DE69904136T2

DE69904136T2 - Verfahren zur Herstellung von hochreinem N-Formyl-Leucin

Info

Publication number: DE69904136T2
Application number: DE69904136T
Authority: DE
Inventors: Patricia Hussenet; Philippe Le Goff; Gerard Sennyey; Charles-Henry Vincent
Original assignee: Isochem SAS
Current assignee: Isochem SAS
Priority date: 1998-12-30
Filing date: 1999-12-17
Publication date: 2003-07-17
Anticipated expiration: 2019-12-18
Also published as: KR20000048445A; FR2788056B1; FR2788056A1; ATE228497T1; ES2187127T3; EP1016652A1; PT1016652E; HU9904727D0; US6294692B1; EP1016652B1; CA2293750A1; HUP9904727A3; HUP9904727A2; DE69904136D1; DK1016652T3; JP2000191611A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von N-Formylleucin mit hoher Reinheit.
Das N-Formyl-leucin, bei dem es sich um ein Leucinmolekül handelt, worin eines der Wasserstoffatome am Stickstoffatom durch eine Formylgruppe ersetzt ist, ist eine bekannte Verbindung, die insbesondere zur Durchführung von Peptidsynthesen verwendet wird.
Es sind verschiedene Verfahren zur Formylierung von Aminen und insbesondere der Aminogruppen von Aminosäuren bekannt. Aminosäuren werden technisch im Allgemeinen durch Einwirkung von Ameisensäure oder einem Alkalimetallformiat N-formyliert. Diese Verfahren haben jedoch Nachteile. Es werden auch störende Verunreinigungen gebildet, insbesondere da die Umsetzung in Gegenwart von Essigsäureanhydrid durchgeführt wird. Dieses reagiert ebenfalls mit den Aminosäuren und es entsteht daher immer eine gewisse Menge an N-acetylierter Aminosäure, die nur schwierig von der N- formylierten Aminosäure abgetrennt werden kann.
Ein anderes Formylierungsverfahren ist in dem Patent US 4 789 757 beschrieben. Es besteht darin, die Aminosäure mit einem großen Überschuss an Formamid umzusetzen. In den meisten Beispielen wird daher eine molare Menge an Formamid verwendet, die zehnmal über der Menge der Aminosäure liegt. Auf diese Weise wird N-Formyl-asparaginsäure, N-Formyl-glycin, N-Formyl-alanin und N-Formyl-phenylalanin hergestellt. Es sind jedoch keine Verfahren zur Abtrennung dieser N-formylierten Derivate aus dem Reaktionsgemisch und für ihre Gewinnung mit möglichst geringen Verunreinigungen beschrieben worden.
Für einige Anwendungen, wie beispielsweise Anwendungen in der Pharmazie oder auf dem Gebiet der Lebensmittel ist es erforderlich, N-Formyl-leucin mit großer Reinheit zur Verfügung zu haben. Wenn die Formylierung des Leucin nach dem oben beschriebene Verfahren mit Formamid durchgeführt wird, sind in dem erhaltenen N-Formylleucin natürlich keine Verunreinigungen wie N-acetylierte Derivate enthalten, das N-Formyl-leucin enthält jedoch im Allgemeinen immer nicht umgesetzten Leucin, Isoleucin und andere Verunreinigungen, die in dem Ausgangsprodukt vorhanden sind, sowie die Reaktionsprodukte dieser Verunreinigungen mit dem Formamid.
Der Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung von N-Formyl-leucin mit einer Reinheit von mindestens 98%.
Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, das N-Formylleucin durch Umsetzung von Leucin mit Formamid herzustellen, und es ist dadurch gekennzeichnet, dass nach Abschluss der Umsetzung das N-Formyl-leucin bei einer Temperatur von etwa 0 bis 40ºC gefällt wird, indem das Reaktionsgemisch mit Wasser und einer Säure so vermischt wird, dass der pH-Wert des Gemisches bei etwa 2 bis 3 liegt.
Es hat sich auch herausgestellt, dass das Verfahren verbessert wird, wenn die Umsetzung des Leucin mit dem Formamid in Gegenwart von Ameisensäure und insbesondere in Gegenwart von etwa 0,1 bis 2 mol Ameisensäure pro Mol Leucin durchgeführt wird.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren kann das N-Formyl-leucin in der gewünschten Reinheit von mindestens 98% und mit einer guten Ausbeute im Allgemeinen in der Größenordnung von 80 bis 90% hergestellt werden.
Das Leucin, das als Ausgangsverbindung verwendet wird, ist eine bekannte Verbindung, die im Handel in den Formen D, L und DL erhältlich ist. Es enthält als überwiegende Verunreinigung im Allgemeinen Isoleucin.
Die N-Formylierung kann wie in dem Patent US 4 789 757 angegeben mit einem beträchtlichen Überschuss an Formamid, im Allgemeinen etwa 10 mol Formamid pro Mol Aminosäure, durchgeführt werden.
Es wurde jedoch festgestellt, dass es vorzuziehen ist, keinen sehr großen Überschuss an Formamid zu verwenden, und dass eine Formamidmenge unter 4 mol pro Mol Leucin und insbesondere von etwa 1,5 bis 3,5 mol pro Mol Leucin gut geeignet ist.
Es ist auch vorteilhaft, die N-Formylierung in Gegenwart von Ameisensäure durchzuführen. Es werden vorzugsweise etwa 0,5 bis 1 mol Ameisensäure pro Mol Leucin eingesetzt.
Die Reaktion wird durchgeführt, indem das Gemisch, das aus dem Formamid und dem Leucin sowie gegebenenfalls Ameisensäure besteht, auf eine Temperatur im Bereich von etwa 80 bis 110ºC und vorzugsweise etwa 90 bis 100ºC vorzugsweise unter Inertgas, wie beispielsweise unter Stickstoff, erwärmt wird. Sie dauert im Allgemeinen eine bis mehrere Stunden.
Wenn die verwendete Formamidmenge über der bevorzugten Menge liegt, ist es vorteilhaft, nach Abschluss der Umsetzung einen Teil des in dem Medium nach der Umsetzung verbleibenden Formamid abzudestillieren, um das Fällen durch das überschüssige Reagens nicht zu komplizieren.
Dann wird das N-Formyl-leucin gefällt. Hierzu werden eine große Wassermenge vorzugsweise im Bereich von etwa 1,5 bis 5 Teile auf ein Gewichtsteil anfänglich eingesetztes Formamid und eine Säure eingesetzt, insbesondere eine anorganische Säure, beispielsweise Salzsäure oder Schwefelsäure, so dass das Fällen am Ende bei einem pH-Wert von etwa 2 bis 3 und vorzugsweise etwa 2 bis 2,5 erfolgt.
Zum Fällen wird nach einer Ausführungsform zunächst die Säure in das zum Fällen erforderliche Wasser gegeben, damit der pH-Wert sauer ist und vorzugsweise im Bereich von 2 bis 3 liegt, worauf das Reaktionsmedium und das angesäuerte Wasser vermischt werden, vorzugsweise indem das Reaktionsmedium in das angesäuerte Wasser gegeben wird oder indem das Reaktionsmedium und das angesäuerte Wasser gleichzeitig in ein Reaktionsgefäß gegeben werden. Während des gesamten Fällvorgangs wird das Gemisch vorzugsweise bei einem pH-Wert von etwa 2 bis 3 und insbesondere etwa 2 bis 2,5 gehalten, indem erforderlichenfalls Säure in das Gemisch gegeben wird. Nach dieser Ausführungsform ist es auch vorteilhaft, das Reaktionsgemisch vor dem Fällen mit Wasser zu verdünnen, beispielsweise in einer Menge von etwa 0,2 bis 0,4 Teile auf ein Gewichtsteil Formamid.
Nach einer anderen Ausführungsform wird das Reaktionsmedium zunächst mit Wasser vermischt und der pH-Wert des Gemisches anschließend durch Zugabe der Säure auf etwa 2 bis 3 und vorzugsweise 2 bis 2,5 eingestellt und dann dort gehalten.
Bei der verwendeten Säure handelt es sich insbesondere um Schwefelsäure.
Es ist auch wichtig, dass die Temperatur während des Fällvorgangs im Bereich von etwa 0 bis 40ºC und vorzugsweise etwa 5 bis 20ºC gehalten wird.
Das N-Formyl-leucin kristallisiert spontan, es kann jedoch auch ein Kristallisationskeim zugegeben werden, um die Kristallisation zu fördern.
Nach abgeschlossener Kristallisation werden die Kristalle von N-Formyl-leucin nach einer üblichen Methode gewonnen. Die erhaltenen Kristalle sind insbesondere so groß, dass sie leicht filtriert, gewaschen und getrocknet werden können.
Die Ausbeute des trockenen N-Formyl-leucin liegt im Allgemeinen über 80%.
Die Reinheit des N-Formyl-leucin liegt bei 98% oder darüber und häufig sogar über 99%.
Das nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene N-Formylleucin kann direkt als Zwischenprodukt zur Durchführung von Peptidsynthesen oder zur Herstellung von pharmazeutischen Produkten eingesetzt werden.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung, ohne ihren Umfang einzuschränken.

Beispiel 1

In einem Reaktionsgefäß, das mit einem Rührsystem ausgestattet ist, werden unter Stickstoff 165,2 g L-Leucin und 821,7 g Formamid gegeben. Das Gemisch wird etwa 6 h auf 100ºC erwärmt. Dann werden etwa 513 g Formamid durch Destillation unter einem Druck von 20 bis 30 mm Quecksilber und einer Massetemperatur von 50 bis 60º entfernt. Anschließend gibt man 1082 g Wasser in das Gemisch. Das Gemisch wird auf 20 bis 25ºC abgekühlt. Dann wird mit Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert. Es wird etwa 2 h bei 20ºC und anschließend 1 h bei 5ºC gerührt. Man filtriert und spült den Filterkuchen mit 100 g Wasser von pH 2. Es wird im Vakuum getrocknet. Auf diese Weise fallen 180,3 g N-Formyl-L-leucin (Ausbeute 90%) mit einem Drehvermögen [α]D²&sup0; = -17,7º (C = 1 in Ethanol) mit einer Reinheit von 98,3% an.
Durch Chromatographie (DC oder GC) wird ermittelt, dass weniger als 0,1 Gew.-% Leucin und weniger als 0,01 Gew.-% Isoleucin übrig bleiben.

Beispiel 2

In ein Reaktionsgefäß, das mit einem Rührsystem ausgestattet ist, werden unter Stickstoff 520 kg (11, 55 kmol) Formamid und 500 kg (3,81 kmol) L-Leucin gegeben. Das Gemisch wird auf eine Temperatur im Bereich von 96 bis 101ºC erwärmt und diese Temperatur wird 10 h gehalten. Es bildet sich eine gelb-orange klare Lösung. Dann gibt man bei etwa 20ºC 150 l elektrolytfreies Wasser zu. Anschließend wird das N-Formyl-L-leucin gefällt, indem das Gemisch während einer Zeitspanne von etwa 1 h in 1500 l Wasser gegeben wird, das mit Schwefelsäure von 55% auf einen pH-Wert von 2 bis 3 angesäuert wurde, wobei der pH-Wert während der gesamten Dauer des Vorgangs durch Zugabe von 55%iger Schwefelsäure aufrechterhalten und die Temperatur im Bereich von 0 bis 35º gehalten wird.
Das N-Formyl-L-leucin kristallisiert allmählich. Nach Zugabe des gesamten Gemisches in das Wasser wird das Medium noch 4 h bei einer Temperatur von 15ºC und einem pH-Wert von 2 bis 2,5 gehalten.
Die gebildeten Kristalle werden mit einer Zentrifuge gewonnen und dann mehrmals mit neutralem Wasser gewaschen und im Trockenschrank getrocknet. Man erhält 490 kg (Ausbeute 81%) N-Formyl-L- leucin mit den folgenden Eigenschaften:
Wassergehalt: 0, 08%
Schmelzpunkt: 139ºC
Reinheit: 99,8% (mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, HPLC oder Titration ermittelt).

Beispiel 3

In ein Reaktionsgefäß, das mit einem Rührwerk ausgestattet ist, werden unter Stickstoff 1 kg L-Leucin, 0,68 kg Formamid und 0,35 kg Ameisensäure gegeben.
Das Gemisch wird 3 bis 4 h auf etwa 90º erwärmt. Dann werden 2 l Wasser zugegeben. Man kühlt das Gemisch auf 15º ab.
Anschließend werden in das Gemisch 0,62 kg Schwefelsäure von 55% gegeben, wodurch ein pH-Wert von 2,3 eingestellt wird. Man rührt das Gemisch weitere 30 min bei 15ºC. Die gebildeten Kristalle werden durch Zentrifugieren gewonnen, mehrmals mit Wasser gewaschen und getrocknet. Es fallen 1,05 kg (Ausbeute 86%) N-Formyl-L-leucin mit einer Reinheit von 98% (durch HPLC ermittelt) an.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung von N-Formyl-leucin durch Umsetzung von Leucin mit Formamid, dadurch gekennzeichnet, dass nach abgeschlossener Reaktion das N-Formyl-leucin bei einer Temperatur von etwa 0 bis 40ºC gefällt wird, indem das Reaktionsmedium mit Wasser und einer Säure so vermischt wird, dass der pH-Wert des Gemisches bei etwa 2 bis 3 liegt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung von Leucin und Formamid in Gegenwart von Ameisensäure durchgeführt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die mit dem Leucin umgesetzte Formamidmenge unter 4 mol pro Mol Leucin liegt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die zum Ausfällen verwendete Wassermenge im Bereich von etwa 1,5 bis 5 Teile auf 1 Gewichtsteil anfänglich eingesetztes Formamid liegt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Durchführung der Fällung das zum Ausfällen erforderliche Wasser durch Zugabe einer Säure angesäuert wird, bevor das Wasser mit dem Reaktionsmedium vermischt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass das Reaktionsmedium vor der Fällung mit Wasser verdünnt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass zur Durchführung der Fällung zunächst das Wasser mit dem Reaktionsmedium vermischt wird und anschließend der pH-Wert des Gemisches durch Zugabe einer Säure auf etwa 2 bis 3 eingestellt und dort gehalten wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass während des Arbeitsgangs des Fällens der pH-Wert zumindest am Schluß im Bereich von etwa 2 bis 2,5 gehalten wird.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Temperatur bei der Fällung im Bereich von etwa 5 bis 20ºC liegt.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Leucin und das Formamid bei einer Temperatur im Bereich von etwa 80 bis 110ºC umgesetzt werden.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Umsetzung in Gegenwart von etwa 0,1 bis 2 mol Ameisensäure pro Mol Leucin erfolgt.