DE69835676T2

DE69835676T2 - Dna polymerase-verwandte faktoren

Info

Publication number: DE69835676T2
Application number: DE69835676T
Authority: DE
Inventors: Takashi Otsu-shi Uemori; Yoshimi Kurita-gun SATO; Tomoko Takatsuki-shi FUJITA; Kazue Uji-shi MIYAKE; Hiroyuki Moriyama-shi MUKAI; Kiyozo Koga-gun ASADA; Ikunoshin Uji-shi KATO
Original assignee: Takara Bio Inc
Current assignee: Takara Bio Inc
Priority date: 1997-06-26
Filing date: 1998-06-24
Publication date: 2007-08-23
Anticipated expiration: 2018-06-25
Also published as: US6218150B1; CA2295306A1; US6333158B1; CN1183253C; WO1999000506A1; EP0997530B1; EP0997530A1; CA2295306C; EP0997530A4; KR100432550B1; AU7933898A; KR20010014211A; DE69835676D1; US20020106675A1; CN1268975A; JP3742659B2

Description

TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft einen DNA polymerase-assoziierten Faktor. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung einen DNA polymerase-assoziierten Faktor, der für ein Reagens für die Gentechnik nützlich ist, und ein Verfahren zur Herstellung desselben, und weiter ein denselben kodierendes Gen und dergleichen.
STAND DER TECHNIK
DNA Polymerasen sind nützliche Enzyme für Reagenzien für die Gentechnik, und die DNA Polymerasen finden breite Anwendung für die Nukleotidsequenzierung von DNA, die DNA Markierung, die ortsgerichtete Mutagenese und dergleichen. Weiterhin sind kürzlich thermostabile DNA Polymerasen mit der Entwicklung des Polymerasekettenreaktions(PCR)-Verfahrens dargestellt worden, und es sind verschiedene DNA Polymerasen, die für das PCR Verfahren geeignet sind, entwickelt und kommerzialisiert worden.
Die gegenwärtig bekannten DNA Polymerasen können nach den Aminosäuresequenzhomologien grob in vier Familien eingeteilt werden, wobei die Familie A (Enzyme des Typs pol I) und die Familie B (Enzyme des Typs α) die große Mehrheit ausmachen. Obwohl DNA Polymerasen, die zu jeder Familie gehören, allgemein zueinander ähnliche biochemische Eigenschaften besitzen, zeigt ein ausführlicher Vergleich, dass sich einzelne Enzyme hinsichtlich der Substratspezifität, Einführungswirksamkeit eines Substratanalogs, Primererweiterbarkeit und der Extensionsrate, Art der DNA Synthese, Verbindung der Exonuklea seaktivität, optimalen Reaktionsbedingungen im Hinblick auf die Temperatur, den pH-Wert und dergleichen und der Empfindlichkeit gegenüber Inhibitoren voneinander unterscheiden. Daher werden diejenigen, die die am besten passenden Eigenschaften für die Anwendungen besitzen, unter allen verfügbaren DNA Polymerasen ausgewählt, und die ausgewählte DNA Polymerase wird verwendet.
Ein hyperthermophiles Archaebakterium pyrococcus furiosus hat eine DNA Polymerase erzeugt, die zum Typ α gehört, und ihr Gen ist bereits isoliert worden [Nucleic Acids Research, 21, 259-265 (1993)].
Als DNA Polymerasen sind zusätzlich zu denjenigen, die ihre Funktionen mit nur einer Art von Enzymprotein exprimieren, wie beispielsweise das Enzym vom Typ pol I oder das Enzym vom Typ α, Oligomerenzyme bekannt, die durch eine große Anzahl von Untereinheitsproteinen gebildet werden. Zusätzlich zu dem als DNA Polymerase dienenden Protein sind auch einige Fälle bekannt, bei denen gleichzeitig Proteinmoleküle zum Regulieren der Funktionen existieren.
Die WO 98/45452, die die Priorität vom 8. April 1997 beansprucht und nach dem Anmeldedatum dieses Patents veröffentlicht wurde, offenbart ein thermostabiles DNA Polymerase Enzym vom Typ III, das assoziierte Untereinheiten enthält, die die DNA stimulierte ATPase Aktivität bei erhöhter Temperatur und/oder Ionenstärke und ein hinzukommendes Protein mit einer DNA polymerase-assoziierten 3'-5'-Exonukleaseaktivität verlangsamen.
OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen thermostabilen DNA polymerase-assoziierten Faktor, der in der Lage ist, die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase zu erhöhen, und einen thermostabilen DNA polymerase-assoziierten Faktor, der eine Bindungsaktivität an eine DNA Polymerase besitzt, zur Verfügung zu stellen.
Eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Gen für den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung vorzusehen.
Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zum Erzeugen des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung vorzusehen.
Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein DNA Syntheseverfahren mittels einer DNA Polymerase in Gegenwart des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung zur Verfügung zu stellen
Eine noch andere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, einen Kit vorzusehen, der den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Gemäß der vorliegenden Erfindung können eine in vitro DNA Synthese und ein DNA Amplifikationssystem zur Verfügung gestellt werden, die durch Verwendung des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung besser als herkömmliche Verfahren sind.
Kürzlich haben die vorliegenden Erfinder eine neue DNA Polymerase mit absolut keiner strukturellen Homologie zu den herkömmlich bekannten DNA Polymerasen im hyperthermophilen Archaebakterium Pyrococcus furiosus (WO 97/2444 Druckschrift) gefunden. Bei dieser DNA Polymerase bilden zwei neue Proteinarten einen Komplex und zeigen eine DNA Polymeraseaktivität. Darüber hinaus zeigt das Enzym eine potente 3' → 5' Exonukleaseaktivität und eine ausgezeichnete Primerextensionsaktivität. Zum Beispiel kann, wenn das Enzym für eine PCR verwendet wird, ein DNA Fragment mit einer Größe von etwa 20 kb amplifiziert werden. Bei dieser neuen, von Pyrococcus furiosus stammenden DNA Polymerase ist, obwohl mindestens zwei Proteinarten wesentliche Bestandteile bei der Enzymaktivität sind, nicht geklärt worden, ob ein Bestandteilsprotein des Enzyms neben dem obigen existiert oder nicht oder ob ein Faktor, der einen Einfluss auf die Aktivität des Enzyms ausübt, existiert oder nicht.
Als Ergebnis von intensiven Studien haben die vorliegenden Erfinder erfolgreich ein Protein isoliert, das an die neue, von Pyrococcus furiosus stammende DNA Polymerase bindet. Weiter haben sie festgestellt, dass die Erzeugung des Proteins mittels Gentechnik durch Klonieren des Gens ermöglicht wird, und darüber hinaus, dass eine DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase erhöht wird.
Insgesamt betrifft die vorliegende Erfindung:

[1] einen thermostabilen DNA polymerase-assoziierten Faktor, der in der Lage ist, die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase zu erhöhen, wobei
[2] der DNA polymerase-assoziierte Faktor gemäß dem obigen Punkt [1] weiter eine Bindungsaktivität an eine DNA Polymerase besitzt, und wobei
[3] der DNA polymerase-assoziierte Faktor gemäß dem obigen Punkt [2], der eine Bindungsaktivität an eine DNA Polymerase besitzt, ein DNA polymerase-bildendes Protein mit der in SEQ ID NO: 5 oder 6 im Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenz umfasst; oder
[4] den DNA polymerase-assoziierten Faktor gemäß einem der obigen Punkte [1] bis (3], der mindestens eine der Aminosäuresequenzen umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 und 80 im Sequenzprotokoll ausgewählt sind;
[5] ein Gen, das einen DNA polymerase-assoziierten Faktor kodiert, wobei der Faktor mindestens eine der Aminosäuresequenzen umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 und 80 im Sequenzprotokoll ausgewählt sind, und eine Aktivität zum Erhöhen der DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase besitzt;
[6] das Gen gemäß dem obigen Punkt [5], das eine Nukleotidsequenz umfasst, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 18, 26, 33, 63, 69 und 79 ausgewählt ist;
[7] ein Gen, das in der Lage ist, unter strikten Bedingungen mit dem Gen des obigen Punkts [5] oder [6] zu hybridisieren und einen DNA polymerase-assoziierten Faktor zu kodieren, der eine Aktivität zum Erhöhen einer DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase besitzt;
[8] ein Verfahren zum Erzeugen eines DNA polymerase-assoziierten Faktors, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren die Kultivierung einer Transformante umfasst, die das Gen von einem der obigen Punkte [5] bis [7] enthält, und das Sammeln eines thermostabilen DNA polymerase-assoziierten Faktors, der die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase erhöhen kann, aus dem Kulturmedium;
[9] ein DNA Syntheseverfahren mit einer DNA Polymerase, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA in Gegenwart des DNA polymerase- assoziierten Faktors von einem der obigen Punkte [1] bis [4] synthetisiert wird;
[10] das DNA Syntheseverfahren nach dem obigen Punkt [9], wobei die DNA in Gegenwart von zwei oder mehr Arten der DNA polymerase-assoziierten Faktoren synthetisiert wird;
[11] das DNA Syntheseverfahren nach dem obigen Punkt [10], wobei die DNA in Gegenwart von F7, PFU-RFC und PFU-RFCLS als DNA polymerase-assoziierten Faktor synthetisiert wird;
[12] das DNA Syntheseverfahren nach einem der obigen Punkte [9] bis [11], wobei die DNA Polymerase eine thermostabile DNA Polymerase ist;
[13] das DNA Syntheseverfahren nach dem obigen Punkt [12], wobei die Synthese mittels eines PCR Verfahrens durchgeführt wird;
[14] ein zur in vitro DNA Synthese verwendbarer Kit, umfassend den DNA polymerase-assoziierten Faktor nach einem der obigen Punkte [1] bis [4] und eine DNA Polymerase;
[15] der Kit nach dem obigen Punkt [14], weiter umfassend ein Reagens, das für die DNA Synthese erforderlich ist;
[16] der Kit nach dem obigen Punkt [14] oder [15], umfassend zwei oder mehr Arten der DNA polymerase-assoziierten Faktoren;
[17] der Kit nach dem obigen Punkt [16], umfassend F7, PFU-RFC und PFU-RFCLS als DNA polymerase-assoziierten Faktor; und
[18] der Kit nach einem der obigen Punkte [14] bis [17], umfassend eine thermostabile DNA Polymerase als DNA Polymerase.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Abbildung, die eine SDS-PAGE von 7 Proteinarten (F1, F2, F3, F4, F5, F6 und F7) zeigt, die mittels einer anti-Pfu Polymerase C Antikörpersäule isoliert wurden. Die Molekulargewichte auf der SDS-PAGE betragen etwa 55 kDa, etwa 24 kDa, etwa 37 kDa, etwa 19,5 kDa, etwa 27 kDa, etwa 64 kDa und etwa 33 kDa in der Reihenfolge von F1 bis F7.
2 ist eine Restriktionsendonukleasekarte eines DNA Inserts des Plasmids pF1-4-10, das ein das F1 Protein kodierendes Gen trägt.
3 ist eine graphische Darstellung, die eine 5' → 3' Exonukleaseaktivität des F1 Proteins zeigt.
4 ist eine graphische Darstellung, die eine 3' → 5' Exonukleaseaktivität des F1 Proteins zeigt.
5 ist eine Restriktionsendonukleasekarte eines DNA Inserts des Plasmids pF2172Nh, das ein das F2 Protein kodierendes Gen trägt.
6 ist eine Restriktionsendonukleasekarte eines DNA Inserts des Plasmids pF7-1-8, das ein das F7 Protein kodierendes Gen trägt.
7 ist ein Autoradiogramm, das bei Zugabe des F7 Proteins eine Primerextensionsaktivität der DNA Polymerase zeigt.
8 ist ein Autoradiogramm, das bei Zugabe des F7 Proteins eine Primerextensionsaktivität für das höhermolekulare Primerextensionsreaktionsprodukt der DNA Polymerase zeigt.
9 ist eine Restriktionsendonukleasekarte eines DNA Inserts des Plasmids pRFS254NdB, das ein das PFU-RFC Protein kodierendes Gen trägt.
10 zeigt die analytischen Ergebnisses einer SDS-PAGE des Proteins (F7), das mittels einer anti-Pfu DNA Polymerase Antikörpersäule isoliert wurde. Das Molekulargewicht von F7 auf SDS-PAGE beträgt wie abgeleitet etwa 33 kDa.
11 zeigt die analytischen Ergebnisse der DNA Polymeraseaktivität des Eluats, erhalten durch Unterwerfen von Pfu DNA Polymerase und einem Gemisch aus Pfu DNA Polymerase und F7 einer Gelfiltration.
12 ist eine Restriktionsendonukleasekarte eines DNA Inserts des Plasmids pRFLSNh, das ein das PFU-RFCLS Protein kodierendes Gen trägt.
13 ist eine Restriktionsendonukleasekarte um das Gen herum, das das F5 Protein auf der genomischen DNA von Pyrococcus furiosus kodiert.
14 zeigt analytische Ergebnisse einer SDS-PAGE von 3 Proteinarten (PFU-RFCLS, PFU-RFC, F7), die durch eine anti-PFU-RFC Antikörpersäule isoliert wurden.
15 ist eine Abbildung, die die DNA Polymeraseaktivität bei Zugabe von F7 oder RFC-N Komplex zeigt.
16 ist eine Restriktionsendonukleasekarte eines DNA Inserts des Plasmids pRFC10, das PFU-RFCLS und PFU-RFC kodierende Gene trägt.
17 ist eine Abbildung, die die DNA Polymeraseaktivität bei Zugabe von F7 oder F7 und rRFC-M Komplex zeigt.
BESTES VERFAHREN ZUM DURCHFÜHREN DER ERFINDUNG
1. DNA polymerase-assoziierter Faktor der vorliegenden Erfindung
In der vorliegenden Beschreibung bedeutet der Ausdruck „DNA polymerase-assoziierter Faktor" einen Faktor, der aufgrund eines gleichzeitigen Bestehens mit der DNA Polymerase Wirkungen auf eine Funktion einer DNA Polymerase ausübt. Konkret umfassen die DNA polymerase-assoziierten Faktoren einen Faktor, der eine Wirkung besitzt, durch die die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase erhöht wird, einen Faktor, der eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase besitzt, und weiter einen, der beide Aktivitäten aufweist, und so weiter. Darüber hinaus ist der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung ein thermostabiles Protein, das beispielsweise beständig gegenüber einer Wärmebehandlung bei 80°C über 15 Minuten ist. Daher kann der Faktor für die DNA Synthetisierungsreaktion unter Hochtemperaturbedingungen mittels einer thermostabilen DNA Polymerase verwendet werden.
(a) DNA polymerase-assoziierter Faktor, der die DNA Synthetisierungsaktivität von DNA Polymerase steigern kann
Der DNA polymerase-assoziierte Faktor, der die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase steigern kann, ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange der Faktor die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase steigern kann. Zum Beispiel umfasst der Faktor Proteine, die eine vollständige oder teilweise Sequenz der Aminosäuresequenz umfassen, wie in mindestens einer Sequenz gezeigt ist, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 und 80 im Sequenzprotokoll ausgewählt ist; oder funktionelle Äquivalente davon, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die aus einer Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einem oder mehr Aminosäuren in mindestens einer der Aminosäuresequenzen resultiert, und das Äquivalent hat eine Aktivität zum Steigern der DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase. In der vorliegenden Beschreibung bezieht sich der Begriff „ein oder mehr" auf eine Anzahl von ein oder mehreren oder mehr. Darüber hinaus betrifft der Ausdruck „funktionelles Äquivalent" Äquivalente, die im Wesentlichen bezüglich ihrer Funktionen und Aktivitäten äquivalent sind, obwohl sie sich im Aufbau unterscheiden, und die funktionellen Äquivalente sind auch vom DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung umfasst.
Die DNA Polymerase, deren Aktivität durch den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung erhöht ist, ist nicht sonderlich eingeschränkt. Beispiele dafür umfassen thermostabile DNA Polymerasen, insbesondere DNA Polymerasen, die vom hyperthermophilen Archaebakterium stammen. Konkret können DNA Polymerasen angeführt werden, die von Pyrococcus furiosus (Pfu Polymerase C und dergleichen, wie unten angegeben) stammen. Wie nachfolgend beschrieben handelt es sich bei der Pfu Polymerase C um ein Enzym, das ein DNA polymerase-bildendes Protein mit den in SEQ ID NO: 5 und SEQ ID NO: 6 im Sequenzprotokoll gezeigten Aminosäuresequenzen umfasst.
Außerdem kann der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung ein solcher sein, der nur eine Aktivität einer bestimmten DNA Polymerase steigert, und er ist vorzugsweise einer, der die Aktivi täten gegenüber mehreren DNA Polymerasearten von unterschiedlichem Ursprung steigert.
Das Verfahren zum Bestimmen einer Aktivität zum Steigern der DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase ist nicht sonderlich eingeschränkt, solange es gewöhnlich zum Bestimmen der DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase verwendet wird. Die Aktivität zum Steigern einer DNA Synthetisierungsaktivität kann zum Beispiel durch Zugabe des Faktors beim Messen einer Aufnahmeaktivität des markierten Nukleotids in einen neuen synthetisierten DNA Strang; und durch Vergleichen der Aufnahmeaktivität mit einer Aktivität, bei der der Faktor nicht zugesetzt wird, bestimmt werden. Darüber hinaus kann ein Nachweisverfahren auf der Grundlage der Kettenlänge eines neuen synthetischen DNA Strangs pro Zeiteinheit oder der Menge eines PCR-amplifizierten Produkts pro Zeiteinheit angegeben werden. Als Verfahren zum Bestimmen der DNA Synthetisierungsaktivität kann ein Verfahren angeführt werden, das in DNA Polymerase from Escherichia coli, veröffentlicht von Harpar und Row, herausgegeben von D.R. Davis, 263-276 (verfasst von C.C. Richardson) und dergleichen beschrieben ist.
Weiter kann im DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung durch eine Kombination aus mehreren DNA polymerase-assoziierten Faktoren eine noch höhere DNA Polymeraseaktivität bei den gleichzeitig bestehenden DNA Polymerasen im Vergleich zu dem der einzelnen Verwendung gezeigt werden.
(b) DNA polymerase-assoziierter Faktor, der die Aktivität zum Binden an DNA Polymerase besitzt
Der DNA polymerase-assoziierte Faktor, der eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase besitzt, ist nicht sonderlich eingeschränkt, so lange er eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase besitzt. Im Übrigen umfasst der DNA polymerase-assoziierte Faktor, der eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase besitzt, in der vorliegenden Beschreibung andere Substanzen, zum Beispiel solche, die eine Aktivität zum indirekten Binden an eine DNA Polymerase über andere DNA polymerase-assoziierte Faktoren aufweisen, sowie solche, die eine Aktivität zum direkten Binden an eine DNA Polymerase aufweisen. Beispiele hierfür beinhalten Proteine, die eine vollständige oder teilweise Sequenz einer Aminosäuresequenz umfassen, wie sie in mindestens einer Sequenz gezeigt ist, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 und 80 im Sequenzprotokoll ausgewählt ist; oder funktionelle Äquivalente davon, die eine Aminosäuresequenz umfassen, die aus einer Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einer oder mehr Aminosäuren in mindestens einer der Aminosäuresequenzen hervorgeht, und das Äquivalent hat eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase. In der vorliegenden Beschreibung betrifft der Ausdruck „ein oder mehr" eine Anzahl von ein oder mehreren oder mehr.
Die DNA Polymerase, die an den DNA polymerase-assoziierten, nicht sonderlich eingeschränkten Faktor der vorliegenden Erfindung bindet, umfasst zum Beispiel eine thermostabile DNA Polymerase, insbesondere DNA Polymerasen, die vom hyperthermophilen Archaebakterium stammen. Konkret können DNA Polymerasen genannt werden, die von Pyrococcus furiosus (Pfu Polymerase C und dergleichen) stammen. Eines oder beide DNA polymerase-bildenden Proteine, die die Aminosäuresequenzen aufweisen, wie sie in SEQ ID NO: 5 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, sind an Pfu Polymerase C gebunden.
Darüber hinaus kann der DNA polmyerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung ein solcher sein, der an eine bestimmte DNA Po lymerase bindet, und er ist vorzugsweise ein solcher, der an mehrere DNA Polymerasearten mit unterschiedlichen Ursprüngen bindet.
Das Verfahren zum Bestimmen der Bindung an eine DNA Polymerase beinhaltet ein Verfahren, das das Mischen des Faktors mit einer DNA Polymerase und das Untersuchen einer Änderung des Molekulargewichts durch native Gelelektrophorese, Gelfiltration und dergleichen umfasst; ein Verfahren zum Untersuchen der Adsorption des Faktors an einen Träger, der an eine DNA Polymerase immobilisiert ist und dergleichen.
Außerdem besitzt der DNA polymerase-assoziierte Faktor, der die Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in SEQ ID NO: 19 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, eine Exonukleaseaktivität. Es wird daher in Erwägung gezogen, dass der DNA polymerase-assoziierte Faktor, der die in SEQ ID NO: 19 gezeigte Aminosäuresequenz umfasst, ein Protein mit einer Funktion ist, die mit der Wirkung einer DNA Polymerase in der DNA Replikation, DNA Reparatur und dergleichen assoziiert ist. Weiter sind als funktionelle Äquivalente des DNA polymerase-assoziierten Faktors Proteine, die eine teilweise Sequenz der Aminosäuresequenz umfassen, wie sie in SEQ ID NO: 19 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einer oder mehr Aminosäuren in mindestens einer der Sequenzen resultiert, wobei die Proteine eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase besitzen und weiter gleichermaßen eine Exonukleaseaktivität besitzen, in der vorliegenden Erfindung als DNA polymerase-assoziierter Faktor umfasst. In der vorliegenden Beschreibung betrifft der Begriff „ein oder mehr" eine Anzahl von ein oder mehreren oder mehr.
Im Übrigen wird bei der Erläuterung des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung der Faktor als ein Protein identifi ziert, das eine vollständige oder teilweise Sequenz von jeder der Aminosäuresequenzen umfasst, wie sie insbesondere in SEQ ID NO im Sequenzprotokoll gezeigt sind, und der Ausdruck „Protein, umfassend" wie er hier verwendet wird, beinhaltet die nachfolgend beschriebenen Proteine, die auch in der vorliegenden Erfindung enthalten sind. Wenn nämlich ein Protein mittels gentechnischer Verfahren hergestellt wird, wird es oft als Fusionsprotein exprimiert. Zum Beispiel wird, um ein Expressionsniveau des gewünschten Proteins zu erhöhen, das Protein durch Zugabe einer N-terminalen, von anderen Proteinen stammenden Peptidkette zum N-Terminus exprimiert oder durch Zugabe einer geeigneten Peptidkette am N-Terminus oder C-Terminus des gewünschten Proteins exprimiert, und es wird ein Träger mit Affinität für jede der Peptidketten verwendet, um so die Reinigung des gewünschten Proteins zu erleichtern. In der vorliegenden Erfindung sind auch die oben erwähnten Fusionsproteine umfasst.
2. Gene, die den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodieren
(a) Eigenschaften von Genen, die einen DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodieren
Die Gene, die den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodieren, sind solche, die den oben erwähnten DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodieren, der eine DNA oder RNA betrifft. Konkret umfassen die Gene ein Gen, das einen DNA polymerase-assoziierten Faktor kodiert, wobei der Faktor eine vollständige oder teilweise Sequenz der Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in mindestens einer Sequenz, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 und 80 im Sequenzprotokoll ausgewählt ist, gezeigt ist, oder eine Aminosäuresequenz, die aus einer Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einer oder mehr Aminosäuren in mindestens einer dieser Sequenzen resultiert, und der Faktor besitzt eine Aktivität zum Steigern der DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase oder eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase. Konkrete Beispiele für solche Gene umfassen Gene, die einen DNA polmyerase-assoziierten Faktor kodieren, umfassend eine vollständige oder teilweise Sequenz einer Nukleotidsequenz, wie sie in mindestens einer Sequenz gezeigt ist, die aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 18, 26, 33, 63, 69 und 79 ausgewählt ist, oder eine Nukleotidsequenz, die aus einer Substitution, Deletion, Addition oder Insertion von einer oder mehr Basen in diesen Sequenzen resultiert, wobei der Faktor eine Aktivität zum Steigern der DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase oder eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase besitzt. In der vorliegenden Beschreibung betrifft der Begriff „ein oder mehr" eine Anzahl von ein oder mehreren oder mehr. In der vorliegenden Erfindung kann weiter ein Gen angeführt werden, das an eine DNA des Gens der vorliegenden Erfindung hybridisieren und eine Aktivität zum Steigern der DNA Synthetisierungsaktivität oder eine Aktivität zum Binden an eine DNA Polymerase besitzen kann.
Der Ausdruck „Gen, das (an ein Gen) zu hybridisieren kann", der in der vorliegenden Beschreibung beschrieben ist, betrifft ein Gen, das eine DNA umfasst, die an eine DNA eines Gens hybridisieren kann, bei dem es sich um ein Gen mit einer dem Gen ähnelnden Nukleotidsequenz handelt. Im Hinblick auf das Gen mit einer einem Gen ähnelnden Nukleotidsequenz gibt es eine große Möglichkeit einer Ähnlichkeit mit einer Aminosäuresequenz eines dadurch kodierten Proteins und zusätzlich einer Ähnlichkeit mit einer Funktion des Proteins. Die Homologie der Nukleotidsequenz des Gens kann dahingehend untersucht werden, ob ein Hybrid (wobei die Gene hybridisiert werden) mit DNAs von beiden Genen oder einem teilweisen Abschnitt davon unter strikten Bedingungen gebildet wird oder nicht. Durch Verwendung der Hybridisie rung kann ein Gen erhalten werden, das ein Protein mit ähnlichen Funktionen für ein das Gen kodierendes Protein hat.
Mit anderen Worten können die anderen Gene der vorliegenden Erfindung mit homologen Nukleotidsequenzen zu einem Gen der vorliegenden Erfindung durch Durchführen einer Hybridisierung mittels eines bekannten Verfahrens unter Verwendung einer DNA des in der vorliegenden Erfindung erhaltenen Gens oder eines teilweisen Abschnitt davon als Sonde erhalten werden. Die Hybridisierung kann zum Beispiel mit einem Verfahren durchgeführt werden, das in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory 1989, herausgegeben von T. Maniatis u.a., oder dergleichen beschrieben ist.
Hier betrifft der Ausdruck „die strikten Bedingungen" Bedingungen, bei denen die nicht spezifische Hybridisierung nicht stattfindet. Konkret gibt es zum Beispiel die folgenden Bedingungen. Mit anderen Worten wird eine DNA immobilisierte Membran bei 50°C 12 bis 20 Stunden zusammen mit einer markierten DNA Sonde in 6 × SSC (wobei 1 × SSC 0,15 M NaCl, 0,015 M Natriumcitrat, pH 7,0, zeigt), enthaltend 0,5% SDS, 0,1% Rinderserumalbumin (BSA), 0,1% Polyvinylpyrrolidon, 0,1% Ficoll 400 und 0,01% denaturierte Lachssamen DNA, inkubiert. Nach dem Abschluss der Inkubation wird die Membran gewaschen, wobei unter den Bedingungen von 37°C in 2 × SSC, enthaltend 0,5% SDS, begonnen wird, die SSC Konzentration bis zu einem Bereich von 0,1 × SDS variabel zu halten, und die Temperatur bis zu einem Bereich von 50°C variabel ist, bis ein Signal, das einer immobilisierten markierten DNA Sonde zugeschrieben wird, vom Hintergrund unterschieden werden kann.
Darüber hinaus kann anstelle der Hybridisierung ein Verfahren zur Genamplifikation mittels einer teilweisen Sequenz der Nukleotidsequenz des Gens der vorliegenden Erfindung als Primer verwendet werden. Zum Beispiel kann ein PCR Verfahren verwendet werden. Die PCR Bedingungen können in geeigneter Weise durch Sequenzen von Primer DNAs oder einer Matrizen DNA bestimmt werden. Ob das Gen, das wie oben beschrieben erhalten wurde, ein Protein mit der gewünschten Funktion kodiert oder nicht, kann durch Nachweisen der Aktivität des sich ergebenden Proteins durch Exprimieren eines Proteins, das durch das Gen kodiert wird, mittels eines geeigneten Wirts und eines Expressionssystems untersucht werden.
Außerdem umfasst das Verfahren zum künstlichen Herstellen einer Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz mit einer oder mehr Substitutionen, Deletionen, Additionen oder Insertionen in der Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz in der vorliegenden Erfindung verschiedene gentechnische Manipulationen, die in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory 1989, herausgegeben von T. Maniatis u.a., oder dergleichen beschrieben sind. Konkrete Beispiele dafür umfassen gentechnische Verfahren, wie beispielsweise Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese und Kassettenmutationsverfahren. Durch das Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese kann eine Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz mit einer oder mehr Substitutionen, Deletionen, Additionen oder Insertionen hergestellt werden. Durch das Kassettenmutationsverfahren kann eine Aminosäuresequenz oder Nukleotidsequenz mit einer größeren Region einer Deletion, Addition oder Insertion im Vergleich zu der Sequenz, die durch das Verfahren zur ortsgerichteten Mutagenese erhalten wurde, hergestellt werden. Diese oben beschriebenen, modifizierten Produkte sind auch in der vorliegenden Erfindung enthalten, solange sie funktionell äquivalent sind. Weiter kann bei der Herstellung eines Proteins durch gentechnische Verfahren in einem Fall, in dem ein Kodon, das auf einem natürlich vorkommenden, das gewünschte Protein kodierenden Gen verwendet wird, mit geringer Häufigkeit verwendet wird, das Expressionsniveau des Proteins niedrig sein. In einem solchen Fall wird das Kodon ohne Änderung der kodierten Aminosäuresequenz künstlich zu einem im Wirt häufig verwendeten umgewandelt, wodurch das gewünschte Protein stark exprimiert wird (zum Beispiel japanische geprüfte Patentveröffentlichung Nr. Hei 7-102146).
(b) Klonieren des Gens, das den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodiert
Ausführliche Beschreibungen über die Analyse der sich ergebenden Klone, die physikalisch-chemischen Eigenschaften des Expressionsprodukt DNA polymerase-assoziierten Faktors, die Erläuterung der Funktionen und dergleichen werden nachfolgend gegeben.
Wie oben beschrieben, besitzt der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung eine Wirkung zum Steigern der DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase oder ein Merkmal zum Binden des Faktors an eine DNA Polymerase. Daher kann der Faktor dadurch erhalten werden, dass man diese Wirkungen als Anzeigen verwendet.
Die DNA Polymerase, die zum Erhalten des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, ist nicht sonderlich eingeschränkt, und ein Beispiel dafür umfasst eine Pyrococcus furiosus-erzeugende DNA Polymerase. Als Pyrococcus furiosus-erzeugende DNA Polymerase kann zum Beispiel ein Enzym verwendet werden, das ein DNA polymerase-bildendes Protein umfasst, das die Aminosäuresequenz beinhaltet, wie sie in SEQ ID NO: 5 und/oder SEQ ID NO: 6 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, die von Pyrococcus furiosus DSM3638 stammt.
Im Übrigen wird in der vorliegenden Beschreibung dieses Enzym als Pfu Polymerase C beschrieben, um es von einer DNA Polymerase vom Typ α zu unterscheiden [Pfu DNA Polymerase, Nucleic Acids Research, 21, 259-265 (1993)], die auch bei Pyrococcus furiosus gefunden wurde. Das das Enzym kodierende Gen wird vom Plasmid pFU1001 getragen. Außerdem wird eine Transformante, Escherichia coli JM109, die mit dem Plasmid transformiert ist, als Escherichia coli JM109/pFU1001 bezeichnet und identifiziert und ist unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-5579 beim Nationalen Institut für Biowissenschaft und Humantechnologie, Agentur für Arbeitswissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Gewerbe, dessen Adresse 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken (Postleitzahl 305-8566), Japan, ist, seit dem 11. August 1995 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) nach dem Budapester Vertrag hinterlegt. Daher kann die Pfu Polymerase C durch Kultivieren der Transformante und Reinigen aus dem sich ergebenden Kulturmedium erhalten werden. Im Übrigen ist die Pfu Polymerase C ein Enzym, das ein DNA polymerase-bildendes Protein mit der Aminosäuresequenz umfasst, wie sie in SEQ ID NO: 5 und/oder SEQ ID NO: 6 im Sequenzprotokoll gezeigt ist.
Pfu Polymerase C ist ein Enzym, das die folgenden Eigenschaften besitzt:

(A) Aufweisen einer höheren Aktivität, wenn die Polymeraseaktivität unter Verwendung eines Komplexes, der aus dem Anlagern eines Primers an eine einzelsträngige Matrizen DNA resultiert, als Substrat bestimmt wird, im Vergleich zu dem Fall, in dem eine aktivierte DNA als Substrat verwendet wird;
(B) Besitzen einer 3' → 5' Exonukleaseaktivität;
(C) Fähigkeit, ein DNA Fragment von etwa 20 kbp ohne Zugabe anderer Enzyme in dem Fall zu amplifizieren, in dem die Polymerasekettenreaktion (PCR) mit λ-DNA als Matrize unter den folgenden Bedingungen durchgeführt wird: PCR Bedingungen: a) eine Zusammensetzung des Reaktionsgemischs: umfassend 10 mM Tris-HCl (pH 9,2), 3,5 mM MgCl₂, 75 mM KCl, je 400 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 0,01% Rinderserumalbumin, 0,1% Triton X-100, 5,0 ng/50 μl λ-DNA, 10 pmol/50 μl Primer λ1 (SEQ ID NO: 58 im Sequenzprotokoll), Primer λ11 (SEQ ID NO: 59 im Sequenzprotokoll) und 3,7 Einheiten/50 μl DNA Polymerase; b) Reaktionsbedingungen: Durchführen einer PCR über 30 Zyklen, wobei ein Zyklus 98°C, 10 Sekunden – 68°C, 10 Minuten ist; und
(D) Umfassen von zwei DNA polymerase-bildenden Proteinarten, die etwa 90.000 Dalton bzw. 140.000 Dalton auf der SDS-PAGE entsprechen.

Das Verfahren zum Erhalten des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung ist nicht sonderlich eingeschränkt. Zum Beispiel kann der Faktor durch Immobilisieren einer DNA Polymerase, wie beispielsweise Pfu Polymerase C, an einen geeigneten Träger, Mischen des DNA polymerase-immobilisierten Trägers mit einer Probe, die den DNA polymerase-assoziierten Faktor enthält, Entfernen vom Träger gelösten Faktors und danach Eluieren des gebundenen Trägers erhalten werden. Die Immobilisierung der DNA Polymerase an den Träger kann durch ein bekanntes Verfahren durchgeführt werden. Alternativ wird ein Antikörper gegen die DNA Polymerase hergestellt, und eine DNA Polymerase kann durch Verwendung des antikörper immobilisierten Trägers immobilisiert werden. Zum Beispiel bindet, wenn ein anti-Pfu Polymerase C Antikörper hergestellt wird und der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung durch Verwendung des Antikörpers aus einer von Pyrococcus furiosus stammenden Probe erhalten wird, einschließlich zum Beispiel einer Lösung mit aufgebrochenen Pyrococcus furiosus Zellen, Pfu Polymerase C in der Probe an diesen Antikörper, wenn der antikörper-immobilisierte Träger wie oben beschrieben verwendet wird. Daher ist es abgesehen von der Probe nicht notwendig, Pfu Polymerase C zuzusetzen, so dass der DNA polymerase-assoziierte Faktor ohne weiteres gereinigt werden kann.
Die Probe, die zum Erhalten des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung verwendet wird, ist nicht sonderlich eingeschränkt. Zum Beispiel können Proben, die von Mikroorganismen stammen, verwendet werden. Konkret können Proben, die von Pyrococcus furiosus DSM 3638 stammen, verwendet werden. Der obige Stamm ist von Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH erhältlich. Im Fall, dass eine Lösung mit aufgebrochenen Zellen, die durch Kultivieren des obigen Stamms in einem geeigneten Wachstumsmedium und Herstellen aus dem sich ergebenden Kulturmedium erhalten werden, auf eine Säule aufgetragen wird, die mit einem mit einem anti-Pfu Polymerase C Antikörper immobilisierten Träger gepackt ist, werden mehreren Proteinarten, die nicht Pfu Polymerase C sind, an der Säule adsorbiert. Das diese Proteine kodierende Gen kann durch die nachfolgend beispielhaft angegebenen Verfahren kloniert werden.
Zuerst werden die obigen Proteine mit einem bekannten Verfahren isoliert und ihre N-terminalen Aminosäuresequenzen werden bestimmt. In Bezug auf die Aminosäuresequenzen werden synthetische Oligonukleotide, die als Primer oder Sonden verwendet werden sollen, hergestellt.
Als Nächstes wird eine PCR mit einer genomischen DNA von Pyrococcus furiosus als Matrize unter Verwendung dieses synthetischen Oligonukleotids als Primer durchgeführt, wodurch ein DNA Fragment, das das gewünschte Gen trägt, erhalten werden kann. Die Bedingungen für eine PCR können entsprechend festgelegt werden. Alternativ kann ein DNA Fragment, das das gewünschte Gen trägt, von einer genomischen DNA von Pyrococcus furiosus unter Durchführung einer Hybridisierung mittels des obigen Oligonukleotids als Sonde erhalten werden. In diesem Fall kann als Hybridisierung eine Southern Hybridisierung mittels einer genomischen DNA von Pyrococcus furiosus verwendet werden, die durch Verdau mit einem geeigneten Restriktionsenzym, Koloniehybridisierung mittels einer Genbibliothek einer genomischen DNA von Pyrocuccus furiosus, eine Plaque-Hybridisierung, Dot-Hybridisierung und dergleichen erhalten wird.
Wenn das oben erhaltene DNA Fragment keine volle Länge des gewünschten Gens trägt, werden neue Primer mit Bezug auf die Nukleotidsequenz des sich ergebenden DNA Fragments hergestellt, und es wird weiter eine PCR oder eine Hybridisierung durchgeführt, und zwar mittels des sich ergebenden DNA Fragments oder seines teilweisen Fragments als Sonde, um so eine volle Länge des gewünschten Gens zu erhalten.
Die Manipulationen der PCR und Hybridisierung sind nicht sonderlich eingeschränkt und können zum Beispiel mit Bezug auf Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ausg., veröffentlicht von Cold Spring Harbor Laboratory 1989, herausgegeben von T. Maniatis u.a., durchgeführt werden.
Wenn die Lösung mit aufgebrochenen Zellen des Stamms Pyrococcus furiosus DSM 3638 mit dem obigen, mit dem anti-Pfu Polymerase C Antikörper immobilisierten Träger gemischt wird, gibt es sieben Prote inarten, die an den Träger adsorbiert werden, sowie Pfu Polymerase C. Im Hinblick auf sechs Arten davon sind in der vorliegenden Erfindung ihre Gene durch die oben beschriebenen Manipulationen isoliert worden. Diese Proteine werden als F1, F2, F3, F4, F5 bzw. F7 bezeichnet; es handelt sich hierbei um die konkreten Beispiele des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung. Die Nukleotidsequenzen eines offenen Leserahmens des diese Proteine kodierenden Gens sind in SEQ ID NO: 18, 26, 79, 33, 69 bzw. 2 im Sequenzprotokoll gezeigt. Darüber hinaus sind die von diesen Nukleotidsequenzen abgeleiteten Aminosäuresequenzen jedes Proteins in SEQ ID NO: 19, 27, 80, 34, 70 bzw. 1 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Das klonierte Gen wird in einen geeigneten Wirt, zum Beispiel Escherichia coli, eingeführt, wodurch die Expression eines dadurch kodierten Proteins ermöglicht wird. Zum Beispiel wird eine Transformante von Escherichia coli JM109, in die ein oben erwähntes, F7 kodierendes Gen eingeführt wird, als Escherichia coli JM109/pF7-HH-18 bezeichnet und identifiziert, und ist seit dem 3. Juni 1997 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6338 beim Nationalen Institut für Biowissenschaft und Humantechnologie, Agentur für Arbeitswissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Gewerbe, dessen Adresse 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken (Postleitzahl 305-8566), Japan, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt. F7 kann durch Kultivieren der Transformante und Gewinnen eines gewünschten Produkts aus der sich ergebenden Kultur erhalten werden. Es wird durch die vorliegende Erfindung aufgeklärt, dass das oben erhaltene F7 die Aktivitäten einer Polymerase vom Typ α (Pfu DNA Polymerase), die von Pyrococcus furiosus stammt, und von zwei DNA Polymerasenarten [J. Bacteriol. 177, 2164-2177 (1995)], die von Pyrodictium occultum stammen, zusätzlich zu der in der Proteinisolierung verwendeten Pfu Polymerase C, steigert.
Darüber hinaus wird auch aufgeklärt, dass jede der oben erwähnten F1, F2, F3, F4 und F5 eine Aktivität von Pfu Polymerase C und Pfu DNA Polymerase steigert.
Wenn die Aminosäuresequenz des Proteins, das vom obigen Stamm Pyrococcus furiosus DSM 3638 stammt, mit einer Aminosäuresequenz eines bekannten Proteins verglichen wird, hat F1 Homologien zu einer einzelsträngigen, DNA-spezifischen Exonuklease, die von Haemophilis influenzae stammt [Science, 269, 496-512 (1995)]. F3 hat Homologien zur von Mycoplana ramose stammenden Acetylpolyaminaminohydrase [Journal of Bacteriology, 178, 5781-5786 (1996)] und humaner Histondeacetylase [Science, 272, 408-411 (1996)]. Darüber hinaus hat F7 Homologien zu dem proliferierenden Zellkernantigen (PCNA), das an der DNA Replikation in Eukaryoten beteiligt ist [EMBO J., 11, 5111-5120 (1995); Nucleic Acids Research, 18, 1353-1381 (1990); Proc. Natl. Aca. Sci. USA, 84, 1575-1579 (1987)]. Wie festgestellt wurde, haben F2, F4 und F5 keine Homologien zu einem bekannten Protein.
Es ist berichtet worden, dass PCNA einen Komplex mit einem Replikationsfaktor C (RFC, RF-C) bildet, der an der DNA Synthese beteiligt sein soll [Journal of Biochemistry, 68, 1542-1548 (1996)]. Daher wird selbst bei Pyrococcus furiosus erwartet, dass ein Protein entsprechend RFC exprimiert wird und dass das Protein zusammen mit dem oben erwähnten F7 an der DNA Synthesereaktion beteiligt ist. Eine weitere ausgezeichnete Wirkung zum Steigern der DNA Polymerase Synthetisierungsaktivität kann durch Sammeln dieses Proteins und zum Beispiel durch Beimengen des sich ergebenden Proteins zusammen mit dem oben erwähnten F7 in das Reaktionssystem für die DNA Polymerase erhalten werden. Das ein RFC Homolog von Pyrococcus furiosus kodierende Gen kann durch die nachfolgend beschriebenen Schritte erhalten werden.
Eine ganze Nukleotidsequenz einer chromosomalen DNA von Archaebakterien Methanococcus jannaschii ist bereits aufgeklärt worden [Science, 273, 1058-1073 (1996)], und die Nukleotidsequenzen tragen das Gen, das ein Protein kodiert, das als Homolog von PCNA und RFC angesehen wird. Die Aminosäuresequenz, die durch das Gen eines Homologs einer kleinen RFC Einheit und einer großen RFC Einheit des Stamms kodiert wird, wird mit der Aminosäuresequenz verglichen, die durch ein bekanntes Gen mit kleinen RFC Untereinheiten kodiert wird [Nucleic Acids Research, 21, 1-3 (1993); Nucleic Acids Research, 22, 1527-1535 (1994)], wodurch auf die Aminosäuresequenzen mit hohen Homologien hin untersucht wird. Ein synthetisches Oligonukleotid kann mit Bezug auf das oben Gesagte hergestellt werden, wobei das Oligonukleotid als Primer oder Sonde zum Erhalten eines Genfragments, das kleine RFC Einheiten und große RFC Einheiten kodiert, verwendbar ist. Anschließend können durch Manipulationen, die zum Erhalten des Gens, das eines der oben erwähnten F1 bis F7 kodiert, mittels des Oligonukleotids angewendet werden, zum Beispiel ein Gen, das PFU-RFC kodiert, das ein Homolog der kleinen RFC Untereinheit ist, und ein Gen, das PFU-RFCLS kodiert, das ein Homolog der großen RFC Untereinheit ist, die jeweils von Pyrococcus furiosus stammen, erhalten werden.
Die Nukleotidsequenz des Gens, das das PFU-RFC kodiert, das wie oben erhalten wird, wird bestimmt und eine Aminosäuresequenz, die abgeleitet wird, um auf diese Weise kodiert zu werden, wird untersucht, und die Aminosäuresequenz wird mit der Aminosäuresequenz einer bekannten kleinen RFC Untereinheit verglichen. Als Ergebnis wird klar, dass eine dazwischen geschaltete Sequenz (Intein) in der Aminosäuresequenz vorhanden ist.
Eine Region, die dem Intein entspricht, wird aus dem Gen eliminiert, wodurch ein Gen, das PFU-RFC in einem exprimierbaren Zustand umfasst, erhalten werden kann. Die Nukleotidsequenz eines offenen Lese rahmens einer Region, die PFU-RFC im Gen kodiert, und die Aminosäuresequenz von PFU-RFC, das von der Nukleotidsequenz abgeleitet ist, sind in SEQ ID NO: 4 bzw. 3 im Sequenzprotokoll gezeigt. Darüber hinaus werden die Nukleotidsequenz eines offenen Leserahmens, der PFU-RFCLS im PFU-RFCLS Gen kodiert, und die dadurch kodierte Aminosäuresequenz des Proteins in SEQ ID NO: 63 bzw. 64 im Sequenzprotokoll gezeigt. Beide Proteine sind auch eines der konkreten Beispiele des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung.
Weiter kann ein für die Expression von PFU-RFC zu verwendendes Plasmid durch Verwendung des Gens konstruiert werden. Ein solches Expressionsplasmid umfasst das Plasmid pRFS254SNc. Darüber hinaus wird eine Transformante von Escherichia coli JM109, in den das Plasmid eingeführt wird, als Escherichia coli JM109/pRFS254SNc bezeichnet und identifiziert und ist seit dem 3. Juni 1997 (Datum der ursprünglichen Hinterlegung) unter der Hinterlegungsnummer FERM BP-6339 beim Nationalen Institut für Biowissenschaft und Humantechnologie, Agentur für Arbeitswissenschaft und Technologie, Ministerium für Internationalen Handel und Gewerbe, dessen Adresse 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken (Postleitzahl 305-8566), Japan, nach dem Budapester Vertrag hinterlegt. PFU-RFC kann durch Kultivieren der Transformante und Sammeln aus der sich ergebenden Kultur erhalten werden. Im Hinblick auf PFU-RFC wird beobachtet, dass das PFU-RFC eine Aktivität einer DNA Polymerase steigert, wenn es alleine verwendet wird, und dass bei Verwendung in Kombination mit dem obigen F7 das PFU-RFC synergistische Wirkungen beim Steigern von Wirkungen im Vergleich zu einem Fall zeigt, in dem jedes Protein allein zugesetzt wird.
Darüber hinaus wird eine Transformante, die aus dem Einführen sowohl des PFU-RFC Gens als auch des PFU-RFCLS Gens resultiert, her gestellt, wodurch ein Komplex, der mit PFU-RFC und PFU-RFCLS gebildet wird (nachfolgend als „holo-RFC" bezeichnet; insbesondere wird durch Gentechnik erzeugtes holo-RFC als „rRFC-M Komplex" bezeichnet), exprimiert werden kann. Der Komplex kann eine Aktivität einer DNA Polymerase steigern, die insbesondere bei Verwendung in Kombination mit dem oben erwähnten F7 große Wirkungen zeigt.
Es kann dem obigen PFU-RFC und PFU-RFCLS weiter ermöglicht werden, eine DNA Polymeraseaktivität durch Verwendung eines Gemischs mit F7 zu steigern. In diesem Fall kann ein Gemisch eines holo-RFC (oder rRFC-M Komplexes) mit F7 verwendet werden, oder es kann ein Komplex, der durch PFU-RFC, PFU-RFCLS und F7 (RFC-N Komplex) gebildet ist, verwendet werden.
Wie oben erläutert, stellt die vorliegende Erfindung einen DNA polymerase-assoziierten Faktor, der in der Lage ist, die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase zu steigern, und ein den Faktor kodierendes Gen zur Verfügung. Der Faktor kann durch Gentechnik unter Verwendung des Gens erzeugt werden. Weiter kann ein Gen, das ein Protein mit einer äquivalenten Funktion mit dem DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodiert, durch Verwendung des Gens auch für gentechnische Verfahren erhalten werden.
Der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung umfasst ein bekanntes Protein, das an der DNA Synthesereaktion, wie oben beschrieben, beteiligt ist. Beispiele für solche bekannten Proteine umfassen solche, die homolog zu Proteinen, wie beispielsweise PCNA und RFC, sind, welche von Eukaryoten stammen. Diese Proteine, wie beispielsweise PCNA und RFC, sollen einen Komplex bilden, der an der DNA Synthesereaktion mit der DNA Polymerase δ beteiligt sein soll [Journal of Biochemistry, 68, 1542-1548 (1996)]. Allerdings ist der in der vorliegenden Erfindung offenbarte DNA polymerase-assoziierte Faktor in der Lage, eine Aktivität einer DNA Polymerase nicht nur mit dem Komplex sondern auch mit einzelnen Faktoren als solchen zu steigern. Weiterhin zeigt der Faktor eine Wirkung auf eine DNA Polymerase, die sich strukturell von der DNA Polymerase δ unterscheidet.
Die vorliegende Erfindung kann in verschiedenen Verfahren, die eine DNA Polymerase verwenden, einschließlich zum Beispiel die Nukleotidsequenzierung für DNA, DNA Markierung, DNA Amplifikation durch PCR und dergleichen, verwendet werden. Der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung wird einem Reaktionssystem für eine DNA Polymerase zugesetzt, wodurch insbesondere eine Verbesserung einer Aktivität einer Extension des DNA Strangs vom Primer gezeigt wird. Da der Faktor eine hohe Thermostabilität aufweist, kann er darüber hinaus für eine PCR verwendet werden, insbesondere für eine PCR, bei der eine Amplifikation einer langkettigen DNA wünschenswert ist.
Weiter können unter den DNA polymerase-assoziierten Faktoren der vorliegenden Erfindung diejenigen, die eine Aktivität zur Bindung an eine DNA Polymerase aufweisen, zur Detektion, Reinigung und dergleichen der DNA Polymerase verwendet werden. Zum Beispiel kann der Faktor wirksam die gebundene DNA Polymerase reinigen, indem sie einer Affinitätschromatographie mittels eines Trägers unterworfen wird, an den der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung gebunden ist.
3. Verfahren zum Erzeugen eines DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung
Eines der Merkmale des Verfahrens zum Erzeugen eines DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass das Verfahren das Kultivieren einer Transformanten umfasst, die das Gen der vorliegenden Erfindung enthält, sowie das Sammeln eines thermostabilen DNA polymerase-assoziierten Faktors aus dem Kulturmedium, der die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase steigern oder eine Bindungsaktivität an eine DNA Polymerase besitzen kann.
Bei dem Verfahren zur Herstellung eines DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung kann ein generell verwendetes Verfahren zum Reinigen von Proteinen angewendet werden. Zum Beispiel wird eine DNA, die den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodiert, an einen Expressionsvektor ligiert, wodurch eine Überexpression unter der Kontrolle eines Promotors des Expressionsvektors stattfindet. Darüber hinaus kann der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung leicht aus einer Transformante gesammelt werden, die das Gen der vorliegenden Erfindung enthält, und zwar durch ein Verfahren, umfassend das Ligieren einer DNA, die den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodiert, an eine DNA, die ein Protein, wie beispielsweise Glutathionreduktase und β-Galactosidase kodiert, oder an eine DNA, die ein Histidin-Tag kodiert, um als Fusionsprotein exprimiert zu werden. Das oben erwähnte Fusionsprotein kann leicht durch Verwendung einer üblicherweise verwendeten Affinitätssäulenchromatographie, wie beispielsweise einer Nickelsäule, isoliert werden. Bei dem oben erwähnten Fusionsprotein kann der DNA polymerase-assoziierte Faktor von einem Protein, wie beispielsweise Glutathionreduktase oder β-Galactosidase durch ein herkömmliches Verfahren getrennt werden.
Darüber hinaus kann der exprimierte DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung auf dieselbe Weise wie das Verfahren zum Erhalten des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung von Pyrococcus furiosus erhalten werden, wobei das Verfahren das Immobilisieren einer DNA Polymerase, wie beispielswei se Pfu Polymerase C, an einen geeigneten Träger, das Mischen des DNA polymerase-immobilisierten Trägers mit einer den DNA polymerase-assoziierten Faktor enthaltenden Probe, das Entfernen derjenigen, die nicht an den Träger gebunden haben, und das Eluieren des daran gebundenen umfasst.
4. Verfahren der DNA Synthese
Eines der großen Merkmale des Verfahrens der DNA Synthese der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass eine DNA mittels einer DNA Polymerase in Gegenwart des oben erwähnten DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung synthetisiert wird. Bei dem Verfahren der DNA Synthese der vorliegenden Erfindung wird eine DNA mittels einer DNA Polymerase in Gegenwart des DNA polymerase-assoziierten Faktors der vorliegenden Erfindung synthetisiert, wodurch eine langkettige DNA mit etwa 20 kb amplifiziert werden kann.
Der DNA polymerase-assoziierte Faktor, der beim DNA-Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung verwendbar ist, umfasst F1, F2, F3, F4, F5, F7, PFU-RFC, PFU-RFCLS und dergleichen. Beim DNA-Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung kann der DNA polymerase-assoziierte Faktor allein oder im Gemisch mit zwei oder mehr Arten verwendet werden. Bei dem DNA-Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung kann ein noch längeres DNA Fragment im Vergleich zur Länge des DNA Fragments, das beim herkömmlichen Verfahren der DNA Synthese erhalten wird, zum Beispiel mittels drei Arten der DNA polymerase-assoziierten Faktoren F7, PFU-RFC und PFU-RFCLS synthetisiert werden. Bei dem DNA-Syntheseverfahren der vorliegenden Erfindung können drei Arten der DNA polymerase-assoziierten Faktoren durch Mischen der drei Arten, die jeweils einzeln zugeführt werden, verwendet werden oder es können im Gemisch zwei Arten von F7 und holo-RFC, gebildet durch PFU-RFC und PFU-RFCLS (rRFC-M Komplex) verwendet werden. Weiter können drei Arten der DNA polymerase-assoziierten Faktoren als Komplex verwendet werden, der aus F7, PFU-RFC und PFU-RFCLS (RFC-N Komplex) gebildet ist.
Die beim Verfahren der DNA Synthese der vorliegenden Erfindung verwendete DNA Polymerase umfasst DNA Polymerasen, wie beispielsweise das von E. coli stammende pol I; und thermostabile DNA Polymerasen, wie beispielsweise von Thermus thermophilus stammende Tth DNA Polymerase, von Thermus aquaticus stammende Taq DNA Polymerase, und von Pyrococcus furiosus stammende Pfu DNA Polymerase.
Darüber hinaus kann beim Verfahren der DNA Synthese der vorliegenden Erfindung eine DNA mittels eines PCR Verfahrens unter Verwendung der oben erwähnten DNA Polymerase synthetisiert werden.
Bei dem Verfahren der DNA Synthese der vorliegenden Erfindung ist die Menge an DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung, die vorhanden sein soll, nicht sonderlich eingeschränkt, und es kann eine Menge, die zum Aufweisen einer Aktivität zum Steigern der Synthetisierungsaktivität der DNA Polymerase ausreicht, verwendet werden.
5. Kit, umfassend den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung
Der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung kann bei verschiedenen Reaktionen verwendet werden, bei denen eine DNA Polymerase benutzt wird. Daher wird der DNA polymerase-assoziierte Faktor der vorliegenden Erfindung an einen Kit angelagert, der für die in vitro DNA Synthese verwendbar ist, einschließlich zum Beispiel einen Kit für die Nukleotidsequenzierung der DNA durch das Didesoxy-Verfahren, einen Kit zum Markieren von DNA, einen PCR Kit, wodurch die Leistung jedes dieser Kits verbessert wird. Außer denjenigen, die die DNA Polymerase und den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung enthalten, kann der oben beschriebene Kit ein Reagenz umfassen, das für die Reaktion einer DNA Polymerase notwendig ist, wobei das Reagens zum Beispiel dNTP und MgCl₂ aufweist. Der DNA polymerase-assoziierte Faktor, der in dem Kit der vorliegenden Erfindung enthalten ist, umfasst F1, F2, F3, F4, F5, F7, PFU-RFC und PFU-RFCLS. Bei dem Kit der vorliegenden Erfindung kann der DNA polymerase-assoziierte Faktor allein oder im Gemisch mit zwei oder mehr Arten verwendet werden. Es ist bevorzugt, drei Arten des DNA polymerase-assoziierten Faktors F7, PFU-RFC und PFU-RFCLS zu verwenden. Jede der drei Arten der DNA polymerase-assoziierten Faktoren kann durch Mischen jedes der drei einzeln zugeführten Arten verwendet werden. Außerdem können im Gemisch von zwei Arten F7 und holo-RFC, das durch PFU-RFC und PFU-RFCLS (rRFC-M Komplex) gebildet wird, verwendet werden. Weiter können die drei Arten der DNA polymerase-assoziierten Faktoren als Komplex verwendet werden, der durch F7, PFU-RFC und PFU-RFCLS (RFC-N Komplex) gebildet wird. Die DNA Polymerase, die im Kit der vorliegenden Erfindung enthalten ist, umfasst auch die DNA Polymerasen, wie beispielsweise das von E. coli stammende pol I; und thermostabile DNA Polymerasen, wie beispielsweise die von Thermus thermophilus stammende Tth DNA Polymerase, die von Thermus aquaticus stammende Taq DNA Polymerase, die von Pyrococcus furiosus stammende Pfu DNA Polymerase. Bei dem Kit der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass der Kit eine thermostabile DNA Polymerase umfasst. Der Kit der vorliegenden Erfindung wird für das Verfahren der DNA Synthese verwendet, wodurch eine hochmolekulare DNA einfacher synthetisiert werden kann.
BEISPIELE
Die vorliegende Erfindung wird nachfolgend mittels der folgenden Beispiele beschrieben, aber die vorliegende Erfindung wird nicht auf diese Beispiele beschränkt.
Beispiel 1
(1) Herstellung von genomischer Pyrococcus furiosus DNA
Pyrococcus furiosus DSM3638 wurde auf die folgende Weise kultiviert.
Ein Medium mit einer Zusammensetzung, umfassend 1% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 1% lösliche Stärke, 3,5% Jamarin S Solid (hergestellt von Jamarin Laboratory), 0,5% Jamarin S Liquid (hergestellt von Jamarin Laboratory), 0,003% MgSO₄, 0,001% NaCl, 0,0001% FeSO₄·7H₂O, 0,0001% CoSO₄, 0,0001% CaCl₂·7H₂O, 0,0001 ZnSO₄, 0,1 ppm CuSO₄·5H₂O, 0,1 ppm KAl(SO₄)₂, 0,1 ppm H₃BO₃, 0,1 ppm Na₂MoO₄·2H₂O und 0,25 ppm NiCl₂·6H₂O wurde in eine 2-Liter Nährsubstratflasche gegeben und bei 120°C 20 Minuten lang sterilisiert. Nach deren Durchblasen mit Stickstoffgas zum Entfernen von gelöstem Sauerstoff wurde der obige Stamm in das sich ergebende Medium inokuliert. Danach wurde das Medium kultiviert, indem es bei 95°C 16 Stunden lang stehen gelassen wurde. Nach dem Beenden der Kultivierung wurden die Zellen mittels Zentrifugation geerntet.
Die geernteten Zellen wurden dann in 4 ml 0,05 M Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 25% Saccharose, suspendiert. Zu dieser Suspension wurden 0,8 ml Lysozym [5 mg/ml, 0,25 M Tris-HCl (pH 8,0)] und 2 ml 0,2 M EDTA zugegeben, und das sich ergebende Gemisch wurde bei 20°C 1 Stunde lang inkubiert. Danach wurde 24 ml einer SET-Lösung [150 mM NaCl, 1 mM EDTA und 20 mM Tris-HCl (pH 8,0)] zugesetzt und 4 ml 5% SDS und 400 μl Proteinase K (10 mg/ml) wurden weiter dem sich ergebenden Gemisch zugesetzt. Danach wurde das sich ergebende Gemisch bei 37°C 1 Stunde lang reagiert. Nach dem Abschluss der Reaktion wurden eine Phenol-Chloroform-Reaktion und eine anschließende Ethanolpräzipitation durchgeführt, um etwa 3,2 mg genomische DNA herzustellen.
(2) Herstellung einer Cosmid DNA Bibliothek
Vierhundert Mikrogramm der genomischen DNA von Pyrococcus furiosus DSM3638 wurde teilweise mit Sau3A1 verdaut und in 35 bis 50 kb Fraktionen durch ein Dichtegradientenultrazentrifugationsverfahren größenfraktioniert. Als Nächstes wurde 1 μg Dreifachhelix Cosmidvektor (hergestellt von Stratagene) mit XbaI verdaut und danach mittels einer alkalischen Phosphatase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) dephosphoryliert und weiter mit BamHI verdaut. Der sich ergebende behandelte Vektor wurde mit 140 μg der obigen 35 bis 50 kb DNA Fraktionen gemischt, und das Gemisch wurde einer Ligationsreaktion unterworfen. Das das genomische DNA Fragment von Pyrococcus furiosus tragende Cosmid wurde mittels eines in vitro Verpackungsverfahrens unter Verwendung des sich ergebenden Reaktionsgemischs und „GIGAPACK GOLD" (hergestellt von Stratagene) in lambda-Phagenpartikel gepackt, um eine Cosmid-Bibliothek zu erstellen. Anschließend wurde ein Abschnitt dieser Bibliothek in E. coli DH5αMCR (hergestellt von BRL) transduziert. Fünfhundert Klone wurden aus den sich ergebenden Transformanten ausgewählt und jeweils als Cosmidklon Nr. 1 bis Nr. 500 bezeichnet. Weiter wurde eine Cosmid DNA aus jedem dieser Klone hergestellt. Mehrere aus den sich ergebenden Cosmid DNAs wurden ausgewählt und mit einem Restriktionsenzym verdaut, um das Vorhandensein eines Inserts von geeigneter Größe nachzuweisen.
(3) Klonieren des Pfu Polymerase C Gens
Es wurde als Reaktionslösung 20 mM Tris-HCl (pH 7,7), 2 mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2 mg/ml aktivierte DNA, je 40 μm dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 60 nM [³H]-dTTP (hergestellt von Amersham) hergestellt. Zu 45 μl der Reaktionslösung wurde ein 1 μl Extrakt in 5 Klon Äquivalent (5 μl), das von jedem Klon der obigen Cosmid DNA Bibliothek stammte, gegeben, und das Gemisch wurde bei 75°C 15 Minuten lang reagiert. Danach wurde ein 40 μl Aliquot dieses Reaktionsgemischs dann auf DE Papier aufgetragen und mit 5% Na₂HPO₄ fünf Mal gewaschen. Die restliche Radioaktivität auf dem DE Papier wurde mittels Flüssig-Szintillationszähler bestimmt. Die primäre Bestimmung wurde mit einer Gruppe bestehend aus 5 Klonen durchgeführt. Die Gruppe, bei der gewisse Aktivitäten festgestellt wurde, wurde anschließend in jeweils einen Klon von den 5 Klonen getrennt und die sekundäre Bestimmung wurde dann durchgeführt. Da es bereits aus dem Hybridisierungstest mit dem Gen als Sonde bekannt war, dass diejenigen Klone in der Cosmid DNA Bibliothek, die ein bekanntes DNA Polymerasegen enthielten, die Klone Nr. 57, 154, 162 und 363 waren, wurden fünf Klone der Klone Nr. 41, 153, 264, 462 und 491 erhalten, die eine DNA Synthetisierungsaktivität besitzen, die sich von jenen Klonen unterscheidet.
Aus den obigen fünf Klonen wurden Cosmide isoliert, und jedes isolierte Cosmid wurde mit BamHI verdaut. Beim Prüfen der sich ergebenden elektrophoretischen Muster wurden mehrere beiderseits übliche Bande festgestellt, was besagt, dass die fünf Klone Regionen mit Überlappungen und leichten Verlagerungen wieder kombinieren. Auf der Grundlage dieses Befunds wurde die Restriktionsendonukleasekarte für die DNA Inserts in den Klonen Nr. 264 und 491 hergestellt. Auf der Basis der resultierenden Restriktionsendonukleasekarte wurden verschiedene DNA Fragmente mit einer Länge von 10 kbp oder so aus dem Cosmid, das vom Klon 264 oder 491 stammte, herausgeschnitten. Die Fragmente wurden dann in pTV118N oder pTV119N Vektor (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) subkloniert. Die Aktivität der thermostabilen DNA Polymerase wurde für die sich ergebende Transformante gemessen, die das erhaltene rekombinante Plasmid enthielt. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass ein Gen zum Erzeugen einer äußerst stabilen DNA Polymerase auf einem XbaI-XbaI Fragment von etwa 10 kbp vorhanden war. Ein Plasmid, das aus dem Einfügen des XbaI-XbaI Fragments in den pTV118N Vektor resultierte, wurde dann als Plasmid pFU1001 bezeichnet, und das Escherichia coli JM109, das mit dem Plasmid transformiert wurde, wurde als Escherichia coli JM109/pFU1001 bezeichnet (FERM BP-5579).
(4) Analyse des DNA polymerase-bildenden Proteins von Pfu Polymerase C
Das obige XbaI-XbaI Fragment, das das DNA Polymerasegen enthält, wurde wieder mit XbaI aus dem obigen Plasmid pFU1001 herausgeschnitten und die Enden mit einem DNA Glättungskit geglättet (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). Das Ergebnis wurde dann zum neuen pTV118N Vektor ligiert, zuvor mit SmaI linearisiert, um Plasmide zum Herstellen von Deletionsmutanten zu ergeben. Die sich ergebenden Plasmide wurden als pFU1002 bzw. pFU1003 gemäß den Ausrichtungen der Inserts bezeichnet. Deletionsmutanten wurden aus dem sequenziellen Deletieren von beiden Enden des DNA Inserts mittels dieser Plasmide hergestellt. Der Kilo-Sequenz-Deletionskit (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), der das Henikoff-Verfahren anwendet (Gene, 28, 351-359), wurde zur obigen Herstellung verwendet. Die verwendeten, 3'-überhängenden und 5'-überhängenden Restriktionsenzyme waren PstI bzw. XbaI. Die Nukleotidsequenz des Inserts wurde durch das Didesoxy-Verfahren mittels des BcaBEST Didesoxy-Sequenzierungskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit den verschiedenen Deletionsmutanten als Matrizen bestimmt. Die sich ergebende Nukleotidsequenz wurde analysiert und als Ergebnis wurden sechs offene Leserahmen (ORFs) gefunden. Die Aktivität der thermostabilen DNA Polymerase wurde mittels der obigen verschiedenen Deletionsmutanten bestimmt. Die Ergebnisse haben gezeigt, dass die Translationsprodukte von ORF3 und ORF4 wichtig zum Darstellen der DNA Polymeraseaktivität waren. Die Aminosäuresequenz von ORF3 ist in SEQ ID NO: 5 im Sequenzprotokoll gezeigt bzw. ist die Aminosäuresequenz in SEQ ID NO: 6 im Sequenzprotokoll gezeigt. Mit anderen Worten ist die Pfu Polymerase C ein Enzym, umfassend zwei Arten der DNA polymerase-bildenden Proteine mit Aminosäuresequenzen wie in SEQ ID NO: 5 bzw. SEQ ID NO: 6 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Beispiel 2
(1) Herstellung von Pfu Polymerase C
Das als Antigen verwendete Pfu Polymerase C wurde auf die folgende Weise hergestellt. Escherichia coli JM109/pFU1001 wurde in 2 Liter LB Medium (1,0% Trypton, 0,5% Hefeextrakt, 0,5% NaCl, pH 7,2), enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, kultiviert. Wenn die Trübheit der Kultur 0,6 in A₆₀₀ erreichte, wurde ein Induktor, Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG), zugesetzt, um eine Endkonzentration von 1 mM zu erhalten, und für weitere 16 Stunden kultiviert. Nach dem Ernten wurden die geernteten Zellen in 37 ml Sonikationspuffer [50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 2 mM PMSF (Phenylmethansuflonylfluorid)] suspendiert, und die Suspension wurde mit einer Ultraschall-Aufbrecheinrichtung behandelt. Der aus der Zentrifugation der aufgebrochenen Lösung bei 12.000 UpM über 10 Minuten resultierende Überstand wurde bei 80°C 15 Minuten lang wärmebehandelt. Danach wurde wieder eine Zentrifugation bei 12.000 UpM über 10 Minuten durchgeführt, und der Überstand wurde wiedergewonnen, um 33 ml eines wärmebehandelten Überstands zu ergeben. Anschließend wurde die obige Lösung 4-mal einer 2-stündigen Dialyse mit 2 Litern Puffer A [50 mM Kaliumphosphat, pH 6,5, 12 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin) als Dialysat unterworfen. Nach der Dialyse wurde 32 ml der Enzymlösung auf eine zuvor mit Puffer A äquilibrierte RESOURCE Q Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, und die aufgetragene Lösung wurde mittels des FPLC Systems (hergestellt von Pharmacia) chromatographiert. Die Elution wurde auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 m M NaCl durchgeführt. Eine Fraktion mit einer DNA Polymeraseaktivität wurde bei 340 mM NaCl eluiert.
Zehn Milliliter einer Enzymlösung, die durch Sammeln einer aktiven Fraktion erhalten wurde, wurde mittels Centriflow CF-50 (hergestellt von Grace Japan) konzentriert, und die konzentrierte Enzymlösung wurde dann einem Austausch mit Puffer A, enthaltend 150 mM NaCl, mit einer PD-10 Säule (hergestellt von Pharmacia) unterworfen, um 3,5 ml einer Enzymlösung zu ergeben. Die sich ergebende Enzymlösung wurde dann auf eine zuvor mit demselben Puffer äquilibrierte HiTrap Heparin Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen. Eine aktive, in einer Konzentration von 400 mM NaCl eluierte Fraktion wurde durch Elution mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 150 bis 650 mM NaCl mittels FPLC System erhalten. Fünf Milliliter dieser Fraktion wurde durch Ultrafiltration mittels Centricon-10 (hergestellt von Amicon) konzentriert, und 120 μl des sich ergebenden Konzentrats wurde auf eine Superose 6 Gelfiltrationssäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 75 mM NaCl und 2 mM 2-Mercaptoethanol, äquilibriert worden war, und die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt. Als Ergebnis wurde eine Fraktion mit einer DNA Polymeraseaktivität in Positionen eluiert, die den Verweilzeiten von 34,7 Minuten und 38,3 Minuten entsprachen. Die in der Position von 38,3 Minuten eluierte Fraktion wurde konzentriert, und das sich ergebende Konzentrat wurde als An tigen zur Herstellung eines polyklonalen anti-Pfu Polymerase C Antikörpers verwendet.
Im Übrigen wurde bei der Reinigung der obigen Pfu Polymerase C die Enzymaktivität auf die folgende Weise bestimmt. Eine aktivierte Kälberthymus DNA (hergestellt von Worthington) (aktivierte DNA) wurde als Substrat verwendet. Die Bestimmungen der DNA Aktivierung und DNA Polymeraseaktivität wurden mit dem Verfahren durchgeführt, das in DNA Polymerase from Escherichia coli, 263-276 (verfasst von C.C. Richardson), veröffentlicht von Harper & Row, herausgegeben von D.R. Davis beschrieben wurde. Zu 5 μl einer Probe, deren Aktivität bestimmt werden sollte, wurde 45 μl einer Reaktionslösung [20 mM Tris-HCl (pH 7,7), 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,2 mg/ml aktivierte DNA, je 40 μM dATP; dCTP, dGTP und dTTP, 60 nM [³H]-dTTP (hergestellt von Amersham)] zugegeben. Das sich ergebende Gemisch wurde bei 75°C 5 Minuten lang reagiert. Ein 40 μl Anteil dieses Reaktionsgemischs wurde dann auf DE Papier (hergestellt von Whatman) gegeben und 5-mal mit 5% Na₂HPO₄ gewaschen. Die restliche Radioaktivität auf dem DE Papier wurde mit einem Flüssigszintillationszähler bestimmt. Die Enzymmenge, die 10 nmol [³H]-dTMP pro 30 Minuten in die Substrat-DNA einführte, bestimmt durch das oben beschriebene Enzymaktivitätsbestimmungsverfahren, wurde als eine Enzymeinheit definiert.
(2) Herstellung von anti-Pfu Polymerase C Antikörper
Das obige Pfu Polymerase C Präparat wurde mit 50 mM Kaliumphosphat, pH 6,5, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl verdünnt, um so eine Konzentration von 1 mg/100 μl zu erhalten. Ein gleiches Volumen von Freunds komplettem Adjuvans wurde zugegeben, und das Gemisch wurde emulgiert. Die sich ergebende Emulsion wurde subkutan mit 50 μl pro Injektion 4-mal in 3-wöchigen Intervallen Kaninchen injiziert. Ganzes Blut wurde 10 Tage nach der abschließenden Immunisierung extrahiert, und das extrahierte Blut wurde 60 Minuten lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde das Blut zentrifugiert, um 60 ml Antiseren, enthaltend polyklonalen anti-Pfu Polymerase C Antikörper, zu ergeben. Zu 20 ml der Antiseren wurde 20 ml gesättigte Ammoniumsulfatlösung gegeben. Das Gemisch wurde 45 Minuten bei 4°C leicht gerührt und zentrifugiert. Das sich ergebende Präzipitat wurde in 5 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert und die Suspension wurde 3-mal einer 2-stündigen Dialyse mittels 2 Liter desselben Puffers als Dialysat unterworfen. Nach der Dialyse wurde 14 ml der Lösung auf eine zuvor mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibrierte Protein A Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, mit demselben Puffer gewaschen und dann mit 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 3,0) eluiert. Der eluierte polyklonale anti-Pfu Polymerase C Antikörper wurde mit 1 M Tris-HCl, pH 98,0, neutralisiert und mit Centriflow CF-50 konzentriert, und einem Austausch mit Kopplungspuffer (0,5 M NaCl, 0,2 M NaHCO₃, pH 8,3) mit einer PD-10 Säule (hergestellt von Pharmacia) unterworfen, um eine polyklonalen anti-Pfu Polymerase C Antikörper enthaltende Lösung herzustellen.
(3) Herstellung einer anti-Pfu Polymerase C Antikörper-Säule
Eine HiTrap NHS-aktivierte Säule (hergestellt von Pharmacia) wurde mit 6 ml 1 mM HCl gewaschen, und 0,9 ml der obigen polyklonalen anti-Pfu Polymerase C Antikörper-Lösung (enthaltend 3,6 mg Äquivalent des polyklonalen anti-Pfu Polymerase C Antikörpers) wurde dann auf eine HiTrap NHS-aktivierte Säule aufgetragen. Nach dem Stehen lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde die sich ergebende Säule mit 3 ml Kopplungspuffer gewaschen. Anschließend wurde die Säule nacheinander mit 6 ml Blockierungspuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 8,3, 0,5 M NaCl), 6 ml Puffer B (0,1 M Natriumacetat, pH 4,0, 0,5 M NaCl) und 6 ml Blockierungspuffer gewaschen, und das sich ergebende Gemisch wurde bei Raumtemperatur 30 Minuten lang stehengelassen. Weiter wurde die Säule mit 6 ml Puffer B, 6 ml Blockierungspuffer und 6 ml Puffer B gewaschen und danach wurde die Säule mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, äquilibriert, um eine anti-Pfu Polymerase C Antikörper-Säule herzustellen.
Beispiel 3
(1) Reinigung des Komplexes, umfassend Pfu Polymerase C mittels anti-Pfu Polymerase C Antikörper-Säule
Pyrococcus furiosus DSM3638 wurde in zwei Nährsubstratflaschen 16 Stunden lang auf dieselbe Weise wie das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren kultiviert. Nach dem Ernten wurden Zellen in 34,7 ml Puffer C (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 mM ATP), enthaltend 2 mM PMSF, suspendiert und die Suspension wurde mit einer Ultraschallaufbrecheinrichtung behandelt. Die aufgebrochene Lösung wurde bei 12.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, und 46 ml des erhaltenen Überstands wurde auf eine zuvor mit Puffer C äquilibrierte anti-Pfu Polymerase C Antikörper-Säule aufgetragen. Nachdem die Säule mit Puffer C gewaschen war, wurde der Komplex, umfassend Pfu Polymerase C, mit Elutionspuffer (0,1 M Glycin-HCl, pH 2,5, 1 mM ATP) eluiert. Nach der Neutralisation mit 1 M Tris-HCl, pH 9,0, wurde das Eluat mittels Centriflow CF-50 konzentriert, um ein Pfu Polymerase C Komplexkonzentrat zu erhalten.
(2) Analyse von Pfu Polymerase C Komplex
Das Pfu Polymerase C Komplexkonzentrat wurde einer SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamidgel; 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,4, verwendet als Elektrophoresepuffer) unterworfen. Das erhaltene Gel wurde durch Western Blotting mittels des anti-Pfu Poly merase C Antikörpers mit dem nachfolgend gezeigten Verfahren erhalten. Nach SDS-PAGE wurde das Gel in einen Blotting Puffer 1 (25 mM Tris-HCl, 20% Methanol, pH 9,4), enthaltend 40 mM 0-Amino-n-capronsäure, eingetaucht. Als Nächstes wurden in den Blotting Puffer 2 (0,3 M Tris-HCl, 20% Methanol, pH 10,4) eingetauchte Filterpapiere, in 25 mM Tris-HCl und 20% Methanol, pH 10,4, eingetauchte Filterpapiere, eine PVDF Membran, eingetaucht in den Blotting Puffer 1, enthaltend 40 mM 0-Amino-n-capronsäure, das obige Gel und Filterpapiere, eingetaucht in den Blotting Puffer 1, enthaltend 40 mM 0-Amino-n-capronsäure, auf einer halbtrockenen Blotting-Einrichtung (hergestellt von Scientific) überlagert, und das Blotting wurde bei 2 mA/cm² 1 Stunde lang durchgeführt. Diese PVDF Membran wurde in Block Ace (hergestellt von Snow Brand Milk Products Co., Ltd.) eingetaucht, enthaltend 0,01% Thimerosal, 10 Minuten geschüttelt und danach wurde die Membran in ein anti-Pfu Polymerase C Antiserum getaucht, das zuvor 1.000-fach mit Block Ace, enthaltend 0,01% Thimerosal, verdünnt worden war. Nach dem Stehen lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde die Membran dreimal 10 Minuten lang mit TBS Puffer (50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl), enthaltend 0,02% Tween-20 und weiter mit TBS Puffer, gewaschen. Die Membran wurde dann in einen zuvor 5.000-fach mit 0,01% Thimerosal enthaltenden Block Ace verdünnten Peroxidase-markierten anti-Kaninchen IgG (Fc) Antikörper (hergestellt von Organon-Technica) getaucht. Nach dem Stehen lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde die PVDF Membran dreimal für 10 Minuten mit TBS Puffer, enthaltend 0,02% Tween-20, und weiter mit TBS Puffer gewaschen. Danach wurde die Membran in Konica Immunostain HRP-1000 (hergestellt von Konica Corporation) eingetaucht, um eine Farbentwicklung zu ermöglichen. Aus den Färbeergebnissen des Gels nach der SDS-PAGE mit Coomassie Brilliant blau R-250, in der 1 gezeigt, und den Ergebnissen des oben erwähnten Western Blotting, war klar, dass die obige komplexe Fraktion sieben Proteinarten (F1 bis F7 in 1) enthielt, die mit dem anti-Pfu Polymerase C Antikörper reaktionsunfähig waren.
Da die Bande, die mit dem anti-Pfu Polymerase C Antikörper reaktionsunfähig waren, als Proteine betrachtet werden, die an die Säule über Pfu Polymerase C adsorbiert sind, wurden die N-terminalen Aminosäuresequenzen dieser Proteine durch das nachfolgend beschriebene Verfahren analysiert. Das Pfu Polymerase C Komplex-Konzentrat, das in Beispiel 3(1) erhalten wurde, wurde einer SDS-PAGE unterworfen und auf eine PVDF Membran auf dieselbe Weise wie oben geblottet. Nachdem diese Membran mit Coomassie Brilliant blau R-250 gefärbt worden war, wurden die gewünschten Bande herausgeschnitten. Die N-terminalen Aminosäuresequenzen der gewünschten Proteine wurden durch automatische Edman-Zersetzung mit G1000A Protein Sequencer (hergestellt von Hewlett-Packard Company) unter Verwendung dieser Membranfragmente als Proben bestimmt. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 1 gezeigt. Die erhaltenen N-terminalen Aminosäuresequenzen, F1 bis F5 und F7, sind in SEQ ID NO: 7 bis 12 im Sequenzprotokoll gezeigt. Tabelle 1
Beispiel 4
Herstellung von Kassetten DNAs
Zehn Mikrogramm der in Beispiel 1 hergestellten, genomischen Pyrococcus furiosus DNA wurde vollständig mit EcoRI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und 500 ng Äquivalent des Verdaus wurde mit 50 ng EcoRI Kassette (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemischt und anschließend ligiert. Die DNA, die aus dem Ligationsreaktionsgemisch für die Ligation durch Ethanolpräzipitation gewonnen wurde, wurde in 20 μl sterilisiertem Wasser gelöst, und diese Lösung wurde als EcoRI Kassetten DNA für die anschließenden Verfahren verwendet.
Mittels ähnlicher Verfahren wie den oben beschriebenen wurden Kassetten DNAs, die jeweils mit der HindIII Kassette, XbaI Kassette, SalI Kassette, PstI Kassette und Sau3AI Kassette (alle von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) ligiert wurden, hergestellt. Bei Ligation mit der XbaI Kassette wurde genomische DNA verwendet, die mit zwei Enzymen, d.h. XbaI und NheI, verdaut war, und jede der erhaltenen DNAs wurde als XbaI Kassetten DNA bzw. NheI/XbaI Kassetten DNA bezeichnet. Bei Ligation mit der SalI Kassette wurde genomische DNA, die mit den beiden Enzymen SalI und XhoI verdaut war, verwendet und jede der erhaltenen DNAs wurde als SalI Kassetten DNA bzw. XhoI/SalI Kassetten DNA bezeichnet. Bei Ligation mit der Sau3AI Kassette wurde genomische DNA, die mit BglII verdaut war, verwendet, und die erhaltene DNA wurde als BglII/Sau3AI Kassetten DNA bezeichnet.
Beispiel 5
(1) Auswahl von Cosmidklonen, die das F1 Gen tragen
Auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz des in Beispiel 3 erhaltenen F1 wurden die Primer F1-1 und F1-2 synthetisiert, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 13 bzw. 14 im Sequenzprotokoll gezeigt sind. Zuerst wurde eine PCR mittels je 100 pmol F1-1 und Kassettenprimer C1 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit 1 μl der EcoRI Kassetten DNA, hergestellt im Beispiel 4, als Matrize durchgeführt. Zweitens wurde eine PCR mit je 100 pmol F1-2 und Kassettenprimer C2 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit 1 μl des sich ergebenden, wie oben erhaltenen Reaktionsgemischs als Matrize durchgeführt. Für die beiden PCRs wurde eine Pfu DNA Polymerase (Enzym vom Typ α, hergestellt von STRATAGENE) verwendet. Die Reaktionsgemischzusammensetzung und die Reaktionsbedingungen sind nachfolgend gezeigt: Das Reaktionsgemisch umfasst 20 mM Tris-HCl, pH 8,2, 10 mM KCl, 20 mM MgCl₂, 6 mM (NH₄)₂SO₄, jeweils 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP, 1% Triton X-100, 0,01% BSA und 2,5 Einheiten Pfu DNA Polymerase (Endvolumen 100 μl), und die Reaktion wurde in 30 Zyklen für die erste PCR und in 25 Zyklen für die zweite PCR durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 45°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Die PCR, die die in den nachfolgenden Beispielen verwendete Pfu DNA Polymerase verwendet, wurde auch mittels derselben Reaktionsgemischzusammensetzung durchgeführt. Ein amplifiziertes DNA Fragment von etwa 550 bp wurde in den Plasmidvektor pUC119 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) subkloniert, und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Danach wurden auf der Grundlage der bestimmten Sequenz die Primer F1S1 und F.S2, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 15 bzw. 16 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, dann synthetisiert. Die PCR wurde mittels dieser F1S1 und F1S2 mit der im Beispiel 1 erwähnten Cosmid DNA als Matrize durchgeführt, wodurch das F1 Gen tragende Cosmidklone ausgewählt wurden. Diese PCR wur de mittels des TaKaRa PCR Amplifikationskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß den beigefügten Anweisungen durchgeführt. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Cosmidklone Nr. 22, 46, 61, 133, 178, 180, 210 und 317 das F1 Gen tragen.
(2) Subklonieren des F1 Gens
Die PCR wurde unter Verwendung von jeweils 20 pmol F1S1 und Kassettenprimer C2 oder F1S2 und Kassettenprimer C2 mit 1 μl der im Beispiel 4 hergestellten HindIII Kassetten DNA als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde mit derselben Reaktionsgemischzusammensetzung, wie die in Beispiel 5(1) verwendete, mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 50 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (3 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde ein DNA Fragment von 570 bp durch F1S2 und Kassettenprimer C2 amplifiziert, während durch F1S1 und Kassettenprimer C2 keine DNA amplifiziert wurde. Dieser Befund ließ erwarten, dass die HindIII Stelle sich direkt stromaufwärts vom Initiationskodon für das F1 Gen und in einem Abstand von der Anlagerungsstelle von F1S1 befindet, so dass die DNA nicht durch die Pfu DNA Polymerase amplifiziert werden kann. Auf dieser Grundlage wurde der Cosmidklon Nr. 61, der willkürlich aus den das F1 Gen tragenden Cosmidklonen ausgewählt wurde, mit HindIII verdaut und die DNA Fragmente von nicht unter 1,5 kb wurden isoliert und jeder wurde in den Plasmidvektor pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) kloniert. Die PCR wurde mittels F1S1 und F1S2 als Primer mit jedem erhaltenen rekombinant Plasmid als Matrize durchgeführt, um das Vorhandensein des F1 Gens zu untersuchen. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass ein HindIII Fragment von etwa 2 kb das F1 Gen trägt. Ein Plasmid, bei dem das F1 Gen in diesem DNA Fragment stromabwärts vom lac Promotor von pTV118N Vektor ligiert wurde, wurde als pF1-4-10 bezeichnet. Was die in diesem Plasmid enthaltenen DNA Inserts an betrifft, wurde eine Restriktionsendonukleasekarte für NcoI, EcoRI, BamHI, PstI, SacI und NdeI hergestellt. Es wurden die Ergebnisse wie in der 2 gezeigt erhalten.
(3) Bestimmung der Nukleotidsequenz des das F1 Gen tragenden DNA Fragments
Es wurde durch das Didesoxy-Verfahren die Nukleotidsequenz des DNA Inserts im Plasmid pF1-4-10 und jedes Plasmid bestimmt, das durch Herausschneiden der NcoI-HindIII, EcoRI-EcoRI, BamHI-PstI, EcoRI-HindIII, HindIII-EcoRI und HindIII-BamHI Fragmente aus dem Plasmid und Subklonieren jedes der sich ergebenden Fragmente in den Plasmidvektor pTV119N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) erhalten wurde. Eine Sequenz von 2.009 bp in den Nukleotidsequenzen des DNA Inserts in pF1-4-10, vollständig auf der Grundlage dieser miteinander kombinierten Ergebnisse bestimmt, ist wie in SEQ ID NO: 17 im Sequenzprotokoll gezeigt. Als Ergebnis der Analyse der Nukleotidsequenz wurde ein offener Leserahmen enthüllt, der die N-terminale Aminosäuresequenz von F1 umfasst. Die obige Sequenz ist in SEQ ID NO: 18 im Sequenzprotokoll gezeigt bzw. die Aminosäuresequenz des F1 Translationsprodukts, wie aus der obigen Sequenz abgeleitet, ist in SEQ ID NO: 19 im Sequenzprotokoll gezeigt. Diese Aminosäuresequenz wurde auf Homologie zu den Aminosäuresequenzen von bekannten Proteinen hin untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass sie homolog zu der von Haemophilus influenzae stammenden, einzelsträngigen DNA-spezifischen Exonuklease [Science, 269, 496-512 (1995)] ist. Die Homologie betrug 23,2% für die erste Hälfte und 24,3% für die letzte Hälfte.
(4) Konstruktion des Plasmids für die F1 Expression
Die PCR wurde mittels des Primers F1Nc, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 20 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, und des obigen Primers F1S2 mit dem im Beispiel 5(2) beschriebenen Plasmid pF1-4-10 als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie die im Beispiel 5(1) verwendete mittels Pfu DNA Polymerase durchgeführt. Unter Verwendung von 1 ng Matrizen DNA und jeweils 20 pmol der beiden Primer wurde die Reaktion in 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Ein Fragment, das durch Verdau eines amplifizierten DNA Fragments von etwa 460 Basenpaaren mit NocI und BglIII (beide von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt), und ein DNA Fragment, das durch Verdau des obigen Plasmids pF1-4-10 mit BglII und HindIII erhalten wurde, wurden zusammen zwischen die NcoI und HindIII Stellen des Plasmidvektors pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) eingeführt. Dieses Plasmid wurde als pF1Nc-2 bezeichnet. Es wurde in Bezug auf das DNA Insert im Plasmid durch das Didesoxy-Verfahren nachgewiesen, dass in der PCR-amplifizierten Region die Nukleotidsequenz keine durch PCR hervorgerufene Mutation hat.
(5) Herstellung der gereinigten authentischen F1 Probe
Escherichia coli JM109/pF1Nc2, Escherichia coli JM109, das mit dem im Beispiel 5(4) erhaltenen Plasmid pF1Nc-2 transformiert wurde, wurde 16 Stunden lang in 2 Liter LB Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, kultiviert. Nach dem Ernten der Zellen wurden 33 ml eines wärmebehandelten Überstands auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2(1) erhalten. Als Nächstes wurde diese Lösung auf eine RESOURCE Q Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit Puffer D (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin) äquilibriert worden war, und die aufgetragene Lösung wurde mittels FPLC System (hergestellt von Pharmacia) chromatographiert. Die Elution wurde auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM NaCl durchgeführt. F1 wurde mit 340 mM NaCl eluiert.
Nachdem 10 ml der durch Sammeln der F1 Fraktion erhaltenen Enzymlösung mittels Centriflow CF50 konzentriert wurde, wurde das sich ergebende Konzentrat einem Austausch mit Puffer D mittels PD-10 Säule (hergestellt von Pharmacia) unterworfen, und 3,5 ml der Lösung wurde auf eine HiTrap Blue Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit demselben Puffer äquilibriert worden war. Mittels des FPLC Systems wurde die Säule mit Puffer D gewaschen, und danach wurde F1 mit 2 M NaCl enthaltendem Puffer D eluiert. Fünf Milliliter dieser Fraktion wurde mittels Centricon-10 konzentriert, und 120 μl des Konzentrats wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, zuvor mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, äquilibriert, enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl. Die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt und als Ergebnis wurde F1 in einer Position eluiert, die einem Molekulargewicht von etwa 49 Kilodalton entspricht. Dieses Molekulargewicht entspricht dem Fall, in dem F1 als Monomer vorhanden ist.
(6) Bestimmung der Exonukleaseaktivität
Die 5' → 3' und 3' → 5' Exonukleaseaktivitäten der gereinigten authentischen F1 Probe wurden auf die folgende Weise untersucht.
Zuerst wurde der Plasmidvektor pUC119 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit SspI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut und einer Agarosegelelektrophorese unterworfen, und ein DNA Fragment von 386 bp wurde aus dem Gel gewonnen und gereinigt. Dieses DNA Fragment wurde am 5'-Terminus mittels [γ-³²P]-ATP (hergestellt von Amersham) und Polynukleotidkinase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) markiert, und das erhaltene, ³²P-markierte DNA Fragment wurde als Substrat zum Feststellen der 5' → 3' Exonukleaseaktivität verwendet. Darüber hinaus wurde der Plasmidvektor pUC119 mit Sau3AI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) verdaut, und ein erhaltenes DNA Fragment von 341 bp wurde gewonnen und auf dieselbe Weise wie oben gereinigt. Weiterhin wurde dieses DNA Fragment am 3'-Terminus durch eine Einfüllreaktion mittels [α-³²P]-dCTP (hergestellt von Amersham) und Klenow Fragment (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) ³²P-markiert, um ein Substrat zum Feststellen der 3' → 5' Exonukleaseaktivität zu ergeben. Die obigen zwei Arten von markierten DNAs wurden durch Gelfiltration mittels NICK Säule (hergestellt von Pharmacia) gereinigt und für die nachfolgend beschriebene Reaktion verwendet.
Zehn Mikroliter eines Reaktionsgemischs (20 mM Tris-HCl, pH 7,7, 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol), enthaltend jeweils 2 ng dieser markierten DNA Fragmente und 12,5 μg von Verdau, erhalten durch vollständiges Verdauen von λ-DNA (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit HaeIII (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), und die oben gereinigte authentische F1 Probe wurden hergestellt und bei 85°C 2,5, 5 oder 7,5 Minuten lang reagiert und danach wurde eine Ethanolpräzipitation durchgeführt, um die DNA zu präzipitieren. Durch Bestimmen der Radioaktivität in diesem Überstand mittels eines Flüssigszintillationszählers wurde die durch die Exonukleaseaktivität zersetzte Substratmenge bestimmt. Zur Bestimmung der 5' → 3' Exonukleaseaktivität wurde 50 fmol gereinigte authentische F1 Probe zugesetzt und zur Bestimmung der 3' → 5' Exonukleaseaktivität wurde 125 pmol der gereinigten authentischen F1 Probe zugesetzt. Diese Ergebnisse sind in den 3 bzw. 4 gezeigt.
Die 3 zeigt die Ergebnisse zur Bestimmung der 5' → 3' Exonukleaseaktivität und die 4 zeigt die Ergebnisse zur Bestimmung der 3' → 5' Exonuklease. In den Figuren zeigt die Abszisse die Reakti onszeit und die Ordinate zeigt das Verhältnis der im Überstand freigesetzten Radioaktivität zu der im ganzen Reaktionsgemisch enthaltenen. Darüber hinaus zeigen in den Figuren schwarze Kreise die Ergebnisse, die mit der gereinigten authentischen F1 Probe der vorliegenden Erfindung erhalten werden und die weißen Kreise zeigen eine Leerreaktion [blank reaction] ohne Zugabe der gereinigten authentischen F1 Probe. Wie in den Figuren gezeigt, besitzt die gereinigte authentische F1 Probe der vorliegenden Erfindung sowohl 5' → 3' als auch 3' → 5' Exonukleaseaktivitäten. Außerdem wurde aus den obigen Ergebnissen gezeigt, dass die 5' → 3' Exonukleaseaktivität etwa 500-mal größer als die 3' → 5' Exonukleaseaktivität ist.
Beispiel 6
(1) Auswahl der das F2 Gen tragenden Cosmidklone
Auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz des im Beispiel 3 erhaltenen F2 wurden die Primer F2-2 und F2-3, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 21 bzw. 22 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Zuerst wurde die PCR mittels 100 pmol des Primers F2-2 und 20 pmol des Kassettenprimers C1 mit 1 μl der im Beispiel 4 hergestellten XbaI Kassetten DNA als Matrize durchgeführt. Zweitens wurde eine PCR mittels 100 pmol des Primers F2-3 und 20 pmol des Kassettenprimers C2 mit 1 μl des sich ergebenden, wie oben erhaltenen Reaktionsgemischs als Matrize durchgeführt. Für die beiden PCRs wurde Pfu Polymerase C verwendet. Die Reaktionsgemischzusammensetzung und die Reaktionsbedingungen sind nachfolgend gezeigt: Das Reaktionsgemisch umfasst 10 mM Tris-HCl, pH 9,2, 75 mM KCl, 3,5 mM MgCl₂, jeweils 0,4 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 0,1% Triton X-100, 0,1% BSA und 2,0 Einheiten von Pfu Polymerase C (Endvolumen 100 μl), und die Reaktion wurde in 30 Zyklen für die erste PCR und 25 Zyklen für die zweite PCR durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 45°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Ein amplifiziertes DNA Fragment von etwa 250 bp wurde in den Plasmidvektor pUC119 subkloniert, und seine DNA Sequenz wurde bestimmt. Auf der Grundlage der bestimmten Sequenz wurden die Primer F2S3 und F2S4, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 23 bzw. 24 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Die PCR wurde mittels dieser Primer mit der im Beispiel 1 hergestellten Cosmid DNA als Matrize durchgeführt, wodurch das F2 Gen tragende Cosmidklone ausgewählt wurden. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels der Pfu DNA Polymerase als Enzym und je 20 pmol der Primer in 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass das Cosmidklon Nr. 172 das F2 Gen trägt.
(2) Subklonieren des F2 Gens
Die PCR wurde jeweils mittels 20 pmol F2S3 und Kassettenprimer C2 oder F2S4 und Kassettenprimer C2 als Primer mit jeweils 1 μl NheI/XbaI und XhoI/SalI Kassetten DNAs des Beispiels 4 als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie die im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 50 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (3 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde jedes der amplifizierten DNA Fragmente von etwa 700 bp und von etwa 1.400 bp für die NheI/XbaI bzw. XhoI/SalI Kassetten DNAs mittels des Primerpaars F2S3 und des Kassettenprimers C2 amplifiziert, während durch das Primerpaar F2S3 und den Kassettenprimer C2 keine DNA amplifiziert wurde. Dieser Befund ließ erwarten, dass sich die NheI und XhoI Stellen im Abstand von der Anlagerungsposition des F2S4 Primers, der mit der Pfu DNA Polymerase nicht amplifizierbar ist, befinden.
Auf dieser Grundlage wurden die verschiedenen, durch Verdau von Nr. 172 mit NheI erhaltenen DNA Fragmente herausgeschnitten und jeder wurde in den Plasmidvektor pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) subkloniert. Die PCR wurde mittels F2S3 und F2S4 als Primer mit jedem rekombinanten, erhaltenen Plasmid als Matrize durchgeführt, um zu untersuchen, ob das F2 Gen vorhanden ist oder nicht. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass ein NheI Fragment von etwa 8 kb das F2 Gen trägt. Ein Plasmid, das aus der Einfügung dieses NheI Fragment in pTV118N resultiert, wurde als Plasmid pF2172Nh bezeichnet. Darüber hinaus wurde eine Restriktionsendonukleasekarte für das DNA Insert in diesem Plasmid hergestellt. Es wurden die in der 5 gezeigten Ergebnisse erhalten.
Auf der Basis der in der 5 gezeigten Restriktionsendonukleasekarte wurde das Plasmid pF2172Nh mit HindIII verdaut, und ein HindIII Fragment von etwa 1,5 kb wurde herausgeschnitten und jedes wurde in den Plasmidvektor pTV118N subkloniert. Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde auf die Insertausrichtung des F2 Gens hin untersucht, und es wurde festgestellt, dass das F2 Gen in der umgekehrten Orientierung im Hinblick auf die lac Promotoren von allen Vektoren eingeführt wurde. Dieses Plasmid wurde als pF2172H16 bezeichnet. Escherichia coli JM109/pF2172H16, Escherichia coli JM109, die mit diesem Plasmid transformiert waren, wurden auf F2 Expression hin untersucht, und es wurde festgestellt, dass sie nicht stark exprimiert waren. Auf dieser Grundlage wurde, um das F2 Gen in der orthodoxen Ausrichtung für den Vektor zu ligieren, pF2172H16 mit HindIII und EcoRI verdaut und das herausgeschnittene HindIII-EcoRI Fragment wurde an den Plasmidvektor pTV119Nd ligiert (diejenigen, die aus der Substitution der NcoI Stelle mit NdeI im Plasmidvektor pTV119N resultierten, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). Das erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pF2172HE11 bezeichnet, und Escherichia coli JM109, die mit diesem Plasmid transformiert war, wurde als Escherichia coli JM109/pF2172HE11 bezeichnet.
(3) Herstellung einer authentischen F2 Probe
Das in Beispiel 6(2) erhaltene Escherichia coli JM109/pF2172HE11 wurde in 2 Liter LB Medium, enthaltend 1 mM IPTG und 100 μg/ml Ampicillin, wurde 16 Stunden lang kultiviert. Nach dem Ernten wurden die Zellen in 23,4 ml Sonikationspuffer suspendiert, und 19,5 ml eines wärmebehandelten Überstands wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2(1) erhalten. Als Nächstes wurde diese Lösung auf eine zuvor mit Puffer D äquilibrierte RESOURCE Q Säule aufgetragen, und die aufgetragene Lösung wurde mittels FPLC System chromatographiert. F2 strömte durch die RESOURCE Q Säule.
Zweiundzwanzig Milliliter der Durchströmungs-F2 Fraktion wurde auf eine RESOURCE S Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit Puffer D äquilibriert worden war. Mittels des FPLC Systems wurde die Elution auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM NaCl durchgeführt, und eine F2 Fraktion wurde mit 170 mM NaCl eluiert. Diese Fraktion wurde mittels Centricon-10 konzentriert, und 75 μl des erhaltenen Konzentrats wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Tris-HCl Puffer (pH 8,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibriert worden war. Die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt, und als Ergebnis wurde F2 in einer Position eluiert, die einem Molekulargewicht von etwa 120 Kilodalton oder etwa 45 Kilodalton entspricht. Dieses Molekulargewicht entspricht dem Fall, in dem F2 ein Hexamer oder Dimer gebildet hat.
(4) Bestimmung der Nukleotidsequenz eines F2 Gen tragenden DNA Fragments
Die Nukleotidsequenz des DNA Inserts im obigen Plasmid pF2172HE11 wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Eine Sequenz von 957 bp der bestimmten Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 25 im Sequenzprotokoll gezeigt. Als Ergebnis der Analyse der Nukleotidsequenz wurde ein offener Leserahmen mit der N-terminalen Aminosäuresequenz von F2 gefunden. Die Nukleotidsequenz dieses offenen Leserahmens ist in SEQ ID NO: 26 im Sequenzprotokoll gezeigt bzw. ist die Aminosäuresequenz des F2 Translationsprodukts, wie von der Nukleotidsequenz abgeleitet, in SEQ ID NO: 27 im Sequenzprotokoll gezeigt. Diese Aminosäuresequenz wurde auf Homologie zu den Aminosäuresequenzen von bekannten Proteinen hin untersucht, und als Ergebnis wurden die homologen Proteine nicht gefunden.
Beispiel 7
(1) Auswahl der das F4 Gen tragenden Cosmidklone
Auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz des im Beispiel 3 erhaltenen F4 wurden die Primer F4-1 und F4-2, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 28 bzw. 29 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Zuerst wurde eine PCR mittels 100 pmol Primer F4-1 und 20 pmol Kassettenprimer C1 mit 1 μl HindIII Kassetten DNA von Beispiel 4 als Matrize durchgeführt. Zweitens wurde eine PCR mittels F4-2 und Kassettenprimer C2 mit 1 μl Reaktionsgemisch als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 30 Zyklen für die erste PCR und 25 Zyklen für die zweite PCR durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 45°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minu ten) stattfindet. Ein amplifiziertes DNA Fragment von etwa 1.100 bp wurde durch diese Reaktion in den Plasmidvektor pUC119 subkloniert, und ein Teil seiner Nukleotidsequenz wurde durch das Didesoxy-Verfahren mittels M4 und RV Primern (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) bestimmt. Auf der Basis der bestimmten Sequenz wurden dann die Primer F4S1 und F4S2, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 30 bzw. 31 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Die PCR wurde mittels dieser F4S1 und F4S2 Primer mit der im Beispiel 1 hergestellten Cosmid DNA als Matrize durchgeführt, wodurch Cosmidklone, die das F4 Gen tragenn ausgewählt wurden. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (1 Minute) stattfindet. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Cosmidklone Nr. 16, 26, 88, 112, 250, 269, 427 und 451 das F4 Gen tragen.
(2) Subklonieren des F4 Gens
Es wurde eine PCR mittels je 20 pmol F4S2 und Kassettenprimer C2 mit 1 μl XbaI Kassetten DNA von Beispiel 4 als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 50 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (3 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde ein DNA Fragment von etwa 700 bp mit F4S2 und Kassettenprimer C2 amplifiziert. Außerdem wurde eine PCR unter denselben Bedingungen mittels F4-2 und Kassettenprimer C2 mit der HindIII Kassetten DNA als Matrize durchgeführt. Als Ergebnis wurde ein DNA Fragment von etwa 1.110 bp amplifiziert. Diese Befunde haben nahe gelegt, dass das F4 Gen in einem XbaI-HindIII Fragment von etwa 1,6 kb vorhanden ist. Auf dieser Grundlage wurde Cosmid Nr. 16 mit XbaI und HindIII verdaut, und ein DNA Fragment von etwa 1,6 kb wurde herausgeschnitten und jedes in den pTV118N Vektor subkloniert. Es wurde eine PCR mittels der F4S1 und F4S2 Primer mit jedem rekombinanten erhaltenen Plasmid als Matrize durchgeführt, um das Vorhandensein des F4 Gens zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein Plasmid erhalten, das ein das F4 Gen tragendes, 1,6 kb XbaI-HindIII Fragment enthält, und dieses Plasmid wurde als Plasmid pF4-1-4 bezeichnet. Außerdem wurde dieses Plasmid mit den Restriktionsenzymen NcoI, EcoRI, BamHI, PstI, SacI und NdeI verdaut. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass keine dieser Stellen im obigen Plasmid oder DNA Insert vorhanden war.
(3) Bestimmung der Nukleotidsequenz des das F4 Gen tragenden DNA Fragments
Die Nukleotidsequenz des DNA Inserts im obigen Plasmid pF4-1-4 wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt.
Eine Sequenz von 1.012 bp der bestimmten Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 32 im Sequenzprotokoll gezeigt. Als Ergebnis der Analyse der Nukleotidsequenz wurde ein offener Leserahmen mit der N-terminalen Aminosäuresequenz von F4 festgestellt. Die Nukleotidsequenz dieses offenen Leserahmens ist in SEQ ID NO: 33 im Sequenzprotokoll gezeigt, bzw. ist die Aminosäuresequenz des F4 Translationsprodukts, wie von der Nukleotidsequenz abgeleitet, in SEQ ID NO: 34 im Sequenzprotokoll gezeigt. Diese Aminosäuresequenz wurde auf Homologie zu den Aminosäuresequenzen von bekannten Proteinen hin untersucht und als Ergebnis wurden die homologen Proteine nicht festgestellt.
(4) Plasmidkonstruktion für die F4 Expression
Es wurde eine PCR in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mit Pfu DNA Polymerase mittels des Primers F4NNd, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 35 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, und des Primers F4CEc, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 36 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, mit dem im Beispiel 7(3) beschriebenen Plasmid pF4-1-4 als Matrize durchgeführt. Die Reaktionsbedingungen sind nachfolgend gezeigt. Mittels 1 ng Matrizen DNA und je 20 pmol der beiden Primer wurde die Reaktion in 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Ein amplifiziertes DNA Fragment von etwa 450 bp wurde mit NdeI und EcoRI (beide von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) verdaut, und das erhaltene DNA Fragment wurde zwischen den NdeI und EcoRI Stellen des oben erwähnten Plasmidvektors pTV119Nd eingeführt, um das Plasmid pF4Nd-6 herzustellen. Weiterhin wurde die Nukleotidsequenz des DNA Inserts im Plasmid durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Es wurde nachgewiesen, dass es keine durch die PCR hervorgerufene Mutation gibt.
(5) Herstellung einer gereinigten authentischen F4 Probe
Escherichia coli JM109/p4Nd-6, Escherichia coli JM109, das mit dem im Beispiel 7(4) erhaltenen Plasmid pF4Nd-6 transformiert war, wurde 16 Stunden lang in 2 Liter LB Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, kultiviert. Nach dem Ernten wurden Zellen in 33,4 ml Sonikationspuffer suspendiert und 28 ml eines wärmebehandelten Überstands wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2(1) erhalten. Als Nächstes wurde diese Lösung auf eine zuvor mit Puffer D äquilibrierte RESOURCE Q Säule aufgetragen, und die aufgetragene Lösung wurde mittels FPLC System chromatographiert. Die Elution wurde auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM NaCl durchgeführt. F4 wurde in einer Konzentration von 325 mM NaCl eluiert.
Drei Milliliter der durch Sammeln der F4 Fraktion erhaltenen Lösung wurde einem Austausch mit Puffer D, enthaltend 150 mM NaCl, mittels PD-10 Säule unterworfen, und 6,9 ml der Lösung wurde auf eine HiTrap Heparin-Säule aufgetragen, die zuvor mit demselben Puffer äquilibriert worden war. F4 wurde nicht an die HiTrap Heparin-Säule adsorbiert und (NH₄)₂SO₄ wurde zu 7,2 ml der durch die Säule strömenden F4 Fraktion zugesetzt, um so eine Endkonzentration von 1 M zu erhalten. Diese Lösung wurde auf eine HiTrap Phenyl-Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit Puffer D, enthaltend 1 M (NH₄)₂SO₄ äquilibriert worden war. Mittels des FPLC Systems wurde die Säule jeweils mit 1 M und 0,5 M (NH₄)₂SO₄ gewaschen und danach wurde F4 mit Puffer D eluiert. Fünf Milliliter dieser Fraktion wurde mittels Centricon-10 konzentriert und 76 μl des erhaltenen Konzentrats wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Tris-HCl Puffer, pH 8,0, enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibriert worden war. Als Ergebnis der Elution mit demselben Puffer wurde F4 in einer Position eluiert, die einem Molekulargewicht von etwa 39 Kilodalton entsprach. Dieses Molekulargewicht entspricht dem Fall, in dem F4 ein Dimer oder Trimer gebildet hat.
Beispiel 8
(1) Auswahl der das F7 Gen tragenden Cosmidklone
Auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz des im Beispiel 3 erhaltenen F7 wurden die Primer F7-1 und F7-2, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 37 bzw. 38 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Zuerst wurde eine PCR mittels 100 pmol F7-1 und 20 pmol Kassettenprimer C1 mit 1 μl der im Beispiel 4 hergestellten HindIII Kassetten DNA als Matrize durchgeführt. Zweitens wurde eine PCR mittels 100 pmol Primer F7-2 und 20 pmol Kassettenprimer C2 mit 1 μl des wie oben erhaltenen Reaktionsgemischs als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde mittels desselben Reaktionsgemischzusammensetzung und Reaktionsbedingungen wie der im Beispiel 6(1) verwendeten durchgeführt. Ein amplifiziertes DNA Fragment von etwa 830 bp wurde in den Plasmidvektor pUC119 subkloniert, und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Auf der Basis der bestimmten Sequenz wurden dann die Primer F7S1 und F7S2, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 39 bzw. 40 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Die PCR wurde mittels dieser Primer mit der im Beispiel 1 beschriebenen Cosmid DNA als Matrize durchgeführt, wodurch die das F7 Gen tragenden Cosmidklone ausgewählt wurden. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (3 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde festgestellt, das die Cosmidklone Nr. 15, 96, 114, 167, 277, 348, 386, 400, 419, 456, 457 und 484 das F7 Gen tragen.
(2) Subklonieren des F7 Gens
Es wurde eine PCR mittels je 20 pmol F7S2 und Kassettenprimer C2 mit 1 μl der im Beispiel 4 beschriebenen HindIII Kassetten DNA als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie die im Beispiel 5(1) verwendete mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 50 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (3 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde ein Fragment von etwa 900 bp amplifiziert. Aus diesem Ergebnis wurde zusammen mit dem Ergebnis der Amplifikation mittels F7-2 von Beispiel 8(1) und Kassettenprimer C2 auf das Vorhandensein des F7 Gens in einem HindIII Fragment von etwa 1,0 kb geschlossen. Auf dieser Grundlage wurde Nr. 15, das willkürlich von den das Gen tragenden Cosmiden ausgewählt wurde, mit HindIII verdaut und ein DNA Fragment von etwa 1,0 kb wurde herausgeschnitten und jedes in den Plasmidvektor pTV118N subkloniert. Die PCR wurde mittels der F7S1 und F7S2 Primer mit jedem erhaltenen rekombinanten Plasmid als Matrize durchgeführt, um auf das Vorhandensein des F7 Gens hin zu untersuchen und als Ergebnis wurde festgestellt das ein HindII Fragment von 1 kb das F7 Gen trägt. Ein Plasmid, bei dem das F7 Gen in diesem DNA Fragment stromabwärts vom lac Promotor des pTV118N Vektors ligiert wurde, wurde als pF7-HH-18 bezeichnet, und ein Plasmid, bei dem das F7 Gen in der entgegengesetzten Richtung ligiert wurde, wurde als pF7-1-8 bezeichnet. Außerdem wurde eine Restriktionsendonukleasekarte für das in diesem Plasmid enthaltenen DNA Insert hergestellt, und die in der 6 gezeigte Karte wurde erhalten.
(3) Bestimmung der Nukleotidsequenz eines das F7 Gen tragenden DNA Fragments
Es wurde durch das Didesoxy-Verfahren die Nukleotidsequenz jedes Inserts in den obigen zwei Plasmidarten bestimmt, wobei jedes Insert in den Plasmiden durch Herausschneiden der BamHI-HindIII, NdeI-HindIII, HindIII-NdeI und HindIII-BamHI Fragmente aus den obigen zwei Plasmidarten und Subklonieren der Fragmente in den Plasmidvektor pTV119Nd hergestellt wurde. Eine Sequenz von 989 bp der Nukleotidsequenz des DNA Inserts des obigen Plasmids, bestimmt auf der Basis dieser ganzen Ergebnisse, ist in SEQ ID NO: 41 im Sequenzprotokoll gezeigt. Als Ergebnis der Analyse der Nukleotidsequenz wurde ein offener Leserahmen gefunden, der die N-terminale Aminosäuresequenz von F7 enthielt. Die Nukleotidsequenz dieses offenen Leserahmens ist in SEQ ID NO: 2 im Sequenzprotokoll gezeigt, und die Aminosäuresequenz des F7 Translationsprodukts, wie von der Nukleotidsequenz abgeleitet, ist in SEQ ID NO: 1 im Sequenzprotokoll gezeigt. Diese Ami nosäuresequenz wurde auf Homologie zu den Aminosäuresequenzen von bekannten Proteinen hin untersucht und als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Aminosäuresequenz homolog zu dem proliferierenden Zellkernantigen war (PCNA), das an der DNA Replikation in Eukaryoten beteiligt ist [EMBO J., 11 5111-5120 (1995); Nucleic Acids Research, 18, 261-265 (1990); Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 1575-1579 (1987)]. Die Homologie zu den in den einzelnen Literaturstellen beschriebenen Proteinen betrug 24, 28 bzw. 24%.
(4) Herstellung einer gereinigten authentischen F7 Probe
Escherichia coli JM109/pF7-HH-18, Escherichia coli JM109, das mit dem im Beispiel 8(2) erhaltenen Plasmid pF7-HH-18 transformiert wurde, wurde 16 Stunden lang in 2 Liter LB Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, kultiviert. Nach dem Ernten wurden die Zellen in 45 ml Sonikationspuffer suspendiert und 41,9 ml eines wärmebehandelten Überstands wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2(1) erhalten. Als Nächstes wurde diese Lösung dreimal einer 2-stündigen Dialyse gegen 2 Liter Puffer A als Dialysat unterworfen. Nach der Dialyse wurde 36 ml der Enzymlösung auf eine zuvor mit Puffer A äquilibrierte RESOURCE Q Säule aufgetragen, und die aufgetragene Lösung wurde mittels FPLC System chromatographiert. Die Elution wurde auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM NaCl durchgeführt. Als Ergebnis wurde F7 bei 340 mM NaCl eluiert.
Zehn Milliliter der durch Sammeln der F7 Fraktion erhaltenen Lösung wurde mittels Centriflow CF-50 konzentriert und danach einem Austausch mit Puffer A, enthaltend 1 M (NH₄)₂SO₄, mittels PD-10 Säule unterworfen, und 3,5 ml der erhaltenen Lösung wurde auf eine zuvor mit demselben Puffer äquilibrierte HiTrap Phenyl-Säule aufgebracht. Mittels des FPLC Systems wurde die Säule der Reihe nach mit 1 M und 0,5 M (NH₄)₂SO₄ gewaschen und danach wurde F7 mit Puffer A eluiert.
Vier Milliliter dieser Fraktion wurde mittels Centricon-10 konzentriert, und 80 μl dieses Konzentrats wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 6,5), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibriert worden war. Als Ergebnis der Elution mit demselben Puffer wurde F7 in einer Position eluiert, die einem Molekulargewicht von etwa 99 Kilodalton entspricht. Dieses Molekulargewicht entspricht dem Fall, in dem F7 ein Trimer gebildet hat.
(5) Wirkungen von F7 auf die Primerextensionsreaktionen
Um auf die Wirkungen von F7 auf die Primerextensionsreaktionen gegenüber verschiedene Polymerasen hin zu untersuchen, wurden die Aktivitäten von Pfu Polymerase C, Pfu DNA Polymerase (DNA Polymerase vom Typ α, hergestellt von STRATAGENE) und Pyrodictium occultum-stammenden Poc DNA Polymerasen I und II [Poc DNA Polymerasen I und II, J. Bacteriol., 177, 2164-2177 (1995)] im Hinblick auf das Vorhandensein oder Fehlen der F7 Zugabe verglichen.
Die Bestimmung der DNA Polymeraseaktivitäten wurden mit Bezug auf die im Beispiel 2(1) beschriebene Pfu Polymerase C Aktivitätsbestimmung durchgeführt. Das verwendete Substrat bestand aus den Konstrukten (M13-HT Primer), wie durch Anlagerung des HT Primers, eines synthetischen Oligonukleotids mit 45 Basen, an die einzelsträngige M13 Phagen DNA (M13mp18 ssDNA, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) hergestellt. Die Nukleotidsequenz des HT Primers ist in SEQ ID NO: 42 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Es wurde konkret ein Reaktionsgemisch [20 mM Tris-HCl, pH 7,7, 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 0,01 μg/μl M13-HT Primer, je 40 μM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 60 nM [³H]-dTTP (hergestellt von Amersham)], das ein Endvolumen von 50 μl aufwies und jeweils die in der Tabelle 2 gelistete DNA Polymerase und F7 enthielt, hergestellt und bei 75°C 5 Minuten lang reagiert. Nachdem das Reaktionsgemisch zum Beenden der Reaktion mit Eis gekühlt worden war, wurde ein 40 μl Anteil auf DE Papier (hergestellt von Whatman) gegeben und 5-mal mit 5% Na₂HPO₄ gewaschen, und danach wurde die verbleibende Radioaktivität auf dem DE Papier mittels eines Flüssigszintillationszählers bestimmt.
Wie in der Tabelle 2 gezeigt wurde für alle verwendeten DNA Polymerasen aufgrund der Zugabe von F7 ein Anstieg der DNA Polymeraseaktivität beobachtet. Tabelle 2

Bemerkung: In der Tabelle ist die Pfu Polymerase C-Menge die Proteinmenge, umfassend je ein Molekül der beiden DNA polymerase-bildenden Proteinen, und die Menge an F7 ist die Menge als Trimer-Protein.

Die Primerausdehnungsaktivität wurde weiter ausführlich untersucht. Der M13-HT Primer, der zuvor am 5'-Terminus des Primers mittels [γ-³²P]-ATP (hergestellt von Amersham) und T4 Polynukleotidkinase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) markiert worden war, wurde als Substrat verwendet.
Eine 1 μl Probenlösung, enthaltend jede der folgenden Proben, wurde hergestellt: 1) 18 fmol Pfu Polymerase C, 2) 18 fmol Pfu Polymerase C + 2 pmol F7, 3) 0,24 pmol Pfu DNA Polymerase, 4) 0,24 pmol Pfu DNA Polymerase + 0,78 pmol F7. Zu jeder Probenlösung wurde 9 μl eines Reaktionsgemischs [20 mM Tris-HCl (pH 9,0), 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol, je 40 μM dATP, dGTP, dCTP und dTTP], enthaltend 0,01 μg/μl ³²P-markierter M13-HT Primer, zugesetzt, und eine Reaktion wurde bei 75°C 2,5 Minuten oder 5 Minuten lang durchgeführt. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit Eis gekühlt, um die Reaktion zu beenden, und 1 μl 200 mM EDTA und 5,5 μl Reaktionsstopplösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenol blau, 0,05% Xylolcyanol) wurde zugesetzt, und die thermische Denaturierungsbehandlung wurde bei 95°C 5 Minuten lang durchgeführt. Nachdem 1,6 μl dieses Reaktionsgemischs mittels 6% Polyacrylamidgel, enthaltend 8 M Harnstoff, elektrophoresiert worden war, wurde ein Autoradiogramm erstellt. Das erhaltene Autoradiogramm ist in 7 gezeigt.
In der Figur zeigen Pfu-C und pfu die Ergebnisse, die mit Pfu Polymerase C bzw. Pfu DNA Polymerase erhalten wurden, und 2,5 und 5 zeigen die jeweiligen Reaktionszeiten (Minuten). Darüber hinaus veran schaulichen in der Figur die Symbole – und + die mit dem Reaktionsgemisch bei Fehlen bzw. Vorhandensein von F7 erhaltenen Ergebnisse. Weiter zeigen die Spuren an beiden Enden der Figur die Ergebnisse der Elektrophorese von λ-EcoT14I Verdau (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), zuvor markiert am 5'-Terminus mittels [γ-³²P]-ATP (hergestellt von Amersham) und T4 Polynukleotidkinase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), und sie wurden zum Ableiten der Längen der Extensionsprodukte verwendet.
Wie in der 7 gezeigt, sind, wenn F7 nicht zugesetzt wird, in der Pfu Polymerase C die DNAs von etwa 300 bis 600 Basen die wichtigsten erhaltenen Extensionsprodukte, während bei Zugabe von F7 die Extensionsprodukte mit niedriger Kettenlänge reduziert werden und das Extensionsproduktverhältnis über 1.000 Basen steigt. Außerdem wurde bei der Pfu DNA Polymerase die Kettenlänge der Extensionsprodukte deutlich durch Zugabe von F7 erweitert. Es war daher klar, dass F7 die Primerextensionsraten sowohl von Pfu Polymerase C als auch Pfu DNA Polymerase erhöht.
Als Nächstes wurden, um die Primerextensionsreaktionsprodukte mit höheren Molekulargewichten zu analysieren, die Primerextensionsreaktionsprodukte von Pfu Polymerase C und Pfu DNA Polymerase mit dem ³²P-markierten M13-HT Primer als Substrat mittels alkalischer Agarosegelelektrophorese analysiert. Zu 1 μl einer Lösung von jeder der obigen Proben 1) bis 4) wurde 9 μl Reaktionsgemisch (20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol, je 40 μM dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 84 nM [α-³²P]-dCTP) zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0,01 μg/μl M13-HT Primer zu erhalten, und eine Reaktion wurde bei 75°C 2,5 Minuten lang durchgeführt. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde zu dem eisgekühlten Reaktionsgemisch 1,11 μl 200 mM EDTA, 1,23 μl 500 mM NaOH und 2,47 μl 6-facher konzentrierte Beladungspuffer (0,125% Bromphenol blau, 0,125% Xylolcya nol, 9% Glycerin) nacheinander zugesetzt. Nachdem 6 μl dieses Gemischs mittels 0,5% alkalischem Agarosegel elektrophoresiert worden war, wurde ein Autoradiogramm erstellt. Das erhaltene Autoradiogramm ist in der 8 gezeigt.
In der Figur zeigen Pfu-C und pfu die Ergebnisse, die mit Pfu Polymerase C bzw. Pfu DNA Polymerase erhalten werden, und in der Figur veranschaulichen die Symbole – und + die Ergebnisse, die ohne bzw. mit Zugabe von F7 erhalten werden. Weiter steht in der Figur die Spur M für den λ-EcoT14I Verdau, der zuvor an einem Ende auf dieselbe Weise wie oben markiert worden war. Wie in der 8 gezeigt ist, wurde im Fall von Pfu Polymerase C ein schwaches Extensionsproduktsignal nahe 2,5 kb bei Fehlen von F7 beobachtet, während ein 7,3 kb Signal, das vollständig M13 ssDNA umgab, bei Vorhandensein von F7 beobachtet wurde. Darüber hinaus wurde im Fall von Pfu DNA Polymerase ein Signal nahe 2,7 kb bei Vorhandensein von F7 beobachtet, während bei Fehlen von F7 kein Signal beobachtet wurde. Diese Befunde zeigen, dass F7 die Extensionsreaktionen der beiden DNA Polymerasen steigern.
Beispiel 9
(1) Auswahl von Cosmidklonen, die ein Gen tragen, das Homologe von kleinen RFC Untereinheiten kodiert
Im Hinblick auf die Aminosäuresequenz der kleinen RFC Einheit von Methanococcus jannaschii [Science, 273, 1058-1073 (1996)] wurde die Homologie zu den Aminosäuresequenzen von kleinen RFC (RF-C) Untereinheiten, die von anderen Organismen stammten, untersucht. Auf der Basis der Aminosäuresequenzen der dazwischen stark konservierten Regionen wurden die Primer RF-F1, RF-F3, RF-F4, RF-R1, RF-R2-RF-R3 und RF-R4 zum Suchen nach dem die kleine RFC Einheit kodie renden Gen synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen dieser Primer sind in SEQ ID NO: 43 bzw. 49 im Sequenzprotokoll gezeigt. Die PCR wurde mittels verschiedener Kombinationen dieser Primer mit genomischer Pyrococcus furiosus DNA als Matrize durchgeführt, um das die kleine RFC Untereinheit kodierende Gen zu suchen. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch mit derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase und mittels 0,25 μg Matrizen DNA und 100 pmol von jedem Primer durchgeführt. Wenn die erste PCR mittels RF-F1 und RF-R4 durchgeführt wurde, wurde die zweite PCR mittels RF-F4 und RF-R4 oder RF-F1 und RF-R1 mit 1 μl des Reaktionsgemischs als Matrize durchgeführt. Wenn die erste PCR mittels RF-F1 und RF-R3 durchgeführt wurde, wurde die zweite PCR mittels RF-F3 und RF-R2 mit 1 μl Reaktionsgemisch als Matrize durchgeführt. Amplifizierte DNA Fragmente von etwa 240 bp, etwa 140 bp bzw. etwa 140 bp wurden erhalten. Jedes dieser DNA Fragmente wurde in den Plasmidvektor pUC119 subkloniert und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Auf der Basis der bestimmten Sequenzen wurden dann die Primer RF-S1, RF-S2, RF-S3, RF-S4 und RF-S5, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 50 bis 54 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Die PCR wurde mittels dieser RF-S1 und RF-S3 Primer mit der im Beispiel 1 hergestellten Cosmid DNA als Matrize durchgeführt, um so die Cosmidklone, die wahrscheinlich das die Homologe der kleinen RFC Untereinheit kodierende Gen tragen, auszuwählen. Die PCR wurde mittels des TaKaRa PCR Amplifikationskits in 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Cosmidklone Nr. 254, 310, 313, 377 und 458 das gewünschte Gen (PFU-RFC Gen) tragen.
(2) Subklonieren des PFU-RFC Gens
Die PCR wurde mittels 100 pmol RF-S1 und 20 pmol Kassettenprimer C2 oder 100 pmol RF-S2 und 20 pmol Kassettenprimer C2 mit je 1 μg im Beispiel 4 hergestellten XbaI und EcoI Kassetten DNAs als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 6(1) verwendeten mittels Pfu Polymerase C Enzym in 50 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (3 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde ein DNA Fragment von etwa 2 kb durch RF-S1 und Kassettenprimer C2 amplifiziert, wenn die XbaI Kassette als Matrize verwendet wurde, und ein DNA Fragment von etwa 1,5 kb wurde durch RF-S2 und Kassettenprimer C2 amplifiziert, wenn die EcoRI Kassette als Matrize verwendet wurde. Jede dieser DNA Fragmente wurde in den Plasmidvektor pUC119 subkloniert, und die erhaltenen rekombinanten Plasmide wurden als pRFSXS1-26 und pRFSES2-8 bezeichnet. Die Restriktionsendonukleasekarten dieser Plasmide wurden hergestellt und als Ergebnis wurde klar, dass weder die NdeI noch die BamHI Stelle im PFU-RFC Gen vorhanden ist.
Die Cosmide der fünf in (1) oben erwähnten Klone wurden jeweils mit NdeI und BamHI verdaut, und die elektrophoretischen Muster wurden untersucht. Als Ergebnis wurde eine gemeinsame Bande nahe 5 kg beobachtet. Unter der Annahme, dass das PFU-RFC Gen in diesem DNA Fragment vorhanden war, wurde ein NdeI-BamHI Fragment von etwa 5 kb aus dem Klon Nr. 254 herausgeschnitten, und jeder in den oben erwähnten pTV119Nd Vektor subkloniert. Eine mit dem erhaltenen rekombinanten Plasmid gebildete Transformante wurde auf das Vorhandensein des PFU-RFC Gens mittels PCR unter Verwendung der RF-S1 und RF-S3 Primer untersucht. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass dieses NdeI-BamHI Fragment das PFU-RFC Gen trägt. Daher wurde das aus dem Einfügen dieses NdeI-BamHI Fragments in den pTV119Nd Vektor resultierende Plasmid als Plasmid pRFS254NdB bezeichnet. Darüber hinaus wurde eine Restriktionsendonukleasekarte dieses Plasmids hergestellt und es wurde die wie in der 9 gezeigte Karte erhalten.
Auf der Basis der in der 9 gezeigten Restriktionsendonukleasekarte wurden verschiedene Fragmente aus pRFS254NdB mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren herausgeschnitten und jedes wurde in den pTV118N Vektor (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd) subkloniert. Zuerst wurde ein DNA Fragment von etwa 500 bp, erhalten durch Verdau von pRFS254NdB mit XbaI und SacI, ein DNA Fragment von etwa 2 kb, erhalten durch Verdau mit XbaI und NcoI, bzw. ein DNA Fragment von etwa 1,1 kb, erhalten durch Verdau mit NcoI und BamHI, hergestellt und jedes wurde mit zuvor mit SAcI und BamHI linearisiertem pTV118N zur Ligation gemischt, um so ein rekombinantes Plasmid zukonstruieren. Dieses Plasmid wurde als pRFS254SXNB bezeichnet.
(3) Bestimmung der Nukleotidsequenz des das PFU-RFC Gen tragenden DNA Fragments
Die Nukleotidsequenz des DNA Inserts im im Beispiel 9(2) erhaltenen Plasmid pRFS254NdB wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Eine Sequenz von 3.620 Basenpaaren der bestimmten Nukleotidsequenz ist in SEQ ID NO: 55 im Sequenzprotokoll gezeigt. Die Aminosäuresequenz des durch diese Nukleotidsequenz kodierten Proteins wurde abgeleitet. Als Ergebnis eines Vergleichs dieser Aminosäuresequenz mit denen der bekannten kleinen RFC Untereinheiten wurde das Vorhandensein von einem Intein in der Aminosäuresequenz von PFU-RFC vorweggenommen. Dieses Intein wird durch Nr. 721 bis 2295 von SEQ ID NO: 55 im Sequenzprotokoll kodiert.
(4) Konstruktion des Intein-eliminierten PFU-RFC Expressionsplasmids
Auf der Basis der im Beispiel 9(3) bestimmten Nukleotidsequenz und der Aminosäuresequenz einer bekannten kleinen RFC Untereinheit und der Nukleotidsequenz des die Untereinheit kodierenden Gens wurden die Primer RF-CBΔI und RF-CAΔI, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 56 und 57 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Es wurde eine inverse PCR mittels dieser beiden Primer, von denen jeder 5'-Terminus zuvor phosphoryliert worden war, mit den obigen Plasmiden pRFS254SXNB als Matrize durchgeführt. Für die inverse PCR wurde der TaKaRa EX Taq verwendet, um 100 μl eines Reaktionsgemischs gemäß den Anweisungen für das Enzym herzustellen. Zu diesem Reaktionsgemisch, dem 15 ng Plasmid pRFS254SXNB und je 20 pmol der Primer zugesetzt wurde, wurde die Reaktion in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (3 Minuten) stattfindet. Ein amplifiziertes DNA Fragment, das durch die inverse PCR erhalten wurde, wurde mittels eines DNA Glättungskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) an den Enden geglättet und danach einer Selbstligation unterworfen, um so ein Plasmid zu konstruieren, das als Plasmid pRFS254ISΔI bezeichnet wurde.
Weiterhin wurde ein XbaI-NcoI Fragment von etwa 400 bp, das nach dem Verdau des Plasmids mit XbaI und NcoI isoliert wurde, mit einem XbaI-SacI Fragment von etwa 500 bp und einem NcoI-BamHI Fragment von etwa 1,1 kb gemischt, jeweils vom im Beispiel 9(2) erhaltenen Plasmid pRFS254NdB isoliert, und die gemischten Fragmente wurden zwischen die BamHI und SacI Stellen des Plasmidvektors pTV118N subkloniert. Das wie oben beschrieben erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pRFS254SNc bezeichnet. Das mit dem Plasmid transformierte Escherichia coli JM109 wurde als Escherichia coli JM109/pRFS24SNc bezeichnet. Es wurde festgestellt, dass die Transformante PFU-RFC auf hohem Niveau exprimiert.
(5) Bestimmung der Nukleotidsequenz eines Gens, kodierend PFU-RFC, ohne Intein zu tragen
Ein vom im Beispiel 9(4) erhaltenen Plasmid pRFS254SXNB stammendes XbaI-NocI Fragment von etwa 400 bp wurde in den Plasmidvektor pTV118N subkloniert, und die Nukleotidsequenz des DNA Inserts wurde bestimmt, um so die den Randbereich des eliminierten Inteins kodierende Nukleotidsequenz nachzuweisen. Aus diesem Ergebnis und den Ergebnissen von Beispiel 9(3) wurde die Nukleotidsequenz des Gens, kodierend PFU-RFC, ohne Intein zu tragen, bestimmt. Die Nukleotidsequenz des offenen Leserahmens, kodierend PFU-RFC, ohne Intein zu tragen, erhalten wie oben beschrieben, und die von der Nukleotidsequenz stammende PFU-RFC Aminosäuresequenz sind in SEQ ID NO. 4 bzw. 3 im Sequenzprotokoll gezeigt.
(6) Herstellung einer gereinigten authentischen PFU-RFC Probe
Escherichia coli JM109/pRFS254Nc, das in Beispiel 9(4) erhalten wurde, wurde 16 Stunden lang in 2 Liter LB Medium, enthaltend 100 μg/ml Ampicillin, kultiviert. Nach dem Ernten wurden Zellen in 44,1 ml Sonikationspuffer suspendiert und 35,2 ml eines wärmebehandelten Überstands wurde auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2(1) erhalten. Als Nächstes wurde diese Lösung auf eine zuvor mit Puffer D äquilibrierte RESOURCE Q Säule aufgetragen, und die aufgetragene Lösung wurde mittels FPLC System chromatographiert. PFU-RFC wurde durch die RESOURCE Q Säule strömen gelassen.
Fünfunddreißig Milliliter der durchströmenden PFU-RFC Fraktion wurde auf eine zuvor mit Puffer D äquilibrierte RESOURCE S Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen. Mittels des FPLC Systems wurde die Elution auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM NaCl durchgeführt, um eine mit 170 mM NaCl eluierte PFU-RFC Fraktion zu erzeugen. 2,9 ml dieser Fraktion wurde mittels Centricon-10 konzentriert und 105 μl des erhaltenen Konzentrats wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Tris-HCl Puffer, pH 8,0, enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibriert worden war. Die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt, und als Ergebnis wurde PFU-RFC in einer Position eluiert, die einem Molekulargewicht von etwa 150 Kilodalton entspricht. Dieses Molekulargewicht entspricht dem Fall, in dem PFU-RFC ein Tetramer gebildet hat.
(7) Wirkungen von PFU-RFC auf die Primerextensionsreaktion
Die Wirkungen von PFU-RFC und F7 auf die Primerextensionsreaktion durch Pfu Polymerase C wurden auf dieselbe Weise wie im Beispiel 8(5) untersucht. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 3 gezeigt. Wie in der Tabelle 3 gezeigt, hat PFU-RFC die Aktivität von Pfu Polymerase C leicht gesteigert. Weiterhin wurde in dem Fall, in dem PFU-RFC gleichzeitig mit F7 zugesetzt wurde, die gesteigerte Aktivität mehr als verdoppelt im Vergleich zu dem Fall, in dem F7 allein zugesetzt wurde. Tabelle 3

Bemerkung: In der Tabelle ist die Menge an Pfu Polymerase C die Menge als Protein, umfassend je ein Molekül der beiden DNA polymerase-bildenden Proteine, und die Mengen an F7 und PFU-RFC sind die Mengen als Trimer- bzw. Tetramerproteine.

Beispiel 10
(1) Herstellung von anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper
Zwölf Milliliter (30.000 Einheiten) klonierte Pfu DNA Polymerase (hergestellt von STRATAGENE) wurde durch Ultrafiltration mittels Centricon-10 konzentriert und danach wurde 0,1 ml des erhaltenen Konzentrats auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibriert worden war. Die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt, und eine Pfu DNA Polymerasefraktion, die in einer Position eluiert wurde, die einem Molekulargewicht von etwa 75 Kilodalton entsprach, wurde gewonnen. Nachdem 0,8 ml dieser Fraktion mittels Centricon-10 konzentriert worden waren, wurde dieses Konzentrat als Antigen verwendet, um einen polyklonalen anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper herzustellen. Das obige Konzentrat wurde mit physiologischer Kochsalzlösung verdünnt, um so eine Pfu DNA Polymerasekonzentration von 2 mg/ml zu erhalten, und die verdünnte Lösung wurde mit einem gleichen Volumen an Freunds komplettem Adjuvans emulgiert. Diese Emulsion wurde subkutan in Kaninchen mit 250 μl pro Injektion viermal in 3-wöchigen Intervallen injiziert. Zehn Tage nach der abschließenden Immunisierung, wurde ganzes Blut extrahiert. Nach dem Stehen lassen bei Raumtemperatur für 60 Minuten, wurde das extrahierte Blut zentrifugiert, um 60 ml eines Antiserums, enthaltend den polyklonalen anti-Pfu DNA Poly merase Antikörper, zu ergeben. Zu 26 ml dieses Antiserums wurde 26 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung zugesetzt, und das Gemisch wurde leicht bei 4°C 1 Stunde und 45 Minuten lang gerührt und anschließend zentrifugiert. Das Präzipitat wurde in 5 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert und mittels einer zuvor mit demselben Puffer äquilibrierten PD-10 Säule (hergestellt von Pharmacia) entsalzt. Zehn Milliliter dieser Lösung wurde auf eine zuvor mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibrierte Protein A Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen. Nachdem die Säule mit demselben Puffer gewaschen worden war, wurde die Elution mit 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 3,0) durchgeführt. Die eluierte, den polyklonalen anti-PFU DNA Polymerase Antikörper enthaltende Fraktion wurde mit 1 M Tris-HCl, pH 9,0, neutralisiert, und danach wurde das Gemisch mittels Centriflow CF-50 konzentriert und einem Austausch mit Kopplungspuffer (0,5 M NaCl, 0,2 M NaHCO₃, pH 8,3) mittels einer PD-10 Säule unterworfen, um eine Lösung, enthaltend den anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper, herzustellen.
(2) Herstellung einer anti-PFU DNA Polymerase Antikörper-Säule
Eine HiTrap NHS-aktivierte Säule (hergestellt von Pharmacia) wurde mit 6 ml 1 m M HCl gewaschen und danach wurde 0,9 ml der obigen polyklonalen anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper-Lösung (enthaltend 4,5 ml Äquivalent des anti-Pfu DNA Polymeraseantikörpers) aufgetragen. Anschließend wurde eine anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper-Säule auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2(3) hergestellt.
(3) Nachweis der Bildung eines Komplexes aus Pfu DNA Polymerase und F7 mittels einer anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper-Säule
Pyrococcus furiosus DSM3638 wurde auf dieselbe Weise wie das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren kultiviert, um Zellen in 9 Liter eines Kulturmediums zu ergeben. Diese Zellen wurden in 33 ml Puffer C (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM ATP), enthaltend 2 mM PMSF, suspendiert, und die sich ergebende Suspension wurde mit einer Ultraschallaufbrecheinrichtung behandelt. Die erhaltene, aufgebrochene Lösung wurde bei 12.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, und 44 ml des erhaltenen Überstands wurde auf die zuvor mit Puffer C äquilibrierte anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper-Säule aufgetragen. Die Säule wurde mit Puffer C, enthaltend 0,1 M NaCl, gewaschen, und danach wurde der Pfu DNA Polymerasekomplex mit Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 8 M Harnstoff) eluiert. Dieses Eluat wurde einer SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamidgel; 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,4, verwendet als Elektrophoresepuffer), unterworfen. Nach der Elektrophorese wurde das Gel mit Coomassie Brilliant blau R-250 durch ein herkömmliches Verfahren gefärbt. Als Ergebnis wurde, wie in der 10 gezeigt, neben der Bande der Pfu DNA Polymerase eine Bande in einer Position entsprechend dem obigen F7 festgestellt.
Auf dieser Grundlage wurde ein Konzentrat dieses Eluats einer SDS-PAGE auf dieselbe Weise wie oben unterworfen, und das erhaltene Gel wurde einem Western Blotting mittels dem anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper auf dieselbe Weise wie im Beispiel 3(2) unterworfen. Aus dem Ergebnis der in der 10 gezeigten SDS-PAGE und den Ergebnissen des obigen Western Blotting wurde klar, dass die Bande in einer F7 entsprechenden Position ein Protein ist, das mit dem anti-Pfu DNA Polymerase Antikörper nicht reagiert.
Weiterhin wurde die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins dieser Bande auf dieselbe Weise wie im Beispiel 3(2) analysiert und als Ergebnis wurde festgestellt, dass dieses Protein F7 ist.
(4) Nachweis der Bildung des Komplexes aus Pfu DNA Polymerase und F7 mittels Gelfiltrationschromatographie
1,2 ml der authentischen F7 Probe, die im Beispiel 8(4) erhalten wurde, wurde einem Pufferaustausch mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl mittels PD-10 Säule unterworfen, und danach wurde die sich ergebende Lösung auf ein Volumen von 50 μl mittels Centricon-10 konzentriert.
Je zehn Mikroliter der in Beispiel 10(1) beschriebenen 0,1 mM Pfu DNA Polymeraselösung, der obigen 0,1 mM (berechnet als Trimer) F7 Lösung und eines Gemischs aus 0,1 mM Pfu DNA Polymerase und 0,1 mM F7 wurde über einen Zeitraum von 30 Minuten von 60° auf 90°C erwärmt. Jede wärmebehandelte Lösung wurde auf eine Superdex 200 PC3.2/30 Gelfiltrationssäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Tris-HCl Puffer, pH 8,0, enthaltend 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibriert worden war, und die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt. Pfu DNA Polymerase und F7 wurden in Positionen eluiert, die Molekulargewichten von etwa 76 Kilodalton bzw. etwa 128 Kilodalton entsprachen. Im Fall des Mischens von Pfu DNA Polymerase und F7 wurden ein Haupthöchststand, entsprechend etwa 320 Kilodalton, und ein Nebenhöchststand, entsprechend etwa 128 Kilodalton, eluiert. Die Fraktionen mit diesen beiden Höchstständen wurden jeweils einer SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamidgel; 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,4, als Elektrophoresepuffer verwendet) unterworfen. Die etwa 320 Kilodalton entsprechende Fraktion enthielt Pfu DNA Polymerase und F7, während die etwa 128 Kilodalton entsprechende Fraktion nur F7 enthielt. Aus dem Obigen wurde festgestellt, dass ein Komplex aus Pfu DNA Polymerase und F7 gebildet wird.
(5) Extensionsaktivität von Pfu DNA Polymerase-F7-Komplex
In der im Beispiel 10(4) beschriebenen Gelfiltration wurden je 20 μl Eluate, erhalten durch Gelfiltration von Pfu DNA Polymerase allein, entsprechend etwa 75 Kilodalton, und Gemisch von Pfu DNA Polymerase und F7, entsprechend 320 Kilodalton, jeweils gesammelt, und die Primerextensionsaktivität von jedem Eluat oder Gemisch wurde mittels des im Beispiel 8(5) beschriebenen Aktivitätsbestimmungsverfahrens bestimmt, bei dem der nicht markierte M13-HT Primer als Substrat verwendet wurde. Außerdem wurde gleichzeitig eine Einführungsaktivität durch das im Beispiel 2(1) beschriebene Verfahren, bei dem eine aktivierte DNA als Substrat verwendet wurde, bestimmt. Die Ergebnisse sind in der 11 gezeigt. Das Verhältnis der Primerextensionsaktivität zur Einführungsaktivität für die beiden Fraktionen wurde derart bestimmt, dass das Verhältnis von 0,65 für die obige 320 Kilodalton Fraktion erhalten wurde und das Verhältnis von 0,29 für die etwa 76 Kilodalton Fraktion erhalten wurde. Daher wurde festgestellt, dass die Primerextensionsaktivität der Pfu DNA Polymerase durch die Bildung eines Komplexes mit F7 gesteigert wurde.
Beispiel 11
(1) Auswahl der Cosmidklone, die das Homologe der großen RFC Untereinheit kodierende Gen tragen
Im Hinblick auf die Aminosäuresequenz der großen RFC Untereinheit von Methanococcus jannaschii [Science, 273, 1058-1073 (1996)] wurde eine Homologie zu den Aminosäuresequenzen der kleinen PFU-RFC Untereinheiten, die kein im Beispiel 9 beschriebenes Intein tragen, untersucht. In Bezug auf die Aminosäuresequenz einer dazwischen stark konservierten Region wurde der Primer RFLS15 zum Suchen nach dem die große RFC Untereinheit kodierenden Gen synthetisiert. Die Nukleotidsequenz des Primers RFLS15 ist in SEQ ID NO: 60 im Sequenzprotokoll gezeigt. Die PCR wurde mittels einer Kombination dieses Primers mit dem obigen Primer RF-F1, entsprechend einer ähnlichen Aminosäuresequenz durchgeführt, die in den beiden Untereinheitsproteinen von RFC mit genomischer Pyrococcus furiosus DNA als Matrize existiert. Die PCR wurde mittels eines Reaktionsgemischs derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) beschriebenen mittels Pfu DNA Polymerase, 0,25 μg Matrizen DNA und 100 pmol pro Primer durchgeführt. Von den beiden Arten von DNA Fragmenten, die mit dieser PCR amplifiziert wurden, wurde ein amplifiziertes DNA Fragment von etwa 630 bp isoliert, dessen Größe sich von der erwarteten Größe des Amplifikationsprodukts, das von der kleinen PFU-RFC Untereinheit stammte, unterschied. Dieses DNA Fragment wurde in den Plasmidvektor pUC119 subkloniert und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Danach wurden in Bezug auf die bestimmte Nukleotidsequenz die Primer RFLS-S3 und RFLS-S4, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 61 bzw. 62 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, dann synthetisiert.
Die PCR wurde mittels dieser beiden Primer mit der im Beispiel 1 hergestellten Cosmid DNA als Matrize durchgeführt, um so die Cosmidklone auszuwählen, die das Homologe der großen RFC Untereinheit kodierende Gen tragen sollen. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Cosmidklone Nr. 254, 310, 313, 377 und 458 das gewünschte Gen (PFU-RFCLS Gen) tragen. Diese Cosmidklonnummern waren mit den obigen Cosmidklonen identisch, die das PFU-RFC Gen trugen. Auf dieser Grundlage wurde die Nukleotidsequenz des DNA Inserts im in SEQ ID NO: 55 im Sequenzprotokoll gezeigten Plasmid pRFS254NdB untersucht, und es wurde festgestellt, das ein Homolog (PFU-RFCLS) der großen RFC Untereinheit durch den offenen Leserahmen kodiert wurde, der bei Nr. 3109 der Sequenz direkt stromabwärts vom PFU-RFC Gen startete. Allerdings enthielt dieses Plasmid pRFS254NdB nicht eine volle Länge des PFU-RFCLS Gens.
(2) Subklonieren des PFU-RFCLS Gens
Um ein DNA Fragment zu isolieren, das die volle Länge des PFU-RFCLS Gens trägt, wurde der obige Klon Nr. 254 mit NheI verdaut, und die verschiedenen erhaltenen DNA Fragmente wurden herausgeschnitten und jedes wurde in den Plasmidvektor pRV118N subkloniert (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.). Die PCR wurde mittels RFLS-S3 und RFLS-S4 als Primer mit jedem der als Matrize erhaltenen, rekombinanten Plasmide durchgeführt, um zu untersuchen, ob das PFU-RFCLS Gen vorhanden ist oder nicht. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass ein NheI Fragment von etwa 11 kb das RFLS Gen trägt. Das aus der Insertion dieses NheI Fragments in pTV118N resultierende Plasmid wurde als Plasmid pRFLSNh bezeichnet. Darüber hinaus wurde eine in diesem Plasmid enthaltene Restriktionsendonukleasekarte des DNA Inserts hergestellt, und es wurden die in der 12 gezeigten Ergebnisse erhalten.
Weiterhin wurde die Nukleotidsequenz des in diesem Plasmid enthaltenen DNA Inserts durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Von der bestimmten Nukleotidsequenz ist die Nukleotidsequenz des Abschnitts des offenen Leserahmens, der PFU-RFCLS kodiert, in SEQ ID NO: 63 im Sequenzprotokoll gezeigt. Die Aminosäuresequenz des von der Sequenz stammenden PFU-RFCLS ist in SEQ ID NO: 64 im Sequenzprotokoll gezeigt.
Beispiel 12
(1) Auswahl der das F5 Gen tragenden Cosmidklone
Auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz des im Beispiel 3 erhaltenen F5 wurden die Primer F5-1-1 und F5-2, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 65 bzw. 66 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Zuerst wurde eine PCR mittels je 100 pmol F5-1-1 und Kassettenprimer C1 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit 1 μl im Beispiel 4 hergestellter PstI Kassetten DNA als Matrize durchgeführt. Zweitens wurde eine PCR mittels 100 pmol sowohl von F5-2 als auch Kassettenprimer C2 (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit 1 μl des obigen Reaktionsgemischs als Matrize durchgeführt. Diese zweite PCR wurde mittels des TaKaRA PCR Amplifikationskits (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) gemäß den beigefügten Anweisungen durchgeführt. Ein amplifiziertes DNA Fragment von etwa 900 bp wurde in den Plasmidvektor pTV118N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) subkloniert. Das erhaltene Plasmid wurde als pF5P2 bezeichnet und seine Nukleotidsequenz wurde bestimmt. Danach wurden auf der Basis der bestimmten Sequenz die Primer F5S1 und F5S2, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 67 bzw. 68 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Die PCR wurde mittels dieser F5S1 und F5S2 mit der im Beispiel 1 beschriebenen Cosmid DNA als Matrize durchgeführt, um so die das F5 Gen tragenden Cosmidklone auszuwählen. Diese PCR wurde mittels des TaKaRa PCR Amplifikationskits gemäß den beigefügten Anweisungen durchgeführt. Als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Cosmidklone Nr. 15, 96, 114, 167, 277, 348, 386, 400, 419, 456, 457 und 484 das F5 Gen tragen. Diese Cosmidklonnummern waren mit den das F7 Gen tragenden Cosmidklonen identisch. Auf dieser Grundlage wurde die in SEQ ID NO: 41 im Sequenzprotokoll gezeigte Nukleotidsequenz untersucht, und es wurde festgestellt, dass ein Abschnitt auf oder nach Nr. 892, der sich stromabwärts zum F7 Gen auf der Sequenz befindet, eine erste Hälfte des F5 Gens trägt.
(2) Subklonieren des F5 Gens
Um das F5 Gen zu subklonieren, wurde eine Restriktionsendonukleasekarte für NcoI, BamHI, PstI, HindIII und NdeI (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) in der Nachbarschaft des F5 Gens mittels des im Beispiel 8 erhaltenen Plasmids pF7-HH-18 und des obigen Plasmids pF5P2 hergestellt, und die in der 13 gezeigten Ergebnisse wurden erhalten.
Auf der Basis der in der 13 gezeigten Restriktionsendonukleasekarte wurde der Cosmidklon Nr. 15 mit NdeI verdaut, und ein Fragment von etwa 900 bp wurde herausgeschnitten und in den Plasmidvektor pTV118Nd subkloniert. Was das erhaltene rekombinante Plasmid anbetrifft, wurde ein Plasmid, das aus der Insertion des F5 Gens in der orthodoxen Orientierung im Hinblick auf den lac Promotor resultierte, als pF5NNF-1 bezeichnet.
(3) Bestimmung der Nukleotidsequenz eines das F5 Gen tragenden DNA Fragments
Die Nukleotidsequenz des DNA Inserts im obigen Plasmid pF5NNF-1 wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Als Ergebnis der Analyse der bestimmten Nukleotidsequenz wurde ein offener Leserahmen gefunden, der ein Protein kodierte, dessen N-terminale Aminosäuresequenz mit der von F5 identisch ist. Die Nukleotidsequenz dieses offenen Leserahmens ist in SEQ ID NO: 69 im Sequenzprotokoll gezeigt, und die von der obigen Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz von F5 ist in SEQ ID NO: 70 im Sequenzprotokoll gezeigt. Diese Aminosäuresequenz wurde auf Homologie zu den Aminosäuresequenzen von bekannten Proteinen hin untersucht, und als Ergebnis wurden keine dazu homologen Proteine gefunden.
(4) Konstruktion des Plasmid für die F5 Expression
Es wurde eine PCR mittels der Primer F5Nco und F5CBam, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 71 bzw. 72 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, mit dem obigen Plasmid pF5NNF-1 als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch mit derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase durchgeführt. Unter Verwendung von 1 ng Matrizen DNA und je 20 pmol von beiden Primern wurde die Reaktion in 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Ein amplifiziertes DNA Fragment von etwa 640 Basenpaaren wurde mit NcoI und BamHI (beide von Takara Shuzo Co., Ltd. hergestellt) verdaut, und das erhaltene Fragment wurde mit pET15b (hergestellt von Novagen) ligiert, das zuvor mit NcoI und BamHI linearisiert worden war. Dieses Plasmid wurde als pF5NBPET bezeichnet. Von dem DNA Insert im Plasmid wurde die mittels PCR amplifizierte Region durch das Didesoxy-Verfahren analysiert, um seine Nukleotidsequenz zu bestimmen. Es wurde nachgewiesen, dass es keine durch die PCR hervorgerufene Mutation gibt.
Escherichia coli HMS174(DE3)/pF5NBPET, mit dem Plasmid pF5NBPET transformiertes Escherichia coli HMS174(DE3), wurde für die F5 Expression bewertet, und es wurde gezeigt, dass ein Protein mit einem F5 entsprechenden Molekulargewicht in der Kultur der Transformante exprimiert ist.
Beispiel 13
(1) Subklonieren des F3 Gens
Auf der Basis der N-terminalen Aminosäuresequenz von F3, erhalten im Beispiel 3, wurden die Primer F3-1 und F3-3-1, deren Nukleotidse quenzen in SEQ ID NO: 73 und 74 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, synthetisiert. Zuerst wurde eine PCR mittels 100 pmol Primer F3-1 und 20 pmol Kassettenprimer C1 mit 1 μl BglII/Sau3AI Kassetten DNA von Beispiel 4 als Matrize verwendet. Mit 1 μl des obigen Reaktionsgemischs als Matrize wurde eine zweite PCR mittels F3-3-1 und Kassettenprimer C2 durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym in 30 Zyklen für die erste PCR und 25 Zyklen für die zweite durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 45°C (30 Sekunden) – 72°C (2 Minuten) stattfindet. Ein amplifziertes DNA Fragment von etwa 500 bp durch diese Reaktion wurde in den Plasmidvektor pTV118N subkloniert, und ein Teil seiner Nukleotidsequenz wurde durch das Didesoxy-Verfahren mittels M4 und RV Primern (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) bestimmt. Auf der Basis der bestimmten Sequenz wurden die Primer F3S1, F3S2, F3S3 und F3S4, deren Nukleotidsequenzen in SEQ ID NO: 75, 76, 77 und 78 im Sequenzprotokoll gezeigt sind, dann synthetisiert. Die PCR wurde mittels dieser F3S1 und F3S2 Primer mit der im Beispiel 1 hergestellten Cosmid DNA als Matrize durchgeführt, und es wurde nach F3 Gen tragenden Cosmidklonen gesucht. Als Ergebnis wurde kein, wahrscheinlich das F3 Gen tragender Cosmidklon gefunden. Auf dieser Grundlage wurde die PCR mittels des Primers F3S3 oder F3S4 und des Primers C2 mit jeder Kassetten DNA von Beispiel 4 als Matrize durchgeführt. Als Ergebnis der Kartierung der Restriktionsendonuklease-Erkennungsstellen in der Nachbarschaft des F3 Gens wurde davon ausgegangen, dass das F3 Gen in einem Fragment von etwa 2,6 kb zwischen der SalI Stelle und der HindIII Stelle vorhanden ist. Auf der Basis dieser Ergebnisse wurde 4 μg genomische Pyrococcus furiosus DNA mit SalI und HindIII verdaut, und danach wurde ein DNA Fragment von etwa 2,6 kb gesammelt und in den pTV118N Vektor subkloniert. Es wurde eine PCR mittels des Primers F3S4 und des Primers FV-N (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) mit jedem der so erhaltenen rekombinanten Plasmide als Matrize durchgeführt, um das Vorhandensein des F3 Gens zu untersuchen. Als Ergebnis wurde ein Plasmid, das ein das F3 Gen tragendes 2,6 kb SalI-HindIII Fragment enthielt, erhalten und dieses Plasmid wurde als Plasmid pF3SH92 bezeichnet. Escherichia coli JM109/pF3SH92, mit diesem Plasmid transformiertes Escherichia coli JM109, wurde auf F3 Expression hin untersucht, und als Ergebnis wurde nachgewiesen, dass ein Protein mit einem F3 entsprechenden Molekulargewicht exprimiert wird.
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz des das F3 Gen tragenden DNA Fragments
Die Nukleotidsequenz des DNA Inserts im obigen Plasmid pF3SH92 wurde durch das Didesoxy-Verfahren bestimmt. Als Ergebnis der Analyse der bestimmten Nukleotidsequenz wurde ein offener Leserahmen gefunden, der ein Protein kodiert, dessen N-terminale Aminosäuresequenz mit der von F3 identisch ist. Die Nukleotidsequenz dieses offenen Leserahmens ist in SEQ ID NO: 79 im Sequenzprotokoll gezeigt bzw. ist die von der Nukleotidsequenz abgeleitete Aminosäuresequenz von F3 in SEQ ID NO: 80 im Sequenzprotokoll gezeigt. Diese Aminosäuresequenz wurde auf ihre Homologie zu den Aminosäuresequenzen von bekannten Proteine hin untersucht, und als Ergebnis wurde festgestellt, dass die Aminosäuresequenz homolog zur Mycoplana ramosaabgeleiteten Acetylpolyaminaminohydrase [Journal of Bacteriology, 178, 5781-5786 (1996)] und humanen Histondeacetylase [Science, 272, 408-411 (1996)] ist.
Beispiel 14
In dem folgenden Beispiel sind die Aktivitäten der im Handel erhältlichen Enzyme auf der Basis der Markierung für einzelne Enzyme ge zeigt. Außerdem wurden Reaktionsgemische, enthalten im Handel erhältliche Enzyme, gemäß den Anleitungen für die jeweiligen Enzyme oder mittels der daran angebrachten Reaktionspuffer hergestellt, wenn nicht anders angegeben. Die PCR wurde mittels des GeneAmp PCR System 9600 (hergestellt von Perkin-Elmer) durchgeführt.
(1) Herstellung des anti-PFU-RFC Antikörpers
Die authentische PFU-RFC Probe von Beispiel 9(6) wurde so verdünnt, um eine Konzentration von 1 mg/100 μl mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl zu erhalten, und das Gemisch wurde mit einem gleichen Volumen von Freunds komplettem Adjuvans emulgiert. Diese Emulsion wurde subkutan in Kaninchen mit 50 μl pro Injektion 4-mal in 3-wöchigen Intervallen injiziert. Zehn Tage nach der abschließenden Immunisierung wurde ganzes Blut extrahiert. Nach dem Stehen lassen bei Raumtemperatur für 60 Minuten wurde das extrahierte Blut zentrifugiert, um 50 ml eines Antiserums, enthaltend den anti-PFU-RFC polyklonalen Antikörper, zu ergeben. Zu 20 ml dieses Antiserums wurde 20 ml einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung gegeben, und das Gemisch wurde leicht bei 4°C 45 Minuten lang gerührt und anschließend zentrifugiert. Das erhaltene Präzipitat wurde in 5 ml 20 mM Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, suspendiert und dreimal einer 2-stündigen Dialyse gegen 2 Liter desselben Puffers als Dialysat unterworfen. Nach der Dialyse wurde 14 ml der Lösung auf eine zuvor mit 20 mM Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) äquilibrierte Protein A Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen. Nachdem die Säule mit demselben Puffer gewaschen worden war, wurde die Elution mit 0,1 M Natriumcitratpuffer (pH 3,0) durchgeführt. Nachdem der eluierte anti-PFU-RFC Antikörper mit 1 M Tris-HCl, pH 9,0, neutralisiert worden war, wurde das Gemisch dann mittels Centriflow CF-50 konzentriert und einem Austausch mit Kopplungspuffer (0,5 M NaCl, 0,2 M NaHCO₃, pH 8,3) mittels einer PD-10 Säule unterworfen, um eine den anti-PFU-RFC Antikörper enthaltende Lösung herzustellen.
(2) Herstellung einer anti-PFU-RFC Antikörpersäule
Eine HiTrap NHS-aktivierte Säule (hergestellt von Pharmacia) wurde mit 6 ml 1 mM HCl gewaschen und danach wurde 0,95 ml der obigen polyklonalen anti-PFU-RFC Antikörperlösung (enthaltend 3,8 mg Äquivalent des anti-PFU-RFC Antikörpers) aufgetragen. Anschließend wurde eine anti-PFU-RFC Antikörpersäule auf dieselbe Weise wie im Beispiel 2(3) hergestellt.
(3) Reinigung des Komplexes enthaltend PFU-RFC mittels anti-PFU-RFC Antikörpersäule
Pyrococcus furiosus DSM3638 wurde auf dieselbe Weise wie das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren kultiviert, um Zellen in 10 Liter Kulturmedium zu ergeben. Diese Zellen wurde in 33 ml Puffer C (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 0,1 mM ATP), enthaltend 2 mM PMSF, suspendiert und die Suspension wurde mit einer Ultraschallaufbrecheinrichtung behandelt. Die aufgebrochene Lösung wurde bei 12.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, und 38 ml des erhaltenen Überstands wurde auf die anti-PFU-RFC Antikörpersäule aufgetragen, die zuvor mit Puffer C, enthaltend 0,1 M NaCl, äquilibriert worden war. Nach dem Waschen mit Puffer C, enthaltend 0,1 M NaCl, wurde die Säule bei 85°C 1 Stunde lang erwärmt, und der PFU-RFC Komplex wurde mit Puffer C, enthaltend 0,1 M NaCl, eluiert. Dieses Eluat wurde einer SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamidgel; 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,4, verwendet als Elektrophoresepuffer) unterworfen. Das Gel wurde nach der Gelelektrophorese mit Coomassie Brilliant blau R-250 durch ein herkömmliches Verfahren gefärbt, und als Ergebnis wurden zusätzlich zur Bande von PFU-RFC eine Bande in der Position für 33 Kilodalton, die dem obigen F7 entspricht, und zwei Banden nahe 60 Kilodalton festgestellt.
Auf dieser Grundlage wurden die N-terminalen Aminosäuresequenzen der Proteine, die in diesen drei Banden existieren auf dieselbe Weise wie im Beispiel 3(2) analysiert. Als Ergebnis wurde wie in der 14 gezeigt, festgestellt, dass die N-terminale Aminosäuresequenz des Proteins in einer dem obigen F7 entsprechenden Position mit der von F7 identisch ist, und jede der N-terminalen Aminosäuresequenzen der beiden Proteinarten nahe 60 Kilodalton war, wie festgestellt wurde, mit der obigen N-terminalen Aminosäuresequenz von PFU-RFCLS identisch.
Als Nächstes wurden die Mengen der PFU-RFC, PFU-RFCLS und F7 Proteine in diesem Eluat durch die Menge an daran gebundenem Coomassie Brilliant blau quantitativ bestimmt. Das Eluat wurde einer SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamidgel; 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,4, verwendet als Elektrophoresepuffer) unterworfen. Das Gel wurde nach der Elektrophorese mit Coomassie Brilliant blau R-250 durch ein herkömmliches Verfahren gefärbt, und danach wurde die Bande ausgeschnitten und mit 500 μl 70%iger Ameisensäure behandelt, um das Coomassie Brilliant blau zu extrahieren, und die Absorptionsfähigkeit bei 630 nm wurde bestimmt. Auf der Basis einer Kalibrierungskurve, die mittels der authentischen F7 Probe von Beispiel 8(4) und der authentischen PFU-RFC Probe von Beispiel 9(6) hergestellt wurde, jeweils von bekannter Konzentration, wurde festgestellt, dass 208 μg PFU-RFC, 55 μg PFU-RFCLS und 51 μg F7 Protein in 500 μl Eluat enthalten waren. Der durch die drei Proteine PFU-RFC, PFU-RFCLS und F7 gebildete Komplex, wie oben beschrieben, wird nachstehend als RFC-N Komplex bezeichnet.
(4) Wirkungen des RFC-N Komplexes auf die Primerextensionsreaktionen
Um die Wirkungen des im Beispiel 14(3) erhaltenen RFC-N Komplexes auf die Primerextensionsreaktionen verschiedener Polymerasen zu untersuchen, wurden die Aktivitäten der Pfu Polymerase C und Pfu DNA Polymerase (DNA Polymerase vom Typ α, hergestellt von STRATAGENE) unter den Fällen verglichen, bei denen der RFC-N Komplex zugegeben wurde, sowie den Fällen, bei denen nur sein Bestandteil F7 zugesetzt wurde. Die DNA Polymeraseaktivitäten wurden auf dieselbe Weise wie das im Beispiel 8(5) beschriebene Verfahren bestimmt, mit der Ausnahme, dass 50 fmol Pfu Polymerase C oder Pfu DNA Polymerase verwendet wurde. Für die Bestimmung der DNA Polymeraseaktivitäten wurde der HT Primer, der ein synthetisches Oligonukleotid mit 45 Basen ist, durch Anlagern an einzelsträngige M13 Phagen DNA (M13mp18ss DNA, hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) wie im Beispiel 8(5) (M13-HT Primer) gezeigt hergestellt. Die Nukleotidsequenz des HT Primers ist in SEQ ID NO: 42 im Sequenzprotokoll gezeigt. Die Ergebnisse für die Pfu DNA Polymerase sind in 15 gezeigt. Die zugesetzten Mengen an F7 und dem RFC-N Komplex sind in den molaren Zahlen von F7 und dem im Reaktionsgemisch enthaltenen RFC-N Komplex exprimiert. Wie in der 15 veranschaulicht, zeigte der RFC-N Komplex einen höheren Anstieg der Aktivität gegenüber Pfu DNA Polymerase als der von F7 allein.
Weiterhin wurde die Primerextensionsaktivität mit dem im Beispiel 8(5) beschriebenen Verfahren untersucht. Reaktionsgemische zum Bestimmen wurden mit den folgenden Zusammensetzungen hergestellt: 1) 100 fmol F7, 2) 0,05 μl RFC-N Komplex (enthaltend 60 fmol F7), 3) 10 fmol Pfu Polymerase C, 4) 10 fmol Pfu Polymerase C + 100 fmol F7, 5) 100 fmol Pfu Polymerase C + 0,05 μl RFC-N Komplex, 6) 20 fmol F7, 7) 0,02 μl RFC-N Komplex (enthaltend 24 fmol F7), 8) 10 fmol Pfu DNA Polymerase, 9) 10 fmol Pfu DNA Polymerase + 20 fmol F7, 10) 10 fmol Pfu DNA Polymerase + 0,02 μl RFC-N Komplex. Zu 1 μl jedes Reakti onsgemischs zur Bestimmung wurde 9 μl eines Reaktionsgemischs [20 ml Tris-HCl (pH 9,0), 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol, je 40 μM dATP, dGTP, dCTP und dTTP], enthaltend 0,01 μg/μl ³²P-markierter M13-HT Primer, zugesetzt, und die Reaktion wurde bei 75°C 2,5 Minuten lang durchgeführt. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch mit Eis gekühlt, um die Reaktion anzuhalten, und 1 μl 200 mM EDTA und 5 μl eines Reaktionsstoppers (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenol blau, 0,05% Yxlolcyanol) wurden weiter zugesetzt, und das Gemisch wurde einer thermischen Denaturierungsbehandlung bei 95°C über 5 Minuten unterworfen. Nachdem 1,6 μl dieses Reaktionsgemischs mittels 6 & Polyacrylamidgel, enthaltend 8 M Harnstoff, elektrophoresiert wurde, wurde ein Autoradiogramm erstellt.
Als Nächstes wurde, um die Primerextensionsreaktionsprodukte mit längeren Ketten zu analysieren, die Analyse mit dem im Beispiel 8(5) beschriebenen Verfahren durchgeführt. Zu 1 μl von jeder der obigen Probenlösungen 1) bis 10) wurde 9 μl eines Reaktionsgemischs [20 mM Tris-HCl, pH 9,0, 15 mM MgCl₂, 2 mM 2-Mercaptoethanol, je 40 μm dATP, dGTP, dCTP und dTTP, 84 nM [α-³²P]-dCTP], enthaltend M13-HT Primer, zugesetzt, um eine Endkonzentration von 0, 01 μg/μl zu erhalten, und das Gemisch wurde bei 75°C 2,5 Minuten lang reagieren gelassen. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde zu dem eiskalten Reaktionsgemisch 1,11 μl 200 mM EDTA, 1,23 μl 500 mM NaOH und 2,47 μl 6-fach konzentrierter Auftragspuffer (0,125% Bromphenol blau, 0,125% Xylolcyanol, 9% Glycerin) nacheinander zugegeben. Nachdem 6 μl dieses Gemischs mittels 0,5% alkalischem Agarosegel elektrophoresiert worden waren, wurde ein Autoradiogramm erstellt.
In beiden Fällen von Pfu Polymerase C und Pfu DNA Polymerase steigerte sich die Menge an langkettigen Extensionsprodukten in dem Fall, in dem der FRC-N Komplex zugesetzt wurde, im Vergleich zu dem Fall von F7 allein.
Es wurde festgestellt, dass die Kettenlängen der langkettigen Extensionsprodukte bis zu etwa 7,2 kb, eine volle Länge der Matrize, betrugen, und zwar bei beiden der verwendeten Polymerasen, in dem Fall von F7 allein und vom RFC-N Komplex.
Beispiel 15 Konstruktion des Plasmids für die rRFC-M Expression

(1) Ein Plasmid für die gleichzeitige Expression von PFU-RFCLS und PFU-RFC wurde konstruiert. Mit Bezug auf die im Beispiel 11(2) bestimmte Nukleotidsequenz wurden der Primer RFLS-NdeN, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 81 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, und RFLS-S9, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 82 gezeigt ist, synthetisiert. Es wurde eine PCR mittels dieser beiden Primer mit dem obigen Plasmid pRFLSNh als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendeten mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym, 10 ng Plasmid pRFLSNh und je 20 pmol der Primer in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (3 Minuten) stattfindet. Ein NdeI-PstI Fragment von etwa 920 bp, isoliert nach dem Verdau eines amplifizierten DNA Fragments, erhalten durch PCR mit NdeI und PstI, ein PstI-EcoRI Fragment von etwa 600 bp, das aus dem im Beispiel 11(2) erhaltenen Plasmid pRFLSNh isoliert wurde, und ein EcoRI-BamHI Fragment mit etwa 2 kb, isoliert aus dem im Beispiel 9(4) erhaltenen Plasmid pRFS254SNc, wurden gemischt und zwischen die NdeI und BamHI Stellen des Plasmidvektors pTV119Nd subkloniert. Das so erhaltene, rekombinante Plasmid wurde als pRFC10 bezeichnet. Darüber hinaus wurde Escherichia coli JM109, das mit dem Plasmid transformiert war, als Escherichia coli JM109/pRFC10 bezeichnet. Es wurde festgestellt, dass diese Transformante ein hohes Expressionsniveau von PFU-RFCLS und PFU-RFC besitzt.
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz von PFU-RFCLS und PFU-RFC kodierenden Gene

Von dem DNA Insert im Plasmid pFRC10, erhalten im Beispiel 5(1), wurde die durch die PCR amplifizierte Region mit dem Didesoxy-Verfahren analysiert, um seine Nukleotidsequenz zu bestimmen, und es wurde nachgewiesen, dass es keine durch die PCR hervorgerufene Mutation gibt. Aus diesem Ergebnis und den Ergebnissen des Beispiels 9(3) und Beispiel 11(2), wurde die Nukleotidsequenz des Gens bestimmt, das PFU-RFCLS und PFU-RFC kodierte, das kein Intein trug. Die Nukleotidsequenz der Gene, die PFU-RFCLS und PFU-RFC kodierten, das kein so erhaltenes Intein trug, ist in SEQ ID NO: 83 im Sequenzprotokoll gezeigt, und seine Restriktionsendonukleasekarte ist in der 16 gezeigt.
Beispiel 16 Herstellung einer authentischen rRFC-M Probe
Im Beispiel 15(1) erhaltenes Escherichia coli JM109/pRFC10 wurde 16 Stunden lang in 500 ml × 4 LB Medium (10 g/l Trypton, 5 g/l Hefeextrakt, 5 g/l NaCl, pH 7, 2) kultiviert, in dem Ampicillin in einer Konzentration von 100 μg/ml vorhanden war und IPTG mit 1 mM vorhanden ist. Nach dem Ernten wurden Zellen in 35,9 ml Sonikationspuffer [50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Mercaptoethanol 10% Glycerin, 2 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)] suspendiert, und die Suspension wurde mit einer Ultraschallaufbrecheinrichtung behandelt. Nach der Zentrifugation bei 12.000 UpM für 10 Minuten wurde eine Wärmebehandlung bei 80°C über 15 Minuten durchgeführt. Danach wurde erneut eine Zentrifugation bei 12.000 UpM für 10 Minuten durchgeführt, um 33,0 ml der wärmebehandelten Enzymlösung zu ergeben. Diese Lösung wurde dann auf eine zuvor mit Puffer A (50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Meraptoethanol, 10% Glycerin) äquilibrierte RESOURCE Q Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, und die aufgetragene Lösung wurde mittels FPLC System (hergestellt von Pharmacia) chromatographiert. Die Elution wurde auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM NaCl durchgeführt.
Als Ergebnis der Analyse des Eluats durch SDS-PAGE (12,5% Polyacrylamidgel; 25 mM Tris-HCl, 192 mM Glycin, 0,1% SDS, pH 8,4, verwendet als Elektrophoresepuffer) wurde PFU-RFCLS und PFU-RFC beide in einer NaCl Konzentration von 240 mM eluiert. Wenn das von den Zellen erhaltene Eluat, in dem nur Pfu-RFC exprimiert war, wie im Beispiel 9(6) beschrieben, auf eine RESOURCE Q Säule aufgetragen wurde, wurde das Eluat nicht an die RESOURCE Q Säule adsorbiert. Andererseits wurde, wenn das Eluat, erhalten aus Zellen, bei denen PFU-RFCLS und PFU-RFC gleichzeitig exprimiert wurden, auf die RESOURCE Q Säule aufgetragen wurde, das Eluat daran adsorbiert, und PFU-RFCLS und PFU-RFC wurden gleichzeitig in einer NaCl Konzentration von 240 mM, wie zuvor beschrieben, eluiert. Aus den Ergebnissen wurde gezeigt, dass diese beiden Proteine einen Komplex gebildet haben. Dieser Komplex wird nachfolgend als rRFC-M Komplex bezeichnet.
Nachdem 4,8 ml einer durch Sammeln der rRFC-M Komplexfraktion erhaltenen Enzymlösung mittels Centriflow CF50 konzentriert worden war, wurde das Konzentrat einem Austausch mit Puffer A, enthaltend 150 mM NaCl, mittels einer PD-10 Säule (hergestellt von Pharmacia) unterworfen, und 3,5 ml der Lösung wurde auf eine zuvor mit einem 150 mM NaCl enthaltenden Puffer A äquilibrierten Heparinsäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen. Mittels des FPLC Systems wurde der Chromatograph auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 150 mM bis 650 mM NaCl entwickelt, und eine rRFC-M Komplexfraktion, die bei 450 mM NaCl eluiert wurde, wurde erhalten. Mittels des Centricon- 10 (hergestellt von Amicon) wurde 3,9 ml dieser Fraktion konzentriert, und 115 μl des Konzentrats wurde auf eine zuvor mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibrierte Superdex 200 Gelfiltrationssäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen. Die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt und es wurde festgestellt, dass der rRFC-M Komplex eine Verweilzeit von 26,3 Minuten hatte. Aus den Vergleichsergebnissen mit der Position der Elution eines Molekulargewichtsmarkers unter denselben Bedingungen wurde das Molekulargewicht des rRFC-M Komplexes mit etwa 370 Kilodalton berechnet.
Weiterhin wurde, um das Zusammensetzungsverhältnis von jeder Einheit im rRFC-M Komplex zu bestimmen, die oben eluierte Fraktion eines Molekulargewichts von etwa 370 kDa einer SDS-PAGE unterworfen.
Das Gel wurde nach der Elektrophorese mit Coomassie Brilliant blau R-250 durch ein herkömmliches Verfahren gefärbt, und danach wurden die Bande der PFU-RFCLS und PFU-RFC Proteine herausgeschnitten und mit 500 μl 70%iger Ameisensäure extrahiert. Die Absorptionsfähigkeit jedes Extrakts bei 630 nm wurde bestimmt, und die Ergebnisse wurden mit der Kalibrierungskurve verglichen, die mittels des im Beispiel 9(6) hergestellten PFU-RFC hergestellt wurde, um so die Menge jedes Proteins zu bestimmen und die Molzahl zu berechnen.
Als Ergebnis wurde festgestellt, dass PFU-RFCLS und PFU-RFC in einem Verhältnis von 1:4 vorkommen. Basierend auf der Tatsache, dass das Molekulargewicht des rRFC-M Komplexes, wie es durch die oben beschriebene Gelfiltration berechnet wurde, etwa 370 kDa betrug, wurde angenommen, dass der rRFC-M Komplex durch die beiden Moleküle von PFU-RFCLS und acht Moleküle von PFU-RFC gebildet wurde. Auf dieser Grundlage wurde die Molzahl berechnet, wobei der obige rRFC-M Komplex als 1 Einheit genommen wurde.
Beispiel 17 Konstruktion der Plasmid F3 Expression

(1) Es wurde eine PCR mittels des Primers F3Nd, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 84 im Sequenzprotokoll gezeigt ist, und des F3S2 Primers, dessen Nukleotidsequenz in SEQ ID NO: 76 gezeigt ist, mit dem im Beispiel 13 hergestellten Plasmid pF3SH92 als Matrize durchgeführt. Die PCR wurde in einem Reaktionsgemisch derselben Zusammensetzung wie der im Beispiel 5(1) verwendete mittels Pfu DNA Polymerase als Enzym, 1 ng Plasmid pF3SH92 und jeweils 20 pmol der Primer in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C (30 Sekunden) – 55°C (30 Sekunden) – 72°C (1 Minute) stattfindet. Ein NdeI-PstI Fragment von etwa 0,5 kb, das nach dem Verdau eines amplifizierten, mittels PCR erhaltenen DNA Fragments durch NdeI und PStI isoliert worden war, und ein PstI-EcoRI Fragment von etwa 1,1 kb, das aus dem Plasmid pF3SH92 isoliert worden war, wurden gemischt und zwischen die NdeI und EcoRI Stellen des Plasmidvektors pTV119Nd subkloniert. Das so erhaltene rekombinante Plasmid wurde als pF3-19 bezeichnet. Darüber hinaus wurde das mit dem Plasmid transformierte Escherichia coli JM109 als Escherichia coli JM109/pF3-19 bezeichnet. Es wurde festgestellt, dass die Transformante eine hohe F3 Expression besitzt.
(2) Bestimmung der Nukleotidsequenz des F3 kodierenden Gens

Von dem DNA Insert im im Beispiel 17(1) erhaltenen Plasmid pF3-19 wurde die mittels PCR amplifizierte Region durch das Didesoxy-Verfahren analysiert, um seine Nukleotidsequenz zu bestimmen, und es wurde nachgewiesen, dass es keine durch die PCR verursachte Mutation gibt.
Beispiel 18 Herstellung einer gereinigten authentischen F3 Probe
Das im Beispiel 17(1) erhaltene Escherichia coli JM109/pF3-19 wurde 16 Stunden lang in 500 ml × 4 LB Medium (10 g/Liter Trypton, 5 g/Liter Hefeextrakt, 5 g/Liter NaCl, pH 7,2), in dem Ampicillin in einer Konzentration von 100 μg/ml vorhanden war, kultiviert. Nach dem Ernten wurden Zellen in 50 ml Sonikationspuffer [50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 2 mM PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid)] suspendiert, und die Suspension wurde mit einer Ultraschallaufbrecheinrichtung behandelt. Nach der Zentrifugation bei 12.000 UpM für 10 Minuten wurde der Überstand einer Wärmebehandlung bei 80°C für 15 Minuten unterworfen. Danach wurde erneut eine Zentrifugation bei 12.000 UpM für 10 Minuten durchgeführt, um einen wärmebehandelten Überstand zu ergeben. Vierundvierzig Milliliter des wärmebehandelten Überstands wurde auf eine zuvor mit dem im Beispiel 16 beschriebenen Puffer A äquilibrierte RESOURCE Q Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, und die aufgetragene Lösung wurde mittels eines FPLC System (hergestellt von Pharmacia) chromatographiert. Das Chromatogramm wurde auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM NaCl entwickelt. Zu 11 ml einer Lösung der Fraktion, enthaltend mit 140 mM bis 240 mM NaCl eluiertes F3, wurde 5,5 ml Puffer A, enthaltend 3 M Ammoniumsulfat zugegeben, und diese Lösung wurde auf eine HiTrap Butylsäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit Puffer A, enthaltend 1 M Ammoniumsulfat, äquilibriert worden war. Nachdem die Säule mit Puffer A, enthaltend 1 M Ammoniumsulfat, mittels des FPLC Systems gewaschen worden war, wurde F3 mit Puffer A, enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat, eluiert. Sechs Milliliter dieser Fraktion wurde auf eine HiTrap Phenylsäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit Puffer A, enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat, äquilibriert worden war. Nachdem die Säule mit Puffer A, enthaltend 0,5 M Ammoniumsulfat, mittels des FPLC Systems gewaschen worden war, wurde F3 mit Puffer A eluiert. Mittels Centricon-10 (hergestellt von Amicon) wurde 9,5 ml dieser Fraktion konzentriert, und 155 μl des Konzentrats wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibriert worden war. Die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt und als Ergebnis wurde F3 in einer Position eluiert, die einer Verweilzeit von 42,1 Minuten entsprach. Aus den Vergleichsergebnissen in der Position der Elution eines Molekulargewichtsmarkers unter denselben Bedingungen wurde ein Molekulargewicht von etwa 25 Kilodalton angenommen. Auf der Basis, dass der theoretische Wert des Molekulargewichts von D3 37 Kilodalton ist, wird abgeleitet, dass F3 ein Monomer ist.
Beispiel 19 Herstellung einer gereinigten authentischen F5 Probe
Escherichia coli HMS174(DE3)/pF5NBPET, das mit dem im Beispiel 12(4) erhaltenen Plasmid pF5NBPET transformierte Escherichia coli HMS174(DE3), wurde 16 Stunden in 500 ml × 4 LB Medium (10 g/Liter Trypton, 5 g/Liter Hefeextrakt, 5 g/Liter NaCl, pH 7,2), in dem Ampicillin in einer Konzentration von 100 μg/ml vorhanden war, kultiviert. Nach dem Ernten wurden die Zellen in 61 ml Sonikationspuffer suspendiert und die Suspension wurde mittels einer Ultraschallaufbrecheinrichtung behandelt. Die aufgebrochenen Zellen wurden bei 12.000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert und danach wurde der Überstand einer Wärmebehandlung bei 80°C für 15 Minuten unterworfen. Anschließend wurde wieder eine Zentrifugation bei 12.000 UpM für 10 Minuten durchgeführt, um einen wärmebehandelten Überstand zu ergeben. Zu 60,5 ml Ammoniumsulfat wurde 8,71 g Ammoniumsulfat zugegeben, und das Gemisch wurde bei 4°C 2 Stunden lang gerührt, und danach wurde eine Zentrifugation bei 12.000 UpM für 10 Minuten durchgeführt. Das Präzipitat wurde in 10 ml Puffer A gelöst und gegen Puffer A dialysiert. Die Enzymlösung nach der Dialyse wurde auf eine zuvor mit Puffer A äquilibrierte RESOURCE Q Säule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, und die aufgetragene Lösung wurde mittels des PFLC Systems (hergestellt von Pharmacia) chromatographiert. Das Chromatogramm wurde auf einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 500 mM NaCl entwickelt. Mittels Centricon-10 (hergestellt von Amicon) wurde 11 ml einer Lösung von einer Fraktion, enthaltend mit 350 mM bis 450 mM NaCl eluiertes F5, konzentriert und 222 μl des Konzentrats wurde auf eine Superdex 200 Gelfiltrationssäule (hergestellt von Pharmacia) aufgetragen, die zuvor mit 50 mM Tris-HCl, pH 8,0, 2 mM 2-Mercaptoethanol und 75 mM NaCl äquilibriert worden war. Die Elution wurde mit demselben Puffer durchgeführt und als Ergebnis wurde F5 in einer Position eluiert, die einer Verweilzeit von 32,5 Minuten entsprach. Aus den Vergleichsergebnissen mit der Position der Elution eines Molekulargewichtsmarkers unter denselben Bedingungen wurde ein Molekulargewicht von etwa 145 Kilodalton angenommen. Dieses Molekulargewicht entspricht dem Fall, in dem F5 ein Heptamer gebildet hat.
Beispiel 20 Herstellung von Primern
Auf der Basis der Nukleotidsequenz von λDNA wurden acht Primerarten, d.h. λ1B bis λ5 und λ7 bis λ9 synthetisiert. Die Nukleotidsequenzen der Primer λ1B bis λ5 und λ7 bis λ9 sind in SEQ ID NO: 85 bis 92 im Sequenzprotokoll gezeigt. Die Kettenlängen der DNA Fragmente, die mit PCR mittels Kombinationen dieser Primer mit λDNA als Matrize amplifiziert wurden, sind in der Tabelle 4 gezeigt. Tabelle 4
Beispiel 21 Wirkungen des F1 Proteins auf DNA Polymerase
Die Wirkungen des im Beispiel 5 erhaltenen F1 Proteins auf die PCR wurden untersucht. Um eine Amplifikationsreaktion der 1 bis 4 kb DNA Fragmente mittels λDNA als Matrize durchzuführen, wurden jeweils die Primer λ1B und λ3, die Primer λ1B und λ4 und die Primer λ1B und λ5 als Primerpaare verwendet, um Reaktionsgemische der nachfolgend gezeigten Zusammensetzungen herzustellen: 10 mM Tris-HCl, pH 9,2, 75 mM KCl, 6 mM MgCl₂, jeweils 0,4 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 0,01% BSA und 1,25 Einheiten Pfu Polymerase C, 500 pg Matrizen DNA, je 5 pmol der Primer, 173 pmol F1 Protein (Endvolumen 25 μl). Mittels jedes Reaktionsgemischs wurde die Reaktion in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 98°C, 0 Sekunden – 68°C, 0 Sekunden stattfindet. Der Ausdrücke „98°C, 0 Sekunden", „68°C, 0 Sekunden" usw., wie sie in der vorliegenden Beschreibung verwendet werden, zeigen an, dass die Reaktionseinrichtung so programmiert wurde, dass die Einstelltemperatur sofort auf die nächste verlagert wird, wenn die Einstelltemperatur erreicht wird.
Nach dem Abschluss der Reaktion wurde 5 μl des Reaktionsgemischs auf 1% Agarosegel (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) elektrophoresiert, um amplifizierte Fragmente nachzuweisen.
Als Ergebnis wurde die Amplifikation von 1 kb, 2 kb und 4 kb DNA Fragmenten, die von den verwendeten Primerpaaren abhingen, nachgewiesen. Andererseits konnten, wenn das obige Reaktionsgemisch ohne die Zugabe des F1 Proteins einer PCR unter den obigen Reaktionsbedingungen unterworfen wurde, keine amplifizierten Fragmente nachgewiesen werden.
Beispiel 22 Wirkungen der F1, F3 und F5 Proteine auf DNA Polymerase
Die Wirkungen des im Beispiel 5 erhaltenen F1 Proteins, des im Beispiel 18 erhaltenen F3 Proteins und des im Beispiel 19 erhaltenen F5 Proteins wurden benutzt, um die Amplifikation eines 6 kb DNA Fragments mittels PCR mit λDNA als Matrize zu untersuchen. Es wurden Reaktionsgemische derselben Zusammensetzungen wie die im Beispiel 21 verwendeten hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Primer λ1 und λ6 als Primerpaar verwendet wurden. Das F1 Protein wurde in einer Menge von 173 pmol zugesetzt, das F3 Protein wurde in einer Menge von 10 pmol zugesetzt und das F5 Protein wurde in einer Menge von 1 pmol zugesetzt, um ein Endvolumen von 25 μl zu erhalten. Mittels jedes Reaktionsgemischs wurde die Reaktion in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 98°C, 1 Sekunde – 68°C, 2 Minuten durchgeführt wurde. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde 5 μl des Reaktionsgemischs auf 1% Agarosegel elektrophoresiert, um amplifizierte Fragmente zu bestätigen.
Als Ergebnis wurde die Amplifikation eines 6 kb DNA Fragments in Gegenwart eines der Proteine F1, F3 und F5 nachgewiesen. Andererseits konnten, wenn diese Proteine nicht zugesetzt wurden, keine amplifizierten Fragmente nicht nachgewiesen werden.
Beispiel 23 Wirkungen der F2 und F4 Proteine auf die DNA Polymerase
Die Wirkungen des im Beispiel 6 erhaltenen F2 Proteins und des im Beispiel 7 erhaltenen F4 Proteins wurden benutzt, um die Amplifikationsreaktion eines 4 kb DNA Fragments mittels PCR mit λDNA als Matrize zu untersuchen. Es wurden Reaktionsgemische derselben Zusammensetzungen, wie die im Beispiel 21 verwendeten hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Primer λ1B und λ5 als Primerpaar, 0,75 Einheiten Pfu Polymerase C und 1 ng Matrizen λDNA verwendet wurden. Das F2 Protein und das F4 Protein wurden jeweils in einer Menge von 1,095 pmol dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um ein Endvolumen von 25 μl zu erhalten. Mittels jedes Reaktionsgemischs wurde die Reaktion in 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C, 30 Sekunden – 55°C, 30 Sekunden – 72°C, 2 Minuten stattfindet. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde 5 μl des Reaktionsgemischs auf 1% Agarosegel elektrophoresiert, um amplifizierte Fragmente nachzuweisen.
Als Ergebnis wurde die Amplifikation eines 4 kb Fragments in Gegenwart eines der Proteine F2 und F4 nachgewiesen. Andererseits wurde, wenn diese Proteine nicht zugesetzt wurden, kein amplifiziertes Fragment nachgewiesen.
Beispiel 24 Wirkungen des rRFC-M Komplexes auf DNA Polymerasen
Um die Wirkungen des rRFC-M Komplexes auf die Primerextensionsreaktionen von verschiedenen Polymerasen zu untersuchen, wurden die Aktivitäten von Pfu Polymerase C und Pfu DNA Polymerase (DNA Polymerase des Typs α, hergestellt von STRATAGENE) für die Fällen verglichen, bei denen der rRFC-M Komplex und F7 nebeneinander bestehen, sowie für die Fälle, bei denen F7 allein besteht.
DNA Polymeraseaktivitäten wurden auf dieselbe Weise wie das im Beispiel 8(5) beschriebene Verfahren bestimmt, mit der Ausnahme, dass 50 fmol Pfu Polymerase C oder Pfu DNA Polymerase verwendet wurde und dass 400 fmol des rRFC-M Komplexes und 0 bis 200 fmol von F7 zugesetzt wurden. Die Ergebnisse des Falls, in dem Pfu DNA Polymerase verwendet wurde, sind in der 17 gezeigt. Die Wirkungen auf Pfu DNA Polymerase waren derart, dass die Aktivität in dem Fall eines Nebeneinanderbestehens von rRFC-M Komplex und F7 höher als im Fall von F7 allein war. Darüber hinaus zeigten die Wirkungen auf Pfu Polymerase C dieselbe Tendenz wie die auf Pfu DNA Polymerase.
Beispiel 25 Wirkungen des Nebeneinanderbestehens von rRFC-M Komplex und F7 Protein auf PCR
Um eine Amplifikationsreaktion eines 4 kb DNA Fragments mittels λDNA als Matrize durchzuführen, wurden Reaktionsgemische derselben Zusammensetzungen wie die im Beispiel 21 verwendeten hergestellt, mit der Ausnahme, dass die Primer λ1B und λ5 und 0,375 Einheiten Pfu Polymerase C verwendet wurden. Der rRFC-M Komplex wurde in einer Menge von 312,5 fmol zugesetzt und das F7 Protein wurde in einer Menge von 125 fmol zum Reaktionsgemisch zugesetzt, um ein Endvolumen von 25 μl zu ergeben. Mittels jedes Reaktionsgemischs wurde die Reaktion in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 98°C, 0 Sekunden – 68°C, 10 Sekunden stattfindet. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde 5 μl des Reaktionsgemischs auf 1% Agarosegel (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) elektrophoresiert, um amplifizierte Fragmente nachzuweisen.
Als Ergebnis wurde die Amplifikation eines 4 kb DNA Fragments, abhängig vom verwendeten Primerpaar im Fall des Systems, in dem der rRFC-M Komplex und das F7 Protein nebeneinander bestanden, nachgewiesen. Andererseits konnten, wenn diese Proteine nicht zugesetzt wurden, keine amplifizierten Fragmente nachgewiesen werden.
Weiterhin wurde ein ähnliches Experiment für eine Amplifikationsreaktion von 8 bis 12 kb DNA Fragmenten mittels λDNA als Matrize durchgeführt. Reaktionsgemische derselben Zusammensetzungen wie die im Beispiel 21 verwendeten wurden hergestellt, mit der Ausnahme, dass jeder der Primer λ1B und λ7, der Primer λ1B und λ8 und der Primer λ1B und λ9 als Primerpaare verwendet wurden und weiter 0,375 Einheiten Pfu Polymerase C und 2,5 ng Matrizen λDNA verwendet wurden. Der rRFC-M Komplex wurde in einer Menge von 312,5 fmol und das F7 Protein wurde in einer Menge von 125 fmol dem Reaktionsgemisch zugesetzt, um ein Endvolumen von 25 μl zu ergeben. Mittels jedes Reaktionsgemischs wurde die Reaktion in 30 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 98°C, 0 Sekunden – 68°C, 3 Minuten stattfindet. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde 5 μl des Reaktionsgemischs auf 1% Agarosegel (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.) elektrophoresiert, um amplifizierte Fragmente nachzuweisen.
Als Ergebnis wurde die Amplifikation von 8 kb, 10 kb und 12 kb DNA Fragmenten abhängig von den verwendeten Primerpaaren in dem Fall des Systems, in dem der rRFC-M Komplex und das F7 Protein nebeneinander bestanden, nachgewiesen. Andererseits wurde, wenn diese Proteine nicht zugesetzt wurden, nur ein 8 kb DNA Fragment nachgewiesen.
Beispiel 26 Wirkungen des Nebeneinanderbestehens von rRFC-M Komplex und F7 Protein auf Pfu DNA Polymerase
Um eine Amplifikationsreaktion eines 4 kb DNA Fragments mittels λDNA als Matrize jeweils unter Verwendung der Primer λ1B und λ3, der Primer λ1B und λ4 und der Primer λ1B und λ5 als Primerpaare durchzuführen, wurden Reaktionsgemische der nachfolgend gezeigten Zusammensetzungen hergestellt: Puffer, der mit Pfu DNA Polymerase versehen wurde, je 0,2 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP und je 0,5 Einheiten Pfu Polymerase, 500 pg Matrizen DNA, 2,5 pmol jedes Primers, 2,5 pmol des rRFC-M Komplexproteins und 0,5 pmol des F7 Proteins (Endvolumen 25 μl). Mittels jedes Reaktionsgemischs wurde die Reaktion in 25 Zyklen durchgeführt, wobei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 94°C, 30 Sekunden – 55°C, 30 Sekunden – 72°C, 1 Minute stattfindet. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde 5 μl des Reaktionsgemischs auf 1% Agarosegel elektrophoresiert, um amplifizierte Fragmente nachzuweisen.
Als Ergebnis wurde die Amplifikation von 1 kb, 2 kb und 4 kb DNA Fragmenten je nach den verwendeten Primerpaaren in dem Fall des Systems, in dem der rRFC-M Komplex und das F7 Protein nebeneinander bestanden, nachgewiesen. Andererseits wurde, wenn diese Proteine nicht zugesetzt wurden, nur 1 kb bis 2 kb DNA Fragmente nachgewiesen.
Beispiel 27 Wirkungen des Nebeneinanderbestehens von rRFC-M Komplex und F7 Protein auf gemischter DNA Polymerase
Die Wirkungen des Nebeneinanderbestehens von rRFC-M Komplex und des F7 Protein auf PCR mittels eines Gemischs aus den beiden DNA Polymerasearten wurden untersucht.
Um eine Amplifikationsreaktion eines 1 kb DNA Fragments mittels λDNA als Matrize unter Verwendung der Primer λ1B und λ3 durchzuführen, wurden Reaktionsgemische der nachfolgend gezeigten Zusammensetzungen hergestellt: Puffer, vorgesehen mit TaKaRa LA Taq (Mg Plus), jeweils 0,4 mM dATP, dCTP, dGTP und dTTP, 1,25 Einheiten LA Taq DNA Polymerase (hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.), 500 pg Matrizen DNA, 5 pmol jedes Primers, 62,5 fmol des RFC Komplexproteins und 12,5 fmol des F7 Proteins (Endvolumen 25 μl). Mittels jedes Reaktionsgemischs wurde die Reaktion in 30 Zyklen durchgeführt, wo bei ein Zyklus ein Verfahren umfasst, das bei 98°C, 0 Sekunden – 68°C, 10 Sekunden stattfindet. Nach dem Abschluss der Reaktion wurde 5 μl des Reaktionsgemischs auf 1% Agarosegel elektrophoresiert, um amplifizierte Fragmente nachzuweisen.
Als Ergebnis kann nachgewiesen werden, dass ein DNA Fragment von 1 kb am effizientesten in dem Fall des Systems amplifiziert wurde, in dem der rRFC-M Komplex und das F7 Protein zugesetzt wurden, und zwar als Ergebnis eines Vergleichs des Systems, in dem der rRFC-M Komplex und das F7 Protein zugesetzt wurden, mit dem System, in dem der rRFC-M Komplex allein zugesetzt wurde, dem System, in dem das F7 Protein allein zugesetzt wurde, oder dem System, in dem LA Taq DNA Polymerase allein zugesetzt wurde.
GEWERBLICHE ANWENDBARKEIT
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein DNA polymerase-assoziierter Faktor vorgesehen werden, der in der Lage ist, die DNA Synthetisierungsaktivität einer DNA Polymerase zu steigern. Der Faktor hat eine Wirkung auf verschiedene DNA Polymerasen und kann auch in verschiedenen Verfahren verwendet werden, in denen eine DNA Polymerase verwendet wird, so dass der Faktor als Reagenz für Untersuchungen in der Gentechnik nützlich ist. Weiter ist es nun möglich, das Enzym durch gentechnische Verfahren mittels eines Gens zu erzeugen, das den DNA polymerase-assoziierten Faktor der vorliegenden Erfindung kodiert.
SEQUENCE LISTING
SEQUENCE LISTING

Claims

Gen, das (a) einen DNA polymerase-assoziierten Faktor kodiert, wobei der Faktor zumindest eine Aminosäuresequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 1, 3, 19, 27, 34, 64, 70 und 80 der Sequenzliste umfasst; oder (b) unter stringenten Bedingungen mit dem Gen von (a) hybridisiert, wobei die stringenten Bedingungen 50°C für 12 bis 20 Stunden in 6 × SSC (Natriumchlorid-Natriumcitrat-Puffer) enthaltend 0.5% SDS (Natrium-Dodecyl-Sulfat), 0.1% BSA, 0.1% Polyvinylpyrrolidon, 0.1% Ficoll 400, und 0.01% denaturierte Lachsspermien-DNA sind, wobei das Gen einen DNA polymerase-assoziierten Faktor kodiert, der eine steigernde Aktivität der DNA-Syntheseaktivität der DNA Polymerase besitzt.
Gen nach Anspruch 1, wobei das Gen zumindest eine Nukleotidsequenz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus SEQ ID NO: 2, 4, 18, 26, 33, 63, 69 und 79 umfasst.
Thermostabiler DNA polymerase-assoziierter Faktor, der vom Gen des Anspruchs 1 oder 2 kodiert wird.
DNA polymerase-assoziierter Faktor nach Anspruch 3, der eine Bindungsaktivität zu einer DNA Polymerase besitzt, die ein DNA Polymerase konstituierendes Protein umfasst, das die in SEQ ID NO: 5 oder 6 der Sequenzliste dargestellte Aminosäuresequenz hat.
Verfahren zur Herstellung eines DNA polymerase-assoziierten Faktors, dadurch gekennzeichnet, dass das Verfahren umfasst die Kultivierung einer Transformante, die ein Gen des Anspruchs 1 oder 2 enthält, und gewinnen eines thermostabilen DNA polymerase-assoziierten Faktors, der die DNA-Synthesaktivität einer DNA Polymerase erhöht, aus dem Kulturmedium.
DNA-Syntheseverfahren mit einer DNA Polymerase, dadurch gekennzeichnet, dass die DNA in der Gegenwart des DNA polymerase-assoziierten Faktors der Ansprüche 3 oder 4 synthetisiert wird.
DNA-Syntheseverfahren nach Anspruch 6, wobei DNA in der Gegenwart von zwei oder mehr Arten des DNA polymerase-assoziierten Faktors synthetisiert wird.
DNA-Syntheseverfahren nach Anspruch 7, wobei DNA in der Gegenwart von F7 (SEQ ID NO: 1), PFU-RFC (SEQ ID NO: 3) und PFU-RFCLS (SEQ ID NO: 64) als einen DNA polymerase-assoziierten Faktor synthetisiert wird.
DNA-Syntheseverfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die DNA Polymerase eine thermostabile DNA Polymerase ist.
DNA-Syntheseverfahren nach Anspruch 9, wobei die Synthese mit einem PCR Verfahren durchgeführt wird.
Kit verwendbar für in vitro DNA Synthese, umfassend den DNA polymerase-assoziierten Faktor von Anspruch 3 oder 4 und eine DNA Polymerase.
Kit nach Anspruch 11, zusätzlich umfassend ein für die DNA Synthese benötigtes Reagens.
Kit nach Anspruch 11 oder 12, umfassend zwei oder mehr Arten des DNA polymerase-assoziierten Faktors.
Kit nach Anspruch 13, umfassend F7, PFU-RFC und PFU-RFCLS als einen DNA polymerase-assoziierten Faktor.
Kit nach einem der Ansprüche 11 bis 14, umfassend eine thermostabile DNA Polymerase als eine DNA Polymerase.