DE69513188T2

DE69513188T2 - Vorrichtung und verfahren zur trennung von zellen

Info

Publication number: DE69513188T2
Application number: DE69513188T
Authority: DE
Inventors: Peter Van Vlasselaer
Original assignee: Dendreon Corp
Current assignee: Dendreon Corp
Priority date: 1994-08-31
Filing date: 1995-08-31
Publication date: 2000-07-06
Anticipated expiration: 2015-09-01
Also published as: JP3397795B2; EP0778944A1; NZ292756A; EP0778944B1; DK0778944T3; WO1996007097A1; AU700743B2; CA2198607C; AU3502595A; DE69513188D1; ES2140705T3; HK1013862A1; ATE186398T1; CA2198607A1; JPH10508190A

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Anreicherung einer gewünschten Zellpopulation aus Zellquellen, wie Körperflüssigkeiten, dispergierte Gewebeproben und gezüchtete Zellen. Insbesondere verwendet das Verfahren eine Zellabfangzentrifugationsvorrichtung, die ein Medium bestimmter Dichte zur Trennung von Zellen geringer Dichte aus Zellpopulationen enthält. Das Verfahren kann durch spezifische Erhöhung der Dichte von unerwünschten Zellen geringer Dichte unter Verwendung von Mikropartikeln, die Zellbindungsmoleküle kovalent gebunden haben, ergänzt werden.

2. Hintergrund

Die Isolierung von spezifischen Zelltypen aus biologischen Flüssigkeiten und Geweben ist für klinische, diagnostische und therapeutische Anwendungen oft wünschenswert. Auf dem Gebiet der klinischen Diagnostik gibt es zum Beispiel einen Bedarf an Verfahren zur morphologischen Analyse von Tumorzellen, fötalen Chromosomenanalyse und Gewebetypisierung. Therapeutisch besteht zum Beispiel ein Bedarf für das Reinigen von Zellen oder Geweben, die bei autologen Zell- oder Gewebetransfusionen oder - transplantationen verwendet werden sollen, z. B. das Reinigen von Geweben von viralen Antigenen und Tumorzellen. Es besteht auch ein Bedarf für die Anreicherung oder Isolierung von gewünschten Zellen zur Verwendung bei Transplantationen, z. B. zur Verwendung bei der ex vivo-Vermehrung von hämatopoetischen Zellen, die zur allogenen und autologen Transplantation bestimmt sind.
Mehrere Verfahren sind auf dem Fachgebiet zur Trennung von gewünschten Zellen aus Körperflüssigkeiten bekannt. Solche Verfahren schließen die Trennung von Zellen basierend auf der Schwebedichte in einer Zelltrennungszusammensetzung (US-Pat. Nr. 4,927,750), die Trennung serologischer Faktoren auf Dichtegradienten unter Verwendung von mit einem anti-serologischen Faktor beschichteten Latexkügelchen (US-Pat. Nr. 3,862,303), die Trennung von Zellen durch die Verwendung eines Magnetfelds (US-Pat. Nr. 4,777,145) und die Trennung von T- und B-Zellen auf Dichtegradienten (US-Pat. Nr. 4,511,662) ein. Auf dem Fachgebiet bekannte Zelltrennungsverfahren können den Nachteil eines Zellverlusts infolge des Klebens von Zellen an Röhrchen und Pipetten aufweisen. Es besteht ein Bedarf für schnelle und effiziente Mittel zur Isolierung von relativ seltenen Populationen von Zellen für diagnostische und therapeutische Verfahren. Die vorliegende Erfindung erfüllt diese Anforderung durch die Bereitstellung von Verfahren zur Isolierung oder Anreicherung von kleineren Populationen von gewünschten Zellen aus Zellquellen oder -gemischen, die eine Vielzahl von Zellpopulationen enthalten. Außerdem sorgt die Erfindung für die Sammlung von angereicherten Zellen in hoher Ausbeute.
Genauer besteht die erfindungsgemäße Entdeckung darin, daß durch das Bereitstellen von in hohem Grade definierten Zelltrennungsmedien, die eine genau gemessene spezifische Dichte haben, spezifische definierte Populationen von Zellen isoliert werden können. Außerdem stellt die Erfindung eine Zellabfangzentrifugationsvorrichtung bereit, die die Sammlung von Zellen durch dieses Verfahren erheblich verbessert. Alternativ oder zusätzlich wird das Verfahren durch Verwendung eines dichteregulierten Zellsortierungsschritts (DACS) verbessert, um einen höheren Spezifitätsgrad für das Trennungsverfahren vorzusehen. Die Erfindung stellt auch spezifische Verfahren zur Isolierung von drei spezifischen Zelltypen bereit, die bei diagnostischen und therapeutischen Verfahren wichtig sind - fötale kernhaltige Zellen, hämatopoetische (CD34&spplus;)-Vorläuferzellen und Brusttumorzellen.

3. Zusammenfassung der Erfindung

Gemäß einen Gesichtspunkt betrifft die Erfindung eine Zelltrennungsvorrichtung, die bei der Isolierung von Zellen durch Dichteverfahren nützlich ist. Die Vorrichtung schließt ein Zentrifugationsröhrchen ein, das einen verengten Bereich aufweist, der innerhalb des Röhrchens liegt. Der Verengungsteil ist so konstruiert und positioniert, daß Flüssigkeit im Bodenteil des Röhrchens zurückgehalten wird, wenn das Röhrchen umgedreht wird. Dieses Merkmal erlaubt das Dekantieren des Röhrchens ohne wesentliches Mischen von Inhalten zwischen Kompartimenten. Die Verengung weist vorzugsweise eine oder mehrere nach unten abfallende Oberflächen auf, die untere Randregionen haben, die eine Öffnung ausmachen, die eine beliebige Form haben kann, oder die eine Vielfalt von Öffnungen bilden können, so lange sie insofern wirksam ist, als sie Flüssigkeit nach dem Umdrehen des Röhrchens zurückhält. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Verengung ein kreisförmiger Ring. Vorzugsweise ist der Ring für einen Preßsitz im Röhrchen zur variablen Positionierung im Röhrchen konstruiert.
Die Vorrichtung schließt auch ein Zelltrennungsmedium ein, das im Bodenteil des Röhrchens enthalten ist. Das Medium liegt im Röhrchen bis zu einer Höhe über der durch die Verengung gebildeten Öffnung vor. Auf diese Weise können Zellen, die an einer Zwischenfläche zwischen dem Zelltrennungsmedium und einem Zellauftragsmedium geringerer Dichte gefangen sind, mit dem Medium geringerer Dichte abgegeben werden, wenn das Röhrchen umgedreht wird, ohne Mischen mit dem Inhalt des Bodenteils des Röhrchens.
Gemäß einer spezifischeren Ausführungsform schließt die Zentrifugenvorrichtung ein Röhrchen mit einem Ringteil ein, der darin angeordnet ist. Der Ringteil macht eine Öffnung aus, die eine kleinere Fläche als der Querschnitt des Röhrchens hat. Der Ringteil kann in dem Röhrchen integriert ausgebildet sein oder er kann längs der inneren Länge des Röhrchens zur Einstellung der Volumina beweglich sein. Das Röhrchen enthält auch eine Dichtegradientenlösung, die den unteren Teil und einen Teil des oberen Teils des Röhrchens bis zu einer Höhe mindestens über der Öffnung im Ringteil füllt. Zur Isolierung eines spezifischen Zelltyps hat die Dichtegradientenlösung eine Osmolalität von 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte innerhalb von 0,0005 g/ml der spezifischen Dichte der gewünschten Zellen.
Spezifische Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Vorrichtung schließen ein geschlossenes System ein, das ein Röhrchen einschließt, welches einen Verengungsteil und einen verschlossenen oberen Teil aufweist. Durchlaßöffnungen in dem oberen Teil dienen als Kanäle zur Einführung von Flüssigkeit in diese Röhrchenausführungsform, die auch eine Durchlaßöffnung aufweisen kann, die Verbindung zu dem Bodenteil des Röhrchens hat.
Alternativ ist eine andere Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung eine hier beschriebene zentrifugierbare Spritze. Die Spritze schließt einen Kolben mit einer verengten Region ein, die einen Flüssigkeit zurückhaltenden Raum im Spritzenboden bildet, der mit dem Flüssigkeit zurückhaltenden Raum vergleichbar ist, der durch die Verengung in der vorstehend beschriebenen Röhrchenvorrichtung gebildet wird.
Die Erfindung schließt auch die vorstehend beschriebene Vorrichtung in spezifischen Anordnungen ein, die zur Isolierung oder Anreicherung von spezifischen Zelltypen bestimmt sind. Zur Isolierung von spezifischen Zellen schließt die Vorrichtung ein Zell trennungsmedium ein, das eine spezifische Dichte hat, die innerhalb von mindestens ± 0,0005 g/ml und vorzugsweise innerhalb von mindestens ± 0,0002 g/ml der spezifischen Dichte der gewünschten Zellen liegt. In bevorzugten Aus%hrungsformen hat das Medium zur Isolierung von CD34&spplus;-hämatopoetischen Vorläuferzellen eine Osmolalität von 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte von 1,0605 g/ml; zur Isolierung von Fötalen kernhaltigen Zellen aus mütterlichem Blut hat die spezifische Dichte eine Osmolalität von 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte von 1,0720 g/ml; und zur Isolierung von Brusttumorzellen hat das Trennungsmedium eine Osmolalität von 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte ausgewählt aus dem Bereich 1,0490-1,0580 g/ml und stärker bevorzugt 1,0580 g/ml.
Gemäß einer damit in Beziehung stehenden Ausführungsform schließt die Erfindung Verfahren zur Isolierung von ausgewählten Zellen aus Zellengemischen gemäß der Verwendung der vorstehend gekennzeichneten Vorrichtung ein. Das Verfahren schließt das Einbringen eines Zellengemisches in die Vorrichtung, das Zentrifugieren der Vorrichtung bei einer Gravitationskraft, die ausreicht, die Zellen, die eine größere spezifische Dichte als die spezifische Dichte des Dichtegradientenmaterials in dem Röhrchen haben, zu pelletieren, und das Sammeln der ausgewählten Zellen aus dem oberen Teil des Röhrchens ein.
Das erfindungsgemäße Verfahren schließt ferner gemäß spezifischen Ausführungsformen Verfahren zur Isolierung oder Anreicherung von CD34&spplus;-hämatopoetischen Vorläuferzellen, Brusttumorzellen und fötalen kernhaltigen Zellen aus Zellengemischen ein. Basierend auf der Entdeckung des Anmelders, daß in hohem Grade definierte Medien verwendet werden können, um spezifische Zelltypen zu isolieren, schließt die Erfindung die Verwendung der vorstehend beschriebenen spezifischen Dichte- und Osmolalitätsbedingungen ein, d. h. die Verwendung von Medien, die auf ± 0,0005 oder vorzugsweise auf ± 0,0002 g/ml bestimmt sind, um Zellen in einem einzigen Medium spezifischer Dichte zu isolieren. CD34&spplus;-Zellen, die isoliert werden können, schließen Kolonie-bildende Zellen und Zellen mit einem Langzeitinitiationsvermögen ein. Fötale kernhaltige Zellen schließen kernhaltige Erythrocyten und Trophoblasten ein. In einer anderen Ausführungsform schließt die Erfindung ein Verfahren zur Isolierung von natürlichen Killerzellen oder natürlichen Suppressorzellen unter Verwendung eines Mediums ein, das eine Dichte von 1,0605 ± 0,0005 g/ml und eine Osmolalität von 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O hat.
In einer anderen Ausführungsform schließt das erfindungsgemäße Verfahren die Inkubation des Zellengemisches, aus dem Zellen isoliert werden sollen, mit zelltypspezifischen Bindemitteln ein, die vor der Zentrifugation über das Zelltrennungsmedium an Trägerpartikel gebunden wurden. In einer bevorzugten Ausführungsform haben die Partikel eine spezifische Dichte, die mindestens 0,001 g/ml größer als die spezifische Dichte des Zelltrennungsmediums ist, zur Sedimentation unerwünschter Zellen, gegen die die Bindemittel gerichtet sind. Die gemäß diesem erfindungsgemäßen Gesichtspunkt verwendeten Bindemittel können Antikörper, Lektine, Cytokine und ähnliches einschließen. Ein spezifisches Bindemittel, das bei der Dezimierung von Leukocyten nützlich ist, ist ein anti-CD45-Antikörper. In einer anderen Ausführungsform können die spezifischen Bindemittel gegen die Zellen von Interesse zur selektiven Sedimentation davon gerichtet sein. Spezifische Ausführungsformen schließen Trägerpartikel ein, die aus Silan-aktiviertem Silica und vorzugsweise 3-Aminopropyltriethoxysilan-aktiviertem Silica gebildet werden.

4. Kurze Beschreibung der Zeichnungen

Fig. 1A-C zeigen Querschnittsansichten einer erfindungsgemäßen Zentrifugationsvorrichtung, die die Schritte der Isolierung oder Trennung von Zellen gemäß einem der erfindungsgemäßen Verfahren veranschaulichen;
Fig. 2A und 2B zeigen schematische Querschnitts- (2A) und perspektivische (2B) Ansichten einer Ausführungsform der Zentrifugenröhrchenvorrichtung, die eine Abschirmung einschließt;
Fig. 3 zeigt eine Querschnittsansicht einer alternativen Ausführungsform des Verengungsteils der Zentrifugenvorrichtung mit einem Ventil;
Fig. 4A-F zeigen Querschnittsansichten von alternativen Ausführungsformen des unteren Teils des erfindungsgemäßen Röhrchens und Verengungsteils;
Fig. 5A und 5B zeigen Querschnittsansichten von weiteren alternativen Ausführungsformen der Erfindung, die mehrere Verengungsteile aufweisen;
Fig. 6 zeigt eine alternative Ausführungsform der Zentriftigenröhrchenvorrichtung in einem geschlossenem System, das zur Behandlung von sterilen Proben geeignet ist;
Fig. 7 zeigt eine zentrifugierbare Spritzenausführungsform der erfindungsgemäßen Zentrifugenvorrichtung;
Fig. 8(A-D) zeigen eine schematische Zeichnung, die ein herkömmliches (8A, B) mit einem dichteregulierten Zellsortierungsverfahren (8C, D) vergleicht;
Fig. 9A-9C zeigen einen Vergleich von Zellzahlen bei drei Zellpräparationen, die durch das herkömmliche Verfahren unter Verwendung von "FICOLL" als Dichtematerial (Fig. 9A), "FICOLL" plus Zellabfangröhrchen (Fig. 9B) und einem regulierten "PERCOLL"-Dichtegradienten plus Zellabfangröhrchen (Fig. 9C) isoliert wurden;
Fig. 10 zeigt die Verteilung von Kolonie-bildenden Einheiten (CFU's) in der Zwischenfläche und in Pelletfraktionen;
Fig. 11 zeigt die Verteilung von verschiedenen Typen von CFU's in der Zwischenfläche und in Pelletfraktionen;
Fig. 12 zeigt die Verteilung des Langzeitkulturinitiationsvermögens (LTC-IC) in der Zwischenfläche und in Pelletfraktionen;
Fig. 13 zeigt die Verteilung von T-Zellen in der Zwischenfläche und in Pelletfraktionen;
Fig. 14 zeigt die Verteilung der natürlichen Suppressoraktivität in Fraktionen unterschiedlicher Dichte;
Fig. 15 zeigt die Verteilung der natürlichen Killeraktivität in Fraktionen unterschiedlicher Dichte;
Fig. 16A-16F zeigen die durchflußcytometrische Analyse einer CD34&spplus;-Zellanreicherung nach Dichtegradientenzentrifugation plus dichteregulierter Zellsortierung;
Fig. 17A-17D veranschaulichen die Anreicherung von 4 Typen von Brusttumorzellen unter Anwendung des erfindungsgemäßen Zelltrennungsverfahrens; und
Fig. 18A-18D veranschaulichen die Brusttumorzellanreicherung von Brusttumorzellen, die Zellen bei einer spezifischen Dichte von 1,0580 g/ml hinzugefügt wurden. Warenzeichenbezeichnungen sind hier durch hochgestellte Buchstaben gekennzeichnet und in Anführungszeichen eingeschlossen.

5. Ausführliche Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur schnellen und ertragsreichen Isolierung oder Anreicherung einer gewünschten Zellpopulation aus Körperflüssigkeiten, dispergierten Gewebeproben, gezüchteten Zellen und ihren Komponenten. Das Verfahren basiert auf der Dichtegradientenzentrifugation von ausgewählten Zellengemischen unter Verwendung von in hohem Grade definierten Dichtegradientenmedien. Genauer schließt die vorliegende Erfindung eine spezifisch entwickelte Zellabfangzentrifugationsröhrchenvorrichtung ein, die eine Dichtegradientenlösung enthält, die die Ausbeute maximiert und die Wirksamkeit des Sammelverfahrens verbessert.
Die allgemeine Erfindung schließt auch Zelltrennungsverfahren zur Isolierung von spezifischen Zelltypen ein: fötalen Zellen, hämatopoetischen CD34&spplus;-Vorläuferzellen und Brusttumorzellen, und wird dadurch veranschaulicht. Jeder dieser Zelltypen veranschaulicht eine wichtige diagnostische und/oder therapeutische Verwendung von Zellen, die durch die erfindungsgemäßen Verfahren isoliert werden. Zum Beispiel, wie hier beschrieben, können kernhaltige fötale Zellen aus zirkulierendem mütterlichem Blut zum Zwecke der Durchführung einer Vielzahl von genetischen Analysen, z. B. Chromosomenanalyse, isoliert werden. Brusttumorzellen können aus zirkulierendem Blut zum Zwecke der Durchführung von diagnostischen Tests, z. B. einer cytologischen Untersuchung, oder zum Zwecke der Entfernung von Tumorzellen aus einer Blutprobe, die zur späteren Reinfusion vorgesehen ist, z. B. Transfusionen oder Transplantationen, isoliert werden. Hämatopoetische Vorläuferzellen können aus Blut oder Knochenmark zur Verwendung als Donorzellen bei einer Knochenmarktransplantation isoliert werden.

5.1. Dichtegradienten-Zelltrennungsverfahren

Dieser Abschnitt beschreibt Zelltrennungsverfahren unter Verwendung von erfindungsgemäßen spezifischen Dichtegradienten. Genauer enthalten die Abschnitte, die folgen, Beschreibungen von bestimmten erfindungsgemäßen Gesichtspunkten: (1) die Verwendung eines Zellabfangzentrifugationsröhrchens in Verbindung mit einem bestimmten Zelltrennungsmedium, um spezifische Zelltypen zu isolieren (Abschnitt 5.1.A); (2) die Verwendung eines Einstufen-Gradientenmediums genauer Dichte, um bestimmte Zelltypen zu isolieren (Abschnitt 5.1.B); und (3) die Verwendung von an spezifische Bindemittel gekoppelten Trägerpartikel, um die Wirksamkeit der erfindungsgemäßen Zelltrennnungsverfahren zu verbessern (Abschnitt 5.2). Außerdem wird die Isolierung der veranschaulichten Zelltypen unter Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren in Abschnitt 5.3. beschrieben.

5.1.A. Zellabfangzentrifugenvorrichtung

In einer bevorzugten Ausführungsform schließt die vorliegende Erfindung eine Zentrifugenvorrichtung und deren Verwendung zur Dichtetrennung von ausgewählten Zelltypen ein. Erfindungsgemäß bezieht sich der Begriff "Zellabfangröhrchen" auf ein Zentrifugenröhrchen, das einen Teil der Vorrichtung bildet und das eine Verengung einschließt, die eine "Abfangvorrichtung" oder eine Flüssigkeit aufnehmende Region im Bodenteil des Röhrchens bildet. Wie durch die folgende Beschreibung und die folgenden Zeichnungen der spezifischen Ausführungsformen veranschaulicht wird, ist ein wichtiges Merkmal der Verengung, daß sie in dem Röhrchen in einer Weise positioniert ist, daß Flüssigkeit im Bodenteil des Röhrchens unter dem Verengungsteil zurückgehalten wird, wenn das Röhrchen umgedreht wird. Die erfindungsgemäße Vorrichtung schließt auch Zelltrennungsmaterial zur Dichtetrennung von Zellen ein.
Eine bevorzugte Ausführungsform der erfindungsgemäßen Zentrifugationsvorrichtung ist im Querschnitt in Fig. 1A und B gezeigt. Wie gezeigt, schließt Röhrchen 10 einen Verengungsteil 12 ein, der eine zentrale Öffnung 14 ausmacht. Der Verengungsteil 12 weist vorzugsweise eine oder mehrere nach unten abfallende Oberflächen auf, die untere Randregionen haben, die eine verengte Öffnung 14 ausmachen.
Die Bodenoberfläche des Verengungsteils kann auch vielleicht in ähnlicher Weise leicht gewinkelt sein (obwohl nicht als solches in den Figuren gezeigt). In einer beispielhaften Ausführungsform mit einem Röhrchen, das einen Innendurchmesser von etwa 2,8 cm hat, beträgt der Durchmesser der durch den Verengungsteil 12 gebildeten Öffnung 14 vorzugsweise etwa 0,5 cm. Die Größe der Öffnung 14 ist im allgemeinen nicht so Mein, daß schwerere Komponenten einer Probe, die auf die Dichtegradientenlösung überschichtet wurde, am Durchgang durch die Öffnung vor der eigentlichen Zentrifugation gehindert werden. Eine solche Bewegung von Komponenten kann auf Grund von normalen Gravitationskräften auftreten. Im allgemeinen wird der Durchmesser der Öffnung 14 durch die Fähigkeit vorgegeben, eine erhöhte Oberflächenspannung entlang der Öffnung zu erzeugen. Eine Begrenzung, die kaum mehr als ein Rand um den Innenraum des Zylinders ist, kann ausreichend sein, um eine solche Oberflächenspannung vorzusehen. Daher kann die Querschnittsfläche der Öffnung, die von dem Verengungsteil gebildet wird, so klein wie etwa 5% oder so groß wie etwa 95% des horizontalen Querschnittsoberflächenbereichs des Röhrchens sein.
Während der in Fig. 1A-D und 2A-B veranschaulichte Verengungsteil kreisförmig (z. B. ringförmig) ist, ist erkennbar, daß der Verengungsteil eine Reihe von Öffnungsformen oder eine Vielfalt von Öffnungen bilden kann. Die Form von Öffnung 14 ist nicht auf eine Kreisform begrenzt, obwohl im allgemeinen ein trichterförmiger Verengungsteil bevorzugt wird, der eine annähernde Kreisform bildet. Die Öffnung kann auch oval, rechteckig, sternförmig oder eine andere Form sein, die einen begrenzten Durchgang in dem Röhrchen erzeugt, mit der Maßgabe, daß die Geometrie für die Erzeugung einer ausreichenden Oberflächenspannung sorgt, um die Abgabe von Flüssigkeit in den Boden des Röhrchens nach dem Umdrehen zu verhindern, wie vorstehend beschrieben. Außerdem kann der Verengungsteil ein Gitter oder Sieb umfassen, das den horizontalen Querschnitt des Röhrchens überspannt. In diesem Fall ist der Ringteil auch der Teil, der eine Vielfalt von Öffnungen umfaßt.
Außerdem, während die Öffnung vorzugsweise horizontal in dem Röhrchen zentriert ist, kann die Öffnung auch unmittig sein und im wesentlichen die gleichen Ergebnisse erzielen. Im Hinblick auf die vertikale Konstruktion und Positionierung im Röhrchen kann der Verengungsteil in dem Röhrchen integriert ausgebildet werden oder kann für einen Preßsitz konstruiert sein. Zum Beispiel kann ein ringförmiger Verengungsteil aus einem elastomeren Siliconmaterial gebildet werden, das in das Röhrchen durch einen Preßsitz in jeder Position entlang der Länge des Röhrchens eingesetzt werden kann.
Wieder unter Bezugnahme auf Fig. 1A wird das Röhrchen 10 mit einer Zelltrennungsdichtegradientenlösung 16 bis zu einer Höhe über dem Verengungsteil 12 oder minimal mindestens über Öffnung 14 gefüllt. Vorzugsweise, unter Bezugnahme auf ein 50 ml-Standardzentrifügationsröhrchen, wird die Dichtegradientenlösung 16 bis zu einer Höhe von mindestens etwa 1 mm über den Verengungsteil eingefüllt. Die zu trennende flüssige Probe 18 wird oben auf die Dichtegradientenlösung 16 überschichtet und das Röhrchen und dessen Inhalt werden einer Zentrifugation unterzogen. Vorzugsweise wird die Probe vorsichtig überschichtet, so daß mindestens etwa 1 mm Dichtegradientenlösung zwischen der Probe und dem oberen Teil des Verengungsteils nach dem Überschichten verbleibt.
Unter Bezugnahme auf Fig. 1B findet man nach der Zentrifugation Komponenten, die eine größere Dichte als die Gradientenlösung haben, in einem Pellet 20 am Boden des Röhrchens 10. Zelluläre Komponenten, die eine geringere Dichte als die Dichtegradientenlösung 16 haben, schwimmen oben auf der Lösung in einer Zwischenfläche 22 zwischen der Gradientenlösung und dem zurückbleibenden Teil der flüssigen Probenlösung. Der Zwischenflächenteil wird dann entfernt. Eine solche Entfernung kann durch Dekantieren des Röhrchens erfolgen, wie durch Pfeil 24 in Fig. 1C angegeben ist. Die Bereitstellung der Dichtegradientenlösung bis zu einer Höhe über der Öffnung, wie vorstehend beschrieben, trägt dazu bei, die Bildung eines Zwischenflächenteils unter dem Verengungsteil 12 zu verhindern.
Ohne sich einer bestimmten zugrundeliegenden Theorie der Funktionsweise des Röhrchens zu verschreiben, wird angemerkt, daß der Verengungsteil 12 das Abgießen des oberen Teils durch Bereitstellen eines Trägers oder Kerns zur Bildung einer mittleren Oberflächenspannung entlang der Fläche der Öffnung 14 erleichtert, wenn das Röhrchen zum Abgießen geneigt wird. Diese Oberflächenspannung verhindert das Mischen des oberen und unteren Teils des Röhrchens, wenn der Inhalt des oberen Teils aus dem Röhrchen gegossen wird. Der Verengungsteil 12 kann als ein Einsatz bereitgestellt werden, der in ein Röhrchen mit geraden Wänden eingesetzt wird. In einer anderen Ausführungsform kann der Verengungsteil 12 als Verengung der Röhrchenwand während eines Formgebungsverfahrens bei der Herstellung des Röhrchens selbst gebildet werden. Wenn der Verengungsteil durch einen Einsatz bereitgestellt wird, kann der Einsatz beweglich sein, um den Bediener in die Lage zu versetzen, die relativen Volumina des unteren Teils 26 und des oberen Teils 28 von Röhrchen 10 entsprechend den Versuchsbedingungen zu verändern. Die Position des Verengungsteils in einem formgepreßten Röhrchen kann während des Herstellungsverfahrens ebenfalls variiert werden, um Röhrchen mit unterschiedlichen relativen oberen und unteren Teilvolumina bereitzustellen. Zum Beispiel erfordert eine 20 ml-Blutprobe bei der Isolierung von Zellen aus peripherem Blut, daß der untere Teil 26 etwa 15 ml ausmacht, um die verhältnismäßig große Menge an abzentrifugierten Erythrocyten aufzunehmen. Zum Vergleich, eine 20 ml-Probe von Apherese- oder Leukocytenmanschetten-Blut würde nur etwa 10 ml im unteren Teil erfordern.
Bei vielen Anwendungen ist es wünschenswert, nur die Überstandsfraktion zu sammeln, die den Zwischenflächenteil enthält. In solchen Fällen wird das Pellet mit dem Röhrchen verworfen. In anderen Fällen kann das Pellet durch mechanische Manipulation/Disruption entfernt werden. Zum Beispiel kann das Röhrchen umgedreht und einem Mischschritt mit einem Vortexgerät unterzogen werden. Ein solcher Mischschritt bricht das Pellet in die benachbarte flüssige Phase hinein auf und induziert die Bewegung dieser flüssigen Phase und der aufgebrochenen Zellen von dem unteren oder Sammlungsteil des Röhrchens in den oberen Teil des Röhrchens.
Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist, daß das Material geringer Dichte über dem Verengungsteil von dem Material darunter durch die einfache Wirkung des Abgießens oder Dekantierens des Inhalts des oberen Teils des Röhrchens getrennt wird. Dies steht im Gegensatz zu vielen herkömmlichen Verfahren der Entnahme von Gradiententrennungen unter Verwendung von Standardzentrifugenröhrchen mit geraden Wänden, bei denen Materialien durch vorsichtiges Pipettieren aus dem Röhrchen oder alternativ durch Durchstechen des Bodens des Röhrchens und langsames Abtropfenlassen des Inhalts des Röhrchens in Sammelbehälter getrennt werden. Somit stellt die vorliegende Erfindung ein bequemes, einfaches Mittel zur Entnahme von unterschiedlich getrennten Materialien bereit.
Im allgemeinen hat bei der Trennung von Zellen durch Dichtezentrifugation unter Verwendung des erfindungsgemäßen Röhrchens eine Lösung, wie die Lösung 18 in Fig. 1A, die ein Zellengemisch enthält, das auf das Dichtegradientenmedium oder -material in dem Röhrchen geladen wird, eine spezifische Dichte, die geringer ist als die spezifische Dichte des Dichtegradienten- oder Zelltrennungsmediums in dem Röhrchen. Während der Zentrifugation lagern sich Zellen, die eine spezifische Dichte haben, die geringer oder gleich der Dichte des Zelltrennungsmediums ist, in der Zwischenfläche ab, die zwischen der Auftragslösung und dem Dichtegradientenmaterial gebildet wird.
Ein anderer Vorteil des erfindungsgemäßen Röhrchens ist, daß anders als bei herkömmlichen Röhrchen mit geraden Wänden, wenn das Röhrchen fallengelassen oder versehentlich umgedreht wird, der Inhalt des getrennten unteren und oberen Teils sich auf Grund des Vorhandenseins des Verengungsteils nicht ohne weiteres mischt. Außerdem, nachdem die Trennung stattgefunden hat, kann die über dem Verengungsteil vorliegende Lösung in dem Röhrchen ohne Beeinträchtigung (oder Befürchtung einer Verunreinigung durch) des (den) Inhalts (Inhalt) des Röhrchens unter dem Verengungsteil gemischt werden.
In einer alternativen bevorzugten Ausführungsform kann das Röhrchen 10 mit einem Einsatz oder einer Abschirmung 30 bereitgestellt werden, wie in Fig. 2A und 2B gezeigt. Die Abschirmung 30 wird über dem Verengungsteil 12 vorgesehen, um das Überschichten der Probe auf die Gradientenlösung zu erleichtern. Die Abschirmung 30 kann in Form eines annähernd konzentrischen Einsatzes vorliegen, der in dem oberen Teil des Röhrchens eingesetzt wird und sich zumindest teilweise um das Röhrchen herum erstreckt. Bei der Verwendung pipettiert der Betreiber Material zwischen die Abschirmung 30 und die Röhrchenwand. Die Abschirmung leitet das Material entlang der Seite des Röhrchens auf den oberen Teil der Dichtegradientenlösung, während eine Störung der Lösung auf ein Minimum verringert wird. Wie in Fig. 2B gezeigt, besteht Röhrchen 10 aus durchsichtigem Kunststoff oder Glas, wobei der Verengungsteil 12 als ein getrennter Siliconeinsatz ausgeformt ist. Die Abschirmung 30 kann im oberen Teil des Röhrchens zum Beispiel durch Interferenzsitz mit Distanzstücken 31, die gegen die Röhrchenwand gerichtet sind, gehalten werden. In einer anderen Ausführungsform könnte Abschirmung 30 als Teil des Röhrchens gebildet werden.
Die Trennung von Materialien kann durch das Hinzufügen eines Ventils 40 zu dem Verengungsteil weiter verbessert werden, wie in Fig. 3 gezeigt. Das Ventil 40 ist über der Öffnung 14 angeordnet. Das Ventil 40 kann ein Rückschlagventil oder ein Ventil sein, das sich nur nach Anwendung einer Schwellenzentrifugalkraft öffnet. Das Ventil kann durch das Bereitstellen von Klappen aus einem weicheren Material über der Öffnung gebildet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform würde die zum Öffnen von Ventil 40 erforderliche Kraft dem 850fachen der normalen Gravitationskraft entsprechen. Das Ventil 40 erlaubt auf diese Weise, daß schwere Zellen während der ersten Zentrifugation hindurch laufen, und hält dann diese Zellen fest, was die weitere Behandlung der leichteren Zellen von Interesse ermöglicht, die sich über dem Ventil befinden (wie Waschen oder Mischen der Zellen). Auf diese Weise kann eine vollständige und letzte Manipulation der Zellen in einem einzigen sterilen Behälter durchgeführt werden.
Fig. 4A-F sind Darstellungen von alternativen Formen und Anordnungen für das Röhrchen und den Verengungsteil der vorliegenden Erfindung. Fig. 4A zeigt ein alternatives Röhrchen 42, das ein getrenntes Bodenkompartiment 44 für das Empfangen des Pellets aufweist, um eine optimale Sammlung von Zellen vorzusehen. Der Verengungsteil 12 ist wie vorstehend beschrieben; er ist an seiner Oberfläche trichterförmig und wird von einem separaten Einsatz aus Kunststoff oder vorzugsweise Silicon gebildet. Fig. 4B zeigt ein Röhrchen 46 mit einer zugespitzten Bodenwand. Das Röhrchen 46 mit der zugespitzten Bodenwand verbessert die Zellsammlung ebenfalls, indem es erlaubt, daß die schwereren Zellen ein besseres Pellet bilden, was wünschenswert sein kann, wenn die Zellen gesammelt werden sollen. Der Verengungsteil 48 ist wieder ein Einsatz, aber mit einer flachen Oberfläche und einer breiteren Öffnung. Fig. 4C veranschaulicht ein anderes Röhrchen 50 mit einem integriert ausgebildeten Verengungsteil 52. Fig. 4D zeigt einen anderen Verengungsteil 54, der die Bewegung im Röhrchen 55 erleichtert, um das relative Volumen des unteren und oberen Teils einzustellen. Aus diesem Grund weist der Verengungsteil 54 ringförmig erweiterte Kontaktpunkte 56 auf. Der Verengungsteil kommt mit dem Röhrchen nur an diesen Punkten in Kontakt, was einen flüssigkeitsdichten Verschluß bildet, aber eine leichtere Regulierbarkeit erlaubt. Das Röhrchen 55 weist auch einen flachen Boden auf.
Fig. 4E veranschaulicht eine weitere alternative erfindungsgemäße Ausführungsform, bei der Röhrchen 60 ein Zellabfangmaterial 62, wie einen Schwamm oder ein Gel, einschließt. Das Material 62 kann Verbindungen enthalten, die bestimmte Zelltypen oder Toxine, die spezifische Zelltypen abtöten, spezifisch binden. Das Material 62 kann gegebenenfalls auch aus magnetischem Material hergestellt sein. Das in Fig. 4F gezeigte Röhrchen 64 veranschaulicht ein weiteres Beispiel eines integriert ausgebildeten Verengungsteils 66 in einem Röhrchen mit einer flachen Bodenwand 68. Der Verengungsteil 66 ist angeordnet, so daß der untere Teil 26 ein kleineres relatives Volumen hat.
Fig. 5A und 5B veranschaulichen weitere alternative Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Röhrchens. In jeder werden zwei Verengungsteile bereitgestellt. Der zweite Verengungsteil 12A ist über dem ersten Verengungsteil 12B angeordnet, um mehrere Kompartimente zu erzeugen, um die Trennung von Zellen mit unterschiedlicher Dichte zu erlauben. In Fig. 5A sind die Verengungsteile als separate Einsätze gezeigt, während sie in dem Röhrchen in Fig. 5B integriert ausgebildet werden. Weitere Verengungsteile können auch hinzugefügt werden, wenn eine Probe mit mehreren verschiedenen Dichten getrennt werden soll.
Fig. 6 veranschaulicht eine erfindungsgemäße Zentrifugenvorrichtung, die in ein geschlossenes System eingearbeitet ist. Ein solches System ist zur sterilen Behandlung von Proben, wie zum Beispiel Blutproben oder Proben, die später in einen Patienten mittels Infusion eingeführt werden sollen, besonders nützlich. Wie veranschaulicht, schließt das geschlossene System 70 einen Vorratsbehälter 71 ein, der als steriler Beutel gezeigt ist, der Blut 72 enthält, das vorher durch bekannte Verfahren gesammelt wurde, und durch einen sterilen Verbindungsschlauch 74 mit dem Zentrifugenröhrchen 76 verbunden ist, das als ein Zentrifugenröhrchen vom "Behälter"("bucket")-Typ veranschaulicht ist, das einen verschlossenen oberen Teil 77 aufweist. Der verschlossene obere Teil weist mindestens eine und vorzugsweise mindestens zwei Eingangs-Durchlaßöffnungen auf, die zum Einführen und zur Entnahme einer Probe und zum Belüften nützlich sind, wie nachstehend beschrieben. In der gezeigten Ausführungsform ist eine feste schmale Leiste 79 eingeschlossen, die von dem verschlossenen oberen Teil 77 nach oben hervorsteht, um eine Schutzwand für die Eingangs- Durchlaßöffnungen zu bilden, und als Befestigungspunkt für einen schutzgewährenden, abnehmbaren Deckel für die Vorrichtung, der dazu dient, eine mögliche Verunreinigung während des Versands und der Lagerung zu verringern.
Unter der weiteren Bezugnahme auf Fig. 6 ist der Schlauch 74 an das Röhrchen 76 über die Eingangs-Durchlaßöffnung 78 gebunden, die mit einem Anschlußstück 80 versehen ist, das ein beliebiger Typ eines Schließendstücks sein kann, das zur sterilen Verbindung angepaßt ist, zum Beispiel ein Luer-LockTM-Spritzenverbindungsstück. In einer anderen Ausführungsform kann das Anschlußstück 80 ein steriles Septum sein, das zur Verbindung mit sterilen Flüssigkeitsbeuteln und Röhrchen angepaßt ist, zum Beispiel ein kleine SAFSITETM-Drahtverlängerungsapparatur mit Rückflußventil und Spin-LookTM Adapter, erhältlich von Burron Medical Inc., Bethlehem, Pennsylvania. Um den Flüssigkeitsfluß in das Zentrifugenröhrchen 76 zu erleichtern, enthält die Vorrichtung eine Belüftungsöffnung 82. Wie gezeigt, ist ein Luftfilter 84 an der Eingangs-Durchlaßöffnung befestigt, um einer Verunreinigung vorzubeugen.
Erfindungsgemäß schließt Röhrchen 76 einen Verengungsteil 88 ein, der gebildet wird, wie vorstehend beschrieben; er ist an seiner Oberfläche trichterförmig. Wie veranschaulicht, wird der Verengungsteil 88 integriert ausgebildet, wobei das Röhrchen 76 eine Vertiefung 89 auf der Außenfläche des Röhrchens bildet. Der Verengungsteil wird durch Träger 90 gestützt, um eine Komprimierung während der Zentrifugation zu verhindern. Der Behälter enthält auch dichtes Material 91, das in dem Röhrchen sowohl über als auch unter dem Verengungsteil 88 verteilt ist.
Ein zusätzliches Merkmal von Röhrchen 76 ist die Eingangs-Durchlaßöffnung 92. Diese Eingangs-Durchlaßöffnung ist über einen verschlossenen Flüssigkeitskanal 94 mit dem Bodenteil 95 von Röhrchen 76 verbunden. Die Eingangs-Durchlaßöffnung und der Kanal werden verwendet, um den unteren Teil des Röhrchens 95 zum Beispiel mit Dichtegradienten-Zelltrennungsmedium zu füllen. In einer anderen Ausführungsform können die Durchlaßöffnung und der Kanal verwendet werden, um Materialien einschließlich Zellpelletmaterialien vom Boden des Röhrchens nach der Zentrifugation zu entfernen. Dieses Merkmal des Röhrchens ist weder erforderlich noch auf den Zusammenhang mit dem geschlossenen System begrenzt, an dem es veranschaulicht wird.
Der Flüssigkeitsfluß aus dem Vorratsbehälter 70 in das Röhrchen 76 kann durch Anlegen eines Saugzugs an die Belüftungsöffnung 82 in Gang gesetzt werden oder er kann durch andere auf dem Fachgebiet bekannte Mittel einschließlich der Schwerkraft eingeleitet werden. Die Durchflußrate wird entweder durch Verändern der Druckhöhe zwischen den beiden Behältern oder durch Regulieren eines Ventils, das im Röhrchen oder an der Eingangs-Durchlaßöffnung an einem Punkt zwischen Vorratsbehälter 70 und Eingangs- Durchlaßöffnung 78 positioniert ist, eingestellt. Die Durchflußrate wird optimal reguliert, um den oberen Teil des Röhrchens 76 über die Höhe der Dichtegradientenlösung zu füllen oder zum Teil zu füllen. Wenn eine ausreichende Menge der flüssigen Probe in das Röhrchen eingetreten ist, kann der Fluß durch ein beliebiges einer Reihe von auf dem Fachgebiet bekannten Mittel beendet werden, wie durch Regulierung durch ein Ventil oder durch Verringerung der Druckhöhe. Der Schlauch wird dann aus dem Behälter entfernt, die Durchlaßöffnung 78 wird luftdicht verschlossen und der Behälter wird einer Zentrifugation unterzogen, wie vorstehend beschrieben.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann das Zellabfangröhrchen in Form einer zentrifugierbaren Spritze, wie die in Fig. 7 veranschaulichte Zentrifugenspritze 110, verwendet werden. Wie veranschaulicht, schließt die Zentrifugenspritze 110 einen Probenbehälter 114 mit einer zentralen Öffnung, die vom Anschlußstück 112 umgeben ist, das zur Aufnahme einer Nadel 113 angepaßt ist, einen Haltegriff 116 und einen Kolben 118 ein. Das Anschlußstück 112 kann ein beliebiger Typ eines Schließendstücks sein, das zur Aufnahme einer Nadel angepaßt ist, zum Beispiel eine Luer-LockTM-Spritzenspitze: In einer anderen Ausführungsform kann das Anschlußstück 112 ein steriles Septum sein, das zur Verbindung mit sterilen Flüssigkeitsbeuteln und Röhrchen angepaßt ist, zum Beispiel eine kleine SAFSITETM-Drahtverlängerungsapparatur mit Rückflußventil und Spin-LookTM- Adapter, erhältlich von Burron Medical Inc., Bethlehem, Pennsylvania.
Der Haltegriff 116 umfaßt ferner vorzugsweise einen Knopf 122 und eine abnehmbare Verbindung 124 zu Kolben 118. Wie gezeigt, besteht Kolben 118 aus einem Stück, das aus einem Kunststoffmaterial maschinell hergestellt oder formgepreßt ist. Der Kolben weist vorzugsweise eine trichterförmige Bodenwand 126 auf, die mit dem Handgriff am Verbindungsstück 124 abnehmbar verbunden ist. Die Seitenwand 127 ist vorzugsweise genau an die Behälterwand angepaßt, um eine Gleitbewegung zu erlauben, aber noch eine im wesentlichen flüssigkeitsdichte Barriere darum bereitzustellen. Eine obere Wand wird durch den Verengungsteil 128 gebildet, der eine zentrale Öffnung 129 ausmacht. In einer anderen Ausführungsform kann der Außendurchmesser der Seitenwand 127 geringfügig kleiner sein, um das Gleiten zu erleichtern, und ein o-ringförmiger Verschluß zwischen der Seitenwand 127 und dem Behälter 114 kann vorgesehen werden. Die abnehmbare Verbindung 124 kann die Form von zum Beispiel einer Verschraubung oder eines Schnappverschlußes annehmen. Vorzugsweise sorgt die Verbindung 124 auch für die erneute Befestigung des Handgriffs 116.
Der Kolben 118 wird mit einem Dichtegradientenmaterial 120 vor der Einführung der Probe gefüllt. Vorzugsweise wird das Dichtegradientenmaterial bis zu einer Höhe über dem Verengungsteil oder mindestens über dem oberen Teil der Öffnung 129 eingefüllt. Zum Beispiel, wenn eine 50 ml-Standardspritze verwendet wird, die einen Innendurchmesser von etwa 2,8 cm hat, wird das Gradientenmaterial vorzugsweise bis zu einer Höhe von etwa 1 mm oder mehr über den Verengungsteil 128 eingefüllt, so daß sich die Zwischenfläche über dem Verengungsteil 128 bildet.

5.1.B. Dichtegradientenmaterialien und Herstellung

Gemäß einem wichtigen Gesichtspunkt der Erfindung wurde festgestellt, daß eine signifikante Anreicherung von spezifischen Zellen durch Zentrifugation eines Zellengemisches auf einem einschichtigen Zelltrennungsmedium, das eine hinreichend definierte spezifische Dichte hat, bewirkt werden kann. Die definierte spezifische Dichte entspricht annähernd der Dichte des gewünschten Zelltyps, der isoliert werden soll. Wichtig ist, daß das Zelltrennungsmedium in einer Genauigkeit von ± 0,0005 g/ml und vorzugsweise ± 0,0002 g/ml der spezifischen Dichte des gewünschten spezifischen Zelltyps hergestellt werden muß. Unter Verwendung eines solchen hinreichend definierten Mediums können spezifische Zelltypen durch Zentrifugation auf einem Medium einer Dichte in einem herkömmlichen Zentrifugenröhrchen isoliert werden. Jedoch, wie hier gezeigt, erleichtert die Verwendung eines Zellabfangröhrchens in Verbindung mit einem solchen Medium im allgemeinen die Handhabung und verbessert die Ausbeute.
Die Zelltrennungsvorrichtung und die Zelltrennungsverfahren der vorliegenden Erfindung schließen die Verwendung eines Zelltrennungsmaterials ein, wie ein Dichtegradientenmaterial, das eine spezifische Schwere zwischen 1,0000 g/ml und 2,0000 g/ml, vorzugsweise zwischen 1,0300 g/ml und 1,2000 g/ml hat, die innerhalb von ± 0,0005 g/ml und vorzugsweise ± 0,0002 g/ml der spezifischen Schwere der gewünschten Zelle genau ist. Eine Vielzahl von im Handel erhältlichen Gradientenmaterialien kann verwendet werden, um eine Zellisolierung auf Grund der definierten Dichte der gewünschten Zellpopulation durchzuführen, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, "PERCOLL", erhältlich von Pharmacia; "FICOLL-HYPAQUE"; jeglicher Zuckerlösung, z. B. Saccharose; Dextran; jeglicher Proteinlösung, z. B. Rinderserumalbumin (BSA); mit Iod markierter Verbindungen mit niedrigem Molekulargewicht, wie Metrizamid; und schwerer Salze, z. B. Cäsiumchlorid.
Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung sollte die Dichtegradientenlösung hergestellt und auf eine vorbestimmte Dichte; eine vorbestimmte Osmolalität, besonders bevorzugt im Bereich von 280 bis 320 mOsm/kg H&sub2;O; und einen vorbestimmten pH-Wert, vorzugsweise 6,8 bis 7,8 und besonders vorzugsweise pH 7,4, zur Aufrechterhaltung eines physiologisch isotonischen Dichtegradienten vor der Verwendung eingestellt werden. Die Osmolalität und der pH-Wert können in Abhängigkeit von den einzelnen Bedingungen, unter denen das Dichtegradiententrennungsverfahren durchgeführt wird, variieren. Zum Beispiel kann die Temperatur, bei der die Proben aufbewahrt oder zentrifugiert werden, Modifikationen der Osmolalität und/oder des pH-Werts des Dichtegradientenmaterials notwendig machen, um die geeignete Dichte aufrechtzuerhalten. Solche Modifikationen der Osmolalität und des pH-Werts sind für den Fachmann offensichtlich.
Zellproben sollten innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums nach der Sammlung verarbeitet werden, da sich die Dichte der Zellen gemäß den Kultur-, Sammlungs- und Lagerungsbedingungen verändern kann. Um die optimale Isolierung von gewünschten Zellen aus Körperflüssigkeiten aufrechtzuerhalten, wird bevorzugt, daß Blutproben innerhalb von 48 Stunden nach der Sammlung verwendet werden. Besonders bevorzugt sollten Körperflüssigkeiten innerhalb von mehreren Stunden nach der Sammlung einer Dichtegradientenzentrifugation unterzogen werden. Die eingestellte Gradientenlösung sollte zu einem Zentrifugationsröhrchen in einem Volumen zugegeben werden, das ausreicht, um zu ermöglichen, daß alle Zellen überschichtet werden können, um sie während der Zentrifugation zu trennen. Zum Beispiel ist ein Volumen von etwa 20-25 ml der Lösung zur Trennung gewünschter Zellen in 20 ml Vollblut im allgemeinen ausreichend.
"SILAN-PERCOLL" (S-Percoll; Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ), klassifiziert als kolloidales Silica, ist ein bevorzugtes Dichtegradientenmaterial. S-Percoll wird aus kolloidalem Silica durch Umsetzen und auf diese Weise Blockieren der Silanolgruppen mit einem Alkyltrimethoxysilanreagens hergestellt und hat die Strukturformel:
Verwandte kolloidale Silicaverbindungen und Verfahren zu deren Herstellung werden im US-Patent 4,927,749 an Dorn ofengelegt. Eine "PERCOLL"- Stammlösung mit einer Osmolalität von 280-320 mOsm/kg kann durch Zugeben von 12 Teilen "PERCOLL" zu 1 Teil 10x Ca- und Mg-freiem PBS oder 1,5 M NaCl für menschliche Zellen oder Zugeben von 9 Teilen "PERCOLL" zu 1 Teil 10x Ca- und Mg-freiem PBS oder 1,5 M NaCl für nicht-menschliche Tierzellen hergestellt werden.
Bei der Ausführung der erfindungsgemäßen Zelltrennungsverfahren wird im allgemeinen bevorzugt, daß die spezifische Dichte des Zelltrennungsmaterials innerhalb von etwa ± 0,0005 g/ml, vorzugsweise ± 0,0002 g/ml, der spezifischen Dichte der zu sammelnden Zellen liegt. Die spezifische Dichte der Stammlösung bis zur vierten Stelle kann unter Verwendung einer geeigneten Vorrichtung, zum Beispiel eines digitalen Dichtemeßgeräts hoher Präzision, wie DMA 48 (Anton PAAR USA, Ashland, VA), das die Dichte mit einer Genauigkeit von ± 0,0002 g/ml mißt, bestimmt werden. Dieser erfindungsgemäße Gesichtspunkt wird nachstehend in Abschnitt 5.3 weiter besprochen.
Die Osmolalität der Stammlösung kann geeigneterweise zum Beispiel auf 280 mOsm/kg H&sub2;O ± 10 zur Verwendung beim Menschen oder 320 mOsm/kg H&sub2;O ± 10 zur Verwendung beim Tier eingestellt werden. Der pH-Wert kann geeigneterweise eingestellt werden, vorzugsweise auf 7,4, wenn eine physiologisch isotonische Lösung gewünscht wird.
Eine geeignete Menge an Zelltrennungsmaterial, das hergestellt wurde, wie vorstehend beschrieben, wird in ein Zentrifugenröhrchen eingebracht, das vorzugsweise, aber nicht notwendigerweise, ein Zellabfangröhrchen ist. Das zu trennende Zellengemisch wird auf das Röhrchen überschichtet, und das Röhrchen wird einer Zentrifugation bei geringer Geschwindigkeit - im allgemeinen etwa 500-1500 · g, unterzogen. Zellen, die eine größere Dichte als die spezifische Dichte des Zelltrennungsmaterials haben, wandern zu dem Pelletteil des Röhrchens, während die, die eine geringere Dichte als das Material haben, an der Zwischenfläche zwischen dem Zellverdünnungsmittel und dem Material zurückbleiben. Im allgemeinen betrifft das erfindungsgemäße Verfahren das Sammeln der leichteren Fraktion von Zellen, die an der Zwischenfläche vorliegt.

5.2. Dichteregulierte Zelltrennung

Gemäß einem weiteren Gesichtspunkt der Erfindung können die hier beschriebenen Dichtetrennungsverfahren durch Zugeben von Mikropartikelträgern, an die zellspezifische Bindemoleküle gebunden sind, die in der Bindung von ausgewählten Zellen in dem Gemisch wirksam sind, zu dem zu trennenden Zellengemisch ergänzt werden. In einem bevorzugten Verfahren werden solche Bindemoleküle verwendet, um während der Zentrifugation aus dem Gemisch verunreinigende Zellen zu entfernen, die Dichten haben, die etwa gleich oder leichter als die Zellen von Interesse sind. Dieses hier als "Dichteregulierte Zelltrennung" (DACS) bezeichnete Verfahren wird im folgenden Abschnitt beschrieben.

5.2.A. Isolierung von Zellen unter Verwendung der dichteregulierten Zellsortierung (DACS)

Die Fig. 8(A-D) vergleichen die dichteregulierte Zellsortierung (Fig. 8C und 8D) mit einer herkömmlichen Dichtegradientenzentrifugation (Fig. 8A und 8B). Bei beiden Verfahren wird Lösung 130, die unerwünschte Zellen 132 und gewünschte Zellen 134 enthält, auf ein Dichtegradientenmaterial 131 überschichtet. Unter Bezugnahme auf Fig. 8B ist nach der Zentrifugation bei der herkömmlichen Gradientenzentriftigation noch eine relativ große Zahl von unerwünschten Zelltypen 132 an der Zwischenfläche mit den Zellen von Interesse 134 gefangen (Fig. 8B).
Unter Verwendung der DACS werden affinitätsmodifizierte Trägerpartikel zu dem Zellengemisch zugegeben, um unerwünschte Zellen zu binden. Wie in Fig. 8C gezeigt, binden die Träger 136 an unerwünschte Zellen, um dichteregulierte Zellen 138 zu bilden. Diese Zellen werden dichter gemacht und auf diese Weise in die Lage versetzt, sich während der Zentrifugation abzuscheiden (Fig. 8D). In einer anderen Ausführungsform kann Zellen, die schwerer als die Gradientendichte sind, eine leichtere Dichte verliehen werden, indem leichtere Trägerpartikel, z. B. stark poröse Silicapartikel, verwendet werden, die durch die direkte oder indirekte Bindung von zelltypspezifischen Bindemitteln zelltypspezifisch gemacht wurden.
Wenn für unerwünschte Zellen spezifische Trägerpartikel mit einer Zell- oder Gewebeprobe gemischt werden, die dann auf einen spezifisch hergestellten Dichtegradienten gemäß den hier beschriebenen erfindungsgemäßen Verfahren überschichtet wird, ermöglicht ein einziger Zentrifugationsschritt eine deutliche Anreicherung eines Zelltyps von Interesse aus der Probe. Das Vorstehende ist ein Beispiel einer dichteregulierten Zellsortierung, die in einer negativen Affinitätsweise verwendet wird, d. h. um unerwünschte Zellen, z. B. Tumorzellen, aus einer Probe durch Verwendung eines modifizierten Trägerpartikels, das Spezifität für die unerwünschte Zellpopulation aufweist, zu entfernen. In einer anderen Ausführungsform kann die dichteregulierte Zellsortierung in einer positiven Affinitätsweise verwendet werden, d. h. um gewünschte Zellen aus einer Probe durch Verwendung eines modifizierten Trägerpartikels, das Spezifität für die gewünschte Zellpopulation aufweist, zu sammeln. Die Kügelchen können von den gewünschten Zellen durch enzymatische oder chemische Spaltung entfernt werden. Zum Beispiel kann Papain verwendet werden, um eine gewünschte Zelle von Immunglobulinen abzuspalten. Nach dem erste Runde der Zentrifugation und Sammlung von angereicherten Zellen, kann eine zweite Zentrifugationsrunde einschließlich einer dichteregulierten Zellsortierung ausgeführt werden, um die gewünschte Zellpopulation weiter anzureichern. Es ist ferner erkennbar, daß ein anderer Vorteil der DACS ist, daß sie die genaue Übereinstimmung der spezifischen Dichte von Zellen von Interesse und dem vorstehend besprochenen Zelltrennungsmaterial weniger wichtig macht, da unerwünschte Zellen, die eine ähnliche Dichte haben, durch dieses Verfahren wirksam entfernt werden können.
Zur Bestätigung der vorliegenden Erfindung ausgeführte Studien, die in Abschnitt 5.3.A. und ausführlich in Beispiel 1E besprochen werden, zeigen, daß, wenn Vollblut von schwangeren Frauen mit mit anti-CD45 beschichteten Trägerpartikeln inkubiert wurden, die meisten Leukocyten aus der Probe entzogen wurden.
Weitere in Beispiel 2 ausführlich beschriebene Studien zeigen, daß zur Isolierung von CD34&spplus;-Zellen apheresiertes Blut von Krebspatienten direkt mit mit anti-CD45-Antikörpern beschichteten Trägerpartikeln inkubiert werden kann, wodurch ebenfalls eine gewünschte Leukocytenverringerung vorgesehen werden kann.
Es ist erkennbar, daß eine Vielzahl von zelltypspezifischen Bindemitteln verwendet werden kann, um spezifische Zelltypen im Blut zielgerecht anzugehen. Die Auswahl solcher Bindemittel ist dem Fachmann auf Grund des zu sammelnden Zelltyps und der Zellenzusammensetzung des Zellengemisches bekannt. Nützliche Mittel schließen Antikörper ein, wie die leukocytenspezifischen Antikörper, z. B. anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5 und anti- CD8, spezifisch für T-Zellen; anti-CD12, anti-CD19 und anti-CD20, spezifisch für B-Zellen; anti-CD14, spezifisch für Monocyten; anti-CD16 und anti-CD56, spezifisch für natürliche Killerzellen; und anti-CD41 für Thrombocyten. Viele dieser Antikörper sind im Handel in einer Form erhältlich, die bereits an verschiedene Typen von Partikeln (AMAC, DYNAL) konjugiert ist. Außerdem schließen zelltypspezifische Bindemittel Lectine, wie Weizenkeim- Agglutinin und Sojabohnen-Agglutinin, Wachstumsfaktoren und Cytokine ein.
In einer anderen Ausführungsform kann unter Bezugnahme auf das hier beschriebene Verfahren zur Isolierung von hämatopoetischen CD34&spplus;-Stammzellen auch ein positives Selektionsverfahren angewendet werden, um zu bewirken, daß die Zellen eine größere Dichte haben, so daß sie während der Zentrifugation pelletiert werden. In diesem Fall werden Trägerpartikel verwendet, die mit gegen CD34 gerichteten Antikörpern beschichtet sind, um alle verbleibenden CD34&spplus;-Zellen zu pelletieren. Außerdem können Antikörper, die gegen einen beliebigen Zelloberflächenmarker gerichtet sind, direkt an schwere Partikel zur Verwendung bei der dichteregulierten Zellsortierung gemäß von auf dem Fachgebiet bekannten Konjugationsverfahren gebunden werden. Es ist bemerkenswert, daß, wenn die dichteregulierte Zellsortierung angewendet wird, die spezifische Dichte des Gradienten weniger wichtig ist, so lange die unerwünschten Zellen alle schwerer gemacht werden.

5.2.B. Trägerpartikel

Eine Reihe von im Handel erhältlichen Trägerpartikeln kann erfindungsgemäß verwendet werden und schließt zum Beispiel organische Polymere, z. B. Polyethylen; Polypropylen; Polyvinylverbindungen, z. B. Polyvinylchlorid, Polyacrylnitril, Polyacrylat, Polymethacrylat, Polycarbonat und Copolymere davon; Polystyrollatex; Nylon; Polyterephthalat; und ähnliches oder anorganische Polymere, z. B. Glas- oder Silicapartikel; Cellulose, Dextrane, Polysaccharide, z. B. Agarose, Cellulose, Sepharose, Sephadex, etc. oder Kombinationen davon ein. Die Trägerpartikel können aus natürlich vorkommenden Polymeren, modifizierten natürlich vorkommenden Polymeren und synthetischen Additions- und Kondensa tionspolymeren bestehen. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Trägerpartikel ist ein Silicapartikel zwischen 0,1-5,0 um, das an eine Aminopropylgruppe gekoppelt ist und eine Dichte größer als 1,08 g/ml hat. US-Pat. Nrn. 4,927,750 und 4,927,749, erteilt am 22. Mai 1990, beschreiben Beispiele von modifizierten Silanen, die erfindungsgemäß als Trägerpartikel verwendet werden können. Verschiedene Trägerpartikel sind im Handel zum von Beispiel Bangs Laboratories, Inc., Carmel, IN; Pharmacia; Sigma Chemical Company; Bio-Rad; AMAC, Inc.; etc. erhältlich.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes schweres Trägerpartikel ist ein Silicakügelchen; das eine größere Dichte als die Dichte des gemäß der nachstehend beschriebenen Verfahren ausgewählten Dichtegradientenmaterials und eine Partikelgröße von 0,1 um bis 5,0 um hat, so daß die Trägerpartikel bei der Zentrifugation pelletiert werden. Ein solches Partikel kann zusätzlich silanisiert sein, wie hier in Beispiel 4B ausführlich beschrieben. Das bevorzugte Partikel hat auch die Fähigkeit, entweder direkt oder indirekt an zelltypspezifische Bindemittel zu binden oder kann mit solchen Mitteln derivatisiert sein. Ein bevorzugtes leichteres Trägerpartikel, das erfindungsgemäß nützlich ist, ist ein Mittel, das eine Dichte von weniger als 1,0 und eine Partikelgröße von 0,1 bis 5,0 um hat, so daß die Partikel über dem Dichtegradienten nach der Zentrifugation schwimmen, sowie ein Mittel, das die Fähigkeit hat, entweder direkt oder indirekt an zelltypspezifische Bindemittel zu binden. Solche Trägerpartikel geringer Dichte können von 3M, St. Paul MN Katalog-Nr. H50/1000, bezeichnet als "Scotchlite-Mikrokügelchen", bezogen werden.
Polystyrollatexpartikel (erhältlich von Sigma Chemical Company) können auch als Partikel geringer Dichte verwendet werden; jedoch zeigen solche Partikel auf Grund der Oberflächenhydrophobizität charakteristischerweise eine unspezifische Bindung. Eine solche unspezifische Bindung kann durch Behandlungsverfahren, wie Vorabsorption mit Protein oder Addition von Methacrylsäuregruppen, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, verringert werden. Latexpartikel können in Partikel hoher Dichte durch die Addition einer Metallgruppe umgewandelt werden.
Zur erfindungsgemäßen Verwendung stehen auch Polyacrylamid-Trägerpartikel zur Verfügung, wie Bio-Rad-Polyacrylamidkügelchen, die an entweder primäre Aminofunktionelle Gruppen (Affi-Gel 701-Kügelchen) oder Carboxyl-funktionelle Gruppen (Affi- Gel 702-Kügelchen oder Immunobead-Reagens) gekoppelt sind.
Die Herstellung von kleinen, stabilen, kugelförmigen Partikeln, die biologisch verträglich sind, d. h. nicht unspezifisch mit Zellen oder anderen biologischen Komponenten in Wechselwirkung treten, und die funktionelle Gruppen enthalten, an die spezifische Proteine und andere biochemische Moleküle kovalent gebunden werden können, wird offengelegt in US-Pat. Nr. 3,957,741, erteilt am 19. Mai 1976. Die Hydroxyl- oder Aminogruppen können durch Cyanbromid zur kovalenten Bindung eines Proteins und anderer Chemikalien, die Aminogruppen enthalten, an das Polystyrollatex aktiviert werden.
US-Pat. Nr. 4,035,316, erteilt am 12. Juli 1977, beschreibt das Verfahren zur Herstellung von zellspezifischen, polymeren Mikrokügelchen variabler Dichte, die mit Amin-, Hydroxyl- und/oder Carboxyl-funktionellen Gruppen derivatisiert sind und eine Dichte von mindestens 1,30 g/ml, vorzugsweise über 1,40 g/ml oder eine Dichte unter 1,15 g/ml und vorzugsweise unter 1,08 g/ml haben.
Ein Verfahren zur Erzeugung sehr gleichförmiger Silicakügelchen wird in US-Pat. Nr. 4,983,369, erteilt am 8. Januar 1991, beschrieben.
Ebenfalls eingeschlossen im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung sind Trägerpartikel oder Trägerpartikel, an die ein magnetischer Stoff gebunden ist, der eine bessere Trennung von Zellen durch die Verwendung eines Magnetfelds erlaubt. US-Pat. Nr. 4,777,145, erteilt am 11. Oktober 1988, beschreibt ein immunologisches Testverfahren unter Verwendung von magnetischen Partikeln. AMAC, Inc., eine Tochterfirma von IMMUNOTECH, 5A (Frankreich), stellt magnetische Mikrokügelchen bereit, die mit einem monoclonalen Antikörper, z. B. anti-CD4, anti-CD8, anti-CD19, anti-CD45, etc., beschichtet sind.

5.2.C. Zelltypspezifische Bindemittel

Die erfindungsgemäßen Zelltrennungsverfahren können die Verwendung von zelltypspezifischen Bindemitteln einschließen, die Spezifität für entweder die gewünschten oder unerwünschten Zellpopulationen aufweisen, die entweder direkt oder indirekt an ein Trägerpartikel gebunden werden können, wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben. Wie hier definiert, schließen "zelltypspezifische Bindemittel" zum Beispiel Antikörper oder Antigene; Peptide oder Polypeptide; Wachstumsfaktoren oder Cytokine; Lectine und Agglutinine; oder andere auf dem Fachgebiet bekannte Aflinitätsmoleküle ein, die Spezifität für entweder die gewünschten Zellpopulationen oder die unerwünschten Zellpopulationen aufweisen. Viele dieser Mittel sind im Handel erhältlich oder können gemäß gut bekannten Verfahren hergestellt werden.
Im Handel erhältliche zelltypspezifische Bindemittel, die erfindungsgemäß verwendet werden können, schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Antikörper, Antigene, Polypeptide, Peptide, Wachstumsfaktoren, membrangebundene Rezeptoren, kleine organische Moleküle, Lectine und Agglutinine ein.
Eine Vielzahl von dem Fachmann bekannten Antikörpern, die im Handel oder über Zellkulturhinterlegungsstellen, z. B. die ATCC, Rockville, Md. oder die NRLL, Peoria, Il., erhältlich sind, kann erfindungsgemäß als zelltypspezifische Bindemittel in Abhängigkeit von dem gewünschten Zelltyp, der isoliert oder angereichert werden soll, verwendet werden. Diese schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, für hämatopoetische und lymphoide Antigene spezifische Antikörper, wie anti-CD2, anti-CD2R, anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5 und anti-CD8, spezifisch für T-Zellen, anti-CDw17, spezifisch für Granulocyten, Monocyten und Thrombocyten, anti-CD 18, spezifisch für Leukocyten, anti-CD71, spezifisch für aktivierte T = und B-Zellen, Makrophagen, proliferierende Zellen, Antikörper gegen Cytokine und Wachstumsfaktoren (z. B. IL1-IL13, EGF, IGF I und 11, TGF-α und -β, TNF-α und -β, FGF, NGF, CIF, IFN-α und -β, CSF's), Hormone, zell- oder tumorassoziierte Antigene oder Marker, Adhäsionsmoleküle, Hämostasemoleküle und Endothelzellen ein. Die einzelnen zu verwendenden Mittel hängen von der Antigenität der gewünschten Zelle und der Zusammensetzung des Zellengemisches, aus dem sie isoliert werden soll, ab. Der Fachmann ist in der Lage, die optimale Trägermittelzusammensetzung auf Grund dieser Faktoren zu bestimmen.
Als Affinitätsmoleküle nützliche Antikörper können gemäß polyclonalen oder monoclonalen Standardherstellungsverfahren hergestellt werden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind. Nützliche Antikörper schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, polyclonale, monoclonale, chimere, einkettige Antikörper, Fab-Fragmente und Fragmente, die aus einer Fab-Expressionsbank und einer Phagendisplay-Expressionsbank hergestellt werden, ein. Im Handel erhältliche Agglutinine können erfindungsgemäß verwendet werden.
Diese schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Weizenkeim-Agglutinin, Erdnuß-Agglutinin, Sojabohnen-Agglutinin, Phytohämagglutinin und Leucoagglutinin ein und sind im Handel von zum Beispiel Pharmacia Fine Chemicals (Piscataway, NJ) erhältlich.

5.2.D. Kupplung von zelltypspezifischen Bindemitteln an ein Trägerpartikel

Die Immobilisierung des zelltypspezifischen Bindemittels an die Trägerpartikel kann durch eine Vielzahl von Verfahren erzielt werden, die dem Fachmann bekannt sind. Solche Verfahren werden zum Beispiel beschrieben bei Bangs (The Latex Course (1992), erhältlich von Bangs Laboratories, Inc., Carmel, IN); Yoshioka et al., Journal of Chromatography 566 (1991), 361-368; Pope et al., Bioconjugate Chem. 4 (1993), 166-171; Harlow und Lane, Antibodies: A Laboratory Manual (1988), Colorado Spring Harbor Laboratory; Avidin-Biotin Chemistry: A Handbook (1992), Hrsg. Savage et al., Verl. PIERCE; und Hermanson et al., Immobilized Affinity Ligand Techniques (1992), Verl. Academic Press, Inc.
Bindungsverfahren schließen zum Beispiel die einfache physikalische Absorption oder Adsorption, bei der das zelltypspezifische Bindemittel direkt an das Trägerprotein ohne die Verwendung von funktionellen Gruppen gebunden wird; die komplexe Adsorption, bei der ein zweites Bindemittel, z. B. BSA, an das Trägerpartikel coadsorbiert wird und die Grundlage für die Bindung funktioneller Gruppen bildet; und die kovalente Bindung des Bindemittels an das Trägerpartikel ein. Das Biotin-Streptavidin-Affinitätssystem kann erfindungsgemäß ebenfalls verwendet werden, um zelltypspezifische Bindemittel an die Trägerpartikel zu binden. Verschiedene chemische Reaktionen an der Partikeloberfläche zur kovalenten Kupplung sind dem Fachmann bekannt und schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Carbonsäure, primäres oder aliphatisches Amin, aromatisches Amin oder Anilin, Chlormethyl(vinylbenzylchlorid), Amid, Aldehyd, Hydroxyl, Thio, Hydrazid, Epoxy, Sulfat und Sulfonat ein. Andere chemische Kupplungsreaktionen werden bei Bangs, Uniform Latex Particles (1984), beschrieben.
Zur erfindungsgemäßen Verwendung wird bevorzugt, daß die direkte oder indirekte Bindung des zelltypspezifischen Bindemittels an das Trägerpartikel in einem Überschuß an Bindemittel durchgeführt wird, um eine maximale Bedeckung der Oberfläche des Trägerpartikels zu ermöglichen, wodurch das Potential für eine unspezifische Bindung und ein Verklumpen der Kügelchen verringert wird. Trägerpartikel können auch Blockierungsmitteln, z. B. Casein, Gelatine und TWEEN-Detergens, ausgesetzt werden, um jegliche freie Stellen auf dem Trägerpartikel aufzufüllen, um die unspezifische Bindung zu verringern.
In einem veranschaulichenden Beispiel können Carboxylgruppen auf der Trägerpartikeloberfläche mit den zur Verfügung stehenden Aminogruppen in dem zelltypspezifischen Bindemittel reaktiv gemacht werden. Andere Mittel zur Bindung eines zelltypspezifischen Bindemittels an Partikeloberflächen schließen die Verwendung von aktivierten Carbonsäuren, Carbodiimiden, d. h. (1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimid oder EDAC, Imidoestern, aktiven Alkylhalogeniden, etc. ein, um Amido-, Amidin- oder Aminobindungen zu bilden.
Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes Trägerpartikel ist ein Aminopropylsilicapartikel, bei dem die Aminogruppen an das Silicapartikel über eine Glutaraldehydbindung gekuppelt wurde, vgl. Beispiel 4.

5.3. Isolierung ausgewählter Zelltypen

Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur Isolierung oder Anreicherung eines gewünschten Zelltyps aus einem in vivo- oder in vitro-Gemisch bereit, wenn die spezifische Dichte des Zelltyps bekannt ist. Beispielhafte spezifische Zelltypen, die durch dieses Verfahren isoliert wurden, werden nachstehend besprochen.
Vorzugsweise schließt das Verfahren das Beladen einer der in Abschnitt 5.1.A. beschriebenen Ausführungsformen der Zellabfangtrennungsvorrichtung mit einem Zelltrennungsmedium, das eine spezifische Dichte hat, die innerhalb von ± 0,0005 g/ml der spezifischen Dichte liegt, und dann das Zentrifugieren der Vorrichtung ein. Die gewünschten Zellen werden dann aus dem oberen Teil des Zentrifugationsröhrchens gesammelt.
Obwohl die Verwendung der Zellabfangzentrifugationsvorrichtung die Einfachheit und Wirksamkeit des erfindungsgemäßen Verfahrens fördert, sollte angemerkt werden, daß die Erfindung zum Teil auf der Spezifität und Genauigkeit der verwendeten Dichtegradienten basiert. Das heißt, die Dichtegradienten müssen hergestellt werden, so daß ihre Dichte genau innerhalb von mindestens ± 0,0005 g/ml und vorzugsweise innerhalb von ± 0,0002 g/ml der spezifischen Dichte der gewünschten Zelle bei einer bestimmten Osmolalität liegt. Somit kann die Erfindung unter Verwendung eines Standardzentrifugationsröhrchens sowie eines Zellabfangröhrchens durchgeführt werden, so lange die Dichte hinreichend definiert ist. Die Beispiele 1-3 beschreiben hier die Verwendung von Zelltrennungsmedien spezifischer Dichte mit und ohne der Zellabfangvorrichtung.
Nach der Zentrifugation findet man die gewünschte Zelle an der Zwischenfläche zwischen dem Gradientenmaterial und der Zellprobenlösung. Das Material an der Zwischenfläche kann gesammelt und dann gegebenenfalls zentrifugiert werden, um es konzentrieren. In einer anderen Ausführungsform, wenn bevorzugt wird, das gewünschte Zellmaterial in einem geschlossenen System zurückzuhalten, kann die Zentrifugation in einem geschlossenen System oder in einer Zentrifugationsspritze mit einer Zellabfanganordnung, wie in Abschnitt 5.1.A. beschrieben, ausgeführt werden.
Gegebenenfalls kann eine verbesserte Reinheit des gewünschten Zelltyps durch Ergänzung des vorstehenden Verfahrens durch ein dichtereguliertes Zellsortierungsverfahren, wie in Abschnitt 5.2. beschrieben, erzielt werden. Wie darin beschrieben, wird vor der Zentrifugation die Zellprobe, die die gewünschte Zelle enthält, Trägerpartikeln ausgesetzt, die zelltypspezifische Bindemittel daran gebunden haben, die darin wirksam sind, unerwünschte Zellen zu binden und zu entfernen.
Für therapeutische Anwendungen wird bevorzugt, daß die gewünschte Zellpopulation in der Zwischenfläche zwischen dem Gradientenmaterial und der Zellprobenlösung bleibt. In einer anderen Ausführungsform, wenn die gewünschten Zellen an Kügelchen im Pellet gebunden sind, können sie enzymatisch oder chemisch von den Kügelchen durch dem Fachmann bekannte Verfahren, einschließlich der Verwendung von proteolytischen Enzymen, z. B. Papain, abgespalten werden.
Durch die hier beschriebenen Zelltrennungsverfahren isolierten oder angereicherten Zellen können für eine Vielzahl von diagnostischen und therapeutischen Anwendungen verwendet werden. Die isolierten oder angereicherten Zellen können unter sterilen Bedingungen gezüchtet und einer cytogenetischen Analyse, z. B. dem Nachweis von chromosomalen Abnormalitäten und einer Geschlechtsbestimmung, unterzogen werden. Die isolierten oder angereicherten Zellen können mit molekularen Sonden für einen empfindlicheren Nachweis unter Verwendung von PCR und FISH umgesetzt werden. Die isolierten oder angereicherten Zellen können auch therapeutisch, zum Beispiel zur allogenen und autologen Transplantation, verwendet werden.
Die folgenden Abschnitte stellen spezifische Informationen zur Isolierung von drei therapeutisch und/oder diagnostisch nützlichen Zelltypen bereit, die gemäß den Prinzipien der vorliegenden Erfindung isoliert werden.

5.3.A. Isolierung von fötalen Zellen aus mütterlichem Blut

Es wurde nun bewiesen, daß eine kleine Zahl von fötalen Zellen im mütterlichen Blut zirkuliert, einschließlich Lymphocyten, Trophoblasten und kernhaltigen Erythrocyten. Diese Zellen stellen eine alternative Quelle von genetischen Materialien zur pränatalen Untersuchung bereit (Simpson und Elias, JAMA 270 (1993), 2357). Jedoch diktiert die Seltenheit solcher Zellen im mütterlichen Blut (abgeschätzt 1 in 10'-108 mütterlichen Blutzellen) die Notwendigkeit für verbesserte Isolierungs- und Nachweisverfahren (Holzgreve et al., J. Reprod. Med. 37 (1992), 410). Obwohl mehrere Nachweisverfahren durch jüngste Fortschritte zugänglich gemacht wurden, einschließlich Polymerasekettenreaktion (PCR) und Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH), ist die Hauptschwierigkeit bei der routinemäßigen Verwendung von mütterlichem Blut zur pränatalen Diagnostik das Unvermögen, die kleine Zahl von fötalen Zellen in einem Gemisch von mütterlichen Zellen anzureichern, um zuverlässige diagnostische Ergebnisse zu erhalten.
Mehrere Verfahren wurden vorgeschlagen, die diese Anforderung erfüllen, einschließlich der fluoreszenzaktivierten Zellsortierung (Herzenberg et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 (1979), 1453), der magnetisch aktivierten Zellsortierung (Ganshirt-Ahlert et al., Am. J. Obstet. Gynecol. 166 (1992), 1350) oder einer Kombination dieser Verfahren (Ganshirt-Ahlert et al., Am. J. Hum. Genet. 51 (1992), A48). Obwohl diese Verfahren in der Lage sind, fötale Zellen teilweise anzureichern, sind sie beide infolge der Notwendigkeit für eine hochentwickelte Ausstattung mit Instrumenten kostenintensiv und auf Grund der Vielzahl von Schritten mühsam. Bedeutsamer ist, daß solche Verfahren einen beträchtlichen Zellverlust zur Folge haben, wodurch die Zahl der zur anschließenden Analyse zur Verfügung stehenden fötalen Zellen verringert wird.
Von den fötalen Zelltypen, von denen bekannt ist, daß sie im mütterlichen Blut während der Schwangerschaft vorliegen, sind kernhaltige Erythrocyten die attraktivsten Kandidaten für die Anreicherung oder den Nachweis. Die Kerne dieser Zellen stellen eine Quelle von genetischem Material für die Anwendung von Verfahren, wie PCR und FISH, bereit. Es gibt auch mehrere gut bekannte, im Handel erhältliche Antikörper, die verwendet werden können, um die Zellen zu charakterisieren, wie anti-CD71 und anti-Glycophorin A. Ein anderer wichtiger Vorteil für das zielgerechte Angehen von fötalen Zellen der erythroiden Linie ist ihre verhältnismäßig kurze Lebensdauer. Anders als Lymphocyten sollten diese Zellen nicht von früheren Schwangerschaften fortbestehen, um die Analyse von mütterlichem Blut zu beeinträchtigen.
Die Vorrichtung und die Verfahren der Erfindung können ver- bzw. angewendet werden, um fötale Zellen aus Zellengemischen zu isolieren. Insbesondere kann das Verfahren angewendet werden, um seltene fötale Zellen aus mütterlichem Blut zum Zwecke der pränatalen Diagnose durch eine genetische Untersuchung zu isolieren.
Dieser erfindungsgemäße Gesichtspunkt basiert zum Teil auf der Entdeckung des Anmelders, daß eine Lösung von kolloidalem Silica (PERCOLL), die auf eine Dichte von 1,0720 ± 0,0005 g/ml, eine Osmolalität von 280 mOsm/kg H&sub2;O und einen pH-Wert von 7,4 eingestellt wurde, fötale Zellen von der Mehrheit der adulten Blutzellen wirksam trennt, wenn Vollblut ohne vorherige Trennung oder Verdünnung auf die Gradientenlösung überschichtet wird. Außerdem wird das Verfahren durch Verwendung von hier beschriebenen Zellabfangzentrifugationsröhrchen verbessert, die eine Verengung enthalten, um zu ermöglichen, daß die Zellen im oberen Teil (d. h. über der Verengung) dekantiert werden können, im Gegensatz zur Verwendung einer Pipette, um die Zellen zu sammeln, was einen erhöhten Zellverlust zur Folge hat.
In der Praxis kann peripheres Blut von schwangeren Frauen in Antikoagulans enthaltenden Röhrchen oder durch Apherese oder Leukopherese gesammelt werden.
Vollblut muß vor der Zentrifugation nicht behandelt oder verdünnt werden. Jedoch, da die Verfahren fötale Zellen auf Grund ihrer spezifischen Schwebedichte anreichern, ist es wichtig, daß die Zellen der Trennung innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums nach der Sammlung unterzogen werden, da sich die Dichte der Zellen entsprechend ihren Kultur- oder Lagerungsbedingungen verändert. Deshalb, um eine optimale Anreicherung von fötalen Zellen aus mütterlichem Blut zu erhalten, wird bevorzugt, daß die Blutproben innerhalb von 48 Stunden nach ihrer Sammlung verwendet werden. Am meisten bevorzugt, sollten Blutproben einer Dichtegradientenzentrifugation innerhalb von mehreren Stunden nach der Sammlung unterzogen werden.
Die vorliegende Erfindung kann ausgeführt werden durch Überschichten von Vollblut auf einen definierten Dichtegradienten in einer Zellabfangzentrifugationsvorrichtung. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in der Zwischenfläche gesammelt und durch einen anderen Zentrifügationsschritt pelletiert, um Zelltrümmer, Thrombocyten und den Rest des Dichtematerials zu entfernen. Danach wird den Zellen die Mehrheit der Leukocyten durch ihre Reaktivität mit einem Antikörper, wie anti-CD45, entzogen; die zurückbleibenden Erythrocyten werden durch Durchflußcytometrie analysiert und die fötalen Zellen in dieser Population werden durch FISH unter Verwendung von spezifischen molekularen Sonden identifiziert.
Die Wirksamkeit des Verfahrens kann weiter verbessert werden, wenn es mit der dichteregulierten Zellsortierung, vorstehend in Abschnitt 5.2. beschrieben, kombiniert wird. Folglich sorgt diese spezifische erfindungsgemäße Ausführungsform für ein schnelles und ertragreiches Verfahren, um fötale Zellen aus einem großen Blutvolumen anzureichern. Die erhöhte Zahl von fötalen Zellen in der so erhaltenen Zellpopulationen erhöht die Empfindlichkeit und Genauigkeit von Verfahren, die im allgemeinen zur genetischen Untersuchung angewendet werden.
Beim Versuch den Zellverlust weiter zu minimieren, aber eine Entfernung der Thrombocyten zu erzielen, kann ein zweiter Zentrifugationsschritt zum Pelletieren der fötalen kernhaltigen Erythrocyten ebenfalls in einem Zellabfangröhrchen ausgeführt werden. Beispiel 1 beschreibt ausführlich Materialien und Verfahren zur Isolierung von kernhaltigen fötalen Zellen gemäß den erfindungsgemäßen Verfahren. Tabelle 1 gibt Ergebnisse aus einem Experiment an, bei dem "PERCOLL" als Dichtegradientenmaterial in einer erfindungsgemäßen Einstufen-Gradiententrennung verwendet wurde. "PERCOLL" wurde hergestellt und auf eine physiologische Osmolalität von 280 mOsm/kg H&sub2;O und einen physiologischen pH-Wert von 7,4 eingestellt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Die Ergebnisse der in Beispiel 1 ausführlich beschriebenen Experimente zusammenfassend, wurde die spezifische Dichte des Zelltrennungsmediums wie beschrieben eingestellt. Die Zellen wurden aus der Zwischenfläche geerntet, und der Prozentsatz von fötalen Zellen und Pellet und Zwischenfläche und auf die Ausbeute mittels Markerantigencharakterisierung überprüft. Wie in Tabelle 1 zusammengefaßt, erzielte eine Dichte von 1,0720 g/ml oder darüber eine Gewinnung von mindestens etwa 50% der kernhaltigen Zellen aus der gesamten kernhaltigen Zellpopulation vor der Zentrifugation; es gab eine beträchtliche Verunreinigung der Zwischenfläche mit reifen Erythrocyten, wenn der Gradient auf eine Dichte von 1,0750 g/ml oder darüber eingestellt wurde.
Aus dem Vorstehenden ist erkennbar, daß, um einen hohen Prozentsatz der gesamten kernhaltigen Zellen aus dem Ausgangszellengemisch zu gewinnen, jedoch die Verunreinigung durch reife Erythrocyten zu verringern, eine Dichte von 1,0720 g/ml optimal ist. Außerdem sollte diese Dichte mit einer Genauigkeit von ± 0,0005 g/ml und vorzugsweise ± 0,0002 g/ml bestimmt werden. Tabelle 1
Beim Vergleich von vier Zelltrennungsverfahren hinsichtlich der Ausbeute an kernhaltigen Erythrocyten ergaben die zwei erfindungsgemäßen Verfahren wesentlich höhere Prozentsätze von kernhaltigen Erythrocyten als das herkömmliche Verfahren. Tabelle 2 zeigt Ergebnisse von Experimenten, bei denen Zellen durch vier verschiedene Verfahren isoliert wurden. In allen zentrifugierten Proben, außer der DACS-behandelten Probe, wurden die zentrifugierten Proben mit an magnetische Kügelchen gekoppelten anti-CD45-Antikörpern gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren Zellen entzogen. Aus diesen Ergebnissen ist ersichtlich, daß Zellabfangröhrchen, die "PERCOLL" mit einer Dichte von 1,0720 ± 0,0002 g/ml enthielten, eine etwa 20fach höhere Zahl von kernhaltigen Erythrocyten als das herkömmliche Verfahren unter Verwendung einer "FICOLL"- Stammlösung mit einer Dichte von 1,077 ± 0,001 g/ml und 320 mOsm/kg H&sub2;O ergaben.
Folglich führte dieses Verfahren zu einer statistisch signifikanten Erhöhung der Gesamtzahl der fötalen kernhaltigen Erythrocyten, die zur anschließenden genetischen Untersuchung verfügbar waren, im Vergleich zu herkömmlichen Verfahren. Außerdem reichert das Verfahren auch fötale Trophoblastenzellen an. Eine weitere Überprüfung wies fötale Zellen in unterschiedlichen Differenzierungsstadien nach, die in den angereicherten Fraktionen vorlagen. Außerdem erzielte das DACS-Verfahren Ergebnisse, die mit dem Verfahren vergleichbar waren, das einen Entzug von unerwünschten CD45&spplus;-Populationen unter Verwendung eines Magnetfeldes erfordert.
Jegliche zur Verwendung bei der Zentrifugation geeigneten Röhrchen können zur Ausführung der Erfindung verwendet werden. In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Zellabfangröhrchen für die Dichtetrennung von fötalen Zellen. Erfindungsgemäß bezeichnet ein Zellabfangröhrchen ein Zentrifugationsröhrchen, das darin eine Verengung oder eine Abfangvorrichtung und ein geeignet eingestelltes Dichtegradientenmaterial enthält, das bis zu einer Höhe über der Verengung eingefüllt ist, so daß Zellen, die eine bestimmte Dichte haben, die Öffnung der Verengung passieren, um ein Zellpellet in dem Kompartiment unter der Verengung während der Zentrifugation zu bilden. Tabelle 2
In den vorstehenden Experimenten verwendete die DACS-Behandlung der mütterlichen Proben anti-CD45 als Mittel, um unerwünschte Blutzellen aus der Zwischenfläche des Dichtegradienten zu entziehen. Eine Vielzahl anderer zelltypspezifischer Bindemittel kann verwendet werden, um spezifische Zelltypen im Blut zielgerecht anzugehen. Diese Mittel umfassen Antikörper, wie anti-CD3, anti-CD4, anti-CD5 und anti-CD8, spezifisch für T-Zellen; anti-CD12, anti-CD19 und anti-CD20, spezifisch für B-Zellen; anti-CD14, spezifisch für Monocyten; anti-CD16 und anti-CD56, spezifisch für natürliche Killerzellen; und anti-CD41 für Thrombocyten. Viele dieser Antikörper sind im Handel in einer Form erhältlich, die bereits an verschiedene Typen von Partikeln konjugiert ist (AMAC, DYNAL). In einer anderen Ausführungsform können zur positiven Selektion von kernhaltigen Erythrocyten reife Erythrocyten aus der Probe entfernt werden, und Trägerpartikel, die mit gegen Glycophorin A oder CD71 gerichteten Antikörpern beschichtet sind, können verwendet werden, um alle zurückbleibenden kernhaltigen Erythrocyten zu pelletieren.
Die durch die vorstehend beschriebenen Verfahren angereicherten kernhaltigen Erythrocyten wurden anschließend auf das Vorhandensein von fötalen Zellen untersucht. Die angereicherten Zellpräparationen, die von Spenderinnen erhalten wurden, von denen bekannt war, daß sie einen männlichen Fötus tragen, wurden zur Verwendung bei der FISH-Analyse ausgewählt. Die Zellen wurden mit einer an einen grünen Fluoreszenzfarbstoff gebundenen X-Chromosom-spezifischen Sonde und einer an einen roten Fluoreszenzfarbstoff gebundenen Y-Chromosom-spezifischen Sonde inkubiert. Fötale kernhaltige Erythrocyten wurden als Zellen mit Kernen identifiziert, die einen roten Fleck und einen grünen Fleck unter einem Fluoreszenzmikroskop enthielten, während andere Zellen mütterlichen Ursprungs waren. Die ganz rechte Spalte von Tabelle 2 zeigt, daß es eine 8fache Zunahme in Bezug auf die Zahl der XY (fötalen)-Chromosomen in den Zellpopulationen gab, die durch ein erfindungsgemäßes Verfahren präpariert worden waren, verglichen mit dem herkömmlichen Verfahren. Es ist von weiterem Interesse anzumerken, daß das Verfahren unter Verwendung einer Zellabfangvorrichtung und "FICOLL" auch die Zahl der fötalen kernhaltigen Erythrocyten auf den Nachweisgrenzwert erhöhte, verglichen mit dem gleichen Gradienten, der ohne Zellabfangröhrchen verwendet wurde, was zeigt, daß die Zellabfangvorrichtung selbst bei der Steigerung der Zellausbeute nützlich war.
Es sollte angemerkt werden, daß, um zuverlässige diagnostische Ergebnisse unter Beteiligung von Verfahren wie FISH zu erhalten, es im allgemeinen notwendig ist, die fötalen Zellen bis zu mindestens 0,1% der fertigen Zellpräparation anzureichern, damit das Anreicherungsverfahren als ein Routineverfahren angewendet werden kann. Für das erfindungsgemäße Verfahren wird hier durch den Nachweis der Anreicherung von fötalen Zellen bis zu einer Menge von 41 Zellen/10.000 analysierten Zellen insgesamt gezeigt, daß es diese Grenze deutlich überschritten hat.

5.3.B. Isolierung von hämatopoetischen CD34&spplus;-Vorläuferzellen

Die Transplantation von Knochenmark und peripherem Blut wird in der Klinik zur Behandlung von Krebs und hämatopoetischen Erkrankungen durchgeführt.
Hämatopoetische Vorläuferzellen wandern in die Knochenmarkmikroumgebung nach einer Transfusion und stellen sie wieder her. In Abhängigkeit von ihrem Differenzierungsgrad tragen diese Vorläuferzellen entweder zur Kurzzeitbesiedlung oder zur Langzeitbesiedlung der Knochenmarkmikroumgebung bei.
Im allgemeinen gibt es zwei Hauttypen von Zellen, die für eine erfolgreiche Transplantation und Besiedelung als notwendig angesehen werden - Zellen der Kolonie-bildenden Einheit (CFU), die eine kurzzeitige Knochenmarkbesiedelung vorsehen, was einer Infektion in dem Patienten während des Zeitraums unmittelbar nach der Radio- und Chemotherapie vorbeugt, und eine Langzeitkultur initiierende Zellen (LTC-IC), die ein lang anhaltendes, selbst regenerierendes, myeloides und lymphoides System in dem Patienten etablieren. Die hämatopoetische Vorläuferzellenpopulation, die das CD34-Oberflächenantigen exprimiert, enthält sowohl CFU als auch LTC-IC. Daher betrifft die vorliegende Erfindung Verfahren zum Anreichern von CD34&spplus;-Zellen.
Außerdem, wenn die Knochenmarkzellen oder eine andere Vorläuferzellenquelle verunreinigende Tumorzellen enthält, die vor der Reinfusion in ein autologes Milieu entfernt werden müssen, macht die große Zahl der Zellen insgesamt bei einem geringen Prozentsatz von CD34&spplus;-Zellen es technisch schwierig, eine hinreichende Entfernung der Tumorzellen durchzuführen. Folglich besteht weiterhin ein Bedarf für ein einfaches Verfahren zur Anreicherung von CD34&spplus;-Vorläuferzellen aus einem Zellengemisch, das eine große Zahl dieser Zellen enthält, die für eine wirksame Abtrennung von zurückbleibenden Tumorzellen zur Verwendung bei einer folgenden Transplantation zugänglich sind.
Beim Versuch, diese Probleme anzusprechen, konzentrierten sich die Erfinder auf die Verwendung von anti-CD34-Antikörpern. Solche Verfahren schließen die positive Selektion ein, wie den Durchgang von Leukocyten über eine Säule, die anti-CD34- Antikörper enthält, oder die Bindung von Zellen an anti-CD34-Antikörper, die an magnetische Kügelchen konjugiert sind, oder durch Panning auf anti-CD34-beschichteten Platten und Sammeln der gebundenen Zellen. Jedoch weisen die auf Affinität basierenden Verfahren im Hinblick auf die praktische Anwendbarkeit insofern Einschränkungen auf, als sie kostenintensiv und zeitaufwendig sind.
Andere Verfahren zur Anreicherung von hämatopoetischen Vorläuferzellen wurden beschrieben, die verschiedene Formen der Dichtegradientenzentriftigation verwenden (Olofsson et al., Scan. J. Haematol. 24 (1980), 254; Ellis et al., J. Immunol. Meth. 66 (1984), 9; Lasky und Zanjani, Exp. Hematol. 13 (1985), 680; Martin et al., Brit. J. Haematol. 63 (1986), 187). Jedoch verwenden alle beschriebenen Verfahren Agarkolonie- Tests, um hämatopoetische Vorläuferzellen nach der Anreicherung zu identifizieren. Es ist bekannt, daß die Vorläufertests nur determinierte Vorläuferzellen nachweisen können, die weniger als 1% der CD34&spplus;-Population ausmachen. Es ist daher ungewiß, ob diese Verfahren tatsächlich die frühen Vorläuferzellen oder Stammzellen anreichern können, die sich dauerhaft ansiedeln und ein lymphohämatopoetisches System wiederherstellen können, da sie klinisch nicht getestet wurden. Außerdem gibt es keinen Hinweis aus den veröffentlichten Berichten, daß eines dieser Verfahren in der Lage ist, eine hinreichende Zahl von Zellen zur klinischen Verwendung zu gewinnen.
Die vorliegende Erfindung stellt Verfahren zur schnellen und ertragsreichen Anreicherung von Vorläuferzellen bereit, die auf der Dichtegradientenzentrifugation basieren. Insbesondere verwendet die Erfindung eine genau bestimmte Dichte einer Dichtegradientenlösung, die vorzugsweise in einem speziell entwickelten Zellabfangzentrifugationsröhrchen enthalten ist, um die Zellausbeute zu maximieren.
Ein Hauptvorteil der hier beschriebenen Verfahren ist, daß ein großes Volumen von apheresiertem Blut direkt auf den Dichtegradienten aufgetragen werden kann. Peripheres Blut kann in Antikoagulans enthaltenden Röhrchen oder durch Apherese oder Leukopherese gesammelt werden. Außerdem verringert das Einstufenverfahren das Gesamtvolumen des Infusats um 70-90%, wodurch die Menge an erforderlichem Kryokonservierungsmittel verringert wird. Nach der Anreicherung macht die fertige Zellpräparation zwischen 10% bis 30% der Ausgangszellzahl aus, aber enthält zwischen 70% und 100% der Ausgangszahl der CD34&spplus;-Zellen und Kolonie-bildenden CFU's. Auf Grund dieser hohen Ausbeute (70% bis 100%) von CD34&spplus;-Zellen kann eine einzige Sammlung von peripherem Blut ausreichend CD34&spplus;-Zellen ergeben, um das hämatopoetische System und das Immunsystem von Patienten wiederherzustellen, die eine ablative Chemotherapie durchmachen. Diese Zellpopulation enthält auch eine verminderte Zahl von T-Zellen, aber eine beträchtliche Zahl von natürlichen Killerzellen und natürlichen Supressorzellen. Außerdem ist das Verfahren schnell, einfach und wirtschaftlich. Die Verarbeitung einer ganzen Probe erfordert keine spezialisierte Ausstattung mit Instrumenten und kann von einer Person in einem zeitlichen Rahmen von einer Stunde durchgeführt werden.
Die vorliegende Erfindung sorgt auch für die Abrennung von verunreinigenden Tumorzellen von den Knochenmarkzellen oder einer anderen Vorläuferzellenquelle vor der Reinfusion der Vorläuferzellen in ein autologes Milieu zur Verwendung bei einer folgenden Transplantation.
Für Abtrennungszwecke wird die Dichte einer bestimmten Tumorzelle durch Zentrifugieren einer tumorhaltigen Probe auf einem diskontinuierlichen Dichtegradienten im Bereich von 1,0490 bis 1,0640 g/ml bestimmt. Der Mehrzahl der unerwünschten Nichttumorzellen stellt Zellen des Immun- und hämatopoetischen Systems dar und hat eine Dichte im Bereich von 1,0610 bis 1,0770. Die Dichte von Tumorzellen fällt im allgemeinen in den 1,0490 bis 1,0580 g/ml-Dichtebereich. Die Dichte des Zelltrennungsmediums wird bis zu einer Genauigkeit innerhalb von ± 0,0005 g/ml, vorzugsweise ± 0,0002 g/ml, der spezifischen Schwere der gewünschten Vorläuferzellen bestimmt. Auf diese Weise kann die Tumorabtrennung durch ein Zweistufenverfahren ausgeführt werden, bei dem die Vorläuferzellen zuerst über ein Zelltrennungsmedium, das Tumorzellen zurückhalten kann, pelletiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann das DACS-Verfahren angewendet werden, um Tumorzellen in einem Einstufenverfahren gemäß den hier beschriebenen Verfahren zu entfernen.
Zur Anreicherung von CD34&spplus;-Zellen sollte das Zelltrennungsmedium auf eine Dichte von 1,0605 ± 0,0005 g/ml, eine physiologische Osmolalität von 270-290 mOsm/kg H&sub2;O und einen physiologischen pH-Wert von 6,8-7, 8 eingestellt werden. Stärker bevorzugt beträgt die Dichte 1,0605 ± 0,0002 g/ml, und die Osmolalität beträgt 280 mOsm/kg H&sub2;O bei pH 7,4.
In einem veranschaulichenden Beispiel wird apheresiertes Blut von einem Krebspatienten, der mit G-CSF behandelt wurde, direkt in ein Zellabfangzentrifügationsröhrchen gefüllt, das eine "PERCOLL"-Lösung enthält, die bis zu einer Höhe über der Verengung eingefüllt wurde und auf die bevorzugte Dichte von 1,0605 ± 0,0005 g/ml, Osmolalität von 280 mOsm/kg H&sub2;O und pH 7,4 eingestellt worden ist. Die Dichte der "PERCOLL"-Lösung kann mit einem Densitometer eingestellt werden, um deren Genauigkeit bis mindestens zur vierten Dezimalstelle zu bestimmen. Es sollte angemerkt werden, daß eine Vielzahl von anderen Gradientenmaterialien verwendet werden kann, um eine Vorläuferzellenanreicherung zu erreichen, und sie schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, "FICOLL", "FICOLL-HYPAQUE", Cäsiumchlorid, jegliche. Proteinlösung, wie Albumin, oder jegliche Zuckerlösung, wie Saccharose und Dextran, ein. Jedoch sollte die Dichtegradientenlösung hergestellt und auf die geeignete Dichte, Osmolalität und den geeigneten pH-Wert gemäß dem hier offengelegten Wert vor deren Verwendung eingestellt werden. Die Gradientenlösung sollte in ein Zentrifugationsröhrchen in einem Volumen eingebracht werden, das ausreicht, um allen Zellen mit einer höheren Dichte zu erlauben, den Gradienten während der Zentrifugation zu durchlaufen. Zum Beispiel ist ein Volumen von etwa 20-25 ml der Lösung im allgemeinen zur Trennung von Zellen in 20 ml von apheresierten Blutproben ausreichend.
Jegliche zur Verwendung bei der Zentrifugation geeigneten Röhrchen können zur Durchführung der Erfindung verwendet werden. In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die in Abschnitt 5.1.A. beschriebene Zellabfangzentrifugationsvorrichtung für die Dichtetrennung von CD34&spplus;-Zellen verwendet.
Tabelle 3 gibt Ergebnisse von Studien an, bei denen "PERCOLL" als Dichtegradientenmaterial verwendet wurde. "PERCOLL" wurde hergestellt und auf eine physiologische Osmolalität von 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O und einen physiologischen pH-Wert von 7,4 eingestellt. Für diese Studie war das Ausgangszellengemisch eine Probe von apheresiertem Blut von einem Nicht-Hodgkin-Lymphom-Patienten, der mit G-CSF behandelt worden war. Wenn der Gradient auf verschiedene Dichten eingestellt wurde, zeigten die Ergebnisse, daß, wenn die Dichte bei 1,0600 g/ml oder darüber lag, es eine etwa 60-90%ige Zunahme von CD34&spplus;-Zellen in der Zwischenflächenfraktion gab, verglichen mit den auf geringere Dichten eingestellten Gradienten. Außerdem erhöhte sich der Prozentsatz der Zellgesamtausbeute leicht bei 1,0600 g/ml oder darüber. Folglich, um einen hohen Prozentsatz der gesamten CD34&spplus;-Zellen aus dem Ausgangszellengemisch zu gewinnen, wurde die Dichte von 1,0605 g/ml ausgewählt. Es wurde ferner bestimmt, daß eine Genauigkeit innerhalb von ± 0,0005 g/ml vorzuziehen war, um eine Anreicherung in hoher Ausbeute von CD34&spplus;-Zellen sicherzustellen.
In weiteren Experimenten, die bei der Bestätigung der vorliegenden Erfindung ausgeführt wurden, wurde "PERCOLL" auf eine Dichte von 1,0605 g/ml und eine Osmolalität von 280 mOsm/kg H&sub2;O eingestellt und mit einer "FICOLL"-Stammlösung verglichen, die eine Dichte von 1,077 ± 0,001 g/ml und 320 mOsm/kg H&sub2;O hatte. Tabelle 4 zeigt, daß, wenn die Gravitationskraft der Zentrifugation zunahm, mehr CD34&spplus;-Zellen bei dem "FICOLL"-Stammlösungsgradienten pelletiert wurden. Da die Verwendung einer nicht eingestellten "FICOLL"-Lösung das Standardmaterial war, das zur Dichtegradiententrennung von CD34&spplus;-Zellen aus einem Zellengemisch verwendet wurde, zeigen diese Ergebnisse, daß ein genau bestimmter Dichtebereich die Anreicherung in hoher Ausbeute von CD34&spplus;-Zellen aus einem Zellengemisch deutlich verbessern kann. Wie in Tabelle 4 gezeigt, erhöhte sich der Prozentsatz der CD34&spplus;-Zellausbeute nach Zentrifugation bei 1500 · g um etwa das 2fache, verglichen mit der Ausbeute, die durch ein herkömmliches Verfahren erzielt wurde. Tabelle 3 Tabelle 4
Absolute Zellzahlen und die Zellrückgewinnung wurden unter Verwendung von apheresierten Blutproben von Nicht-Hodgkin-Lymphom-Patienten bestimmt. Die mittlere Zellrückgewinnung aus 5 Proben war unterschiedlich, aber lag immer im Bereich von 90%. Da die Zellzählung nach einem Waschschritt durchgeführt wurde, kann dieser einen Zellverlust von bis zu 10% ausmachen. Die CD34&spplus;-Zellgewinnung wurde von den 5 verschiedenen Blutproben bestimmt und lag immer im Bereich von 90%. Dieses Ergebnis war mit dem vorstehend gezeigten unspezifischen Zellverlust vergleichbar, folglich war er nicht auf einen spezifische Verringerung der Gesamtzahl der CD34&spplus;-Zellen oder eine Veränderung in der CD34-Expression durch hämatopoetische Vorläuferzellen zurückzuführen. Wenn die quantitative Gewinnung von CFU's bestimmt wurde, lag die CFU-Gewinnung ebenfalls im Bereich von 90%. Folglich verändert das Zelltrennungsverfahren durch den 1,0605 g/ml- Dichtegradienten nicht das funktionelle Potential von hämatopoetischen Vorläuferzellen, Kolonien zu bilden.
Außerdem wurde die quantitative Verteilung der CFU's über den Gradienten bestimmt. Die in Fig. 10 gezeigten Ergebnisse veranschaulichen, daß nur eine kleine Zahl von CFU's in den Pelletfraktionen beobachtet wurde, und etwa 90-100% der CFU's lagen in der Zwischenfläche von 1,0605 g/ml "PERCOLL" vor. Auch wurde beobachtet, daß 100% der CFU-GEMM's in der Zwischenfläche vorlagen (Fig. 11). LTC-IC-Tests zeigten, daß zwischen 90-100% der nicht determinierten hämatopoetischen Stammzellen in der Zwischenfläche vorlagen (Fig. 12).
Daher zeigen diese Daten, daß die Zentrifugation von apheresiertem Blut auf einem einschichtigen Gradienten, der auf 1,0605 ± 0,0005 g/ml eingestellt wurde, einen geringfügigen unspezifischen Verlust (10% oder weniger) des gesamten Zellprodukts zur Folge hatte. Jedoch, obwohl die Zwischenfläche etwa 30% der Zellzahl insgesamt ausmachte, enthielt diese Zellpopulation 70-90% der CD34&spplus;-Zellen und mehr als 90% der CFU's. Die Zwischenfläche enthielt 100% der CFU-GEMM's, und da CFU-GEMM's Vorläuferzellen mit einem geringen hämatopoetischen Determinierungsgrad und einem begrenzten Grad der Selbstregenerierung darstellen, enthielt die Zwischenfläche auch die nicht determinierten hämatopoetischen Stammzellen. Die mit den LTC-IC-Tests erhaltenen Ergebnisse stützen diese Schlußfolgerung weiter. Dieses vereinfachte Verfahren kann die Automatisierung der CD34&spplus;-Zellanreicherung in einem vollständig geschlossenen System ermöglichen. Außerdem ergaben Experimente, die in Zellabfangröhrchen durchgeführt wurden, ähnliche Ergebnisse mit einem noch größeren Grad an Kontinuität.
Weitere Indikationen für CD34&spplus;-Zellen. Die Transplantat-Wirt-Reaktion (GvHD) wird durch die T-Zellen induziert, die in den Donor-Allotransplantaten vorliegen. Folglich schließen einige Transplantationsprotokolle die vollständige Entfernung von T-Zellen aus dem Transplantat vor der Transplantation ein. Obwohl diese Verfahren die GvHD wirksam verminderten, hatten sie auch eine zunehmende Häufigkeit von Transplantatsmißerfolgen und Tumorrezidiven zur Folge. Anders ausgedrückt, kann die Anwesenheit einer begrenzten Zahl von T-Zellen für die Überlebenschancen von Allotransplantatpatienten vorteilhaft sein.
In diesem Zusammenhang wurde ein "PERCOLL"-Gradient auf eine Dichte von 1,0605 ± 0,0005 g/ml eingestellt, um ihn auf seine Fähigkeit zu testen, T-Zellen zu entfernen. Normales Knochenmark und apheresierte Blutproben von G-CSF-behandelten normalen Individuen wurden auf dem Dichtegradienten weiterverarbeitet. Die Zellen aus der Zwischenfläche und den Pelletfraktionen wurden mit den T-Zellen-spezifischen anti-CD3- Antikörpern gefärbt. Fig. 13 zeigt, daß bei beiden Gewebequellen die Zwischenfläche zwischen 10% und 20% der Gesamtzahl der T-Zellen enthielt, die in dem nicht weiterverarbeiteten Material vorlagen.
In vitro-Studien haben gezeigt, daß menschliches Knochenmark Zellen geringer Dichte enthält, die in vitro Alloreaktionen in den gemischten Lymphocytenkulturen (MLR) blockieren. Auf Grund der Tatsache, daß diese suppressive Aktivität nicht-HLA-beschränkt war, wurde sie in der Literatur als natürliche Suppressor (NS)-Aktivität bezeichnet. Ein "PERCOLL"-Dichtegradient wurde auf eine Dichte von 1,0605 ± 0,0005 g/ml eingestellt, um ihn auf seine Fähigkeit zu testen, Zellen mit NS-Aktivität anzureichern. Apheresierte Blutproben von Lymphompatienten und von normalen Individuen, die eine G-CSF-Behandlung erhalten hatten, wurden auf einem diskontinuierlichen, fünfschichtigen Gradienten zentrifugiert, und die Zwischenflächen und das Pellet wurden auf ihr Potential durchmustert, die gemischte Lymphocytenkultur zu hemmen. Fig. 14 zeigt, daß Zellen mit NS-Aktivität eine Dichte hatten, die gleich oder geringer als 1,0605 g/ml war. Folglich lag mehr als 90% der NS-Aktivität in der letzten Zellpräparation nach Zentrifugation auf einem 1,0605 g/ml- Gradienten vor.
Für NK-Zellen wurde gezeigt, daß sie autologe Tumorzellen abtöten. Aus klinischer Sicht kann es vorteilhaft sein, eine erhöhte Zahl von NK-Zellen in dem Transplantat zur Verfügung zu haben, um Tumorrezidive zu verringern. In diesem Zusammenhang wurde die Dichte von NK-Zellen auf einem diskontinuierlichen, fünfschichtigen "PERCOLL"- Gradienten bestimmt. Für NK-Zellen wurde ebenfalls eine Dichte gezeigt, die gleich oder geringer als 1,0605 g/ml ist. Folglich lagen mehr als 90% der NK-Zellen in der letzten Zellpräparation nach Zentrifugation auf einem 1,0605 g/ml-Gradienten vor, wie in Fig. 15 gezeigt.
Fig. 16(A-F) zeigen das Ergebnis eines repräsentativen Experiments, bei dem CD34&spplus;-Zellen unter Anwendung des DACS-Verfahrens in Verbindung mit dem erfindungsgemäßen Dichteverfahren durch Entfernen von verunreinigenden Zellen mit einem an einen schweren Träger (wie magnetische Kügelchen oder Aminopropylglaskügelchen) gekoppelten anti-CD45-mAb angereichert wurden. In diesem speziellen Experiment wurde die gesamte Zellzahl um 82% verringert, und die CD34-Ausbeute betrug ungefähr 40%. Die CD34-Reinheit wurde von 2% auf etwa 20% erhöht. Da der anti-CD45-Antikörper auch einige der CD34&spplus;-Zellen entfernte, könnte dieses Verfahren durch Verwendung eines Gemisches von anderen Antikörpern, um Nichtstammzellen zu entziehen, verbessert werden.

5.3.C. Anreicherung von Brusttumorzellen

Es ist bewiesen, daß sich Brusttumorzellen und Tumoremboli direkt in den Blutstrom ausbreiten, was eine alternative und wünschenswerte Quelle von Brusttumorzellen für diagnostische Zwecke bereitstellt (Cecil Textbook of Medicine, a.a.O.). Jedoch, um zirkulierende Körperflüssigkeiten erfolgreich zur Brustkrebsdiagnose zu verwenden, muß die kleine Zahl von zirkulierenden Brusttumorzellen erst angereichert werden, und man muß hochempfindliche und spezifische Verfahren anwenden, um die Brusttumorzellen nachzuweisen.
Gegenwärtig besteht ein Bedarf für ein schnelles und reproduzierbares Verfahren, das zur Weiterverarbeitung eines großen Volumens von Vollblut geeignet ist und eine spezifische Anreicherung in hoher Ausbeute von Brusttumorzellen aus zirkulierenden Körperflüssigkeiten bewirkt. Dies kann durch Anwendung der erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis von metastasierenden Brusttumorzellen aus solchen Flüssigkeiten erreicht werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur schnellen und ertragsreichen Isolierung oder Anreicherung von Brusttumorzellpopulationen aus Zellquellen oder Zellengemischen, die auf der Dichtegradientenzentrifugation basieren. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines speziell entwickelten Zellabfangzentrifugationsröhrchens, das eine genau bestimmte Dichte einer Dichtegradientenlösung enthält, und eine Sammlungsweise der gewünschten Zellpopulation, die die Ausbeute maximiert. Das erfindungsgemäße Verfahren kann angewendet werden, um die Empfindlichkeit des Brusttumornachweises durch Anreichern der Tumorzellen aus einer Zellquelle, z. B. Vollblut, vor der Anwendung von molekularen oder zellulären Nachweisverfahren zu erhöhen. In Kombination mit tumorspezifischen Antikörpern und der dichteregulierten Zellsortierung erlaubt das Verfahren die Abtrennung von Tumorzellen aus einem Knochenmark- oder peripheren Blut-Stammzellentransplantat.
Die vorliegende Erfindung zeigt, daß die geeignete Einstellung eines Gradientenmaterials auf eine spezifische Dichte, Osmolalität und eine spezifischen pH-Wert die Zelltrennung erheblich verbessert. Für die Anreicherung von Brusttumorzellen sollte ein Gradient auf eine Dichte von 1,0490 bis 1,0580 ± 0,0005 g/ml, abhängig von dem spezifischen Typ der Brusttumorzelle, eine physiologische Osmolalität von 270-290 mOsm/kg H&sub2;O und einen physiologischen pH-Wert von 6,8-7, 8 eingestellt werden. In einer spezifischen Ausführungsform werden beispielsweise Brusttumorzellen direkt in ein Zellabfangzentrifugationsröhrchen eingebracht, das ein geeignetes Zelltrennungsmedium enthält, wie eine "PERCOLL"-Lösung, das bis zu einer Höhe über der Verengung eingefüllt ist. In den hier beschriebenen spezifischen Beispielen wurde die erfolgreiche Anreicherung von Tumorzellen auf "PERCOLL"-Dichtegradientenmaterial ausgeführt, das auf die spezifische Dichte zwischen 1,0490 bis 1,0580 ± 0,0002 g/ml, abhängig von dem spezifischen Typ der Brusttumorzelle, eine Osmolalität von 280 mOsm/kg H&sub2;O und einen pH-Wert von 7,4 eingestellt worden war. Die Dichte der "PERCOLL"-Lösung kann mit einem Densitometer eingestellt werden, um deren Genauigkeit genau zu bestimmen, wie in Abschnitt 5.1.B. beschrieben.
Die durch die in Beispiel 3 beschriebenen Verfahren angereicherten Zellen können anschließend auf das Vorhandensein von Brusttumorzellen untersucht werden. Die so erhaltene Ausbeute an isolierten oder angereicherten Zellen aus den erfindungsgemäßen Zelltrennungsverfahren kann für diagnostische Zwecke, z. B. morphologische, molekulare, biochemische oder immunphänotypische Tests, verwendet werden. Zum Beispiel kann DNA aus den gesammelten Zellen präpariert und einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unterzogen werden, oder die gesammelten Zellen können morphologisch beurteilt werden, wodurch die Anwendung von invasiven und teueren chirurgischen Verfahren umgangen wird, auf die man für eine solche Bestimmung bisher angewiesen war.
Verschiedene Brusttumorantigene und Brusttumormarker sind dem Fachmann bekannt oder sind im Handel erhältlich, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, Cathepsin D (Westley et al., 1980), EGF-R (Osborne et al., 1980), Östrogenrezeptor (Gorski et al., 1966), Ki-67 (Gerdes et al., 1983), Progesteronrezeptor (Horowitz et al., 1983) und TGF-α, der mit Brustkrebs assoziiert ist. Antikörper, die gegen diese Antigene oder Marker gerichtet sind, können verwendet werden, um den Tumortyp von gesammelten Zellen zu beurteilen.
Ein Hauptvorteil der hier beschriebenen Verfahren ist, daß ein großes Volumen von Vollblut direkt auf den Dichtegradienten aufgetragen werden kann. Peripheres Blut kann in Antikoagulans enthaltenden Röhrchen oder durch Apherese oder Leukopherese gesammelt werden. Vollblut muß vor der Zentrifugation nicht weiterverarbeitet oder verdünnt werden. Jedoch, da die Verfahren Brusttumorzellen auf Grund ihrer spezifischen Schwebedichte anreichern, ist es wichtig, daß die Zellen einer Trennung innerhalb eines relativ kurzen Zeitraums nach ihrer Sammlung aus einer in vivo-Quelle unterzogen werden, da sich die Dichte der Zellen entsprechend ihren Kultur- und Lagerungsbedingungen verändert. Deshalb, um eine optimale Anreicherung von Brusttumorzellen aus Blut zu erhalten, wird bevorzugt, daß die Blutproben innerhalb von 48 Stunden nach ihrer Sammlung verwendet werden. Am meisten bevorzugt sollten Blutproben einer Dichtegradientenzentrifugation innerhalb von mehreren Stunden nach der Sammlung unterzogen werden.
Die Dichte von vier Brusttumorzelltypen, die von Tumorzellinien abstammen, wurde unter Verwendung eines diskontinuierlichen "PERCOLL"-Dichtegradientensystems bestimmt (Fig. 17A-17D). Die Zellen wurden aus jeder der Zwischenflächen gesammelt und in einem Hämocytometer gezählt. Die Ergebnisse zeigten, daß 30 bis 60% der Tumorzellen eine Dichte haben, die gleich oder höher als 1,0580 g/ml ist (Fig. 18A-D). Dies zeigt, daß die Tumorzellen enthaltende Fraktion zwischen 10 und 80% rein war. Von den bei einer spezifischen Dichte von 1,0580 gesammelten Zellen waren etwa 75 bis 85% der Zellen insgesamt Tumorzellen, während etwa 10% des gesamten Zellvolumens eine Verunreinigung waren. Dies zeigt, daß die Nachweisgrenze des Tests um etwa das 10fache von 1/106 auf iiiO' verbessert wird.
Wenn radioaktiv markierte Brusttumorzellen mit einer Leukocytenmanschette von peripherem Blut gemischt wurden, konnten bis zu 80% von ihnen durch Zentrifugieren des Gemisches auf einem 1,0580 g/ml, 280 mOsm-Gradienten zurückgehalten werden. Außerdem verunreinigte nur eine kleine Fraktion (< 10% der anfänglichen Zellzahl) von Nichttumorzellen die gesammelte Tumorfraktion.
Die in Fig. 17A-17D und 18A-18D gezeigten Dichtebereiche, die unter Verwendung von gezüchteten Brusttumorzellen erhalten wurden, sind wahrscheinlich auf Brusttumorzellen anwendbar, die aus in vivo-Quellen erhalten wurden. Für den Fachmann ist offensichtlich, daß leichte Variationen in Bezug auf die Dichte von verschiedenen Brust tumorzellen aus in vivo-Quellen eine Verfeinerung der genauen Dichte, die erforderlich ist, um eine optimale Anreicherung zu erzielen, notwendig machen kann. Verfahren zur Bestimmung der spezifischen Dichte mit einer Genauigkeit von ± 0,0002 g/ml werden hier offengelegt.
Das vorstehende Verfahren kann auch in Verbindung mit dem hier beschriebenen DACS-Verfahren angewendet werden. Zum Beispiel kann Vollblut direkt mit mit anti- CD45-Antikörpern beschichteten Trägerpartikeln inkubiert werden, die mit den meisten Leukocyten reagieren. Da Brusttumorzellen mit anti-CD45 in keinem signifikanten Umfang reagieren, wird die überwiegende Mehrheit der Nicht-Erythrocyten, Leukocyten und anderen Zellen schwerer gemacht als das Dichtematerial und pelletiert während der Zentrifugation, während die Brusttumorzellen im oberen Kompartiment zurückbleiben. Eine Vielzahl von anderen zelltypspezifischen Bindemitteln kann verwendet werden, um spezifische Zelltypen im Blut zielgerecht anzugehen, wie in den vorstehenden Abschnitten besprochen.
In einer anderen Ausführungsform kann das positive DACS-Selektionsverfahren angewendet werden, um zu bewirken, daß die Brusttumorzellen schwerer als ihre normale Dichte sind, so daß sie während der Zentrifugation pelletiert werden. Zelltypspezifische Bindemittel, die beim positiven Selektionsverfahren nützlich sind, schließen, aber sind nicht darauf begrenzt, Antikörper gegen Brusttumorantigene und Antikörper gegen Brusttumormarker ein, z. B. CA 15-3 (Kufe et al., 1984), CA 549 (Bray et al., 1987), Cathepsin D (Westley et al., 1980), EGF-R (Osborne et al., 1980), Östrogenrezeptor (Gorski et al., 1966), Ki-67 (Gerdes et al., 1983), Progesteronrezeptor (Horowitz et al., 1983) und TGF-α, der mit Brustkrebs assoziiert ist, ein. Viele dieser Antikörper sind im Handel erhältlich.
Die durch die hier beschriebenen Verfahren angereicherten Zellen können anschließend auf das Vorhandensein von Brusttumorzellen untersucht werden. Die so erhaltene Ausbeute an isolierten oder angereicherten Zellen aus den erfindungsgemäßen Zelltrennungsverfahren kann für diagnostische Zwecke, z. B. morphologische, molekulare, biochemische oder immunphänotypische Tests, verwendet werden. Zum Beispiel kann DNA aus den gesammelten Zellen präpariert und einer Polymerasekettenreaktion (PCR) unterzogen werden, oder die gesammelten Zellen können morphologisch beurteilt werden, wodurch die Anwendung von invasiven und teueren chirurgischen Verfahren umgangen wird, auf die man für eine solche Bestimmung bisher angewiesen war. In einer anderen Ausführungsform können Tumorzellen durch das Vorhandensein von Tumorzellmarkern identifiziert werden, die dem Fachmann bekannt sind, einschließlich, aber nicht darauf begrenzt, Cathepsin D (Westley et al., 1980), EGF-R (Osborne et al., 1980), Östrogenrezeptor (Gorski et al., 1966), Ki-67 (Gerdes et al., 1983), Progesteronrezeptor (Horowitz et al., 1983) und TGF-α, der mit Brustkrebs assoziiert ist. Antikörper, die gegen diese Antigene oder Marker gerichtet sind, können verwendet werden, um den Tumortyp von gesammelten Zellen zu beurteilen.

6. Beispiele

Beispiel 1

Isolierung von kernhaltigen Erythrocyten aus mütterlichem Blut

A. Herstellung von Dichtegradienten

Die "PERCOLL"-Lösung wurde von Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) bezogen und bei 4ºC gemäß der Empfehlung des Verkäufers gelagert. Eine Stammlösung wurde durch Mischen von 12 Teilen "PERCOLL" mit 1 Teil 10x Calcium- und Magnesiumfreier, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7,4 und die Osmolalität auf 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O eingestellt. Zur Verwendung bei der Trennung von fötalen kernhaltigen Erythrocyten in einer Blutprobe wurde die Stammlösung mit Calcium- und Magnesium-freiem PBS bis zu einer Dichte von 1,0720 ± 0,0005 g/ml weiter verdünnt und bei Raumtemperatur verwendet. Es war wichtig, die Dichte des Gradienten bis zu einer Genauigkeit innerhalb von ± 0,0005 g/ml, vorzugsweise innerhalb von ± 0,0002 g/ml, von 1,0720 g/ml einzustellen, um die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Zelltrennung sicherzustellen. Dies wurde mit einem digitalen Densitometer hoher Präzision, wie DMA 48 (Anton PAAR USA, Ashland, VA), erreicht. Alle Verfahren wurden unter sterilen Bedingungen und bei Raumtemperatur durchgeführt.

B. Sammlung und Weiterverarbeitung von Blutproben

Peripheres Blut wurde von schwangeren Frauen in Antikoagulans enthaltenden Röhrchen gesammelt. Die Sammlung wurde vor der 20. Schwangerschaftswoche durchgeführt, da die Zahl der in mütterlichem Blut zirkulierenden fötalen Zellen im allgemeinen nach der 17. Schwangerschaftswoche abzunehmen beginnt. Ein optimaler Sammlungszeit raum ist Woche 13. Nach der Sammlung wurden die Blutproben innerhalb von 48 Stunden weiterverarbeitet.

C.1. Dichtegradientenzentrifugation von peripherem Blut

Vollblutproben wurden auf ein "PERCOLL"-Zelltrennungsmedium, das vorher auf eine Dichte von 1,0720 ± 0,0002 g/ml, eine Osmolalität von 280 mOsm/kg H&sub2;O und einen pH-Wert von 7,4 eingestellt worden war, in einem konischen 50 ml-Zellabfangröhrchen überschichtet. Das Röhrchen enthielt eine Verengung an einer Stelle, so daß sich etwa 15 ml "PERCOLL" im unteren Kompartiment und 5 ml "PERCOLL" über der Verengung befanden. Im allgemeinen wurden 20 ml der Blutproben auf den oberen Teil dieses Gradienten überschichtet. Das Röhrchen wurde bei 850 · g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die an der Zwischenfläche des Gradienten vorhandenen Zellen; d. h. oben auf dem "PERCOLL", wurden durch Gießen des gesamten Inhalts des oberen Kompartiments des Röhrchens in ein anderes 50 ml-Röhrchen gesammelt. Das Zellpellet und assoziierte Flüssigkeit in der Region unter der Verendung blieben darin zurück, wenn das Röhrchen umgedreht wurde. Nach Zentrifugation bei 650 · g für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Flüssigkeit oben auf dem Pellet mit einer Pipette entfernt, und die Zellen im Pellet wurden in PBS resuspendiert. Da dieser Zentrifugationsschritt bei geringer Geschwindigkeit vorzugsweise verwendet wurde, um die Zellen von Interesse zu einem Pellet einzuengen, während Zelltrümmer und Thrombocyten in der oberen Region entfernt wurden, könnte auch eine Zellabfangvorrichtung verwendet werden, um diesen Schritt zu erleichtern. In dieser alternativen Ausführungsform wurde ein modifiziertes 50 ml-Zellabfangröhrchen verwendet, bei dem die Verengung nahe dem Boden des Röhrchens plaziert war, so daß ein kleines Volumen von etwa 0,5 ml unterhalb davon vorhanden war. Diese Anordnung würde das Pellet schützen und den Zellverlust während der Entfernung der Flüssigkeit über dem Pellet nach der Zentrifugation verringern. Dieses spezifische Merkmal würde auch erlauben, daß das erfindungsgemäße Verfahren in einer automatisierten Weise angewendet werden kann, ohne daß die Notwendigkeit für einen anschließenden Zellsortierungsschritt besteht, der durchgeführt wurde, um verunreinigende Zellen, insbesondere Thrombocyten, zu dezimieren.
Das vorstehend beschriebene Zelltrennungsverfahren wurde mit herkömmlichen Verfahren verglichen und das folgende Verfahren wurde auch als Kontrolle ausgeführt.
Dieses Verfahren war mit bereits veröffentlichten Verfahren vergleichbar, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (Bianchi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 3279).
Die Blutprobe wurde gesammelt, wie vorstehend beschrieben, und 1 : 4 in PBS verdünnt. Das verdünnte Blut wurde auf "FICOLL-HYPAQUE" (Pharmacia) in 4 verschiedenen 15 ml-Röhrchen überschichtet. Die Dichte der "FICOLL"-Stammlösung lag bei 1,077 ± 0,001 g/ml und die Osmolalität bei 320 mOsm/kg H&sub2;O, wie von Pharmacia veröffentlicht. Die Röhrchen wurden bei 850 · g für 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Zellen an der Zwischenfläche über dem "FICOLL" wurden mit einer Pipette gesammelt und in zwei 15 ml-Röhrchen überführt. Die Röhrchen wurden bis oben mit PBS gefüllt und bei 650 · g für 10 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die Flüssigkeit oben auf dem Pellet wurde mit einer Pipette abgesaugt und das Pellet in PBS resuspendiert. Außerdem wurden auch Experimente unter Verwendung von Zellabfangröhrchen mit einer "FICOLL"-Lösung beim Versuch durchgeführt, die Zellausbeute zu steigern.

C.2. Affinitätstrennung durch ein Magnetfeld

Die fötalen kernhaltigen Erythrocyten, die nach der vorstehend beschriebenen Dichtegradientenzentrifugation in PBS resuspendiert worden waren, wurden durch die Entfernung von CD45&spplus;-Leukocyten durch Inkubieren der Zellen mit einem monoclonalen anti- CD45-Antikörper (Clon ALB-12) (Biodesign International, Kennebunk, ME) für 30 Minuten bei 4ºC weiter angereichert. Die nicht gebundenen Antikörper wurden durch Waschen der Zellen in PBS entfernt. Ein Ziege-anti-Maus-Antikörper, konjugiert an magnetische Partikel (Immunocon), wurde zu den Zellen für 30 Minuten bei 4ºC zugegeben. Die Zellen wurden in PBS gewaschen und einem Magnetfeld ausgesetzt, das die die magnetischen Partikel bedeckenden CD45&spplus;-Leukocyten anzieht, während die fötalen kernhaltigen erythroiden Zellen und Trophoblasten in Lösung blieben. Die fötalen Zellen wurden mit einer Pipette gesammelt und einmal in PBS gewaschen. Die Zellen wurden dann durch Antikörperfärbung und durchflußcytometrische Analyse getestet, um die Zahl der kernhaltigen Erythrocyten zu bestimmen.

D.1 Dichteregulierte Zellsortierung

Von schwangeren Frauen gesammeltes Vollblut wurde mit 1,4 u- Aminopropylglaskügelchen (Bangs Laboratories Inc., Carmel, IN), die mit einem anti- CD45-Antikörper (ALB-12) Glutaraldehyd-beschichtet worden waren, für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das gesamte Blutzellengemisch wurde auf "PERCOLL" (1,0720 ± 0,0002 g/ml, 280 mOsm/kg H&sub2;O, pH 7,4) in einem 50 ml-Zellabfangröhrchen überschichtet. Das Röhrchen enthielt etwa 15 ml "PERCOLL" unter der Verengung und etwa 5 ml darüber. Es war wichtig, das Volumen unter der Verengung mit "PERCOLL" vollständig aufzufüllen, um der Bildung von Luftblasen vorzubeugen. Das Röhrchen wurde bei 850 · g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die leukocytendezimierte Zellpopulation wurde aus der Zwischenfläche über dem "PERCOLL" durch Abgießen der ganzen oberen Region des Röhrchens in ein 50 ml-Röhrchen gesammelt. Die Zellen wurden bei 650 · g für 10 Minuten bei Raumtemperatur abzentrifugiert und die Flüssigkeit oben auf dem Pellet wurde mit einer Pipette entfernt. Die Zellen in dem Pellet wurden in PBS resuspendiert.
In einer anderen Ausführungsform kann der zweite Zentrifugationsschritt in einem modifizierten Zellabfangröhrchen, wie vorstehend in Abschnitt 5.2. beschrieben, ausgeführt werden. Außerdem könnte auch eine zweite dichteregulierte Zellsortierung unter Verwendung von Antikörpern, wie anti-CD41, durchgeführt werden, um spezifisch Thrombocyten zu entfernen.

D.2. Antikörperfärbung und durchflußcytometrische Analyse

Die leukocytendezimierte Zellpopulation in PBS wurde mit dem DNA-Farbstoff LDS 751 (Exciton, Inc., Dayton, OH) und für die erythroide Abstammungslinie spezifischen, FITC-konjugierten monoclonalen Antikörpern, wie anti-Glycophorin A und anti-CD71 (Becton Dickinson, Inc., San Jose, CA), behandelt. Der LDS 751-Farbstoff unterschied zwischen kernhaltiger und einer kernhaltigen Zelle. Eine Million Zellen wurden mit 10 ul Antikörper für 30 Minuten bei 4ºC in Gegenwart von 5% Kaninchenserum und LDS 751 inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und in 1% Paraformaldehyd fixiert. Die Antikörper-gebundenen Zellen wurden durch Durchflußcytometrie analysiert, für die eine statistische Analyse mit 104 Durchflußereignissen unter Verwendung eines mit einem LYSYS 11-Programm ausgestatteten FACSScan-Systems durchgeführt wurde.

Beispiel 2

Anreicherung von CD34&spplus;-Zellen aus einem Blutzellengemisch

A. Herstellung von Dichtegradienten

Die "PERCOLL"-Lösung wurde von Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) bezogen und bei 4ºC gemäß der Empfehlung des Verkäufers gelagert. Eine Stammlösung wurde durch Mischen von 12 Teilen "PERCOLL" mit 1 Teil 10x Calcium- und Magnesiumfreier, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7,4 und die Osmolalität auf 280 mOsm/kg H&sub2;O eingestellt. Zur Verwendung bei der Abtrennung von CD34&spplus;-Zellen in einen Zellengemisch wurde die Stammlösung mit Calcium- und Magnesium-freiem PBS bis zu einer Dichte von 1,0605 ± 0,0005 g/ml weiter verdünnt und bei Raumtemperatur verwendet. Es war wichtig, die Dichte des Gradienten bis zu einer Genauigkeit innerhalb von ± 0,0005 g/ml von 1,0605 g/ml einzustellen, um die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Zelltrennung sicherzustellen. Dies wurde mit einem digitalen Densitometer hoher Präzision, wie DMA 48 (Anton PAAR USA, Ashland, VA), erreicht. Alle Verfahren wurden unter sterilen Bedingungen und bei Raumtemperatur durchgeführt.
B. Sammlung von eripherem Blut und Knochenmark
Patienten wurden hydratisiert und mit Cyclophosphamid (4 g/m²) behandelt, das durch intravenöse (IV) Infusion über zwei Stunden über einen zentralen Venenkatheder verabreicht wurde. Vierundzwanzig Stunden nach Beendigung der Cyclophosphamid-Infusion werden die Patienten mit G-CSF (Neupogen, Amgen, Thousand Oaks, CA) behandelt, der durch subkutane (SC) Injektion in einer Dosis von etwa 10 ug/kg/d verabreicht wurde. Nach Gewinnung einer Leukocytenzahl (WBC) von gleich oder mehr als 1 · 10&sup9;/l wurde eine Apherese eingeleitet. Die Apherese wurde unter Verwendung einer Cobe Spectra-Zelltrennungsvorrichtung (Lakewood, Colorado) in einer Rate von 80 ml/min für 200 min (Gesamtvolumen 161) durchgeführt.

C. Dichtegradientenzentrifugation von Leukocytenmanschetten von apheresiertem Blut und Knochenmark

Apheresiertes peripheres Blut wurde direkt auf den Dichtegradienten aufgetragen.
Jedoch wurden Vollblut und Knochenmarkaspirate zu einer Leukocytenmanschette weiterverarbeitet (Entfernung von Erythrocyten), bevor sie auf den Dichtegradienten aufgetragen wurden.
Leukocytenmanschettenproben von apheresiertem Blut oder Knochenmark wurden auf einen "PERCOLL"-Gradienten, der vorher auf eine Dichte von 1,0605 ± 0,0005 g/ml, eine Osmolalität von 280 mOsm/kg H&sub2;O und einen pH-Wert von 7,4 eingestellt worden war, in einem konischen 50 ml-Zellabfangröhrchen oder einem im Handel erhältlichen Röhrchen überschichtet. Das Zellabfangröhrchen enthielt eine Verengung an einer Stelle, so daß sich etwa 15 ml "PERCOLL" im unteren Kompartiment und 5 ml "PERCOLL" über der Verengung befanden. Es war wichtig, das Volumen unter der Verengung mit "PERCOLL" vollständig aufzufüllen, um der Bildung von Luftblasen vorzubeugen. Im allgemeinen wurden 20 ml der apheresierten Blutproben auf den oberen Teil dieses Gradienten überschichtet. Das Röhrchen wurde bei 850 · g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die an der Zwischenfläche des Gradienten, d. h. oben auf dem "PERCOLL", vorhandenen Zellen wurden durch Gießen des gesamten Inhalts des oberen Kompartiments des Röhrchens in ein anderes 50 ml-Röhrchen gesammelt. Das Zellpellet in der Region unter der Verengung wurde am Ausgießen gehindert, wenn das Röhrchen umgedreht wurde.
Um das in dem vorhergehenden Absatz beschriebene Zelltrennungsverfahren mit herkömmlichen Verfahren zu vergleichen, wurden die Testproben auch auf "FICOLL- HYPAQUE" (Pharmacia) überschichtet. Die Dichte der "FICOLL"-Stammlösung lag bei 1,077 ± 0,001 g/ml und die Osmolalität bei 320 mOsm/kg H&sub2;O, wie vom Verkäufer veröffentlicht.

D. Dichteregulierte Zellsortierung

Apheresiertes Blutprodukt wurde mit 1,4 u-Aminopropylglaskügelchen (Bangs Laboratories Inc., Channel, IN), die mit einem anti-CD45-Antikörper (Clon ALB-12, Biodesign International, Kennebunk, ME) Glutaraldehyd-beschichtet worden waren, für 45 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Das gesamte Blutzellengemisch wurde auf "PERCOLL" (1,0605 ± 0,0005 g/ml, 280 mOsm/kg H&sub2;O, pH 7,4) in einem 50 ml-Röhrchen überschichtet.

E. Konjugation von monoclonalen Antikörpern an Trägerpartikel

Phycoerythrin-konjugierte (PE), monoclonale anti-CD34-Antikörper (hämatopoetischer Vorläuferzellenmarker) und Fluorescein-konjugierte (FITC), monoclonale anti- CD45-Antikörper (Pan-Leukocytenmarker) wurden von Becton Dickinson, Inc. (San Jose, CA) bezogen. Nicht konjugierte Antikörper, die gegen CD45, CD16 (Granulocyten, Monocyten), CD3 (T-Zellen) und CD 14 (Monocyten) gerichtet waren, wurden im Labor gemäß den auf dem Fachgebiet gut bekannten Verfahren hergestellt.
Die Antikörper wurden an entweder Ziege-anti-Maus-beschichtete magnetische Kügelchen oder an Ziege-anti-Maus-beschichtete Aminopropylglaskügelchen durch Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur konjugiert. In einer anderen Ausführungsform könnten die Antikörper an diese Kügelchen ohne die Ziege-anti-Maus-Brücke direkt gebunden werden oder könnten über eine Avidin-Biotin-Kupplungsreaktion gebunden werden.
Außerdem könnten die Antikörper in Fab2-Fragmente gespalten werden, um die unspezifische Bindung von Zellen an die Kügelchen über ihren Fc-Teil zu verringern.

F. Antikörperfärbung und durchflußcytometrische Analyse

Die Zellen wurden mit 10 ul eines Antikörpers und dem DNA-Farbstoff LDS 751 (Exciton, Inc., Dayton, OH) pro 10&sup6; Zellen für 30 Minuten auf Eis in Gegenwart von 5% Kaninchenserum inkubiert. Das Kaninchenserum wurde verwendet, um die unspezifische Bindung an die Zellen zu verringern. Die Zellen wurden zweimal mit PBS gewaschen und anschließend mit 1% Paraformaldehyd fixiert. Eine statistische Analyse wurde mit 10&sup4; Durchflußereignissen unter Verwendung eines mit einem LYSYS 11-Programm ausgestatteten FACSScan-Durchflußcytometrie-Systems durchgeführt.

G. Koloniebildungs (CFU)-Testflinktionelle Bestimmung der determinierten CD34&spplus;-Zellen

Die funktionellen Eigenschaften der CD34&spplus;-Zellen in einer Zellprobe wurden durch den Koloniebildungstest (CFU) bestimmt. Dieser Test erlaubt die Quantifizierung der Zahl an determinierten hämatopoetischen Vorläuferzellen in der Zelllösung. 10&sup5; Zellen wurden in 2 ml halbfester Methylcellulose gemischt, die verschiedene Kolonie-stimulierende Faktoren und Erythropoietin (Terry Fox Laboratories, Vancouver) enthielt. Das ganze Gemisch wurde für 14 Tage bei 37ºC inkubiert. Die Zahl der erythroiden (CFU-E, BFU-E), Granulocyten/Makrophagen (CFU-GM)- und gemischten (CFU-GEMM)-Kolonien wurde unter einem Umkehrmikroskop (40x) gezählt.

H. Test auf eine Langzeitkultur initijerende Zellen (LTC-IC)/funktionelle Bestimmung der nicht determinierten CD34&spplus;-Zellen

Die Zahl der nicht determinierten hämatopoetischen Vorläuferzellen in einem Zellengemisch wurde durch die eine Langzeitkultur initiierende Kultur bestimmt. Die Zellen wurden auf eine bestrahlte Stromanährschicht überimpif, und eine Bestimmung der CFU's wurde als eine Funktion der Zeit durchgeführt. Hämatopoetische Stammzellen waren in der Lage, sich selbst zu regenerieren, und brachten CFU's in diesem System für einen Zeitraum hervor, der 5 Wochen überschritt. Knochenmark-Langzeitstromakulturen wurden in Platten mit 96 Vertiefungen (106 Zellen in 200 ul pro VertiefUng) in α-MEM-Medium, supplementiert mit 12,5% Pferdeserum, 12,5% fötalem Kälberserum, 2 mM L-Glutamin, 0,2 mM i-Inositol, 20 uM Folsäure und 10&supmin;&sup4; M 2-Mercaptoethanol, initiiert und bei 33ºC in einer feuchten Atmosphäre gehalten. In wöchentlichen Intervallen wurde die Hälfte des Mediums entfernt und durch ein gleiches Volumen von frischem Medium ersetzt. Nach 2-wöchiger Kultur wurden die konfluenten Stromaschichten mit Gammstrahlen (2000 rad) bestrahlt, um endogene hämatopoetische Zellen abzutöten. Nicht fraktionierte Proben und Zellpräparationen nach der Trennung wurden auf die bestrahlten Stromaschichten in dem gleichen Medium, supplementiert mit 10&supmin;&sup6; M Hydrocortison, überimpft. Nach 5-wöchiger Kultur wurden die anhaftenden und nicht anhaftenden Zellen gesammelt und in dem CFU-Test wie vorstehend in Teil G durchmustert.

I. Test auf natürliche Killer (NK)-Zellen

K562-Zielzellen wurden mit 100 uCl &sup5;¹Cr für 1 Stunde bei 37ºC markiert und dann viermal gewaschen und gezählt. Die Zielzellen wurden für 4 Stunden in V-Boden- Multivertiefungsplatten mit 96 Vertiefungen zusammen mit nicht fraktioniertem, apheresiertem Blut und Zellen aus den verschiedenen Fraktionen nach der Zelltrennung gezüchtet. Effektor- und Zielzellen wurden in unterschiedlichen Verhältnissen, 100 : 1, 50 : 1, 25 : 1 und 12 : 1, gemischt. Zum Beispiel enthielt das 100 : 1-Verhältnis 5 · 10&sup5;-Effektorzellen und 5 · 10³ Zielzellen. Nach dem Inkubationszeitraum wurden 100 ul des Überstands geerntet und in einem Szintillationszähler gezählt. Die maximale und spontane &sup5;¹Cr- Freisetzung wurde dadurch gemessen, daß entweder 50 ul der Zielstammlösung bzw. des Überstands von den Effektorzellen selbst gezählt wurden. Die prozentuale Cytotoxizität wurde gemäß der Formel:
Prozent Cytotoxizität = CpM Experiment - CpM spontane Freisetzung / CpM maximale Freisetzung - CpM spontane Freisetzung
bestimmt.

J. Gemischte Lymphocytenkultur und natürliche Suppressorzellaktivität

Zellen aus zwei verschiedenen Leukocytenmanschetten wurden in einer Flachboden-Multivertiefungsplatte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von je 105 Zellen gemischt. Eine der Leukocytenmanschetten erhielt 3000 rad und wurde als die "Stimulatoren" bezeichnet. Die andere Leukocytenmanschette wurde unbehandelt verwendet und als die "ansprechenden Zellen" bezeichnet. Nicht fraktionierte, apheresierte periphere Blutprodukte (APBL) oder Zellen aus den Fraktionen unterschiedlicher Dichte wurden zu diesen Cokulturen in einer Menge von 105 Zellen pro Vertiefung zugegeben. Diese Zellen wurden als "Suppressoren" bezeichnet und erhielten 1500 rad, bevor sie zu der MLR zugegeben wurden. Die Zellen wurden für 5 Tage gezüchtet und dann mit [³H)-Thymidin (1 uCi/Vertiefung) gepulst. 18 Stunden später wurden die Zellen geerntet, und die Menge an eingebautem Thymidin wurde in einem Szintillationszähler bestimmt. Die durch die Suppressorzellen induzierte prozentuale Suppression wurde durch die Formel:
Prozent Suppression = CpM Kontrolle - CpM Experiment / CpM Experiment
bestimmt.

Beispiel 3

Bestimmung der Dichte von Brusttumorzellen und ihre Anreicherung durch Dichtegradientenzentrifugation

Die Zellen wurden mit ³H-Thymidin für 24 Stunden unter Standardkulturbedingungen gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren inkubiert. Die Zellen wurden mit einer Leukocytenmanschette von peripherem Blut gemischt.

A. Herstellung von Dichtegradienten

Die "PERCOLL"-Lösung wurde von Pharmacia Biotech (Uppsala, Schweden) bezogen und bei 4ºC gemäß der Empfehlung des Verkäufers gelagert. Eine Stammlösung wurde durch Mischen von 12 Teilen "PERCOLL" mit 1 Teil 10x Calcium- und Magnesiumfreier, phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) hergestellt. Der pH-Wert der Lösung wurde auf 7,4 und die Osmolalität auf 280 mOsm/kg H&sub2;O eingestellt. Zur Verwendung bei der Anreicherung von Brusttumorzellen, die aus in vitro-Zellinien in einen Zellengemisch erhalten wurden, wurde die Stammlösung mit Calcium- und Magnesium-freiem PBS in fünf verschiedenen Fraktionen mit den jeweiligen Dichten 1,0490, 1,0520, 1,0550, 1,0580 und 1,0610 weiter verdünnt und bei Raumtemperatur verwendet. Es war wichtig, die Dichte des Gradienten mit einer Genauigkeit von ± 0,0002 g/ml Punkten einzustellen, um die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit der Zelltrennung sicherzustellen. Dies wurde mit einem digitalen Densitometer hoher Präzision, wie DMA 48 (Anton PAAR USA, Ashland, VA), erreicht. Alle Verfahren wurden unter sterilen Bedingungen und bei Raumtemperatur durchgeführt.

B. Dichtegradientenzentrifugation

Radioaktiv markierte Brustkrebszellen wurden mit einer Leukocytenmanschette von einer gesunden Spenderin gemischt und auf dem diskontinuierlichen Gradienten zentrifugiert. Zellengemische, die die Brusttumorzellen aus den Zelllinien 30 HTB, 126 HTB, 1500 CRL und 1504 CRL enthielten, wurden auf "PERCOLL"-Gradienten, die vorher auf Dichten im Bereich, von 1,0490-1,0610 ± 0,0002 g/ml, Osmolalitäten von 280 mOsm/kg H&sub2;O und pH-Werte von 7,4 eingestellt worden war, in einem konischen 50 ml-Zellabfangröhrchen überschichtet. Das Röhrchen enthielt eine Verengung an einer Stelle, so daß sich etwa 15 ml "PERCOLL" im unteren Kompartiment und 50 ml "PERCOLL" über der Verengung befanden. Es war wichtig, das Volumen unter der Verengung mit "PERCOLL" vollständig aufzufüllen, um der Bildung von Luftblasen vorzubeugen. Im allgemeinen wurden 20 ml der Zellproben oben auf diesen Gradienten überschichtet. Das Röhrchen wurde bei 850 · g für 30 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Die an der Zwischenfläche des Gradienten, d. h. oben auf dem "PERCOLL", vorhandenen Zellen wurden durch Gießen des gesamten Inhalts des oberen Kompartiments des Röhrchens in ein anderes 50 ml-Röhrchen gesammelt. Das Zellpellet in dem Kompartiment unter der Verengung wurden am Abgießen gehindert, wenn das Röhrchen umgedreht wurde. Nach Zentrifugation bei 650 · g für 10 Minuten bei Raumtemperatur wurde die Flüssigkeit oben auf dem Pellet mit einer Pipette entfernt, und die Zellen im Pellet wurden in PBS resuspendiert. Da dieser Zentrifugationsschritt bei geringer Geschwindigkeit vorwiegend dazu verwendet wurde, die Zellen von Interesse zu einem Pellet einzuengen, während Zelltrümmer und Thrombocyten in der Flüssigkeit entfernt wurden, könnte auch eine Zellabfangvorrichtung verwendet werden, um diesen Schritt zu erleichtern. In dieser alternativen Ausführungsform wurde ein modifiziertes 50 ml-Zellabfangröhrchen verwendet, bei dem die Verengung nahe dem Boden des Röhrchens plaziert war, so daß ein kleines Volumen von etwa 0,5 ml darunter vorhanden war. Diese Anordnung schützt das Pellet und verringert den Zellverlust während der Entfernung der Flüssigkeit über dem Pellet nach der Zentrifugation. Dieses spezifische Merkmal würde auch erlauben, daß das erfindungsgemäße Verfahren ohne die Notwendigkeit für eine Zellsortierung automatisiert werden kann.

Beispiel 4

Herstellung von Trägerpartikeln

A. Herstellung der Kügelchen

Silicakügelchen (1,4 um), die von Bangs Laboratories, Carmel, IN bezogen worden waren, wurden mit konzentrierter HCl für 2 Stunden bei Raumtemperatur gewaschen und mit einem Vortexgerät alle 15 Minuten gründlich gemischt, um Kugelklümpchen aufzubrechen. Nach dem Waschen wurden die Kügelchen bei 850 g für 5 Minuten zentrifugiert. Der HCl enthaltende Überstand wurde dekantiert, und die Kügelchen wurden mit deionisiertem H&sub2;O unter gründlichem Mischen mit einem Vortexgerät gewaschen, um die Klümpchen aufzubrechen.
Die Kügelchen wurden bei Raumtemperatur über Nacht in konzentrierter Salpetersäure unter ständigem Rühren unter Verwendung eines Magnetrührers inkubiert. Die Kügelchen wurden dann bei 850 g für 5 Minuten zentrifugiert und dreimal mit deionisiertem Wasser unter Verwendung von 50 ml deionisiertem H&sub2;O bei jedem Schritt gewaschen. Die Kügelchen wurden zwischen jedem Waschschritt mit einem Vortexgerät gründlich gemischt, um ein Verklumpen der Kügelchen zu verhindern. Zum Schutz vor einer mikrobiellen Kontaminierung wurden die Kügelchen bei 0-4ºC in deionisiertem H&sub2;O bis zur weiteren Verwendung gelagert.

8. Silanisierung der Kügelchen

Um die Kügelchen zu silanisieren, wurde entweder 3-Aminopropyltriethoxysilan, (3-Iodpropyl)trimethoxysilan oder [1-9-Trimethoxysilyl)-2-(m-(oder p)-chlormethyl)phenyl] - ethan verwendet. 40 ml Silanlösung (einer 10%igen Lösung in 95% Ethanol/deionisiertes H&sub2;O) wurden pro 4 g Kügelchen zugegeben. Das Kügelchengemisch wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur über Kopf gedreht. Die Kügelchen wurden bei 850 g für 5 Minuten zentrifugiert, und das überschüssige Silan wurde unter Verwendung von 95% Ethanol/- deionisiertem H&sub2;O in einem Volumen von 100 ml ausgewaschen. Die Kügelchen wurden zwischen jedem Waschschritt mit einem Vortexgerät gründlich gemischt, um ein Verklumpen der Kügelchen zu verhindern. Nach dem Waschschritt können die Kügelchen getrocknet und gelagert werden. In einer anderen Ausführungsform können die Kügelchen in 95% Ethanol/ deionisiertem H&sub2;O kühl gelagert werden, was dem Verklumpen der Kügelchen vorbeugt.

C. Antikörperkupplung an das Aminopropylglas

Die silanisierten Kügelchen wurden über Nacht in 2,5% Glutaraldehyd bei Raumtemperatur inkubiert. Am nächsten Tag wurden die Kügelchen bei 850 g für 5 Minuten zentrifugiert, und das freie Glutaraldehyd wurde mit deionisiertem H&sub2;O in einem Volumen von 100 ml pro 5 g Kügelchen ausgewaschen. Die Kügelchen wurden zwischen jedem Waschschritt mit einem Vortexgerät gründlich gemischt, um ein Verklumpen der Kügelchen zu verhindern.
Der Antikörper wurde zu den Aminopropylkügelchen in einem Überschuß von mindestens 3 mg/m² Kugelgesamtfläche zugegeben, und die Kügelchen wurden über Nacht bei Raumtemperatur über Kopf gedreht. Am nächsten Tag wurden die Kügelchen bei 850 g für 5 Minuten zentrifugiert, und das freie Protein wurde mit 100 ml deionisiertem WO ausgewaschen. Die Kügelchen wurden zwischen jedem Waschschritt mit einem Vortexgerät gründlich gemischt, um ein Verklumpen der Kügelchen zu verhindern. Die Kügelchen wurden in deionisiertem H&sub2;O, enthaltend 0,1 Natriumazid, kühl gelagert. Die fertige Kügelchensuspension sollte 70-90% einzelne Kügelchen und 10-30% vorwiegend Duplett- und Triplettkügelchen enthalten.
Die Bindungseffizienz der Antikörperkonjugierten Kügelchen (im Hinblick auf den Prozentsatz der Kügelchen, die beschichtet sind) kann unter Verwendung einer durchflußcytometrischen Analyse und einem fluoreszenzmarkierten Antikörper, der gegen den gekoppelten Antikörper gerichtet ist, bestimmt werden. In einer anderen Ausführungsform kann der Antikörper zu den silanisierten Kügelchen direkt ohne die Glutaraldehydbindung zugegeben werden.

Claims

1. Zelltrennungsvorrichtung, umfassend:

ein Zentrifugationsröhrchen, das Seitenwände und einen geschlossenen Boden hat;

ein in dem Röhrchen angeordneter Verengungsteil, der so positioniert und konstruiert ist, daß Flüssigkeit im Bodenteil des Röhrchens unterhalb des Verengungsteils zurückgehalten wird, wenn das Röhrchen umgedreht wird, und ein Zelltrennungsmedium, das im Bödenteil des Röhrchens enthalten ist und sich, vor dem Zentrifugieren des Röhrchens, über das Verengungsteil bis zu einer Höhe über einer Öffnung, die durch das Verengungsteil gebildet wird, ausdehnt, so daß Zellen, die an einer Zwischenfläche zwischen dem Zelltrennungsmedium und einem Medium geringerer Dichte gefangen sind, nach der Zentrifugation mit dem Medium geringerer Dichte abgegeben werden, wenn das Röhrchen umgedreht wird.

2. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei der Verengungsteil eine oder mehrere nach unten abfallende Oberflächen aufweist, die untere Randregionen haben, die eine verengte Öffnung ausmachen.

3. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Verengungselement ein Ring ist, der eine zentrale, verengte Öffnung hat.

4. Vorrichtung nach Anspruch 3, wobei der Ring ein elastomerer Ring ist, der für einen Preßsitz im Röhrchen bei einer ausgewählten Röhrchenhöhe konstruiert ist.

5. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Verengungsteil eine Vielfalt von Öffnungen aufweist.

6. Vorrichtung nach Anspruch 1, wobei das Röhrchen einen verschlossenen oberen Teil aufweist und in diesem oberen Teil eine Durchlaßöffnung ausgebildet ist, durch welche flüssiges Material in das Röhrchen eingeführt werden kann.

7. Vorrichtung nach Anspruch 6, die weiterhin eine zweite Durchlaßöffnung in dem oberen Teil und einen geschlossenen Flüssigkeitskanal, der die zweite Durchlaßöffnung mit dem Boden des Röhrchens unterhalb des Verengungsteils verbindet, aufweist.

8. Vorrichtung nach Anspruch 1, zur Verwendung in der Isolierung von CD34&spplus;- hämatopoetischen Vorläuferzellen, wobei die spezifische Dichte des Zelltrennungsmediums innerhalb ± 0.0005 g/ml der spezifischen Dichte der CD34&spplus;-hämatopoetischen Vorläuferzellen liegt.

9. Vorrichtung nach Anspruch 8, wobei das Zelltrennungsmedium eine Osmolalität von 280±10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte von 1.0605 g/ml hat.

10. Vorrichtung nach Anspruch 1, zur Verwendung in der Isolierung von kernhaltigen fötalen Zellen aus einem Zellengemisch, das auch mütterliche Blutzellen enthält, wobei die spezifische Dichte des Zelltrennungsmediums innerhalb von ± 0.0005 g/ml der spezifischen Dichte der fötalen Zellen liegt.

11. Vorrichtung nach Anspruch 10, wobei das Zelltrennungsmedium eine Osmolalität von 280±10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte von 1.0720 g/ml hat.

12. Vorrichtung nach Anspruch 1, zur Verwendung in der Isolierung von Brusttumorzellen aus einem Zellengemisch, wobei das Zelltrennungsmedium eine Osmolalität von 280±10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte ausgewählt aus dem Bereich 1.0490-1.0580 g/ml hat.

13. Verfahren zur Isolierung von ausgewählten Zellen aus einem Zellengemisch, das eine oder mehrere Zelltypen mit Dichten, die unterschiedlich von jener der des ausgewählten Zelltypes sind, enthält, umfassend:

Einbringen eines Zellgemisches, das den ausgewählten Zelltyp enthält, in eine Zentrifugationsvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1-7, enthaltend ein Zelltrennungsmedium mit einer spezifischen Dichte, die innerhalb ± 0.0005 g/ml der spezifischen Dichte des ausgewählten Zelltypes liegt,

Zentrifugieren in der Vorrichtung bei einer Gravitationskraft, die ausreicht, die Zellen, die eine höhere spezifische Dichte als die spezifische Dichte des Dichtegradientenmaterials in dem Röhrchen haben, zu pelletieren, und

Sammeln einer Zellenfraktion aus dem oberen Teil des Röhrchens der Vorrichtung, die die ausgewählte Zelle enthält.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das Sammeln durch Dekantieren des Mediums, das im oberen Teil der Vorrichtung vorliegt, aus der Vorrichtung erfolgt.

15. Verfahren nach Anspruch 13, das weiterhin die Inkubation des Zellengemisches mit einem zelltypspezifischen Bindemittel umfaßt, das vor der Zentrifugation an Trägerpartikel gebunden wurde, wobei die Partikel eine spezifische Dichte haben, die mindestens 0.001 g/ml größer als die spezifische Dichte des Zelltrennungsmediums ist.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei das zelltypspezifische Bindemittel nicht an den ausgewählten Zelltyp, der isoliert werden soll, bindet.

17. Verfahren nach Anspruch 13, zum Anreichern von CD34&spplus;-Zellen aus einem Zellengemisch, wobei das Zelltrennungsmedium eine Osmolalität von 280±10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte von 1.0605±0.0002 g/ml hat.

18. Verfahren nach Anspruch 13 zur Verwendung bei der Isolierung von kernhaltigen fötalen Zellen aus einem Zellengemisch, das auch mütterliche Blutzellen enthält, wobei das Zelltrennungsmedium eine Osmolität von 280±10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte von 1.0720±0.0002 g/ml hat.

19. Verfahren nach Anspruch 13 zur Verwendung in der Isolation von Brusttumorzellen aus einem Zellengemisch, wobei das Zelltrennungsmedium eine Osmolalität von 280±10 mOsm/kg H&sub2;O und eine spezifische Dichte ausgewählt aus dem Bereich 1.0490-1.0580 g/ml hat.

20. Verfahren zur Isolierung von CD34&spplus;-Zellen aus einem Zellengemisch, umfassend:

Überschichten des Zellengemisches auf einem Zelltrennungsmedium in einem Zentrifugenröhrchen, wobei das Zelltrennungsmedium eine spezifische Dichte von 1.0605±0.0005 g/ml und eine Osmolarität von 280±10 mOsm/kg H&sub2;O hat,

Zentrifugieren des Zentrifugenröhrchens bei einer Gravitationskraft, die ausreicht, um Zellen, die eine größere spezifische Dichte als die spezifische Dichte des Trennungsmediums haben, zu pelletieren, und

Sammeln der CD34&spplus;-Zellen aus dem oberen Teil des Röhrchens.

21. Verfahren zur Isolierung von kernhaltigen fötalen Zellen aus einem Zellengemisch, umfassend:

Überschichten des Zellengemisches auf einem Zelltrennungsmedium in einem Zentrifugenröhrchen, wobei das Zelltrennungsmedium eine spezifische Dichte von 1.0720 ± 0.0005 g/ml und eine Osmolarität von 280±10 mOsm/kg H&sub2;O hat,

Sammeln der fötalen Zellen aus dem oberen Teil des Röhrchens.

22. Verfahren zur Isolierung von Brusttumorzellen aus einem Zellengemisch, umfassend:

Überschichten des Zellengemisches auf einem Zelltrennungsmedium in einem Zentrifugenröhrchen, wobei das Zelltrennungsmedium eine spezifische Dichte von 1.0490 ± 1.0580 g/ml und eine Osmolarität von 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O hat,

Sammeln der Brusttumorzellen aus dem oberen Teil des Röhrchens.

23. Verfahren zur Isolierung von natürlichen Killerzellen aus einem Zellengemisch, umfassend:

Überschichten des Zellengemisches auf einem Zelltrennungsmedium in einem Zentrifugenröhrchen, wobei das Zelltrennungsmedium eine spezifische Dichte von 1.0605 ± 0.0005 g/ml und eine Osmolarität von 280 ± 10 mOsm/kg H&sub2;O hat,

Sammeln der natürlichen Killerzellen aus dem oberen Teil des Röhrchens.