)serin/0,4 mMol Pyridoxal-5'-phosphat-Lösung (1,0 ml) (Lösungsmittel: 100 mMol NH&sub4;OH-NH&sub4;Cl gepufferte Lösung (pH 8,5)) hinzugegeben. Die Suspension wurde unter Schütteln bei 30ºC für 24 Stunden inkubiert. Nach der Vervollständigung der Reaktion wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt. Die optische Reinheit und die Konzentration des hergestellten 2-Amino-1-(3-chlorphenyl)ethanols im Überstand wurden mit HPLC gemessen.
Es wurde aus der HPLC-Bestimmung festgestellt, dass der Providencia stuatii (IFO 12930) (R)-2-Amino-1-(3-chlorphenyl)- ethanol bei einer Konzentration von 0,9 mMol mit einer optischen Reinheit von 100%e.e. produzierte. Die Ausbeute der Reaktion betrug 3,0% (= (0,9/(60/2)) · 100).

[Beispiel 5]

Mikroorganismuskulturmedium 3 und Mikroorganismuskulturmedium 4 (jeweils 5 ml) wurden jeweils in Teströhre mit einem Innendurchmesser von 21 mm eingegeben. Nach der Sterilisation wurden die Medien mit Gibberella fujikuroi (IFO 30337 Stamm) (ein Loop) geimpft und dann unter Schütteln bei 30ºC für 48 Stunden inkubiert. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation abgetrennt, in 100 mMol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) (1,0 ml) suspendiert und dann jeweils in Teströhren mit einem Innendurchmesser von 15 mm eingegeben. In diese Suspension wurden 92,8 mMol DL-threo-3-(3-Chlorphenyl)serin/0,4 mMol Pyridoxal-5'-phosphat in 100 mMol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) (1,0 ml) gegeben. Nach dem Beschichten mit 2,0 ml flüssigem Paraffin auf der Oberfläche wurde die Suspension statisch bei 30ºC für 17 Stunden inkubiert, um eine Reaktion zu induzieren. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt. Die optische Dichte und die Konzentration des hergestellten 2-Amino-1-(3- chlorphenyl)ethanols im Überstand wurden mit HPLC gemessen. Die Ergebnisse der HPLC-Bestimmung sind in Tabelle 1 gezeigt. TABELLE 1

[Beispiel 6]

Zellen von Gibberella fujikuroi (IFO 30337 Stamm) wurden im Mikroorganismuskulturmedium 3 wie in Beispiel 5 hergestellt und statisch bei 30ºC für 17 Stunden unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 5 inkubiert, um eine Reaktion zu induzieren, mit der Ausnahme, dass als Substrat DL-threo-3- Phenylserin verwendet wurde. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt. Die optische Reinheit und die Konzentration des hergestellten 2- Amino-1-phenylethanols im Überstand wurden mit HPLC gemessen.
Die optische Dichte betrug 100%e.e. als R-Form, mit der Konzentration von 6,9 mMol und einer Ausbeute von 14,9%.

[Beispiel 7]

Gibberella fujikuroi (IFO 9977, IFO 30336, IFO 31251, NRIC 1240), Gibberella acuminata (IFO 30307), Gibberella zeae (IFO 7772), Gibberella lateritium (IFO 7188), und Fusarium anguioides (IFO 4467) wurden mit einem Loop jeweils mit 5 ml Mikroorganismuskulturmedium 3 geimpft. Die Stämme von Gibberella fujikuroi wurden unter Schütteln bei 30ºC für 48 Stunden kultiviert, die anderen Mikroorganismen bei 30ºC für 72 Stunden. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt und dann in 1,0 ml 100 mMol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) suspendiert. Die Suspensionen wurden in Teströhren mit einem Innendurchmesser von 15 mm eingegeben. In diese Suspensionen wurden jeweils 1,0 ml 92,8 mMol DL-threo-3-(3-Chlorphenyl)serin/0,4 mMol Pyridoxal-5'-phosphat in 100 mMol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) gegeben. Die erhaltene Suspension wurde statisch bei 30ºC für 17 Stunden inkubiert, um eine Reaktion zu induzieren. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde der Überstand durch Zentrifugation abgetrennt. Die optische Dichte und die Konzentration des hergestellten 2-Amino-1-(3- chlorphenyl)ethanols im Überstand wurden mit HPLC gemessen. Die Ergebnisse der HPLC-Bestimmung sind in Tabelle 2 gezeigt. "R" in der Säule "optische Reinheit" bedeutet die R-Form des Produkts. TABELLE 1

[Beispiel 8]

Gibberella fujikuroi (IFG 30337 Stamm) wurde in 5 ml YM-Medium bei 30ºC für 24 Stunden in einer Teströhre mit einem Innendurchmesser von 21 mm unter Schütteln kultiviert. Mikroorganismuskulturmedium 3 (700 ml) wurde in einen 1,2 l Minigefäß (Marubishi Bioengineering Co., Ltd.) eingegeben und bei 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde die Vorkultur von Gibberella fujikuroi (1,4 ml) in das Minigefäß geimpft und bei 30ºC für 40,5 Stunden (600 Umdrehungen, 1,0 vvm) kultiviert. Nachdem das Kulturmedium (100 ml) abzentrifugiert war, wurden die Zellen zweimal mit 50 ml 100 mMol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) gewaschen und in 9,8 ml der gleichen gepufferten Lösung suspendiert. In diese Suspension wurden 0,30 g kristallines DL-threo-3-(3-Chlorphenyl)serin und 0,2 ml 10 mMol Pyridoxal-5'-phosphatlösung in die Suspension gegeben und gerührt, um die hinzugegebenen Substanzen zu lö¬ sen. Die erhaltene Suspension wurde bei 30ºC für 39 Stunden inkubiert, nachdem 5 ml flüssiges Paraffin auf die Oberfläche geschichtet wurde. Es wurde durch HPLC-Analyse festgestellt, dass (R)-2-Amino-1-(3-Chlorpehnyl)ethanol bei einer Konzentration von 10,7 g/l im Reaktionsgemisch produziert worden war (Ausbeute: 44,8%).

[Beispiel 9]

Mikroorganismuskulturmedium 1A (200 ml) wurde in einen 500 ml Erlenmeyerkolben eingegeben. Nach der Sterilisation wurde es mit Enterococcus hirae (IFO 3181) geimpft und unter Drehen bei 37ºC für 21 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden anschließend durch Zentrifugation abgetrennt, in 100 mMol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) suspendiert, und die optische Dichte der Suspension bei 660 nm wurde auf 100 eingestellt. Diese Zellsuspension (1,96 ml) wurde in eine Teströhre mit einem Innendurchmesser von 21 mm eingegeben. Es wurden kristallines DL-threo-3-(Chlorphenyl)serin (50 mg) und 10 mMol Pyridoxal- 5'-phosphatlösung (40 ul) in die obige Suspension gegeben. Diese Zellsuspension wurde unter Schütteln bei 37ºC für 24 Stunden kultiviert. Nach Vervollständigung der Reaktion wurden die optische Dichte und die Konzentration des hergestellten (R)-2-Amino-1-(3-chlorphenyl)ethanols und diejenigen des übriggebliebenen Substrats mit HPLC gemessen.
Es wurde aus der HPLC-Bestimmung festgestellt, dass (R)-2- Amino-1-(3-Chlorphenyl)ethanol bei einer Konzentration von 30,7 mMol mit einer optischen Reinheit von 100%e.e. produziert worden war. Die Ausbeute der Reaktion betrug 26,5% (= (30,7/116,0) · 100). Es wurde ebenfalls festgestellt, dass die optische Reinheit und die Konzentration des verbliebenen (+)-threo-3-(3-Chlorphenyl)serins 100%e.e. bzw. 57,4 mMol betrugen. Die Prozentzahl des verbliebenen (+)-threo-3-(3- chlorphenyl)serins zur Anfangsmenge des Substrats betrug 49,5 % (= (57,4/116) · 100).

[Beispiel 10]

Gibberella fujikuroi (IFO 30337 Stamm) wurde in 25 ml YM- Medium bei 30ºC für 24 Stunden in einem Sakaguchi-Kolben unter Schütteln vorkultiviert. Mikroorganismuskulturmedium 5 (600 ml) wurde in ein 1,2 l Minigefäß (Marabishi Bioengineering Co., Ltd.) eingegeben und bei 121ºC für 15 Minuten sterilisiert. Nach dem Abkühlen wurde das Minigefäß mit 12 ml der Vorkultur geimpft und bei 30ºC für 72 Stunden kultiviert (900 Umdrehungen, 1,0 vvm). Das kultivierte Medium (300 ml) wurde herausgenommen und dann zentrifugiert. Die Zellen wurden zweimal mit der gleichen Menge deionisiertem Wasser wie beim verwendeten Kulturmedium gewaschen, in deionisiertem Wasser suspendiert, und das Suspensionsvolumen wurde auf 60 ml eingestellt. In ein 1,2 l Minigefäß (Marabishi Bioengineering Co., Ltd.) wurden deionisiertes Wasser (430 ml), kristallines DL- threo-3-(3-Chlorphenyl)ethanol und 10 ml mMol Pyridoxal-5'- phosphatlösung eingegeben und gerührt, um eine vollständige Lösung herzustellen. Die Zellsuspension (60 ml) wurde in die obige Substratmischung gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde bei 50ºC für 42 Stunden (200 Umdrehungen) mit leichtem Einblasen von Stickstoffgas inkubiert. Der pH der Reaktionsmischung wurde bei 6,2 über die Reaktion durch Zugabe von 10% H&sub2;SO&sub4; gehalten. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch durch HPLC analysiert. Es wurde festgestellt, dass bei einer Konzentration von 15,2 g/l im Reaktionsgemisch (Ausbeute 44,8%) (R)-2-Amino-1-(3-chlorphenyl)ethanol hergestellt worden war. Es wurde ebenfalls festgestellt, dass (+)-threo-3-(3- chlorphenyl)serin bei einer Konzentration von 19,6 g/l zurück blieb und die Prozentzahl des verbliebenen (+)-threo-3-(3- chlorphenyl)serins zur Anfangsmenge des Substrats 49,9% (= 19,6 · 0,425/16,7 · 100) betrug. Das Gewicht der entstandenen Flüssigkeitsfraktion betrug 425 g.

[Beispiel 11]

Reinigung von (+)-threo-3-(3-Chlorphenyl)serin

Deionisiertes Wasser (100 ml) wurde in 100 ml des Reaktionsgemischs in Beispiel 10 nach Vervollständigung der Reaktion gegeben. Die verdünnte Reaktionsflüssigkeit wurde auf 50ºC erwärmt, gerührt, und dann wurden die Zellen durch Zentrifugation entfernt. Makromolekulare Materialien, wie Proteine, im Überstand wurden durch eine Ultrafiltrationsmembran (Amicon Inc.) entfernt. Der filtrierte Überstand wurde in einem Verdampfer im Vakuum eingeengt, um das Gewicht des Überstands auf etwa 23 g herabzusetzen. Der eingeengte Überstand wurde über Nacht bei 4ºC stehen gelassen. Es wurden Rohkristalle durch Filtration abgetrennt und mit 10 g eiskaltem reinen Wasser gewaschen. Die erhaltenen Rohkristalle wurden zu 15 g reinem Wasser gegeben und durch Erwärmen bei 90ºC unter Rühren gelöst. Die entstandene erwärmte Lösung wurde filtriert. 2- Propanol (15 g) wurde schnell in die gefilterte Lösung gegeben, die dann über Nach bei 4ºC stehen gelassen wurde. Die Kristalle wurden durch Filtration abgetrennt, mit einer Mischung aus Wasser und 2-Propanol (1/1) gewaschen und vakuumgetrocknet, um weiße Kristalle (0,76 g) herzustellen, die die folgenden Eigenschaften aufwiesen. Die Ausbeute der Reinigung betrug 39%.
Chemische Reinheit: 99,5%, [α]²&sup5;D + 15,0º (c = 0,215, H&sub2;O);
Optische Reinheit: analysiert mit CROWNPAK CR (+)) von (+)- threo-3-(3-Chlorphenyl)serin; 100%e.e.;
¹H-NMR (D&sub2;O-TMSPNa): δ 7,52 (br s, 1H), 7,45-7,38 (m, 3H), 5,30 (d.J = 4,38 Hz, 1H), 3,92 (d,J = 4,38 Hz, 1H).

[Beispiel 12]

Tyrosindecarboxylase (0,1 E) (Sigma, Produktcode Nr. T-4379; Aktivität: 0,07 E/mg, von Streptococcus faecalis nach dem vorhandenen Katalog) wurde in einer Teströhre mit einem Innendurchmesser von 15 mm mit DL-threo-3-(3-Chlorphenyl)serin und Pyridoxal-5'-phosphat gemischt, so dass die Endkonzentration in der Mischung auf 30 mMol für das erstere, 0,2 mMol für das letztere bei einem Gesamtvolumen bei 1,0 ml eingestellt war. Die Mischung wurde statisch bei 30ºC für 21 Stunden inkubiert. Nach Vervollständigung der Reaktion wurde die Mischung mit einer Ultrafiltrationsmembran mit 0,22 um Poren filtriert. Die filtrierte Mischung wurde in geeigneter Weise verdünnt, um Proben für HPLC-Analyse zu erhalten. Es wurde durch HPLC- Bestimmung festgestellt, dass (R)-2-Amino-1-(3- Chlorphenyl)ethanol bei einer Konzentration von 4,7 mMol in der Mischung hergestellt worden war, und seine Dichte betrug 100%e.e. Die Ausbeute der Reaktion betrug 15,7% (= 4,7/(60/2) · 100).

[Beispiel 13]

Die gleichen Stufen wie in Beispiel 12 wurden durchgeführt, mit der Ausnahme, dass die Tyrosindecarboxylase weiter gereinigt wurde. Die Reinigung der Tyrosindecarboxylase wurde nach einer Methode, die von S. Allenmark et al. in J. Chromatography, 153, 239-245 (1978) beschrieben wurde, durchgeführt.
Tyrosindecarboxylase, die auf Phenylsepharose 4B (Parmacia) in einer Säule geladen war, wurde mit 1,0 Mol Natriumacetat gepufferter Lösung (pH 6,0) eluiert. Es wurden aktive Fraktionen, die zu einem Peak gehörten, gesammelt, gegen 0,1 Mol Natriumacetat gepufferter Lösung (pH 5,5) dialysiert und mit einer Ultrafiltrationsmembran, die für die Reaktion verwendet werden soll, eingeengt. Die Bestimmung der Ergebnisse aus der HPLC-Analyse eines Reaktionsgemischs waren fast die gleichen wie in Beispiel 12.

[Beispiel 14]

Die gleichen Schritte wurden wie in Beispiel 12 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Tyrosindecarboxylase aus einem Homogenat von Enterococcus faecalis (NRIC 1141) Zellen gereinigt worden war. Die Reinigung der Tyrosindecarboxylase von einem Homogenat von Enterococcus faecalis (NRIC 1141) Zellen wurde wie folgt durchgeführt:
Enterococcus faecalis (NRIC 1141) (ein Loop) wurde in steriliseirtes Mikroorganismuskulturmedium 1A geimpft und unter Rotation bei 37ºC für 24 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden durch Zentrifugation abgetrennt. Etwa 1 g Zellen (Nassmasse) wurde in 2,5 ml 0,1 Mol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 5,5) suspensiert und ultrabeschallt. Der Überstand wurde durch Zentrifugation abgetrennt und mit 2% Protaminsulfat behandelt, um die Nukleinsäuren zu entfernen. Der behandelte Überstand wurde sorgfältig gegenüber 1,0 Mol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 6,0) dialysiert, auf eine Säule mit Phenylsepahrose 4B, die mit 1,0 Mol Essigsäure gepufferter Lösung (pH 6,0) equilibriert war, geladen und mit der gleichen Pufferlösung eluiert. Es wurden aktive Fraktionen, die zu einem einzelnen Peak gehörten, gesammelt, gegen 0,1 Mol Natriumacetat gepufferter Lösung (pH 5,5) dialysiert und mit einer Ultrafiltrationsmembran, die für die Reaktion verwendet werden kann, eingeengt. Die Bestimmung der Ergebnisse aus der HPLC- Analyse der Reaktionsmischung waren fast die gleichen wie in Beispiel 12.

[Beispiel 15]

Die gleichen Schritte wurden wie in Beispiel 12 durchgeführt, mit der Ausnahme, dass Tyrosindecarboxylase, die von einem Homogenat von Enterococcus hirae (IFO 3181) Zellen gereinigt war, verwendet wurde.
Die Reinigung von Tyrosincarboxylase aus einem Homogenat von Enterococcus hirae (IFO 3181) Zellen wurde in ähnlicher Weise wie für Enterococcus faecalis (NRIC 1141) Zellen in Beispiel 14 durchgeführt. Es wurde durch HPLC-Bestimmung festgestellt, dass (R)-2-Amino-1-(3-chlorphenyl)ethanol bei einer Konzentration von 10,6 mMol produziert worden war, und seine Dichte betrug 100%e.e. Die Ausbeute der Reaktion betrug 35,3% (= 10,6/(60/2) · 100).

[Beispiel 16]

Tyorsindecarboxylase (0,030 E), die aus Zellen von Enterococcus hirae (IFO 3181) in Beispiel 15 hergestellt worden war, wurde in einer Teströhre mit einem Durchmesser von 15 ml mit DL-threo-3-(3-chlorphenyl)serin vermischt, so dass die Endkonzentration in der Mischung auf 35 mMol für das erstere, 0,2 mMol für das letztere in einem Gesamtvolumen von 10 ml eingestellt worden war. Die Reaktion wurde durchgeführt, indem die Mischung bei 37ºC für 48 Stunden inkubiert wurde. Es wurde durch HPLC-Bestimmung festgestellt, dass (R)-2-Amino-1-(3- chlorphenyl)ethanol bei einer Konzentration von 17,6 mMol in der Mischung hergestellt worden war, und seine optische Dichte betrug 100%e.e. Die Ausbeute der Reaktion betrug 50,3% (= 17,6/35 · 100). Es wurde ebenfalls festgestellt, dass (+)- threo-3-(3-Chlorphenyl)serin bei einer Konzentration von 17,7 mMol verblieb, und seine optische Reinheit betrug 100%e.e. Die Prozentzahl des verbliebenen (+)-threo-3-(3- Chlorphenyl)serins zur Anfangsmenge des Substrats betrug 50,6 % (= 17,7/35) · 100).

Vorteile der Erfindung

Nach der vorliegenden Erfindung kann eine Mischung aus den Enantiomeren von threo-3-Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten, die durch Formel (1) dargestellt sind, stereoselektiv unter Verwendung von Tyrosindecarboxylase oder Mikroorganismen der Genuses Enterococcus, Lactobacillus, Providencia, Fusarium und Gibberella decarboxyliert werden. Demzufolge können fast optisch rein (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seine Halogensubstitutionsprodukte, die durch die Formel (2) dargestellt sind, wirtschaftlich im industriellen Maßstab hergestellt werden. Zur gleichen Zeit kann eines der Enantiomeren von threo-3-Phenylserin oder seinen Halogensubstitutionsprodukten selektiv übrig bleiben, und optisch aktives throe-3-Phenylserin oder seine Halogensubstitutionsprodukte können wirtschaftlich im industriellen Maßstab hergestellt werden. Formel (1) Formel (2)
worin X H, F, Cl, Br oder I bedeutet und an jeder der ortho-, meta und para-Stellungen lokalisiert sein kann.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seinen Halogen substituierten Produkten in jeder der ortho-, meta- und para-Stellungen des aromatischen Rings, mit den Schritten:

Umsetzen von Tyrosindecarboxylase mit einer Mischung aus den Enantiomeren von threo-3-Phenylserin oder seinen Substitutionsprodukten, die durch die Formel (1) dargestellt sind und Sammeln des entstandenen (R)-2-Amino-1-phenylethanols oder seiner Halogen substituierten Produkte, die durch die Formel (2) dargestellt sind:

Formel (1)

Formel (2)

worin X H, F, Cl, Br oder I bedeutet und an jeder der ortho-, meta- und para-Stellungen lokalisiert sein kann.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin das threo-3-Phenylserin oder seine Substitutionsprodukte, die durch die Formel (1) dargestellt sind, threo-3-(3-Chlorphenyl)serin sind:

Formel (1)

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin die Tyrosindecarboxylase aus dem Mikroorganismus des Genus Enterococcus stammt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Tyrosindecarboxylase aus Enterococcus faecalis stammt.

5. Verfahren nach Anspruch 3, worin die Tyrosindecarboxylase aus Enterococcus hirae stammt.

6. Verfahren zur Herstellung von (R)-2-Amino-1-phenylethanol oder seiner Halogen substituierte Produkten in jeder der ortho-, meta- und para-Stellungen des aromatischen Rings, mit den Schritten:

Umsetzen von mindestens einem Mikroorganismus, der zu den Genera Enterococcus, Lactobacillus, Providencia, Fusarium und Gibberella gehört und aus Enterococcus faecalis oder Enterococcus hirae, Lactobacillus brevis, Providencia stuatii, Fusarium anguioides, Gibberella fujikuroi, Gibberella zeae, Gibberella lateritium oder Gibberella acuminata gewählt ist, mit einer Mischung aus den Enantiomeren von threo-3- Phenylserin oder seinen Substitutionsprodukten, die durch die Formel (1) dargestellt sind und

Sammeln des entstandenen (R)-2-Amino-1-phenylethanols oder seiner Halogen substituierten Produkte, die durch die Formel

(2) dargestellt sind:

Formel (1)

Formel (2)

7. Verfahren nach Anspruch 6, worin das threo-3-Phenylserin oder seine Substitutionsprodukte, die durch die Formel (1) dargestellt sind, threo-3-(3-Chlorphenyl)serin sind:

Formel (1)

8. Verfahren nach Anspruch 6, worin das threo-3-Phenylserin oder seine Substitutionsprodukte, die durch die Formel (1) dargestellt sind, threo-3-Phenylserin sind:

Formel (1)

9. Verfahren nach Anspruch 6, worin der Mikroorganismus der zum Genus Enterococcus gehört, Enterococcus faecalis (NRIC 1141) oder Enterococcus hirae (IFO 3181) ist, der Mikroorganismus, der zum Genus Lactobacillus gehört, Lactobacillus brevis (NRIC 1037) ist, der Mikroorganismus, der zum Genus Providencia gehört, Providencia stuatii (IFO 12930) ist, der Mikroorganismus, der zum Genus Fusarium gehört, Fusarium anguioides (IFO 4467) ist, der Mikroorganismus, der zum Genus Gibberella gehört, Gibberella fujikuroi (IFO 9977, IFO 30336, IFO 30337, IFO 31251 und NRIC 1240), Gibberella zeae (IFO 7772), Gibberella lateritium (IFO 7188) oder Gibberella acuminata (IFO 30307) ist.

10. Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem Phenylserin oder seinen Substitutionsprodukten in jeder der ortho-, meta- und para-Stellungen des aromatischen Rings, mit den Schritten:

Sammeln des verbliebenen optisch aktiven Phenylserins oder seiner Halogen substituierten Produkte in der Mischung.

Formel (1)

Formel (2)

11. Verfahren nach Anspruch 10, worin das threo-3-Phenylserin oder seine Substitutionsprodukte, die durch die Formel (1) dargestellt sind, threo-3-(3-Chlorphenyl)serin sind:

Formel (1)

12. Verfahren nach Anspruch 10, worin das threo-3-Phenylserin oder seine Substitutionsprodukte, die durch die Formel (1) dargestellt sind, threo-3-Phenylserin sind:

Formel (1)

13. Verfahren nach Anspruch 10, worin der Mikroorganismus, der zum Genus Enterococcus gehört, Enterococcus faecalis (NRIC 1141) oder Enterococcus hirae (IFO 3181) ist, der Mikroorganismus, der zum Genus Lactobacillus gehört, Lactobacillus brevis (NRIC 1037) ist, der Mikroorganismus, der zum Genus Providencia gehört, Providencia stuatii (IFO 12930) ist, der Mikroorganismus, der zum Genus Fusarium gehört, Fusarium anguioides (IFO 4467) ist, der Mikroorganismus, der zum Genus Gibberella gehört, Gibberella fujikuroi (IFO 9977, IFO 30336, IFO 30337, IFO 31251 und NRIC 1240), Gibberella zeae (IFO 7772), Gibberella lateritium (IFO 7188) oder Gibberella acuminata (IFO 30307) ist.

14. (+)-threo-Form von 3-(3-Chlorphenylserin).