DE69836226T2

DE69836226T2 - Ifn rezeptor 1 bindende proteine, dafür kodierende dna und verfahren zur regulierung der zellulären antwort auf interferone

Info

Publication number: DE69836226T2
Application number: DE69836226T
Authority: DE
Inventors: Michel Revel; Carolina Abramovitch; E. Judith CHEBATH
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1997-01-15
Filing date: 1998-01-15
Publication date: 2007-02-01
Anticipated expiration: 2018-01-16
Also published as: US7264945B2; KR100591988B1; EA199900663A1; IL130960A; CA2276111A1; CZ247199A3; EP1019500A4; JP2001508306A; DK1019500T3; EE9900272A; BR9806755A; EP1019500B1; CN1243544A; ATE342972T1; AU731206C; EE04819B1; WO1998031796A8; KR20000070181A; KR20050046779A; NO993412L

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich im Allgemeinen auf die molekularen Mechanismen der Interferonwirkung und spezifischer auf neue, den Interferon-Rezeptor 1 bindende Proteine, rekombinante DNA-Moleküle, die für diese kodieren und Verfahren zur Modulierung der zellulären Antwort auf Interferon.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Typ I-Interferone (IFN-α und -β-Subtypen) erzeugen pleiotrope Wirkungen auf Zellen, wie z.B. die Inhibition der Virusreplikation (antivirale Wirkung), die Inhibition der Zellproliferation (antitumorale Wirkungen) und die Modulation der Immunzellaktivitäten (immunregulatorische Wirkungen). Diese verschiedenen Wirkungen der Interferone (IFNs) stehen in Beziehung mit morphologischen und biochemischen Modifikationen der Zellen (Revel, 1984, als Zusammenfassung).
Interferone üben ihre Wirkungen über Spezies-spezifische Rezeptoren aus. Als Typ I-IFNs wurden zwei transmembrale Rezeptorketten identifiziert. IFNAR1 (Uze et al., 1990) und IFNAR2-2 (oder IFNAR2-c, Domanski et al., 1995). Die Transduktion des von IFN-α,β,ω erzeugten Signals beinhaltet Proteintyrosinkinasen der Familie der Janus-Kinasen (Jak) und Transkriptionsfaktoren der Stat-Familie (Damell et al., 1994). Proteine des Jak-Stat-Weges werden durch Bindung an die intracytoplasmatischen (IC) Domänen der IFNAR1- und IFNAR2-Rezeptorketten aktiviert. Zu den Proteinen, die an die IFNAR1 IC-Domänen binden, gehören tyk2 und Stat2 (Abramovich et al., 1994). Stat2 würde anschließend Stat1 heranziehen, um den IFN-induzierten ISGF3-Transkriptionskomplex zu bilden, der IFN-induzierte Gene aktiviert (Leung et al., 1995). Transkriptionskomplexe, die Stat3 enthalten, werden ebenfalls von IFN-β induziert (Harroch et al., 1994), und eine IFN-abhängige Bindung von Stat3 an IFNAR1-IC wurde beobachtet (Yang et al., 1996). Die Proteintyrosinphosphatasen PTP1C und D assoziieren bei Zugabe von IFN reversibel mit IFNAR1 (David et al., 1995a). Darüber hinaus binden zwei Serin/Threoninproteinkinasen, die 48 kDa ERK2 MAP-Kinase (David et al., 1995b) und die cAMP-aktivierte Proteinkinase A (David et al., 1996) an die isolierten membran-proximalen 50 Reste von IFNAR1-IC. Daher dienen die IC-Domänen des Typ I IFN-Rezeptors als Andockstellen für verschiedene Proteine, die dazu dienen, die biologischen Wirkungen der IFNs auf Zellen zu erzeugen und zu regulieren.
Das Two-Hybrid-Screening in Hefe ist ein wirksames Verfahren zum Identifizieren neuer Proteine, die an bestimmte Polypeptidsequenzen binden (Fields and Song, 1989). Kurz beschrieben, wird der Two-Hybrid-Screen durchgeführt durch Transfizieren von Hefezellen mit (a) einer Plasmid-DNA, in der das definierte Polypeptid (Beute, bait) an die DNA-bindende Domäne des Gal4-Transkriptionsfaktors fusioniert ist und (b) einer cDNA-Bibliothek, die an die Aktivierungsdomäne von Gal4 in einem pACT Plasmid fusioniert ist. Hefezellen, die mit einer cDNA transfiziert wurden, die für ein Protein kodiert, das an die Polypeptidbeute bindet, werden dann die Gal4-Aktivität wieder herstellen. Das Vorhandensein eines solchen Proteins, das an die Polypeptidbeute bindet, wird durch Expression einer enzymatischen Aktivität, wie z.B. der β-Galactosidase, von einem GAL1-lacZ-Konstrukt aus, das vorzugsweise in das Hefegenom eingeführt wird, offenbart. Es ist möglich, aus Hefeklonen, die in diesem Test positiv sind, das pACT Plasmid zu isolieren, die Nukleotidsequenz seines Inserts zu bestimmen und das Protein, für welches es kodiert, zu identifizieren. Dieses Verfahren hat die Identifikation neuer Proteine, die mit der IC-Domäne von Zytokinrezeptoren interagiert, ermöglicht (Boldin et al., 1995).
Die Zitierung irgendeines Dokumentes hierin ist nicht als Zugeständnis gedacht, dass ein derartiges Dokument den relevanten Stand der Technik darstellt oder für die Patentierbarkeit irgendeines Anspruches der vorliegenden Erfindung zu berücksichtigendes Material darstellt. Jegliche Aussage zum Inhalt oder Datum irgendeines Dokumentes basiert auf der den Anmeldern zum Zeitpunkt der Einreichung zugänglichen Information und stellt kein Eingeständnis bezüglich der Korrektheit einer solchen Aussage dar.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf zwei neue humane Proteine, die hierin als IR1B1 und IR1B4 bezeichnet werden, die als IFN-Rezeptor 1 (IFNAR1) bindende Proteine identifiziert wurden, sowie auf die für diese beiden Proteine kodierende DNA. Jedes der beiden 1R1B1- und 1R1B4-Proteine interagiert mit der intracytoplasmatischen (IC) Domäne von IFNAR1 und vermittelt die zellulären Antworten auf Interferon.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz enthält, die entweder für das IR1B1- oder das IR1B4-Protein kodiert, oder Fragmente davon, ebenso wie die dadurch kodierten Proteine. In den rekombinanten DNA-Molekülen sind die Nukleotidsequenz, die für das IR1B1- oder das IR1B4-Protein kodiert oder die Fragmente davon funktionell mit einem Promotor entweder in Sense-Orientierung oder in Antisense-Orientierung verbunden.
Durch Verabreichen des rekombinanten DNA-Moleküls, das einen Promotor enthält, der funktionell mit der Nukleotidsequenz, die für ein neues IFNAR1-bindendes Protein kodiert, in Sense-Orientierung verbunden ist, direkt in Tumore, wird die Antwort auf eine exogene Interferon-Therapie bei der Behandlung von Krebs verstärkt.
Darüber hinaus bezieht sich die vorliegende Erfindung ferner auf ein Verfahren zur Verlängerung des Überlebens eines Gewebetransplantats durch Einführen des rekombinanten Moleküls, das einen Promotor enthält, der funktionell mit der Nukleotidsequenz verbunden ist, die für ein neues IFNAR1-bindendes Protein kodiert oder mit einem Fragment davon, in Antisense-Orientierung, in das zu transplantierende Gewebe vor der Transplantation in den Patienten.
Folglich bezieht sich die vorliegende Erfindung außerdem auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine derartige DNA, RNA oder ein derartiges Protein enthalten sowie auf therapeutische Verfahren zur Verwendung derselben.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich außerdem auf Antikörper, die spezifisch für die neuen Proteine gemäß der vorliegenden Erfindung sind.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die Interaktion von IR1B1 mit der IFNAR1-IC Domäne, wie mit Hilfe der Two-Hybrid genetischen Interaktionsanalyse in Hefe gemessen wurde. In dem umrandeten unteren Teil der Abbildung ist das cDNA Insert in pACT in Kombination mit verschiedenen "Beuten" (baits) angegeben.
2 zeigt die Interaktion von IR1B4 mit der IFNAR1-IC Domäne, wie mit Hilfe der Two-Hybrid genetischen Interaktionsanalyse in Hefe gemessen. In dem umrandeten unteren Teil der Abbildung sind die cDNA-Inserts in pACT in Kombination mit verschiedenen "Beuten" angegeben.
3 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 1) und die Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 2) von IR1B1.
4 zeigt die Homologie und das Alignment der Aminosäuresequenz von IR1B1 (SEQ ID NR: 2) mit den Aminosäuresequenzen von zwei Calciumbindenden Proteinen, Calcineurin B (abgekürzt CALB; SEQ ID NR: 3) und Caltractin (abgekürzt CATR; SEQ ID NR: 4). Identische Aminosäuren in IR1B1 und CALB oder zwischen CALB und CATR sind durch das Symbol "|" zwischen den beiden gezeigt. Eine Übereinstimmung zwischen IR1B1 und CATR, jedoch nicht mit CALB, wird durch das Symbol ":" zwischen beiden gezeigt. Regionen, die in Fettdruck dargestellt sind, sind die Calcium-bindenden Helix-loop-Helix EF-Hand-Domänen.
5 zeigt Northern Blots der IR1B1 mRNA und 18S rRNA (untere Linie) in humanen U266S Myelomzellen, die mit IR1B1 cDNA hybridisiert wurden und die rasche und transiente Induktion von IR1B1 bei Behandlung der Zellen entweder mit IFN-α8 oder IFN-β für 2 h oder 18 h. Die erste Spur ist eine Kontrolle ohne IFN-Behandlung nach 2 h.
6A und 6B sind SDS-PAGE Spuren, welche die in vitro-Interaktion von IR1B4 mit der isolierten IFNAR1-IC Domäne (6a) und mit Zellextrakten aus humanen U266S Zellen und U266R Zellmembranen zeigen (6B). In 6A wurden die [³⁵S]Methionin-markierten Translationsprodukte mit oder ohne flag-IR1B4 in vitro-Transkripten entweder mit anti-flag M2-Kügelchen immunpräzipitiert (10 μl) (Spuren 1 und 4) oder mit Glutathion-Kügelchen zur Reaktion gebracht (50 μl), die an GST gekoppelt sind, das an die 100 Aminosäuren lange IFNAR1-IC Domäne fusioniert ist (Spuren 2 und 5) oder an GST allein gekoppelt ist (Spuren 3 und 6). Nach einer Über-Nacht-Inkubation bei 4°C (Endvolumen 100 μl) wurden die Kügelchen gewaschen, und die SDS-eluierten Proteine wurden vor der SDS-PAGE unter reduzierenden Bedingungen gekocht. In 6B wurden U266S Zellen (Spur 1) oder U266R-Zellen (Spur 2) mit Brij-Puffer und Antiproteasen ext rahiert (Abramovich et al., 1994), und 0,35 ml (10⁷ Zellen) wurden über Nacht bei 4°C mit 75 μl [³⁵S]Methionin-markierten Translationsprodukten derflag-IR1B4 Transkripte inkubiert. Anti-IFNAR1 mAb R3, der auf Protein G-Kügelchen immobilisiert wurde (25 μl) wurde für 2,5 h dazugegeben, in Brij-Puffer gewaschen und mit SDS eluiert, gekocht und reduzierte Proteine wurden mit Hilfe einer SDS-PAGE analysiert. Eine Kontrolle mit antiflag M2-Kügelchen wie oben beschrieben wurde laufen gelassen (Spur 3). Die getrockneten Gele wurden in einem Phosphor-Imager visualisiert. In den ersten drei Spuren der 6A wurde keine IR1B4 mRNA zu der in vitro-Translationsreaktion gegeben. In den zweiten drei Spuren der 6A wurde eine mRNA, die für das IR1B4-Protein fusioniert an das flag-Protein kodiert, in einem in vitro-System translatiert.
7 zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NR: 7) und die abgeleitete Aminosäuresequenz (SEQ ID NR: 8) von IR1B4.
8 zeigt das Aminosäure-Alignment von IR1B4 (SEQ ID NR: 8) und PRMT1 (SEQ ID NR: 9) und ihre Unterschiede.
9 zeigt das Aminosäure-Alignment von IR1B4 und HCP-1 (SEQ ID NR: 10) und ihre Unterschiede.
10 zeigt ein Methyltransferase-Assay. Extrakte aus U266S Zellen wurden mit Kügelchen zur Reaktion gebracht, die mit Protein A und anti-IFNAR1 Antikörper (Spur 1) oder mit Protein A allein (Spur 2) beschichtet sind. Die Methyltransferaseaktivität wurde durch Markieren der Histone mit ¹⁴C(Methyl)-S-adenosylmethionin und durch Analysieren der Radioaktivität in der Histonbande mit Hilfe der Elektrophorese auf einem SDS-PAGE gemessen.
11 zeigt ein Assay der Protein-Arginin-Methyltransferaseaktivität in U266S Zellen. In Spur 1 wurde die Protein-Arginin-Methyltransferaseaktivität humaner U266S Zellen durch Methylieren des Peptids R1, das die Sequenz der Sequenz SEQ ID NR: 11 aufweist, gemessen. In Spur 2 wurde ein Antisense-Oligonukleotid der SEQ ID NR: 12, das komplementär zu der Se quenz der Nukleotide 12–33 um das Initiationscodon der IR1B4 cDNA herum ist, dazugegeben. In Spur 3 wurde das entsprechende Sense-Oligonukleotid dazugegeben. Es ist zu beobachten, dass das Antisense-Oligonukleotid die Protein-Arginin-Methyltransferaseaktivität im Wesentlichen inhibiert, während das Kontroll-Sense-Oligonukleotid einen geringen Effekt hat.
12 ist eine Grafik, welche die Wachstumsinhibition humaner U266S Zellen in Antwort auf eine IFN-β-Behandlung in Gegenwart oder Abwesenheit des in 11 verwendeten Antisense-Oligonukleotids zeigt (AS-1), des entsprechenden Sense-Oligonukleotids (S-3) und eines weiteren Antisense-Oligonukleotids, das gegen den mittleren Teil der IR1B4 cDNA gerichtet ist (AS-2). Die Zelldichte wurde mit Hilfe eines Farbtests mit Alamar Blau quantifiziert (siehe Beispiel 7), und die Verringerung der Zelldichte wurde als Prozent der unbehandelten Kontrollvertiefungen berechnet und als Wachstumsinhibition dargestellt.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Entdeckung zweier neuer humaner Proteine, die mit der intracytoplasmatischen Domäne (IC) der IFNAR1-Kette des InterferonTyp 1 (IFN-α, β oder ω) Rezeptors interagieren und werden hierin als IFN-Rezeptorbindendes Protein 1 (IR1B1) und IFN-Rezeptor-bindendes Protein 4 (IR1B4) bezeichnet. Die Interaktion dieser zwei neuen Proteine mit IFNAR1 wurde mit Hilfe eines Two-Hybrid genetischen Tests in Hefe nachgewiesen, in denen die Transfektion des Hefe-Reporterstammes SFY526 (Bartel et al., 1993) mit IR1B1 oder IR1B4 cDNA, die an die Gal4-Aktivierungsdomäne fusioniert war, nur zu einer β-Galactosidaseaktivität führte, wenn die IFNAR1-IC Domäne (fusioniert an die Gal4 DNA-bindende Domäne) als Beute verwendet wurde.
Die Sequenz der IR1B1 cDNA kodiert für ein 191 Aminosäuren langes Polypeptid. Computerrecherchen der Sequenzdatenbanken zeigten, dass IR1B1 ein neues Protein ist, das eine bemerkenswerte Homologie, z.B. Calcium-bindende Stellen (E-F-Hände), mit den Calcium-bindenden Proteinen Calcineurin β und Caltractin aufweist. Calcineurin β (Guerini et al., 1989) ist eine 19 kDa-Untereinheit einer Serin/Threoninphosphatase, die eine Schlüsselrolle bei der Aktivierung der Translokation des Transkriptionsfaktors NFT in den Nukleus von T-Lymphocyten spielt und durch immunsuppressive Arzneimittel wie z.B. Cyclosporin inhibiert wird. Caltractin (Lee und Huang, 1993), ein 21 kDa-Protein, ist ein mit dem Cytoskelett assoziiertes Protein, das in Centrosomen zu finden ist und ist an der Bewegung der Chromosomen während der Mitose und allgemeiner an den Microtubuli-Organisationszentren beteiligt. Folglich ist das neue IR1B1-Protein ein neues Mitglied der Calcineurin- und Caltractin-Familien der Calcium-regulierten Proteine.
Es wurde überraschenderweise festgestellt, dass das Gen für IR1B1 in humanen Zellen durch Behandlung mit IFN rasch aktiviert wird. Folglich ist dies das erste Beispiel eines Calcium-bindenden Proteins, das durch IFN induziert wird. Da Calciumionen die Zellmorphologie, -adhäsion und -teilung regulieren, könnte die Modulation der IR1B1-Aktivität in Zellen die Antwort normaler und maligner Zellen auf IFN beeinträchtigen. Die Rolle von IR1B1 bei der Vermittlung der IFN-Wirkung in Zellen wird unterstützt durch die Interaktion von IR1B1 mit der IC-Domäne einer IFN-Rezeptorkette.
Während von IR1B4 ebenso wie von IR1B1 festgestellt wurde, dass es ein neues Protein ist, wie mit Hilfe von Computerrecherchen der Sequenzdatenbanken festgestellt wurde, wurde ferner festgestellt, dass IR1B4 eine Sequenzhomologie mit Enzymen aufweist, die S-Adenosylmethionin zur Methylierung von Argininresten in Proteinen verwenden und als Protein-Arginin-Methyltransferasen bezeichnet werden (PRMT1; Kagan und Clarke, 1994; Lin et al., 1996). Von IR1B4 wurde festgestellt, dass es in vitro direkt an die IC-Domäne von IFNAR1 bindet, und die konstitutive Assoziierung der PRMT-Aktivität mit der IFNAR-Kette des IFN-α, β-Rezeptors, der aus humanen Zellen isoliert wurde, wurde durch Methylierung der Histone nachgewiesen. Als Antisense-Oligodeoxynukleotide der IR1B4 cDNA zu humanen Zellkulturen dazugegeben wurden, wurde eine Verringerung der PRMT-Aktivität in der Zellkultur beobachtet. Humane Myelomzellen, die auf diese Weise behandelt wurden, zeigten eine wesentlich verringerte Antwort auf IFN, wie mit Hilfe der Wachstumsinhibition gemessen wurde. Folglich ist IR1B4/PRMT an dem Stoffwechselweg beteiligt, durch den der IFN-Rezeptor die Wachstumsinhibition in Tumorzellen bewirkt und ist außerdem an anderen Funktionen des IFN-Rezeptors beteiligt. Bekannte Substrate von PRMT schließen eine Anzahl von RNA- und DNA-bindenden Proteinen ein und insbesondere heteronukleäre Ribonukleoproteine (hnRNPs). Die hnRNPs sind an dem mRNA-Transport aus dem Nukleus in das Cytoplasma, dem alternativen Splicen der prä-mRNA und der posttranskriptionellen Kontrolle beteiligt (Liu und Drey fuss, 1995). Entsprechend können die neue humane IR1B4/PRMT cDNA und das IR1B4/PRMT Protein, die durch ihre Assoziation mit dem IFN-Rezeptor entdeckt wurden, verwendet werden, um die Antwort humaner oder tierischer Zellen auf IFN zu modifizieren.
Ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß der vorliegenden Erfindung enthält eine Nukleotidsequenz, die für das IR1B1 Protein oder das IR1B4 Protein kodiert, oder ein Fragment davon und kann entweder verwendet werden, um die zelluläre Antwort auf IFN durch Verstärkung der Expression der IR1B1 cDNA oder IR1B4 cDNA zu erhöhen oder um die zelluläre Antwort auf IFN durch Senken der Expression der IR1B1 cDNA oder IR1B4 cDNA zu verringern.
Die verstärke in vivo Expression der IR1B1 oder IR1B4 cDNA wäre nützlich bei der Krebstherapie, in der die verstärkte zelluläre Antwort auf IFN zu einer Verringerung des malignen Zellwachstums und zu einer verstärkten Antwort auf die exogene IFN-Therapie führen würde. Um eine verstärkte in vivo Expression des IR1B1 und IR1B4 an dem Zielort für eine verstärkte zelluläre Antwort auf IFN zu erhalten, können Expressionsvektoren, die eine IR1B1 oder IR1B1 cDNA enthalten, die in Sense-Orientierung funktionell mit einem starken konstitutiven Promotor verbunden ist, direkt in den Zielort injiziert werden, wie z.B. in Gehirntumore oder metastatische Tumorknoten (z.B. Melanome oder Brustkrebs).
Umgekehrt wäre die verringerte in vivo Expression der IR1B1- oder IR1B4-Proteine nützlich zur Verlängerung des Überlebens von Gewebstransplantaten, da die Abstoßung dieser Transplantate in dem Wirt durch die Histokompatibilitätsantigene (MHC-Klasse 1) vermittelt wird, deren Synthese von dem IFN-Stimulus abhängig ist. Wird die cDNA für IR1B1 oder IR1B4 oder Fragmente davon, die in einem geeigneten Vektor enthalten sind und funktionell in Antisense-Orientierung mit einem Promotor verbunden sind, in Zellen oder Gewebe eingeführt, die transplantiert werden sollen, führt die Expression der Antisense-RNA zur Degradation der IR1B1 oder IR1B4 mRNA (oder Sense-RNA für IR1B1/IR1B4) und folglich zu einer Abnahme der zellulären Konzentrationen des IR1B1- oder IR1B4 Proteins.
Die Antisense-RNA wird von einem stromaufwärts gelegenen Promotor transkribiert, der funktionell mit einer kodierenden Sequenz verbunden ist, die in Antisense-Richtung an geordnet ist, d.h. entgegengesetzt der normalen oder Sense-Richtung der DNA und seiner transkribierten Sense-RNA (mRNA). Die Expression der Antisense-RNA, die komplementär zu der Sense-RNA ist, ist ein wirksamer Weg zur Regulierung der biologischen Funktion der RNA-Moleküle. Durch die Bildung einer stabilen Duplex zwischen der Sense-RNA und der Antisense-RNA wird das normale oder Sense-RNA-Transkript inaktiviert und ist nicht mehr translatierbar.
Rekombinante DNA-Molekül, die z.B. die Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, enthalten die cDNA des IR1B1 oder IR1B4 oder Fragmente davon, die funktionell mit einem Promotor entweder in Sense- oder in Antisense-Orentierung verbunden sind. Die Bezeichnung "Promotor" soll eine doppelsträngige DNA- oder RNA-Sequenz umfassen, die fähig ist, die RNA-Polymerase zu binden und die Transkrption einer "funktionell verbundenen" Nukleinsäuresequenz zu bewirken. Folglich wäre eine DNA-Sequenz funktionell mit einer Promotorsequenz verbunden, wenn der Promotor in der Lage ist, die Transkription der DNA-Sequenz zu bewirken, unabhängig von der Orientierung der DNA-Sequenz.
Die Promotorarten, die zur Kontrolle der Transkription verwendet werden, können jegliche Arten sein, die in den Wirts/Zielzellen funktionieren. Beispiele für Promotoren, die in Säugerzellen funktionieren, schließen den SV40 frühen Promotor, den Adenovirus Major Late Promotor, den Herpes simplex (HSV) Thymidinkinasepromotor, den Rous Sarcom (RSV) LTR-Promotor, den humanen Cytomegalievirus (CMV) Immediate Early Promotor, den LTR-Promotor des Säugertumorvirus der Maus (MMTV), den Interferon β-Promotor, den Hitzeschockprotein 70 (hsp70) Promotor, ebenso wie zahlreiche andere auf dem Gebiet bekannte Promotoren ein.
Ein Promotor, der zur Expression des IR1B1- oder des IR1B4-Proteins funktionell mit der IR1B1 oder IR1B4 cDNA in Sense-Orientierung verbunden ist, ist vorzugsweise ein starker konstitutiver Promotor. Dies ermöglicht hohe Konzentrationen an IR1B1 oder IR1B4, ungeachtet des Vorhandenseins eines endogenen zellulären Mechanismus zur Regulierung der Expression von IR1B1 oder IR1B4.
In ähnlicher Weise ist der Promotor, der funktionell mit der IR1B1 oder IR1B4 cDNA in Antisense-Orientierung verbunden ist, vorzugsweise ein starker Promotor, wie z.B. der Promotor, der in der regulierenden Region des Epstein-Barr-Virus (EBV) vorhanden ist, der hohe Konzentrationen der Antisense-RNA Expression ermöglicht (Deiss und Kimchi, 1991).
Die Antisense-Sequenz ist vorzugsweise nur in den Wirtszellen/Zielzellen exprimierbar, die vorzugsweise humane Zellen sind, und die exprimierte Antisense-RNA sollte stabil sein (d.h. nicht einer raschen Degradation unterliegen). Die Antisense-RNA sollte nur mit der in den Wirtszellen/Zielzellen exprimierten Sense-mRNA hybridisieren und ein stabiles doppelsträngiges RNA-Molekül bilden, das im Wesentlichen nicht translatierbar ist. In anderen Worten hindert die Antisense-RNA, die in den Wirtszellen/Zielzellen exprimiert wird, die exprimierte Sense-mRNA daran, in ihre IR1B1- oder IR1B4-Proteine translatiert zu werden. Die von dem Vektor stammende Antisense-Sequenz kann entweder die vollständige IR1B1 oder IR1B4 cDNA-Sequenz tragen oder lediglich einen Teil davon, solange der Antisense-Teil in der Lage ist, mit der Sense-mRNA zu hybridisieren und deren Translation in ihr IR1B1- oder ihr IR1B4-Protein zu verhindern. Entsprechend wird eine "Antisense"-Sequenz wie durchgehend in der Beschreibung und den Ansprüchen verwendet, definiert als die vollständige Antisense-Sequenz oder ein Teil davon, die/der im Stande ist, in transformierten/transfizierten Zellen exprimiert zu werden und die/der außerdem im Stande ist, spezifisch mit der "Sense" IR1B1 oder IR1B4 mRNA zu hybridisieren, um ein nicht translatierbares doppelsträngiges RNA-Molekül zu bilden.
Die Antisense-Sequenz muss nicht mit der gesamten Länge der IR1B1 oder IR1B1 mRNA hybridisieren. Stattdessen kann es mit ausgewählten Bereichen hybridisieren, wie z.B. der 5' untranslatierten nicht kodierenden Sequenz, der kodierenden Sequenz oder der 3' untranslatierten Sequenz der "Sense" mRNA. Vorzugsweise hybridisiert die Antisense-Sequenz mit der 5' kodierenden Sequenz und/oder der 5' nicht kodierenden Region, wie z.B. an den Cap- und Initiationskodonstellen, da bei vielen Beispielen von Antisense-Oligonukleotiden beobachtet wurde, dass ein Targeting des Initiationskodons effektiver ist, während ein Targeting interner Sequenzen innerhalb des kodierenden Bereiches nicht so wirksam ist (Wickstrom, 1991). Die Effektivität einer Antisense-Sequenz bei der Verhinderung der Translation einer IR1B4 Sense-mRNA kann leicht in einem Assay zur Bestimmung der Protein-Arginin-Methyltransferaseaktivität in U266S Zellen wie in Beispiel 7 beschrieben überprüft werden. Angesichts der Größe des Säugergenoms ist die Antisense IR1B1- oder IR1B4 Sequenz vorzugsweise wenigstens 17, bevorzugter wenigstens 30 Basenpaare lang. Jedoch können kürzere Sequenzen immer noch nützlich sein, d.h. sie hybridisieren entweder zufällig nicht an andere Säugerse quenzen oder eine solche "Kreuzhybridisierung" beeinträchtigt den Metabolismus der Zelle nicht in einer solchen Weise oder in einem solchen Ausmaß, dass sie das Erreichen der Ziele dieser Erfindung verhindert.
Sowohl das bevorzugte Ziel der Hybridisierung als auch die bevorzugte Länge der Antisense-Sequenz sind leicht durch systematische Experimente zu bestimmen. Standardverfahren, wie z.B. in Ausubel et al., Editoren, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc., New York, N.Y., 1987–1996, und in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschreiben, können verwendet werden, um einen zunehmend größeren Teil der Antisense-Sequenz systematisch aus dem Vektor zu entfernen. Neben der vollständig langen Antisense-Sequenz kann eine Folge versetzter Deletionen erzeugt werden, vorzugsweise an dem 5'-Ende der Antisense-Sequenz. Dies erzeugt eine Serie trunkierter Antisense-Sequenzen, die noch immer komplementär vorzugsweise zu dem 5'-Ende der Sense-mRNA bleiben und als Ergebnis noch immer ein RNA-Molekül bilden, das an dem 5'-Ende der Sense-mRNA doppelsträngig ist (das 3'-Ende einer Antisense-RNA komplementieren) und nicht translatierbar bleibt. Darüber hinaus können Antisense-Oligonukleotide, wie z.B. das Oligonukleotid AS-1 (SEQ ID NR: 12) einfach chemisch synthetisiert werden und in einen Vektor in funktioneller Verbindung mit einem Promotor eingeführt werden, um zur Verringerung der in vivo zellulären Expression des IR1B1- oder IR1B4-Proteins verwendet zu werden.
Die Vektoren gemäß der vorliegenden Erfindung können jegliche geeignete eukaryontische oder prokaryontische Vektoren sein, die normalerweise zur Transfektion von Säugerzellen verwendet werden, wie z.B. episomale, replizierbare oder chromosomal integrierbare Vektoren, die auf dem Gebiet wohlbekannt sind. Ein besonders bevorzugter Vektor zur Expression der IR1B1 oder IR1B4 Antisense-RNA ist das episomale Plasmid, das die regulatorische Region des Epstein-Barr-Virus (Deiss und Kimchi, 1991) enthält, die als Promotor dient, der funktionell mit der IR1B1 oder IR1B4 cDNA verbunden ist, die in Antisense-Orientierung relativ zu dieser regulatorischen Region angeordnet ist. Die Verwendung von Antisense Vektoren und Oligonukleotid-Phosphorothioaten wird in Annals of the New York of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, Editoren B.E. Huber und J.S. Lazo, Vol. 716, 1994 (z.B. Milligan et al., S. 228–241) behandelt.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann das Überleben von Geweben oder Organen, die in einen Patienten mit einem Bedarf an einem solchen Transplantat transplantiert werden, durch Verringern der zellulären Antwort auf IFN verlängert werden. Die Abstoßung des transplantierten Gewebes wird durch die Histokompatibilitätsantigene vermittelt, wobei die Synthese dieser MHC Klasse I Antigene von einem IFN-Stimulus abhängig ist. Folglich wird eine Verringerung der zellulären Antwort auf den IFN-Stimulus das Überleben des transplantierten Gewebes verlängern. Das Verfahren zur Verlängerung des Überlebens eines Gewebetransplantats gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst das Einführen eines rekombinanten DNA-Moleküls, das eine IR1B1 oder IR1B4 cDNA-Sequenz oder ein Fragment davon enthält, die funktionell mit einem Promotor in Antisense-Orientierung verbunden ist, in die Zellen eines Gewebes oder eines Organs, das in einen Patienten transplantiert werden soll, wobei die Antisense IR1B1 oder IR1B4 RNA in diesen transfizierten/transformierten Zellen exprimiert wird. Das rekombinante DNA-Molekül kann auf eine Art und Weise in die Zellen eines Gewebes oder Organs eingeführt werden, die auf dem Gebiet als zu diesem Zweck geeignet bekannt ist. Nach dem Einführen des rekombinanten DNA-Moleküls in die Zellen des Gewebes oder des Organs kann das Gewebe oder das Organ in den Patienten mit einem Bedarf an einem solchen Transplantat transplantiert werden.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung, die ein rekombinantes DNA-Molekül enthält, das ein Expressionsvektor ist und das die IR1B1 oder IR1B4 cDNA funktionell verbunden mit einem Promotor in Sense-Orientierung enthält, kann direkt in Tumore injiziert werden, z.B. in Hirntumore und metastatische Tumorknoten, um die Zellen innerhalb dieser Tumore empfindlicher für ein Ansprechen auf eine exogene IFN-Therapie als Behandlung für Krebs zu machen. Die verstärkte zelluläre Antwort auf eine exogene IFN-Therapie würde zu einer Inhibition des malignen Zellwachstums führen.
Der in vivo oder ex vivo Gentransfer ist gut dokumentiert, d.h. in Annals of the New York Academy of Sciences: Gene Therapy for Neoplastic Diseases, Vol. 716, 1994; siehe z.B. "Direct Gene Transfer for the Understanding and Treatment of Human Disease" von G.E. Plautz auf den Seiten 144–153, und "Mechanisms of Action of the p53 Tumor suppressor and Prospects for Cancer Gene Therapy by Reconstitution of p53 Function" von Roemer et al., auf den Seiten 265–282. Verfahren zum Insertieren rekombinanter DNA-Moleküle in die Zellen eines zu transplantierenden Gewebes oder Organs oder eines Tumors schließen Vektoren des Adenovirus, des Retrovirus, des Adenovirus-assoziierten Virus (AAV), ebenso wie die direkte DNA-Injektion oder die Oligonukleotid-Liposomeninjektion ein. Klinische Studien, in denen retrovirale Vektoren in Hirntumore injiziert werden oder in denen ein Adenovirus verwendet wird, um die Zellen des oberen respiratorischen Traktes eines Patienten mit cystischer Fibrose zu infizieren, sind wohlbekannt.
Es ist beabsichtigt, dass pharmazeutische Zusammensetzungen, die das rekombinante DNA-Molekül, das für die IR1B1 oder IR1B4 cDNA kodiert oder ein Fragment davon umfassen, entweder in der Sense- oder Antisense-Orientierung in Bezug auf einen funktionell verbundenen Promotor, sämtliche Zusammensetzungen umfassen, in denen das rekombinante DNA-Molekül in einer Menge enthaften ist, die zum Erreichen des beabsichtigten Zweckes wirksam ist. Darüber hinaus können die pharmazeutischen Zusammensetzungen geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger oder Arzneimittelträger enthalten, die das rekombinante DNA-Molekül stabilisieren oder dessen Verabreichung erleichtern.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist auf Moleküle gerichtet, die den Antigen-bindenden Teil eines Antikörpers enthalten, der spezifisch für die IFNAR1 bindenden Protein IR1B1 oder IR1B4 sind, oder Fragmente davon, zur Verwendung in diagnostischen Verfahren, wie z.B. Immunnachweisverfahren, um die Konzentrationen der IR1B1- oder IR1B4-Proteine in Tumorgeweben zu überprüfen, die aus Biopsien erhalten wurden, oder zur Verwendung bei der Reinigung des Proteins durch Affinitätschromatografie.
Der Begriff "Antikörper" soll polyklonale Antikörper, monoklonale Antikörper (mAbs), chimere Antikörper, anti-idiotypische (anti-Id) Antikörper, Einzelkettenantikörper und rekombinant hergestellte humanisierte Antikörper enthaften, ebenso wie aktive Fraktionen davon, die mit Hilfe jeglicher bekannter Methoden bereitgestellt wurden, wie z.B. der enzymatischen Spaltung, der Peptidsynthese oder rekombinanter Methoden, ohne auf diese beschränkt zu sein.
Polyklonale Antikörper sind heterogene Populationen von Antikörpermolekülen, die aus den Seren von Tieren stammen, die mit einem Antigen immunisiert wurden. Ein monoklonaler Antikörper enthält eine im Wesentlichen homogene Population von Antikörpern, die spezifisch für Antigene sind, wobei die Population im Wesentlichen ähnliche Epitop-Bindungsstellen enthält. Mabs können mit Hilfe von Verfahren erhalten werden, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind. Siehe z.B. Kohler und Milstein, Nature 256–497 (1975); US-Patent Nr. 4,376,110; Ausubel et al., Editoren, siehe oben, Harlow und Lane ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL Cold Spring Harbor Laboratory (1988); und Colligan et al., Editoren, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Greene Publishing Assoc. and Wiley Interscience, N.Y., (1992, 1993), wobei die Inhalte dieser Referenzen hierin vollständig durch Referenz eingeschlossen sind. Solche Antikörper können aus jeder Immunglobulinklasse, einschließlich IgG, IgM, IgE, IgA, GILD und irgendeiner Unterklasse davon stammen. Ein Hybridom, das ein Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung produziert, kann in vitro, in situ oder in vivo kultiviert werden. Die Herstellung hoher Titer der mAbs in vivo oder in situ macht dies zum derzeitig bevorzugten Herstellungsverfahren.
Chimere Antikörper sind Moleküle mit verschiedenen Teilen, die aus verschiedenen Tierspezies stammen, wie z.B. solche, die eine variable Region aufweisen, die von einem murinen mAb stammen und eine humane Immunglobulin konstante Region. Chimere Antikörper werden in erster Linie verwendet, um die Immunogenität bei der Anwendung zu reduzieren und die Ausbeuten bei der Herstellung zu erhöhen, so werden z.B. human-murine Chimere mAbs verwendet, wenn murine mAbs höhere Ausbeuten aus Hybridomen aufweisen, jedoch eine höhere Immunogenität in Menschen aufweisen. Chimere Antikörper und Verfahren zu ihrer Herstellung sind auf dem Gebiet bekannt (Cabilly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3273–3277 (1984); Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:68516855 (1984); Boulianne et al., Nature 312:64346 (1984); Cabilly et al., europäische Patentanmeldung 125023 (veröffentlicht am 14. November 1984); Neuberger et al., Nature 314:268–270 (1985); Taniguchi et al., europäische Patentanmeldung 171496 (veröffentlicht am 19. Februar 1985); Morrison et al., europäische Patentanmeldung 173494 (veröffentlicht am 5. März 1986); Neuberger et al., PCT-Anmeldung WO 8601533, (veröffentlicht am 13. März 1986); Kudo et al., europäische Patentanmeldung 184187 (veröffentlicht am 11. Juni 1986); Morrison et al., europäische Patentanmeldung 173494 (veröffentlicht am 5. März 1986); Sahagan et al., J. Immunol. 137:1066–1074 (1986); Robinson et al., internationale Patentveröffentlichung, WO 9702671 (veröffentlicht am 7. Mai 1987); Liu et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:3439-3443 (1987); Sun et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:214–218 (1987); Better et al., Science 240:1041–1043 (1988); und Harlow und Lane, ANTIBODIES: A LABORATORY MANUAL, siehe oben.
Ein anti-idiotypischer (anti-Id) Antikörper ist ein Antikörper, der einzigartige Determinanten erkennt, die im Allgemeinen mit der Antigenbindungsstelle eines Antikörpers assoziiert sind. Ein Id-Antikörper kann durch Immunisieren eines Tieres derselben Spezies und desselben genetischen Typs (z.B. einem Mausstamm) wie die Quelle des mAb mit dem Antikörper, gegen den ein anti-Id hergestellt wird, hergestellt werden. Das immunisierte Tier wird die idiotypischen Determinanten des immunisierenden Antikörpers erkennen und auf diese idiotypischen Determinanten durch Produzieren eines Antikörpers gegen diese idiotypischen Determinanten (den anti-Id Antikörper) antworten. Siehe z.B. US-Patent Nr. 4,699,880.
Der anti-Id Antikörper kann außerdem als "Immunogen" verwendet werden, um eine Immunantwort in noch einem weiteren Tier zu induzieren, was zur Erzeugung eines sogenannten anti-anti-Id Antikörpers führt. Der anti-anti-Id kann epitopisch identisch mit dem ursprünglichen mAb sein, der den anti-Id induzierte. Folglich ist es durch Verwendung von Antikörpern für die idiotypischen Determinanten eines mAbs möglich, weitere Klone zu identifizieren, die Antikörper mit der gleichen Spezifität exprimieren.
Es sollte selbstverständlich sein, dass Antikörper gemäß der vorliegenden Erfindung intakte Antikörper sein können, wie z.B. monoklonale Antikörper, dass es jedoch die epitope Bindungsstelle des Antikörpers ist, welche die gewünschte Funktion zur Verfügung stellt. Folglich können neben dem intakten Antikörper proteolytische Fragmente davon, wie z.B. die Fab oder F(ab')₂-Fragmente verwendet werden. Fab und F(ab')₂-Fragmenten fehlt das Fc-Fragment des intakten Antikörpers, sie werden rascher aus dem Blutkreislauf eliminiert und sie können eine geringere nicht-spezifische Bindung an Gewebe haben als ein intakter Antikörper (Wahl et al., J. Nucl. Med. 24:316–325 (1983)). Solche Fragmente werden typischerweise durch proteolytische Spaltung hergestellt, unter Verwendung von Enzymen wie z.B. Papain (um Fab-Fragmente herzustellen) oder Pepsin (um F(ab')₂-Fragmente herzustellen).
Darüber hinaus kann die für die variable Region des Antikörpers kodierende DNA in andere Antikörper insertiert werden, um chimere Antikörper herzustellen (siehe z.B. US-Patent 4,816,567) oder in T-Zell-Rezeptoren, um T-Zellen mit derselben Breitenspezifität herzustellen (siehe Eshhar, Z. et al., Bi: J. Cancer Suppl., 10:27-9, 1990; Gross, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:10024-8, 1989). Einzelkettenantikörper können ebenfalls hergestellt und verwendet werden. Einzelkettenantikörper können einzelkettige zu sammengesetzte Polypeptide sein, die Antigen-bindende Eigenschaften aufweisen und ein Paar Aminosäuresequenzen umfassen, die homolog oder analog zu den variablen Regionen einer Immunglobulin leichten und schweren Kette sind (V_H-V_L verbunden oder Einzelketten F_V). Sowohl V_H als auch V_L können natürliche monoklonale Antikörpersequenzen kopieren oder eine oder beide Ketten können ein CDR-FR-Konstnakt derart umfassen, wie es in US-Patent 5,091,513 beschrieben ist. Die getrennten Polypeptide, die analog zu den variablen Regionen der leichten und schweren Ketten sind, werden durch einen Polypeptidlinker zusammengehalten. Verfahren zur Herstellung solcher Einzelkettenantikörper, insbesondere solche, in denen die für die Polypeptidstrukturen der V_H und V_L-Ketten kodierenden DNA bekannt sind, können in Übereinstimmung mit den z.B. in den US-Patenten 4,946,778, 5,091,513 und 5,096,815 beschriebenen Verfahren erhalten werden.
Folglich soll die Bezeichnung "ein Molekül, das den Antigen-bindenden Teil eines Antikörpers umfasst" nicht nur intakte Immunglobulinmoleküle eines jeglichen Isotyps. die mit Hilfe einer tierischen Zelllinie oder einem Mikroorganismus erzeugt wurden, umfassen, sondern außerdem die reaktive Fraktion davon, einschließlich des Fab-Fragmentes, des Fab'-Fragmentes, des F(ab')₂-Fragmentes, der variablen Region der schweren und/oder leichten Ketten davon und chimerer oder Einzelkettenantikörper, die solche reaktiven Fraktionen enthalten, ebenso wie jegliche andere Molekülarten oder Zellarten, in die eine derartige Antikörper reaktive Fraktion physisch insertiert wurde, wie z.B. einen chimeren T-Zell-Rezeptor oder eine T-Zelle, die einen solchen Rezeptor aufweist oder Moleküle, die entwickelt wurden, um therapeutische Komponenten mittels eines Teils des Moleküls, das eine derartige reaktive Fraktion enthält, zu verabreichen, ohne jedoch auf diese beschränkt zu sein.
Nachdem die Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, wird dieselbe noch einfacher durch Verweis auf die folgenden Beispiele verstanden werden, die im Wege der Veranschaulichung zur Verfügung gestellt werden und nicht als die vorliegende Erfindung beschränkend gedacht sind.
Beispiel 1: Zwei humane Proteine, IR1B1 und IR1B4, binden an den IFN-Rezeptor
Ein cDNA-Fragment, das für die gesamte IFNAR1-IC Domäne kodiert, das mit Hilfe einer PCR unter Verwendung eines BamH1 Sense-Primers (5'ctgaggatccAAAGTCTTCTTGAGATGCATC (SEQ ID NR: 5)) und eines EcoRI Antisense-Primers (5'tgacgaattcctaTCATACAAAGTC (SEQ ID NR: 6)) amplifiziert wurde, wurde in einem BlueScript Vektor (BS-SK⁺, Stratagene) kloniert. Das BamHI-SalI Fragment aus diesen BS-IFNAR1-IC wurde in den pGBT₁₀ Vektor (CloneTech) eingeführt und im Leserahmen nach der Gal4 DNA-Bindungsdomäne (pGBT₁₀-IFNAR1-IC) für das Two-Hybrid-Screening eingefügt. Das Verfahren des Two-Hybrid-Screenings (Fields und Song, 1989) wurde mit Hilfe des modifizierten Verfahrens nach Durfee et al (1993) unter Verwendung der pACT Plasmid cDNA-Bibliothek aus mit einem humanen Epstein-Ban--Virus (EBV) transformierten B-Lymphocyten durchgeführt, um den Hefe-Reporterstamm Y153 mit pGBT₁₀-IFNAR1-IC cozutransformieren. Der Hefestamm Y153 hat zwei Reportergene unter der Kontrolle der GAL1 Upstream Activating Sequences (UAS), die nur transkribiert werden, wenn die Aktivität des Gal4 Transkriptionsfaktors wieder hergestellt wird. Dies erfordert, dass das Fusionsprotein, das durch das pACT Plasmid kodiert wird, das in diesen bestimmten Hefeklon eingeführt wurde, eine Affinität für die IFNAR1-IC Domäne des pGBT₁₀ Plasmids aufweist. Eines der Reportergene ist GAL1 His3, das das Wachstum in einem Medium erlaubt, in dem Histidin fehlt; das andere Reportergen ist GAL-LacZ, welches die β-Galactosidaseaktivität bereitstellt. Darüber hinaus weisen die pACT Plasmide das Leu2-Gen auf, und das pGBT₁₀ Plasmid weist das TRP1-Gen auf, was das Wachstum in einem Medium erlaubt, in dem Leucin bzw. Tryptophan fehlt. Die Kolonien wurden in synthetischem Medium SC ohne Trp, Leu, His, in der Gegenwart von 25 mM 3-Aminotriazol (das weiterhin nach Histidinprototrophie selektiert). Die wachsenden Kolonien wurden anschließend unter Verwendung des X-gal-Filterassays (Breeden und Naysmith, 1985) auf β-Galactosidaseaktivität getestet.
Neun positive Hefeklone wurden erhalten, und ihre pACT Plasmide wurden durch Transfektion in E. coli HB101 und Selektion nach leu⁺-Transformanten gewonnen. Für jede Hefe-DNA wurden zwei dieser E. coli HB101 Klone isoliert. Die teilweise DNA-Sequenzierung der pACT Plasmide aus diesen E. coli Klonen zeigte, dass sie zwei Gruppen von cDNA-Sequenzen zuzuordnen waren, die IR1B1 und IR1B4 genannt wurden. Die pACT Plasmide der IR1B1- und IR1B4-Gruppen wurden Spezifitätstests durch Cotransformation des SFY526 Hefe-Reporterstammes (Bartel et al., 1993) mit pAS Plasmiden, die Lamin, cdk2 und p53 oder andere Kontrollinserts enthielten (CloneTech), unterzogen. Kolonien, die in SC -trp, -leu wuchsen, wurden auf ihre β-Galactosidaseexpression getestet. Von den spezifisch positiven pACT Plasmiden wurden Inserts mit XhoI ausgeschnitten, in BS-KS (Stratagene) kloniert und einer Sequenzierung von den T7- und T3- Promotoren aus unter Verwendung des DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kits in einem 373A DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems) unterzogen.
1 zeigt die Ergebnisse für den pACT Klon IR1B1, der mit verschiedenen pAS- oder pGBT₁₀-Plasmid-Beuten in die Hefe SFY526 cotransfiziert wurde. Hefezellen wuchsen in dem selektiven SC-Medium -trp, -leu in den Spuren 1 bis 9 auf dem Filter. Die Färbung durch das X-Gal-Reagenz (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid) war nur in den Spuren 2 und 4 positiv. Wie in 1 angegeben, ist Spur 4 eine Kontrollhefe mit einem aktiven lacZ-Gen. Spur 2 ist die Kombination von IR1B1 und IFNAR1-IC Fusionsproteinen. IR1B1 allein (Spur 9) oder irgendeine andere Kombination außer IR1B1 und IFNAR1-IC zeigte keine β-Galactosidaseaktivität. Daher ist IR1B1 spezifisch in der Lage, mit der IC-Domäne der IFNAR1 IFN-Rezeptorkette zu kombinieren.
In ähnlicher Weise zeigt 2 die Ergebnisse für den pACT-Klon IR1B4, der mit verschiedenen pAS- oder pGBT₁₀-Plasmid-Beuten in die Hefe SFY526 cotransfiziert wurde. Hefezellen wuchsen in SC-Medium -trp, -leu in den Spuren 1 bis 8 des Filters, und die Färbung mit X-Gal-Reagenz war nur in den Spuren 3 und 7 positiv. Wie in dem unteren umrandeten Teil der 2 angegeben, ist Spur 7 eine Kontrollhefe mit einem aktiven lacZ-Gen. Spur 3 ist die Kombination von IR1B4 und IFNAR1-IC Fusionsproteinen. Wie die Ergebnisse, die mit IR1B1 erhalten wurden, zeigte IR1B4 allein (Spur1) oder irgendeine andere Kombination außer IR1B4 und IFNAR1-IC keine β-Galactosidaseaktivität. Daher ist IR1B4 also spezifisch in der Lage, mit der IC-Domäne der IFNAR1 IFN-Rezeptorkette zu kombinieren.
Beispiel 2: Die IR1B1 Proteinsequenz zeigt Calcium-bindende EF-Hand-Stellen
Das cDNA-Insert der pACT-IR1B1 Plasmide wurde mit dem Restriktionsenzym XhoI ausgeschnitten, in einen Bluescript BS-KS Vektor kloniert und einer Sequenzierung von den T7- und T3-Promotoren aus unter Verwendung des DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kits in einem 373A DNA-Sequenzierer (Applied Biosystems) unterzogen. Das längste Plasmid hat eine Sequenz mit 830 Nukleotiden (3), gefolgt von der Gal4-Aktivierungsdomäne und der Linkersequenz des pACT Plasmids, und ein offener Leserahmen mit 191 Aminosäuren wurde dann festgestellt (3). Eine Online-Recherche der Proteindatenbanken wurde unter Verwendung des BlastP-Algorithmus (Altschul et al., 1990) ebenso wie des Bioaccelerator Alignments (Henikoff und Henikoff, 1992) durchgeführt. Die höchsten Treffer wurden für Caltractin erhalten (CATR HUMAN, Zugang Swiss Protein SW New P41208), mit 62,1 % Ähnlichkeit und 32,4 % Identität der Aminosäuren 52 bis 173, sowie für Calcineurin B (CALB NAEGR, Zugang Swiss Protein P42322; CALB HUMAN, Zugang P06705), mit 59,8 % Ähnlichkeit und 32,5 % Identität der Aminosäuren 50 bis 171.
4 zeigt das Alignment von IR1B1 mit humanem Calcineurin B (CALB) und Caltractin (CATR). Die Domänen der Calciumbindung und der Helix-Loop-Helix EF-Hand sind in fettgedruckten und unterstrichenen Buchstaben gezeigt. IR1B1 hat zwei EF-Hand-Stellen, jedoch sind die ersten beiden EF-Hand-Domänen nicht konserviert. IR1B1 weist eine Homologie sowohl zu Calcineurin B (dargestellt als vertikale Linien in 4) als auch zu Caltractin (dargestellt als Säulen in 4) auf. Jedoch ist IR1B1 klar ein neues und anderes humanes Protein, das zuvor nicht identifiziert wurde.
Beispiel 3: IR1B1 ist ein IFN-induziertes Genprodukt
Humane U266S Myelomzellen (etwa 3 × 10⁶ Zellen in 5 ml Suspensionskulturen) wurden mit rekombinantem IFN-α8 (2 × 10⁶ IU/mg aus Bakterien) oder mit rekombinantem IFN-β (3 × 10⁸ IU/mg aus CHO-Zellen) mit 750 IU/ml für 2 Stunden oder 18 Stunden behandelt. Nach der Behandlung mit IFN wurden die Zellen gesammelt und mit Tri-Reagenz (Molecular Research Center, Cincinnati, Ohio) extrahiert, das ein Produkt ist, das Guanidinthiocyanat und Phenol enthält. Die extrahierte RNA wurde mit Ethanol präzipitiert, mit Formaldehyd denaturiert und mit Hilfe der Elektrophorese in Formaldehyd-Agarosegelen (10 μg RNA/Tasche) analysiert und auf GeneScreen Plus (Dupont, New England Nuclear, Billerica, MA) geblottet. Der Northern Blot wurde mit 10⁶ cpm IR1B1 cDNA, die mit Hilfe des Rediprime Kits (Amersham, UK) unter Verwendung von ³²P-dCTP und Zufallspriming markiert wurde, zur Reaktion gebracht.
5 zeigt, dass die IR1B1 cDNA mit einer 1,1 kb RNA hybridisierte. Die Menge der IR1B1 mRNA war 2 Stunden nach der Behandlung der U266S mit IFN-β merklich erhöht. Jedoch war die IR1B1 mRNA 18 Stunden nach der IFN-Behandlung aus den Zellen verschwunden, was darauf hindeutet, dass die Induktion sowohl schnell als auch transient erfolgt. Viele IFN-induzierte mRNAs sammeln sich über einen Zeitraum von 24 Stunden nach der IFN-Behandlung weiter in den Zellen an (Revel und Chebath, 1986).
Es wurde bestätigt, dass dieselbe Menge RNA in jeder Spur vorhanden war. Wie in dem unteren Teil der 5 gezeigt, ergab die Hybridisierung derselben U266S RNA (reich an IFN-Rezeptor) mit einer 18S ribosomalen cDNA-Sonde dieselbe Menge 18S rRNA in jeder Spur (nur der Teil des Blots, wo die 18S rRNA läuft, wird gezeigt). In einem weiteren Experiment unter Verwendung von 1200 U/ml IFN zur Induktion wurde IR1B1 mRNA mit IFN-α8 außerdem nach 2 Stunden beobachtet, jedoch nicht nach 30 Minuten (nicht gezeigt).
Es wurde festgestellt, dass die IR1B1 mRNA dieselbe 1,1 kb Größe in verschiedenen humanen Zellen aufweist (U266-Zellen, Daudi-Zellen und THP-1-Zellen). Es ist bemerkenswert, dass diese Größe der Größe der Caltractin mRNA ähnelt, jedoch nicht der der Calcineurin B mRNA (2,5 kb). Die geringe Größe der mRNA ist in Übereinstimmung damit, dass IR1B1 ein kleines Protein von etwa 20 kDa ist.
Beispiel 4: IR1B4 Protein bindet in vitro an IFNAR1
Die Bindung von IR1B4 an die IC-Domäne von IFNAR1 wurde durch Synthetisieren des IR1B4 Proteins mit einer Proteinmarkierung (Flag-Sequenz) unter Verwendung der in vitro Translation in Retikulozyten-Lysaten und Reaktion dieses Proteins mit einem rekombinanten IFNAR1-IC Fusionsprotein in E. coli überprüft. Die pACT-IR1B4 DNA aus Beispiel 1, geschnitten mit XhoI und aufgefüllt mit Hilfe des Klenow-Enzyms, wurde in den PECE-Flag Expressionsvektor kloniert (Ellis et al., 1986), der mit EcoRI geschnitten und aufgefüllt wurde. Das NotI-BamHI-Fragment, das die Flag-IR1B4-Fusion im Leseraster enthielt, wurde in BS-SK rekloniert, der mit NotI-BamHI geschnitten wurde und zwar stromabwärts der T3-Promotoren. Die Sequenz der Flag-Fusion wurde durch Sequenzieren von dem T3-Promotor aus überprüft. Die in vitro Transkription (Promega Kit) wurde mit Hilfe der T3-Polymerase und 1 μg der mit BamHI linearisierten BS-Flag-IR1B4 DNA durchgeführt. Die in vitro Translation wurde in Retikulozyten-Lysaten des Kaninchens (Promega Kit) mit [³⁵S]Methionin (Amersham) und 5 μg der RNA-Transkripte für 1 Stunde bei 30°C durchgeführt. Die Produkte wurden vor der Verwendung mit RNase behandelt. Das GST-IFNAR1-IC-Fusionsprotein wurde durch Klonieren des BamHI-EcoRI Inserts des BS-IFNAR1-IC (siehe oben) in dieselbe Schnittstelle von pGEX2 (Pharmacia Biotech) hergestellt. GST und GST-IFNAR1-IC wurden in E. coli exprimiert und gebunden an Glutathion-Agarosekügelchen (Sigma) gewonnen.
Anti-Flag M2 Agarosekügelchen stammten von Kodak Scientific Imaging Systems. Die monoklonalen Antikörper IFNaR3 gegen die α-Komponente des IFN-Rezeptors (IF-NAR1) waren ein nettes Geschenk des Dr. O. Colamonici (Colamonici et al., 1990) und wurden mit einer 1:100-Verdünnung verwendet. Die Kaninchen-Antikörper gegen das C-terminale Peptid des IFNAR1-IC (Ab 631) wurden hergestellt und zur Immunpräzipitation von IFNAR1 aus Brij-Extrakten (0,75 ml) von 2 × 10⁷ humanen U266S- und U266R Myelomzellen mit zuvor beschriebenen Antiproteasen verwendet (Ambrovich et al., 1994), außer dass die Protein G-Kügelchen (Pharmacia) mit mAb IFNaR3 SDS-PAGE verwendet wurden und die Analyse in einem Fujix BAS 1000 Phosphor-Imager wie zuvor beschrieben durchgeführt wurde (Harroch et al., 1994).
Es wurde zunächst verifiziert, dass ein Proteinprodukt mit etwa 32 kDa erhalten wird, wenn die Translationsprodukte mit Hilfe von anti-Flag Antikörpern immunpräzipitiert wurden (6A und 6B). Jedes Mal, wenn die Verwendung von anti-Plag Antikörpern in den 6A und 6B angegeben wird (durch +-Zeichen) bedeutet dies, dass das radioaktive Translationsprodukt der IR1B4-Flag Fusions-mRNA (in vitro transkribiert von dem entsprechenden DNA-Konstrukt) mit einem anti-Flag M2-Antikörper zur Reaktion gebracht und an Agarosekügelchen (ein Produkt der Kodak Scientific Imaging Systems) gebunden war. Das translatierte Produkt, das IR1B4 fusioniert an die Flag-Aminosäuresequenz enthält, wurde an diese anti-Flag Antikörperkügelchen gebunden, und nach dem Abzentrifugieren der Kügelchen wurde das Protein mit SDS-Puffer eluiert und auf eine SDS-PAGE geladen. Diese Reaktionen dienen als Kontrolle, um nachzuweisen, dass das erwartete fusionierte Protein vorhanden ist.
Kügelchen aus Glutathion-Sepharose (Sigma), an welche die Glutathion S-Transferase (GST) fusioniert mit IFNAR1-IC gebunden war, wurden zu der Retikulozyten-Lysat-Translationsreaktion dazugegeben. Die Kügelchen wurden zentrifugiert und gewaschen, und die an die GST-Kügelchen gebundenen Proteine wurden mit Hilfe von Natriumdodecylsulfat (SDS 1 %) freigesetzt und mit Hilfe der SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (PAGE) analysiert. Es wurde beobachtet, dass das 32 kDa Protein, das mit ³⁵S-Methionin markiert war, an GST-IFNAR1-IC gebunden war, jedoch nicht an GST allein (6A). Dies zeigt, dass IR1B4 direkt an die isolierte IFNAR1-IC-Peptidregion bindet.
Um zu verifizieren, dass IR1B4 mit dem IFNAR1 Protein interagiert, wie es in den humanen Zellmembranen vorhanden ist, wurden Detergens-Extrakte humaner U266 Myelom zellen mit den mit ³⁵S-Methionin markierten Translationsprodukten der IR1B4 mRNA aus Retikulozyten-Lysaten gemischt. Das IFNAR1 Protein wurde mit Hilfe eines monoklona-len Antikörpers IFNaR3, der spezifisch für die Ektodomäne des IFNAR1 ist (von Colamonici et al., 1990), immunpräzipitiert. Die Analyse mit Hilfe der SDS-PAGE zeigt das Vorhandensein der 32 kDa IR1B4-Flag-Bande (6B), wenn die Detergensextrakte aus U266S Zellen stammten (die reich an IFN-Rezeptor sind), jedoch nicht wenn sie aus U266R-Zellen stammten – einer mutierten IFN-α,β-resistenten derivatisierten Zelllinie von U266 Zellen, welcher die IFN-Rezeptoren fehlen (Abramovich et al., 1994). Die 32 kDa Bande wurde in ähnlicher Weise beobachtet, wenn U266S-Extrakte mit Ab 631 gegen das C-terminale Peptid von IFNAR1 zur Reaktion gebracht wurden, und IFNAR1 wurde mit Hilfe des anti-Flag präzipitiert, wenn Cos-7 Zellen durch flg-IR1B4 und humane IFNAR1 cDNAs transfiziert wurden. Diese Ergebnisse zeigten, dass IR1B4 an intaktes IFNAR1 aus humanen Zellen auf spezifische Weise bindet.
Beispiel 5: IR1B4 cDNA- und Proteinsequenzen
Die Nukleotidsequenz der IR1B4 cDNA weist einen offenen Leserahmen auf, der für ein 361 Aminosäure langes Protein kodiert (7). Diese humane cDNA erkannte eine 1,5 kb lange, konstitutiv exprimierte Poly-A⁺ mRNA in verschiedenen humanen Zellen, einschließlich der U266 Myelomzellen. Eine Online-Recherche der Proteindatenbanken wurde unter Verwendung des BlastP Algorithmus (Altschul et al., 1990) ebenso wie des Bioaccelerator Alignments (Henikoff und Henikoff, 1992) durchgeführt, und es wurde festgestellt, dass IR1B4 ein einzigartiges Mitglied der Protein-Arginin-Methyltransferasefamilie ist. Die PRMT1 cDNA der Ratte, die von Lin et al., beschrieben wurde (1996, Genbanksequenz I.D. 1390024; Zugang U60882) ist nur zu 81,4 % homolog, wenn sie mit Hilfe des ALIGN Computerprogramms analysiert wird. Auf der Aminosäureebene (8) unterscheidet sich das humane IR1B4/PRMT in seinem Aminoterminus klar von PRMT1, wobei die ersten 19 Aminosäuren vollständig unterschiedlich sind. Die N-terminale Sequenzierung von IR1B4 allein hätte keinerlei Hinweis zur Verfügung gestellt, dass IR1B4 homolog zu PRMT1 ist. Von einem weiteren humanen Protein, das beschrieben wurde, HCP-1 (Nikawa et al., 1996; Genbank Zugang D66904), wurde ebenfalls festgestellt, dass es eine Homologie zu IR1B4 aufweist. Jedoch weist HCP-1 von den Resten 147–175 eine unterschiedliche Aminosäuresequenz auf (9). HCP-1 wurde ursprünglich auf Grundlage seiner Fähigkeit, die ire15 Mutation in Hefe zu kom plementieren, identifiziert, und seine enzymatische Funktion war zuvor nicht identifiziert (Nikawa et al., 1996). Daher ist IR1B4 ein neues humanes Protein.
Beispiel 6: An IFNAR1-IC gebundenes IR1B4 Protein hat Methyltransferaseaktivität
Die Methyltransferaseaktivität konnte mit Hilfe des IFNAR1-Rezeptors aus humanen Zellextrakten coimmunpräzipitiert werden. Brij-Detergens-Extrakte aus U266S Zellen wurden über Nacht bei 4°C mit oder ohne den anti-IFNAR1 Antikörper Ab 631 zur Reaktion gebracht (Abramovich et al., 1994). Protein A-Kügelchen (40 μl eines 50 % IPA-400 Fast Flow, Repligen) wurden für 1 Stunde dazugegeben. Die Kügelchen wurden gewaschen und in 0,1 ml 25 mM Tris-HCl, pH 7,5,1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 50 μM (0,25 μCi) ¹⁴C-(Methyl)-S-adenosylmethionin (Amersham) und 100 μg Histone (Type IIA aus dem Kälberthymus, Sigma) für 30 min bei 30°C inkubiert. Die in vitro Methylierung der Histone wurde unter den von Lin et al. (1996) beschriebenen Bedingungen durchgeführt. Die Radioaktivität in der Histonbande wurde nach der SDS-PAGE (15 % Acrylamid) und der Exposition in dem Phosphorimager analysiert. Eine Markierung der Histone mit¹⁴C-Methyl wurde mit den Kügelchen beobachtet, die mit anti-IFNAR1 beschichtet waren, nicht jedoch mit solchen in der Kontrollreaktion (10). Daher ist die Methyltransferaseaktivität des Proteins konstitutiv mit der IFN-Rezeptorkette dieser humanen Zellen assoziiert. Eine ähnliche Enzymaktivität wurde festgestellt, wenn IFNAR1 5 Minuten nach Zugabe von IFN-β zu den U266S Zellen immunpräzipitiert wurde.
Beispiel 7: Beteiligung des IR1B4/PRMT1 an der IFN-Wirkung
Ein Antisense-Oligodeoxynukleotid-Phosphorthioat (Stein et al., 1989), das komplementär zu der Sequenz der Nukleotide 12–33 um das Initiationscodon der IR1B4 cDNA herum ist (AS-1, Antisense-Sequenz 5'-GGCTACAAAATTCTCCATGATG-3'; SEQ ID NR: 12) wurde chemisch synthetisiert. Die Oligonukleotide wurden zu U266S Zellen, die in 96-Welt Mikroplatten (8000 Zellen/Vertiefung/0,2 ml RPMI, 10 % FCS) ausgesät waren, mit einer Endkonzentration von 10 μM am Tag 0 dazugegeben, und erneut mit 5 μM am Tag 2. IFN-β wurde mit 64 oder 125 IU/ml am Tag 0 dazugegeben. Nach 3 Tagen der Kultivierung wurden 20 μl Alamar Blau, ein kolorimetrischer Zelldichteindikator auf Grundlage der Oxido-Reduktion (BioSource, Camarillo, CA), zu jeder Vertiefung dazugegeben, und die Inkubation wurde für 6–7 Stunden fortgesetzt. Die Färbung wurde in einem Mikroplatten-ELISA-Lesegerät (Testfilter 530 nm, Referenzfilter 630 nm) mit mehr fachem Auslesen der Duplikatvertiefungen gemessen. Die Korrelation der Wachstumskurven wurde mit Hilfe der Lebendzellzahlen und der OD überprüft. Um die Methyltransferase zu messen, wurden Zellen aus vereinigten Vertiefungen durch Frieren und Wiederauftauen in 25 μl/Vertiefung 25 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 40 μg/ml Leupeptin und Aprotinin, 20 μg/ml Pepstatin, 1 μM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) lysiert. Die Reaktionen wurden in 50 μl mit 25 μl der Zellextrakte, 100 μM Peptid R1 (Najbauer et al., 1993; erhalten von Genosys, Cambridge, UK), 3 μCi [³H] (Methyl)Sadenosylmethionin (Amersham, 73 Ci/mmol) für 30 min bei 30°C durchgeführt. Nach der Elektrophorese in einem SDS-Polyacrylamid (16 %) Gel, der Fixierung in 50 % Methanol, 10 % Essigsäure und der Behandludng mit Amplify^® (Amersham), wurde die Autoradiografie für 8 Tage durchgeführt. Diese AS-1 Antisense-DNA war in der Lage, die Protein-Arginin-Methyltransferaseaktivität in U266S Zellen stark zu verringern, wie durch Inkorporation tritiummarkierter Methylgruppen in das R1-Peptidsubstrat gemessen wurde (11), und wurde verwendet, um die Rolle, die dieses Enzym bei der IFN-Wirkung spielen könnte, zu untersuchen. Die wachstumsinhibitorische Aktivität von IFN wurde ausgewählt, da sie am direktesten in Zellen quantifiziert werden kann, und weil eine Interaktion des PRMT1 der Ratte mit wachstumsbezogenen Genprodukten beobachtet worden ist (Lin et al., 1996). Die Zugabe des Antisense-1 Oligonukleotids AS-1, das komplementär zu der Sequenz um das Initiationscodon der IR1B4/PRMT cDNA herum ist, verringerte die wachstumsinhibitorische Wirkung des IFN-β auf humane U266S Myelomzellen (12). Dies bedeutet, dass die mit IFN behandelten Zellen in der Gegenwart des Antisense AS-1 ein höheres Wachstum zeigten (was eine toxische Wirkung der Phosphorthioate ausschließt). Das Wachstum in der Abwesenheit von IFN war nicht signifikant beeinflusst. Das Sense-Oligonukleotid S-3, das derselben cDNA-Region entspricht, hatte nur eine geringe Wirkung (S-3, 12) im Vergleich zu Antisense-1. Sense S-3 hatte außerdem nur einen geringen inhibitorischen Effekt auf den Grad der Enzymaktivität (11). Ein weiteres Antisense-Phosphorthioatoligonukleotid AS-2 (SEQ ID NR: 13), das gegen die Mitte der cDNA gerichtet war und komplementär zu den Nukleotiden 572–592 der SEQ ID NR: 7 war, hatte fast keine Wirkung (12). Die bis zu 5-fache Verringerung in der wachstumsinhibitorischen Wirkung von IFN-β auf Myelomzellen, die mit Hilfe des Antisense-1 Oligonukleotids teilweise defizient in der PRMT-Aktivität gemacht wurden, zeigt, dass die Assoziation des IR1B4/PRMT-Enzyms mit der IC-Domäne des IFNAR1-Rezeptors für die IFN-Wirkung auf Zellen funktionell signifikant ist.
Diese Experimente zeigen außerdem, dass das IR1B4 Protein Peptidsubstrate der PRMT-Klasse von Enzymen methyliert, wie z.B. das R1-Peptid Gly-Gly-Phe-Gly-Gly-Arg-Gly-Gly-Phe-Gly (SEQ ID NR: 11; Najbauer et al., 1993), das in dem Experiment verwendet wurde, das in 11 dargestellt wird. Die Methylierung von Proteinen an Argininresten, die sich neben Glycinresten befinden (z.B. wie in dem oben genannten Peptid) könnte eine Art der Proteinmodifikation sein, die ebenso wie die Phosphorylierung dazu dient, Signale in die Zelle zu transduzieren. Die hnRNP-Gruppe von Proteinen ist ein Ziel von PRMT-Enzymen, und da diese Proteine die mRNA-Prozessierung, das Splicen, den Transport und die Stabilität beeinflussen (Liu und Dreyfuss, 1995), könnte ihre Methylierung eine Rolle bei den posttranskriptionellen Kontrollen der Genexpression spielen. Das IR1B4/PRMT Protein, von dem hier entdeckt wurde, dass es an eine Kette des IFN-Rezeptors bindet, könnte Änderungen der Genexpression in Antwort auf IFN vermitteln. Andere Proteinsubstrate könnten über den IFN-Rezeptor methyliert werden, einschließlich weiterer Komponenten des IFN-Rezeptorkomplexes und der Transkriptionsfaktoren. Lin et al. (1996) haben beobachtet, dass die Bindung des PRMT1 der Ratte an Wachstumsfaktor-induzierte Proteine PRMT1 aktiviert und seine Substratspezifität modifiziert, möglicherweise durch Entfernen einiger inhibitorischer Proteine, die mit PRMT1 in dem Cytoplasma der Zellen assoziiert sind. Eine ähnliche Aktivierung des an die IFNAR1-Kette des IFN-Rezeptors gebundenen IR1B4 kann erwartet werden.
Schlussfolgerungen
Ein neues Protein IR1B1 wird beschrieben, das mit der intracytoplasmatischen Domäne der IFNAR1-Kette des Typ I-Interferonrezeptors interagiert. Dieses Protein wird sehr rasch und transient nach der IFN-Behandlung humaner Zellen induziert. IR1B1 ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein von Helix-Loop-Helix EF-Hand-Stellen, die das Kennzeichen Calcium-bindender Proteine sind. Calciumionenflüsse wurden impliziert bei den Wirkungsmechanismen der IFNs und insbesondere für die initialen Zellantworten und Veränderungen der Zellmorphologie und der Organisation des Cytoskeletts (Tamm et al., 1987). Durch Calciumionen aktivierte Enzyme konnten in Antwort auf IFNs sekundäre Messenger produzieren, wie z.B. Diacyl-Glycerin. Darüber hinaus regulieren Calmodulin-ähnliche Proteine eine Anzahl von Proteinkinasen, und von diesen Stoffwechselwegen wurde beobachtet, dass sie in IFN-behandelten Zellen funktionieren (Tamm et al., 1987). Es ist wahrscheinlich, dass das IFN-Rezeptor bindende Protein IR1B1 an derartigen Ca⁺⁺-abhängigen Wirkungen der IFNs auf Zellen beteiligt ist.
Das Two-Hybrid-Screening nach Proteinen, die mit der IFNAR1-IC Domäne interagieren, identifizierte außerdem ein weiteres Protein IR1B4, von dem sich herausstellte, dass es ein Mitglied der Enzymfamilie der Protein-Arginin-Methyltransferase ist (PRMT1; Lin et al., 1996). Von diesem Enzym ist bekannt, dass es eine Anzahl von RNA und DNA bindenden Proteinen methyliert, insbesondere die heterologen nukleären Ribonukleoproteine (hnRNPs). Die hnRNPs wird an dem mRNA-Transport aus dem Nukleus ins Cytoplasma, dem alternativen Splicen der prä-mRNA und den posttranskriptionellen Kontrollen beteiligt (Liu und Dreyfuss, 1995). Die IR1B1 und IR1B4/PRMT1 Proteine, die an die IFNAR1-IC Domäne andocken, zeigen neuartige Signalmechanismen der IFNs, die neben den bekannten Jak-Stat-Stoffwechselwegen existieren, die von Darnell et al. (1994) beschrieben wurden.
Nachdem diese Erfindung nun vollständig beschrieben wurde, wird den Fachleuten auf dem Gebiet bewusst sein, dass dieselbe innerhalb eines weiten Bereiches äquivalenter Parameter, Konzentrationen und Bedingungen durchgeführt werden kann, ohne von dem Geist und dem Umfang der Erfindung abzuweichen und ohne unzumutbare Experimente.
Während diese Erfindung im Zusammenhang spezifischer diesbezüglicher Ausführungsformen beschrieben wurde, ist klar, dass weitere Modifikationen möglich sind.
Der Verweis auf bekannte Verfahrensschritte, herkömmliche Verfahrensschritte, bekannte Verfahren oder herkömmliche Verfahren ist nicht in irgendeiner Weise ein Zugeständnis, dass irgendein Aspekt, die Beschreibung oder eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung in dem relevanten Stand der Technik offenbart, gelehrt oder nahegelegt ist.
Referenzen

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SEQUENZPROTOKOLL
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein rekombinantes DNA-Molekül, das eine Nukleotidsequenz umfasst, die für ein an den IFNAR1-Rezeptor bindendes Protein kodiert, das durch IFN-α oder IFN-β induziert werden kann und die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 8 aufweist.
Ein rekombinantes DNA-Molekül in Übereinstimmung mit Anspruch 1, das weiterhin einen Promotor umfasst, der funktionell mit der genannten Sequenz verbunden ist, die für ein IFNAR1-Rezeptor-bindendes Protein kodiert, in Sense-Orientierung, so dass der genannte Promotor im Stande ist, das genannte Protein zu exprimieren, wenn sich das rekombinante DNA-Molekül in einem geeigneten Expressionswirt befindet.
Ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 2, wobei der genannte Promotor ein starker konstitutiver Promotor in humanen Zellen ist.
Ein rekombinantes DNA-Molekül in Übereinstimmung mit Anspruch 1, wobei die genannte Nukleotidsequenz SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 7 ist.
Eine rekombinante DNA umfassend ein DNA-Molekül, das die Nukleotidsequenz der SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 7 umfasst, entweder in Sense- oder in Antisense-Orientierung, oder ein Fragment davon, das im Stande ist, mit einer mRNA zu hybridisieren, die für ein Interferon-induzierbares IFNAR1-Rezeptor-bindendes Protein kodiert und dadurch dessen Expression verhindert.
Eine rekombinante DNA in Übereinstimmung mit Anspruch 5.
Eine rekombinante DNA in Übereinstimmung mit Anspruch 5, wobei die genannte Sequenz in der Sense-Orientierung vorliegt.
Eine rekombinante DNA in Übereinstimmung mit Anspruch 5, wobei die genannte Sequenz in der Antisense-Orientierung vorliegt.
Eine rekombinante DNA in Übereinstimmung mit Anspruch 8, die ein rekombinantes DNA-Molekül umfasst, das weiterhin einen mit der genannten Sequenz in Antisense-Orientierung funktionell verbundenen Promotor umfasst, so dass der genannte Promotor im Stande ist, eine Antisense-RNA zu exprimieren, die komplementär zu der gesamten Sense-RNA oder einem Teil der Sense-RNA ist, die für ein Interferon-induziertes IFNAR1-Rezeptor-bindendes Protein kodiert.
Ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß Anspruch 9, wobei die genannte Nukleotidsequenz ein Segment des 5'-Endes der SEQ ID NR: 1 oder SEQ ID NR: 7 ist.
Ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 2, 9 und 10, wobei der genannte Promotor ein Interferon-induzierbarer Promotor ist.
Ein rekombinantes DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 1–5 und 7-10, das ein Expressionsvektor ist.
Eine Wirtszelle, die fähig ist, eine Antisense-RNA zu exprimieren, die komplementär zu einer Sense-RNA ist, die für ein Interferon-induzierbares IFNAR1-Rezeptor-bindendes Protein kodiert, wobei die Zelle einen Expressionsvektor in Übereinstimmung mit Anspruch 12 enthält.
Verwendung eines Expressionsvektors, der das rekombinante DNA-Molekül gemäß einem der Ansprüche 8–10 enthält, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Verlängerung des Überlebens eines Gewebetransplantats durch Einführen des genannten Expressionsvektors in die Zellen eines Gewebes oder Organs, das in einen Patienten transplantiert werden soll, der dieses benötigt.
Verwendung eines Expressionsvektors, der das rekombinante DNA-Molekül nach Anspruch 3 oder Anspruch 4 umfasst, sowie von exogenem Interferon zur Herstellung eines pharmazeutischen Kits zur Behandlung von Krebs, das die aufeinander folgende Verabreichung des Expressionsvektors und des exogenen Interferons erlaubt, um die Antwort gegenüber exogenem Interferon zu verstärken.
Ein IFNAR1-bindendes Protein, das die Sequenz der SEQ ID NR: 2 oder SEQ ID NR: 8 aufweist.
Ein Molekül, das den Antigen-bindenden Teil eines Antikörpers umfasst, der spezifisch für ein IFNAR1-bindendes Protein in Übereinstimmung mit Anspruch 16 ist.
Ein Molekül gemäß Anspruch17, das aus einem monoklonalen Antikörper besteht.
Ein Verfahren zur Bereitstellung eines IFNAR1-Rezeptor-bindenden Proteins, welches das Einbringen einer DNA in Übereinstimmung mit Anspruch 1 in einen geeigneten Expressionswirt in einer Weise umfasst, durch welche die Expression des genannten Proteins bei der Kultivierung des genannten Wirtes erreicht werden kann, und Kultivieren des genannten Wirtes, so dass die Expression des genannten Proteins erreicht wird.