DE69906944T2

DE69906944T2 - 20-hete antagonisten und agonisten

Info

Publication number: DE69906944T2
Application number: DE69906944T
Authority: DE
Inventors: Magdalena Alonso-Galicia; R. Falck; R. Harder; R. Jacobs; J. Roman
Original assignee: University of Texas System; Medical College of Wisconsin Research Foundation Inc; University of Texas at Austin
Current assignee: University of Texas System; Medical College of Wisconsin Research Foundation Inc; University of Texas at Austin
Priority date: 1998-02-26
Filing date: 1999-02-24
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2019-02-25
Also published as: JP3921583B2; CN1291890A; CA2320706C; AU2786199A; DE69906944D1; EP1056449B1; US20020049244A1; ATE237321T1; ES2194444T3; US20020072534A1; US6395781B1; EP1056449A2; KR100390312B1; US6596769B2; US6605641B2; KR20010034544A; JP2003522098A; WO1999043310A3; WO1999043310A2; AU750579B2

Description

Hintergrund der Erfindung

Neuere Untersuchungen haben ergeben, dass glatte Gefäßmuskelzellen in verschiedenen Gefäßbetten Enzyme der Cytochrom P450 4A-Familie und verwandter Familien (CYP 4A) exprimieren, die die Bildung von 20- Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) katalysieren. 20-HETE stellt einen starken Konstriktor (EC&sub5;&sub0; < 10&supmin;&sup8; M) von renalen, zerebralen und Skelettmuskel-Arteriolen dar. Es fördert den Ca²&spplus;-Eintritt durch Depolarisierung von VSM-Zellen im Anschluss an eine Blockade von KCa- Kanälen und durch Erhöhung des Leitvermögens von Ca²&spplus;-Kanälen vom L-Typ (D. Harder, J. Vasc. Research, Bd. 34 (1997), S. 237-243; R. Roman, News in Physiological Sciences, (1999), in Druck). In der Niere wird 20-HETE ferner durch renale tubuläre Zellen gebildet, wo es an der Regulierung des Natriumtransports im proximalen Tubulus und im aufsteigenden dicken Schenkel der Henle-Schleife beteiligt ist. In der humanen und Kaninchenlunge (R. Roman (1999), a.a.O.) wird ferner 20-HETE durch die Luftwege erzeugt, wo es als starker, endogen gebildeter Bronchodilatator dient (D. Zhu, Am. J. Resp. Cell Mol. Biol., Bd. 19 (1998), S. 121-128; E. R. Jacobs, Am. Physiol., (1999), im Druck).
Trotz der Bedeutung von 20-HETE bei der Regulierung des vaskulären Tonus, der Nierenfunktion und des Luftwegwiderstands ist über seinen Wirkungsmechanismus wenig bekannt. Neuere Untersuchungen haben ergeben, dass die vasokonstriktorische Reaktion auf 20-HETE und deren Hemmwirkungen auf den Natriumtransport mit einer Aktivierung der PKC- und MAP-Kinase-Signalleitungskaskaden verbunden sind (C.-W. Sun, Hypertension, Bd. 33 (1999), S. 414-418). Die Aktivierung dieser Wege wird üblicherweise durch rezeptorvermittelte Ereignisse ausgelöst, jedoch gibt es derzeit keinen Hinweis auf einen 20-HETE-Rezeptor. Bisher gibt es keine veröffentlichen Untersuchungen bezüglich der Feststellung, ob 20- HETE an Membran- oder Cytosol-Proteine bindet, oder bezüglich der Feststellung, ob die vasokonstriktorische Reaktion für 20-HETE spezifisch ist oder durch eng verwandte Analoge nachgeahmt werden kann.

Kurze zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung resultiert aus einer Untersuchung über Struktur und Aktivität einer Reihe von 20-HETE-Analogen mit dem Ziel zur Ermittlung der strukturellen Determinanten in bezug auf die vasokonstriktorische Reaktion in interlobulären, durch Mikrosektion aus Rattennieren gewonnenen Arterien.
Erfindungsgemäß wird ein 20-HETE-Agonist oder -Antagonist zur Verringerung des vaskulären Durchmessers eines Patienten oder zur Verhinderung der durch 20-HETE verursachten Verringerung des vaskulären Durchmessers beansprucht.
Die Verbindung weist die folgende Formel auf
worin R&sub1; unter Carbonsäure-, Phenol-, Amid-, Imid-, Sulfonamid-, Sulfonimid-, aktiven Methylen-, 1,3-Dicarbonyl-, Alkohol-, Thiol-, Amin-, Tetrazol- oder anderen Heteroarylgruppen ausgewählt ist,
R&sub2; unter Carbonsäure-, Phenol-, Amid-, Imid-, Sulfonamid-, Sulfonimid-, aktiven Methylen-, 1,3-Dicarbonyl-, Alkohol-, Thiol-, Amin-, Tetrazol- oder anderen Heteroarylgruppen ausgewählt ist,
W eine C&sub1;-C&sub2;&sub5;-Kohlenwasserstoffkette bedeutet, die linear, cyclisch oder verzweigt sein kann und Heteroatome, wie S, O, N oder Se, enthalten kann,
Y eine C&sub1;-C&sub2;&sub5;-Kohlenwasserstoffkette bedeutet, die linear, cyclisch oder verzweigt sein kann und Heteroatome, wie S, O, N oder Se, enthalten kann,
sp< 3-Center unter Vinylen-, Arylen-, Heteroarylen-, Cyclopropylen- und Ethinylenresten ausgewählt ist,
X eine Alkylkette bedeutet, die linear, verzweigt, cyclisch oder polycyclisch sein kann und Heteroatome enthält oder nicht,
m den Wert 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 hat und
n den Wert 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens handelt es sich bei der Verbindung um einen Agonisten und der vaskuläre Durchmesser wird verringert oder der glatte Bronchiolenmuskel erweitert. In dieser Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung um einen 20-HETE- Agonisten. Vorzugsweise handelt es sich bei der Agonistenverbindung um 20-Hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-diensäure.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens handelt es sich bei der Verbindung um einen 20-HETE-Antagonisten und wird eine durch 20- HETE verursachte Verringerung des vaskulären Durchmessers verhindert.
Vorzugsweise handelt es sich bei dieser Verbindung um 20-Hydroxyeicosa- 6(Z),15(Z)-diensäure (PS rev 20-HETE).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung eines 20-HETE-Agonisten oder -Antagonisten der vorstehenden Formel zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung eines Patienten.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist der Patient eine Krankheit auf, die aus folgender Gruppe ausgewählt ist: Diabetes, Schwangerschaftstoxämie (Präeklampsie), hepatorenales Syndrom, durch Cyclosporin induzierte Nephrotoxizität, zerebraler Vasospasmus, Schlaganfall und Hochdruck. Die vasokonstriktorischen Wirkungen des vom Patienten endogen gebildeten, überschüssigen 20-HETE werden bei Behandlung mit einem 20-HETE-Antagonisten gemäßigt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist der Patient Hochdruck, einen septischen Schock oder eine andere entzündliche Erkrankung in Verbindung mit der Induktion von Stickoxid-synthase auf und wird mit einer Menge eines 20-HETE-Antagonisten, die zu einer Verminderung der Symptome ausreicht, behandelt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden Patienten mit einem 20- HETE-Antagonisten behandelt, um eine Vaskularisation von granulären oder neoplastischen Geweben zu verhindern. Diese Behandlung vermindert die Blutzufuhr zu Tumoren und verhindert deren Wachstum.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist der Patient einen Zustand auf, der aus folgender Gruppe ausgewählt ist: kongestives Herzversagen, pulmonales Ödem, hepatorenales Syndrom, Hochdruck, salzempfindliche Form von Hochdruck und Asthma. Ein derartiger Patient wird mit einer Menge eines 20-HETE-Agonisten behandelt, die zur Herbeiführung einer diuretischen Wirkung, eines geringeren Blutvolumens und zur Ödemverhinderung ausreicht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist der Patient eine salzempfindliche Form von Hochdruck auf und wird mit einer Menge eines 20-HETE-Antagonisten behandelt, die zur Förderung der Natriumausscheidung unter Verringerung der Krankheitssymptome ausreicht.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform weist der Patient Asthma auf und der 20-HETE-Agonist wird durch Inhalationstherapie verabreicht, um die verengten Luftwege zu erweitern.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Patient an pulmonalem Hochdruck leiden. In diesem Fall wird 20-HETE oder ein 20-HETE-Agonist durch Infusion verabreicht, um den pulmonalen Kreislauf zu erweitern.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Patient an einer zerebralen Gefäßschädigung, Vasospasmus, Migräne- oder Cluster- Kopfschmerzen, Schlaganfall oder durch Kokain induzierten Vasospasmus leiden und wird mit einem 20-HETE-Antagonisten behandelt, um die Durchblutung zu erhöhen und die Symptome zu lindern.
Die vorliegende Erfindung betrifft ferner eine pharmazeutische Zubereitung, die eine unter 20-HETE-Agonisten und -Antagonisten ausgewählte Verbindung und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff enthält. Die Zubereitung wird vorzugsweise aus der Gruppe 20- Hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-diensäure, 20-Hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)- diensäure, N-Methylsulfonyl-20-hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-dienamid und N- Methylsulfonyl-20-hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-dienamid sowie einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff ausgewählt.
Gemäß einem Merkmal der vorliegenden Erfindung werden 20-HETE- Agonisten und -Antagonisten bereitgestellt. Ferner wird eine allgemeine Formel zur Beschreibung der 20-HETE-Agonisten und -Antagonisten angegeben.
Gemäß einem weiteren Merkmal der Erfindung werden therapeutische Verwendungen von 20-HETE-Agonisten und -Antagonisten beschrieben.
Weitere Merkmale, Ziele und Vorteile der vorliegenden Erfindung ergeben sich beim Studium der Beschreibung, der Ansprüche und der Zeichnung.

Kurze Beschreibung der verschiedenen Darstellungen der Zeichnung

Fig. 1 zeigt einen Satz von Strukturformeln von einigen der verschiedenen, hier beschriebenen 20-HETE-Analogen.
Figg. 2A und B sind Diagramme zum Vergleich der Einflüsse von verschiedenen Analogen von 20-HETE auf den Durchmesser von isolierten, renalen, interlobulären Arterien.
Figg. 3A und B sind Diagramme zur Darstellung der antagonistischen Aktivität von verschiedenen Analogen auf die vasokonstriktorische Reaktion auf 20-HETE in isolierten, renalen interlobulären Arterien.
Figg. 4A und B sind Diagramme zur Darstellung der antagonistischen Aktivität von anderen Analogen auf die vasokonstriktorische Reaktion auf 20-HETE in isolierten, renalen, interlobulären Arterien.
Fig. 5 zeigt in schematischer Weise Strukturformeln von hier beschriebenen spezifischen 20-HETE-Agonisten und -Antagonisten.
Fig. 6 zeigt in verallgemeinerter Weise 20-HETE- Agonisten/Antagonisten und bietet ein Schema für die Herstellung von Agonisten und Antagonisten.
Figg. 7A und B zeigen eine Reihe von Beispielen geeigneter Verbindungen.
Figg. 8A, B, C, D, E und F zeigen eine Reihe von Reaktionsschemata zur Herstellung von 20-HETE-Agonisten und -Antagonisten.
Fig. 9 zeigt ein Schema zur Erläuterung der Einflüsse von 20-HETE auf Blutgefäße.
Fig. 10 zeigt ein Schema zur Erläuterung der Einflüsse von 20-HETE auf renale, proximale Tubuli.
Fig. 11 zeigt ein. Schema zur Erläuterung der Einflüsse von 20-HETE auf den renalen, dicken aufsteigenden Schenkel der Henle-Schleife.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Gegenstand der Erfindung ist ein 20-HETE-Antagonist oder -Agonist zur Verringerung des vaskulären Durchmessers oder zur Verhinderung der durch 20-HETE verursachten Verringerung des vaskulären Durchmessers eines Patienten.
Die Verbindung weist die folgende allgemeine Formel auf:
worin R&sub1;, R&sub2;, W, Y, sp< 3 Center, x, m und n die vorstehend definierten Bedeutungen haben.
In sämtlichen speziellen Beispielen handelte es sich beim ersten Kohlenstoff um eine Carboxylgruppe. Jedoch könnte dieser durch einen anderen Typ einer ionisierbaren Gruppe ersetzt werden, wie ausführlich in der verallgemeinerten Struktur (Fig. 6A) dargelegt ist. Bei der Verbindung handelt es sich um einen Agonisten, wenn sie ein Paar Doppelbindungen und eine Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom 20-21 der Kette aufweist. Der Agonist weist typischerweise eine Länge von 20-21 Kohlenstoffatomen auf. (Der Gesamtabstand zwischen der ionisierbaren Gruppe C&sub1; und der reaktiven Gruppe an C&sub2;&sub0; oder C&sub2;&sub1; entspräche einer Kohlenstoffkette mit einer Länge von 20-21 Kohlenstoffatomen, wobei die Kette aber auch andere Atome, wie O, S oder N, enthalten könnte.) Es würde sich um einen Antagonisten handeln, wenn an dieser Position eine Hydroxylgruppe fehlt. Der Agonist weist typischerweise eine Länge von 19- 21 Kohlenstoffatomen auf.
Aufgrund dieser Struktur-Aktivitäts-Untersuchungen schlagen wir ein allgemeines Schema für die Struktur von Agonisten und Antagonisten der Wirkungen von 20-HETE gemäß der Darstellung in Fig. 6A vor. Agonisten und Antagonisten erfordern beide eine Carboxylgruppe oder eine andere ionisierbare Gruppe an einem Ende des Moleküls, die als Verankerungspunkt am mutmaßlichen Rezeptor dient. Sie erfordern ferner eine Doppelbindung oder eine andere funktionelle Gruppe in einem Abstand von 14-15 Kohlenstoffatomen von C&sub1; (der Carboxylgruppe oder der ionisierbaren Gruppe), die dazu befähigt ist, eine π-Bindung zur Stabilisierung des Moleküls an der Akzeptorstelle zu bilden. Ein Agonist weist ferner eine Hydroxylgruppe oder eine andere ionisierbare oder funktionelle Gruppe auf, die zur Ausbildung einer mit dem Rezeptor in Wechselwirkung tretenden Wasserstoffbrückenbindung befähigt ist, und zwar in einem Abstand von 20 oder 21 Kohlenstoffatomen von der ionisierbaren Gruppe am Kohlenstoff 1. Antagonisten weisen eine ähnliche Struktur auf, jedoch fehlt bei ihnen eine reaktive Gruppe am Kohlenstoffatom 20-21.
Ferner zeigen unsere Prototypbeispiele, dass eine Hydroxylgruppe oder eine andere funktionelle Gruppe, die sich am Kohlenstoffatom 19 der Kette befindet, die antagonistische Aktivität verstärkt.
Die nachstehenden Beispiele charakterisieren verschiedene analoge Verbindungen, die wir hergestellt und getestet haben, um die strukturellen Determinanten der vasokonstriktorischen Reaktion in aus Rattennieren durch Mikrosektion präparierten interlobulären Arterien zu bestimmen. Aufgrund dieser Untersuchungen fanden wir spezifische Agonisten und Antagonisten für 20-HETE.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in Verfahren zur Verwendung verschiedener Verbindungen der vorstehenden Formel, wobei es sich bei den Verbindungen entweder um Agonisten oder um Antagonisten von 20-HETE handelt.
In einer Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung um einen Agonisten, wobei der vaskuläre Durchmesser verringert wird. Vorzugsweise umfasst die Verbindung eine Hydroxylgruppe in einer Entfernung von 5 oder 6 Kohlenstoffatomen von einer Doppelbindung, wobei es sich um ps20-HETE handelt.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform handelt es sich bei der Verbindung um einen 20-HETE-Antagonisten, wobei der vaskuläre Durchmesser an einer Verringerung durch 20-HETE gehindert wird. Vorzugsweise weist die Verbindung eine OH-Gruppe auf, die sich nicht in einem Abstand von 5 oder 6 Kohlenstoffatom von einer Doppelbindung befindet, wobei es sich um 20-Hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-diensäure handelt.
Verbindungen der vorliegenden Erfindung lassen sich in analoger Weise zu den in den folgenden Beispielen enthaltenen Synthesebeschreibungen herstellen.
Unter Zuhilfenahme der nachstehenden Beispiele lässt sich sehr einfach feststellen, ob es sich bei einer Verbindung um einen 20-HETE- Agonisten oder -Antagonisten handelt. Bei einer Verbindung handelt es sich um einen 20-HETE-Agonisten, wenn sie den vaskulären Durchmesser eines Patienten verringert.
Unter dem Ausdruck "Verringerung des vaskulären Durchmessers bei einem Patienten" ist eine Verringerung gemäß den im nachstehenden Methodenteil beschriebenen Angaben zu verstehen. Die Anmelder haben ein Testsystem von isolierten Gefäßen beschrieben, wobei die Gefäße an Glas- Mikropipetten angebracht und verschiedenen Testverbindungen ausgesetzt werden. Wir glauben, dass eine Verringerung des vaskulären Durchmessers von mindestens 20% darauf hinweist, dass eine Verbindung einen 20-HETE- Agonisten darstellt.
Nachstehend beschreiben wir ferner einen Test für die 20-HETE- Antagonistenaktivität. Bei dieser Analyse wurden die Testverbindungen durch eine vor und nach Zugabe der Testverbindung erzeugte kumulative Dosis/Wirkungs-Kurve gegenüber 20-HETE analysiert. Die Zugabe bestimmter Antagonisten, wie 5-HETE oder 15-HETE, blockierte die vasokonstriktorische Reaktion auf 20-HETE. Geeignete Antagonisten mit einer ähnlichen Blockierungswirkung der vasokonstriktorischen Reaktion kommen in Betracht.
Wir schlagen die therapeutische in vivo-Verwendung der Agonisten und Antagonisten von 20-HETE bei humanen Patienten vor. Es ist aus dem Stand der Technik bekannt, dass Arzneistoffe, die in vitro den Durchmesser von isolierten Gefäßen verringern, auch in vivo wirken (A. P. Zou, Am. J. Physiol, Bd. 270 (1996), R226-R237; A. P. Zou, Am. J. Physiol., Bd. 266 (1994), F275-F282; D. R. Harder, (1997), a.a.O.; M. Alonso-Galicia, Hypertension, Bd. 29 (1997), S. 320-325).
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung besteht in der Verwendung von 20-HETE-Agonisten und Antagonisten auf bestimmten therapeutischen Gebieten. Die 20-HETE-Antagonisten und -Agonisten entsprechen der vorstehend beschriebenen Formel.
Es kommt in Betracht, 20-HETE-Antagonisten zur Mäßigung einer erhöhten endogenen Bildung von 20-HETE durch einen Patienten zu verwenden, wie in den nachstehenden Beispielen ausgeführt wird. Diese Modulation kann sich bei einem Patienten als wertvoll erweisen, der einen der folgenden Zustände oder Krankheiten aufweist:
Koronararterienerkrankung, Diabetes, Schwangerschaftstoxämie (Präeklampsie), hepatorenales Syndrom, durch Cyclosporin induzierte Nephrotoxizität, Zerebrovasospasmus, Schlaganfall oder Hochdruck.
Ferner kommt es in Betracht, einen 20-HETE-Antagonisten zur Behandlung eines Patienten mit septischem Schock oder einer anderen entzündlichen Erkrankung, die mit einer Induktion der Synthese von Stickoxid verbunden ist, zu verwenden, wie in den nachstehenden Beispielen ausgeführt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kommt es in Betracht, dass ein 20-HETE-Antagonist die Vaskularisierung von granulären oder neoplastischen Geweben verhindert und sich bei der Behandlung von Krebs eignet, wie in den nachstehenden Beispielen ausgeführt wird.
Ferner kommt es in Betracht, dass ein 20-HETE-Agonist bestimmte therapeutische Anwendungen findet, wie in den nachstehenden Beispielen ausgeführt wird. Gemäß einer Ausführungsform kann der Agonist eine diuretische Wirkung bereitstellen und sich bei einem Patienten mit kongestivem Herzversagen, pulmonalem Ödem, hepatorenalem Syndrom oder Hochdruck als wertvoll erweisen.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann sich der 20-HETE-Agonist bei einem Patienten mit Asthma als wertvoll erweisen. Vorzugsweise wird die Verbindung in Form einer Inhalationstherapie verabreicht, wie in den nachstehenden Beispielen ausgeführt wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann der Patient an pulmonalem Hochdruck leiden, wobei 20-HETE oder ein 20-HETE-Agonist zur Erweiterung des pulmonalen Kreislaufs durch Infusion verabreicht wird.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform kann ein Patient an einer zerebralen vaskulären Schädigung, Vasospasmus, Migräne- oder Cluster- Kopfschmerzen, Schlaganfall oder einem durch Kokain induzierten Vasospasmus leiden und wird mit einem 20-HETE-Antagonisten behandelt, um die Durchblutung zu steigern und die Symptome zu lindern.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft eine pharmazeutische Zubereitung, die eine der nachstehend aufgeführten Verbindungen und einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff enthält:
20-Hydroxyeicosansäure, S(20-HETE),
19-Hydroxynonadecansäure, (sC&sub1;&sub9;-Analoges),
20-Hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-diensäure, (ps 20-HETE),
20-Hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-diensäure, (ps rev 20-HETE),
N-Methylsulfonyl-20-hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-dienamid und
N-Methylsulfonyl-20-hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-diensäure.

Beispiele

Allgemeine Ausführungen

Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass Arachidonsäure (AA) vorwiegend durch einen von P450 4A abhängigen Weg zu 20- Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE) in der Niere und im peripheren Gefäßsystem metabolisiert wird und dass 20-HETE als kritischer zweiter Messenger bei der Regulierung des renalen und peripheren Gefäßtonus, der renalen Funktion und der Langzeitkontrolle des arteriellen Drucks wirkt. Diesbezüglich stellt 20-HETE einen starken Vasokonstriktor dar, der die Öffnung von Ca&spplus;&spplus;-aktivierten K&spplus;-Kanälen in Zellen der glatten Gefäßmuskulatur hemmt. Die Verbindung fördert den Ca²&spplus;-Eintritt durch Depolarisierung von VSM-Zellen im Anschluss an eine Blockade von KCa- Kanälen und durch eine Erhöhung des Leitvermögens von Ca²&spplus;-Kanälen vom L- Typ (D. R. Harder, (1997), a.a.O.; R. J. Roman, (1999), a.a.O). Inhibitoren der Bildung von 20-HETE bewirken in vivo eine Blockierung der myogenen Reaktion von renalen, zerebralen und peripheren Arteriolen auf Erhöhungen des transmuralen Drucks und die Autoregulation der renalen und zerebralen Durchblutung (D. R. Harder et al., (1997), a.a.O.; A. Zou et al.,(1996), a.a.O.; A, P. Zou et al., (1994), a.a.O.). Sie schwächen auch die vasokonstriktorische Reaktion von Endothelin, All und Inhibitoren der NO-Synthase (A. O. Oyekan, Am. J. Physiol., Bd. 274 (1998), R52-R61; D. W. Sun et al., Circ. Res., Bd. 83 (1998), S. 1069-1079), die vasokonstriktorische Reaktion auf Erhöhungen des Gewebe-PO&sub2;-Werts (D. R. Harder, Circ. Res., Bd. 79 (1996), S. 54-61; J. H. Lombard, Am. J. Physiol., Bd. 276 (1999), H503-H507), die mitogenen Wirkungen von Wachstumsfaktoren in der glatten Gefäßmuskulatur und renalen Mesangialzellen (Lin et al., Am. J. Physiol., Bd. 269 (1995), F806-F816; Uddin et al., Hypertension, Bd. 31 (1998), S. 242-247) und die Entwicklung von Hochdruck von spontan hypertonischen Ratten und anderen Hochdruck-Modellen (Roman et al., Am. J. Hypertension, Bd. 10 (1997), S. 638-678).
In der Niere wird 20-HETE ferner durch renale tubuläre Zellen gebildet, wo es an der Regulierung des Natriumtransports im proximalen Tubulus und dem dicken aufsteigenden Schenkel der Henle-Schleife teilnimmt (R. S. Roman, (1999), a.a.O.). 20-HETE wird auch in den Luftwegen der Lunge des Menschen und des Kaninchens gebildet, wo es einen starken, endogen gebildeten Bronchodilatator darstellt. (Zhu et al., (1998) a.a.O.; Jacobs et al., (1999), a.a.O.).
Trotz der Bedeutung von 20-HETE in bezug auf die Regulierung der Nierenfunktion des Gefäßtonus und des Luftwegwiderstands weiß man wenig über ihren Wirkungsmechanismus. Neuere Untersuchungen haben ergeben, dass die mitogenen Wirkungen von 20-HETE und ihre Einflüsse auf den Gefäßtonus und den Natriumtransport mit einer Aktivierung von PKC- und MAP-Kinase- Signalleitungskaskaden verbunden sind (C. W. Sun et al., (1999), a.a.O.). Eine Aktivierung dieser Wege wird üblicherweise durch rezeptorvermittelte Ereignisse ausgelöst. Jedoch gibt es derzeit keine vorveröffentlichten Beweise für einen 20-HETE-Rezeptor. Es gibt auch keine früheren Untersuchungen zur Feststellung, ob 20-HETE an Membranproteine bindet oder ob die vasokonstriktorischen Eigenschaften von 20-HETE durch andere Analoge nachgeahmt werden können.
Somit bestand der Zweck der vorliegenden Untersuchung darin, Struktur-Aktivitäts-Studien an einer Reihe von synthetischen 20-HETE- Analogen durchzuführen, um die strukturellen Determinanten der vasokonstriktorischen Reaktion in aus Rattennieren durch Mikrosektion gewonnenen interlobulären Arterien zu bestimmen.

Verfahren

Allgemeines

Die Versuche wurden an männlichen Sprague-Dawley-Ratten im Alter von 10 bis 12 Wochen, die von Harlan Sprague-Dawley Laboratories (Indianapolis, IN) bezogen wurden, durchgeführt. Die Ratten wurden in der Tierversorgungsanlage im Medical College of Wisconsin, einer von der American Association for the Accreditation of Laboratory Animal Care anerkannten Organisation, gehalten. Die Tiere hatten freien Zugang zu Futter und Wasser. Sämtliche Vorgehensweisen, an denen Versuchstiere beteiligt waren, wurden vom Animal Care Committee of the Medical College of Wisconsin genehmigt.

Untersuchungen an isolierten Gefäßen

Aus Rattennieren wurden durch Mikrosektion interlobuläre Arteriolen (Innendurchmesser 70-120 um) gewonnen. Die Gefäße wurden an Glas- Mikropipetten in einer Perfusionskammer angebracht. Die Perfusionskammer enthielt eine physiologische Kochsalzlösung, die mit einem Gasgemisch aus 95% O&sub2; und 5% CO&sub2; äquilibriert und auf 37ºC gehalten wurde. Das Gefäß wurde an den Pipetten befestigt. Seitenverzweigungen wurden mit 10-0- Seidennahtmaterial abgebunden. Der Pipettenzulauf wurde mit einem unter Druck gesetzten Behälter zur Kontrolle des intraluminalen Perfusionsdrucks, der mit einem Messwertwandler (Cobe, Lakewood, CO) überwacht wurde, verbunden. Die Gefäße wurden auf die vor der Mikrosektion gemessene in vivo-Länge gedehnt. Die Ausflusskanüle wurde abgeklemmt und der intraluminale Druck wurde während des Versuchs auf 90 mmHg gehalten. Die Gefäßdurchmesser wurden mit einem Videosystem, das aus folgenden Elementen bestand, gemessen: Stereomikroskop (Carl Zeiss, Inc., Deutschland), CCTV-Fernsehkamera (Kp-130AU, Hitachi, Japan). Videocassettenrecorder (AG-7300, Panasonic, Japan), Fernsehmonitor (CVM- 1271, Sony, Japan) und Video-Meßsystem (VIA-100, Boeckeler Instrument Co., Tucson, AZ).
Die Zusammensetzung des Perfusats und des Bades ist nachstehend angegeben (in mM): 119 NaCl, 4,7 KCl, 1,17 MgSO&sub4;, 1,6 CaCl&sub2;, 12 NaHCO&sub3;, 1,18 NaH&sub2;PO&sub4;, 0,03 EDTA und 10 Glucose, pH-Wert 7,4. Indomethacin (5 uM), Baicalein (0,5 uM) und 17-ODYA (1 uM) wurden in das Bad gegeben, um die endogene Bildung und den Stoffwechsel von Eicosanoiden über den Cyclooxygenase-, Lipoxygenase- und Cytochrom P450-Weg zu blockieren. Nach der Äquilibrierung wurden kumulative Dosis/Wirkungs-Kurven für jedes der 20-HETE-Analogen erzeugt.

Einfluss der Position der Hydroxylgruppe auf die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE

Bei diesen Versuchen wurden die Einflüsse steigender Konzentrationen von 5(S)-, 8(S)-, 12(S)-, 15(S)- und 19(S)-HETE (nur zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung) auf den Durchmesser von isolierten, unter Druck gesetzten, renalen, interlobulären Rattenarterien untersucht. Alle diese Analogen weisen die gleiche Anzahl an Kohlenstoffatomen und Doppelbindungen und das gleiche Molekulargewicht wie 20-HETE auf (Fig. 1). Der Hauptunterschied zwischen diesen Verbindungen und 20-HETE besteht in der Position der OH-Gruppe entlang der Kohlenstoffkette. Zusätzliche Versuche wurden mit Arachidonsäure und 20-Carboxyarachidonsäure durchgeführt, die strukturell ähnlich wie 20-HETE sind, bei denen aber eine Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom 20 fehlt, sowie mit 20-Hydroxyeicosa-6,15-diensäure (reverse 20-HETE), bei dem die Carboxyl- und Hydroxylgruppen an den Kohlenstoffatomen 1 und 20 umgekehrt angeordnet sind. Kumulative Dosis/Wirkungs-Kurven wurden für jede Verbindung (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) in Gegenwart von Indomethalcin, Baicalein und 17-ODYA erzeugt. Die Gefäßdurchmesser wurden 2 bis 3 Minuten nach der Zugabe der Verbindungen zu dem Bad aufgezeichnet.

Einfluss der Doppelbindungen und der Kohlenstoff-Kettenlänge auf die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE

Anschließend prüften wir die Bedeutung der Doppelbindungen und der Länge der Kohenstoffkette auf die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE. Bei diesen Untersuchungen wurden die Doppelbindungen im 20-HETE- Molekül entfernt, wodurch partiell gesättigte und gesättigte 20-HETE- Derivate entstanden (20-Hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-diensäure; 20- Hydroxyeicosansäure; Fig. 1). 20-HETE wurde ferner um ein Kohlenstoffatom verkürzt, wodurch ein 19-Kohlenstoff-Analoges entstand (19- Hydroxynonadeca-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)-tetraensäure (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung) (Fig. 1). Ferner wurden Doppelbindungen entfernt, wodurch ein gesättigtes Analoges mit 19 Kohlenstoffatomen entstand (19-Hydroxynonadecansäure, Fig. 1). Außerdem wurde an das 20-HETE-Molekül ein Kohlenstoffatom angefügt, wodurch ein Analoges mit 21 Kohlenstoffatomen entstand (21-Hydroxyheneicosa- 5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)-tetraensäure (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung) (Fig. 1). Schließlich wurden die Wasserstoffatome am Kohlenstoffatom 20 durch Methylgruppen ersetzt (20,20-Dimethyl-20-HETE (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung). Nach einer Äquilibrierungsperiode wurden kumulative Dosis/Wirkungs-Kurven für diese Analogen (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) in Gegenwart von Indomethacin, Baicalein und 17-ODYA erzeugt. Der vaskuläre Durchmesser wurde 2 bis 3 Minuten nach Zugabe dieser Verbindungen zu dem Bad aufgezeichnet.

Antagonistische Aktivität gegen 20-HETE

Die inaktiven Analogen von 20-HETE wurden ferner auf ihre antagonistische Aktivität getestet. Bei diesen Versuchen wurden kumulative Dosis/Wirkungs-Kurven gegenüber 20-HETE (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) vor und nach Zugabe von 5(S)-HETE (0,5 uM), 8(S)-HETE (1 uM), 12(S)-HETE (0,5 uM), 15(S)-HETE (1 uM), 19(S)-HETE (1 uM), des C&sub1;&sub9;-Analogen (1 uM), von Arachidonsäure (1 uM), 20-Carboxyarachidonsäure (1 uM), von reverser 20- HETE (1 uM), gesättigter 20-HETE (1 uM) und den gesättigten C19-Analogen (1 uM) (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung) zu dem Bad erzeugt. Die vaskulären Durchmesser wurden 2 bis 3 Minuten nach Zugabe der einzelnen Dosen von 20-HETE zu dem Bad aufgezeichnet.

Arzneistoffe und Chemikalien

Sämtliche Chemikalien waren von analytischer Reinheit. Indomethacin wurde von der Fa. Sigma Chemicals (St. Louis, MO), bezogen. 5(S)-, 8(S)-, 12(S)-, 15(S)-, 19(S)-HETE, Baicalein und 17-ODYA wurden von der Fa. Biomol. Corp., (Plymouth Meeting, PA) bezogen. 20-HETE, reverse 20-HETE, das Analoge mit 19-Kohlenstoffatomen, Dimethyl-20-HETE, 21-HETE, 20- Carboxyarachidonsäure und die gesättigten und partiell gesättigten C19- und 20-HETE-Analogen wurden alle nach den folgenden Angaben hergestellt.

Chemische Synthesen von 20-HETE und Analogen

Die folgenden Herstellungen beziehen sich auf die Figg. 1, 8A, B, C, D, E und F.

Herstellung von 20-HETE (9b) (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung)

Unter heftigem Rühren wurde eine Lösung von Methyl-14,15- dihydroxyeicosatrienoat (1) (700 mg, 1,98 mmol) in wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (30 ml) bei -40ºC mit Pb(OAc)&sub4; (890 mg, 2,00 mmol) innerhalb von 2 Minuten portionsweise versetzt (Schema 1, Fig. 8A). Nach 30 Minuten wurde das Reaktionsgemisch durch eine Kieselgelschicht geleitet, um anorganische Salze zu entfernen. Der Filterkuchen wurde mit EtOAc/Hexan (1 : 1, 30 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden unter Vakuum eingedampft. Man erhielt den Aldehyd 2 (435 mg, 87%) in Form eines labilen, farblosen Öls, das sofort in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,60-1,78 (m, 2H), 2,00-2,15 (m, 2H) 2,30 (t, J~7,4 Hz, 2H) 2,70-2,85 (m, 4H), 3,18-3,28 (m, 2H), 3,65 (s, 3H), 5,28-5,75 (m, 6H), 9,65 (t, J~1,8 Hz, 1H);
TLC: EtOAc/Hexan (1 : 1), Rf~0,5.
Natriumborhydrid (139 mg, 3,65 mmol) wurde portionsweise zu einer gerührten Lösung der rohen Verbindung 2 (435 mg, 1,76 mmol) in MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 2, 10 ml) gegeben. Nach 45 Minuten wurde das Gemisch unter vermindertem Druck eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; unter Verwendung von EtOAc/Hexanen (2 : 3) gereinigt. Man erhielt den Alkohol 3 (350 mg, 80%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,60-1,75 (m, 2H), 2,04-2,15 (m, 2H), 2,25-2,38 (m, 4H), 2,72-2,85 (m, 4H), 3,65 (t, J~7,2 Hz, 2H), 3,68 (s, 3H), 5,28-5,60 (m, 6H);
TLC: EtOAc/Hexane (1 : 1), Rf~0,39.
Triphenylphosphin (495 mg, 1,89 mmol) wurde portionsweise bei 0ºC zu einer gerührten Lösung der Verbindung 3 (340 mg, 1,35 mmol) und Tetrachlorkohlenstoff (585 mg, 1,75 mmol) in wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (15 ml) gegeben. Nach 40 Minuten wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; unter Verwendung von CH&sub2;Cl&sub2; als Elutionsmittel gereinigt. Man erhielt das Bromid 4 (375 mg, 88%) in Form eines mobilen, farblosen Öls.
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,64-1,75 (m, 2H), 2,04-2,15 (m, 2H), 2,25-2,36 (m, 2H), 2,60-2,70 (m, 2H), 2,75-2,84 (m, 4H), 3,38 (t, J~7,2 Hz, 2H), 3,65 (s, 3H), 5,30-5,60 (m, 6H);
TLC: EtOAc/Hexan (1 : 1) Rf~0,61.
Wässriges LiOH (2 ml einer 1 M Lösung) wurde tropfenweise bei 0ºC zu einer Lösung der Verbindung 4 (375 mg, 1,19 mmol) in Tetrahydrofuran (THF)/H&sub2;O (5 : 1, 20 ml) gegeben. Nach 12-stündigem Rühren bei Umgebungstemperatur wurde der pH-Wert unter Verwendung einer 1 M wässrigen Oxalsäurelösung auf 4, 5 eingestellt. Das THF wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit H&sub2;O (15 ml) und mit EtOAc (3 · 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O (15 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Man erhielt die Bromsäure 5 (318 mg, 89%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,63-1,76 (m, 2H), 2,08-2,16 (m, 2H), 2,40 (t, J~7,1 Hz, 2H), 2,60-2,70 (m, 2H), 2,75-2,86 (m, 4H), 3,40 (t, J~7,2 Hz, 2H), 5,30-5,55 (m, 6H);
TLC: EtOAc/Hexane (3 : 1), Rf~0,34.
Ein Gemisch aus Triphenylphosphin (524 mg, 2 mmol, 3,5 Äquivalente) und der Bromsäure 5 (305 mg, 1 mmol) in wasserfreiem CH&sub3;CN (6 ml) wurde 60 Stunden in einem geschlossenen Rohr auf 85ºC erwärmt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels und chromatographischer Reinigung an SiO&sub2; unter Verwendung von MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (5 : 95) erhielt man das Phosphoniumsalz 6 (530 mg, 92%) in Form eines viskosen, hygroskopischen Öls.
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,55-1,70 (m, 2H), 1,96-2,10 (m, 2H), 2,40 (t, J~7,1 Hz, 2H), 2,42-2,60 (m, 2H), 2,62-2,70 (m, 4H) 3,75-3,88 (m, 2H), 5,20-5,50 (m, 6H), 7,65-7,80 (m, 15H);
TLC: MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 7), Rf~0,21.
Lithium-bis-(trimethylsilyl)-amid (0,32 ml einer 1 M Lösung in THF) wurde tropfenweise bei -78ºC zu einer Lösung der Verbindung 6 (90 mg, 0,16 mmol) in THF/Hexamethylphosphorsäureamid (HMPA) (4 : 1, 2,5 ml) gegeben. Das Gemisch entwickelte allmählich die für Ylide charakteristische dunkelgelbe Färbung. Das Reaktionsgemisch wurde 1 Stunde bei -40ºC gehalten, wieder auf -78ºC abgekühlt und tropfenweise mit einer Lösung des Aldehyds 12b (30 mg, 0,133 mmol) in wasserfreiem THF (1 ml) versetzt. Nach weiteren 1,5 Stunden wurde die Reaktion mit 50% wässrigem NH&sub4;OAc gestoppt. Nach Extraktion mit EtOAc (3 · 10 ml) wurden die vereinigten organischen Extrakte mit H&sub2;O (2 · 5 ml) und Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Der nach Abdampfen des Lösungsmittels unter Vakuum erhaltene Rückstand wurde in MeOH/Et&sub2;O (1 : 5, 4 ml) gelöst und bei 0ºC mit einem Überschuss an Diazomethan in Ether 0,5 Stunden behandelt. Nach Entfernung sämtlicher flüchtiger Bestandteile und nach chromatographischer Reinigung des erhaltenen Öls an SiO&sub2; unter Verwendung von EtOAc/Hexanen (1 : 10) erhielt man ein Gemisch aus dem Silylester 7b und Δ14,15-trans-7b (8 : 1, 73%), das zweckmäßigerweise erst nach der nächsten Stufe aufgetrennt wurde.
¹H-NMR des 7b/Δ14,15-trans-7b-Gemisches (250 MHz, CDCl&sub3;): δ 0,84 (s, 9H), 1,20-1,75 (m, 8H), 2,00-2,18 (m, 4H), 2,30 (t, J~7,5 Hz, 2H), 2,72- 2,85 (m, 6H), 3,60 (t, J~7,3 Hz, 2H), 3,65 (s, 3H), 5,30-5,40 (m, 8H), 7,38-7,45 (m, 6H), 7,59-7,68 (m, 4H);
TLC: EtOAc/Hexane (1 : 2), Rf~0,62.
Eine Lösung von 7b/Δ14,15-trans-7b (63 mg, 0,11 mmol) und n- Tetrabutylammoniumfluorid (0,22 mmol, 5 Äquivalente) in THF (8 ml) wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach Abdampfen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in EtOAc (10 ml) gelöst, sodann mit H&sub2;O (2 · 5 ml) und Kochsalzlösung (8 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingeengt. Nach Säulenchromatographie (SiO&sub2;) des Rückstands unter Verwendung von Et&sub2;O/Hexanen (7 : 3) erhielt man ein Gemisch des Esters 8b und seines Δ14,15-trans-Isomeren (77%) in Form eines farblosen Öls, das durch HPLC an einer Varian Microsorb Si 5 u-Säule (10 · 250 mm) unter isokratischer Elution mit Hexan/EtOH (99,4 : 0,6) mit 6 ml/min und unter Überwachung bei 205 nm (8b: Rt~32,4 min. Δ14,15-trans-8b: Rt~34,8 min) aufgetrennt wurde.
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;) δ 1,25-1,75 (m, 8H), 2,00-2,20 (m, 5H), 2,30 (t, J~7,5 Hz, 2H), 2,72-2,85 (m, 6H), 3,65 (t, J~7,3 Hz, 2 H), 3,70 (s, 3H), 5,30-5,50 (m, 8H).
Wässriges NaOH (0,149 ml einer 1 M Lösung, 0,149 mmol) wurde bei 0ºC zu einer Lösung der Verbindung 8b (12,4 mg, 0,037 mmol) in THF/H&sub2;O (3 : 1, 2 ml) gegeben. Nach Rühren über Nacht bei Raumtemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit H&sub2;O (3 ml) verdünnt, durch tropfenweise Zugabe von 1 M wässriger Oxalsäure auf den pH-Wert 6,5 eingestellt und sodann mit EtOAc (3 · 3 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O (10 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Man erhielt 20-HETE (9b) (8,5 mg, 72%) in Form eines farblosen Öls, das in jeglicher Hinsicht mit einer authentischen Probe identisch war.
¹HPLC: Phenomenex Nucleosil 5 u C&sub1;&sub8;-Säule (4,6 · 250 mm) unter linearer Elution von CH&sub3;CN/H&sub2;O/HOAc (49,95 : 49,95 : 0,1) bis CH&sub3;CN/HOAc (99,9 : 0,1) innerhalb von 40 Minuten mit 1 ml/min und Überwachung bei 205 nm (Rt~18 min).
TLC: MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 10), Rf~0,45.

Herstellung des Aldehyds 12b

tert.-Butylchlordiphenylsilan (400 mg, 1,45 mmol) und AgNO&sub3; (250 mg, 1,47 mmol) wurden zu einer Lösung von 1,6-Hexandiol (10b) (343 mg, 2,90 mmol) in THF/Pyridin (15 : 1, 32 ml) gegeben (eq. 1). Nach 12-stündigem Rühren im Dunklen wurde das Reaktionsgemisch durch eine Celite-Schicht filtriert. Der Filterkuchen wurde mit THF (10 ml) gewaschen. Die vereinigten Filtrate wurden eingedampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; unter Verwendung von MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 49) gereinigt. Man erhielt die Verbindung 11b (495 mg, 96%, bezogen auf das Silylierungsmittel).
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,04 (s, 9H), 1,16-1,70 (m, 8H), 3,48-3,76 (m, 4H), 7,38-7,44 (m, 6H), 7,61-7,66 (m, 4H);
TLC: MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (5 : 95), Rf~0,49.
Frisch destilliertes Oxalylchlorid (353 mg, 2,78 mmol) wurde bei -78ºC zu einer Lösung von Methylsulfoxid (DMSO) (543 mg, 6,95 mmol) in wasserfreiem CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) gegeben. Nach 10 Minuten wurde Silylether 11b (495 mg, 1,39 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (3 ml) tropfenweise zugegeben. Das Gemisch wurde weitere 1,5 Stunden gerührt. Sodann wurde Triethylamin (702 mg, 6,95 mmol) zugegeben. Das Gemisch wurde innerhalb von 30 Minuten auf -20ºC erwärmt und sodann in gesättigte wässrige NaHCO&sub3;-Lösung gegossen. Nach Trennung der Phasen wurde die wässrige Phase mit CH&sub2;Cl&sub2; (2 · 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit Kochsalzlösung (15 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; unter Verwendung von CH&sub2;Cl&sub2; gereinigt. Man erhielt den Aldehyd 12b (450 mg, 92%).
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,04 (s, 9H), 1,36-1,80 (m, 8H), 2,24-2,52 (m, 2H), 3,64 (t, J~6 Hz, 2H), 7,32-7,44 (m, 6H), 7,63-7,70 (m, 4H), 9,72 (t, J~1,8 Hz, 1H);
TLC: MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; (1 : 49), Rf~0,71.

Herstellung von 19-Hydroxynonadeca-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)- tetraensäure (9a) und 21-Hydroxyheneicosa-5(Z),8(Z),11(Z),14(Z)- tetraensäure (9c) (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung)

Das C&sub1;&sub9;-Homologe 9a und das C&sub2;&sub1;-Homologe 9c wurden auf die gleiche Weise und in vergleichbaren Ausbeuten wie die Verbindung 9b (Schema 1) unter Verwendung des Wittig-Salzes 6 und der Aldehyde 12a bzw. 12c (eq. 1) hergestellt. Die TLC-Eigenschaften und die NMR-Spektren von 9a und 9c waren mit Ausnahme der Integration praktisch identisch mit 9b.

Herstellung von 20,20-Dimethyl-20-HETE (19) (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung)

MeLi (1,4 M Lösung in Et&sub2;O, 10,4 ml, 14,6 mmol) wurde tropfenweise unter Rühren bei Raumtemperatur zu einer Lösung von Methyl-6-heptenoat (13) (946 mg, 6,65 mmol) in wasserfreiem Et&sub2;O (30 ml) unter Argon gegeben (Schema 2, Fig. 8B). Nach 12 Stunden wurde das Reaktionsgemisch durch Zugabe von 5% Salzsäure auf den pH-Wert 4 eingestellt und mit EtOAc (3 · 10 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Sämtliche flüchtigen Bestandteile wurden unter Vakuum entfernt. Man erhielt den Alkohol 14 (950 mg, 100%), dessen Reinheit zur direkten Verwendung in der nächsten Stufe ausreichte.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,22 (s, 6H), 1,26-1,46 (m, 6H), 2,03- 2,18 (m, 2H), 4,92-5,08 (m, 2H), 5,72-5,90 (m, 1H);
TLC: EtOAc/Hexane (1 : 4), Rf~0,38.
Ein Gemisch aus dem Alkohol 14 (870 mg, 6,1 mmol), 3,4-Dihydro-2H- pyran (DHP) (1,12 ml, 12,2 mmol) und Pyridinium-p-toluolsulfonat (PPTS) (153 mg, 0,61 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (43 ml) wurde 12 Stunden bei Umgebungstemperatur gerührt und sodann mit Et&sub2;O (50 ml) verdünnt und filtriert. Das Filtrat wurde unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde an SiO&sub2; unter Verwendung von EtOAc/Hexanen (5 : 95) chromatographiert. Man erhielt den THP-Ether 15 (1,13 g, 82%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (250 MHz, CDCl&sub3;): δ 1,19 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 1,30-1,42 (m, 4H), 1,42-1,58 (m, 6H), 1,60-1,6B (m, 1H), 1,75-1,90 (m, 1H), 2,01-2,12- (m, 2H), 3,38-3,44 (m, 1H), 3,90-3,99 (m, 1H), 4,67-4,70 (m, 1H), 4,92- 5,08 (m, 2H), 5,72-5,90 (m, 1H);
TLC: EtOAc/Hexane (15 : 85), Rf~0,64.
Eine Lösung von THP-Ether 15 (565 mg, 2,5 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (10 ml) wurde bei 0ºC 10 Minuten lang mit einem kontinuierlichen O&sub3;-Strom gesättigt. Nach Spülen mit Argon zur Entfernung von überschüssigem O&sub3; wurde reines Me&sub2;S (1 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdampfen sämtlicher flüchtigen Bestandteile unter Vakuum und nach chromatographischer Reinigung des Rückstands an SiO&sub2; unter Verwendung von EtOAc/Hexan (15 : 85) als Elutionsmittel erhielt man den Aldehyd 16 (390 mg, 68%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,18 (s, 3H), 1,21 (s, 3H), 1,40-1,80 (m, 12H), 2,43 (dt, J~1,5 und 6,4 Hz, 2H), 3,40-3,52 (m, 1H), 3,90-4,00 (m, 1H), 4,68-4,74 (m, 1H), 9,78 (t, J~1,5 Hz, 1H);
TLC: EtOAc/Hexane (1 : 9), Rf~0,19.
Lithium-bis-(trimethylsilyl)-amid (0,3 ml einer 1 M Lösung, 0,30 mmol) wurde langsam bei -78ºC zu einer Suspension des Phosphoniumsalzes 6 (82 mg, 0,15 mmol) in THF/HMPA (4 : 1, 5 ml) unter Argon gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde weitere 30 Minuten bei -78ºC gerührt, sodann 1 Stunde auf -40ºC erwärmt und wieder auf -78ºC abgekühlt. Der Aldehyd 16 (43 mg, 0,19 mmol) in THF (1,5 ml) wurde tropfenweise bei -78ºC zu der vorstehenden gelben Ylidlösung gegeben. Nach 1, 2 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit 50%iger wässriger NH&sub4;OAc-Lösung versetzt und mit EtOAc (3 · 20 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O (5 ml) und Kochsalzlösung (5 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde in Et&sub2;O gelöst und 15 Minuten mit überschüssigem ätherischem CH&sub2;N&sub2; behandelt. Nach Abdampfen sämtlicher flüchtigen Bestandteile unter Vakuum und Reinigung des Rückstands durch PTLC [SiO&sub2;: Et&sub2;O/Hexane (7 : 3), Rf~0,56] erhielt man den THP-Ester 17 (35 mg, 53%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,20 (s, 3H), 1,23 (s, 3H), 1,23-1,85 (m, 12H), 1,95-2,20 (m, 4H), 2,34 (t, J~7,6 Hz, 2H), 2,70-2,90 (m, 6H), 3,35-3,50 (m, 1H), 3,68 (s, 3H), 3,85-4,00 (m, 1H), 4,68-4,74 (m, 1H), 5,20-5,45 (m, 8H).
Ein Gemisch des THP-Esters 17 (35 mg, 0,08 mmol) und PPTS (2 mg) in MeOH (1 ml) wurde 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Nach Abdampfen des Lösungsmittels unter Vakuum und Reinigung des Rückstands durch PTLC [SiO&sub2;: Et&sub2;O/Hexan (7 : 3), Rf~0,38] erhielt man den Hydroxyester 18 (23 mg, 80%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,23 (s, 6H), 1,31-1,52 (m, 6H), 1,71 (Quintett, J~7,2 Hz, 2H), 2,02-2,20 (m, 4H), 2,35 (t, J~7,4 Hz, 2H), 2,74-2,90 (m, 6H), 3,67 (s, 3H), 5,25-5,46 (m, SH).
Ein Gemisch aus dem Ester 18 (11 mg, 0,03 mmol) und wässrigem LiOH (0,17 ml einer 1 M Lösung von 0,17 mmol) in THF/H&sub2;O (4 : 1, 2,5 ml) wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Der pH-Wert des Reaktionsgemisches wurde durch Zugabe von 1 M wässriger Oxalsäure auf 4 eingestellt. Die angesäuerte Lösung wurde mit EtOAc (3 · 5 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O (10 ml) und Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen und unter Vakuum eingedampft. Man erhielt 20,20-Dimethyl-20- HETE (19) (9,8 mg, 93%) als farbloses Öl.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,21 (s, 6H), 1,30-1,52 (m, 6H), 1,71 (Quintett, J~7,3 Hz. 2H), 2,03-2,20 (m, 4H), 2,33 (t, J~7,6 Hz, 2H), 2,72-2,87 (m, 6H), 5,25-5,45 (m, 8H).

Herstellung von 14,15-Dehydro-20-HETE (26) (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung)

Ein Gemisch aus dem Ester 7b (1,0 g, 1,74 mmol) und LiOH (9 ml einer 1 M Lösung, 9 mmol) in THF/H&sub2;O (4 : 1, 20 ml) wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wurde das organische Lösungsmittel unter Vakuum abgedampft (Schema 3, Fig. 8B). Der Rückstand wurde mit H&sub2;O (10 ml) verdünnt, mit: 1 M Oxalsäure auf den pH-Wert 5,5 angesäuert und mit EtOAc (3 · 50 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O (50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Man erhielt die Säure 20 (960 mg, 98%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,03 (s, 9H), 1,20-1,42 (m, 4H), 1,44- 1,60 (m, 2H), 1,67 (Quintett, J~7,1 Hz, 2H), 1,92-2,18 (m, 4H), 2,34 (t, J~7,2 Hz, 2H), 2,68-2,88 (m, 6H), 3,63 (t, J~7,4 Hz, 2H), 5,25-5,46 (m, 8H), 7,28-7,47 (m, 6H). 7,55-7,70 (m, 4H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexane (1 : 4), Rf~0,15.
Ein Gemisch aus der Säure 20 (960 mg, 1,72 mmol) und 1,1'- Carbonyldiimidazol (Im&sub2;CO) (418 mg, 2,58 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (35 ml) wurde 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und sodann unter Rühren bei 0ºC in eine 3,5 M ätherische H&sub2;O&sub2;-Lösung (20 ml, 69 mmol) mit einem Gehalt an einer katalytischen Menge an Lithiumimidazol mit einer Kanüle übertragen. Nach 5 Minuten wurde das Reaktionsgemisch mit CH&sub2;Cl&sub2; (25 ml) verdünnt und mit pulverisiertem KH&sub2;PO&sub4; (1,4 g, 10,32 mmol) versetzt. Der Rührvorgang wurde weitere 5 Minuten bei 0ºC fortgesetzt. Die erhaltene Suspension wurde durch einen Wattebausch in einen mit Argon gespülten Kolben filtriert, der eine Suspension von wasserfreiem Na&sub2;SO&sub4; (3 g) in CH&sub2;Cl&sub2; (30 ml) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre stehen gelassen, filtriert und mit Kochsalzlösung (40 ml) gewaschen, bis die wässrige Phase beim Test auf Wasserstoffperoxid mit Stärke-12-Papier negativ reagierte. Die organische Phase wurde unter Vakuum abgedampft. Der Rückstand wurde in Et&sub2;O/MeOH (3 : 1, 15 ml) gelöst. Die Lösung wurde bei 0ºC langsam mit überschüssigem ätherischem CH&sub2;N&sub2; versetzt, bis die gelbe Färbung 15 Minuten lang anhielt. Nach Entfernen des Lösungsmittels unter Vakuum unter chromatographischer Reinigung des Rückstands an einer SiO&sub2;-Säule erhielt man das Epoxid 21 (650 mg, 65%) in Form eines farblosen Öls zusammen mit zurückgewonnenem 7b (200 mg).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,05 (s, 9H), 1,29-1,65 (m, 8H), 1,73 (Quintett, J~7,2 Hz, 2H), 2,12 (dt, J~6,3 und 12,5 Hz, 2H), 2,18-2,47 (m, 2H), 2,34 (t, J~7,4 Hz, 2H), 2,67-3,00 (m, 6H), 3,64 (s, 3H), 3,66 (t, J~7,1 Hz, 2H), 5,28-5,58 (m, 6H), 7,30-7,50 (m, 6H), 7,60-7,74 (m, 4H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 4), Rf~0,39.
Eine Lösung des Epoxids 21 (650 mg, 1,1 mmol) in peroxidfreiem THF (5 ml) wurde tropfenweise unter Rühren bei 0ºC unter argon zu einem Gemisch aus AcOH/THF/gesättigten wässrigem KBr (20 : 4 : 3, 27 ml) gegeben. Nach 10 Stunden wurde das Reaktionsgemisch unter Vakuum auf ein Viertel seines Volumens eingeengt, mit H&sub2;O (10 ml) verdünnt und 3-mal mit Et&sub2;O extrahiert. Die vereinigten ätherischen Extrakte wurden mit 10%iger wässriger NaHCO&sub3;-Lösung, H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Nach Passage des Rückstands über eine kurze SiO&sub2;-Säule erhielt man das Bromhydrin 22 (700 mg, 94%) in Form eines untrennbaren Gemisches von Regioisomeren.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,05 (s, 9H), 1,16-1,48 (m, 4H), 1,49- 1,64 (m, 2H), 1,71 (Quintett J~7,3 Hz, 2H), 1,80-2,07 (m, 2H), 2,13 (dt, J~6,5 und 13,3 Hz, 2H), 2,35 (t, J~7,3 Hz, 2H), 2,42 (t, J~6,5 Hz, 1H, D&sub2;O austauschbar), 2,66-2,95 (m, 4H), 3,41-3,57 (m, 1H), 3,64 (t, J~7,2 Hz, 2H), 3,65 (s, 3H), 4,00-4,15 (m, 1H), 5,27-5,61 (m, 6H), 7,27 (m, 6H), 7,59-7,70 (m, 4H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexane (1 : 4), Rf~0,39.
Eine Lösung des Bromhydrins 22 (700 mg, 1,05 mmol) in Aceton (4 ml) wurde tropfenweise bei -20ºC zu einer Lösung von Jones-Reagenz (0,7 ml einer 2 M Lösung, 1,57 mmol) in Aceton (15 ml) gegeben. Die Reaktion wurde nach 30 Minuten durch langsame Zugabe von überschüssigem i-PrOH gestoppt. Nach Filtration zur Entfernung von Chromsalzen wurde das Filtrat unter Vakuum eingedampft. Der Rückstand wurde mit H&sub2;O (10 ml) und Et&sub2;O (8 ml) ausgeschüttelt. Die Phasen wurden getrennt und die wässrige Fraktion wurde weitere 2-mal mit Et&sub2;O extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden mit Kochsalzlösung (10 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Durch Reinigung des Rückstands an einer SiO&sub2;-Säule erhielt man das Bromketon 23 (500 mg, 72%) in Form eines farblosen Öls, das sofort bei der nächsten Stufe eingesetzt wurde.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,07 (s, 9H), 1,20-1,80 (m, 8H), 2,02- 2,17 (m, 2H), 2,34 (t, J~7,4 Hz, 2H), 2,64-2,91 (m, 4H), 3,40-3,54 (m, 2H), 3,64 (s, 3H), 3,66 (t, J~6,1 Hz, 2H), 4,17-4,85 (m, 1H), 5,25-5,70 (m, 6H), 7,30-7,48 (m, 6H), 7,60-7,78 (m, 4H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 4), Rf~0,46.
Ein Gemisch aus dem Bromketon 23 (400 mg, 0,599 mmol), Tosylhydrazin (224 mg, 1,199 mmol) und Hydrochinon (7 mg, 0,06 mmol) wurde 32 Stunden bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre in CH&sub2;Cl&sub2;/HOAc (2 : 1, 9 ml) gerührt, sodann mit H&sub2;O (20 ml) verdünnt und mit Et&sub2;O (3 · 50 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Nach Reinigung durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; erhielt man das Acetylen 24 (140 mg, 41%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,05 (s, 9H), 1,41-1,60 (m, 6H), 1,72 (Quintett, J~7,2 Hz, 2H), 1,97-2,19 (m, 4H), 2,31 (t, J~7,3 Hz, 2H), 2,68-2,84 (m, 4H), 2,85-2,98 (m, 2H), 3,63 (t, J~7,1 Hz, 2H), 3,65 (s, 3H), 5,29-5,50 (m, 6H), 7,33-7,48 (m, 6H), 7,63-7,72 (m, 4H);
TLC: SiO&sub2;, Et&sub2;O/Hexan (1 : 1), Rf~0,53.
Ein Gemisch aus dem Silylmethylester 24 (140 mg, 0,245 mmol) und n- Tetrabutylammoniumfluorid (1,2 ml einer 1 M Lösung, 1,2 mmol) in wasserfreiem THF (5 ml) wurde 12 Stunden bei 0ºC unter einer Argonatmosphäre gerührt und sodann unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde in EtOAc (50 ml) gelöst, mit H&sub2;O (30 ml) und Kochsalzlösung (30 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Nach Reinigung des Rückstands durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; erhielt man den Hydroxyester 25 (50 mg, 62%) als labiles, farbloses Öl.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,36-1,67 (m, 6H), 1,72 (Quintett, J~7,3 Hz, 2H), 2,02-2,24 (m, 4H), 2,33 (t, J~7,5 Hz, 2H), 2,75-2,88 (m, 4H), 2,89-3,00 (m, 2H), 3,65 (t, J~6,8 Hz, 2H), 3,67 (s, 3H), 5,30-5,53 (m, 6H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 3), Rf~0,14.
Der Ester 25 (4,8 mg, 0,014 mmol) und LiOH (72 ul einer 1 M Lösung, 0,072 mmol) wurden bei Raumtemperatur in THF/H&sub2;O (5 : 2, 1,5 ml) 12 Stunden unter einer Argonatmosphäre gerührt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit 1 M Oxalsäure auf den pH-Wert 6,5 eingestellt und 3-mal mit EtOAc extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Man erhielt die Acetylensäure 26 (4,7 mg, > 95%) in Form eines labilen, farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,35-1,65 (m, 6H), 1,71 (Quintett, J~7,3 Hz, 2H), 2,02-2,24 (m, 4H), 2,37 (t, J~7,3 Hz, 2H), 2,70-2,88 (m, 4H), 2,89-2,99 (m, 2H), 3,67 (t, J~5,4 Hz, 2H), 5,28-5,54 (m, 6H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (3 : 7), Rf~0,15.

Herstellung von 19(S)-HETE (34) und 19(R)-HETE (36) (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung)

Eine ätherische Lösung (2 ml) von 4-Brombuten (1,31 g, 9,76 mmol) wurde bei 0ºC tropfenweise zu einer Suspension von frisch aktivierten Magnesiumspänen (238 mg, 9,79 mmol) in Et&sub2;O (7 ml) gegeben (Schema 4, Fig. 8D). Sodann ließ man das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmen und ließ es 3 Stunden stehen. Die erhaltene homogene, blassgelbe Lösung des Grignard-Reagenz 28 wurde bei -20ºC mit einer Kanüle unter positivem Stickstoffdruck in eine gerührte Suspension von CuCN (88 mg, 0,98 mmol) in trockenem THF (10 ml) übertragen. Nach 20 Minuten wurde (S)-(-)-Propylenoxid (27) (94,6 mg, 1,62 mmol) als Reinsubstanz zu der homogenen Cupratlösung gegeben. Die Lösung wurde sodann 12 Stunden bei 0ºC gerührt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von gesättigter wässriger NH&sub4;Cl-Lösung gestoppt. Nach Extraktion mit EtOAc (3 · 10 ml) wurden die vereinigten organischen Extrakte mit H&sub2;O (2 · 10 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Nach Reinigung des Rückstands durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; erhielt man den Alkohol 29 (623 mg, 81%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ (d, J~6,7 Hz, 3H), 1,32-1,37 (m, 4H), 1,91-2,12 (m, 2H), 3,80-3,82 (m, 1H), 4,93-5,05 (m, 2H), 5,79-5,88 (m, 1H);
TLC: SiO&sub2;, Et&sub2;O/Hexan (1 : 1), Rf~0,52.
AgNO&sub3; (543 mg, 3,21 mmol) und tert.-Butylchlordiphenylsilan (840 mg, 3,05 mmol) wurden nacheinander bei Raumtemperatur zu einer Lösung des Alkohols 29 (317 mg, 2,78 mmol) in THF/Pyridin (14 : 1, 10 ml) gegeben. Nach 12 Stunden wurde das Reaktionsgemisch durch eine Celite-Schicht filtriert. Der Filterkuchen wurde mit Et&sub2;O (10 ml) gewaschen. Das wässrige Filtrat wurde abgetrennt und mit Et&sub2;O (2 · 10 ml) extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden mit gesättigter wässriger CuSO&sub4;- Lösung, H&sub2;O (2 · 50 ml) und Kochsalzlösung (50 ml) gewaschen und über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet. Sodann wurden sämtliche flüchtigen Bestandteile unter vermindertem Druck entfernt. Nach Reinigung des Rückstands durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; (5% Et&sub2;O/Hexan) erhielt man den Silylether 30 (820 mg, 84%) in Form eines mobilen, farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 1,05 (s, 9H), 1,08 (d, J~6,4 Hz, 3H), 1,32-1,60 (m, 4H), 1,92-2,01 (m, 2H), 3,80-3,92 (m, 1H), 4,91-5,00 (m, 2H), 5,70-5,81 (m, 1H), 7,33-7,48 (m, 6H), 7,64-7,75 (m, 4H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 9), Rf~0,9.
Ozon wurde 15 Minuten bei 0ºC durch eine Lösung der Verbindung 30 (500 mg, 1,42 mmol) in trockenem CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) geleitet. Danach ergab eine dünnschichtchromatographische Analyse, dass kein Ausgangsmaterial mehr verblieben war. Das Reaktionsgemisch wurde kurz mit Argon gespült und sodann unter Rühren mit überschüssigem Me&sub2;S (2 ml) versetzt. Man ließ das Gemisch sodann auf Raumtemperatur erwärmen. Nach 12 Stunden wurden sämtliche flüchtigen Bestandteile unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; gereinigt. Man erhielt den Aldehyd 31 (387 mg, 77%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,05 (s, 9H), 1,08 (d, J~6,2 Hz, 3H), 1,39-1,50 (m, 2H), 1,51-1,70 (m, 2H), 2,29 (dt, J~1,8 und 7,1 Hz, 2H), 3,78-3,95 (m, 1H), 7,32-7,49 (m, 6H), 7,62-7,73 (m, 4H), 9,67 (t, J~1,8 Hz, 1H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 9), Rf~0,39.
Durch Wittig-Kondensation des Aldehyds 31, (1,81 mg, 0,507 mmol) mit dem Ylid 6 (220 mg) und durch Veresterung des Addukts unter Verwendung von Diazomethan gemäß den Angaben für die Umsetzung von 12 zu 7 (Schema 1) erhielt man das Addukt 32 (144 mg, 66%) in Form eines farblosen Öls, das durch PTLC gereinigt wurde [SiO&sub2;: EtOAc/Hexan (1 : 4), Rf~0,64].
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,05 (s, 9H), 1,07 (d, J~6,3 Hz, 3H), 1,30-1,49 (m, 4H), 1,72 (Quintett, J~7,3 Hz, 2H), 1,90-2,03 (m, 2H), 2,05-2,15 (m, 2H), 2,33 (t, J~7,4 Hz, 2H), 2,64-2,89 (m, 6H), 3,67 (s, 3H), 3,75-3,90 (m, 1H), 5,20-5,47 (m, 8H), 7,28-7,49 (m, 6H), 7,62-7,71 (m, 4H).
Durch Desilylierung der Verbindung 32 (450 mg) erhielt man den Hydroxyester 33 (210 mg, 78%). Anschließend wurde das für die Umwandlung von 7 in 8 beschriebene Verfahren eingehalten (Schema 1).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,20 (d, J~6,3 Hz, 3H), 1,40-1,53 (m, 4H), 1,71 (Quintett, J~7,4 Hz, 2H), 2,06-2,17 (m, 4H), 2,33 (t, J~7,4, 2H), 2,74-2,88 (m, 6H), 3,68 (s, 3H), 3,75-3,86 (m, 1H), 5,32-5,49 (m, 8H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 3), Rf~0,23.
Diethylazodicarboxylat (DEAD) (68 mg, 0,387 mmol) wurde als Reinsubstanz unter Rühren bei Raumtemperatur unter einer Argonatmosphäre zu einer Lösung des Alkohols 33 (100 mg, 0,299 mmol), Ph&sub3;P (102 mg, 0,389 mmol) und Benzoesäure (48 mg, 0,389 mmol) in wasserfreiem Benzol (3 ml) gegeben. Nach 2 Stunden wurden sämtliche flüchtigen Bestandteile unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; gereinigt. Man erhielt das Benzoat 35 (109 mg, 83%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,37 (d, J~6,2 Hz, 3H), 1,41-1,53 (m, 2H), 1,61-1,79 (m, 4H), 2,10 (q, J~7,3 Hz, 4H), 2,32 (t, J~7,4 Hz, 2H), 2,75-2,90 (m, 6H), 3,69 (s, 3H), 5,18 (m, 1H), 5,34-5,46 (m, 8H), 7,45 (t, J~7,1 Hz, 2H), 7,56 (t, J~7,1 Hz, 1H), 8,04 (d, J~7,1 Hz, 2H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 3), Rf~0,54.
Die Hydrolyse der Ester 33 und 35 zu den entsprechenden Verbindungen 19(S)-HETE (34) bzw. 19(R)-HETE (36) wurde gemäß den Angaben für die Umwandlung der Verbindung 18 in die Verbindung 19 durchgeführt (Schema 2, Fig. 8B)

Herstellung von 20-Hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-diensäure (50)

Eine Lösung der 5-Hexinsäure (37) (3,4 g, 30,35 mmol) in Et&sub2;O (6 ml) wurde tropfenweise bei 0ºC unter Rühren und unter Argon zu einer Lösung von LiAlH&sub4; (860 mg, 22,7 mmol) in Et&sub2;O (20 ml) gegeben (Schema 5, Fig. 8E). Sodann wurde das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur gebracht und 3 Stunden stehen gelassen. Anschließend wurde es auf 0ºC gekühlt und mit gesättigter wässriger Na&sub2;SO&sub4;-Lösung versetzt. Die erhaltene Suspension wurde durch eine Celite-Schicht filtriert. Der Filterkuchen wurde mit Et&sub2;O gewaschen. Die vereinigten Etherfiltrate wurden über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Man erhielt das 5-Hexin-1-ol (38) (3,02 g, 91%) in Form eines farblosen Öls von ausreichender Reinheit zur Verwendung bei der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung.
¹H NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 3,67-3,69 (m, 2H), 2,25 (dt, J~2,4 und 6,4 Hz, 2H), 1,96 (t, J~2,4 Hz, 1H), 1,57-1,72 (m, 4H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (3 : 7), Rf~0,38.
tert.-Butylchlordiphenylsilan (10,1 g, 36,97 mmol) wurde innerhalb von 5 Minuten bei Raumtemperatur zu einer Lösung des Alkohols 38 (3,02 g, 30,81 mmol) und Imidazol (2,51 g, 36,97 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (25 ml) gegeben. Nach 12 Stunden wurde das Reaktionsgemisch mit CH&sub2;Cl&sub2; (70 ml) verdünnt, mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Nach Reinigung des Rückstands an einer SiO&sub2;-Säule (5% EtOAc/Hexan) erhielt man den Silylether 39 (8,4 g, 86%) in Form eines blassgelben Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 7,65 (dd, J~1,6 und 7,6 Hz, 4H), 7,35- 7,42 (m, 6H), 3,65 (t, J~6,8 Hz, 2H), 2,19-2,22 (m, 2H), 1,92-1,94 (m, 1H), 1,55-1,71 (m, 4H), 1,10 (s, 9H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (15 : 85), Rf~0,56.
n-BuLi (0,66 ml einer 1,6 M Lösung in Hexan, 1,05 mmol) wurde tropfenweise bei -40ºC zu einer Lösung des Silylethers 39 (320 mg, 0,96 mmol) in THF (6 ml) gegeben. Anschließend wurde wasserfreies HMPA (1,5 ml) zugesetzt. Nach 1 Stunde wurde langsam eine Lösung von 1-Brom-7- (tetrahydropyranyloxy)-heptan (Neeland et al., J, Org. Chem., Bd. 59 (1994), S. 7383-7394) (40) (291 mg, 1,05 mmol) in THF (2 ml) zugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde innerhalb von 2 Stunden auf Raumtemperatur gebracht und 12 Stunden bei dieser Temperatur belassen. Sodann wurde es bei 0ºC mit einer wässrigen gesättigten NH&sub4;Cl-Lösung versetzt. Sodann wurde das Gemisch 3-mal mit Et&sub2;O extrahiert. Die vereinigten Etherextrakte wurden mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Nach Reinigung des Rückstands durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; (5% EtOAc/Hexan) erhielt man das Addukt 41 (310 mg, 63%) in Form eines mobilen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 7,66 (dd, J~1,6 und 7,6 Hz, 4H), 7,35- 7,42 (m, 6H), 4,56-4,58 (m, 1H), 3,83-3,88 (m, 1H), 3,71-3,75 (m, 1H), 3,67 (t, J~6 Hz, 2H), 3,46-3,50 (m, 1H), 3,34-3,39 (m, 1H), 2,11-2,16 (m, 4H), 1,78-1,88 (m, 2H), 1,42-1,77 (m, 12H), 1,29-1,41 (m, 6H), 1,08 (s, 9H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (15 : 85), Rf~0,70.
Ein Gemisch aus dem Acetylen 41 (2,01 g, 3,93 mmol) und Pyridiniump-toluolsulfonat (98 mg, 0,393 mmol) in MeOH (12 ml) wurde 12 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann unter Vakuum eingeengt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; unter Verwendung von EtOAc/Hexan (1 : 9) gereinigt. Man erhielt den Alkohol 42 (1,61 g, 92%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 7,66 (dd, J~1,6 und 7,6 Hz, 4H), 7,35- 7,41 (m, 6H), 3,67 (t, J~6,4 Hz, 2H), 3,59-3,65 (m, 2H), 2,11-2,17 (m, 4H), 1,62-1,68 (m, 2H), 1,52-1,60 (m, 4H), 1,41-1,49 (m, 2H), 1,32-1,39 (m, 6H), 1,04 (s, 9H);
TLC, SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (2 : 3) Rf~0,33.
Kohlenstofftetrabromid (124 mg, 0,373 mmol), PPh&sub3; (98 mg, 0,373 mmol) und Pyridin (31 ul, 0,373 mmol) wurden nacheinander bei 0ºC zu einer Lösung des Alkohols 42 (140 mg, 0,311 mmol) in CH&sub2;Cl&sub2; (5 ml) gegeben. Nach 3 Stunden wurden sämtliche flüchtigen Bestandteile unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; (2% EtOAc/Hexan) gereinigt. Man erhielt das Bromid 43 (148 mg, 91%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 7,66 (dd,, J~1,6 und 8 Hz, 4H), 7,35- 7,41, (m, 6H), 3,67 (t, J~6,2 Hz, 2H), 3,38 (t, J~6,4 Hz, 2H), 2,11-2,16 (m, 4H), 1,84 (Quintett, J~7,4 Hz, 2H), 1,62-1,67 (m, 2H), 1,55-1,61 (m, 2H), 1,31-1,48 (m, 8H), 1,04 (s, 9H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 9) Rf~0,58.
n-BuLi (0,45 ml einer 1,6 M Lösung in Hexan, 0,72 mmol) wurde bei -40ºC tropfenweise zu einer Lösung von 7-(Tetrahydropyran-2-yloxy)-1- heptin (H. J. Bestmann et al., Synthesis (1992), S. 123M-1241) (44) (60 mg, 0,65 mmol) in THF (8 ml) und HMPA (2 ml) unter einer Argonatmosphäre gegeben. Nach 1 Stunde wurde eine Lösung des Bromids 43 (376 mg, 0,72 mmol) in THF (1 ml) eingeleitet. Sodann wurde das Reaktionsgemisch innerhalb von 1 Stunde auf Raumtemperatur erwärmt. Nach weiteren 16 Stunden bei Umgebungstemperatur wurde das Reaktionsgemisch mit einer gesättigten wässrigen NH&sub4;Cl-Lösung versetzt und mit Et&sub2;O (3 · 6 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Nach Reinigung des Rückstands durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; unter Verwendung von 5% EtOAc/Hexan als Elutionsmittel erhielt man das Bisacetylen 45 (84 mg, 61%) in Form eines blassgelben Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 7,66 (dd, J~1,6 und 8 Hz, 4H), 7,35-7,41 (m, 6H), 4,55-4,57 (m, 1H) 3,84-3,89 (m, 1H), 3,70-3,76 (m, 1H), 3,67 (t, J~6,2 Hz, 2H), 3,47-3,52 (m, 1H), 3,35-3,41 (m, 1H), 2,10-2,17 (m, 8H), 1,88-1,92 (m, 1H), 1,41-1,65 (m, 19H), 1,28-1,40 (m, 6H), 1,04 (s, 9H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 9), Rf~0,7.
NaBH&sub4; (32 mg, 0,8 mmol) wurde unter einer Wasserstoffatmosphäre portionsweise unter Rühren zu einer Lösung von Nickel(II)-acetat- tetrahydrat (200 mg, 0,8 mmol) in EtOH (600 ml) gegeben. Nach 30 Minuten wurde die Verbindung 45 (5,80 g, 16 mmol) in EtOH (50 ml) zugegeben, wonach die Zugabe von frisch destilliertem Ethylendiamin (4,8 g) folgte. Das heterogene Gemisch wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur unter Wasserstoff (1 atm) gehalten, sodann mit Et&sub2;O (600 ml) verdünnt und durch eine SiO&sub2;-Schicht filtriert. Nach Einengen des Filtrats unter Vakuum erhielt man das Dien 46 (4,40 g, 84%) in Form eines farblosen Öls, das keiner weiteren Reinigung bedurfte.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 7,66 (dd, J~1,6 und 8 Hz, 4H), 7,35-7,41 (m, 6H), 5,30-5,35 (m, 4H), 4,55-4,57 (m, 1H), 3,70-3,76 (m, 1H), 3,65 (t, J~6,4 Hz, 2H), 3,47-3,50 (m, 1H), 3,35-3,40 (m, 1H), 1,96-2,09 (m, 8H), 1,80-1,91 (m, 1H), 1,65-1,79 (m, 1H), 1,51-1,62 (m, 8H), 1,21-1,42 (m, 16H), 1,04 (s, 9H);
TLC: SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (1 : 9), Rf~0,75.
Ein Gemisch aus der Verbindung 46 (196 mg, 0,311 mmol) und n- Tetrabutylammoniumfluorid (1,55 ml einer 1 M Lösung in THF, 1,55 mmol) in THF (4 ml) wurde 3 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und sodann unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Nach Reinigung des Rückstands durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; unter Verwendung von 10% EtOAc/Hexan als Elutionsmittel erhielt man den Alkohol 47 (102 mg, 84%) in Form eines blassgelben Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 5,34-5,40 (m, 4H), 4,56-4,58 (m, 1H), 3,84-3,89 (m, 1H), 3,70-3,76 (m, 1H), 3,62-3,65 (m, 2H), 3,47-3,52 (m, 1H), 3,35-3,41 (m, 1H), 1,96-2,09 (m, 8H), 1,79-1,90 (m, 1H), 1,62-1,78 (m, 1H), 1,51-1,61 (m, 8H), 1,22-1,43 (m, 16H);
TLC: EtOAc/Hexan (3 : 7), Rf~0,52.
Eine Lösung des Alkohols 47 (11,4 mg, 0,036 mmol) und Pyridiniumdichromat (PDC) (81 mg, 0,216 mmol) in trockenem DMF (1,5 ml) wurde 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt, sodann mit H&sub2;O (2 ml) verdünnt und mit EtOAc (3 · 5 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und eingedampft. Der Rückstand wurde in Et&sub2;O/MeOH (4 : 1, 3 ml) gelöst und 30 Minuten bei 0ºC mit überschüssigem CH&sub2;N&sub2; behandelt. Sämtliche flüchtigen Bestandteile wurden unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde durch PTLC gereinigt [SiO&sub2;, EtOAc/Hexan (2 : 3), Rf~ 0,65]. Man erhielt den Ester 48 (7 mg, 62%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz) δ 5,35-5,41 (m, 4H), 4,56-4,58 (m, 1H), 3,84-3,89 (m, 1H), 3,70-3,76 (m, 1H), 3,66 (s, 3H), 3,47-3,52 (m, 1H), 3,35-3,41 (m, 1H), 2,31 (t, J~7,6 Hz, 2H), 1,94-2,09 (m, 8H), 1,78-1,90 (m, 1H), 1,64-1,78 (m, 1H), 1,45-1,62 (m, 6H), 1,21-1,42 (m, 16H).
Eine Lösung des vorstehenden THP-Esters 48 (7 mg, 0,016 mmol) und PPTS (1 mg) wurde bei Raumtemperatur in MeOH (1 ml) gerührt. Nach 12 Stunden wurde das Lösungsmittel unter Vakuum entfernt. Der Rückstand wurde in EtOAc (4 ml) gelöst, mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, getrocknet und zur Trockne eingedampft. Nach Reinigung des Rückstands durch PTLC (SiO&sub2;: EtOAc/Hexan (2 : 3), Rf~0,42) erhielt man den Hydroxyester 49 (4,3 mg, 80%) in Form eines farblosen Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 5,36-5,42 (m, 4H), 3,67 (s, 3H), 3,66 (t, J~6,8 Hz, 2H), 2,31 (t, J~7,2 Hz, 2H), 1,99-2,08 (m, 8H), 1,68 (Quintett, J~7,2 Hz, 2H), 1,55-1,61 (m, 2H), 1,28-1,39 (m, 15H).
Eine Hydrolyse des Hydroxyesters 49 (11 mg, 0,034 mmol) wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Verwendung von NaOH (0,134 ml einer 1 M Lösung in H&sub2;O) in THF/H&sub2;O (5 : 1, 2 ml) durchgeführt. Das THF wurde unter Vakuum entfernt. Das verbleibende wässrige Gemisch wurde mit 1 M Oxalsäure auf den pH-Wert 4 angesäuert. Die erhaltene trübe Suspension wurde mit EtOAc (3 · 5 ml) extrahiert. Die vereinigten Extrakte wurden mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum eingedampft. Nach Reinigung des Rückstands durch PTLC [SiO&sub2;: EtOAc/Hexan (1 : 1), Rf~0,3] erhielt man 20-Hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)- diensäure (50) (8 mg, 78%) in Form eines blassgelben Öls.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz): δ 5,36-5,42 (m, 4H), 3,66 (t, J~6,8 Hz, 2H), 2,35 (t, J~7,5 Hz, 2H), 1,98-2,11 (m, 8H), 1,69 (Quintett, J~7,5 Hz, 2H), 1,56-1,60 (m, 2H), 1,28-1,39 (m, 15H).

Herstellung von 20-Hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-diensäure (54)

Ein Gemisch aus dem Dien 46 (92 mg, 0,146 mmol) und PPTS (10 mg) in MeOH (4 ml) wurde über Nacht bei Raumtemperatur gehalten, sodann zur Entfernung des Methanols unter Vakuum eingeengt, mit EtOAc (20 ml) verdünnt, mit H&sub2;O und Kochsalzlösung gewaschen, über Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und unter Vakuum zur Trockne eingedampft (Schema 6). Nach Reinigung des Rückstands durch Säulenchromatographie an SiO&sub2; erhielt man den Alkohol 51 (62 mg, 79%) als farbloses Öl.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 7,66 (dd, J~1,6 und 8 Hz, 4H), 7,35-7,41 (m, 6H), 5,36-5,42 (m, 4H), 3,61-3,67 (m, 4H), 1,96-2,09 (m, 8H), 1,55- 1,66 (m, 6H), 1,22-1,41 (m, 15H), 1,04 (s, 9H);
TLC: EtOAc/Hexan (2 : 3), Rf~0,45.
Der Alkohol 51 (62 mg) wurde gemäß den Angaben zur Umwandlung der Verbindung 47 in die Verbindung 48 in den Ester 52 (65%) umgewandelt (Schema 5).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 7,66 (dd, J~1,6 und 8 Hz, 4H), 7,35-7,41 (m, 6H), 5,35-5,42 (m, 4H), 3,66 (s, 3H) 3,63-3,66 (m, 2H), 2,31 (t, J~7,6 Hz, 2H), 1,94-2,06 (m, 8H), 1,60-1,65 (m, 2H), 1,55-1,60 (m, 2H), 1,26-1,48 (m, 14H), 1,04 (s, 9H);
TLC: EtOAc/Hexan (1 : 1), Rf~0,62.
Der Silylester 52 (28 mg) wurde gemäß den Angaben zur Umwandlung der Verbindung 46 in die Verbindung 47 zum Alkohol 53 (11 mg, 80%) desilyliert (Schema 5, Fig. 8E).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 400 MHz): δ 5,35-5,42 (m, 4H), 3,66 (s, 3H), 3,62- 3,65 (m, 2H), 2,31 (t, J~7,6 Hz, 2H), 1,98-2,08 (m, 8H), 2,51-1,69 (m, 4H), 1,22-1,49 (m, 15H);
TLC: SiO&sub2;: EtOAc/Hexan (2 : 3), Rf~0,45.
Der Ester 53 (10 mg) wurde gemäß den Angaben zur Umwandlung der Verbindung 49 in die Verbindung 50 in die Säure 54 (8 mg, 78%) umgewandelt (Schema 5, Fig. 8E).
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 300 MHz): δ 5,30-5,42 (m, 4H), 3,66 (dt, J~0,9 und 6,3 Hz, 2H), 2,35 (t, J~7,2 Hz, 2H), 1,98-2,09 (m, 8H), 1,54-1,67 (m, 4H), 1,24-1,50 (m, 15H);
TLC: EtOAc/Hexan (1 : 1), Rf~0,3.

Herstellung von 20-Hydroxyeicosansäure (55) und 19- Hydroxynonadecansäure (56)

Ein Gemisch aus dem Ester 8b (5 mg) und 10% Pd/C (2 mg) in EtOH/EtOAc (9 : 1, 3 ml) wurde 8 Stunden unter einer Wasserstoffatmosphäre (1 atm) gerührt. Nach Verdünnen mit einem gleichen Volumen an Et&sub2;O wurde das Reaktionsgemisch durch eine Celite-Schicht filtriert. Der Filterkuchen wurde mit Et&sub2;O (4 ml) gewaschen. Nach Eindampfen der vereinigten Filtrate erhielt man Methyl-20-hydroxyeicosanoat (5 mg, 98%) in Form einer farblosen kautschukartigen Substanz.
¹H-NMR (CDCl&sub3;, 250 MHz): δ 1,20-1,42 (m, 30H), 1,51-1,68 (m, 4H), 2,32 (t, J~7,3 Hz, 2 H), 3,65 (t, J~6,6 Hz, 2H), 3,68 (s, 3H);
TLC: EtOAc/Hexane (3 : 7), Rf~0,37.
LiOH (45 ul) einer 1 M wässrigen Lösung wurde unter Rühren bei Raumtemperatur zu einer Lösung des vorstehenden Esters (5,2 mg, 0,015 mmol) in THF/H&sub2;O (5 : 1, 1,5 ml) gegeben. Nach 10 Stunden wurde der pH-Wert unter Verwendung von 1 M Oxalsäure auf 4 eingestellt. Sodann wurde das Reaktionsgemisch mit EtOAc (3 · 4 ml) extrahiert. Die vereinigten organischen Extrakte wurden unter Vakuum eingedampft. Man erhielt 20- Hydroxyeicosansäure (55) (4,5 mg, 92%) in Form eines Feststoffes vom F. 86ºC.
¹H-NMR (250 MHz, CD&sub3;OD): δ 1,20-1,45 (m, 30H), 1,45-1,63 (m, 4H) 2,28 (t, J~7,4 Hz, 2H), 3,55 (t, J~6,5 Hz, 2H);
TLC: EtOAc/Hexane (3 : 7), Rf~0,08.
19-Hydroxynonadecansäure (56) wurde in analoger Weise aus dem Ester 8a hergestellt.

Eicosatetraen-1,20-disäure (lediglich zu Erläuterungszwecken und nicht Gegenstand der Erfindung)

Die Herstellung erfolgte aus 20-HETE (9a) in einer Ausbeute von 84% gemäß den Angaben von S. Manna et al., Tetrahedron Lett., Bd. 24 (1983), S. 33-36.

Statistik

Es werden die Mittelwerte ± 1 SEM (Standardfehler) angegeben. Die Signifikanz der Unterschiede der Mittelwerte zwischen den Gruppen und innerhalb der Gruppen wurde durch Varianzanalyse für Wiederholungsmessungen gemäß dem Duncan-Mehrfachbereich-Test bestimmt. Ein P-Wert von < 0,05 unter Anwendung eines "two-tailed test" wurde als signifikant angesehen.

Ergebnisse

Die vasokonstriktorischen Reaktionen gegenüber den 20-HETE-Derivaten sind in Fig. 2 dargestellt. In renalen, interlobulären Arteriolen erzeugte 20-HETE (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) eine konzentrationsabhängige Abnahme des Durchmessers (-4,3 ± 0,8 bis -22,5 ± 1,5 um, n = 7) (Fig. 2A). Die Schwellenkonzentration von 20-HETE, die den vaskulären Durchmesser verringerte, betrug 10 nM. Im Gegensatz dazu wiesen 5(S)-, 8(S)-, 12(S)-, 15(S)- und 19(S)-HETE keinen signifikanten Einfluss auf den Durchmesser der renalen, interlobulären Arterien selbst bei einer Konzentration von 1 um auf (Fig. 2A).

Bedeutung weiterer struktureller Merkmale auf die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE

Die Einflüsse einer Verlängerung der Länge der Kohlenstoffkette auf die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE sind in Fig. 2B dargestellt. Das Derivat mit 21 Kohlenstoffatomen und das Dimethylderivat stellten ebenso starke Vasokonstriktoren dar wie 20-HETE. Jedoch wiesen Arachidonsäure, der eine Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom 20 fehlt, das 20-HETE-Analoge mit 19 Kohlenstoffatomen und 20-Carboxyarachidonsäure keinen signifikanten Einfluss auf den vaskulären Durchmesser auf. Gleichermaßen wies das gesättigte 20-HETE-Derivat, bei dem die Doppelbindungen zur Veränderung der tertiären Struktur des Moleküls beseitigt waren, keinen Einfluss auf den vaskulären Durchmesser auf (Fig. 2B). Im Gegensatz dazu stellte das partiell gesättigte 20-HETE-Derivat, bei dem nur zwei der vier Doppelbindungen entfernt worden waren, einen ebenso starken Konstriktor wie 20-HETE dar (Fig. 2B). Interessanterweise beseitigte ein Austausch der Positionen der Hydroxyl- und Carboxygruppen an den Kohlenstoffatomen 1 und 20 im partiell gesättigten, reversen 20- HETE-Analogen die agonistische Aktivität (Fig. 2B).

Determinanten der 20-HETE-antagonistischen Aktivität

Wir untersuchten ferner die Frage, ob die inaktiven 20-HETE-Analogen als Antagonisten der vasokonstriktorischen Reaktion auf 20-HETE dienen können. Dosis/Wirkungs-Kurven gegenüber 20-HETE wurden an isolierten, perfundierten, renalen Gefäßen vor und nach Zugabe von 0,5 bis 1 mM der verschiedenen Analogen zu dem Bad aufgestellt. Unter Kontrollbedingungen erzeugt 20-HETE (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) eine dosisabhängige Abnahme des Innendurchmessers (-6,4 ± 1,2 bis -21,8 ± 1,0 um, n = 10) (Fig. 3A). Eine Zugabe von 5- (n = 5) oder 15-HETE (n = 5) zum Bad blockierte die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE vollständig (Fig. 3A). Gleichermaßen wurde nach Zugabe von 19-HETE, des C&sub1;&sub9;-Analogen (n = 6) oder des partiell gesättigten, reversen 20-HETE (n = 3) zum Bad die Reaktion gegenüber 20-HETE vollständig beseitigt (Fig. 3B).
In weiteren Versuchen wurden die Einflüsse der Bewegung der Hydroxylgruppe näher zum hydrophoben Kopf von 20-HETE auf die antagonistische Aktivität untersucht. Bei diesen Untersuchungen ergab 20- HETE (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) eine Abnahme des Gefäßdurchmessers von -5,3 ± 0,6 bis -19,2 ± 1,9 um (n = 7) unter Kontrollbedingungen (Fig. 4A). Eine Zugabe von 8(S)- oder 12(S)-HETE (1 uM) wies keinen signifikanten Einfluss auf die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE auf (Fig. 4A). In Gegenwart von 8(S)-HETE bewirkte 20-HETE (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) immer noch eine Abnahme des Durchmessers dieser Gefäße von -2,8 ± 0,7 bis -16,9 ± 0,2 um (n = 3). Gleichermaßen ergab sich in Gegenwart von 12(S)-HETE durch 20-HETE (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) immer noch eine Abnahme des vaskulären Durchmessers von -5,5 ± 1,7 bis -16,2 ± 2,9 um (n = 5) (Fig. 4A).
Analoge von 20-HETE, denen eine Hydroxylgruppe fehlt, wirkten offensichtlich als echte kompetitive Antagonisten der vasokonstriktorischen Reaktion gegenüber 20-HETE. Beispielsweise verringerte Arachidonsäure (1 uM) die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 1 um 20-HETE erwartungsgemäß um 50% (Fig. 4B). Jedoch wies 20- Carboxy-AA keine signifikanten antagonistischen Eigenschaften auf (Fig. 4B).
Wir prüften sodann die Bedeutung der Doppelbindungen auf die 20- HETE-antagonistische Aktivität. Bei diesen Versuchen verringerte 20-HETE (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) den Durchmesser dieser Gefäße von -5,1 ± 0,5 bis -18,9 ± 0,8 um (n = 10) (Fig. 4B). Eine Zugabe des gesättigten Analogen mit 19 Kohlenstoffatomen zum Bad verringerte die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE um etwa 50% (Fig. 4B). Gleichermaßen wies auch das gesättigte 20-HETE-Derivat eine kompetitive antagonistische Aktivität auf (Fig. 4B). In Gegenwart dieser Verbindung verringerte 20-HETE (10&supmin;&sup8; bis 10&supmin;&sup6; M) den vaskulären Durchmesser nur um -0,9 ± 1,3 bis -7,0 ± 2,9 um (n = 5) (Fig. 4B).
Eine Zusammenfassung der speziellen Beispiele von Verbindungen, bei denen wir eine agonistische oder antagonistische Aktivität nachweisen konnten, ist in Fig. 5 dargestellt. Wie aus Fig. 5 ersichtlich ist, benötigen alle hier beschriebenen Verbindungen mit bekannten agonistischen und antagonistischen Eigenschaften eine Schleifenstruktur wie 20-HETE mit einem nicht-polaren Kopf sowie eine Hydroxylgruppe oder eine andere reaktive Gruppe in der Nähe des Kohlenstoffatoms 20. Wenn die Verbindung eine Hydroxylgruppe oder eine äquivalente reaktive Gruppe in einem Abstand von 5 oder 6 Kohlenstoffatomen von der Doppelbindung aufweist, handelt es sich um einen Agonisten. Wenn die OH-Gruppe sich nur in einem Abstand von 4 Kohlenstoffatomen von der Doppelbindung oder an einer anderen Stelle befindet, handelt es sich um einen Antagonisten. Aus diesen speziellen Beispielen leiteten wir eine allgemeinere Beschreibung der Struktur, die für die agonistische und antagonistische Aktivität erforderlich ist, in Fig. 6 ab. Ferner sind spezielle Beispiele für verwandte Strukturen aufgeführt (Fig. 7), für die auf der Grundlage der hier vorgelegten Informationen vorhergesagt werden kann, dass sie bei Anwendung der hier beschriebenen Tests eine agonistische oder antagonistische Aktivität aufweisen sollten.

Erörterung

In der vorliegenden Untersuchung wurden die vaskulären Einflüsse einer Reihe von Analogen von 20-HETE zur Bestimmung der strukturellen Determinanten der vasokonstriktorischen Reaktion gegenüber dieser Verbindung geprüft. Unsere Ergebnisse zeigen, dass Arachidonsäure, die sich von 20-HETE durch das Fehlen einer Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom 20 unterscheidet, renale, interlobuläre Arterien nicht verengt. Gleichermaßen wiesen 5-, 8-, 12-, 15- und 19-HETE, bei denen sich die Hydroxylgruppe an anderen Kohlenstoffatomen befindet, keinen Einfluss auf den vaskulären Durchmesser auf. Außerdem wies ein Derivat von 20-HETE mit 19 Kohlenstoffatomen keinen Einfluss auf den Gefäßtonus auf. Im Gegensatz dazu stellen 21-HETE und Dimethyl-20-HETE ebenso starke Konstriktoren wie 20-HETE dar. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine vasokonstriktorische Reaktion auf 20-HETE in kritischer Weise vom Vorliegen einer Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom 20 oder 21 abhängt.
Wir prüften ferner die Bedeutung der tertiären Struktur von 20-HETE für seine vasokonstriktorischen Eigenschaften. Die charakteristische Schleifenstruktur von 20-HETE und anderen Eicosanoiden wird durch Wechselwirkungen zwischen den Doppelbindungen im Molekül bestimmt. Daher wurden die vaskulären Reaktionen auf gesättigte und partiell gesättigte Analoge von 20-HETE mit den Reaktionen der nativen Verbindung verglichen. Wir stellten fest, dass das gesättigte 20-HETE-Analoge keinen Einfluss auf den Gefäßtonus hatte, während das partiell gesättigte Analoge, bei dem die Doppelbindungen zwischen den Kohlenstoffatomen 5 und 6 sowie 14 und 15 intakt waren, seine vasokonstriktorische Aktivität behielt. Diese Befunde zeigen, dass die Schleifenstruktur von 20-HETE ebenfalls für seine vasokonstriktorischen Eigenschaften wichtig ist.
Der vielleicht interessanteste Befund der vorliegenden Untersuchung besteht darin, dass Analoge von 20-HETE, denen eine vasokonstriktorische Aktivität fehlt, als Antagonisten dienen können. Diesbezüglich stellten Arachidonsäure, 5-, 15-, 19-HETE und das C19-Analoge durchweg sehr wirksame Antagonisten der vasokonstriktorischen Reaktion gegenüber 20- HETE dar. Ferner gab es vorhersagbare strukturelle Determinanten der antagonistischen Aktivität. Es hat somit den Anschein, dass eine Konservierung der hydrophoben Natur der Schleifenstruktur von 20-HETE für die antagonistische Aktivität kritisch ist. Beispielsweise konnten Moleküle wie 12- oder 8-HETE, die eine Hydroxylgruppe in der Nähe des Molekülkopfes aufweisen, nicht mit der mutmaßlichen 20-HETE- Bindungsstelle in Wechselwirkung treten und keinen Antagonismus gegen die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE entfalten. Aufgrund dieser Befunde ist vorherzusagen, dass 11(S)- und 7(S)-HETE sowie 8,9- und 11,12-EETs und DiHetes durchweg als 20-HETE-Antagonisten unwirksam sind.
Wir stellten ferner fest, dass die Doppelbindungen und die intakte Schleifenstruktur der 20-HETE-Analogen wichtige Determinanten der antagonistischen Aktivität sind. Diesbezüglich waren die gesättigten C19- und C20-Analogen von 20-HETE in Bezug auf die antagonistische Wirkung gegen die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE nicht ebenso wirksam wie die Ausgangsverbindungen. Ähnlich wie bei unseren Befunden für Analoge mit agonistischer Aktivität stellten wir fest, dass nur ein Paar von Doppelbindungen für die Aufrechterhaltung der antagonistischen Aktivität erforderlich ist. Diesbezüglich blockierte ein partiell gesättigtes, reverses 20-HETE-Analoges vollständig die vasokonstriktorische Reaktion gegenüber 20-HETE. Diese Verbindung ist von besonderem Interesse, da sie im Vergleich zu den übrigen Analogen biologisch stabiler sein sollte, da die Entfernung der Doppelbindungen zwischen den 8,9- und 11,12-Kohlenstoffatomen den Stoffwechsel dieser Verbindungen durch Cyclooxygenase- und Lipoxygenase-Ezyme blockieren sollte. Die Stabilität dieser Verbindung könnte auch durch Zugabe einer ionisierbaren Sulfonimidgruppe verstärkt werden, um den Stoffwechsel durch β-Oxidation und Veresterung zu blockieren. Kürzlich wurde berichtet, dass die Addition dieser Gruppe die in vivo-Bioverfügbarkeit verstärkt und die biologischen Aktivitäten von 20-HETE, EETs und Mechanismus-basierten Inhibitoren der Synthese von 20-HETE nicht verändern (Imig et al.., Hypertension, Bd. 33 (Teil 2) (1999), S. 408- 413).
Die vorliegenden Befunde, dass es bestimmte strukturelle Erfordernisse für die vasokonstriktorischen Wirkungen von 20-HETE gibt und dass die eng verwandten, inaktiven Analogen als 20-HETE-Antagonisten dienen, stellen den ersten Beweis für einen 20-HETE-Rezeptor dar. Die Natur dieses Rezeptors muss jedoch noch bestimmt werden. Klassische Rezeptoren sind üblicherweise mit der extrazellulären Seite der Membran assoziiert und stellen Mitglieder der 7-Transmembrandomänen-Familien von Proteinen dar. Die Einflüsse von 20-HETE auf die Aktivität des Kaliumkanals, den Gefäßtonus und das Wachstum und den Natriumtransport von renalen Tubuli ist mit der Aktivierung der PKC- und/oder der MAP- kinase-tyrosin-kinase-Aktivität verbunden (Sun et al., (1999), a.a.O.).
Es hat den Anschein, dass 20-HETE eher wie DAG als intrazellulärer Lipid- Aktivator der Kinase-Aktivität, statt als ein Hormon oder parakrines Hormon, das auf einen extrazellulären Rezeptor einwirkt, wirkt.
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass 20-HETE eine wichtige Rolle als zweiter Messenger bei der Autoregulation der renalen Durchblutung, des tubuloglomerulären Feedbacks, des renalen Natriumtransports, der pulmonalen Funktion und der mitogenen und vasokonstriktorischen Reaktion auf zahlreiche vasoaktive Hormone und Wachstumsfaktoren spielt (Roman, (1999), a.a.O.). Die Bildung von P450- Metaboliten von AA ist in genetischen und experimentellen Hochdruckmodellen verändert (D. E. Stec et al., Hypertension, Bd. 271 (1996), S. 1329-1336; D. Sacerdoti et al., Science, Bd. 243 (1989), S. 388-390; D. E. Stec et al., Hypertension, Bd. 27 (1996), S. 564-568), sowie bei Diabetes (S. Imaoka et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., Bd. 152 (1988), S. 680-687), bei hepatorenalem Syndrom (D. Sacerdoti et al., J. Clin. Invest., Bd. 100 (1997), S. 1264-1270) und bei Schwangerschaftstoxämie. 20-HETE trägt auch zu den vasokonstriktorischen Wirkungen von Angiotensin 11, Endothelin und Stickoxid-synthase- Inhibitoren sowie zu den Hemmwirkungen von PTH, Dopamin, All, Bradykinin, Endothelin, Vasopressin und TNF auf den Natriumtransport in der Niere bei (R. J. Roman, (1999), a.a.O.). Aufgrund der kritischen Rolle dieser Substanz bei der Regulierung der renalen und pulmonalen Funktion und des Gefäßtonus sowie bei der Steuerung des arteriellen Drucks ist es wahrscheinlich, dass 20-HETE-Antagonisten und stabile Analoge ein therapeutisches Potential bei der Behandlung einiger dieser Krankheiten aufweisen. Schließlich sollten diese Analogen den Forschern sehr wichtige neue Werkzeuge zur Untersuchung von 20-HETE-Signalleitungswegen und der Rolle dieser Substanz bei der Steuerung der renalen und kardiovaskulären Funktion an die Hand geben.

Verwendung von Analogen und Antagonisten

Renaler Stoffwechsel von Arachidonsäure durch Cytochrom P450-Enzyme

Es ist seit langem bekannt, dass die Enzyme Cyclooxygenase und Lipoxygenase Arachidonsäure (AA) metabolisieren und dass die gebildeten Produkte sowohl die renale Funktion als auch den Gefäßtonus beeinflussen (J. C. McGiff, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. Bd. 31 (1991), S. 339-369). Jedoch ist in den letzten 10 Jahren ein neuer Weg für den Stoffwechsel von AA aufgetaucht. Tatsächlich haben neuere Untersuchungen ergeben, dass in kleinen Blutgefäßen im gesamten Körper, in den Glomeruli und Tubuli in der Niere und im pulmonaren Gefäß- und Luftwegsystem AA vorwiegend durch Cytochrom P450-Enzyme zu Epoxyeicosatriensäuren (EETs), Dihydroxyeicosatriensäuren (DiHETEs) und 19- und 20- Hydroxyeicosatetraensäuren (19- und 20-HETE) metabolisiert wird. Es hat nunmehr ferner den Anschein, dass diese Metaboliten eine zentrale Rolle als zweite Messenger bei der Regulierung des Gefäßtonus, der Nierenfunktion und der Lungenfunktion spielen und die nachteiligen Einflüsse von Mitogenen auf Blutgefäße und die Niere bei verschiedenen Krankheitszuständen vermitteln (D. R. Harder et al., J. Vasc. Rev., Bd. 32 (1995), S. 79-92; M. Rahman et al., Am. J. Hypertens., Bd. 10 (1997), S. 356-365; J. C. McGiff, (1991), a.a.O.).
Enzyme der Cytochrom P450 4A-Familie (CYP 4A) katalysieren die Bildung von 20-HETE. cDNAs, die für 13 verschiedene Isoformen dieser Enzymfamilie kodieren, wurden nunmehr in verschiedenen Spezies identifiziert. CYP 4A11 und CYP 4F2 werden in der humanen Niere exprimiert. CYP 4F2 scheint die Isoform darzustellen, die primär für die Bildung von 20-HETE beim Menschen verantwortlich ist (A. E. C. M. Simpson, Gen. Pharmac., Bd. 28 (1997), S. 351-359). Es wurden vier Isoformen, nämlich CYP 4A1, 4A2, 4A3 und 4A8, aus Rattennieren kloniert. Sämtliche Formen, mit Ausnahme von CYP 4A8, erzeugen bei Inkubation mit Arachidonsäure 20-HETE. Botschaften für die CYP 4A2- und 4A3-Isoformen werden in kleinen Arteriolen im gesamten Körper, in Glomeruli und renalen Tubuli in der Niere und in den Luftwegen und dem Gefäßsystem der Lunge exprimiert. Gleichermaßen lässt sich CYP 4A-Protein in renalen und zerebralen Arterien, in der Niere sowie im Luftweg- und Gefäßsystem der Lunge nachweisen (Zhu et al., (1998), a.a.O.; Jacobs et al., (1999), a.a.O.). Kleine Blutgefäße, Nierengewebe und Lungengewebe bilden bei Inkubation mit AA durchweg 20-HETE.
Zahlreiche Faktoren regulieren die Expression von Cytochrom P450- Enzymen. CYP 4A1- und 4A3-mRNA und -Protein werden in der Niere von neonatalen Ratten in starkem Maße exprimiert, wobei jedoch die Konzentrationen mit dem Erwachsenwerden abnehmen. Im Gegensatz dazu wird CYP 4A2-Protein in den Nieren von Neugeborenen nicht exprimiert, wobei die Konzentrationen mit zunehmendem Alter ansteigen, bis es die Hauptisoform darstellt, die in den Nieren von erwachsenen Ratten exprimiert wird (K. Omata et al., Am. J. Physiol., Bd. 262 (1992), F8- F16). Im proximalen Tubulus steigert Angiotensin II (AII) die Bildung von EETs, während epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), Dopamin und Parathyroidhormon (PTH) die Bildung von 20-HETE steigern (F. Lin, (1995), a.a.O.; M. Ominato, J. Membrane Biol., Bd. 152 (1996), S. 235-243; M. Rahman et al., L1997), a.a.O4. In TALH steigern eine Reihe von Peptidhormonen die Bildung von 20-HETE (L. W. Frazier und T. Yorio, Pröc. Soc. Exp. Biol. Med., Bd. 201 (1992), S. 229-243; J. C. McGiff, (1991), a.a.O.). Die Expression von CYP 4A-Proteinen in der Niere und im Gefäßsystem wird bei Ratten, die mit einer salzreichen Diät gefüttert werden, herunterreguliert. Dies kann verhindert werden, wenn durch intravenöse Infusion bestimmte AII-Kreislaufspiegel aufrechterhalten werden. Im Gegensatz dazu erhöht eine starke Salzaufnahme die Expression von CYP 2C23 und die Bildung von EETs in der Niere (K. Makita et al., FASEB J., Bd. 10 (1996), S. 1456-1463).
Die renale CYP 4A-Aktivität wird durch Glucocorticoide, Mineralcorticoide und Progesteron erhöht. Antilipidämische Mittel, wie Clofibrat, induzieren die Expression von CYP 4A1 und 3 sowie die Synthese von 20-HETE in Leber und Niere (J. C. McGiff, (1991), a.a.O.; A. E. C. M. Simpson, (1997), a.a.O.). Weitere induzierende Mittel von P450-Enzymen, wie Phenobarbitol, 3-Methylcholanthren und 3,4-Benzo(a)pyren verändern die renale CYP 4A-Aktivität nicht (A. E. C. M. Simpson, (1997), a.a.O.). Verschiedene wichtige kardiovaskuläre Hormone, wie All, Vasopressin und Endothelin, aktivieren Phospholipasen und verstärken die Synthese und die Freisetzung von 20-HETE. 20-HETE trägt zur vasokonstriktorischen Reaktion gegenüber diesen Agonisten bei (A. E. C. M. Simpson, (1997), a.a.O.).
Die CYP 4A-Aktivität ist bei Diabetes, Schwangerschaftstoxämie, hepatorenalem Syndrom, Cyclosporin-induzierter Nephrotoxizität und bei verschiedenen Modellen von Hochdruck erhöht (K. Makita et al., (1996), a.a.O.; M. Rahman et al., (1997), a.a.O.). Schwangerschaftstoxämie, hepatorenales Syndrom, Cyclosporin induzierte Nephrotoxizität und Hochdruck stellen durchweg Krankheiten dar, die durch eine intensive renale und periphere Vasokonstriktion gekennzeichnet sind, die durch eine übermäßige Bildung von 20-HETE in den Gefäßen vermittelt werden kann. Die Überproduktion von 20-HETE kann auch als Wachstumsfaktor wirken, der eine Hypertrophie der Gefäßwände hervorruft und das Lumen verengt. Dies führt letztlich zu Herzanfällen, Schlaganfällen oder Nierenversagen, Zuständen, bei denen es sich durchweg um Langzeitfolgen dieser Krankheiten handelt. Diese Feststellungen lassen darauf schließen, dass Inhibitoren der Synthese oder Antagonisten der Wirkungen von 20-HETE eine therapeutische Wirkung in Bezug auf eine Verhinderung der nachteiligen Einflüsse dieser Krankheiten auf die renale oder Gefäßfunktion ausüben, die letztlich wesentlich zur Mortalität und Morbidität beitragen.
Wir schlagen vor, dass Patienten mit einem oralen, aktiven, lange wirkenden 20-HETE-Antagonisten auf täglicher Basis behandelt werden, um den Blutdruck zu senken und eine Gefäßverengung zu verhindern.

20-HETE bei der Regulierung des Gefäßtonus

Kleine Blutgefäße im gesamten Körper exprimieren CYP 4A2-mRNA und Protein und bilden bei Inkubation mit AA in starkem Maße 20-HETE. 20- HETE stellt einen starken Konstriktor (EC&sub5;&sub0; < 10&supmin;&sup8; M) der Zellen der glatten Gefäßmuskulatur dar. Es fördert den Ca²&spplus;-Eintritt durch Depolarisieren von renalen VSM-Zellen im Anschluss an eine Blockade des KCa-Kanals und durch Erhöhung des Leitvermögens der Ca²&spplus;-Kanäle vom L-Typ (D. R. Harder et al., (1995), a.a.O.). Inhibitoren der Bildung von 20- HETE aktivieren den KCa-Kanal in VSM-Zellen. Diese Wirkung kann durch nM- Konzentrationen von 20-HETE umgekehrt werden. Diese Befunde zeigen, dass 20-HETE normalerweise in kleinen Blutgefäßen im gesamten Körper gebildet wird, wo es als intrazellulärer zweiter Messenger dient, der die Aktivität des KCa-Kanals reguliert (A. P. Zou et al., (1996), a.a.O.).
Eine Zusammenfassung der Rolle von 20-HETE bei der Regulierung des Gefäßtonus ist in Fig. 9 dargestellt. Eine Membrandehnung, vasoaktive Hormone und Mitogene aktivieren Phospholipase C. Der anschließende Anstieg von IP&sub3; löst die Freisetzung von intrazellulären Ca²&spplus;-Lagern aus. Jedoch sollten Erhöhungen der intrazellulären Ca²&spplus;-Konzentration KCa- Kanäle aktivieren und zu einer Membran-Hyperpolarisation führen, die das Einströmen von Ca²&spplus; durch die spannungsempfindlichen Kanäle begrenzt. Dies ist kontraproduktiv und läuft der Vasokonstriktion zuwider. Daher muss ein bestimmter Mechanismus zur Pufferung gegen eine Aktivierung von KCa-Kanälen in VSM im Anschluss an eine Freisetzung von intrazellulären Ca²&spplus;-Lagern existieren. Man nimmt an, dass an dieser Stelle 20-HETE eine wichtige Rolle spielt. Erhöhungen der intrazellulären Ca²&spplus;-Konzentration aktivieren die Ca²&spplus;-empfindlichen Enzyme Phospholipase A und DAG-Lipase unter Freisetzung von Arachidonsäure. Arachidonsäure wird in 20-HETE umgewandelt, das den KCa-Kanal in renalen VSM-Zellen blockiert und zu einer Membrandepolarisierung, einem erhöhten Einströmen von Ca²&spplus; und einer verlängerten vasokonstriktorischen Reaktion führt. Gemäß diesem Schema dient 20-HETE als kritischer zweiter Messenger, der die vasokonstriktorische Reaktion auf eine Membrandehnung und sämtliche anderen vasoaktiven Hormone und Wachstumsfaktoren, die Phospholipasen aktivieren und intrazelluläres Calcium freisetzen, reguliert.
Es gibt nunmehr starke Anzeichen dafür, dass 20-HETE diese Rolle bei der Regulierung des Gefäßtonus sowohl in vivo als auch in vitro spielt. Diesbezüglich verstärkt Arachidonsäure die myogene Reaktion von isolierten perfundierten Arterien auf Erhöhungen des transmuralen Drucks, und Inhibitoren der Bildung von 20-HETE blockieren diese Reaktion vollständig (D. R. Harder et al., (1995), a.a.O.). Inhibitoren der Bildung von 20-HETE blockieren in vivo die Autoregulation der renalen und zerebralen Durchblutung (A. P. Zou et al., (1994), a.a.O.). Sie schwächen ferner in vivo und in vitro die vasokonstriktorischen Reaktionen auf Vasopressin, Angiotensin 11, Endothelin und Norepinephrin.
20-HETE stellt ferner einen Mediator oder Modulator der tubuloglomerulären Feedback-Reaktionen (TGF-Reaktionen) in der Niere dar. Dieser Schluss beruht auf dem Befund, dass das für die Bildung von 20- HETE verantwortliche Enzym in der Macula densa der Niere exprimiert wird (O. Ito et al., Am. J. Physiol., Bd. 274 (1998), F395-F414) und dass 20- HETE einen starken Konstriktor der renalen, afferenten Arteriole darstellt (A. P. Zou et al., a.a.O.). Die Beobachtungen, dass die Zugabe von AA zu der die Henle-Schleife perfundierenden Flüssigkeit bei Ratten in vivo die TGF-Reaktionen verstärkt und dass die TGF-Reaktionen durch Zugabe von P450-Inhibitoren zu tubulären Perfusaten blockiert werden, stellen eine weitere Stütze dieser Hypothese dar. Außerdem stellt eine Perfusion der Henle-Schleife mit einer Lösung mit einem Gehalt an 20-HETE die TGF-Reaktionen nach einer Blockade der endogenen Bildung dieser Verbindung in der Ratte in vivo wieder her. Diese Untersuchungen lassen darauf schließen, dass 20-HETE entweder als Mediator von TGF dient oder als zweiter Messenger auf dem Niveau der afferenten Arteriole dient, um die vasokonstriktorische Reaktion auf einen anderen Mediator, der durch die Macula densa freigesetzt wird, zu leiten (A. P. Zou et al., (1994), a.a.O.).
Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass 20-HETE möglicherweise auch als vaskulärer Sauerstoffsensor dient und die Veränderungen im Gefäßtonus, die mit Veränderungen der Sauerstoffzufuhr zu den Geweben verbunden sind, vermittelt. Dieser Schluss beruht auf unserem Befund, dass die Bildung von 20-HETE in renalen und zerebralen Arteriolen in kritischer Weise von der Sauerstoffspannung des Inkubationsmediums abhängt (D. R. Harder et al., (1996), a.a.O.). Der Km-Wert dieser Reaktion beträgt 66,6 mbar (50 Torr), was in der Größenordnung des in Geweben im gesamten Körper gefundenen PO&sub2;-Werts liegt. Außerdem haben neuere Untersuchungen unserer Gruppe gezeigt, dass Inhibitoren der Bildung von 20-HETE und einige der 20-HETE-Rezeptorantagonisten, die hier beschrieben werden, die vasokonstriktorische Reaktion auf Erhöhungen des Gewebe-PO&sub2;-Werts und die gesamten autoregulatorischen Körperreaktionen auf Erhöhungen der Gewebe-Sauerstoffabgabe, die für die Entwicklung von volumenabhängigen Hochdruckmodellen einen zentralen Punkt darstellt, blockieren. Diese Befunde lassen darauf schließen, dass 20-HETE- Antagonisten von therapeutischem Wert bei der Behandlung von salzempfindlichen Hochdruckformen sind.
Diesbezüglich würde eine Behandlung von Patienten mit einem oral aktiven 20-HETE-Antagonisten die vasokonstriktorischen Wirkungen von 20- HETE auf Blutgefäße im gesamten Körper blockieren und den Blutdruck verringern. Sie würde auch die wachstumsfördernden Wirkungen von 20-HETE auf die Blutgefäßwände blockieren und dadurch eine Verengung von renalen, zerebralen und koronaren Arterien, wo es zu Herzanfällen, Schlaganfällen und Nierenversagen kommt, verringern.

20-HETE-Stickoxid-Wechselwirkung bei der Kontrolle des Gefäßtonus

Zahlreiche Untersuchungen zeigen, dass die tonische Entspannung von NO eine wichtige Rolle bei der Dämpfung der Vasokonstriktion im gesamten Körper spielt. Obgleich allgemein angenommen wird, dass die gefäßerweiternde Reaktion auf NO durch eine Erhöhung von cGMP vermittelt wird, bestehen zunehmend Anzeichen dafür, dass NO Einflüsse auf die K&spplus;- Kanäle und den Gefäßtonus hat, die von cGMP unabhängig sind. NO bindet an Häm in Cytochrom P450 4A-Enzymen und hemmt die Bildung von 20-HETE in renalen und zerebralen Arteriolen (Sun et al., (1998), a.a.O.; M. Alonso- Galicia et al., Am. J. Physiol., Bd. 275 (1998), F370-F378). Es gibt auch Anzeichen dafür, dass die Hemmung der Bildung von 20-HETE die cGMP- unabhängigen Einflüsse von NO sowohl auf den renalen als auch auf den zerebralen Kreislauf vermittelt. Diesbezüglich hemmt NO den KCa-Kanal in VSM-Zellen und erweitert kleine Blutgefäße. Diese Einflüsse sind jedoch cGMP unabhängig, da sie nicht durch Inhibitoren von Guanylyl-cyclase oder PKG blockiert werden können (C. W. Sun et al., (1998), a.a.O.). Diese Einflüsse von NO auf K&spplus;-Kanäle und den Gefäßtonus können vollständig blockiert werden, indem man den NO-induzierten Abfall der 20-HETE-Spiegel durch Zugabe von exogenem 20-HETE zum Bad verhindert (C. W. Sun et al., (1998), a.a.O.). Diese Befunde zeigen, dass NO die Bildung von 20-HETE hemmt und dass dies die cGMP-unabhängige Komponente der gefäßerweiternden Reaktion auf NO vermittelt, indem der KCa-Kanal in renalen VSM-Zellen aktiviert wird (M. Alonso-Galicia et al., (1998), a.a.O.; C. W. Sun, Circ. Res., Bd. 83 (1998), S. 1-11).
In anderen Untersuchungen wurde festgestellt, dass Inhibitoren der Bildung von 20-HETE die gefäßerweiternde Reaktion auf Stickoxid im renalen und zerebralen. Kreislauf und den Blutdruckabfall in intakten Tieren blockieren (M. Alonso-Galicia et al., (1997), a.a.O.). Sie verhindern auch den Blutdruckabfall und die zerebrale Durchblutungshyperämie, die in einem septischen Schockmodell mit der Induktion von Stickoxid-synthase verbunden sind. Diese Befunde zeigen, dass 20-HETE-Rezeptorantagonisten ein therapeutisches Potenzial bei der Behandlung von septischem Schock und anderen entzündlichen Krankheitsmodellen, die mit der Induktion von Stickoxid-synthase verbunden sind, besitzen.
Diesbezüglich ist es bekannt, dass Stickoxid bei Schock in übermäßigem Maße gebildet wird und den Blutdruck auf ein Niveau senkt, bei dem die Organfunktionen nicht mehr aufrechterhalten werden können. Da 20-HETE-Antagonisten die Wirkungen von NO blockieren, verringert eine Behandlung von Patienten mit septischem Schock durch intravenöse Verabreichung eines 20-HETE-Antagonisten die Einflüsse von Stickoxid und stellt den normalen Blutdruck und die Durchblutung von Herz, Niere und Gehirn wieder her. Diese Behandlung würde vermutlich kurzzeitig (1-3 Tage) erfolgen, bis das toxische Mittel oder die Infektion beseitigt sind.
Der Vorteil der Verwendung von 20-HETE-Antagonisten anstelle von Inhibitoren der Stickoxid-synthase besteht darin, dass die Antagonisten die Wirkungen von Stickoxid an der Effektorstelle blockieren, so dass sie auch dann eingesetzt werden können, nachdem sich der Patient bereits im Schockzustand befindet. Außerdem senken die 20-HETE-Antagonisten im Gegensatz zu Inhibitoren von Stickoxid-synthase nicht die Gewebe- Grunddurchblutung. Die durch NO-Synthase-Inhibitoren hervorgerufene ausgeprägte Vasokonstriktion ruft nämlich intensive ischämische Endorganschäden hervor, wodurch eine Verwendung dieser Mittel bei der Schockbehandlung ausgeschlossen ist.

P450-Eicosanoide bei der Regulierung der Nierenfunktion

Die Rolle von P450-Metaboliten von AA als zweite Messenger bei der Regulierung des Natriumtransports in verschiedenen Nephron-Segmenten in der Niere hat sich ebenfalls in letzter Zeit als ein sich dynamisch entwickelndes neues Gebiet erwiesen. Eine Zusammenfassung der Einflüsse dieser Verbindungen auf die Reabsorption von Natrium im proximalen Tubulus findet sich bei Roman et al., (1999), a.a.O. Verschiedene Arbeitsgruppen haben berichtet, dass 20-HETE den primären AA-Metaboliten darstellt, der durch den proximalen Tubulus gebildet wird, und dass 20- HETE die Na-K-ATPase-Aktivität in diesem Nephron-Segment hemmt, indem es die durch PKC induzierte Phosphorylierung der alpha-Untereinheit von Na- K-ATPase verstärkt (A. Aperia et al., Adv. Pharmacol., Bd. 42 (1998), S. 870-876; M. Ominato et al., (1996), a.a.O.).
Anschließende Untersuchungen haben gezeigt, dass die Hemmwirkungen von Dopamin und PTH auf die Na-K-ATPase-Aktivität und den Natriumtransport im proximalen Tubulus eine Aktivierung von PLA&sub2; und eine verstärkte Bildung von 20-HETE beinhalten. Es gibt auch Hinweise darauf, dass P450-Inhibitoren die Hemmwirkungen von All auf die Reabsorption am proximalen Tubulus blockieren können. Diese Wirkung ist mit einer verstärkten Bildung von 5,6-EET verbunden, das die Translokation des NH3, Na&spplus;-H&spplus;-Austauschers zur apikalen Membran der proximalen Tubuluszellen beeinträchtigt (M. Rahman et al., (1997), a.a.O.).
20-HETE spielt auch eine herausragende Rolle bei der Regulierung des Chloridtransports im TALH. Escalante und McGiff (J. C. McGiff, (1991), a.a.O.) berichteten erstmals, dass 20-HETE den Hauptmetaboliten von AA, der in TALH-Zellen gebildet wird, darstellt und dass es den Na&spplus;-K&spplus;-2Cl&supmin;- Cotransport in diesem Nephron-Segment hemmt. Anschließende Patch-Clamp- Untersuchungen ergaben, dass 20-HETE einen 70-pS-K&spplus;-Kanal in der apikalen Membran von TALH-Zellen blockiert (Wang et al., J. Gen. Physiol., Bd. 106 (1995), S. 727-743). Die Blockade dieses Kanals begrenzt die Verfügbarkeit von K&spplus; für den Transport über den Na&spplus;-K&spplus;-2Cl&supmin;-Transporter und verringert das Lumen-positive, transepitheliale Potenzial, das als Hauptantriebskraft für die passive Reabsorption von Kationen (Na&spplus;, K&spplus;, Ca²&spplus; und Mg²&spplus;) im TALH dient. In Übereinstimmung mit dieser Ansicht bewirken P450-Inhibitoren eine Erhöhung und 20-HETE eine Verringerung des transepithelialen Potenzials und des Chloridtransports des in vitro perfundierten, isolierten TALH. Neuere Untersuchungen haben gezeigt, dass P450-Inhibitoren auch die Hemmwirkungen von All, Bradykinin, Endothelin, Vasopressin und Erhöhungen der intrazellulären Ca²&spplus;-Konzentration auf den Natriumtransport in TALH blockieren. Aufgrund der Bedeutung von 20-HETE bei der Regulierung des Natriumtransports in der Niere ist es wahrscheinlich, dass stabile Analoge von 20-HETE Diuretika darstellen und somit möglicherweise therapeutisch bei der Behandlung von Natrium- Rückhaltezuständen, wie kongestivem Herzversagen, pulmonalem Ödem, hepatorenalem Syndrom und Hochdruck, verwendet werden können.
Bei diesen Natrium-Rückhaltezuständen, die durch Ödembildung und eine extrazelluläre Volumenexpansion gekennzeichnet sind, lässt sich erwarten, dass eine Verabreichung eines oral aktiven, stabilen Analogen von 20-HETE in der Niere angereichert wird und die tubuläre Reabsorption von Natrium und Wasser hemmt, da 20-HETE normalerweise den Natriumtransport im proximalen Tubulus und TALH hemmt. Dieser Vorgang könnte durch Addition einer Gruppe an der Carbonsäuregruppe erleichtert werden, um die Ausscheidung des Arzneistoffes in den Urin zu erleichtern, indem man am ersten Kohlenstoffatom eine Glucuronidgruppe addiert. Eine Hemmung der tubulären Reabsorption würde die Natriumausscheidung erhöhen, den Blutdruck und das extrazelluläre Volumen senken und die Schwere des Ödems bei diesen Zuständen vermindern.

Rolle von 20-HETE bei der Pathogenese von Hochdruck

Verschiedene Beobachtungen lassen darauf schließen, dass eine Veränderung der Bildung von 20-HETE in der Niere eine Rolle bei der Entwicklung von genetischen und experimentellen Hochdruckmodellen spielt. Diesbezüglich wird das P450 4A2-Gen selektiv in den Nieren von spontan hypertensiven Ratten (SHR) überexprimiert (D. Sacerdoti et al., (1989), a.a.O.; D. Stec et al., (1996), a.a.O.). Dies ist mit einer verstärkten Bildung von 20-HETE in der Niere verbunden. Eine Verabreichung von Inhibitoren der Bildung von 20-HETE senkt den arteriellen Druck in SHR und kann eine Hochdruckentwicklung verhindern (D. Sacerdoti et al., (1989), a.a.O.). Da 20-HETE einen starken Vasokonstriktor darstellt (D. R. Harder et al., (1995), a.a.O.); A. P. Zou et al., (1996), a.a.O.), kann 20-HETE zur Wiederherstellung der Druck-Natriurese-Beziehung in SHR durch Erhöhung des renalen Gefäßwiderstands und der TGF-Reaktionen beitragen (R. J. Roman, Am. J. Hypertension, Bd. 3 (1990), S. 893-900). Der Befund, dass Inhibitoren der Bildung von 20-HETE den erhöhten renalen Gefäßtonus in SHR umkehrt, unterstützt diese Hypothese (J. Imig et al., Am. J. Physiol., Bd. 266 (1994), H1879-H1885). Kürzlich beendeten wir auch eine genetische Verknüpfungsanalyse, um festzustellen, ob eine Cosegregation des P450 4A-Genotyps mit dem durchschnittlichen arteriellen Grundliniendruck bei dieser Population vorliegt (D. F. Stec et al., (1996), a.a.O.). Jedoch wurde eine signifikante Verknüpfung zwischen dem P450 4A-Genotyp und der Veränderung des arteriellen Drucks in F2-Ratten, die einer erhöhten Salzaufnahme unterlagen, festgestellt. Diese Untersuchungen zeigen, dass 20-HETE zur Erhöhung des renalen und peripheren Gefäßtonus in SHR beiträgt und dass der P450 4A-Genotyp eine Determinante der Salzempfindlichkeit in diesem Modell zu sein scheint. Diese Untersuchungen lassen darauf schließen, dass ein 20-HETE-Antagonist antihypertonische Wirkungen aufweist und dazu beiträgt, einige der ischämischen, glomerulären Schädigungen, die mit diesem Hochdruckmodell verbunden sind, zu verhindern.
Salzempfindliche (S)-Dahl-Ratten benötigen einen hohen renalen Perfusionsdruck, um die gleiche Menge an Natrium und Wasser wie normotensive Ratten auszuscheiden (R. J. Roman et al., Am. J. Hypertension, 1997). Dies ist weitgehend auf eine Erhöhung des Cl- Transports im dicken aufsteigenden Schenkel der Henle-Schleife zurückzuführen (Ito et: al., Hypertension, Bd. 33 (Teil 2) (1999), S. 419- 423. Es gibt nunmehr fünf Arten von Hinweisen, die darauf schließen lassen, dass eine Abnormalität im Nierenstoffwechsel von AA durch Enzyme der P450 3A-Familie zur Erhöhung des Schleifen-Cl&supmin;-Transports zur Entwicklung von Hochdruck in Dahl-S-Ratten beitragen kann. Diesbezüglich werden die Bildung von 20-HETE und die Konzentrationen an P450 4A-Protein in der Henle-Schleife von Dahl-S-Ratten verringert (D. E. Stec et al., (1996), a.a.O.). Eine Verabreichung von exogenem 20-HETE normalisiert den Schleifen-CV-Transport (R. J. Roman et al., (1997), a.a.O.). Ein genetischer Marker im P450 4A2-Gen unterliegt einer Cosegregation mit der Entwicklung von Hochdruck in Dahl-S-Ratten. Eine Induktion der renalen Bildung von 20-HETE mit Clofibrat hemmt die Entwicklung von Hochdruck in Dahl-S-Ratten (D. E. Stec et al., (1996), a.a.O.). Eine Hemmung der renalen 20-HETE-Bildung erzeugt bei einem normotensiven Stamm von Ratten, die mit einer sehr salzreichen Diät gefüttert werden, Hochdruck (D. E. Stec et al., Hypertension (1997), S. 315-320).
Diese Ergebnisse lassen darauf schließen, dass der P450 4A2-Locus als Gen in Frage kommt, das zu Veränderungen der renalen Funktion und zur Entwicklung von Hochdruck bei Dahl-S-Ratten beiträgt. Ferner zeigen diese Ergebnisse, dass eine Ersatztherapie mit 20-HETE-Agonisten von therapeutischem Wert bei salzempfindlichem Hochdruck sein kann. Diesbezüglich sollte eine orale Verabreichung von stabilen, oral wirksamen 20-HETE-Agonisten die tubuläre Reabsorption von Natrium hemmen, die Natriumausscheidung erhöhen und das Blutvolumen und den Blutdruck senken.
Es gibt auch Hinweise darauf, dass 20-HETE zu einer Erhöhung des Gefäßtonus und der Endorganschädigungen beiträgt, die bei experimentellen Hochdruckmodellen auftreten. Diesbezüglich schwächt eine Blockade der Bildung von 20-HETE den Anstieg des arteriellen Drucks, der durch eine chronische Verabreichung von Angiotensin 11 und Endothelin sowie durch eine Blockade der Stickoxid-synthase hervorgerufen wird (Roman et al., (1999), a.a.O.). Eine Blockade der 20-HETE-Bildung schwächt auch die Entwicklung von Mineralcorticoid-Hochdruck und verhindert die Nierenschädigung und die Herzhypertrophie, die bei diesem Hochdruckmodell auftreten (A. D. Oyekan et al., Am. J. Physiol., Bd. 276 (1999), R000 R000, im Druck). Diese Untersuchungen lassen darauf schließen, dass 20- HETE-Rezeptor-Antagonisten mögliche antihypertonische Mittel darstellen und günstige Wirkungen bei der Verhinderung von Nieren- und Herz- Endorganschädigungen bei verschiedenen Hochdruckmodellen entfalten können.

Rolle von 20-HETE bei der Regulierung der Lungenfunktion

In der Lunge des Kaninchens und des Menschen ergeben sich umgekehrte Einflüsse im Vergleich zu denen im peripheren Gefäßsystem. E. A. Jacob et al. (1999), a.a.O., haben kürzlich berichtet, dass pulmonale Arterien und Bronchialringe von Menschen, Kaninchen und Hunden durchweg in intensiver Weise 20-HETE bilden, wenn sie mit Arachidonsäure inkubiert werden. 20- HETE stellt einen starken Dilatator der pulmonalen Arterien und der Bronchiolenringe dar. Die gefäßerweiternde Reaktion auf 20-HETE hängt von einem intakten Endothel ab und ist von Cyclooxygenase abhängig. 20-HETE stimuliert entweder die Freisetzung von gefäßerweiternden Cyclooxygenase- Produkten aus Lungengeweben oder es wird selbst durch Cyclooxygenase zu einem gefäßerweiternden Produkt metabolisiert. Diese Untersuchungen zeigen, dass 20-HETE und 20-HETE-Agonisten sich zur Erweiterung des pulmonalen Gefäßsystems bei Patienten mit pulmonalem Hochdruck eignen.
In den humanen Bronchiolengeweben stellen 20-HETE-Agonisten starke Bronchodilatatoren dar (E. A. Jacob et al., (1999), a.a.O.). Nanomolare Konzentrationen dieser Agonisten hemmen vollständig die durch Carbachol hervorgerufene Erhöhung des bronchiolaren Tonus, was den üblichen klinischen Test für Asthma darstellt. Diese Untersuchungen zeigen, dass stabile 20-HETE-Agonisten sich als durch Inhalation einzunehmende Bronchodilatatoren zur Behandlung von Asthma eignen. Sie können insbesondere bei Patienten wertvoll sein, die gegenüber der bronchodilatatorischen Wirkung von anderen Mitteln (β-Agonisten, Steroide), die in Asthma-Inhalatoren eingesetzt werden, resistent sind.

Mitogene Wirkungen von 20-HETE

Neben der Regulierung des Gefäßtonus und des renalen Natriumtransports gibt es zunehmend Beweise dafür, dass 20-HETE die mitogenen Wirkungen von vasoaktiven Mitteln und Wachstumsfaktoren sowohl in der Niere als auch im Gefäßgewebe vermittelt. Diesbezüglich verstärken EETs und 20-HETE den Einbau von Thymidin in eine Reihe von Zelltypen. P450-Inhibitoren schwächen die Wachstumsreaktionen gegenüber Serum, Vasopressin, EGF und Phorbolestern in gezüchteten glomerulären, mesangialen Zellen ab. 20-HETE (10&supmin;&sup9; M) fördert das Wachstum von gezüchteten LLC-PK1 und OK-Zellen und P450-Inhibitoren blockieren die mitogenen Wirkungen von EGF in diesen Zellen (F. Lin et al., (1995), a.a.O.). Schließlich aktiviert 20-HETE die MAP-Kinase- Signalleitungskaskade und Erhöhungen der Bildung von 20-HETE vermitteln die mitogenen Wirkungen von EGF in gezüchteten Aorta-VSM-Zellen (Uddin et al., (1998), a.a.O.). Diese Beobachtungen lassen darauf schließen, dass 20-HETE eine wichtige Rolle bei der Proliferation von mesangialen Zellen und der Entwicklung von Glomerulosklerose in Verbindung mit Hochdruck, Diabetes und Immunstörungen spielt. Diesbezüglich besitzen 20-HETE- Antagonisten ein therapeutisches Potenzial in Bezug auf eine Verhinderung der Verengung von Blutgefäßen, die das Auftreten von Schlaganfällen, Herzkrankheiten und Nierenschädigungen in Verbindung mit Diabetes, Hochdruck, Cyclosporin-Nephrotoxizität und einer Reihe von entzündlichen Nierenerkrankungen verstärkt. Da 20-HETE außerdem die mitogenen und angiogenen Wirkungen einer Reihe von Wachstumsfaktoren, die bei der Tumorbildung beteiligt sind, vermittelt, ist es wahrscheinlich, dass sich die 20-HETE-Antagonisten als Arzneistoffe gegen Krebs eignen, indem sie die Gefäßbildung und/oder das Wachstum von neoplastischen Geweben verhindern.
Wir ziehen es in Betracht, Patienten oral aktive, stabile 20-HETE- Antagonisten zu verabreichen, die das Gefäßwachstum und die Hypertrophie begrenzen und ischämische und organische Schädigungen in Herz, Niere und Gehirn (Herzanfall, Schlaganfall und Nierenkrankheiten) verhindern. Bei der Krebstherapie kann die Blockade des 20-HETE-Wegs das Wachstum von Blutgefäßen in Tumoren begrenzen.

Zusammenfassung

Die Rolle von P450-Metaboliten von AA bei der Regulierung der Nierenfunktion und des Gefäßtonus stellt ein sich rasch ausbreitendes Gebiet dar, wobei aber bereits einige allgemeine Konzepte in Erscheinung getreten sind. Erstens bilden VSM-Zellen 20-HETE. Diese Substanz dient als zweiter Messenger, der eine kritische Rolle bei der myogenen Reaktion, TGF, Gefäßhypertrophie und den vaskulären Reaktionen auf Vasokonstriktoren und -dilatatoren durch Regulation der K&spplus;-Kanalaktivität spielt. Zweitens werden P450-Metaboliten von AA leicht im proximalen Tubulus und im TALH gebildet und dienen als zweite Messenger bei der Regulation des Natriumtransports. Schließlich ist die Bildung von P450- Metaboliten von AA in der Niere bei Hochdruck, Diabetes, hepatorenalem Syndrom und im Fall einer Schwangerschaft verändert. Aufgrund der Bedeutung dieses Weges bei der Regulierung der renalen und vaskulären Funktion und bei der Vermittlung der wachstumsfördernden Wirkungen einer Reihe von Mitogenen ist es wahrscheinlich, dass P450-Metaboliten von AA zu den Veränderungen der Nierenfunktion und des Gefäßtonus, die mit diesen Krankheiten verbunden sind, beitragen. Ferner ist es wahrscheinlich, dass 20-HETE-Rezeptorantagonisten ein breites therapeutisches Potenzial bei der Behandlung verschiedener Zustände, wie septischer Schock, Hochdruck, Diabetes, Asthma, glomeruläre Krankheiten und Krebs, besitzen.

Claims

1. Verbindung der Formel

worin R&sub1; unter Carbonsäure-, Phenol-, Amid-, Imid-, Sulfonamid-, Sulfonimid-, aktive Methylen-, 1,3-Dicarbonyl-, Alkohol-, Thiol-, Amin-, Tetrazol- und anderen Heteroarylgruppen ausgewählt ist,

R&sub2; unter Carbonsäure-, Phenol-, Amid-, Imid-, Sulfonamid-, Sulfonimid-, aktive Methylen-, 1,3-Dicarbonyl-, Alkohol-, Thiol-, Amin-, Tetrazol- und anderen Heteroarylgruppen ausgewählt ist,

W eine C&sub1;-C&sub2;&sub5;-Kohlenwasserstoffkette bedeutet, die linear, cyclisch oder verzweigt sein kann und Heteroatome enthalten kann,

Y eine C&sub1;-C&sub2;&sub5;-Kohlenwasserstoffkette bedeutet, die linear, cyclisch oder verzweigt sein kann und Heteroatome enthalten kann,

sp< 3-Center unter Vinylen-, Arylen-, Heteroarylen-, Cyclopropylen- und Ethinylenresten ausgewählt ist,

X eine Alkylkette bedeutet, die linear, verzweigt, cyclisch oder polycyclisch sein kann und Heteroatome enthalten kann,

m den Wert 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 hat und

n den Wert 0, 1, 2, 3, 4 oder 5 hat,

zur Verwendung bei der therapeutischen Behandlung des menschlichen oder tierischen Körpers.

2. Verbindung nach Anspruch 1, wobei R&sub1; oder R&sub2; eine Carboxylgruppe oder eine andere ionisierbare Gruppe bedeuten und wobei die Verbindung eine Doppelbindung oder eine andere funktionelle Gruppe in einem Abstand von 14 bis 15 Kohlenstoffatomen von der ionisierbaren Gruppe enthält.

3. Verbindung nach Anspruch 2, bei der es sich um einen 20-HETE- Agonisten handelt und der eine Länge von 20 bis 21 Kohlenstoffatomen, ein Paar von Doppelbindungen und eine Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom 20 oder 21 an R&sub1; oder R&sub2; aufweist.

4. Verbindung nach Anspruch 3, wobei es sich um ps20-HETE handelt.

5. Verbindung nach Anspruch 2, wobei es sich um einen 20-HETE- Antagonisten handelt, der eine Länge von 19 bis 21 Kohlenstoffatomen aufweist, ein Paar von Doppelbindungen besitzt und keine Hydroxylgruppe am Kohlenstoffatom 20-21 an R&sub1; oder R&sub2; aufweist.

6. Verbindung nach Anspruch 5, wobei es sich um 20-Hydroxyeicosa- 6(Z),15(Z)-diensäure handelt.

7. Verwendung einer Verbindung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Verringerung des vaskulären Durchmessers oder zur Verhinderung der durch 20-HETE verursachten Verringerung des vaskulären Durchmessers.

8. Verwendung nach Anspruch 7, wobei es sich bei der Verbindung um einen 20-HETE-Agonisten handelt und wobei das Arzneimittel zur Verringerung des vaskulären Durchmessers dient.

9. Verwendung nach Anspruch 7, wobei es sich bei der Verbindung um einen 20-HETE-Antagonisten handelt und wobei das Arzneimittel zur Verhinderung der durch endogenes 20-HETE verursachten Verringerung des vaskulären Durchmessers dient.

10. Verwendung nach Anspruch 7 oder 9, wobei das Arzneimittel zur Verringerung der durch die erhöhte Bildung von 20-HETE verursachten schädlichen Wirkungen dient und wobei das Arzneimittel zur Behandlung von Diabetes, Schwangerschaftstoxämie, hepatorenalem Syndrom, zerebralem Vasospasmus, Cyclosporin-induzierter Nephrotoxizität oder Hochdruck dient.

11. Verwendung nach Anspruch 9 oder 10, wobei das Arzneimittel zur Behandlung von Hochdruck, septischem Schock oder anderen entzündlichen Erkrankungen, die mit der Induktion von Stickoxid-synthase verbunden sind, oder zur Verhinderung der Vaskularisierung oder des Wachstums von neoplastischen Geweben dient.

12. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Arzneimittel zur Erzielung einer diuretischen Wirkung oder zur Behandlung von kongestivem Herzversagen, pulmonalem Ödem, hepatorenalem Syndrom, Hochdruck, einer salzempfindlichen Form von Hochdruck oder Asthma dient.

13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei das Arzneimittel zur Behandlung einer salzempfindlichen Form von Hochdruck dient und wobei das Arzneimittel so zubereitet ist, dass eine Menge eines 20-HETE-Agonisten abgegeben wird, die ausreicht, die Natriumausscheidung zur Verringerung der Krankheitssymptome zu fördern.

14. Verwendung nach Anspruch 8, wobei das Arzneimittel zur Behandlung der Symptome von pulmonalem Hochdruck durch Dilatation des pulmonalen Kreislaufs dient und wobei das Arzneimittel zur Verabreichung durch Infusion zubereitet ist.

15. Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Arzneimittel zur Behandlung von zerebraler vaskulärer Schädigung, Vasospasmus, Migräne- oder Cluster-Kopfschmerzen, Schlaganfall oder Kokain-induziertem Vasospasmus dient und wobei das Arzneimittel so zubereitet ist, dass eine Menge eines 20-HETE-Antagonisten abgegeben wird, die ausreicht, die Durchblutung zu erhöhen und die Symptome zu lindern.

16. Pharmazeutische Zubereitung, enthaltend eine Verbindung, ausgewählt unter (I) 20-Hydroxyeicosansäure (S-20-HETE), (2) 19- Hydroxynonadecansäure (sC&sub1;&sub9;-Analoges), (3) 20-Hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)- diensäure (ps-20HETE), (4) 20-Hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-diensäure (rev-ps- 20-HETE), (5) N-Methylsulfonyl-20-hydroxyeicosa-5(Z),14(Z)-dienamid und (6) N-Methylsulfonyl-20-hydroxyeicosa-6(Z),15(Z)-dienamid sowie einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff.