DE69424545T2

DE69424545T2 - Verfahren zur herstellung von immunoglobulin g konzentrat

Info

Publication number: DE69424545T2
Application number: DE69424545T
Authority: DE
Inventors: Patrick Bonneel; Miryana Burnouf; Thierry Burnouf; Dominique Dernis
Original assignee: AETSRN
Current assignee: LFB SA
Priority date: 1993-06-14
Filing date: 1994-06-13
Publication date: 2001-01-18
Anticipated expiration: 2014-06-14
Also published as: HU9503557D0; ES2148332T3; BR9406814A; FR2706466A1; EP0703922B1; CA2165203A1; HU218463B; ATE193020T1; EP0703922A1; DK0703922T3; CA2165203C; PT703922E; GR3034177T3; CZ287186B6; FR2706466B1; JPH09500369A; AU7002394A; CZ328795A3; JP4218980B2; DE69424545D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Konzentrat von Immunglobulinen G zur therapeutischen Verwendung und das Verfahren zum Herstellen dieses Konzentrats.
Es werden bereits seit langem verschiedene Zubereitungen von polyvalenten Immunglobulinen verwendet. Im Allgemeinen werden sie ausgehend von einem "Pool" von Seren von 2000 bis 5000 Spendern hergestellt, was das Vorhandensein von allen Antikörpern gewährleistet, die normalerweise in der Gesamtheit der Population einer ausgewählten Gegend vorhanden sind.
Diese Zubereitungen von Immunglobulinen werden nach der mehr oder weniger abgewandelten klassischen Methode von Cohn hergestellt, d. h. durch Fällung mit Ethanol. Dieses Verfahren weist einen erheblichen Nachteil auf, der auf die Behandlung mit Ethanol zurückzuführen ist, welches eine gewisse Denaturierung der Proteine und die Bildung von Aggregaten von Immunglobulinpolymeren hervorruft. Diese ergeben ein therapeutisches Risiko, indem sie die Aktivierung des Komplement-Systems und anaphylaktische Reaktionen hervorrufen. Diese Zubereitungen können folglich nicht in intravenösen Injektionen, sondern nur in intramuskulären Injektionen verwendet werden, was die injizierbare Dosis und die Wirksamkeit beschränkt.
Es werden bereits verschiedene Behandlungen angewandt, um dieses Problem zu umgehen: die Spaltung der Immunglobuline durch Pepsin oder durch Plasmin, eine Behandlung mit β-Propiolacton oder mit Reduktionsmitteln und Alkylierungsmitteln, oder bei pH 4, oder mit PEG, um die Aggregate zu fällen.
Die Anmelderin hat es vorgezogen, diese enzymatischen oder chemischen Behandlungen zu vermeiden, und hat den Schritt der Fällung mit Ethanol weggelassen. Sie hat auf diese Weise ein Verfahren zustandegebracht, welches eine Abfolge von chromatographischen Trennungen umfasst und keine Fällung umfasst.
Die Herstellung von Konzentraten von Immunglobulinen durch Chromatographie ist bereits von Friesen et al. erprobt worden (Friesen - Joint IABS/CSL Symp. on Standardization in Blood Fractionation - Australia 1986 - Develop. biol. Standard. 67, 1987, 3-13; Immunoglobulins - Pub. Central Lab. Netherlands Red Cross 1988 - Ed. Krynen, Strengers, Van Aken), welche eine oder zwei Anionenaustauscher-Chromatographien verwenden:
- eine einzige Chromatographie an DEAE-Sephadex gestattet die Herstellung von spezifischen γ-Globulinen ausgehend von hyperimmunen Sera, sie ist aber nur auf kleine Volumina anwendbar.
- eine Chromatographie an DEAE-Sepharose gefolgt von einer Chromatographie an DEAE-Sephadex gestattet größere Volumina herzustellen und ist auf die Herstellung von polyvalenten Immunglobulinen anwendbar, aber das Verfahren hat sich im großtechnischen Maßstab nicht als rentabel erwiesen.
Ein Verfahren zur Reinigung von IgG durch Chromatographie ist in EP-0 268 973 beschrieben, ausgehend von einer Plasmafraktion, die vorzugsweise durch Fällung mit Ethanol vorgereinigt wurde (mit Ausnahme eines der Beispiele).
Das Verfahren umfasst anschließend eine Diafiltration oder eine Molekularsieb- Chromatographie an einem (Sephadex-...)Gel, anschließend eine Anionenaustauscher- Chromatographie, anschließend eine Abtrennung oder Inaktivierung der Enzyme durch Afflnitäts-Chromatographie oder durch Zugabe von Antithrombin III. Das Verfahren umfasst anschließend eine Sterilisation mit β-Propiolacton oder mit UV-Licht.
Die Reinigung von immunglobuünen bringt spezielle Probleme mit sich, zusätzlich zu denjenigen, die bereits vorstehend erwähnt wurden, da ihre biologische Aktivität mit ihrer strukturellen Unversehrtheit verbunden ist, diese Aktivität lässt sich aber nicht einfach messen wie eine enzymatische Aktivität. So schwankt z. B. für einen spezifischen Antikörper bei einem gleichen durch ELISA bestimmten Antikörpergehalt die Fähigkeit zur Neutralisation der Infektiosität eines Virus stark von einem Konzentrat zum anderen in Abhängigkeit von dem Herstellungsverfahren.
Die Anmelderin hat sich daher bemüht, ein nicht denaturierendes Verfahren zur Reinigung von Immunglobulinen bereitzustellen, welches in großtechnischem Maßstab anwendbar ist (z. B. auf Serumchargen von mehr als 500 Liter) und welches darüber hinaus die Gewinnung von anderen Plasmaproteinen von therapeutischem Interesse gestattet.
Das Verfahren zum Herstellen eines Konzentrats von Immunglobulinen gemäß der vorliegenden Erfindung umfasst keine Fällung mit Ethanol und umfasst eine Abfolge von chromatographischen Schritten, in deren Verlauf die Immunglobuline stets in flüssiger Phase und bei einem pH zwischen 5, 5 und 7, 8 bleiben. Das Verfahren umfasst auch einen Virusinaktivierungsschritt, z. B. durch die Behandlung mit einem Lösungsmittel- Detergens.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird auf Gesamtplasma oder vorzugsweise auf den Überstand einer Tieftemperatur-Fällung angewandt.
Es lässt sich auf große Volumina eines "Pools" von Plasmen, die für die Herstellung von polyvalenten Immunglobulinen bestimmt sind, ebenso wie auf kleinere Volumina von hyperimmunen Plasmen, die zur Herstellung von spezifischen immunglobulinen bestimmt sind, anwenden.
Das Ausgangsplasma oder die Ausgangsplasmafraktion wird vorzugsweise einem Vorreinigungsschritt unterzogen, bevor das eigentliche Verfahren ausgeführt wird; diese erfolgt durch Filtration über eine Reihe von Filterpatronen mit einer Porosität von 0,5 bis 0,2 u, die aus Cellulose und aus Perliten, welche negative Ladungen tragen, und aus einer geringen Menge an positiv geladenem Harz bestehen (Filter Zeta plus®, die von Cuno - USA geliefert werden). Diese Filter gestatten dank ihrer negativen Ladung die Adsorption und folglich hier die Eliminierung des Faktors XI, welcher ohne diesen Vorreinigungsschritt zusammen mit den Immunglobulinen aufgereinigt wird, was eine Unverträglichkeit gegenüber dem Endprodukt und das Auftreten von niedrigem Blutdruck nach sich ziehen kann.
Das Verfahren umfasst gegebenenfalls einen oder mehrere Vorreinigungsschritte, welche das Entfernen von bestimmten Plasmaproteinen und somit die Verringerung der Größe der späteren Chromatographiesäulen gestatten, was besonders für die großen Volumina von Vorteil ist. So kann die Proteinfraktion chargenweise in Gegenwart eines DEAE-Sephadex®-Anionenaustauschergels vorgereinigt werden, was die Retention und folglich Eliminierung des Faktors IX, des Faktors VII und von Protein C gestattet. Sie kann anschließend auf eine Säule von DEAE-Sepharose®-Anionenaustauschergel injiziert werden, was die Retention und Eliminierung von Albumin und von α-Antitrypsin gestattet. Letztere können gemäß bekannten Methoden desorbiert und konzentriert werden und dies mit einer besonders hohen Ausbeute aufgrund des Verfahrens, wie es für die vorliegende Erfindung beschrieben ist.
Die proteinhaltige Fraktion, welche das Filtrat der Säule bildet, kann gegebenenfalls einer Chromatographie an einer Heparin-Sepharose®-Säule unterzogen werden, bevor sie der folgenden Chromatographie unterzogen wird, um das Antithrombin III zu entfernen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst einen Entsalzungsschritt entweder durch Ultrafiltration oder durch Molekularsieb-Chromatographie, wobei das Filtrat der gegebenenfalls durchgeführten Vorreinigungsschritte auf eine Säule mit Gel aus vernetztem Dextran, z. B. Sephadex®-G25, das in einem 0,022M Tris-HOI-Puffer bei pH 7,8 äquilibriert ist, injiziert wird, und die Fraktion, welche die Plasmaproteine enthält, gewonnen wird.
Diese proteinhaltige Fraktion wird anschließend auf eine Chromatographiesäule injiziert, die aus einem Anionenaustauschergel, insbesondere einem Gel, das mit DEAE-Gruppen gepfropft ist, gebildet ist. Man erhält eine besonders hohe Ausbeute mit einem vemetzten Acrylamidgel wie DEAE-Trisacryl®-Plus LS (Sepracor-IBF, Ref 262080), das in einem 0,025M Tris-HOI-Puffer bei pH 7,8 äquilibriert ist. Diese Säule adsorbiert praktisch alle Plasmaproteine mit Ausnahme der Immunglobuline G. Letztere befinden sich in dem Filtrat und können auf ungefähr 50 g/l konzentriert werden.
Die konzentrierte Immunglobulinlösung wird anschließend einer Virusinaktivierungsbehandlung beispielsweise durch eine Behandlung in Gegenwart von Lösungsmittel- Detergens und vorzugsweise von 0,3% TnBP (Tri(n-butyl)phosphat) und 1% Tween®80 (Polyoxyethylensorbitan-monooleat) bei 25ºC unter leichtem Rühren während mindestens 6 Stunden unterzogen.
Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst anschließend eine Chromatographie an einem Kationenaustauschergel, insbesondere an einem Gel, das mit Carboxymethylgruppen (cm-Gruppen) gepfropft ist. Eine besonders hohe Ausbeute wird mit einem cm-Trisacryl® LS-Gel (Sepracor, Ref. 260280), das in 0,024M Natriumacetatpuffer bei pH 5,5 äquilibriert ist, erhalten. Die Eliminierung des Lösungsmittel-Detergens in dem Filtrat. Die Immunglobuline werden anschließend durch Erhöhen der Ionenstärke des Puffers auf 0,15-0,19 M NaCl desorbiert und eluiert.
Sie werden mit Saccharose bis 110 g/l versetzt, konditioniert und lyophilisiert. Die Analyse des Konzentrats von Immunglobulinen G, das durch das vorstehend beschriebene Verfahren erhalten wurde, bestätigt, dass es frei ist von Aggregaten von Immunglobulinen G, von Immunglobulinen A und dass es überraschenderweise auch von Immunglobulinen E frei ist oder davon nicht mehr als einen Anteil enthält, der weniger als 10% des im Plasma vorhandenen Anteils beträgt, was ihm einen zusätzlichen therapeutischen Vorteil verleiht.
Die vorliegende Erfindung betrifft folglich ein Konzentrat von Immunglobulin G, das aus Plasma stammt und frei ist von Aggregaten von Immunglobulinen G und von lmmunglobulinen E sowie von IgA.
Diese Eigenschaften machen es daher besonders geeignet für eine Injektion auf intravenösem Weg und es wird auf geeignete Weise im Hinblick auf diese Injektion formuliert.
Die folgenden Beispiele beschreiben Ausführungsformen des Verfahrens.

Beispiel 1

Das Ausgangsmaterial ist ein Pool von 500 Litern Plasma von gesunden Spendern, die zufällig aus einer normalen Population ausgewählt wurden.
Nach der Tieftemperatur-Fällung gemäß klassischen Methoden wird der Überstand gewonnen, um den verschiedenen Chromatographie-Schritten unterzogen zu werden.

1.A Entsalzungs-Chromatopraphie

Diese Chromatographie erfolgt an einer Säule GF 04-06 (Sepracor®) mit 65 Litern Sephadex®G25, die in einem 0,022M Tris-HCl-Puffer bei pH 7,8 äquilibriert ist, mit einem Durchfluss von 450 Liter/Stunde.
Das Filtrat wird durch Densitometrie untersucht und die Fraktion, welche die gesamten Proteine enthält, wird gewonnen.
Die Säule wird durch Spülen mit einer Lösung von 1 M NaCl regeneriert.

1.B Chromatopraphie an einem Anionenaustauscherpel

Diese Chromatographie erfolgt an Säulen GF 08015 mit 65 Litern DEAE-Trisacryl®, die in 0,025M Tris-HCl-Puffer bei pH 7, 8 äquilibriert sind, mit einem Durchfluss von 150 Liter/Stunde.
Unter diesen Anwendungsbedingungen sind die Immunglobuline G praktisch die einzigen Proteine, welche nicht an der Säule adsorbiert werden.
Das Filtrat wird durch Densitometrie untersucht und die proteinhaltige Fraktion wird gewonnen. Sie besteht folglich zu nahezu 100% aus Immunglobulinen G.
Das Albumin, welches an der Säule adsorbiert bleibt, wird durch Zugabe von 0,4M NaCl zu dem Puffer eluiert und wird gemäß klassischen Methoden konzentriert.
Die Säule wird durch Spülen mit einer Lösung von 2M NaCl regeneriert.

1.C Virusinaktivierungsbehandlung

Das Filtrat der vorangehenden Säule wird auf ungefähr 50 g/l konzentriert und einer herkömmlichen Behandlung durch Zugabe eines Gemisches von Lösungsmittel- Detergens während 6 Stunden bei 25ºC unter leichtem Rühren unterzogen.
Das Gemisch umfasst 0,3% TnBP und 1% Tween 80.

1.D Chromatographie an einem Kationenaustauschergel

Diese Chromatographie erfolgt an einer Säule GF 08015 mit 65 Litern CM-Trisacryl®, die in 0,024M Natriumacetatpuffer bei pH 5,5 äquilibriert ist, mit einem Durchfluss von 20 bis 100 Liter/Stunde.
Unter diesen Anwendungsbedingungen werden die Immunglobuline an dem Gel adsorbiert und die Kombination Lösungsmittel-Detergens und die gegebenenfalls vorhandenen denaturierten Verunreinigungen oder andere Rückstände werden in dem Filtrat eliminiert.
Die Immunglobuline werden anschließend durch Erhöhung der Ionenstärke des Puffers durch Zugabe von 0,15 bis 0,19M Natriumchlorid desorbiert.
Die gewonnene Immunglobulinfraktion weist eine Konzentration von 30 bis 50 g/l auf und kann folglich so, wie sie ist, nach der Zugabe von Saccharose bis 110 g/l konditioniert werden.
Die Säule wird durch Spülen mit einer Lösung von 1 M NaCl regeneriert.

Beispiel 2

Zu dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren fügt man einen einleitenden Vorreinigungsschritt vor der ersten Chromatographie hinzu.
Der Überstand von der Tieftemperatur-Fällung wird einer Filtration über eine Gruppe von 3 Filterpatronen mit einer Porosität zwischen 0,5 und 0,2 u, welche im Wesentlichen negativ geladen sind, unterzogen (Filter Zeta plus®, geliefert von Cuno, Process Filtration Products, Filialen von Commercial Intertech Corp. USA und beschrieben in den US-Patenten 4,783,262 und 4,859,340, bezeichnet als "Cuno-Filter"). Diese Filter bestehen aus gereinigter Cellulose, aus Perliten und aus einer geringen Menge eines positiv geladenen Harzes. Andere Filtersysteme, die im Handel erhältlich sind, können ebenfalls verwendet werden.
Die Filter werden in Citrat/Phosphat-Puffer gespült, welcher Natriumcitrat, Dinatriumphosphat, Kaliumphosphat, Natriumchlorid und Dinatrium-EDTA enthält und auf einen pH zwischen 5,5 und 6,5 und vorzugsweise auf pH 6 eingestellt ist.
Dieser Filtrationsschritt gestattet die Retention und folglich Eliminierung von Faktor XI.

Beispiel 3

Zu dem in Beispiel 1 oder in Beispiel 2 beschriebenen Verfahren wird ein vorheriger Adsorptionsschritt an einem Anionenaustauschergel vor der ersten Entsalzungs- Chromatographie an Sephadex G25 hinzugefügt.
Diese vorherige Adsorption erfolgt chargenweise in Gegenwart von DEAE-Sephadex® bei einer Konzentration von 1,5 g/Liter Plasma während 2 bis 5 Stunden. Dies gestattet die Retention und folglich Eliminierung von Faktor IX, von Faktor VII und von Protein C. Die Immunglobuline befinden sich im Überstand.
Dieser kann wieder einer zusätzlichen Vorreinigung durch eine Chromatographie an einer Säule aus DEAE-Sepharose®CL6B fast flow (Pharmacia) unterzogen werden. Das Plasmamaterial wird dialysiert und auf eine Leitfähigkeit von 1,6 mS mit 0,025M Natriumacetat eingestellt. Der pH wird auf 7,6 eingestellt.
Die Säule wird in 0,025M Natriumacetatpuffer bei pH 7,6 äquilibriert.
Die Immunglobuline befinden sich im Filtrat.
Dieses Verfahren weist den zweifachen Vorteil auf:
- dass es Immunglobuline, die bereits vorgereinigt sind, filtrieren lässt und somit eine Verringerung der Größe der nachfolgenden Chromatographiesäulen gestattet.
- und dass es das Albumin und das α-Antitrypsin zurückhält, welche anschließend gemäß bekannten Methoden mit einer besonders hohen Ausbeute aufgereinigt werden können.
Das Filtrat, welches die vorgereinigten Immunglobuline G enthält, kann wieder einer Chromatographie an einer Säule aus Heparin-Sepharose®, die in 0,02M Phosphat- 0,154M Natriumchlorid-Puffer bei pH 6,8 äquilibriert ist, unterzogen werden.
Diese Chromatographie gestattet es, das Antithrombin III zu adsorbieren und somit zu eliminieren, während sich die Immunglobuline G in dem Filtrat befinden.

Beispiel 4

Es wurden die durch ELISA gemessenen Antikörpertiter und die Neutralisationsfähigkeit der Infektiosität eines als Modell gewählten Virus, des Cytomegalievirus, mit den gemäß den klassischen Methoden der Fraktionierung durch Ethanol gefolgt von einer Behandlung bei pH 4 in Gegenwart von Pepsin und gemäß dem Verfahren der vorliegenden Erfindung hergestellten Immunglobulinen verglichen.
Die Ergebnisse zeigen deutlich, dass für eine äquivalente Menge von Antikörpern (im ELISA) die Qualität dieser, bewertet anhand ihrer biologischen Aktivität (der Neutralisationsfähigkeit), bei den auf chromatographischem Weg hergestellten Antikörpern eindeutig höher ist.

Beispiel 5

Es wurde die Menge an IgE gemessen, die in dem Ausgangsplasma, in den Chargen des Konzentrats von IgG, das gemäß der klassischen Methode (wie sie in Beispiel 4 beschrieben ist) und mit der chromatographischen Methode gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wurde, vorhanden ist.
Die folgende Tabelle zeigt, dass beinahe kein IgE mehr in der Zubereitung durch Chromatographie verbleibt, während sie in den klassischen Zubereitungen konzentrierter sind als in dem Ausgangsplasma.

Claims

1. Verfahren zum Herstellen eines Konzentrats von Immunglobulinen G zur therapeutischen Verwendung ausgehend von menschlichem Plasma oder dem Überstand von bei Tieftemperatur ausgefälltem Plasma, dadurch gekennzeichnet, daß es keine Fällung mit Ethanol umfaßt und daß es eine Abfolge von Chromatographie-Schritten, in deren Verlauf die Immunglobuline stets in flüssiger Phase und bei einem pH zwischen 5, 5 und 7, 8 bleiben, sowie einen Virusinaktivierungsschrift umfaßt, wobei das ganze Verfahren nacheinander umfaßt:

a) einen Entsalzungsschritt

b) eine Chromatographie an einem Anionenaustauschergel

c) eine Virusinaktivierungsbehandlung

d) und eine Chromatographie an einem Kationenaustauschergel.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Ausgangsmaterial die nach der Tieftemperatur-Fällung überstehende Plasma-Fraktion ist.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Überstand von der Tieftemperatur-Fällung einem Vorreinigungsschritt durch Filtration über eine Reihe von Filterpatronen mit einer Porosität von 0,5 bis 0,2 u unterzogen wird, die aus Cellulose und aus Perliten, welche negative Ladungen tragen, und aus einer geringen Menge an positiv geladenem Harz bestehen.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1-3, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehrere Vorreinigungsschritte durch Adsorption von bestimmten Plasmaproteinen an Gelen umfaßt, die ausgewählt sind aus den Anionenaustauschergelen und Heparin-Sepharose.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt a) an einem Gel aus vernetztem Dextran, das in einem 0,022M Tris-HCl-Puffer bei pH 7, 8 äquilibriert ist, durchgeführt wird und daß die Fraktion, welche die Plasmaproteine umfaßt, zurückgewonnen wird, um dem Schritt b) unterzogen zu werden.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt b) an einem Gel aus vernetztem Acrylamid, das mit DEAE-Gruppen gepfropft ist und in einem 0,025M Tris-HCl-Puffer bei pH 7, 8 äquilibriert ist, durchgeführt wird und daß das Filtrat zurückgewonnen wird, um dem Schritt c) unterzogen zu werden.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt c) durch Behandlung mit einem Lösungsmittel-Detergens während mindestens 6 Stunden bei 25ºC ausgeführt wird.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Schritt d) an einem Gel aus vernetztem Acrylamid, das mit Carboxymethylgruppen gepfropft ist und in einem 0,024M Natriumacetat-Puffer bei pH 5, 5 äquilibriert ist, durchgeführt wird und daß die an dem Gel adsorbierten Immunglobuline durch Erhöhen der Ionenstärke des Puffers auf 0,15 - 0,19M NaCl eluiert werden.

9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die eluierten Immunglobuline von Schritt d) mit Saccharose bis 110 g/l versetzt und anschließend lyophilisiert werden.