DE69834527T2 - Verfahren zur Geschlechtsbestimmung von Säuger-Nachkommenschaft - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung ist auf ein Verfahren zur Trennung von X- und Y-zugeordneten Spermien gerichtet, indem eine Spermaprobe mit einem Antikörper in Kontakt gebracht wird, der für ein Geschlecht spezifisch ist, wobei der Antikörper an ein magnetisches Kügelchen mit einem Durchmesser gebunden ist, der die Trennung von Spermien erlaubt, die genügend Beweglichkeit besitzen, um eine erfolgreiche Befruchtung und Fertilität zu ermöglichen.
• Landwirte und andere Personen, die mit Tieren wirtschaften, haben sein langem erkannt, dass es wünschenswert ist, die Wahrscheinlichkeit, Nachkommenschaft mit einem ausgewählten Geschlecht zu erhalten, zu erhöhen. In der Vergangenheit wurden Verfahren zur Erhöhung des Prozentsatzes von X-Spermienzellen oder Y-Spermienzellen vorgeschlagen, um so eine größere Wahrscheinlichkeit zu erzielen, männliche bzw. weibliche Nachkommenschaft zu erhalten. Beispiele von früheren Forschungen werden beispielsweise bei Garner, D.L. et al., „An Overview of Separation of X- and Y-Spermatozoa," Proceedings of the Tenth Technical Conference on Artificial Insemination and Reproduction (National Association of Animal Breeders), S. 87–92 (1984) und Pinkel, D. et al., „Flow Cytometric Determination of the Proportions of X- and Y-Chromosome Bearing Sperm In Samples of Purportedly Separated Bull Sperm," J. Animal Scien., 60, S. 1303–1307 (1985), besprochen.
• Frühere Verfahren schlossen beispielsweise Verfahren ein, die auf der Dichtesedimentation basieren (vgl. beispielsweise Brandriff, B.F. et al., „Sex Chromosome Ratios Determined by Karyotypic Analysis in Albumin-Isolated Human Sperm", Fertil. Steril., 46, S. 678–685 (1986)).
• Das US-Patent 3,687,806 für Van Den Bovenkamp offenbart ein immunologisches Verfahren zur Kontrolle des Geschlechts von Säuger-Nachkommenschaft unter Verwendung von Antikörpern, die entweder mit den X- oder den Y-Chromosomen reagieren und bei dem von einem Agglutinationsschritt Gebrauch gemacht wird, um gebundene Antikörper von nicht reagierenden Antikörpern zu trennen.
• Das US-Patent 4,191,749 für Bryant offenbart ein Verfahren zur Erhöhung des Prozentsatzes der Säuger-Nachkommenschaft mit einem der beiden Geschlechter unter Verwendung eines männlich-spezifischen Antikörpers, der an ein Festphasenimmunabsorbierendes Material gekoppelt ist, um männlich-zugeordnete Spermien selektiv zu binden, während die weiblich-zugeordneten Spermien ungebunden im Überstand zurückbleiben.
• Das US-Patent 5,021,244 für Spaulding offenbart ein auf dem DNA-Gehalt basierendes Verfahren zum Sortieren von lebenden Zellen, insbesondere von Spermienpopulationen, um mit X- oder Y-Spermien angereicherte Subpopulationen mittels geschlechtsassoziierter Membranproteine und für derartige Proteine spezifische Antikörper zu produzieren.
• WO 9707399 offenbart ein Verfahren zur Trennung von X- und Y-zugeordneten Spermien unter Verwendung von Antikörpern und der Filtration über Glaswollefilter. Ein weiteres theoretisches Beispiel wird unter Verwendung von magnetischen Kügelchen mit einem Durchmesser von 4,5 Mikrometern beschrieben.
• Diese Verfahren führen jedoch häufig zur ungenügenden Trennung von X- und Y-Spermien und häufig zu Schädigungen der Spermien, so dass dadurch deren Beweglichkeit und Fertilitätserfolgsrate verringert wird.
• Es ist deshalb ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Trennung von X- und Y-zugeordneten Spermien bereitzustellen, das das Inkontaktbringen einer Samenprobe mit einem Antikörper, der für einem Geschlecht zugeordnete Spermien spezifisch ist, und das Trennen dieser Spermien von dem anderen Geschlecht zugeordneten Spermien umfasst, wobei der Antikörper an einen Träger aus porenfreien, magnetischen Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 bis 2 Mikrometer gebunden ist.
• Es ist ein weiteres Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit bereitzustellen, dass nicht-menschliche Säuger-Nachkommenschaft ein spezifisch erwünschtes Geschlecht aufweist.
• Es ist ferner ein erfindungsgemäßes Ziel, ein Verfahren zur Trennung von X- und Y-zugeordnetem Spermien bereitzustellen, ohne die Beweglichkeit oder Befruchtungsrate der getrennten Spermien zu gefährden.
• Es ist ferner noch ein erfindungsgemäßes Ziel, ein Verfahren zur Trennung von X- und Y-zugeordneten Spermien mittels Antikörper bereitzustellen, die für das ausgewählte Spermium spezifisch und an magnetische Kügelchen gebunden sind, wie vorstehend dargestellt, um eine hoch spezifische Trennung zu ermöglichen, so dass eine Spermaprobe bereitgestellt wird, die reich an ausgewählten Spermienarten ist und im Wesentlichen frei von dem anderen Spermientyp ist.
• Diese und weitere Ziele der vorliegenden Erfindung werden durch ein Verfahren erreicht, wie vorstehend dargestellt, wobei eine Spermienprobe mit Antikörpern in Kontakt gebracht wird, die für eine ausgewählte Spermienart spezifisch sind, wobei die Antikörper an Kügelchen, vorzugsweise magnetisch, mit einem Durchmesser 0,1 bis 2 Mikrometer gebunden sind, und anschließend die Kügelchen entfernt werden, wobei der verbleibende Überstand gesammelt werden kann und Spermien nur vom X- oder Y-zugeordneten Typ enthält.
• Die vorliegende Erfindung stellt die Trennung von X- und Y-tragenden Spermien bereit, die in der Lage sind, unter Verwendung von Standard-KB-Verfahren zu befruchten. Wie vorstehend angemerkt, gefährden frühere Trennungsverfahren häufig die Beweglichkeit und Befruchtungsfähigkeit der Spermien, so dass die Befruchtung unter Verwendung von derartigen getrennten Spermien komplizierte Verfahren wie IVF erfordert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann zur Trennung von X- und Y-Spermien von einer Vielfalt von Säugerspezies, einschließlich Vieh wie Rinder und Schafe sowie Hunde, Katzen, Pferde, Schweine und andere Spezies verwendet werden. Das Verfahren ist auch auf menschliche Samen anwendbar.
• Mittels der vorliegenden Erfindung kann eine Spermienprobe, die sowohl X- als auch Y-Spermien enthält, getrennt werden, so dass eine X- oder Y-angereicherte Spermiensubpopulation produziert wird, die im Wesentlichen im Hinblick auf die gewünschten Spermien rein ist und im Wesentlichen frei von anderen Spermienarten ist. Mit „im Wesentlichen frei" meinen wir, dass die Verwendung einer Probe, die beispielsweise mit X-Spermien angereichert ist, falls sie für eine künstliche Befruchtung verwendet werden würde, nur eine geringe Chance haben würde, männliche Nachkommen zu produzieren, weil die Spermienprobe weniger als 20%, vorzugsweise weniger als 10% Y-Spermien aufweist. Die Trennung der X- oder Y-Spermien erfolgt durch die Verwendung von Antikörpern, die an X- oder Y-spezifische Proteine aus Spermienzellen binden. Diese Antikörper können von jeder Art von Antiköpern (einschließlich IgG und IgM) sein und können entweder polyclonale Antikörper oder monoclonale Antikörper sein. Falls polyclonale Antikörper verwendet werden sollen, dann können derartige Antikörper nach den an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Beispielsweise können Verfahren verwendet werden, wie diejenigen, die bei Hurn, B.A. et al., (1980), Meth. In Enzymology, Herausg. Van Vanakis, H. und Langone, J. S. 104–142 beschrieben werden.
• Falls gewünscht, können monoclonale Antikörper verwendet werden und nach Verfahren hergestellt werden, die an sich im Fachgebiet bekannt sind, wie diejenigen, die ursprünglich von Milstein und Köhler, veröffentlicht in Nature (1975), 256, S. 495–497, verfasst wurden. Dieses Grundverfahren beinhaltet die Injektion einer immunogenen Substanz in ein Tier, gewöhnlich eine Maus. Nach einem entsprechenden Zeitraum für die Antikörperproduktion gegen das Immunogen wird die Maus getötet. Die Zellen werden aus der Milz entfernt und mit Myelomzellen fusioniert. Hybridomzellen, die sich aus dieser Fusion ergeben, können in vitro reproduzieren und jede exprimiert eine genetische Information für einen spezifischen Antikörper. Die aus einer Hybridomfusion produzierten Antikörper können daher nur eine einzige antigene Determinante des Immunogens erkennen.
• Zellen, die aus einzelnen Hybridomzellen gezüchtet werden, können dann auf die Produktion von Antikörpern gegen die antigene Zieldeterminante durchmustert werden. Jene Hybridome, die für das Zielantigen positiv sind, können weiter durchmustert werden, um diejenigen zu identifizieren, die den gewünschten Affinitätsgrad haben. Monoclonale Antikörper, die alle diese Merkmale zeigen, können dann unter Verwendung der tatsächlichen Testbedingungen durchmustert werden, um zu bestimmen, ob die Testbedingung die antikörperbindenden Merkmale oder die Affinität ändert, und um diejenigen mit einer Kreuzreaktivität gegenüber möglichen kontaminierenden Antigenen auszuschließen.
• Bevorzugte Antikörper sind diejenigen, die für das Y-Sperma spezifisch sind und daran binden, wie Antikörper, die das H-Y-Antigen binden. Derartige Antikörper können beispielsweise durch das in US-Patent 4,680,258 für Hammerling et al. beschriebene Verfahren hergestellt werden.
• Wie vorstehend angemerkt, werden die Antikörper, die entweder für X- oder Y-Spermien spezifisch sind, auf Kügelchen immobilisiert. Diese Kügelchen können Plastikkügelchen oder magnetische Kügelchen sein. Nützliche Plastikkügelchen sind Sepharose 6 MB oder andere Kügelchen, die groß genug sind, so dass sie sich in einem Chargenreinigungsverfahren absetzen. Wenn Plastikkügelchen verwendet werden, werden die Kügelchen, die einen daran gebundenen Antikörper besitzen, in einer Spermienprobe gemischt und man lässt sie am Boden des Behälters absetzen. Dieser Schritt kann, falls gewünscht, wiederholt werden, um die Vollständigkeit der Trennung des Spermas nach dem Geschlechtschromosom zu erhöhen.
• Falls magnetische Kügelchen verwendet werden, sind die Kügelchen Mikrosphären aus magnetischen Partikeln, die eine immobilisierende Matrix darstellen. Man hat gemäß der vorliegenden Erfindung herausgefunden, dass die magnetischen Kügelchen mit einen Durchmesser von 0,1 bis 2 Mikrometer besonders nützlich zur Trennung der gewünschten Spermienart sind, ohne dass die Beweglichkeit oder Befruchtungsfähigkeit der Spermien gefährdet werden. Besonders nützliche magnetische Kügelchen werden beispielsweise im US-Patent 5,071,076, US-Patent 5,108,933, US-Patent 4,795,698 und in der PCT-Patent-Veröffentlichung Nr. WO 91/09678 beschrieben. Nach den in diesen Patenten beschriebenen Verfahren können Kügelchen hergestellt werden, die insbesondere einen Durchmesser von 0,1 bis 0,5 Mikrometer aufweisen.
• Die Antikörper werden an die Kügelchen mittels Verfahren gebunden, die an sich im Fachgebiet bekannt sind. Im Allgemeinen wird eine verbindende Verbindung an die magnetischen Kügelchen während der Herstellung der Kügelchen gebunden. Auf den Kügelchen wird ein Antikörper (wie ein IgG-Antikörper, der gegen Maus-IgM gerichtet ist) durch Mischen der Kügelchen mit etwa 1 mg Eisen/ml mit gereinigtem Antikörper mit 1 mg/ml Protein gebunden. Nachdem der Antikörper an die Kügelchen gebunden wurde, werden die Kügelchen gewaschen, so dass nur der gebundene Antikörper zurückbleibt. Zusätzliche dem Fachmann bekannte Verfahren werden beispielsweise im US-Patent 4,018,886; US-Patent 3,970,518; US-Patent 4,855,045 und US-Patent 4,230,685 beschrieben. Protein A ist eine bevorzugte verbindende Verbindung, die die Effektivität des Einfangens durch die gebundenen Antikörper stark erhöht. (Forsgren et al., (1977) J. Immunol. 99:19). Protein A bindet an den Fc-Anteil der IgG-Subklasse-Antikörper und erweitert und präsentiert daher den Fab-Anteil dieser Antikörper. Die sich ergebende richtige Orientierung der Antikörper und die Erweiterung weg von den Partikeln führen zu einer sehr effektiven Interaktion zwischen den gebunden Antikörpern und ihrem Ziel.
• Das Verfahren zur Bindung von Protein A an magnetische Partikel kann durch irgendeines von mehreren Verfahren ausgeführt werden, die durch die wissenschaftliche Literatur zur Verfügung stehen. In einem derartigen Verfahren werden magnetische Eisenoxidpartikel mit etwa einem Mikrometer Durchmesser durch eine Reaktion zuerst mit 3-Aminopropyltriethoxysilan, dann mit Glutaraldehyd chemisch derivatisiert. Die derivatisierten magnetischen Partikel werden dann mit Protein A gemischt, was zu einem magnetischen Partikel führt, an den das Protein A covalent gebunden ist. Die Antikörper werden dann den magnetischen Protein A-Partikeln zugegeben und nach einer kurzen Inkubationszeit bilden sich die Protein A-Antikörper-Komplexe (Weetall, H.H. (1976) Meth. In Enzymol. 44:134–48).
• Das Folgende ist ein spezifisches Beispiel des erfindungsgemäßen Verfahrens:
• Beispiel 1:
• Etwa 10⁸ bis 10¹⁰ Spermien in einer Volumenmenge von 1–10 ml werden mit gepuffertem Kulturmedium (Dulbeco modifiziertes Eagle-Medium) gewaschen, indem 10 Minuten bei 1.500 UpM zentrifugiert wird. Die Spermien werden dann in 4 ml gepuffertem Kulturmedium resuspendiert, nachdem der Überstand behutsam dekantiert wurde. Die Spermiensuspension wird dann in zwei Fläschchen aufgeteilt und in jedes Fläschchen werden 500 μl magnetische Kügelchen gegeben, an die Antikörper für Y-tragende Spermien gebunden sind. Die Fläschchen werden mit einem Deckel versehen und dann 30 Minuten bei 3 UpM kopfüber auf einem Rotator bei Raumtemperatur rotiert.
• Nach der Rotation werden die Deckel gelöst und in ein magnetisches Fangrack gestellt, wie dasjenige, die im US-Patent 5,571,481 beschrieben wird. Nach 15 Minuten Exposition im Magnetfeld wird der Überstand entfernt, der reich an X-tragendem Spermien und im Wesentlichen frei von Y-tragendem Spermien ist. Der entfernte Überstand wird dann nach Spermien ausgezählt, und die Konzentration wird, wie zur Befruchtung erforderlich, eingestellt. Jene Probe wird dann in einen Halm oder in Halme für das Befruchtungsverfahren geladen.
• Falls gewünscht, kann eine vollständigere Trennung erhalten werden, indem das magnetischen Einfangverfahren hintereinander wiederholt wird.
• Nachdem die Erfindung also beschrieben wurde, ist klar, dass dieselbige auf viele Arten variiert werden kann. Derartige Variationen sollen nicht als Abweichen vom Geist und Umfang der Erfindung betrachtet werden, und alle derartigen Modifizierungen, wie sie für den Fachmann offensichtlich wären, sind dafür vorgesehen, in den Umfang der folgenden Patentansprüche eingeschlossen zu werden.

Claims (8)

1. Verfahren zur Trennung von X- und Y-zugeordneten Spermien, umfassend das Inkontaktbringen einer Samenprobe mit einem Antikörper, der spezifisch ist für einem Geschlecht zugeordnete Spermien, und das Trennen dieser Spermien von dem anderen Geschlecht zugeordneten Spermien, wobei der Antikörper an einen Träger aus porenfreien, magnetischen Kügelchen mit einem Durchmesser von 0,1 bis 2 Mikrometer gebunden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei der Antikörper durch eine verbindende Zwischenverbindung an die Kügelchen gebunden ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die verbindende Zwischenverbindung Protein A ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Antikörper spezifisch für Y-Chromosomen tragendes Sperma ist.
5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der Antikörper spezifisch für ein H-Y-Antigen ist.
6. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Kügelchen einen Durchmesser von 0,1 bis 0,5 Mikrometer haben.
7. Verfahren nach Anspruch 6, wobei der Antikörper ein monoclonaler Antikörper ist.
8. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Samenprobe mit den Kügelchen in Kontakt gebracht wird, die Probe einem Magnetfeld ausgesetzt wird und der verbleibende Überstand abgenommen wird, um einen Überstand bereitzustellen, der reich an X-Chromosomen tragendem Sperma ist.