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Die
vorliegende Erfindung betrifft eine flüssige Zusammensetzung zur intravenösen Verabreichung, die
eine wässrige
Lösung
von Immunglobulin aufweist. Bei dem Immunglobulin handelt es sich
im Allgemeinen um Immunglobulin G (IgG), das von menschlichem Blutplasma
abgeleitet ist.
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Immunglobulin
zur intravenösen
Infusion ist seit mehreren Jahren in Gebrauch gewesen. Das Produkt ist
als eine lyophilisierte trockene Formulierung oder in einigen Fällen als
eine intravenöse
injizierbare flüssige Formulierung
verfügbar.
Die trockene Formulierung, die als eine Ampulle angeboten wird,
die beispielsweise 5 g Immunglobulin enthält, muss zu einer injizierbaren
Lösung
vor Gebrauch wiederhergestellt werden, und es werden bei mehreren
klinischen Indikationen Dosismengen bis zu 1 g pro kg Körpergewicht
pro Tag empfohlen. Derartige große Dosismengen erfordern eine
Zahl von Ampullen, um zu einer injizierbaren Formulierung wiederhergestellt
zu werden, was unbequem und zeitaufwendig ist. Es gibt daher wesentliche
Vorteile bei der Bereitstellung einer gebrauchsfertigen injizierbaren
Formulierung. Von derartigen flüssigen
Formulierungen muss jedoch verlangt werden, dass sie bei langzeitiger
Aufbewahrung stabil sind.
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Konventionell
wurde IgG aus Blutplasma unter Anwendung von Prozessen der Ethanolfraktionierung isoliert.
Diese schließen
die ursprünglichen
Methoden von Cohn-Oncley ein, die hauptsächlich in den Vereinigten Staaten
noch immer in Gebrauch sind, sowie verschiedene andere etablierte
Modifikationen dieser Methode, die hauptsächlich in Europa zur Anwendung
gelangen (eine Übersicht über Prozesse
der Ethanolfraktionierung findet sich in "Ethanol Precipitation" von Kistler P. und
Friedli H. in "Methods
of Plasma Protein Fractionation",
J. M. Curling, Herausg., Academic Press, Inc., New York, 1980).
Ein Nachteil von Ethanol ist seine Fähigkeit zur Denaturierung von
Proteinen, der unter Anwendung niedriger Verarbeitungstemperaturen
ausgeglichen wird, womit diese Methoden im Allgemeinen als "kalte Ethanolfraktionierung" bezeichnet werden. Die
Prozesse der kalten Ethanolfraktionierung hängen insgesamt von der Einstellung
von 5 Variablen ab, d. h. Ethanolkonzentration, pH-Wert, Ionenstärke, Temperatur
und Proteinkonzentration, um die selektive Trennung der Proteine
zu unterschiedlichen Präzipitaten
zu erzielen, die üblicherweise
als die "Fraktionen" bekannt sind. Fraktion "II" ist das Haupt-Immunglobulin,
das ein Präzipitat
in der kalten Ethanolfraktionierung von Human-Blutplasma trägt.
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Seit
einiger Zeit sind Präparate
für die
intramuskuläre
Verabreichung von Immunglobulin aus Fraktion II formuliert worden.
Bei der intravenösen
Infusion dieser Präparate
hat sich jedoch gezeigt, dass sie schwere beeinträchtigende
Reaktionen hervorrufen, die bei den Empfängern einer Anaphylaxie ähneln (d.
h. cardiovaskulärer
Kollaps und Bronchospasmus) (siehe "Immunoglobulins: Characteristics and
Uses of intravenous preparations",
Alving B. M. und Finlayson J. S., Herausg., US Dept. of Health and
Human Sciences Publication Nr. (FDA)-80-9005, 1979). Diese schwerwiegenden
beeinträchtigenden
Reaktionen sind dafür
bekannt, dass sie hauptsächlich
durch das Vorhandensein von Aggregaten von IgG-Molekülen und
die Kontamination von Fraktion II mir Spurenmengen von vasoaktivem
Blutplasmaenzymen hervorgerufen werden, wie beispielsweise Präkallikreinaktivator
(PKA) und Kallikrein. Aggregiertes Immunglobulin kann die Komplementgruppe
von Blutplasma-Proteinen binden und aktivieren (sogenannte "antikomplementäre Aktivität"), wobei die Aktivierung des
Komplementsystems zu der Erzeugung der Komplementpeptide C5a und
C3a führt,
bei denen es sich um Anaphylatoxine handelt. Es ist außerdem bekannt,
dass die Verabreichung von PKA und Kallikrein in physiologisch signifikanten
Mengen schwere Hypertonie und cardiovaskulären Kollaps hervorrufen kann.
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Bei
der Herstellung einer Zubereitung von Immunglobulin für die intravenöse Infusion
müssen
daher die vorgenannten Punkte beachtet werden. Es sind eine Reihe
von Vorgehensweisen ausprobiert worden, um dieses Problem zu lösen. Diese
schließen
die Veränderung
der Verarbeitung von Fraktion II ein, um eine Aggregatbildung zu
verhindern; ferner die Reinigung des Immunglobulins von Fraktion
II, um so Aggregate und andere kontaminierende Plasmaproteine zu
entfernen, sowie die Behandlung von Immunglobulin aus Fraktion II
mit sehr geringen Mengen eines proteolytischen Enzyms, wie beispielsweise
Pepsin, um etwaige Aggregate und restliches PKA und Kallikrein aufzuspalten.
(Eine Übersicht über die
Herstellung von Immunglobulin zur intravenösen Infusion findet sich in "Methods for the Production
of IVIG Preparations and Analysis of IVIG Preparations Available", von Lundblad J.
L. und Schroeder D. D. in Clinical Applications of Intravenous Immunoglobulin
Therapy, P. L. Yap, Herausg., Churchill Livingstone Inc., New York,
1992). Die Verwendung von Pepsin auf diesem Weg hat gezeigt, dass
sie bei einem verhältnismäßig niedrigen
pH-Wert von beispielsweise 4,0 optimal ist. Darüber hinaus gilt auf dem Gebiet
als durchaus selbstverständlich,
dass eine solche Behandlung bei niedrigem pH-Wert eine wirksame
Maßnahme
zur Virusinaktivierung ist (siehe Reid, K. G. et al., Vox Sang., 55,
S. 75–80,
1988, "Potential
contribution of mild pepsin treatment at pH 4 to the viral safety
of human immunoglobulin products").
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Genaugenommen
müssen
Präparate
aus Humanimmunglobulin zur intravenösen Infusion bestimmten Standards
genügen,
wie sie beispielsweise von der „European Pharmacopoeia Commission" empfohlen werden,
die die Richtlinien unter anderem für die Molekulargrößenverteilung
vorgibt, die antikomplementäre Aktivität, PKA;
und das die Methode zur Herstellung einen Schritt oder mehrere Schritte
einschließt,
von denen sich gezeigt hat, dass sie bekannte Infektionsmittel inaktivieren
(siehe die „European
Pharmacopoeia",
3. Ausg., veröffentlicht
im Juni 1996, die die 2. Ausg. vom 1. Januar 1997 ersetzt, Monographienummer:
1997: 0918, "Human
Normal Immunoglobulin for Intravenous Administration").
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Die
Mehrzahl der Humanimmunglobulin-Produkte für die intravenöse Infusion,
die sich gegenwärtig auf
dem Markt befindet, befindet sich in Form von gefriergetrockneten
Präparaten
zur Gewährleistung
der Stabilität
bei Versand und Lagerung. Diese Präparate müssen vor Gebrauch auf die ursprüngliche
Konzentration wiederhergestellt werden, was unbequem und zeitaufwendig
sein kann, wie bereits beschrieben worden ist. Darüber hinaus
sind auch flüssige
Zusammensetzungen von Immunglobulin zur intravenösen Infusion verfügbar.
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Die
US-P-4499073 (Cutter Laboratories Inc.) beschreibt die Herstellung
einer intravenös
injizierbaren Lösung
von Humanimmunglobulin, die einen pH-Wert im Bereich von 3,5 bis
5,0 haben muss. Ferner wird verlangt, dass die Ionenstärke auf
niedrige Werte herabgesetzt wird und speziell unterhalb von 0,001.
Die Haltung des pH-Wertes innerhalb dieses Bereichs und das Aufrechterhalten
einer geringen Ionenstärke
sollen für
die Fähigkeit
zur Lagerung der flüssigen
Formulierung über
längere
Zeit entscheidend sein, während
gleichzeitig Kriterien befriedigt werden, wie beispielsweise Molekulargrößenverteilung
und antikomplementäre
Aktivität.
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Ein
anderer Vorschlag für
die Herstellung einer stabilen flüssigen Formulierung von Humanimmunglobulin
findet sich in der Patentschrift WO 95/22990 (The Green Cross Corporation),
worin ein pH-Wert im Bereich von 5,5 in Verbindung mit einer geringen
elektrischen Leitfähigkeit
von weniger als 1 (1/mΩ)
verlangt wird.
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Die
in der US-P-4499073 ausgeführten
Vorschläge
beziehen sich auf die Behandlung von Fraktion II oder Fraktion III
als Filtrat (Überstand
III), die nach den ursprünglich
von E. J. Cohn et al. (J. Am. Chem. Soc. 68: 459–475, 1946) und L. J. Oncley
et al. (J. Am. Chem. Soc. 71: 541–550, 1949) beschriebenen Methoden hergestellt
werden. Allerdings scheinen diese Bedingungen nicht für die Herstellung
einer stabilen IgG-Lösung geeignet
zu sein, die von anderen Reaktionsschemen der kalten Ethanolfraktionierung
abgeleitet sind. Die pH-Bedingungen und die geringe Ionenstärke, die
in dieser Fundstelle vorgegeben sind, führen nicht zur Erzeugung eines
stabilen Produktes bei Anwendung auf Immunglobulin, das nach dem
Reaktionsschema der kalten Ethanolfraktionierung von den Anmeldern
der vorliegenden Erfindung hergestellt wird. Da verschiedene modifizierte
Methoden der kalten Ethanolfraktionierung weit verbreitete Anwendung
finden und speziell in Europa, besteht ein Bedarf nach einer stabilen
IgG-Lösung,
die von anderen Ausgangsmaterialien abgeleitet ist als solchen,
wie sie in bekannten Ausführungen
als geeignet gelehrt werden.
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Es
ist jetzt überraschenderweise
entdeckt worden, dass stabile, intravenös injizierbare Immunglobulin-Lösungen erhalten
werden können,
indem ganz andere pH-Wert-Bedingungen und Ionenstärken zum
Einsatz gelangen, als sie in bekannten Ausführungen gelehrt werden, und
zwar unter zusätzlicher
Einbeziehung einer Behandlung des Immunglobulinpräparats mit
einem Enzym, wie beispielsweise Pepsin.
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Die
vorliegende Erfindung gewährt
somit eine flüssige
Zusammensetzung für
die intravenöse
Verabreichung, die eine Lösung
eines Immunglobulins in einem pharmazeutisch zulässigen wässrigen Träger aufweist, wobei der pH-Wert
der Lösung
im Bereich von 5,0 bis 5,8 und die Ionenstärke im Bereich von 0,02 bis 0,25
liegen und das Immunglobulin einer Behandlung mit Pepsin unterzogen
wurde.
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Die
Ionenstärke
kann im Bereich von 0,04 bis 0,25 liegen. Die Ionenstärke (I)
ist als die halbe Summe des Produktes der Ionenkonzentration (C)
in einer Lösung
und des Quadrates seiner Wertigkeit (Z) definiert, d. h. I = ½ΣC·Z2. Beispielsweise würde die Ionenstärke von
60 mM NaCl wie folgt berechnet werden: ½[0,06 × 12]
+ (0,06 × 12)] = 0,06.
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Lösungen von
Immunglobulin, die gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt und gemessen wurden, haben Leitfähigkeitswerte
von näherungsweise
4/mmho bis über
20/mmho.
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Der
wässrige
Träger
muss "pharmazeutisch
zulässig" insofern sein, dass
er mit anderen Inhaltsstoffen der Zusammensetzung kompatibel und
für den
Patienten nicht schädlich
ist.
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Die
flüssige
Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung hat den Vorteil, dass
sie nicht gefriergetrocknet ist. Damit muss die flüssige Zusammensetzung
vor Gebrauch nicht auf die ursprüngliche
Konzentration wiederhergestellt werden. Eine chemische Modifikation
des Immunglobulins ist weder erforderlich noch ist eine umfangreiche
zusätzliche
Reinigung der Fraktion II notwendig.
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Es
hat sich als vorteilhaft erwiesen, dass die Formulierung der flüssigen Zusammensetzung
nach der vorliegenden Erfindung eine Zusammensetzung ergibt, die
bei der Aufbewahrung stabil ist. Unter "stabil bei der Aufbewahrung" soll verstanden
werden, dass das Immunglobulin im Wesentlichen weder aggregiert
noch zerfällt
und akzeptable Werte der antikomplementären Aktivität, PKA-Aktivität und Kallikrein-Aktivität während der
Aufbewahrung über
eine längere
Zeitdauer bei einer Temperatur im Bereich von 4° bis 25°C bewahrt.
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Als
eine "längere Zeitdauer" werden 12 Wochen
verstanden, vorzugsweise 26 Wochen und am meisten bevorzugt 52 Wochen
bei 25°C;
sowie 6 Monate und bevorzugt 12 Monate und am meisten bevorzugt
24 Monate bei 4°C.
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Dass
die Zusammensetzung im Wesentlichen nicht aggregiert soll bedeuten,
dass es eine Zunahme von nicht mehr als 2,5% bis 3% des Immunglobulingehaltes
des Präparates
gibt, das eine Molekulargröße hat, die
größer ist
als die in dem Präparat
vorliegenden IgG-Dimere. Dass die Zusammensetzung im Wesentlichen nicht
zerfällt,
soll bedeuten, dass nicht mehr als 5% bis 7% des Präparats eine
Molekulargröße haben,
die kleiner ist als die in dem Präparat vorliegenden IgG-Monomere.
Der Umfang des Abbaus der Zusammensetzung wird darüber hinaus
als akzeptabel angesehen, wenn mehr als 50% der anfänglichen
Antikörperfunktion
erhalten geblieben sind (z. B. Anti-Rötelnvirus-Aktivität). Ein
akzeptables Maß der
antikomplementären
Aktivität
ist ein solches, wo der Verbrauch an Komplement nicht größer ist
als 50% (1 CH50 pro Milligramm Immunglobulin: die
Definition siehe das hierin beigefügte Protokoll B). Akzeptable
Werte von PKA und Kallikrein sind nicht größer als 35 IU pro ml und weniger
als 0,05 IU pro ml in einer Lösung,
die 30 g/l Immunglobulin enthält.
Tests auf die Molekulargrößenverteilung,
auf die antikomplementäre
Aktivität,
die PKA/Kallikrein-Aktivität
und die Anti-Röteln-Aktivität sind in
den nachfolgenden Protokollen A bis D beschrieben.
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Eine
flüssige
Zusammensetzung, die die Stabilitätsmerkmale zeigt, wie sie vorstehend
beschrieben wurden, würde
das Potential besitzen, bestimmte Standards (wie sie beispielsweise
bereits in der „European Pharmacopoeia" angegeben sind)
für Formulierungen
von Immunglobulin einzuhalten, die für intravenöse Infusion geeignet sind.
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Nach
den vorstehend ausgeführten
Anforderungen im Zusammenhang mit zulässigen Werten der Aggregation,
der antikomplementären
Aktivität,
des PKA/Kallikrein-Gehaltes und der Antikörperfunktion liegt der pH-Wert
der flüssigen
Zusammensetzung vorzugsweise im Bereich von pH 5,25 bis 5,75 und
die Ionenstärke im
Bereich von 0,04 bis 0,18 und mehr bevorzugt 0,03 bis 0,18.
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Es
ist jetzt festgestellt worden, dass eine Pepsinbehandlung zusammen
mit einer Formulierung der Zusammensetzung, wie sie hierin festgelegt
wurde, jegliche Anforderungen an den Einsatz einer weiteren Reinigung
oder Modifikation des Materials der Fraktion II überflüssig macht. Die flüssige Formulierung
kann restliches Pepsin enthalten, dieses lässt sich jedoch nach Erfordernis
entfernen.
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Darüber hinaus
ist eine Behandlung mit Pepsin bei niedrigem pH-Wert, z. B. pH 4,
als ein Schritt zur Virusdesaktivierung besonders wirksam.
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Das
Immunglobulin der Zusammensetzung ist vorzugsweise IgG, das restliche
Mengen anderer Immunglobuline enthalten kann, z. B. IgA und/oder
IgM bis zu einer Menge von 5 Gew.-% des Gesamtgehalts des Immunglobulins.
Allerdings können
Zusammensetzungen, die für
eine vorgegebene spezielle Anwendung geeignet sind, nach Erfordernis
IgA und/oder IgM aufweisen.
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Das
Immunglobulin der flüssigen
Zusammensetzung kann auf dem Wege jeder beliebigen geeigneten Methode
erhalten werden. Beispielsweise kann das Immunglobulin nach dem
vorstehend erwähnten
Prozess der kalten Ethanolfraktionierung von Cohn-Oncley hergestellt
werden oder nach einer modifizierten Methode der kalten Ethanolfraktionierung,
wie sie beispielsweise in 1 beschrieben
wird. Das Immunglobulin kann als ein Präzipitat der Fraktion II oder
als ein Überstand
(beispielsweise Überstand
III oder I und III) aus dem Fraktionierungsprozess erhalten werden.
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Das
Präzipitat
der Fraktion II kann gefroren werden und vor der erneuten Auflösung, Behandlung
mit Pepsin und Zubereitung zu einer flüssigen Zusammensetzung aufbewahrt
werden, die für
die intravenöse
Verabreichung geeignet ist. Die Ethanolverunreinigung in der erneut
aufgelösten
Fraktion II (oder Überstand
I und III) kann beispielsweise durch Diafiltration einer Lösung davon
gegen einen geeigneten Puffer bei einem niedrigen pH-Wert entfernt
werden. Ein geeigneter Puffer enthält beispielsweise 0,45% NaCl,
1% Sucrose und 200 bis 400 ml 1 M HCl/kg Protein. Alternativ kann
die Ethanolverunreinigung beispielsweise durch Gefriertrocknen entfernt
werden, wobei die getrockneten Feststoffe erneut aufgelöst und auf
einen niedrigen pH-Wert unter Verwendung eines geeigneten Titriermittels
eingestellt werden, wie beispielsweise Chlorwasserstoffsäure. Verallgemeinert
lässt sich
sagen, dass der pH-Wert der Immunglobulin-Lösung, aus der die Ethanolverunreinigung
entfernt worden ist, im Bereich von 3,9 bis 4,5 und bevorzugt 3,9
bis 4,1 liegt und die Restverunreinigung von Ethanol kleiner ist
als 10 mg/g Protein.
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Die
Immunglobulin aufweisende Lösung
kann sodann eingeengt werden (z. B. durch Ultrafiltration) bis 8%
bis 12% Gewicht/Gewicht Gesamtprotein und ein geeignetes Stabilisiermittel,
wie beispielsweise Kohlenhydrat (z. B. Glucose, Maltose oder Sucrose)
bei einer Konzentration zwischen einem Teil Stabilisiermittel pro ein
Teil Protein (Gewicht/Gewicht) bis 2 Teilen Stabilisiermittel pro
ein Teil Protein (Gewicht/Gewicht) zugesetzt werden. Beispiel: 1
: 1 (Gewicht/Gewicht) Glucose zu Protein, 1,5 : 1 oder 2 : 1 Maltose
zu Protein und 1,5 : 1 oder 2 : 1 Sucrose zu Protein. Andere Stabilisiermittel,
wie beispielsweise Aminosäuren
(z. B. Glycin) können in
dieser Stufe ebenfalls bei einer Konzentration bis zu 100 mg/g Protein
zugesetzt werden.
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Anschließend wird
eine Inkubation mit einer geringen Menge von Pepsin ausgeführt, um
die Bildung von Aggregaten von Immunglobulin-Monomer zu verringern,
die antikomplementäre
Aktivität
zu verringern und die Werte der PKA- und Kallikrein-Aktivität herabzusetzen.
Bevorzugt wird Pepsin im Bereich von 10 bis 150 μg/g Gesamtprotein und mehr bevorzugt
im Bereich von 25 bis 100 μg/g
Gesamtprotein zugesetzt. Die Immunglobulin-Lösung wird sodann bei einer
geeigneten Temperatur im Bereich von 20° bis 37°C und bevorzugt 35°C und für eine geeignete
Zeitdauer im Bereich von 1 Stunde bis 72 Stunden und bevorzugt 20
bis 24 Stunden inkubiert.
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Nach
der Inkubation wird der pH-Wert der Immunglobulin-Lösung zwischen
pH 5,0 und 5,8 unter Verwendung eines geeigneten Titriermittels
eingestellt, wie beispielsweise Natriumhydroxid. Bevorzugt wird
der pH-Wert zwischen pH 5,25 und 5,75 eingestellt. Die Proteinkonzentration
der Lösung
kann sodann auf 2 bis 10% (Gewicht/Gewicht) und bevorzugt auf 4
bis 6% (Gewicht/Gewicht) durch Verdünnung unter Verwendung einer
Salzlösung
einer geeigneten Konzentration eingestellt werden, um so die Ionenstärke der
Lösung
auf einen Wert zwischen 0,02 und 0,25 zu bringen. Bevorzugt wird
die Ionenstärke
zwischen 0,03 und 0,18 eingestellt. Sofern andere Stabilisiermittel,
wie beispielsweise Aminosäuren
(z. B. Glycin) der Zusammensetzung zuvor (siehe vorstehend) nicht
zugesetzt worden sind, können
sie in die Formulierung in dieser Stufe bei einer Konzentration
bis zu 100 mg/g Protein einbezogen werden.
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Die
fertig angesetzte Immunglobulin-Lösung wird sodann filtriert,
um etwaige potentielle bakterielle Kontamination zu entfernen, und
wird aseptisch in pharmazeutisch zulässige Behälter dispensiert.
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Es
wird daher eine flüssige
Zusammensetzung für
die intravenöse
Verabreichung bereitgestellt, die bei Lagerung stabil ist und eine
Lösung
in einem pharmazeutisch zulässigen
wässrigen
Träger
eines Immunglobulins aufweist, das aus der kalten Ethanolfraktionierung
von Plasma hergestellt wird, wobei das Immunglobulin in dem endgültigen Behälter keiner
Gefriertrocknung unterzogen werden muss.
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Unter
Bezugnahme auf die folgenden Beispiele werden Ausführungsformen
der vorliegenden Erfindung eingehender anhand von Beispielen beschrieben:
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BEISPIELE
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BEISPIEL 1: PROZEDUR ZUR
ERLANGUNG VON IMMUNGLOBULIN ALS AUSGANGSMATERIAL
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Immunglobulin
(Fraktion II) wird üblicherweise
hergestellt aus Human-Blutplasma durch kalte Ethanolfraktionierung.
Ein Beispiel für
eine Vorgehensweise beim Herstellen der Fraktion II ist in 1 ausgeführt. In 1 wird die Fraktion II unter Anwendung
einer Modifikation der Methode von Vogelaar et al. (Vox Sang. 27:
193–206,
1974) aus einem vereinten Präzipitat
von Fraktion I, II und III isoliert, das unter Anwendung der Ausfällungsbedingungen
für Fraktion
II und III von Hink et al. isoliert wurde (Vox Sang, 2: 174–186, 1957).
Die Methode des Herstellens eines vereinten Präzipitats von Fraktion I, II
und III ist außerdem
von Kistler und Nitschmann (Vox Sang, 7: 414–424, 1962) beschrieben worden.
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BEISPIEL 2: HERSTELLUNG
EINER FLÜSSIGEN
IMMUNGLOBULIN-ZUSAMMENSETZUNG ZUR INTRAVENÖSEN INFUSION
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Immunglobulin
(Fraktion II), das wie vorstehend oder nach einer beliebigen anderen
geeigneten Methode hergestellt wurde, wird in sterilem destilliertem
Wasser (3,5 l/kg Paste) bei 4°C
aufgelöst.
Die resultierende Lösung
wird sodann durch Filtration (Filter mit einer Porenweite von 0,45 μm) vor der
Ethanolentfernung (bis Ethanol < 10
mg/g) geklärt
und eine pH-Wert-Einstellung (pH bis 4,0 ± 0,1) durch Diafiltration
gegen mindestens 4 Volumina 0,45% NaCl, 1% Sucrose und 310 bis 320
ml 1 M HCl/kg Protein vorgenommen. Die Lösung wird abschließend bis
auf zwischen 8 und 12% Gesamtprotein mit Hilfe der Ultrafiltration
eingeengt.
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Die
Proteinlösung
wird sodann mit einem Stabilisiermittel (Sucrose zu 2 Teilen pro
1 Teil Protein Gewicht/Gewicht) und einer geringen Menge zugesetztem
Pepsin (0,025 bis 0,1 mg Pepsin/g Protein) angesetzt. Die Pepsin
enthaltende Lösung
wird filtriert (Filter mit einer Porenweite von 0,45 μm) und für 21 Stunden
bei 35°C
inkubiert.
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Nach
der Inkubation wird der pH-Wert der Lösung auf zwischen pH 5,0 und
5,8 unter Verwendung von 0,25 M NaOH eingestellt. Die Proteinkonzentration
der Lösung
wird zwischen 4 und 6% eingestellt und die NaCl-Konzentration auf
60 mM. Die fertig zubereitete flüssige
Immunglobulin-Zusammensetzung
wird steril filtriert und aseptisch in geeignete Behälter dispensiert.
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BEISPIEL 3: HERSTELLUNG
EINER FLÜSSIGEN
IMMUNGLOBULIN-ZUSAMMENSETZUNG ZUR INTRAVENÖSEN INFUSION, ANGESETZT MIT
EINER AMINOSÄURE
(GLYCIN) ALS EIN ZUSÄTZLICHES
STABILISIERMITTEL
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Es
wurde ein Immunglobulin-Zusammensetzung, die zur intravenösen Verabreichung
geeignet ist, wie in Beispiel 2 mit einem Gehalt von Glycin mit
50 mg/g als ein Stabilisiermittel zusätzlich zu der Formulierung der
Lösung
mit Sucrose vor der Pepsinbehandlung und Inkubation hergestellt.
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BEISPIEL 4: STABILITÄT VON FLÜSSIGEN IMMUNGLOBULIN-ZUSAMMENSETZUNG
ZUR INTRAVENÖSEN
INFUSION
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Es
wurden eine Reihe von Chargen von flüssigem Immunglobulin verschiedener
Zusammensetzungen (einschließend
solche, wie sie in den Beispielen 2 und 3 beschrieben wurden) hergestellt
und mit unterschiedlichen pH-Werten angesetzt. Diese Zusammensetzungen
wurden auf ihre Stabilität
nach einer Lagerung bei unterschiedlichen Temperaturen unter variierender
Zeitdauer getestet. Die Tests wurden nach den Testprotokollen A
bis D ausgeführt,
die nachfolgend beschrieben sind.
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Die
Kriterien für
die Stabilität
sind wie folgt festgelegt:
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AGGREGATION
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Es
gibt eine Zunahme von nicht mehr als 2,5% des Immunglobulingehalts
des Präparats,
das eine Molekulargröße hat,
die größer ist
als die in dem Präparat
vorliegenden IgG-Dimere.
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ZERFALL
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Es
liegen nicht mehr als 5% des Proteingehalts des Präparats vor,
die eine Molekulargröße kleiner
als die in dem Präparat
vorliegenden IgG-Monomere haben.
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ANTIKÜRPER-FUNKTION
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Es
bleiben nicht mehr als 50% Antikörper-Aktivität (z. B.
Anti-Röteln-Virus)
im Vergleich zu dem anfänglichen
Wert zum Zeitpunkt der Herstellung der Zusammensetzung zurück.
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ANTIKOMPLEMENTÄRE AKTIVITÄT
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Der
Verbrauch von Komplement ist nicht größer als 50% (1 CH50 pro
mg Immunglobulin: die Definition siehe das beigefügte Protokoll
B).
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PKA-AKTIVITÄT
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In
einer Lösung
von 30 g/l Immunglobulin gibt es eine PKA-Aktivität von nicht
mehr als 35 IU/ml.
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KALLIKREIN-AKTIVITÄT
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In
einer Lösung
von 30 g/l gibt es eine Kallikrein-Aktivität von nicht mehr als 0,05 IU/ml.
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Die
Ergebnisse für
diese Versuchsreihen sind in den Tabellen 1 bis 8 dargestellt. Die
Ergebnisse sind als die Zahl der Chargen gegeben, die bei den angegebenen
Kriterien und der gezeigten Zeitdauer und Temperatur stabil waren.
Die Zahl der Chargen die auf die angegebenen Kriterien zu der gezeigten
Zeit und Temperatur getestet wurde, ist in Klammern angegeben. Beispielsweise
bedeutet ein Eintrag von "1(4)" gegen eine Zerfalls/Antikörerfunktion
für 4 Wochen
bei 37°C,
dass 1 Charge von 4 getesteten nach einer Aufbewahrung für 4 Wochen
bei 37°C
den vorstehend beschriebenen Stabilitätskriterien sowohl hinsichtlich
des Zerfalls als auch der Antikörperfunktion
genügt
hat.
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Auch
in den Tabellen 1 bis 8 beziehen sich die in den schattiert dargestellten
Spalten auf Daten, die flüssige
Zusammensetzungen betreffen, die gemäß der vorliegenden Erfindung
hergestellt wurden, nämlich Zusammensetzungen
mit einem pH 5,0 bis 5,8, einer Ionenstärke von 0,02 bis 0,25 und die
einer Pepsinbehandlung unterzogen wurden. Die Daten, die sich auf
Immunglobulin-Zusammensetzungen beziehen, die nicht nach der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurden und die als Beispiel gezeigt werden,
befinden sich in den Spalten, die nicht schattiert sind.
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Die
Schlussfolgerungen aus den Ergebnissen sind Folgende:
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VERSUCH I (TABELLE 1)
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5% GEWICHT/VOLUMEN IMMUNGLOBULIN
(BEHANDELT MIT PEPSIN BEI 0,1 mg/g); 10% SUCROSE; 60 mM NaCl; pH
4,05 BIS 6,02
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Wenn
ein Produkt nach der vorliegenden Erfindung bei einem pH-Wert von
5,25 bis 5,5 in flüssiger Form
angesetzt wird, ist das Produkt für mehr als 26 Wochen bei 4°C stabil
und besteht die experimentellen beschleunigten Stabilitätstests
bei 25° und
37°C.
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VERSUCH II (TABELLE 2)
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5% GEWICHT/VOLUMEN IMMUNGLOBULIN
(DAS NICHT MIT PEPSIN BEHANDELT WORDEN IST); 10% GEWICHT/VOLUMEN
SUCROSE; 60 mM NaCl; pH 4,25 BIS 5,25
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Bei
Abwesenheit von Pepsin bildet eine flüssige Formulierung mit einem
pH-Wert von 5,25 oder weniger bei Aufbewahrung bei erhöhten Temperaturen
Aggregate. Darüber
hinaus ist aus früheren
Arbeiten bekannt und wurde bei der pH 5,25-Formulierung in diesem
Versuch bestätigt,
dass Pepsin zur Verringerung von PKA und Kallikrein notwendig ist.
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VERSUCH III (TABELLE 3)
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5% GEWICHT/VOLUMEN IMMUNGLOBULIN
(DAS NICHT MIT PEPSIN BEHANDELT WORDEN IST); 10% GEWICHT/VOLUMEN
SUCROSE; 3 BIS 9 mM NaCl; pH 4,50 BIS 5,0
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Wenn
Immunglobulin-Zusammensetzungen bei niedrigem pH-Wert und geringer
Ionenstärke
ohne Pepsin angesetzt wurden, hatte das Produkt hohe Werte für PKA und
Kallikrein, die bei Aufbewahrung bei 25°C und 4°C nicht verringert wurden. Die
Zusammensetzungen bildeten bei Aufbewahrung bei 37°C Aggregate.
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Diese
Formulierungsbedingungen sind unter denen, wie sie im US-P-4 499
073 (Cutter Laboratories Inc.) beschrieben wurden, für die Fähigkeit
zur Aufbewahrung einer flüssigen
Formulierung über
längere
Zeitdauer entscheidend. Die Ergebnisse dieses Versuches demonstrieren,
dass die in der US-P-4
499 073 festgelegten Bedingungen nicht zu der Erzeugung eines stabilen
Produktes führen,
wenn sie auf Immunglobulin angewendet werden, das nach dem Reaktionsschema
der kalten Ethanolfraktionierung hergestellt wird, wie dieses von
den Anmeldern der vorliegenden Erfindung angewendet wurde.
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VERSUCH IV (TABELLE 4)
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5% GEWICHT/VOLUMEN IMMUNGLOBULIN
(BEHANDELT MIT PEPSIN BEI 0,1 mg/g); 10% GEWICHT/VOLUMEN SUCROSE;
4 BIS 9 mM NaCl; pH 4,4 BIS 5,2
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Wenn
Immunglobulin-Zusammensetzungen bei geringerer Ionenstärke angesetzt
wurden (in Gegenwart von Pepsin), neigte das Produkt zur Fragmentbildung
selbst bei 4°C.
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VERSUCH V (TABELLE 5)
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5% GEWICHT/VOLUMEN IMMUNGLOBULIN
(BEHANDELT MIT PEPSIN BEI 0,025 mg/g ODER 0,05 mg/g); 10% GEWICHT/VOLUMEN
SUCROSE; 60 mM NaCl; pH 5,25 BIS 5,75
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Wenn
die Pepsinkonzentration bis 0,025 mg/g Protein verringert wurde
zerfiel das Produkt nicht und die Werte für PKA und Kallikrein lagen
einwandfrei innerhalb der Grenzen. Alle Chargen zeigten außerdem keine
Aggregation bei Aufbewahrung bei erhöhten Temperaturen.
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VERSUCH VI (TABELLE 6)
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5% GEWICHT/VOLUMEN IMMUNGLOBULIN
(BEHANDELT MIT PEPSIN BEI 0,1 mg/g); 10% GEWICHT/VOLUMEN SUCROSE;
100 UND 180 mM NaCl; pH 4,05 BIS 5,5
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Wenn
die Ionenstärke
von Immunglobulin-Zusammensetzungen (die einer Behandlung mit Pepsin
bei 0,1 mg/g Protein unterzogen wurden) von etwa 60 mM auf 180 mM
NaCl erhöht
wurde, bildete das Produkt im Allgemeinen bei Aufbewahrung bei erhöhten Temperaturen
Aggregate.
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VERSUCH VII (TABELLE 7)
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5% GEWICHT/VOLUMEN IMMUNGLOBULIN
(BEHANDELT MIT PEPSIN BEI 0,025 BIS 0,1 mg/g); 10% GEWICHT/VOLUMEN
SUCROSE; 50 mg GLYCIN PRO g PROTEIN; 30 BIS 60 mM NaCl; pH 5,5
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Die
bevorzugte Zusammensetzung lässt
sich auch mit einer Aminosäure
(z. B. Glycin) als ein zusätzliches
Stabilisiermittel ansetzen.
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VERSUCH VIII (TABELLE
8)
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5% GEWICHT/VOLUMEN IMMUNGLOBULIN
(BEHANDELT MIT PEPSIN BEI 0,025 BIS 0,1 mg/g); 7,5 BIS 10% GEWICHT/VOLUMEN
MALTOSE; 50 mg GLYCIN PRO g PROTEIN; 60 mM NaCl; pH 5,5
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Die
bevorzugte Zusammensetzung kann auch mit Maltose als Stabilisiermittel
angesetzt werden; die bevorzugte Konzentration von Maltose beträgt 7,5 bis
10% Gewicht/Volumen.
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Wenn
ein Produkt nach der vorliegenden Erfindung bei einem pH-Wert im
Bereich von 5,0 bis 5,8, einer Ionenstärke von 0,02 bis 0,25 angesetzt
und einer Pepsinbehandlung unterworfen wird, so ist das Produkt in
Gegenwart entweder von Maltose oder Sucrose für mehr als 26 Wochen bei 4°C stabil
und besteht die experimentellen, beschleunigten Stabilitätstests
bei 25° und
37°C.
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Auf
der Grundlage der aus den verschiedenen getesteten Zusammensetzungen
erhaltenen Daten wurde eine Zusammensetzung, wie sie zuvor hierin
festgelegt wurde (d. h. angesetzt bei einem pH-Wert im Bereich von
5,0 bis 5,8, einer Ionenstärke
von 0,02 bis 0,25 und einer Pepsinbehandlung unterzogen) als stabil hinsichtlich
einer annehmbaren Aggregation, Zerfall, antikomplementären Aktivität, PKA-Gehalt
und Kallikreingehalt ermittelt.
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TESTPROTOKOLLE
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A. MOLEKULARGRÖSSENVERTEILUNG
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Die
Molekulargrößenverteilung
des Immunglobulinproduktes wurde durch Größenausschluss unter Anwendung
der Hochleistungsflüssigchromatographie
gemessen. Das Produkt wird auf einem Pye Unicam-Modularsytem unter Verwendung einer
TSK G3000 SW-XL-Gelfiltrationssäule
mit den Abmessungen 7,8 × 300
mm mit einer Führungssäule (7,8 × 40 mm)
analysiert, die aus dem gleichen Material zusammengesetzt war. Es
wurden Proben auf 5 bis 10 g/l in der mobilen Phase (0,2 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0) verdünnt und
durch eine 0,45 μm-Membran
vor dem Einspritzen von 20 μl
filtriert. Das Protein wurde bei 0,4 ml/min eluiert und durch UV-Absorption
bei 280 nm detektiert. Die erhaltenen Spuren wurden durch manuelle
Dreiecksberechnung nach den Kriterien analysiert, die in der „European
Pharmacopoeia" beschrieben
werden.
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Es
wurden Peakflächen,
die dem Aggregat entsprechen (Retentionszeit 15 bis 18 min), Dimer
(18,5 bis 19,5 min), Monomer (21,0 bis 22,0 min) und Fragmente (jegliches
Material, das nach dem Monomerpeak und vor der Salzfront eluierte)
identifiziert und prozentual zu der Gesamtelutionsfläche quantifiziert.
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B. ANTIKOMPLEMENTÄRE AKTIVITÄT
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Der
Wert der spontanen (Antigen-unabhängig)-Aktivierung von Komplement
durch Immunglobulinpräparate
wird mit Hilfe des Grades der Lysehemmung von sensibilisierten roten
Blutkörperchen
von Schafen durch eine konstante Menge von Komplement nach der Methode
von Frommhagen und Findenberg (J. Immunol. 89: 336–343, 1962)
gemessen.
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In
der Zusammenfassung wurde ein festgesetzte Menge von Meerschweinchen-Komplement
mit eine Reihe von Verdünnungen
der zu testenden Proben inkubiert. Nach einer Weile der Inkubation
(60 min bei 37°C)
wurde die durch die Testproben inaktivierte Komplementmenge ermittelt,
indem eine gleiche Menge von sensibilisierten Schaf-Erythrozyten
zu jedem Röhrchen
zugesetzt und der Hämolysegrad
gemessen wurde. Die Verdünnung
der Testprobe, in der 50% Hämolyse
auftrat, ist auch die Verdünnung,
die 50% des vorhandenen Komplementes verbraucht hat. Aus der Proteinkonzentration
dieser Probe kann die antikomplementäre Aktivität in mg Protein berechnet werden,
das zum Verbrauch von 1 CH50-Einheiten erforderlich
ist (für
50% Lyse von 108 roten Schaf-Blutkörperchen
erforderliches Komplement).
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C. PRÄ-KALLIKREIN-AKTIVATORAKTIVITÄT UND KALLIKREIN-AKTIVITÄT
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Die
Menge von PKA-Aktivität
in dem Immunglobulinprodukt wurde nach der Methode von Alving und Mitarbeitern
gemessen (J. Lab Clin Med. 96: 334–346, 1980).
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In
der Zusammenfassung wurde die Messung der PKA-Aktivität mit Hilfe
einer zweistufigen Prozedur ausgeführt, worin die erste Stufe
die Umwandlung von Prä-Kallikrein
in Kallikrein mit Hilfe des zu analysierenden Materials umfasste.
In der zweiten Stufe wurde das erzeugte Kallikrein anhand seiner
Hydrolyserate des synthetischen Substrats 52303 (Kabi Diagnostics,
Schweden) mit Hilfe eines Endpunkt-Inkubationsassays gemessen. Die PKA-Aktivität wurde
mit derjenigen des Präparats
UK-Referenz 1 verglichen (eine Plasma-Proteinfraktion, die 75 Internationale
Einheiten PKA enthält).
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Die
durch PKA in der Probe erzeugte Kallikrein-Aktivität wurde
gemessen, indem die Aktivität,
die in Abwesenheit von Prä-Kallikrein
ermittelt wurde, von der in seiner Gegenwart gemessenen subtrahiert
wurde. Die Kallikreinkonzentration wurde in Einheiten/ml aufgezeichnet,
worin eine Einheit diejenige Menge an Kallikrein ist, die 0,2 mM
S2302 mit einer Anfangsrate von 1 Mikromol/min bei pH 8,0 und 37°C hydrolysiert.
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In
der Praxis wurden 10 μl
Testlösung
mit 90 μl
Prä-Kallikrein-Reagens
(hergestellt nach der Methode von Lundblad (Develop. Biol. Stand.
44: 107–114,
1979) bei pH 8,0 und 37°C
für 60
min) inkubiert. Danach wurden 500 μl S2302 zugesetzt und die Inkubation
für weitere
10 min fortgesetzt, wonach die Reaktion durch Zusatz von 100 μl 10%ige
Essigsäure
angehalten wurde. Sämtliche
Proben, Standards und Kontrollen wurden zweifach assayiert, wobei
in jede Probe und Kontrolle eine Kallikrein-Blindprobe einbezogen wurde (anstelle von
Prä-Kallikrein-Reagens
Assay-Puffer zugesetzt). Sodann wurde das Absorptionsmaß jeder
Lösung
bei 405 nm abgelesen und aus den mittleren optischen Dichten der
Standards eine Standardkurve konstruiert. Das mittlere Absorptionsmaß der Blindproben
wurde von dem mittleren Absorptionsmaß der Testlösungen subtrahiert und die
PKA-Konzentrationen aus der Standardkurve berechnet.
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D. ANTIKÖRPERFUNKTION
(ANTI-RÖTELN-VIRUS-AKTIVITÄT)
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Anti-Röteln-Antikörper wurde
mit Hilfe einer Hämolyse
nach der Gel-Methode quantifiziert. Hierbei handelt es sich um einen
komplementvermittelten Assay, bei dem die funktionelle Integrität von Anti-Röteln-Antikörpern gemessen
wird, die vorhanden sind und die sowohl auf Eigenschaften des Antigenbindens
als auch auf antigenvermitteltes Komplementbinden des Immunglobulinpräparats beruht.
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In
der Zusammenfassung wurden rote Blutkörperchen sensibilisiert, indem
ihre Oberflächen
mit Röteln-Antigen
beschichtet wurden und diese anschließend in Agarose suspendiert
und zu Platten ausgegossen wurden. Sobald sich die Mischung verfestigte,
wurden Mulden ausgeschnitten und mit den zu testenden Proben und
Standards gefüllt.
Während
der Inkubation über
Nacht bei 4°C
diffundierten die Proben in die Agarose ein und etwaiger vorhandener
spezifischer Antikörper
komplexierte mit dem Antigen auf den Oberflächen der roten Blutkörperchen.
Das Gel wurde sodann mit Meerschweinchen-Komplement übergossen
und bei 37°C inkubiert.
Die Antigen-Antikörper-Komplexe
aktivieren das Komplement, was zu einer Lyse der roten Blutkörperchen
führt.
Dieses wird zu einer klaren kreisrunden Fläche manifestiert, die die Mulde
umgibt, wobei die Fläche
der Hämolysezone
proportional zu log10 der Antikörperkonzentration
ist. Es wurden Verdünnungen
der zu testenden Proben parallel mit Verdünnungen eines Standards assayiert
(zuvor geeicht gegen den Internationalen WHO-Standard) und aus einer
graphischen Darstellung der Flächen
der Diffusionszone der Standards im Vergleich zur Antikörperkonzentration
die Anit-Röteln-Antikörperkonzentrationen
der im Test befindlichen Proben berechnet.
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