DE69818106T2

DE69818106T2 - Immunologische zusammensetzungen und verfahren zur transienten änderung des zentralnervensystem-myelins der saügetiere und förderung der nerven-regenerierung

Info

Publication number: DE69818106T2
Application number: DE69818106T
Authority: DE
Inventors: D. John STEEVES; K. Jason DYER; S. Hans KEIRSTEAD
Original assignee: University of British Columbia
Current assignee: Dyer Jason K Vancouver British Columbia Ca; Steeves John D Vancouver British Columbia Ca
Priority date: 1997-10-28
Filing date: 1998-10-28
Publication date: 2004-06-17
Anticipated expiration: 2018-10-29
Also published as: DK1047449T3; JP2001521008A; IL135799A0; US6969516B1; EP1047449A1; US6548061B1; DE69818106D1; ATE249241T1; IL135799A; WO1999021581A1; EP1047449B1; PT1047449E; AU9617998A; ES2210829T3; AU748143B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen und deren Verfahren zur Benutzung zur Förderung des Wachstums und/oder der Regeneration von Nervengewebe innerhalb des Zentralnervensystems (ZNS).
ZNS-Schaden
Etwa 1.100 neue Rückenmarkverletzungen passieren jedes Jahr in Kanada; über 10.000 pro Jahr geschehen in den Vereinigten Staaten. Diese Zahlen sind 5mal höher wenn man auch Patienten einschließt, die an Hirnschäden leiden, welche die Hemmung von neuronalem Wachstum nach traumatischer Hirnverletzung involvieren. Die Zahl an Patienten mit chronischen Rückenmarkverletzungen in Nordamerika ist in der Größenordnung von 300.000. Diese Zahl ist wiederum 5mal höher, wenn man Patienten einschließt, die an Hirnschäden leiden, welche die Hemmung von neuronalem Wachstum nach traumatischer Hirnverletzung involvieren.
Rückenmarksverletzungen resultieren häufig in einem dauerhaften Verlust der spontanen Bewegung unterhalb der Schadensstelle. Zumeist junge und sonst gesunde Personen werden paraplegig oder quadriplegig aufgrund von Rückenmarksverletzungen. In den Vereinigten Staaten gibt es eine geschätzte Anzahl von 200.000 Quadriplegischen. Angesichts des notwendigen Pflegeaufwands, ist es nicht schwierig, sich vorzustellen, dass die mit der Pflege von Patienten mit Zentralnervensystem (ZNS)-Schäden verbundenen Gesundheitsfürsorgekosten gut über 10 Milliarden Dollar pro Jahr für Nordamerika betragen.
Das ZNS (das Gehirn und Rückenmark) besteht aus Neuronen und Glia, wie beispielsweise Astrozyten, Mikroglia und Oligodentrozyten. Neuronen haben typischerweise zwei Typen von Fortsätzen: Dendriten, welche synaptischen Kontakt von Axonen von anderen Neuronen erhalten; und Axone, durch welche jedes Neuron mit anderen Neuronen und Effektoren kommuniziert. Das Axon eines ZNS-Neuron ist von einer Myelinscheide umhüllt.
In höheren Vertebraten besitzen Axone innerhalb des ZNS eine begrenzte Fähigkeit zur Reparatur nach einer Verletzung. Im Gegensatz zu Neuronen innerhalb des embryonalen oder neuronalen ZNS oder innerhalb des adulten peripheren Nervensystems (PNS) (Saunders et al., (1992) Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. 250: 171– 180; Schwab and Bartoldi (1996) Physiol. Rev. 76: 319–370; Steeves et al., (1994) Prog. BrainRes. 103: 243–262), versagen axotomisierte Neuronen des adulten Säuger-ZNS in der Darbietung von wesentlicher axonaler Regeneration. Tatsächlich verhindert eine vollständige ZNS-Axonen-Unterbrechung wahrscheinlich die Gesundung. Obwohl axotomisierte, proximal zum neuronalen Zellkörper gelegene Fasern regeneratives Wachstum injizieren, wird dieses nachfolgend innerhalb einer kurzen Distanz (1–2 mm) abgebrochen und wird häufig gefolgt von retrograder Degeneration. Peripherale Nerventransplantate in das ZNS stellen eine günstige Umgebung dar, durch welche ZNS-Axone anatomisch regenerieren werden (May et al., Cajal's Degeneration and Regeneration of the Nervous System, History of Neuroscience Series #5 (NY and Oxford: Oxford Univ Press, 1991) at 769), obwohl ZNS-Axone nicht in der Umgebung von adultem Rückenmark wieder wachsen werden. Diese Befunde zeigen, dass adulte ZNS-Neuronen intrinsische Wachstumseigenschaften beibehalten und bei günstigen Umgebungsbedingungen in der Lage sind, erfolgreich Wachstumsprogramme zu reaktivieren.
Aktuelle Therapien von Rückenmarksverletzungen
Zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen existieren zahlreiche aktuelle Therapien. Interventionelle Therapien, einschließlich Opiatantagonisten, Thyreotropin-Releasing-Hormon, lokale Rückenmarkskühlung, Dextraninfusion, Adrenorezeptorenblockade, Kortikosteroide, und Sauerstoffüberdruck wurden verwendet, aber sind von fragwürdigem klinischen Wert.
Periphere Nerventransplantate wurden als Brücken über ZNS-Läsionen vorgeschlagen (David and Aguayo (1981) Science 214: 931–933; Houle (1991) Exp. Neurol. 113: 1–9; Richardson et al., (1984) J. Neurocytol. 13: 165–182 ; Richardson et al., (1980) Nature 284: 264–265; Xu et al., (1995) Exp. Neurol. 138: 261–276; Ye and Houle (1997) Exp. Neurol. 143: 70–71). In letzter Zeit wurden Transplantate von umhüllenden Zellen der Riechrinde verwendet, um die Regeneration von verletzten kortikospinalen Projektionen in der Ratte zu fördern (Li et al., (1997) Science 277, 2000, 2002). Eine neue Studie (Cheng et al., (1996) Science 273: 510–513) verwendete einen kombinatorischen Ansatz, der frühere Arbeiten (Siegal et al., (1990) Exp. Neurol. 109: 90–97) fortführte: Nach Durchtrennung von adultem Rückenmark wurden periphere Transplantate verwendet, um weiße Substanzgänge mit zentraler grauer Substanz dergestalt zu verbinden, um regenerierende Fasern aus einer hemmenden Umgebung in die eher permissive graue Substanz zu dirigieren.
Die US-Patente Nr. 5650148 und 5762926 beschreiben ein Verfahren zur Behandlung von Schäden am ZNS durch Transplantierung von Donorzellen, die modifiziert wurden, um Moleküle wie Neutrophine zu produzieren, in das ZNS.
Die Verwendung von transplantierten neuronalen Zellen ist auch von begrenztem klinischen Wert: Obwohl Axone in der Lage sein werden, in transplantiertes Gewebe zu wachsen, werden sie nicht in der Lage sein, aufgrund der hemmenden Substanz im ZNS, aus dem transplantierten Gewebe zurück in das ZNS zu wachsen. Dieser Überblick der aktuellen Verfahren zur Behandlung von Rückenmarksverletzungen zeigt, dass ein Bedarf an Mitteln zur Förderung des Wiederwachsens, der Reparatur, und Regeneration von Neuronen in Säuger-ZNS, sowohl in akuten wie in chronischen Situationen verbleibt.
Myelin
Es wurde vorgeschlagen, dass das Unvermögen von ZNS-Axonen zur Regenerierung nach Verletzung an die Gegenwart des Myelins gebunden ist. Die Myelinscheide, die ein Axon umgibt, ist aus verfestigten Plasmamembranen von Schwann'schen Zellen und Oligodendrozyten aufgebaut. Obwohl ihr Aufbau dem von jeder anderen Plasmamembran ähnelt, dadurch dass es Lipide, Proteine und Wasser enthält, sind die relativen Anteile und Ablagerungen dieser Komponenten für das Myelin ohnegleichen.
Das Myelin im ZNS wird durch Oligodendrozyten produziert und durch die Expression des Myelin Basic Protein (MBP) charakterisiert. MBP ist ausschließlich mit Myelin assoziiert und ist eines der ersten Proteine, die zu Beginn der Myelinbildung von ZNS-Axonalfasern exprimiert werden. Galaktozerebrosid (Gal C) ist das bedeutendste, von Oligodendrozyten produzierte Sphingolipid. Gal C umfasst ungefähr 15 Prozent der Gesamtlipide in menschlichem Myelin und ist über Spezien hinweg hoch konserviert. Obwohl Gal C auf der Oberfläche der Zellkörper von Oligodendrozyten exprimiert wird, ist es in größerer Konzentration auf der Oberfläche von myelinen Membranen konzentriert (Ranscht et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 2709–2713). Es gibt wachsende Evidenz dafür, dass die Gegenwart von ZNS-Myelin das regenerative Wachstum von einigen ZNS-Axonen zurückhalten oder hemmen kann (Schwab and Bartoldi (1996) Physiol. Rev. 76: 319– 370), einschließlich zahlreicher Beispiele von verbreiteten Vertebratenfamilien (Schwegler et al., (1995) J. Neurosci. 15: 2756–2767; Steeves et al., (1994) Prog. Brain Res. 103: 243–262). Sowohl das ZNS von niederen Vertebraten (z. B. Neunauge) wie auch das entwickelnde ZNS von höheren Vertebraten (z. B. Vögel und Säuger) zeigt substantielle axonale Regeneration nach Verletzung (Davis and McClellan (1994) J. Comp. Neurol. 344: 65–82; Hasan et al., (1993) J. Neurosci. 13: 492–507; Hasan et al., (1991) Restor. Neurol. Neurosci. 2: 137–154; Iwashita et al., (1994) Nature 367: 167–170; Saunders et al., (1992) Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. 250: 171–180; Treherne et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 431–434; Varga et al., (1995) Eur. J. Neurosi. 7: 2119–2129). Das gemeinsame Merkmal all dieser Positivbeispiele für Regeneration ist entweder ein ZNS, dem kompaktes Myelin fehlt (Neunauge) oder unvollständige Myelinentwicklung zum Zeitpunkt der Verletzung (embryones Küken, neonatales Opposum und Ratte). Das entwicklungsgemäße Auftreten von Myelin korreliert zeitlich mit dem Verlust der Regeneration von verletzten ZNS-Axonen. Zusätzlich könnte das robuste Wachstum von transplantierten fötalen Neuronen im adulten ZNS (Bregmann et al., (1993) Exp. Neurol. 123: 3–16; Li and Raisman (1993) Brain Res. 629: 115–127; Yakovleff et al., (1995) Exp. Brain Res. 106: 69–78) einem Fehlen von Rezeptoren für Myelininhibitoren zum Zeitpunkt ihrer Differenzierung zugeschrieben werden und/oder einer Fähigkeit, jedwedes inhibitorisches Signal von Myelin außer Kraft zu setzen.
Spezifische Moleküle, die mit Myelin assoziiert sind, wurden als putative Mediatoren dieser hemmenden Aktivität identifiziert, einschließlich des Myelin-assoziierten Glykoproteins (MAG) (McKerracher et al., (1994) Neuron. 13: 805–811; Mukhopadhyay et al., (1994) Neuron. 13.757–767) und NI 35/250, ein bis heute nicht identifiziertes Myelin-abgeleitetes Protein (Bandtlow and Schwab (1991) Soc. Neurosci. Abstr. 17: 1495; Caroni and Schwab (1988) J. Cell Biol. 106: 1281–1288; Caroni and Schwab (1988) Neuron. 1: 85; Crutcher (1989) Exp. Neurol. 104: 39–54; Savio and Schwab (1989) J. Neurosci. 9: 1126–1133; Schwab and Caroni (1988) J Neurosci. 8: 2381–2393); IN-1 (Brosamle, et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci., 24: 1559; NI-35/250 (Huber et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci., 24: 1559; NI-220/250 (van der Haar et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci., 24: 1559; arretin, Janani et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci., 24: 1560; and NOGO (Chen et al., (1998) Abst. Soc. Neurosci., 24: 1776) Degeneration. Peripherale Nerventransplantate in das ZNS stellen eine günstige Umgebung dar, durch welche ZNS-Axone anatomisch regenerieren werden (May et al., Cajal's Degeneration and Regeneration of the Nervous System, History of Neuroscience Series #5 (NY and Oxford: Oxford Univ Press, 1991) at 769), obwohl ZNS-Axone nicht in der Umgebung von adultem Rückenmark wieder wachsen werden. Diese Befunde zeigen, dass adulte ZNS-Neuronen intrinsische Wachstumseigenschaften beibehalten und bei günstigen Umgebungsbedingungen in der Lage sind, erfolgreich Wachstumsprogramme zu reaktivieren.
Experimentelle Versuche, die Myelin-assoziierte Hemmung von NI35/250 funktionell zu blockieren, durch Verwendung eines Anti-NI35/250 Antikörpers, IN-1, haben etwas anatomische Regenerierung von corticospinalen Axonen ermöglicht (Bregman et al., (1995) Nature 378: 498–501; Caroni and Schwab (1988) Neuron. 1: 85–96; Schnell and Schwab (1990) Nature 343: 269–272).
Die immunologische Störung von reifem Myelin innerhalb des aviären Rückenmarks (Keirstead et al., (1995) J. Neurosci. 15: 6963–6974) und die Verzögerung des Beginns der ZNS-Myelinbildung während der normalen aviären oder Säuger-Neuroentwicklung (Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 11664– 11668; Keirstead et al., (1997) Brain Res. Bull. 44: 727–734; Varga et al., (1995) Eur. J. Neurosci. 7: 2119–2129) haben ebenfalls das ZNS-axonale Wiederwachsen und/oder -sprießen ermöglicht.
Die Gegenwart bestimmter Komponenten, ansässig oder eingebettet in Myelin, die hemmend auf die Regenerierung von axonalem Wachstum nach Verletzung sind, macht es wünschenswert, Myelin und seine hemmenden Komponenten transient zu entfernen, um die Reparatur von verletztem adultem Rückenmark zu fördern. Adultes Rückenmark kann in vivo durch Wirkstoffe (z. B. Ethidiumbromid) demyelinisiert werden; jedoch haben diese Wirkstoffe unspezifische schädliche Wirkungen auf andere Zelltypen im zentralen Nervensystem (z. B. Astrocyten). Zusätzlich sind myelin-defiziente Stämme von Mäusen und Ratten jederzeit verfügbar, aber diese sind aufgrund einer verkürzten Lebensspanne von begrenztem experimentellem Wert: Die meisten überleben keine mehrere Wochen nach Geburt.
Infolge dessen gibt es einen Bedarf an verbesserten Verfahren zur Störung von Myelin in vivo um die Regenerierung von neurologischem Gewebe zu verbessern. Die vorliegende Erfindung liefert Verfahren, die sich mit diesem Bedarf befassen.
Das Komplement
Das Komplementsystem ist der primäre humorale Vermittler von Antigen-Antikörperreaktionen. Es besteht aus mindestens 20 chemisch und immunologisch von einander verschiedenen Serumproteinen, die in der Lage sind, miteinander, mit Antikörpern und mit Zellmembranen zu interagieren (siehe, zum Beispiel J. Klein, Immunology. The Science of Self-Nonself Discrimination (New York: John Wiley & Sons, 1982), 310–346). Die Hauptakteure in diesem System sind 11 Proteine, benannt C1 bis C9, B und D, die normalerweise unter den Plasmaproteinen vorhanden sind. Diese Proteine sind normalerweise inaktiv, aber können auf zwei verschiedene Arten aktiviert werden: Der klassische Weg oder der alternative Weg.
Der klassische Weg wird durch eine Antigen-Antikörper-Reaktion aktiviert: Wenn ein Antikörper an ein Antigen bindet, wird eine spezifische reaktive Stelle im konstanten Abschnitt des Antikörpers aktiviert, welche wiederum direkt an das C1-Molekül des Komplementsystems bindet. Dies setzt eine Kaskade von sequenziellen Reaktionen in Bewegung, die mit der Aktivierung des C1-Pro-Enzyms beginnt.
In dieser ersten Phase des Komplementsystems werden nur wenige Antigen-Antikörperkombinationen benötigt, um eine Vielzahl von Molekülen zu aktivieren. Dann aktivieren die C1-Enzyme nachfolgend größer werdende Mengen an Enzymen in den späteren Phasen des Komplementsystems. Vielfältige Endprodukte werden gebildet, welche wichtige Wirkungen erzielen, die helfen, Schäden durch einen eindringenden Organismus oder Toxin zu verhindern, einschließlich Opsonisierung und Phagozytierung, Lysis, Aglutination, Neutralisation von Viren, Chemotaxis, Aktivierung von Mastzellen und entzündlichen Wirkungen.
Das Komplementsystem kann auch durch einen alternativen Weg, ohne die Vermittlung von Antigen-Antikörperreaktionen, aktiviert werden. Bestimmte Wirkstoffe reagieren mit Komplementfaktoren B und D und bilden ein Aktivierungsprodukt, welches Faktor C3 aktiviert, wobei der Rest der Komplementkaskade aktiviert wird; daher werden im Wesentlichen dieselben Endprodukte des Systems gebildet wie beim klassischen Weg und verursachen dieselben Wirkungen. Da der alternative Weg keine Antigen-Antikörperreaktion beinhaltet, ist er einer der ersten Verteidigungslinien gegen eindringende Mikroorganismen.
Da sowohl die Komponenten des klassischen Wegs wie auch des alternativen Wegs des Komplementsystems lokal agieren um C3 zu aktivieren, ist dieser die Schlüsselkomponente des Komplements. C3 ist ein 195 kD Protein, welches zwei Disulfit-überbrückte Ketten von 105 und 75 kD umfasst. Der enzymatisch aktive C4-C2 Komplex, der im klassischen Weg durch die Bindung von C1 q an einen Antigen-Antikörperkomplex aktiviert wird, spaltet C3 in zwei Fragmente, C3a und C3b. Das größere Fragment, C3b, bindet kovalent an die Oberfläche von Zielzellen, wo es als Protease wirkt, um die nachfolgenden Schritte in der Komplementkaskade zu katalysieren. Es wird auch durch spezifische Rezeptorproteine auf Makrophagen und Neutrophilen erkannt, die die Fähigkeit dieser Zellen, die Zielzelle zu phagozytieren, verstärken. Insbesondere Membran-gebundenes C3b löst eine weitere Kaskade von Reaktionen aus, die zur Bildung von Membran-Attackierungskomplexen der späten Komponenten führen. Es wurde gezeigt, dass Komplementfixierung durch zelloberflächenbindende Antikörper, die ionische Homöostase von vielen verschiedenen Zellen in vitro innerhalb von Minuten nach Aktivierung beeinträchtigen kann (Mayer (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69: 2954–2958; Morgan (1989) Biochem. J. 264: 1–14).
Verwendung von Komplement mit Myelin-spezifischen Antikörpern
Nach Anlagerung eines komplementfixierenden spezifischen Antikörpers an ein Myelin-Oberflächenantigen, bildet Serumkomplement einen Membran-Attackierungskomplex durch eine enzymatische Kaskade, was in einem schnellen Einfließen von extrazellulärem Kalzium resultiert (Dyer and Benjamins (1990) J. Cell Biol. 111: 625–633) und anschließendem Rearrangement des Zytoskeletts (Dyer and Matthieu (1994) J. Neurochem. 62: 777–787). Dies macht in vivo die unterbrochenen Myelin-Fortsätze zu einem Ziel für Phagozytose durch nachfolgende Mikroglia sowie durch alle eindringenden Makrophagen.
Es wurde gezeigt, dass die in vitro-Anwendung von Serumkomplement mit Myelinspezifischen Antikörpern die Myelinausschmückung in aufgereinigten Oligodendrozytenkulturen unterdrückt (Dorfman et al., (1979) Brain Res. 177: 105-114; Dubios-Dalcq et al., (1970) Pathol. Eur. 5: 331–347; Dyer and Benjamins (1990) J. Cell. Biol. 111: 625–633; Fry et al., (1974) Science 183: 540–542; Hubry et al., (1977) Science 195: 173–175).
In vivo-Myelinunterbrechung, unter Verwendung von Anti-GalC-Serum und Komplement, wurde in optischen Nerven von Meerschweinchen gezeigt (Sergott et al., (1984) J. Neurol. Sci. 64: 297–303); Myelinunterbrechung wurde innerhalb ein bis zwei Stunden nach Behandlung beobachtet.
Das Hühnerkükenmodell
Im aviären Modell korreliert der Beginn der Myelinierung im embryonalen Rückenmark des Kükens am E13 mit dem Übergang von einer permissiven zu einer restriktiven Periode des funktionellen Reparierens von durchtrenntem Rückenmark. Das erste Auftauchen von Küken-Oligodendrozyten am 10. und 11. Embryonaltag der Entwicklung (E10 bis E11) geht der initialen Bildung von Myelin um zwei bis drei Embryonaltage voraus und ist durch die Expression von Galaktozerebrosid (Gal C) charakterisiert, das bedeutendste von Oligodendrozyten produzierte Sphingolipid. Im reifen Vogelrückenmark, nach Durchtrennung des Rückenmarks, erleichterte immunologische Unterbrechung des Rückenmarksmyelins Regeneration durch Hirnstamm-spinale Nervenzellen (Keirstead et al. (1995), J. Neurosci. 15: 6963– 6974; Keirstead et al. (1997), Brain Res. Bull., 44: 727–734). Die immunologische Unterbrechung des Myelins war vorübergehend, bewirkt durch eine intraspinale Infusion von sowohl Serum-Komplement als auch einem myelin-spezifischen, komplement-fixierenden Antikörper (z. B. GalC Antikörper). Eine solche Behandlung führte zur Regeneration von bis zu 20% der reifen Hirnstamm-spinalen Axons.
Diese Hintergrundinformation wird zur Verfügung gestellt zum Zweck der Kenntnismachung bekannter Information, von der der Anmelder glaubt, dass die von möglicher Relevanz für die vorliegende Erfindung ist. Kein Eingeständnis ist notwendigerweise beabsichtigt, noch sollte das so ausgelegt werden, dass irgendeine der voranstehenden Informationen Stand der Technik für die vorliegende Erfindung darstellt. Publikationen, auf die in der Spezifikation Bezug genommen wird, werden hiermit mittels Bezugnahme in ihrer Gesamtheit in diese Anmeldung aufgenommen.
Der Zweck der vorliegenden Erfindung ist es, ein Mittel zur Förderung des erneuten Wachstums, der Reparatur, und der Regeneration von Nervenzellen im Säugerzentralnervensystem zur Verfügung zu stellen. Dementsprechend stellt die Erfindung Zusammensetzungen und Methoden der Verwendung zur Förderung von erneutem Wachstum, Reparatur, und/oder der Regeneration von Nervenzellen im Zentralnervensystem eines Säugers zur Verfügung, wie beispielsweise eines Menschen, sowohl bei chronischen als auch bei akuten Störungen.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt eine Zusammensetzung zur Verfügung, umfassend therapeutisch wirksame Mengen des folgenden:

(a) ein oder mehrere humane oder humanisierte komplement-fixierende Antikörper oder deren Fragmente, die spezifisch an ein Epitop des Myelins im Menschen binden; und
(b) ein oder mehrere Komplementproteine oder deren Fragmente;

In einer spezifischen Ausführungsform ist das Epitop des Myelins ein Myelinscheidenepitop, wie beispielsweise Galactocerebrosid (GalC), O4, Myelin Oligodendrozyten-Glykoprotein (MOG), oder Myelin-assoziiertes Glykoprotein (MAG), NOGO, NI22, NI-35/250, oder Arretin, oder Fragmente davon. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Epitop des Myelins GalC. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform ist MOG.
In einer bevorzugten Ausführungsform schließen die Komplementproteine oder deren Fragmente die C3 Komponente ein, oder ein Fragment, eine Variante, ein Analoges, oder ein chemisches Derivat davon. In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Komponente C3b verwendet.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung umfasst die Zusammensetzung des weiteren Neutrophine und Wachstumsfaktoren, wie beispielsweise NT-3, CNTF, FGF-1, BDNF, PDGF, GDNF, CT-1, oder BNP.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf die Verwendung dieser Zusammensetzungen um erneutes Wachstum, Reparatur, und/oder Regeneration von Nervenzellen in einer Person zu fördern durch die vorübergehende Unterbrechung und/oder vorübergehende Demyelinierung des Myelins.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Zusammensetzungen in Personen verwendet, die der Nervenzellenreparatur und/oder -regeneration als Folge neuronaler Dysfunktion bedürfen. Diese neuronale Dysfunktion kann ein Resultat akuter oder chronischer Verletzung des Zentralnervensystems sein. Es kann auch das Resultat einer degenerativen Erkrankung, beispielsweise Alzheimer'scher oder Parkinson'scher Krankheit sein.
In einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die Zusammensetzungen in Personen verwendet, um innerhalb des Zentralnervensystems eine Umgebung zu schaffen, die relativ permissiv hinsichtlich des Wachstums transplantierter Zellen ist.
Gemäß einer mehr bevozugten Ausführungsform ist die Zusammensetzung eine zweiteilige Zusammensetzung, wobei beabsichtigt ist, die beiden Teile miteinander zu vermengen, entweder vor Verbreichung, zum Zeitpunkt der Verbreichung, oder nach Verabreichung an einen Menschen, der einer solchen Behandlung bedarf.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf eine Methode zur Förderung von erneutem Wachstum, Reparatur und Regeneration von Nervenzellen im Säugerzentralnervensystem, wobei der Schaden eine Folge entweder chronischer oder akuter Störung ist. Die Methode bedingt Einbringen eines oder mehrerer komplement-fixierender Antikörper oder deren Fragmente, die spezifisch an ein Epitop des Myelins binden und Einbringen eines oder mehrerer Komplementproteine oder deren Fragmente, die entweder zusammen oder getrennt eingebracht werden, um vorübergehende Unterbrechung und/oder vorübergehende Demyelinierung des Myelins in der neuronalen Zone bewirken, die der Regeneration bedarf.
Verschiedene andere Gegenstände und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden ersichtlich aus der detaillierten Beschreibung der Erfindung.
Die Erfindung ist des weiteren illustriert durch die angefügten Tabellen und Figuren, die folgendes zeigen:
Tabelle 1 zeigte rubrospinale Nervenzellenzählungen, die von individuellen Kontroll- und Versuchstieren erhalten wurden durch retrograde Fluorogold-Markierung vom umbalen Rückenmark einer erwachsenen Ratte.
1 zeigt (A) Photomicrographie eines Querschnitts des Rückenmarks einer erwachsenen Ratte auf der Höhe einer linksseitigen T10 Hemisektions-Verletzung, gefärbt mit Cresylviolett. Alle Verletzungen wurden untersucht und resultierten immer im Abtrennen der Funiculi, durch die der Rubrospinaltrakt verläuft. Die kontralateralen dorsalen (dh) und ventralen (vh) Hörner wurden immer unzerstört belassen; der Zentralkanal (cc) ist zwecks Orientierung markiert. (B) Untersuchung der sichtbaren Fluorogolddiffusion im kontroll-behandelten und immunologisch unterbrochenen und einer Hemisektion unterzogenen Rückenmark. Diffusion des retrograden Tracers wurde mit dem Lichtmikroskop zu den angezeigten Zeitpunkten nach Injektion in das lumbale Rückenmark gemessen (betreffend Details siehe Methoden). Immunologische Demyelinierung wirkte sich nicht signifikant auf die Diffusion des Tracers aus.
2 zeigt Elektronen-Photomicrographien von Querschnitten durch den dorsolateralen Funiculus nach kontinuierlicher intraspinaler Infusion von immunologischen Reagenzien über 7 Tage. (A) Innerhalb eines spinalen Segments (< 2 mm) von der Infusionsstelle waren große Regionen nackter, demyelinierter Axons sichtbar. Bei einigen Axons wurde beobachtet, dass sie mit monozytären Zellen (M, z. B. infiltrierender Makrophage) und/oder endogener Microglia assoziiert sind, von denen einige auch Myelin Ovoide (Pfeil) oder Myelinreste enthielten. (B) Auf anderen Rastern konnten Monozyten und invadierende Polymorphonucleozyten (PMN) in enger Assoziation mit demyelinierten Axons gesehen werden. Makrophagen und/oder Microglia wurden auf der Grundlage ihres hochdichten endoplasmatischen Reticulums (Pfeilspitzen) identifiziert, und „finger-artige" Prozesse. Einige Monozyten haben Komponenten der Basal-Lamina abgelagert, wie beispielsweise Kollagen (Col), was sie von Astrozyten unterscheidet. Viellappige Zellkerne sind charakteristisch für PMNs und erleichtern ihre Identifizierung. (C) Beispiel der Myelin-Unterbrechung. Dies wird oft 4–8 mm (1–2 spinale Segmente) von der immunologischen Infusionsstelle beobachtet, wo Axons noch mit Myelin assoziiert waren; jedoch waren die Myelin-Lamellen unterbrochen (delaminiert). Eine Regionen kohärenter Myelinverpackung hatten Bestand (Pfeile). (D) Beispiel des Erscheinungsbilds von Axons innerhalb des dorsolateralen Funiculus nach einer Kontrollinfusion von Meerschweinchen-Komplement allein. Einige unspezifische Schäden der Myelinscheiden traten auf, insbesondere innerhalb eines spinalen Segments von der Infusionsstelle; die kompakte Natur des Myelins blieb jedoch intakt. Ursprüngliche Vergrößerung × 4000 (A, B, D), × 10000 (C).
3 zeigt Demonstrationen der Regeneration rubrospinaler Nervenzellen nach linksseitiger thorakaler Hemisektion und nachfolgender immunologischer Myelin- Suppressionsbehandlung. A und B sind Photomicrographien rubrospinaler Nervenzellen desselben experimentell behandelten Tiers (14 Tage Infusion von Serumkomplement mit anti-GalC); A stammt vom unverletzten Roten Kern während B vom verletzten Roten Kern stammt. C und D sind vom gleichen kontrollbehandelten Tier (14 Tage Infusion von Serumkomplement allein): C ist der unverletzte Rote Kern und D ist der verletzte Rote Kern. Fluorogold-Injektion innerhalb des rostralen lumbalen Rückenmarks 28 Tage nach Verletzung ergab retrograde Markierung unverletzter rubrospinaler Nervenzellen (A und C) als auch jener rubrospinalen Nervenzellen, die sich vom verletzten Roten Kern regeneriert haben (B und D). (E) und (F): Der Axotomie unterzogene rubrospinale Nervenzellen wurden retrograd markiert zum Zeitpunkt der Verletzung mit der ersten Markierung RDA (ausgefüllte Pfeilspitzen), und in der Folge 28 Tage später mit der zweiten Markierung FG (nicht ausgefüllte Pfeilspitzen). Doppelt markierte (RDA + FG) Zellen sind mit einem Stern markiert and repräsentieren jene rubrospinalen Nervenzellen, die sich nach immunologischer Myelin-Suppressionsbehandlung regeneriert haben. Maßstab: Balken = 100 μm.
4 zeigt eine relative quantitative Untersuchung der Regeneration rubrospinaler Nervenzellen nach thorakaler Verletzung und immunologischer Behandlung. Die Regeneration wurde durch Zählen FG-markierter Zellen in abwechselnden Gewebsschnitten untersucht: jene sowohl mit multipolarer neuronaler Morphologie als auch mit FG-Markierung wurden als positiv bewertet. Prozentuale Regeneration wurde durch den Vergleich der retrograd markierten Zellzählungen aus dem verletzten Roten Kern mit dem unverletzten Kontroll-Roten Kern innerhalb desselben Tiers berechnet. Für jedes Tier wurde das Ausmaß der Verletzung untersucht. Ausgefüllter Balken: Unterdrücktes Myelin; schraffierter Balken: Gepoolte kontroll-behandelte Gruppen. Gezeigte Daten ± Standardabweichung.
5 zeigt den Effekt der Entfernung eines einzelnen Komplementproteins auf die immunologische Demyelinierung. (A) Unverletztes Kontrollrückenmark. Elektronen-Photomicrographien von Querschnitten durch den dorsolateralen Funiculus, die die Ultrastruktur adulter Myelinscheiden zeigen. (B) 7 Tage Infusion mit myelinspezifischem Antikörper und humanen Komplement-Seren führt zu einer ausgeprägten Myelin-Suppression. (C) Die Entfernung der C3 Komponente des Komplements führt zu einem Fehlen der Myelinentfernung, was auf die fundamentale Rolle dieses Proteins hinweist in entweder (i) der Opsonisierung, oder (ii) der Propagierung der Kaskade zum lytischen Membran-Attacken Komplex (MAC), dem finalen lytischen Pfad-Komplex. Es wird vermutet, dass es ein fundamentales und essentielles Erfordernis eines myelin-spezifischen zelloberflächen-bindenden Antikörpers ist, den klassischen Komplement-Pfad für effektive vorübergehende Demyelinierung zu aktivieren.
6 zeigt eine relative quantitative Untersuchung der Regeneration von lateralen vestibulospinalen Nervenzellen nach thorakaler Verletzung und verzögerter immunologischer Behandlung. Immunologische Demyelinierungsbehandlung wurde, wie angezeigt, um 1 oder 2 Monate nach Verletzung verzögert. Regeneration wurde untersucht durch Zählen FG-markierter Zellen in abwechselnden Gewebsschnitten: jene sowohl mit multipolarer neuronaler Morphologie als auch mit FG-Markierung wurden als positiv bewertet. Prozentuale Regeneration wurde durch den Vergleich der retrograd markierten Zellzählungen des verletzten lateralen vestibulospinalen Kerns mit dem der Kontrolle dienenden unverletzten lateralen vestibulospinalen Kern innerhalb desselben Tiers berechnet. Für jedes Tier wurde das Ausmaß der Verletzung untersucht. Ausgefüllter Balken: Unterdrücktes Myelin; schraffierter Balken: Gepoolte kontroll-behandelte Gruppen. Gezeigte Daten ± Standardabweichung.
7 zeigt A) Darstellung einer dorsalen Ansicht des Rattenzentralnervensystems, wo der relative Ursprung und Verlauf des Rubrospinaltrakts (RN) und des lateralen Vestibulartrakts (LVe) dargestellt sind. Ebenfalls illustriert (durchgezogene Linie) ist die linksseitige thorakale Hemisektions-Verletzung (~T10, Linie), die immunologische Infusionsstelle (~T11, vertikale Schraffur), und die Stelle der Fluorogold-Injektion (~L1, diagonale Schraffur). B) Zusammengesetzte Photomicrographie von Parasagittalschnitten durch das untere thorakale und rostrale lumbale Rückenmark (T9 – L1, rostral zeigt nach oben). Etwas Fluorogold-Diffusion kann klarerweise von der Infusionsstelle ausfließen als intensiver weißer „Halo"; diese Färbung nahm jedoch rapide mit dem Abstand von der Infusionsstelle ab und keine war jemals sichtbar rostral zu T11, der immunologischen Infusionsstelle (das heißt, keine Diffusion zu oder oberhalb der Verletzung bei T10, daher keine Evidenz für irgendwelche „falsch" positive retrograde Markierung von Hirnstamm-spinalen Projektionen). C) Photomicrographie von Querschnitten des Rückenmarks auf der Höhe der T10 linksseitigen Hemisektionsverletzung, gefärbt mit Cresylviolett. Alle Verletzungen wurden untersucht und resultierten immer im Abtrennen der Funiculi, durch die der Rubrospinaltrakt und der laterale Vestibulospinaltrakt verlaufen. Die kontralateralen dorsalen (dh) und ventralen (vh) Hörner wurden immer unzerstört belassen; der Zentralkanal (cc) ist zwecks Orientierung markiert. D) und E) Unspezifische, mit Blutzellen innerhalb der Verletzung und der Pumpenimplantationsstellen assoziierte Fluoreszenz, die das Ausmaß des Schadens, der mit der Verletzung bzw. der Cannula-Implantation assoziiert ist, anzeigt. Spezifische Fluorogold-Fluoreszenzmarkierung wurde niemals auf der Höhe der Cannula-Implantation oder der Hemisektions-Verletzung beobachtet.
8 zeigt Regeneration lateraler vestibulospinaler Nervenzellen nach linksseitiger thorakaler Hemisektion und nachfolgender immunologischer Myelin-Suppressionsbehandlung. A und B sind Photomicrographien lateraler vestibulospinaler Nervenzellen vom gleichen experimentell-behandelten Tier (14 Tage Infusion von Serum-Komplement mit anti-GalC); A ist vom verletzten lateralen vestibulären Kern und B ist vom unverletzten lateralen vestibulären Kern. C und D sind auch vom gleichen kontroll-behandelten Tier (14 Tage Infusion von Serum-Komplement allein); wobei C der verletzte laterale vestibuläre Kern und D der unverletzte laterale vestibuläre Kern ist. Fluorogold-Injektion innerhalb des rostralen lumbalen Marks 28 Tage nach Verletzung führte zur retrograden Markierung unverletzter lateraler vestibulospinaler Nervenzellen (B und D) als auch jener lateralen vestibulospinalen Nervenzellen, die vom verletzten lateralen vestibulospinalen Kern regeneriert haben (A und C), weitere Details siehe Resultate. E ist eine Darstellung eines Querschnitts durch das Mittelhirn, wobei die Lage des lateralen vestibulären Kerns (LVe) angezeigt ist, SpVe = spinaler vestibulärer Kern, MVe = medialer vestibulärer Kern, 4V = vierter Ventrikel, FN = Gesichtsnerv-Trakt, 7 = siebenter cranialer (facialer) Kern, PFI = Paraflocculus. Maßstab: Balken = 100 μm.
9 zeigt die relative quantitative Bewertung der Regeneration der rubrospinalen und lateral vestibulospinalen Neuronen nach Brustverletzung und immunologischer Behandlung. Die Regeneration wurde bestimmt durch Zählen der FG-markierten Zellen in alternierenden Gewebeschnitten; die Schnitte mit multipolarer neuronaler Morphologie und FG-Markierung wurden als positiv erachtet. Die prozentuale Regeneration wurde kalkuliert durch Vergleich der verletzten Nuklei mit den contralateralen (nicht verletzten) Nuklei innerhalb desselben Tiers. Für jedes Tier wurde der Verletzungsgrad bestimmt. Ausgefüllte Balken, experimentell; offene Balken, zusammengefasste Kontrollgruppen.
10 zeigt eine quantitative Bestimmung der Regeneration der deszendierenden Hirnstamm-Spinalaxone nach chronischer lateraler Hemisektion und verzögerter immunologischer Behandlung. Prozentualer Anteil der Retrograd-markierten roten Nuklei (rot) und lateraler vestibulärer Neuronen (grün) gegen contralateral nicht verletzte, nach Kontrolle (PBS, Ab, GpC) Behandlung (offene Balken) oder immunologische Disruption/Demyelinierung (ausgefüllte Balken). Ausgedrückt als prozentualer Anteil markierter Zellen in den verletzten Nuklei gegen unverletzte contralaterale. Die folgenden Ausdrücke und Abkürzungen werden durch die ganze Beschreibung hindurch und in den Ansprüchen verwendet:
Der Ausdruck „Antikörper oder Fragment davon" umfasst rekombinante, chimäre und affinitätsmodifizierte Formen hergestellt durch Techniken der Molekularbiologie, welche im Stand der Technik bekannt sind;
„ZNS" bezieht sich auf das zentrale Nervensystem;
der Ausdruck „Komplementprotein oder Fragment davon" (C) bezieht sich auf jegliches von 13 Gesamt-Serum-Protein oder jegliches von mehr als 20 Zwischenprodukten und Komplexen des Komplementsystems, den primären humoralen Mediator der Antigen-Antikörper Reaktion und umfasst Varianten, Analoga, und chemische Derivate davon;
der Ausdruck „Zusammensetzung" wird verwendet, um mehr als eine Komponente zu bezeichnen. Die Elemente der Zusammensetzung können vermischt werden, jedoch ist es nicht nötig, dass sie in der gleichen Lösung kombiniert werden. In einer alternativen Ausführungsform müssen sie nicht gepackt werden, aufbewahrt oder sogar zusammengemischt werden. Die Elemente (Antibody-Typ und Komplement-Typ) können zum Ort der Nervenzerstörung nacheinander oder zur gleichen Zeit geliefert werden. Das Bedürfnis nach einer therapeutisch effektiven zeitlichen Sequenz wird vom Fachmann verstanden. Das Konzept von mindestens einem Komplement-fixierenden Antikörper, oder Fragment davon plus zusätzlich eines Komplementproteins oder aktiven Fragments davon gleich dem Konzept der Zusammensetzung. Diese Elemente werden zum Ort der Verletzung verabreicht, um ein Komplex zu formen mit einem geeigneten Epitop, welches im Myelin vorhanden ist und schrittweise demyeliniert wird. Deshalb werden die beiden ersten Elementtypen (von denen mehr als ein Mitglied jedes Elementtyps, z. B. zwei oder mehr Antikörper oder Komponentenproteine oder Fragmente) zum Ort verabreicht werden, welcher für eine transiente Demyelinierung vorgesehen ist, um einen in sito Komplex zu formen, in vivo mit den Epitopen/Epitop auf dem Myelin.
Der Ausdruck „Demyelinierung" bezieht sich auf das Entfernen oder Zusammenbrechen des Myelins im neurologischen Gewebe. Demyelinierung besteht aus dem Entfernen der Myelinscheide, wie z. B. die umgebenden Neuronen oder neuronalen Projektionen (z. B. die Axone). Dieser Vorgang kann chemisch oder immunologisch sein sowohl im experimentellen als auch pathologischen Stadium. Diese Erfindung verursacht transiente Demyelinierung, um Reparatur und neues Wachstum zu verursachen.
Der Ausdruck „Disruption" bezieht sich auf die Delamination oder Disruption der dreidimensionalen Konformation des Myelins;
der Ausdruck „Disfunktion", wenn in Zusammenhang mit der Beschreibung der therapeutischen Verwendung der Erfindung verwendet, umfasst jeglichen Traumatyp des Nervensystems und daraus resultierenden Funktionsverlust. Solche Traumata können verursacht werden durch physische Verletzung oder Krankheit;
der Ausdruck „Fab" bedeutet ein Antikörper-Fragment, welches erhalten wird durch Spaltung eines Antikörpers in der Scharnierregion, was die Verursachung zweier Fab-Fragmente nach sich zieht, wobei jedes die schwere und leichte Kettendomäne des Antikörpers enthält und auch die Fc-Region;
der Ausdruck „Fc" bedeutet die konstante Region des Antikörpers, welche Komplement aktivieren kann;
der Ausdruck „Fv-Fragment" bedeutet ein Heterodimer aus schwerer und leichter variabler Kettendomäne eines Antikörpers. Diese variablen Domänen können durch Peptidlinker zusammengefasst werden oder durch künstlich hergestellte Disulfidbrücken;
Wachstumsfaktoren sind extrazelluläre Polypeptid-Signalmoleküle, welche eine Zelle zum Wachstum oder zur Proliferation stimulieren. Beispiele sind epidermale Wachstumsfaktoren (EGF) und Blutplättchen-abgeleitete Wachstumsfaktoren (PDGF). Die meisten Wachstumsfaktoren besitzen andere Wirkungen neben der Induktion des Zellwachstums oder der Proliferation. Wachstumsfaktoren können eingeteilt werden in breite und enge Spezifitätsklassen. Die Wachstumsfaktoren breiter Spezifitätsklasse, wie z. B. PDGF betreffen jegliche Zellart. Das andere Extrem sind Faktoren mit enger Spezifität. In intakten Tieren hängt die Proliferation von mot-Zellen von spezifischen Kombinationen von Wachstumsfaktoren ab und weniger von einzelnen Wachstumsfaktoren. Eine relativ geringe Anzahl von Wachstumsfaktoren-Familien kann daher, in verschiedenen Kombinationen, dazu dienen, die Proliferation jeglicher der vielen Zelltypen eines höheren Tieres selektiv zu regulieren.
Fibroblasten-Wachstumsfaktor (FGF) bezieht sich auf jegliche Gruppe von Proteinen, normalerweise intrazellulär, die eine wichtige angiogenische Funktion haben und die Wundheilung und Gewebereparatur verstärken. Eine zu hohe Aktivität dieser Faktoren wurde mit Neoplasien in Verbindung gebracht.
Neurotrophe Faktoren sind eine Familie von Substanzen, welche Wachstum und Regeneration von Neuronen unterstützen. Während Wachstumsfaktoren in anderen Bereichen des Körpers Zellteilung fördern und unterstützen, können Neuronen sich nicht teilen; aber sie können nach Verletzung regenerieren und neurotrophe Faktoren fördern diese Regeneration. Des weiteren wird auch das Axon- und Dendritenwachstum gefördert, wobei die Dendriten neuronale Verzweigungen darstellen, welche Verbindungen mit anderen Neuronen darstellen.
„GalC" bezieht sich auf Galactocerebroside;
„MAG" bezieht sich auf Myelin-assoziiertes Glycoprotein;
„MBP" bezieht sich auf Myelin-basisches Protein;
„MOG" bezieht sich auf Myelin-oligodendrozytisches Glycoprotein;
der Ausdruck „neurologisches Gewebe" bezieht sich auf Neuronen und andere Zellen, welche sich üblicherweise in der Region des Nervensystems befinden, wie z. B. des ZNS;
„PNS" bezieht sich auf das periphere Nervensystem;
der Ausdruck „rekombinanter Antikörper oder Fragmente davon" umfasst chimäre oder rekombinante Formen der Antikörper oder Fragmente davon, wobei die Fc-Domäne substituiert ist durch eine Fc-Domäne einer anderen Art oder Isotyp, affinitätsmodifizierte Formen der Antikörper oder Fragmente davon, wobei die Bindungsstellen geändert sind, aviditätsmodifizierte Formen der Antikörper oder Fragmente davon, wobei die Scharnierregionen geändert sind, immunreaktive Fragmente davon, und Kombinationen davon; und
der Ausdruck „Regeneration von neurologischem Gewebe" umfasst das neue Wachstum von Neuronen, welche in der neuen Formierung von neuronalen Verbindungen resultieren, sowohl anatomischer und/oder funktioneller Natur.
Die Erfindung basiert auf der unerwarteten Entdeckung, dass eine Kombination von Antikörpern, welche an Epitope von Myelin-produzierenden Glia-Zellen binden, als auch Komplement verwendet werden können zur Disruption und Demyelinierung der Myelinscheide, dergestalt, dass Reparatur und Regeneration des Säugerneurologischen Gewebes verstärkt wird. Die Zusammensetzung dieser Erfindung kann verwendet werden als ein Therapeutikum in Fällen, in denen Verletzung oder Krankheit des Säugernervensystems vorhanden ist, dergestalt, dass ein Bedürfnis der Vereinfachung der neuronalen Plastizität und des neuen Wachstums von neuronalen Verbindungen gegeben ist. Das neurologische Gewebe wird der Myelinzerstörenden erfindungsgemäßen Zusammensetzung ausgesetzt so schnell als möglich nach Auftauchen der Verletzung, des Traumas oder der Krankheit. Eine Beschreibung des Protokolls, um ein transiente Demyelinierung auszuführen, wurde in Kierstead and Blakemore, 1997, J. Neuropath. Expt. Neurol. 56 1191–1201; Kierstead et al., 1998, Glia. 22 161–170 beschrieben.
Die Erfindung stellt Mittel zur Verfügung zur Förderung der Regeneration neurologischen Gewebes in einem Säuger, wie z. B. dem Menschen, mit einer Nervensystem-Disfunktion durch Kontaktieren des neurologischen Gewebes mit einer therapeutisch wirksamen Menge einer Zusammensetzung umfassend ein Komplement-fixierenden Antikörper, welcher Myelin bindet, und Komplement. Die Zusammensetzung der Erfindung kann auch verwendet werden im Bereich der Tiermedizin.
Die Zusammensetzungen der Erfindung umfassen einen oder mehrere Antikörper oder Fragmente davon, welche Myelin binden und einen oder mehrere Seumkomplementproteine oder Fragmente davon.
Antikörper
Die Antikörper der Erfindung können jegliche Antikörper oder Fragmente davon sein, welche spezifisch an Myelin binden, wobei die Antikörper das Komplementsystem aktivieren. Bevorzugte Antikörper der Erfindung binden spezifisch an die Myelinscheiden-Epitope, wie z. B. Galactocerebroside (GalC), O4, Myelin Oligodendrozyt Glycoprotein (MOG), oder Myelin-assoziierte Glycoproteine (MAG). Andere bevorzugte Epitope sind NOGO (früher NI 35/250) und NI220 und Arretin.
Herstellung der Antikörper
Die Antikörper der Erfindung oder Fragmente davon können sein:

a) natürlich vorkommende;
b) Antikörper, welche aus Krankheitszuständen erhalten wurden, wie z. B. B-Zellen von Multiple Sklerose-Patienten;
b) hergestellt durch rekombinante DNA-Technologie
c) hergestellt durch biochemische oder enzymatische Fragmentierung größerer Moleküle;
d) hergestellt durch Verfahren resultierend aus einer Kombination aus a) bis c); oder
e) hergestellt durch irgendein anderes Mittel der Herstellung von Antikörpern.

Humane Antikörper können hergestellt werden durch eine Vielzahl von Techniken, welche dem Fachmann bekannt sind, umfassend die Verwendung von Insektenzellen und transgenen Pflanzen, wie z. B. Tabak oder Getreidesamen (Cramer, CL. CropTech Development Corp; Reno. J., NeoRx-IVC'sIV Annual Conference: Sept9–12, S. F., USA).
Die Antikörper der Erfindung können auch durch traditionelle Techniken hergestellt werden, wie z. B. monoklonale oder polyklonale Techniken, auch wenn monoklonale Antikörper bevorzugt sind. Im Allgemeinen können Antikörper erhalten werden durch Injektion des gewünschten Immunogens in eine große Vielzahl von Wirbeltieren oder Wirbellosen unter Verwendung konventioneller Techniken. Während Nagetiere, insbesondere Mäuse, bevorzugt sind, können auch andere Arten verwendet werden, wie z. B. Mitglieder aus Rinder-, Schaf-, Pferd-, Schwein- oder Geflügelfamilien. Immunisierung dieser Tiere kann problemlos ausgeführt werden und ihre Lymphozyten, im Spezifischen Splenozyten, können erhalten werden mit Hilfe von Fusionen.
Immunisierungsprotokolle sind gut bekannt und bleiben effizient, auch wenn sie stark variieren (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice 2nd edition Academic Press, 1986). Isolierte Proteine, synthetische Peptide, und bakterielle Fusionsproteine, welche Antigenfragmente der Myelinmoleküle enthalten, können als Immunogene verwendet werden. Vorzugsweise werden die Immunogene von Peptiden oder rekombinanten Proteinen angereichert mit Proteinen oder Fragmenten davon, welche die Epitope gegen die gewünschten Antikörperproduzierenden B-Zellen oder Splenozyten enthalten.
Nach Aufreinigung der Proteine oder davon abgeleiteter Peptide zum gewünschten Aufreinigungsgrad, können sie suspendiert oder aufgelöst werden in einem passenden physiologischen Träger, oder können gekoppelt werden an ein Adjuvants. Immunogenische Mengen von Antigen-Präparationen angereichert in Myelin, oder antigene Teile davon werden normalerweise in Konzentrationsbereichen von 1 μg bis 100 mg/kg pro Wirt injiziert. Verabreichung kann geschehen durch Injektion, wie z. B. intramuskulär, peritoneal, subkutan oder intravenös.
Verabreichung kann einmal oder mehrfach geschehen, normalerweise in ein bis vier Wochen Intervallen.
Immunisierte Tiere werden überprüft auf Produktion von Antikörpern gegen das gewünschte Antigen, die Milz wird entfernt und Milz-B-Lymphozyten werden isoliert und fusioniert mit einer Myeloma-Zelllinie oder transformiert. Die B-Lymphozyten können auch aus dem Blut isoliert werden. Die Transformation oder Fusion kann ausgeführt werden nach konventionellen Methoden, die Fusionstechnik wird beschrieben in vielen Patenten, wie z. B. US-Patent-Nr. 4,172,124; 4,350,683; 4,363,799; 4,381,292; und 4,423,147. Das Verfahren der Immortalisierung ist nicht wesentlich, jedoch wird die am häufigsten verwendete Methode die Fusion mit einem Myeloma Fusionspartner sein. Andere Techniken der Immortalisierung umfassen EBV-Transformationen, Transformationen mit nackter DNA, wie z. B. Oncogenen oder Retroviren, oder jegliches andere Verfahren, welches stabile Aufrechterhaltung der Zelllinie und Herstellung von monoklonalen Antikörpern verursacht. Das allgemeine Verfahren zur Herstellung von monoklonalen Antikörpern wurde beschrieben (Köhler und Milstein 1975 Nature 256: 495–497). Humane monoklonale Antikörper können erhalten werden durch Fusion der Milzzellen mit passenden humanen Fusionspartnern, wie z. B. WI-L2, beschrieben in der europäischen Patentanmeldung 82.301103.6. Eine ausführliche Beschreibung der Technik zur Herstellung von Maus-X-Maus monoklonalen Antikörpern wurde offenbart (Oi and Herzenberg 1980 in Mishell and Shiigi eds Selected Methods in Cellular Immunology 351–372). Die daraus resultierten Hybridoma werden gescheent, um individuelle Klone zu isolieren, wobei jeglicher Klon eine einzige Antikörperart gegen das Antigen sekretiert.
Die immortalisierten Zelllinien können mittels konventioneller Techniken kloniert und gescheent werden, und Antikörper in den Zellüberständen nachgewiesen werden die zur Bindung an Myelin befähigt sind. Geeignete immortalisierte Zelllinien können dann in vitro gezüchtet werden oder in die Peritonialhöhle eines geeigneten Wirts zur Herstellung von Bauchwasserflüssigkeit injiziert werden. Immortalisierte Hybridomzelllinien können leicht aus einer Vielzahl von Quellen hergestellt werden. Alternativ können diese Zelllinien an anderen neoplastische B-Zellen fusioniert sein, wobei solche anderen B-Zellen als Empfänger für genomische DNA, die für Antikörper kodiert, dienen.
Die von den transformierten oder Hybridoma-Zelllinien segregierten monoklonalen Antikörper können einer beliebigen Klasse oder Subklasse von Immunglobulinen angehören, wie IgM, IgD, IgA, IgG_1-4, oder IgE. Da IgG der am häufigsten benutzte Isotyp für diagnostische Tests ist, wird er meistens bevorzugt.
Um die mögliche Antigenizität des monoklonalen Antikörpers in einem menschlichen Wirt, der von einem Tier (nicht Mensch) erhalten wurde zu umgehen, können chimere Antikörper konstruiert werden. Z. B das antigenbindende Fragment eines Immunglobulinmoleküls (variable Region) kann über Peptidbindung mit mindestens einem Teil eines anderen Proteins das von den Menschen nicht als fremd erkannt wird, verbunden sein, wie die konstante Region eines menschlichen Immunglobulinmoleküls. Das kann durchgeführt werden indem Exons der variablen Region von Tieren mit Exons der kappa oder gamma konstanten Region des Menschen fusioniert werden. Verschiedene Techniken sind dem Fachmann bekannt, wie die in PCT 86/01533, EP171496 und EP173494 beschriebenen. Als alternative Methode zur Herstellung von Antikörpern beschreibt das US Patent Nr. 5627052 ein Methode zur Herstellung von Proteinen, die die Bindungscharakteristika oder die gewünschte Funktion von speziellen Antikörpern replizieren. Ein Beispiel einer Anwendung dieser Methode schließt die Isolierung und Charakterisierung einer menschlichen B-Lymphozyten Zelle ein, die einen spezifischen anti-Myelin-Antikörper herstellt, z. B. aus dem Blut eines Patienten mit multipler Sklerose.
Antikörper Konstruktion
Die Antikörper können intakt oder als Fragmente wie Fv, Fab, und F(ab')₂ verwendet werden solange eine Fc Region, die das Komplement bindet, vorhanden ist. Solche Antikörperfragmente liefern bessere Diffusionseigenschaften in vivo als der gesamte Antikörper aufgrund ihrer kleineren Größe. Die Mittel zur Konstruktion von Antikörpern durch DNA-Rekombinationstechniken und chemische Modifikationsmethoden werden als dem Fachmann bekannt betrachtet.
Die Antikörper können fragmentiert sein um hoch immunoreaktive F(ab')₂ , F(ab') und Fab Fragmente zu erhalten unter Verwendung des Enzyms Pepsin mit Hilfe in der Technik gut bekannter Methoden (siehe Colcher et al., (1983) Cancer Res. 43: 736–742).
Aufgrund der Entwicklung von molekularen Klonierungstechniken, ist es jetzt möglich menschliche monoklonale Antikörperfragmente schnell mittels „Panning-Phage-Display" – „Bibliotheken" gegen vordefinierte Antigen-Spezifitäten herzustellen. Z. B. Techniken (siehe Pistillo et al., Human Immunology, 57(1): 19–26, 1997 Sep 15).
Antikörper oder Fragmente davon können auch in rekombinanten Formen mittels molekularbiologischer Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden (siehe Rice et al., (1982) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 7862–7865, Kurokawa et al., (1983) Nucleic Acids Res. 11: 3077–3085; Oi et al., (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 825–829; Boss et al., (1984) Nucleic Acid Res. 12: 3791– 3806; Boulianne et al., (1984) Nature (London) 312: 643–646; Cabily et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 3273–3277; Kenten et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 2955–2959; Liu et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 5369–5373; Morrison et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 6851–6855; Neuberger et al., (1984) Nature (London) 312: 604–608; Potter et al., (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 7167–7165; Neuberger et al., (1985) Nature (London) 314: 268–270; Jones et al., (1986) Nature (London) 321: 522 ; Oi et al., (1986) Bio Techniques 4: 214– 221; Shagan et al., (1986) J. Immunol. 137: 1066–1074 ; Sun et al., (1986) Hybridoma 5 (Supp. 1): S17–S20 ; and Sun et al., (1987) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 214–218).
Antikörper oder Fragmente davon können spezifischer in die chimere Form umgewandelt werden indem Antikörperfragmente durch andere Arten ersetzt werden, z. B. menschliche konstante Regionen (Fc-Domänen) durch Mauskonstante Regionen, mittels der in den oben zitierten Referenzen beschriebenen, dem Fachmann bekannten DNA-Rekombinationstechniken. Diese Fc-Domänen können von verschiedenen menschlichen Isotypen sein, z. B. IgG₁, IgG₂, IgG₃, IgG₄, oder IgM.
Darüberhinaus können die Antikörper oder deren Fragmente vorverändert sein dass sie eine in der Affinität modifizierte Form, in der Avidität modifizierte Form, oder beides haben, durch Verändern der Bindungsstelle oder der Hinge Region mittels DNA-Rekombinationstechniken die dem Fachmann bekannt sind, wie die in den oben zitierten Referenzen beschriebenen.
Die rekombinanten Antikörperformen können auch fragmentiert sein um immunoreaktive Fragmente F(ab')₂, F(ab'), und Fab in der gleichen Art und Weise wie beschrieben herzustellen.
Antikörperfragmente können auch Fv-Fragmente einschließen, die kleinsten funktionellen Moleküle der Antikörper die erforderlich sind um die Bindung und die Spezifität des gesamten Antikörpers aufrecht zu erhalten. Fv Fragmente sind Heterodimere zusammengesetzt aus der variablen Domäne der schweren Kette und einer variablen Domäne der leichten Kette. Proteolytischer Verdau von Antikörpern kann zu isolierten Fv Fragmenten führen, jedoch eine bevorzugte Methode um Fv Fragmente zu erhalten ist durch Rekombinationstechnologien (siehe Skerra und Pluckthun (1988) Science 240. 1038–1041)
Fv-Fragmente (Fvs) können nicht kovalent assoziierte V_H und V_L Domänen sein, obwohl diese dazu tendieren voneinander zu disoziieren. Stabile Fvs können hergestellt werden in dem rekombinierte Moleküle hergestellt werden in denen V_H und V_L Domänen über einen Peptidlinker verbunden sind, so dass die antigenverbindende Stelle in einem einzelnen Protein neu gebildet wird. Diese rekombinanten Moleküle werden als Einzelketten-Fvs(scFvs) bezeichnet. Die Mittel zur Herstellung von scFvs sind dem Fachmann bekannt (siehe Raag und Whitlow (1995) FASEB 9: 73; Bird et al., (1988) Science 242: 423–426; Houston et al., (1998) Proc. Natl. Acad. Sci USA 85: 5879–5883). Alternativ können zwei variable Domänen und durch eine konstruierte Disulfidbindung verbunden und stabilisiert sein; diese werden als Fvs (dsFvs) bezeichnet (siehe Reiter und Pastan (1996) Clin. Cancer Res. 2: 245–252).
Die Fc Domäne eines Antikörpers ist erforderlich zur Aktivierung des Komplements. Fv Fragmente, denen die Fc Domäne fehlt können das Komplement nicht aktivieren. Damit Fv Fragmente für die vorliegende Erfindung geeignet sind müssten sie mit einem neuen Aktivator für die Komplementkaskade konstruierte sein. Als ein Beispiel könnte das Fv Fragment so konstruiert sein, dass die C_H2-Domäne einen IgG Antikörper einschließt. Als alternatives Beispiel kann ein vollständig synthetisches Molekül an ein Fv Fragment gebunden sein um das Komplement zu aktivieren oder einen Aktivator des Komplements der ähnlich ist wie die in dem Gebiet kann an das Fv Fragment gebunden sein.
Der Antikörpern kann auch durch Zusatz eines Moleküls wie Polyethylenglycol modifiziert sein (wie beschrieben im US Patent 5766897) um die biologische Halbwertszeit, Wirksamkeit oder die Diffusion des Moleküls in situ zu verlängern (siehe US Patent 5747446. Chinol et al., 98 Brit. J. Cancer, 78: 189–197; Francis et al., 98, Intl J. Hematol. 68: 1–18).
Markierung der Antikörper oder Fragmente
Die Antikörper dieser Erfindung oder deren Fragmente können ohne Modifikation verwendet werden oder können in einer Vielzahl von Art und Weisen modifiziert sein, z. B. durch Markierung. Markierung soll so verstanden werden, dass das Verbinden entweder kovalent oder nicht kovalent mit einer Markierung erfolgt, die direkt oder indirekt den Nachweis des Antikörpers ermöglicht um den Verlaufs der therapeutischen Behandlung unter Verwendung der Zusammensetzung aufzuzeichnen.
Eine Markierung kann jegliches Material umfassen, das eine nachweisbare chemische oder physikalische Eigenschaft besitzt. Eine große Vielzahl von Markierungen sind bekannt, einschließlich Radionuklide, Enzyme, Enzymsubstrate, Enzym-Cofaktoren, Enzym-Inhibitoren, Liganden (besonders Hapten), Fluorophore, Chromophore Luminophore und magnetische Partikel. Diese Markierungen sind nachweisbar auf der Basis entweder ihrer eigenen physikalischen Eigenschaften (Fluorophore, Chromophore oder Radioisotope), oder ihre Reaktivität oder Bindungseigenschaften (z. B. Enzyme, Substrate, Cofaktoren und Inhibitoren). Diese Materialien sind dem Fachmann gut bekannt. US Patent 4,671,958 lehrt Verfahren die zur Markierung von Antikörpern oder um ein Komplement an Antikörper zu binden, verwendet werden können.
Komplement
Der Komplementanteil der Zusammensetzung kann von einem oder mehreren Komplementproteinen, – fragmenten, – varianten, – analogen und oder chemischen Derivaten umfasst sein.
Ein Fragment eines Komplementproteins betrifft jegliche Untereinheit eines C-Moleküls. z. B. Fragmente von C3 schließen C3b, iC3b, C3a, C3c, c3dg und C3d ein.
Eine „Variante" eines Komplementproteins oder Fragments davon betrifft ein Molekül, das im wesentlichen ähnlich ist entweder wie das gesamte Protein oder ein Fragment davon, das eine biologische Aktivität besitzt, die im wesentlichen ähnlich ist wie die biologische Aktivität des Komplementsproteins oder dessen Fragments.
Ein Molekül wird als „im Wesentlichen" ähnlich zu einem anderen Molekül bezeichnet wenn beide Moleküle eine im wesentlichen ähnliche Struktur haben oder wenn beide Moleküle eine ähnliche biologische Aktivität besitzen.
Varianten von C3b schließen z. B. C3b-Dimere oder höhere Oligomere ein. Wenn C Aktivierung auf der Zelloberfläche auftritt, führen mehrere Zyklen von Enzymreaktionen zu einer Abscheidung von C3b in der multimeren Form auf der Oberfläche. C3b Dimere oder höhere Oligomere haben tatsächlich eine höhere Affinität für die Zellen als C3b Monomere.
Varianten des Komplementproteins oder Fragmente davon werden durch chemische oder rekombinante Mittel hergestellt, die in der Fachwelt bekannt sind hergestellt. Solche Varianten schließen z. B. Deletionen oder Insertionen oder Substitutionen von Aminosäureresten innerhalb der Aminosäuresequenz ein. Z. B., mindestens ein Aminosäurerest kann entfernt sein und ein unterschiedlicher Rest kann an dessen Platz eingefügt sein. Substantielle Änderungen der Funktion oder der immunologischen Eigenschaften werden durch Auswahl von Substitutionen gemacht die weniger konservativ sind, d. h. die sich stärker in ihrer Wirkung unterseiden, bei der Aufrechterhaltung (einer der Struktur des Peptidrückgrats im Bereich der Substitution, z. B., als Faltblatt oder helikaler Konformation, (b) der Änderung der Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle, oder (c) der Größe der Seitenkette. Die Substitutionen die normalerweise erwarten lassen, dass sie größeren Veränderungen HERVORRUFEN sind diejenigen, bei denen (a) Glycin und/oder Prolin durch eine anderen Aminosäure substituiert oder deletiert oder eingefügt wurde; (b) ein hydrophiler Rest z. B Seryl oder Threonyl durch einen hydrophoben Rest, z. B. Leucyl, Isoleucyl, Phenylalanyl, Valyl oder Analyl substituiert wurde; (c) ein Zysteinrest durch einen anderen Rest substituiert wurde (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette z. B. Lysyl, Arginyl oder Histydyl durch einen Rest der eine elektronegative Ladung hat, z.B Glutamyl oder Aspartyl substituiert wurde; oder (e) ein Rest mit einer großen Seitenkette, e. g. Phanylalanin, durch einen Rest der keine Seitenkette hat, e. g. Glycin substituiert wurde.
Die meisten Deletionen, Insertionen und Substitutionen lassen keine radikalen Änderungen der Eigenschaften des Proteinmoleküls erwarten. Jedoch, wenn es schwierig ist die exakte Wirkung der Substitution, Deletion oder Insertion vor der Durchführung vorauszusagen, wird der Fachmann es zu schätzen wissen, dass die Wirkung mittels Routine Screening Tests bewertet wird. z. B. eine Veränderung des immunologischen Charakters des Proteinmoleküls, wie die Bindung eines bestimmten Antikörper wird durch einen Immunoassay wie den Immunoassay eines kompetitiven Typs gemessen.
Ein „Analog" eines Komplementproteins oder eines Fragments davon betrifft ein nicht natürliches Molekül das im Wesentlichen zu dem gesamten Protein oder eines Fragments davon ähnlich ist.
Ein „chemisches Derivat" eines Komplementproteins oder eines Fragments davon enthält zusätzliche chemische Reste die normalerweise nicht Teil des Proteins oder Fragments sind. Kovalente Modifikationen des Peptides sind im Rahmen dieser Erfindung eingeschlossen. Solche Modifikationen können in das Molekül eingefügt werden durch Reagieren des Ziel-Aminosäurerestes des Peptids mit einem organisch derivatisierenden Agens, das fähig ist mit ausgewählten Seitenketten oder dem endständigen Rest zu reagieren, wie es in der Fachwelt wohl bekannt ist (siehe E. Creighton Proteins: Structure and Molecule Properties (San Francisco W H Freeman, 1983) S. 70–86).
Der Komplementanteil der Zusammensetzung kann eine Komponente sein, die sich von der Antikörperkomponente physikalisch unterscheidet. Alternativ können die Komplementproteine oder Fragmente davon kovalent oder nicht kovalent direkt an die Antikörperkomponente gebunden sein, so dass die Bindung des Antikörpers auf der Oberfläche des Myelins den endogenen Immunsystemangriff auslöst.
Die Komplement-Komponenten können Fraktionen sein, die gereinigt wurden oder in denen die Proteine, die das Komplementsystem umfassen, angereichert wurden. Solche Präparationen sollten die relativ große Labilität des Komplements berücksichtigen und eine ausreichende Kombination von Faktoren vorsehen, um eine vollständige Aktivierung der Komplement-Kaskade zu ermöglichen, damit transiente Demyelinisierung eintreten kann.
Der Komplementteil der Zusammensetzung kann ein oder mehrere Komplementproteine, -fagmente, -varianten, -analoga, und/oder chemische Derivate umfassen. Es ist jedoch zu beachten, dass die C3-Komponente des Komplements entweder in der Opsonisierung oder in der Ausbreitung der Kaskade zu lytischem MAC eine fundamentale Rolle spielt. In einer bevorzugten Ausführungsform sollte die C3-Komponente oder ein Fragment, eine Variante, ein Analogon oder ein chemisches Derivat davon im Komplementteil der Zusammensetzung enthalten sein. In Situationen, die Demyelinisierung bedingen, sollte die C3-Komponente in jedem Fall vorhanden sein, um optimale Ergebnisse zu erreichen. In Situationen, die eine Regeneration bedingen, ist diese Komponente mit geringerer Gewißheit notwendig.
Der Komplementteil der Zusammensetzung kann aus dem eigenen Serum eines Patienten oder aus dem Serum eines Spenders oder aus den zusammengefassten Sera einer Reihe von Spendern, wie jenen welche käuflich zu erwerben sind und welche nach beständigen, anerkannten Standards produziert werden, gewonnen werden.
Die Komplementkomponenten können aus Arten, die sich von den Arten unterscheiden, denen sie verabreicht werden, gewonnen werden, da die Zusammensetzungen direkt in das Nervengewebe eingeführt werden (z. B. intrathecal).
Andere Faktoren
Die Zusammensetzung kann optional andere Chemikalien oder Arzneimittel enthalten, wie etwa Wachstumsfaktoren und Neurotrophine. Es ist bekannt, dass die nützlichen Effekte von blockierenden ZNS-Myelin-assoziierten Inhibitoren auf die axonale Regeneration durch die gleichzeitige Verabreichung von Neurotrophinen wie etwa NT-3 (Bregman et al., (1995) Nature 378: 498–501; Schnell et al., (1994) Nature 367: 170–173) verstärkt werden können. FGF-1 kann ebenfalls verwendet werden (Chang et al., 1996, siehe oben).
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung GalC-spezifische monoklonale Antikörper und menschliches Serumkomplement.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung MOG-spezifische monoklonale Antikörper und menschliches Serum-Komplement.
Verwendungen
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können benutzt werden um das Nachwachsen, die Reparatur und/oder die Regeneration von Neuronen im ZNS eines Patienten zu fördern, indem transiente immunologische Zerstörungen von Myelin oder transiente Demyelinisierung von Axonen stimuliert werden. Der transiente Demyelinisierungsprozess der vorliegenden Erfindung vollzieht sich vorzugsweise im ZNS, noch bevorzugter im Rückenmark.
Der Patient kann ein beliebiges Säugetier sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Patient ein Mensch.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können verwendet werden, um das Nachwachsen, die Reparatur und/oder die Regeneration von dysfunktionellen Neuronen im ZNS, die durch Verletzungen wie z. B. Rückenmarksverletzungen geschädigt wurden, zu fördern. Das Verfahren kann nach unmittelbaren oder chronischen Verletzungen verwendet werden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um das Nachwachsen, die Reparatur und/oder die Regeneration von dysfunktionellen Neuronen im ZNS zu fördern, die durch eine Krankheit wie etwa eine degenerative Krankheite, einschließlich Alzheimer und Parkinson, geschädigt wurden.
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können ebenfalls verwendet werden, um ein Milieum Säugetier-ZNS zu erzeugen, das für das Wachstum von transplantierten Zellen relativ permissiv ist. Wenn beispielsweise PNS-Zellen an eine Stelle im ZNS transplantiert werden, die beschädigt wurde, können die Axone in der Lage sein in das transplantierte Gewebe hineinwachsen, aber sie können aufgrund der inhibitorischen Effekte des Myelins nicht aus diesem Gewebe heraus in das ZNS zurückwachsen. Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung können zurr Zerstörung des Myelins im ZNS verwendet werden, um die Ausdehnung der Axone in diese Bereiche zu ermöglichen.
Präparationen und Verabreichung
Die Verfahren zum Gebrauch der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung umfassen die Verabreichung einer therapeutisch wirksamen Menge einer solchen Zusammensetzung an einen Patienten. Der hierbei verwendete Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge" bezieht sich auf eine Menge der Zusammensetzung, die ausreichend ist, um wirksam und transient das ZNS zu zerstören oder zu demyelisieren, so dass die Reparatur und die Regeneration des neurologischen Gewebes und der neuronalen Verbindungen verstärkt wird. Allgemein wird die therapeutische Zusammensetzung verabreicht in einem Bereich zwischen etwa 0,03 mg und etwa 0,6 mg Antikörper in einer 20–30%igen Komplementlösung pro kg Körpergewicht. Vorzugsweise erstreckt sich der Bereich von 0,05 mg bis 0,4 mg Antikörper in einer 20–30%igen Komplementlösung pro kg Körpergewicht. In der am meisten bevorzugten Form erstreckt sich der Bereich von 0,1 mg bis 0,3 mg Antikörper in einer 20–30%igen Komplementlösung pro kg Körpergewicht. Das exakte Verhältnis von Antikörper zu Komplement wird in Abhängigkeit von den Umständen variieren; da allerdings die Menge an aktiviertem Komplement direkt proportional zur Anzahl gebundener Antikörpermoleküle ist, ist es möglich, relative hohe Konzentrationen an Komplement, die über die relativen Konzentrationen des Antikörpers hinausreichen, zu verabreichen. Zusätzlich ändert sich die spezifische Konzentration des verabreichten Antikörpers mit der spezifischen Dysfunktion und ihrem Schweregrad, ebenso wie mit dem Alter, dem Geschlecht und der medizinischen Vorgeschichte des Patienten. Der klinische Fachmann wird solche Faktoren kennen und wissen, wie die Dosierungsbereiche der Zusammensetzung entsprechend angepasst werden.
Die Mehrzahl der Rückenmarksverletzungen resultiert aus einer Beschädigung der Wirbelsäule, die das Rückenmark umgibt. Diese Beschädigung schließt Frakturen, Verrenkungen oder beides ein. Ein Großteil der Beschädigungen des Rückenmarks ist zurückzuführen auf sekundäre Phänomene, die sich innerhalb von Stunden nach der Verletzung ereignen. An diesem Punkt kann die resultierende Beschädigung reversibel sein; ein kritischer Faktor für die wiederherstellbare ZNS-Funktion ist daher die Zeit, die zwischen der Verletzung und dem Beginn der Therapie verstrichen ist. Am bevorzugtesten wird die Verabreichung der Zusammensetzung an einen Patienten im Falle einer Dysfunktion des Nervensystems als Resultat einer Verletzung so bald wie möglich nach der Verletzung durchgeführt.
Eine der Verwendung der Erfindung gemäße Zusammensetzung kann einem Patienten parenteral durch Injektion oder durch graduelle Infusion über die Zeit verabreicht werden. Zum Beispiel kann die Zusammensetzung intrathecal verabreicht oder direkt in das Rückmark injiziert werden.
Präparationen für eine parenterale Verabreichung sind in einem verträglichen Arzneimittelträger enthalten, mit den Komponenten der Zusammensetzung wie auch mit dem Patienten kompatibel ist. Solche Träger enthalten sterile wäßrige oder nicht wäßrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht wäßrige Lösungsmittel umfassen Propylenglykol, Polyethylenglykol, metabolisierbare Öle, wie etwa Olivenöl oder Squalan und injizierbare organische Ester, wie etwa Ethyloleat. Wäßrige Träger umfassen Wasser, alkoholisch/wäßrige Lösungen und Emulsionen oder Suspensionen, welche Salinen und gepufferte Medien umfassen. Parenterale Träger umfassen eine NaCl-Lösung, Ringers Dextrose, Dextrose und NaCl, laktiertes Ringer-Reagenz oder fixierte Öle. Konservierungsmittel und andere Zusatzstoffe können ebenfalls enthalten sein, wie etwa zum Beispiel antimikrobielle, antioxidierende, chelatierende Reagenzien und inerte Gase oder ähnliches. Ein bevorzugter Träger ist künstliche, zerebrospirale Flüssigkeit.
Kit
Die Materialien, die benutzt werden, um die Erfindung auszuführen, sind ideal geeignet für die Präparation eines Kit. Ein solcher Kit kann umfassen eine Trägereinheit, die kompartimentiert ist, um abgeschlossen nebeneinander einen oder mehrere Behältniseinheiten, wie etwa Phiolen, Röhren und ähnliches zu enthalten, wobei jede Behältniseinheit eines der separaten Elemente enthält, die im Verfahren benutzt werden. Zum Beispiel kann eine Behältniseinheit einen GalC-spezifischen Antikörper umfassen. Alternativ können die Bestandteile, wenn gewünscht, in flüssiger oder lyophylisierter Form enthalten sein. Nadeln und/oder andere Geräte, welche die Bereitstellung des Komplements und der Antikörper an der Stelle der Beschädigung ermöglichen, können umfassen:

(a) silastische Röhren, Polyethylenröhren, Tygonröhren (Norton Performance Plastik)
b) subkutane Pumpen (wie das Medtronic-Pumpensystem, das bekannt ist für die intrathecale Verabreichung von Baclofen);
c) spinale Nadeln für direkte intraspinale Verabreichung oder für kurzzeitige intrathecale Verabreichung.

Ein Beispiel für ein Verfahren, das einen solchen Kit verwendet, ist die Einführung einer 14er Tuohy-Nadel in den lumbaren, subarachnoiden Raum. Ein 5-F-Katheter wird coaxial platziert mit der Spitze an L10 und zur Flanke (oder einer entsprechenden Stelle) getunnelt. Diese Art der Instruktion würde von jemandem, der mit der Technik vertraut ist, verstanden. Der Schlauch wird intrathecal angeordnet und mit der Pumpe verbunden. Die Pumpe, die eine geringe Menge der Reagenzien enthält, wird unter der Haut platziert und kann mittels einer Nadel, die in das Septum der Pumpe eingeführt wird, in der Arztpraxis aufgefüllt werden. Alternativ kann die Infusaid-Pumpe verwendet werden.
Vorteile gegenüber den bisherigen Verfahren
Die Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung und ihre Verwendung zeigen eine Reihe von Vorteilen gegenüber den Verfahren für die Regeneration neuronalen Wachstums im ZNS, die gegenwärtig verfügbar sind.
Interventionstherapien, die Opiat-Antagonisten, Thyrotropin-freisetzende Hormone, lokale Marksabkühlung, Dextraninfusionen, adrenergische Blockierung, Corticosteroide und Überdruck-Sauerstoff umfassen, zielen darauf ab, sekundäre Entzündungsschäden nach traumatischen Verletzungen des Rückenmarks zu reduzieren, um die Ausbreitung der Schäden auf nicht-verletzte Neuronen zu verhindern. Im Gegensatz zur vorliegenden Erfindung fördern sie allerdings nicht die Regeneration der beschädigten Neuronen.
Die Transplantation periphärer Nerven und die Übertragung von Spenderzellen ins ZNS sind nützlich, da die Axone in sie hinein wachsen; die Axone können allerdings aufgrund inhibitorischen Myelins nicht aus ihnen heraus in das sie umgebende ZNS wachsen. Im Gegensatz dazu zerstört die vorliegende Erfindung das inhibitorische Myelin und erlaubt ein Nachwachsen der Neuronen im ZNS.
Die vorliegende Erfindung wird detaillierter in den folgenden, nicht limitierenden Beispielen beschrieben. Die nachfolgend beschriebenen Beispiele sind nicht so zu verstehen, dass sie den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung einschränken. Es wird davon ausgegangen, dass zahlreiche Varianten für den Fachmann auf dem Gebiet, zu dem die vorliegende Erfindung gehört, offensichtlich sind. Die beigefügten, geeignet aufgebauten Ansprüche bilden die einzige Beschränkung für den Umfang der vorliegenden Erfindung.
BEISPIEL 1
Regeneration von Hirnstamm-Spinal-Axonen
Das folgende Beispiel veranschaulicht, dass die transiente Unterdrückung der Entwicklung der Myelinisierung oder die Zerstörung von reifem Myelin durch lokale intraspinale Infusion von Serum-Komplement-Proteinen zusammen mit einem Komplement-fixierenden Myelin-spezifischen Antikörper die Regeneration von Hirnstamm-Spinal-Axonen nach spinaler Transsektion in einem Säugetier-Patienten unterstützt.
Materialien und Methoden:
Chirurgische Spinal-Transsektion und Transiente Immunologische Zerstörung des Myelin:
Zehn bis 12 Wochen alte erwachsene, weibliche Ratten (Sprague-Dawley), etwa 200 g schwer, wurden mit Ketamin/Xylazin (60 mg/kg bzw. 7,5 mg/kg) betäubt. Nach einer begrenzten dorsolateralen Laminectomie bei T10, wurde eine linksseitige Rückenmarks-Hemisektion mit einer Mikroschere vorgenommen. Das Ausmaß der Verletzung wurde anschließend durch das dreimalige Durchziehen eines scharfen Skalpells durch die Verletzung bestätigt (1A). Unmittelbar nach der Verletzung wurde eine intraspinale Kanüle bei T11 (n = 22 gesamt) implantiert und mit einer Alzet-osmotischen Pumpe verbunden (14 Tage), um eine intraspinale Infusion (bei 0,5 μl/Std) des Serumkomplements (GIBCO BRL Nr. 19195-015, 33% v/v) zusammen mit einem Komplement-fixierenden IgG-Antikörper für Galactozerebroside (entweder unser eigener polyclonaler Antikörper oder Chemicon Intl. Ltd. Nr. AB142, 25% v/v) kontinuierlich bereitzustellen. Kanülen wurden durch Dentalacryl, das auf die Wirbelknochen aufgebracht wurde, in ihrer Position gehalten. Muskelschichten wurden anschließend über das Dentalacryl genäht und das Oberflächengewebe und die Haut wurden verschlossen. Das Ausmaß der Hemisektion wurde am Ende der fünfwöchigen Behandlung und der Genesungszeit beständig histologisch bestätigt.
Alle Kontrolltiere erhielten eine identische Hemisektion und wurden dann mittels einer osmotischen Pumpe für dieselbe Zeitspanne entweder mit dem Träger allein (0,1 M Phosphat-gepufferte Salzlösung, PBS, n = 5), mit dem Antikörper allein (25% v/v, n = 2) oder dem Serum-Komplement allein (33% v/v, n = 6) intraspinal infundiert. Alle chirurgischen Eingriffe und anschließenden Tierschutz verfahren entsprechen den Bestimmungen des kanadischen Tierschutzausschusses und des Tierschutzausschusses der Universität von British Columbia.
Elektronenmikroskopie:
Gewebe für eine Ultrastruktur-Analyse wurde aus 10 bis 12 Wochen alten erwachsenen weiblichen Sprague-Dawley-Ratten gewonnen, welche 7 Tage nach der Infusion mittels einer osmotischen Pumpe von Serum-Komplement zusammen mit Komplement-fixierendem IgG-Antikörper für GalC (Details siehe oben) getötet wurden. Die Tiere wurden mit Ketamin/Xylazin (120 mg/kg bzw. 15 mg/kg) tödlich betäubt, anschließend intrakardial mit 200 ml 0,1 M PBS (pH 7,4), gefolgt von 100 ml 4% Glutaraldehyd in 0,1 M PB (pH 7,3) durchpumpt und anschließend in derselben Fixierungslösung über Nacht fixiert. Die Infusionsstelle und das umgebende Mark wurde in 1 mm Querblöcke geschnitten und weiterverarbeitet, um die rostral-kaudale Abfolge zu erhalten. Blöcke wurden in 0,1 M Na-Cacodylat-Puffer (für 24 h) gewaschen, in 2% OsO4 fixiert, durch aufsteigenden Alkohol dehydriert und gemäß Standardprotokollen in Spurns-Harz eingebettet. Gewebeblöcke der Versuchstiere und unbehandelter Kontrolltiere wurden parallel/analog verarbeitet. Dünne Schnitte (1 μm) wurden von jedem Block geschnitten, mit alkalischem Toludin-Blau gefärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht. Für die elektronenmikroskopische Untersuchung wurden die Blöcke zurechtgeschnitten und dann Sektionen von 80-100 nm herausgeschnitten, auf ein Kupfernetz verbracht, mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt und unter einem Zeiss EM 10C Elektronenmikroskop (bei 80 kV) untersucht.
Retrograde Neuronenmarkierung:
Wenn ein retrograder Indikator (Einzelmarkierung) in das rostrale Lumbarmark injiziert wird (1 cm caudal von der Verletzungsstelle), sollte er aufgenommen und zu den Ursprungszellkörpern sowohl über intakte Axone als auch über regenerierte Leitungen zurücktransportiert werden. Es ist deshalb entscheidend, dass der retrograde Indikator verläßlich und ausgiebig viele, wenn nicht alle, absteigenden spinalen Leitungsneuronen markiert. Ebenso bedeutsam ist es, dass der Indikator in einer kontrollierten und reproduzierbaren Art in einem Abstand injiziert wird, der ausreichend kaudal zur spinalen Verletzung liegt, um jede direkte Diffusion des Indikators bis zur Hemisektion zu vermeiden. Der retrograde Markierungsstoff, der diese Bedingungen am besten erfüllt, ist Fluorogold (Sahibzada, et al., (1987) Brain Res. 415, 242–256). Fluoreszierende Dextranamine wie etwa RDA benötigen eine vorhergehende axonale Verletzung um die axonale Aufnahme zu erleichtern (ermöglichen?) (Heimen und Zaborsky, Neuroanatomical Tract-tracing Methods 2: Recent Progress (New York: Plenum, 1989), und sind deshalb besser für den Gebrauch in retrograden Doppelmarkierungs-Nachweisstudien geeignet.
Einzelmarkierungsstudien:
28 Tage nach der Hemisektion und 14 Tage nach Beendigung der intraspinalen Infusion der immunologischen Reagenzien wurde jede erwachsene Ratte mit Ketamin/Xylazin (60 mg/kg) bzw. 7,5 mg/kg) betäubt, Fluorogold (FG, 100–150 nl Gesamtvolumen, 5% w/v in sterilem dH₂O; Fluorochome Inc., Eaglewood, CO, USA) wurde in einem Volumen von 50 bis 75 nl beidseitig in die Mitte des spinalen Gewebes auf Höhe von L1, etwa 1 cm caudal der Verletzungsstelle injiziert.
Die besondere Wirkung des Demyelinierungsprotokolls auf das Ausmaß der Diffusion von FG wurde auch bewertet. Ratten (n = 8) wurden wie oben beschrieben experimentell behandelt; es wurden jedoch nach 12, 24, 72 und 120 Stunden nach Injektion von FG in den L1-Markstrang Tiere getötet. Acht andere Ratten dienten als Kontrolle, wobei die Pumpe nur Träger enthielt, und wurden parallel zu den experimentell behandelten Tieren behandelt. Kryostatschnitte (25 μm dick) wurden für das Ausmaß der FG-Diffusion von jeder Injektionsstelle (1B) analysiert. Es gab zwischen den experimentell behandelten und als Kontrolle behandelten Tieren keine wesentlichen Unterschiede im Ausmaß der sichtbaren FG-Diffusion, wie im Lichtmikroskoplevel nachgewiesen. In allen Fällen lag der Bereich der FG-Diffusion 4 bis 6 mm (1 bis 1,5 Wirbelabschnitte) von der Injektionsstelle oder mindestens 1,5 Wirbelabschnitte kaudal zur Läsionsstelle.
Untersuchungen mit Doppelmarkierung:
Zum Zeitpunkt der Läsion wurde die Schnittstelle mit Gel-Schaum, getränkt mit 12% (w/v in sterilem dH₂O) Rhodamin-konjugierten Dextranamin (RDA, 10.000 MW FluoroRuby, Molecular Probes) für 30 Minuten gefüllt. Der Gel-Schaum wurde dann entfernt und die verbleibenden operativen Verfahren wurden vollendet (wie oben beschrieben). Nach 28 Tagen des Überlebens wurden alle Tiere mit Ketamin/Xylazin (jeweils 60 mg/kg und 7.5 mg/kg) betäubt. FG (100–150 nl Gesamtvolumen, 5% w/v in sterilem dH₂O) wurde bilateral in das Parenchym auf der L1-Höhe des Marks (n = 6) injiziert.
Analyse der axonalen Regeneration:
Sieben Tage nach der Injektion des FG-Markierungsstoffs in das lumbale Rückenmark bekamen die Tiere eine zum Tode führende Betäubung mit Ketamin/Xylazin (jeweils 120 mg/kg und 15 mg/kg) und wurden dann intrakardial mit 200 ml von 0,1 M PBS (pH 7,4) durchspült, gefolgt von 100 ml von 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH 7,3). Das Hirn und das Rückenmark wurden dann entfernt und über Nacht in dem gleichen Fixierungsmittel nachfixiert.
Anschließend wurde das Fixierungsmittel von jedem Hirn und Rückenmark entfernt, worauf diese gefriergetrocknet wurden, indem das Gewebe in eine Reihe von Saccharoselösungen (15% gefolgt von 21%) gelegt wurde. Kranzförmige oder parasagittale Schnitte wurden mit einer Dicke von 25 um auf einem Kryostat geschnitten. Die Gewebeabschnitte des Hirnstammes und des Rückenmarks wurden unter einem Zeiss-Axioskop mit einer 100 W-Quecksilberbirne (Exzitation/Emission-Wellenlängen: FG, 365/420 nm; RDA, 546/590 nm) untersucht.
Der Hirnstamm-spinale Kern, der benutzt wurde um die axonalen regenerativen Fähigkeiten der experimentell behandelten Tiere zu untersuchen, war der Rote Kern (RN, Ursprung ist contralateral zur Schnittstelle). Rückenmark-Projektionen aufweisende Axons von jedem RN kreuzen auf die gegenüber liegende Seite des Mittelhirns und steigen durch das Rückenmark innerhalb des contralateralen dorsolateralen Funiculus ab. Dieser Weg der contralateralen Rückenmarkprojektion ist als komplett lateralisierter Trakt bekannt mit der möglichen Ausnahme von 2 bis 5% der Axone, die über eine ipsilaterale Route (Brown (1974) J. Comp. Neurol. 154: 169–188; Huisman et al., (1981) Brain Res. 209: 217–286; Shieh et al., (1983) J. Comp. Neurol. 214: 79–86; Waldron and Gwyn (1969) J. Comp. Neurol. 137: 143– 154) Projektionen zum Rückenmark aufweisen können.
Unter Verwendung eines einfach-blinden Protokolls, wurde die Anzahl der retrograd markierten Neuronen innerhalb des Roten Kerns (RN) in jedem anderen Gewebeabschnitt des Kerns gezählt, um zu vermeiden, dass dasselbe Neuron zweimal gezählt wird. Nur die Zellen, die einen Kern und eine neuronale Morphologie (d. h. multi-polar in ihrer Erscheinung) aufweisen und die speziell mit FG markiert wurden (d. h. bei Verwendung anderer fluoreszierender Filter nicht sichtbar; siehe oben) und die sich in die proximalen Fortsätze ausdehnen, galten als positiv markierte Rückenmark-Projektionen aufweisende Neuronen. Der Prozentsatz der regenerativen Neuronen wurde dann bestimmt im Vergleich zu der Anzahl der markierten Neuronen innerhalb des contralateralen (unverletzten) Kontrollkern in dem selben Tier.
Ergebnisse:
Ausmaß der Rückenmarkdemyelinisierung und Myelinstörung nach immunologischer Behandlung
Direkte intraspinale Infusion von 33% heterologem (Meerschweinchen-) Serumkomplement mit polyclonalen Antikörpern auf GalC (25%) in PBS über 7 Tage (@0,5 μl/hr) erzielte eine extensive Demyelinierung bis zu 2 mm von der Infusionskanüle entfernt (gesamte rostrokaudale Entfernung von 4 mm oder etwa 1 Rückenmarkabschnitt (2A)). Diese Zone der Demyelinierung war auf jeder Seite durch weitere Abschnitte von 8 mm oder 2 Segmenten des Rückenmarks gebunden, dadurch gekennzeichnet, dass das Myelin unterbrochen war (d. h. Myelin, das extensiv delaminiert ist und eine ausfasernde Erscheinung hat, 2C). Wie in früheren Studien gezeigt wurde (Keirstead et al., (1995) J. Neurosci. 15: 6963–6974; Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 89: 11664– 11668; Keirstead et al., (1997) Brain Res. Bull. 44: 727–734), verursachten Kontrollinfusionen von heterologem Serumkomplement allein, Myelin-spezifische Antikörper allein oder PBS allein nur beschränkten nicht-spezifischen Schaden um die Kanülenstelle. Es gab keine umgebende Zone einer Demyelinisierung oder Myelinstörung (2D).
Die immunologische Demyelinisierung und Unterbrechung von Myelin im Rückenmark der experimentell behandelten ausgewachsenen Ratte ist ein aktiver Prozess, der sich über das gesamte Querschnittsprofil des Rückenmarks erstreckt. Immunologische Myelinstörung beginnt am 1. Tag und ist mit einer Invasion von Makrophagen oder nicht wandernden Hortega-Zellen oder polymorphonuklearen Zellen (z. Z. Leukozyten wie Neutrophile, Eosinophile und Basophile) verbunden. Viele Makrophagen/Hortega-Zellen enthalten Myelinfragmente und beenden ihre phagozytäre Aktivität innerhalb von 7 Tagen (2B). Dieses Muster der Demyelinierung und Myelinunterbrechung kann so lange erhalten werden, bis das Serumkomplement und der Myelin spezifische Antikörper infundiert sind. Neueste Beweise schlagen vor, dass Remyelinisierung innerhalb von 2 Wochen beginnt, nachdem die immunologische Infusion beendet ist (Keirstead and Blakemore (1997) Glia (in Druck); Dyer, Bourque and Steeves (unveröffentlichte Beobachtungen); das neue Myelin stammt von unterschiedlichen oligodendrozyten Progenitoren, obwohl sich ausbreitende Schwannsche Zellen und überlebende "reife" Oligodendrozyten auch zur Remyelinisierung beitragen können.
Wahl des retrograden Tracers und seines Diffusionsabstands zur Injektionsstelle In dieser Studie hängt der wichtige anatomische Beweis für axonale Regeneration innerhalb des hemisezierten und immunologisch Myelin-unterdrückten Rückenmarks der ausgewachsenen Raten vom Vergleich zwischen der Anzahl an retrograd markierten Neuronen innerhalb eines homologen Paares von Hirnstammspinalen Kernen ab. Diese Vergleiche sind nur stichhaltig, wenn der in Betracht gezogene Hirnstamm-spinale Kern hoch unilaterale Projektionen hat, die auf einer Seite des Rückenmarks auf allen Höhen begrenzt sind. Eine linke thorakale Hemisektion (1A) trennte die contralateral projizierenden magnozellulären Neuronen des rechten Roten Kerns (RN) ab, aber ließ die Projektionen vom linken Roten Kern ungeschädigt (bei ihrer Projektion durch den intakten rechten dorsolateralen Funiculus des thorakalen Rückenmarks).
In allen Fällen wurde die Fluorogold-Markierung (100–150 nl) bilateral innerhalb des rostralen Lumbalmarkstranges injiziert (1 cm oder 3 Wirbelabschnitte kaudal zu der Hemisektionsverletzungsstelle). Wir untersuchten die Dauer und den Grad der rostrokaudalen Diffusion von Fluorogold innerhalb des lumbalen und thorakalen Rückenmarks von normal myelinierten (Kontroll-)Tieren und experimentell behandelten Ratten (d. h. unter demyelinierten Bedingungen und Bedingungen mit unterbrochenem Myelin). Zufällig gewählte 25 μm-Abschnitte von experimentell und als Kontrolle behandeltem Rückenmark (das sich von L2 zu T8 erstreckt) wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, wobei die höchste Einstellung der 100 W-Quecksilbelampe verwendet wurde. Spinales Gewebe wurde untersucht auf das Ausmaß von Fluorogold-Diffusion bei verschiedenen Überlebensintervallen nach Injektion, einschließlich: 12 Std. (n = 4), 24 Std. (n = 4), 3 Tage (n = 4) und 5 Tage (n = 4). Der maximale rostrale Diffusionsabstand, der beobachtet wurde, betrug 4 bis 6 mm (oder 1 bis 1,5 spinale Abschnitte) und trat innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden ein. Der Grad der Fluorogold-Diffusion innerhalb des lumbalen Rückenmarks änderte sich zu in den folgenden untersuchten Zeitpunkten nicht (1B).
Zusammenfassend kann man sagen, dass kein Tier (im Experiment oder als Kontrolle) irgenwelche Anzeichen einer Fluorogold-Markierung innerhalb des Rückenmarks auf Höhe der Hemisektionsläsion (T10) zeigte; daher musste hinsichtlich dieses Kriteriums kein Tier aus der Studie ausgeschlossen werden. Der erhältliche Beweis zeigt, dass die retrograde Markierung beschränkt war auf die Markierung intakter und regenerierender Hirnstamm-Rückmarkneuronen, die axonale Projektionen kaudal der T10-Verletzungstelle haben.
Beweis für Hirnstamm-spinale axonale Regenerierung durch retrograde neuronale Markierung
28 Tiere (12 Testtiere (9 retrograd einzeln markierte, 3 doppelt markierte) und 16 Kontrolltiere (13 retrograd einzeln markierte, 3 doppelt markierte)) wurden einer linksseitigen lateralen Hemisektion des T10-Markstrangs unterzogen. Unmittelbar nach der Hemisektion wurde eine Infusionskanüle (verbunden mit einer 14d-osmotischen Pumpe) direkt in den Markstrang 4–5 mm (1 Rückenmarkssegment) kaudal zur Verletzungsstelle eingeführt. Die osmotische Pumpe enthielt eine Anzahl von 3 verschiedenen Kontrolllösungen oder die Testbehandlung (d. h. nur ein PBS-Vehikel, nur Serumkomplement, nur anti-Galactocerebrosid-Antikörper bzw. Serumkomplement mit anti-GalC-Antikörpern). Die Tiere konnten sich anschließend für 28 Tage regenerieren bevor ihnen das Fluorogold rostral in die Lende 1 cm (d. h. 3 Rückenmarkssegmente) kaudal zur Läsionsstelle injiziert wurde. Nachdem die Tiere weitere sieben Tage überlebten, wurde jedes Tier getötet und das Gehirn und das Rückenmark wurde zur Untersuchung und Analyse (siehe Materialien und Verfahren in Bezug auf die Kriterien, die zur Bestimmung der markierten Neuronen verwendet wurden) entnommen.
Das Ausmaß der Hemisektionsläsion wurde in jedem Tier bestimmt. Mit Ausnahme eines Testtieres und eines zur Kontrolle behandelten Tieres wurde bei allen Tieren der linke thorakale Markstrang hemiseziert (1A). Am wichtigsten ist, dass die Region des Tractus rubrospinalis (dorsolateraler Funiculus) abgetrennt wurde. Die Trakte auf der rechten Seite mit Substantia alba blieben stets intakt und unbeschädigt; gewöhnlich war die Substantia grisea der gegenüberliegenden Seite ebenfalls unbeschädigt.
Wenn man "blinde" Zählungen der Anzahl der markierten Neuronen innerhalb eines jeden RN (3A–B, Tabelle 1) vergleicht, so zeigen die Daten, dass 31,8% ± 13,38% (n = 9, Bereich 10–50%) der verletzten magnozellulären RN-Neuronen einen ausreichenden Abstand zum kaudalen Lumbalmark regeneriert hatten, um das Fluorogold einzubauen und retrograd zu transportieren (4). Im Gegensatz dazu zeigten die Kontrolltiere, die entweder nur das PBS-Vehikel, nur den GalC-Antikörper oder nur Serumkomplement erhalten hatten, keine bedeutsame Menge der RN-Markierung: 1,49% ± 0,84% (3C–D; 4, n = 13, Bereich 0–3, Tabelle 1). Die Markierung einiger Neuronen innerhalb des verletzten rechten RN-Nucleus könnte die kleinere Anzahl an RN darstellen, die keine Projektion zur gegenüberliegenden Seite des Mittelhirns aufweisen und innerhalb des ipsilateralen (unverletzten Markstrangs) absteigen (Shieh et al., (1983) J. Comp. Neurol. 214: 79– 86). Innerhalb der parvozellulären Region der RN konnte keine retrograde Markierung der Zellen beobachtet werden. Dies wurde erwartet, da diese RN-Region vorwiegend nur eine Projektion bis zur zervikalen Region des Rückenmarks aufweist.
Eine doppelte retrograde Markierung des verletzten und Myelin-supprimierten rubrospinalen Trakts wurde ebenfalls auf die Qualität hin untersucht (3E und F). Eine große Anzahl der RDA-positiven (erste Markierung) magnozellulären RN-Neuronen wurde nach direkter Markierung der Läsionsstelle zum Zeitpunkt der Hemisektionsverletzung am thorakalen Rückenmark beobachtet. Nach intraspinaler Myelin-Suppression und anschließender Injektion von Fluorogold kaudal zur Läsionsstelle wurde eine kleine überlappende Population von FG-positiven Neuronen beobachtet (d. h. einige Neuronen waren sowohl mit RDA als auch mit FG markiert). Zellen, die ausschließlich mit dem ersten oder dem zweiten Markierungsstoff markiert waren, waren ebenfalls in jedem analysierten Hirnstamm vorhanden. Die niedrige Anzahl an doppelt markierten Hirnstamm-spinalen Neuronen könnte teilweise auf das Versagen eines abgetrennten Axons zurückzuführen sein, RDA vor Verschließen des abgeschnittenen Endes aufzunehmen, d. h. es muss frisch verletzt werden (Heimen und Zaborszky Neuroanatomical tract-tracing methods 2: Recent Progress (New York: Plenum, 1989)). Außerdem wird die Population an rubrospinalen Neuronen, die den Hirnstamm nicht kreuzen ebenfalls als FG-positive Zellen in dem "verletzten" Nucleus erscheinen. Aufgrund der kleinen Anzahl von Tieren, die untersucht wurden, haben wir nicht versucht, diese Ergebnisse zu quantifizieren. Nichtsdestotrotz stellen sie wahrscheinlich eine Unterschätzung der axonalen Regenerierung dar, die durch die immunologische Demyelinierung und Myelinunterbrechung erleichtert wird, jedoch auf keinen Fall eine Überschätzung des Grads an Hirnstamm-spinaler Regeneration nach Myelin-Suppression.
Wie im Vergleich zum Stand der Technik wird die vorliegende Erfindung unter Verwendung von Spinaltranssektion (Keirstead et al., (1995) J. Neurosci. 15: 6963– 6974; Keirstead et al., (1992) Proc. Natl. Acad. Sci (USA) 89: 11664–11668) gezeigt unter Verwendung eines Hemisektionsmodells für diese Studie, so dass jedes Tier als seine eigene interne Kontrolle dienen könnte (d. h. die axonale Regenerierung von verletzten Hirnstrom-Spinal-Projektionen könnte einfach mit dem unverletzten gegenüberliegenden Homolog verglichen werden). Weiterhin war es das Ziel der vorliegenden Erfindung, den Grad an Zystenhohlraumbildung, die oft bei größeren spinalen Läsionen auftritt, sowie den Grad an Qual für die Tiere über relativ lange Regenerationsphasen zu minimieren, die für diese Studie notwendig sind.
Untersuchungen auf irgendwelche funktionale oder verhaltensmäßige Unterschiede während der fünfwöchigen Regenerierungsphase nach der experimentellen Behandlung zeigte keine bemerkenswerten Unterschiede in den Bewegungsmustern zwischen den verletzten Tieren und den unverletzten Kontrolltieren (d. h. alle Tiere liefen umher und alle Tiere waren vergleichbar im Hinblick auf die grundlegenden Reflexfunktionen). Diese Beobachtungen trafen zu ungeachtet dessen, ob die Behandlung intraspinal nach einer Hemisektionsverletzung infundiert wurde (z. B. nur PBS, nur GalC-Antikörper, nur Serumkomplement oder Serumkomplement plus GalC-Antikörper).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die immunologische Suppression von Myelin (Demyelinisierung und Myelinunterbrechung) die anatomische Regeneration der Hirnstrom-Spinalaxone innerhalb der Wirbelsäule der verletzten erwachsenen Ratte erleichtern.
BEISPIEL II
Wirkungen der Entfernung eines einzelnen Komplement-Proteins auf die immunologische Demyetinisierung
Material und Verfahren:
Chirurgische Rückenmarkstranssektion und transiente immunologische Myelinstörung:
Zehn bis 12 Wochen alte weibliche Ratten (Sprague-Dawley) mit einem Gewicht von etwa 200 g wurden jeweils mit Ketamin/Xylazin (60 mg/kg bzw. 7,5 mg/kg) narkotisiert. Eine begrenzte dorsolaterale Laminektomie wurde auf Höhe von T10 durchgeführt und mit einer osmotische Pumpe von Alzet (Tag 14) verbunden, um eine fortlaufende intraspinale Infusion (@ 0,5 μl/h) von C3-abgereichtertem Serumkomplement (Sigma S8788, 33% v/v) zusammen mit einem Komplement fixierenden Antikörper gegen Galactocerebrosid (entweder unser eigener polyclonaler Antikörper oder Chemicon Intl. Ltd. #AB142, 25% v/v) zu gewährleisten. Die Kanülen wurden mittels Dental-Acrylat fixiert, das an dem Wirbelknochen angebracht wurde. Anschließend wurden Muskelschichten über dem Dental-Acrylat vernäht, und das oberflächliche Gewebe und die oberflächliche Haut wurden verschlossen.
Sämtlichen Kontrolltieren wurde eine Infusion intraspinal mittels einer osmotischen Pumpe über den selben Zeitraum von menschlichem Gesamt-Serumkomplement (Sigma S1764, 33% v/v) zusammen mit einem Komplement fixierenden IgG-Antikörper gegen Galactocerebrosid (entweder unser eigener polyclonaler Antikörper oder Chemicon Intl. Ltd. #AB142, 25% v/v) verabreicht. Alle chirurgischen Verfahren und nachfolgenden Tierschutzprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Staates Kanada und dem University of British Columbia Animal Care Committee durchgeführt.
Elektronenmikroskopie wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Ergebnisse:
Wie in 5 gezeigt führt die Entfernung des C3-Bestandteils des Komplements zu einem Fehlen der Myelinentfernung. Dies zeigt, dass dieses Protein eine grundlegende Rolle entweder (i) bei der Opsonisierung oder (ii) der Vermehrung der Kaskade zum lytischen Maembranangriffskomplex (MAC), dem terminalen lytischen Leitungskomplex, spielt.
BEISPIEL III
Regenerierung der chronisch verletzten Neuronen
Materialien und Verfahren:
11 Tiere (6 Test- und 5 Kontrolltiere) wurden einer linksseitigen Lateralhemisektion des T10-Rückenmarks wie folgt unterzogen: 10 bis 12 Wochen alte weibliche Ratten (Sprague-Dawley) mit einem Gewicht von etwa 200 g wurden mit Ketamin/Xylazin (60 mg/kg bzw. 7,5 mg/kg) narkotisiert. Nach einer begrenzten dorsolateralen Laminektomie auf Höhe von T10 wurde eine linksseitige Rückenmarkshemisektionsläsion mittels Mikroscheren durchgeführt. Das Ausmaß der Läsion wurde anschließend durch ein dreimaliges Durchziehen eines spitzen Skalpells durch die Läsionsstelle bestätigt.
Einen Monat (5 Tiere) bzw. 2 Monate (6 Tiere) nach der Hemisektion wurde eine Infusionskanüle (verbunden mit einer 14d osmotischen Pumpe) direkt in das Rückenmark 4 bis 5 mm (1 Rückenmarkssegment) kaudal zur Verletzungsstelle eingeführt. Die Kanülen wurden mittels Dental-Acrylat fixiert, das an dem Wirbelknochen angebracht wurde. Anschließend wurden Muskelschichten über dem Dental-Acrylat vernäht, und das oberflächliche Gewebe und die oberflächliche Haut wurden verschlossen. Die osmotische Pumpe sorgte für eine fortlaufende intraspinale Infusion (0,5 μl/h) von Meerschweinchen-Serumkomplement (33% v/v) zusammen mit einem Komplement fixierenden IgG-Antikörper gegen Galactocerebrosid (entweder unser eigener polyclonaler Antikörper oder Chemicon Intl. Ltd. #AB142, 25% v/v).
Bei sämtlichen Kontrolltieren wurde eine identische Hemisektionsläsion durchgeführt, und anschließend wurde ihnen mittels einer Infusion über eine osmotische Pumpe über den selben Zeitraum nur Gesamt-Meerschweinchenserumkomplement (33% v/v) verabreicht.
Die Tiere konnten sich dann für 28 Tage regenerieren bevor ihnen Fluorogold in die Lendenwirbelsäule, 1 cm (d. h. 3 Rückenmarkssegmente) kaudal zur Läsionsstelle wie in Beispiel 1 beschrieben injiziert wurde. Nachdem sie weitere 7 Tage überlebten, wurde jedes Tier getötet und das Gehirn und das Rückenmark wurden wie in Beispiel 1 beschrieben zur Untersuchung und Analyse entnommen.
Das Ausmaß der Hemisektionsläsion wurde sowohl am Ende des fünfwöchigen Behandlungs- als auch des Regenerationszeitraums histologisch bestätigt. Alle chirurgischen Verfahren und nachfolgenden Tierschutzprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Staates Kanada und dem University of British Columbia Animal Care Committee durchgeführt.
Ergebnisse:
Das Ausmaß der Hemisektionsläsion wurde bei jedem Tier überprüft. Bei allen Tieren wurde die Region des Tractus vestibulospinalis abgetrennt. Die rechtsseitigen Trakte mit der weißen Substanz blieben stets intakt und unbeschädigt, während die graue Masse auf der entgegengesetzten Seite gewöhnlich unbeschädigt blieb.
Wenn man "blinde" Zählungen der Anzahl der markierten Neuronen innerhalb eines jeden LVe (6) vergleicht, so zeigten die Daten, dass innerhalb des einen Monats von den chronisch verletzten Tieren 31,5% ± 5% (n = 3) der verletzten lateralen vestibulospinalen Neuronen sich in ausreichendem Abstand zum kaudalen Lumbalmarkstrang regeneriert hatten, um Fluorogold einzubauen und retrograd zu transportieren. Im Gegensatz dazu zeigten die zur Kontrolle behandelten Tiere, denen nur Serumkomplement verabreicht wurde, keine bedeutende Menge an LVe-Markierungen: 3,6% ± 2,7% (n = 2). Von den Tieren, bei denen die Behandlung vor Behandlungsbeginn um zwei Monate hinausgezögert wurde, hatten sich 26,8% ± 13% (n = 3) der verletzten lateralen vestibulospinalen Neuronen in ausreichendem Abstand zum kaudalen Lumbalmarkstrang regeneriert, um Fluorogold einzubauen und retrograd zu transportieren. Im Gegensatz dazu zeigten die zur Kontrolle behandelten Tiere, denen nur Serumkomplement verabreicht wurde, keine bedeutende Menge an LVe-Markierungen: 5,4% ± 1,8% (n = 2). Diese Ergebnisse zeigen, dass die vorliegenden erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Förderung des erneuten Wachstums, des Reparierens und der Regenerierung von chronisch verletzten Neuronen im ZNS von Säugern verwendbar ist.
BEISPIEL IV
Chirurgische Spinaltranssektion und transiente immunologische Myelinstörung
10 bis 12 Wochen alte weibliche Ratten (Sprague-Dawley) mit einem Gewicht von etwa 200 g wurden mit Ketamin/Xylazin (60 mg/kg bzw. 7,5 mg/kg) narkotisiert. Nach einer begrenzten Laminektomie auf Höhe von T10, wurde eine linksseitige Rückenmarkshemisektionsläsion mit Mikroscheren durchgeführt und das Ausmaß der Läsion wurde anschließend durch Durchziehen eines spitzen Skalpells durch die Läsionsstelle (7) bestätigt. Unmittelbar nach der Läsion wurde eine intraspinale Kanüle auf der Höhe von T11 (n = 22 insgesamt) implantiert und mit einer osmotischen Pumpe von Alzet (14 Tage) verbunden, um dann eine fortlaufende intraspinale Infusion (@ 0,5 μl/h) von Serumkomplement (GIBCO BRL #19195-015, 33% v/v) zusammen mit einem Komplement fixierenden IgG-Antikörper gegen Galactocerebrosid (entweder unser eigener polyclonaler Antikörper oder Chemicon Intl. Ltd. #AB142, 25% v/v) zu gewährleisten. Die Kanülen wurden mittels Dental-Acrylat fixiert, das an dem Wirbelknochen angebracht wurde. Anschließend wurden Muskelschichten über dem Dental-Acrylat vernäht, und das oberflächliche Gewebe und die oberflächliche Haut wurden verschlossen. Das Ausmaß der Hemisektionsläsion wurde sowohl am Ende des fünfwöchigen Behandlungs- als auch des Regenerationszeitraums histologisch bestätigt.
Bei sämtlichen Kontrolltieren wurde eine identische Hemisektionsläsion durchgeführt, und anschließend wurde ihnen mittels einer Infusion über eine osmotische Pumpe über den selben Zeitraum entweder nur mit einem Vehikel (0,1 M phosphatgepufferte Kochsalzlösung, PBS, n = 5), nur mit Antikörper (25% v/v) oder nur mit Serumkomplement (33% v/v, n = 6) verabreicht. Alle chirurgischen Verfahren und nachfolgenden Tierschutzprotokolle wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Staates Kanada und dem University of British Columbia Animal Care Committee durchgeführt.
Elektronenmikroskopie
Gewebe für die ultrastrukturelle Analyse wurde von 10 bis 12 Wochen alten weiblichen Sprague-Dawley-Ratten 7 Tage nach Infusion von Serumkomplement zusammen mit einem Komplement fixierenden IgG-Antikörper gegen GalC (Näheres siehe oben) mittels einer osmotischen Pumpe erhalten. Den Tieren wurde eine zum Tode führende Betäubung mit Ketamin/Xylazin (120 mg/kg bzw. 15 mg/kg) verabreicht. Anschließend wurden sie intrakardial mit 200 ml 0,1 M PBS (pH-Wert 7,4), gefolgt von 100 ml 4% Glutaraldehyd in 0,1 M PB (pH-Wert 7,3) durchspült und dann über Nacht mit dem Fixierungsmittel nachfixiert. Die Infusionsstelle und der umliegende Markstrang wurde in 1 mm große Querstücke geschnitten und verarbeitet, um die rostral-kaudale Folge zu erhalten. Die Stücke wurden in 0,1 M Natriumcacodylat-Puffer (24 Stunden) gewaschen, in 2% OsO4 nachfixiert, durch aufsteigende Alkohole dehydriert und in Spurr-Harz nach Standardprotokollen eingebettet. Gewebestücke von den Testtieren und den unbehandelten Kontrolltieren wurden parallel verarbeitet. Dünne Schnitte (1 um) wurden aus jeden Stück geschnitten, mit alkalischem Tuluiden-Blau gefärbt und unter einem Lichtmikroskop untersucht. Für eine elektronenmikroskopische Untersuchung wurden die Stücke zurechtgeschnitten und Abschnitte von 80 bis 100 nm geschnitten, die mit Uranylacetat und Bleicitrat gefärbt waren, auf Kupfergitter aufgebracht und unter einem Ziess-EM-10C-Elektronenmikroskop (bei 80 kV) betrachtet.
Retrograde neuronale Markierung
Einzelmarkierungsstudien
28 Tage nach der Hemisektionsläsion und weitere 14 Tage nach Beendigung der intraspinalen Infusion der immunolgischen Reagenzien wurde jede Ratte mit Ketamin/Xylazin (60 mg/kg bzw. 7,5 mg/kg) narkotisiert. Fluorogold (FG, 100–150 nl Gesamtvolumen, 5% w/v in sterilem dH₂O; Fluorochrome Inc. Englewood, CO, USA) wurde beidseitig in die Mitte des Spinalgewebes auf der Höhe von L1, etwa 1 cm kaudal zur Läsionsstelle (7) injiziert (50–75 nl).
Doppelmarkierungsstudien
Zum Zeitpunkt der Läsion wurde die Hemisektionsstelle 30 Minuten lang mit einem Gelschaum eingepackt, der in 12% (w/v in sterilem dH₂O) Rhodamin konjugiertem Dextranamin (RDA, 10000MW FluoroRuby, Molekularsonden) getaucht war. Der Gelschaum wurde anschließend entfernt und die verbleibenden chirurgischen Verfahren wurden abgeschlossen (wie vorstehend beschrieben). Nachdem die Tiere 28 Tage überlebten, wurden alle Tiere mit Ketamin/Xylazin (60 mg/kg bzw.) 7,5/kg) narkotisiert, und ihnen wurde FG (100–150 nl Gesamtvolumen, 5% w/v in sterilem dH₂O) (50–75 nl) beidseitig in das Spinalparenchym auf der Höhe von L1 des Markstrangs (n = 6) injiziert.
Analyse der Regenerierung:
Sieben Tage nach der Injektion des FG-Markierungsstoffs in den Lumbalmarkstrang wurde den Tieren eine zum Tode führende Betäubung mit Ketamin/Xylazin (120 mg/kg bzw. 15 mg/kg) verabreicht. Anschließend wurden sie intrakardial mit 200 ml 0,1 M PBS (pH-Wert 7,4), gefolgt von 100 ml 4% Paraformaldehyd in 0,1 M PBS (pH-Wert 7,3) durchspült. Das Gehirn und das Rückenmark wurden dann entnommen und über Nacht in dem selben Fixierungsmittel nachfixiert. Anschließend wurde jedes Gehirn und Rückenmark von dem Fixierungsmittel befreit und durch Einlegen des Gewebes in eine Reihe von Saccharoselösungen (15% gefolgt von 21%) kryokonserviert. Koronale oder parasagittale Schnitte wurden mit einer Dicke von 25 um auf einem Kryostat geschnitten. Die Hirnstamm- und Rückenmarksschnitte wurden unter einem Zeiss-Axioskop mit einer 100 W-Quecksilber-Birne (Anregungs-/Emissionswellenlänge bei FG 365/420 nm; RDA 546/590 nm; Fluoreszein 490/515 nm) untersucht.
Die beiden Hirnstamm-spinalen Kerne, die verwendet werden, um die axonalen regenerativen Fähigkeiten der in den Experimenten behandelten Tiere einzuschätzen, waren der rote Kern (RN) (Ursprung ist kontralateral zur Hemisektion) und der Laterale Vestibuläre (LVe) Nukleus (Ursprung ist ipsilateral zur Hemisektion). Axone mit Spinalprojektion aus jedem RN kreuzen an der gegenüberliegenden Seite des Mittelhirns und steigen im ganzen Rückenmark innerhalb des kontralateralen dorsolateralen Funiculus ab. Dieser kontralaterale spinale Projektionsweg ist bekanntlich ein vollkommen lateralisierter Trakt mit der möglichen Ausnahme von 2–5% der Axone, deren Projektion zum Mark vielleicht auf ipsilateralem Weg erfolgt (Waldron und Gwyn 1969; Brown, 1974; Huisman et al., 1981; Shieh et al., 1983). Die Projektion des LVe-Trakts erfolgt vom dorsolateralen pontinen Rautenhirn, wobei innerhalb des Hirnstammes und der ventrolateralen Substantia alba des Rückenmarks ein ausschließlich ipsilateraler Weg beibehalten wird (Zemian et al., 1979; Shamboul, 1980).
Unter Verwendung eines Einzel-Blind-Protokolls wurde die Anzahl der retrograd markierten Neuronen innerhalb des roten Kerns (RN) (kontralateral zur Hemisektion) und des Lateralen Vestibulären (LVe) Kerns (ipsilateral zur Hemisektion) in jedem anderen Gewebeabschnitt gezählt (durch diese Hirnstammnuklei) um zu verhindern, dass dasselbe Neuron zweimal gezählt wird. Nur Zellen, die einen Zellkern und eine neuronale Morphologie (d. h. multipolar in der Erscheinung) aufweisen und die spezifisch mit FG markiert sind (d. h. nicht sichtbar bei Verwendung anderer fluoreszierender Filter; siehe oben), das in die proximalen Fortsätze verlängert ist, wurden als positiv markierte Neuronen mit Spinalprojektion betrachtet. Der Prozentsatz an regenerierenden Neuronen für jede Hirnstamm-spinale Projektion wurde dann im Vergleich zu der Anzahl markierter Neuronen innerhalb des kontralateralen (unverletzten) Kontrollkerns innerhalb des selben Tieres bestimmt.
Ausmaß der Rückenmarksdemyelinierung und Myelinsunterbrechung nach einer immunologischen Behandlung
Eine direkte intraspinale Infusion über einen Zeitraum von 7 Tagen (@ 0,5 μl/Std.) von 33%-igem heterologem (Meerschweinchen)Serumkomplement zusammen mit polyclonalen Antikörpern gegen GalC (25%) in PBS führte zu einer extensiven Demyelinierung bis zu 2 mm entfernt von der Infusionskanüle (gesamte rostrokaudale Distanz von 4 mm oder etwa 1 Spinalsegment (2A). Dieser Demyelinierungsbereich wurde auf jeder Seite eingegrenzt von weiteren 8 mm oder 2 Segmenten des Rückenmarks, charakterisiert durch eine Störung des Myelins (d.h. Myelin, das extensiv delaminiert ist und eine zerrissene Erscheinung hat, 2B). Wie in vorhergehenden Studien gezeigt wurde (Keirstead et al., 1992, 1995), führten Kontrollinfusionen mit heterologem Serumkomplement alleine, Meylinspezifischen Antikörper alleine oder PBS alleine nur zu einer unspezifischen Schädigung, die direkt um die Stelle der Kanüle herum lokalisiert war. Es gab keinen umliegenden Bereich mit einer Demyelinisierung oder Myelinstörung (2C).
Die immunologische Demyelinierung und Unterbrechung des Myelins des Rückenmarks einer experimentell behandelten ausgewachsenen Ratte war ein aktiver Prozess, der sich über das gesamte Querschnittprofil des Strangs erstreckte. Die immunologische Myelinstörung begann innerhalb eines Tages und war verbunden mit dem Eindringen von Makrophagen oder residenter Mikroglia oder polymorphonucleärer Zellen (z. B. Leukozyten wie Neutrophile, Eosinophile und Basophile). Viele Makrophagen/Mikroglia enthielten Myelinfragmente und beendeten ihre phagozytische Aktivität innerhalb von 7 Tagen (2D). Dieses Muster für die Demyelinierung und Unterbrechung des Myelins konnte so lange aufrecht erhalten werden, wie das Serumkomplement und der Myelin-spezifische Antikörper durch eine Infusion verabreicht wurden. Neuere Beweise legen nahe, dass die Remyelinierung innerhalb von 2 Wochen nach der Beendigung der immunologischen Infusion beginnt (Keirstead und Blakemore, 1997; Dyer, Bourque und Steeves unveröffentlichte Beobachtungen) und dass das neue Myelin aus differenzierenden oligodendrozytischen Vorläufern stammt, obwohl eindringende Schwann-Zellen und überlebende "reife" Oligodendrozyten vielleicht auch zur Remyelinierung beitragen.
Auswahl eines retrograden Tracers und seine Diffusionsdistanz von der Injektionsstelle
In dieser Studie hängt der hauptsächliche anatomische Beweis für die axonale Regeneration im hemisezierten und immunologisch Myelin-unterdrückten Rückenmark ausgewachsener Ratten vom Vergleich zwischen der Anzahl retrograd-markierter Neuronen innerhalb eines homologen Paares von Hirnstammspinalen Kernen ab. Damit diese Vergleiche gültig sind, muss der in Betracht gezogene Hirnstamm-spinale Kern in einem hohen Maße unilaterale Projektionen haben, die auf allen Ebenen auf eine Seite des Rückenmarks beschränkt sind. Wie in 7A zusammengefasst, trennte eine linke Thoraxhemisektion die kontralateral projektierenden magnozellulären Neuronen des rechten roten Kerns (RN), dabei blieben jedoch die Projektionen des linken RN unverletzt (bei der Projektion durch den intakten rechten dorsolateralen Funiculus des Thoraxstrangs). In gleicher Weise trennte eine linke Thoraxhemisektion die Neuronen mit ipsilateraler Projektion des linken lateralen vestibulospinalen Kerns (LVe), aber die linken Axone des rechten LVe Kerns blieben unverletzt (bei denen auch eine Projektion durch die intakte rechte Seite des Thoraxstrangs durch die ventrolaterale Substantia alba vorlag).
Wenn ein retrograder Tracer (einzelne Markierung) in den rostrale lumbale Rückenmark injiziert wird (1 cm kaudal zur verletzten Stelle), sollte er inkorporiert und durch intakte Axone in die ursprünglichen Zellkörper zurückgebracht werden, sowie regenerierte Projektionen. Es ist deshalb wichtig, dass der retrograde Tracer verläßlich und umfassend die meisten, wenn nicht alle, absteigenden spinalen Projektionsneuronen markiert. Eine Voraussetzung, die genauso wichtig ist, ist dass der Tracer in einer kontrollierten und wiederholbaren Weise injiziert werden muss und zwar in einer Entfernung, die ausreichend kaudal zur spinalen Verletzung ist, dass sie jede direkte Diffusion des Tracers auf die Ebene der Hemisektionsverletzung verhindert. Der retrograde Marken, der all diese Bedinungen am besten erfüllt, war Fluorogold (Sahibzada, et al., 1987). Fluoreszierende Dextranamine, wie RDA, benötigen eine nicht lange zurückliegende axonale Verletzung um die Aufnahme der Axone zu erleichtern (siehe Heimen und Zaborsky, 1989) und waren deshalb für die retrograden Tracingstudien mit doppelter Markierung (Beschreibung siehe unten) besser geeignet.
In allen Fällen wurde der Fluorogold Marken (100–150 nl) bilateral in das rostrale lumbale Rückenmark injiziert (1 cm oder 2–3 spinale Segmente kaudal zur Stelle der Hemisektionsverletzung, 7). Wir bestimmten den zeitlichen Verlauf und den Grad der rostrokaudalen Diffusion von Fluorogold im Lumbal- und Thoraxrückenmark von normal myelinierten (Kontroll)Tieren und experimentell behandelten Ratten (d. h. unter demyelinierten Bedingungen und Bedingungen, unter denen Myelin unterbrochen ist). Zufällig ausgewählte 25 um große Bereiche von experimentell behandeltem und zur Kontrolle behandeltem Rückenmark (im Bereich von L2 bis L8) wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop untersucht, wobei die höchste Intensitätseinstellung der 100 W Quecksilberlampe benutzt wurde. Spinales Gewebe wurde auf das Ausmaß der Diffusion von Fluorogold hin untersucht und zwar bei unterschiedlichen Überlebensintervallen nach der Injektion, umfassend: 12 Std. (n = 6), 24 Std. (n = 6), 3d (n = 6), 5d (n = 6) und 7d (n = 22). Der beobachtete maximale rostrale Diffusionsabstand betrug 4–6 mm (oder 1–1,5 spinale Segmente) und trat in einer Zeitspanne von 24 Std. auf. Das Ausmaß der Diffusion von Fluorogold innerhalb des lumbalen Rückenmarks veränderte sich über die folgenden untersuchten Zeitpunkte nicht (7).
Beweise für spinal-axonale Regeneration des Hirnstamms durch retrograde neuronale Markierung
Kurzgesagt, 28 Tiere: 12 experimentelle Tiere (9 retrograd mit einem Marken markierte, 3 mit zwei Markern markierte) und 16 Kontrolltiere (13 retrograd mit einem Marken markierte, 3 mit zwei Markern markierte) wurden einer lateralen Hemisektion des T10 Rückenmarks auf der linken Seite unterzogen. Sofort nach der Hemisektion wurde eine Infusionskanüle (verbunden mit einer 14d osmotischen Pumpe) 4–5 mm (1 spinales Segment) kaudal zur Stelle der Verletzung direkt in das Rückenmark eingeführt. Die osmotische Pumpe enthielt eine aus 3 verschiedenen Kontrolllösungen oder die experimentelle Behandlung (d. h. jeweils PBS-Vehikel alleine, Serumkomplement alleine, anti-galactocerebroside Antikörper alleine oder Serumkomplement mit anti-GalC Antikörpern). Die Tiere konnten sich dann 28 Tage erholen bevor das Fluorogold in das rostrale Lumbar 1 cm kaudal zur Lesionsstelle injiziert wurde (d. h. mindestens 2 spinale Segmente). Nach weiteren 7 Tagen des Überlebens wurde jedes Tier getötet und das Gehirn und das Rückenmark zur Untersuchung und Analyse entnommen (siehe oben bzgl. der Kriterien, die verwendet wurden, um ein markiertes Neuron zu bestimmen).
Bei jedem Tier wurde das Ausmaß der Hemisektionslesion bestimmt. In allen außer einem experimentellen und einen zur Kontrolle behandelten Tier wurde das linke Thoraxrückenmark hemiseziert (7). Am stärksten wurde die Region des rubrospinalen Tracers (dorsolateraler Funiculus) und des lateral vestibulospinalen Trakts (ventrolateraler Funiculus) durchtrennt. Die Trakte mit Substantia alba auf der rechten Seite blieben immer unversehrt und unverletzt und meistens blieb auch die Substantia grisea der unverletzten Seite unverletzt.
Wie oben diskutiert, waren der RN und der LVe die zwei Paare des Hirnstammspinalen Kerns, die auf Beweise für retrograde Markierung untersucht wurden (nach Hemisektion des Rückenmarks und immunologischer Myelinstörung). Diese Hirnstamm-spinalen Kerne wurden auf Grund ihrer unilateralen Projektionsmuster innerhalb des thorakalen und lumbalen Rückenmarks ausgewählt, was Vergleiche zwischen retrograder Markierung innerhalb eines verletzten Nukleus und des unverletzten kontralateralen Homologen ermöglichte. Bei einem Vergleich von "blinden" Zählungen der Anzahl an markierten Neuronen innerhalb jedes RN (3A–B) zeigten die Daten, dass in 31,8% ± 4,7% (n = 8, Bereich 10–50%) der verletzten magnocellulären RN-Neuronen durch Regeneration ein ausreichender Abstand im kaudalen lumbalen Rückenmark geschaffen worden war um das Fluorogold aufzunehmen und retrograd zu transportieren. Im Gegensatz dazu zeigten zur Kontrolle behandelte Tiere, die entweder nur PBS oder nur GalC-Antikörper oder nur Serumkomplement erhielten kein erhebliches Ausmaß an RN-Markierung; 1,49% ± 0,23%, (3C–D; 9, n = 13, Bereicht 0–3). Die Markierung einiger Neuronen innerhalb des verletzten rechten RN-Nukleus kann die geringe Anzahl an RN darstellen, die nicht auf die gegenüberliegende Seite des Mittelhirns projizieren und innerhalb des ipsilateralen (unverletzten) Marks absteigen (Shieh et al., 1983). Innerhalb der parvozellulären Region des RN wurde keine retrograde Markierung von Zellen beobachtet.
Die retrograde Markierung von regenerierenden LVe-Neuronen wurde auch beobachtet, jedoch nur nach experimenteller Demyelinierung und Unterbrechung des Rückenmarkmyelins (8). Bei 8 experimentellen Tieren betrug der durchschnittliche Prozentsatz der Regeneration von LVe-Markierung im Gegensatz zum unverletzten kontralateralen Kontrollnukleus 41,8% ± 3,1% (n = 8, Bereich 33– 49%). Bei zur Kontrolle behandelten Tieren (siehe oben) betrug der Prozentsatz der LVe-Markierung 2,24% ± 0,55% (5, n = 13, Bereicht 0–6).
Doppelte retrograde Markierung des verletzten und Myelin-unterdrückten rubrospinalen Trakts wurde auch quantitativ bestimmt (9E und F). Nach der direkten Markierung der Lesionsstelle zur Zeit der Hemisektionsverletzung am Thoraxrückenmark wurde eine große Anzahl an RDA-positiven (erste Markierung) magnozellulären RN-Neuronen beobachtet. Nach intraspinaler Myelinunterdrückung und nachfolgender Injektion von Fluorogold kaudal zur Lesionsstelle (bzgl. Einzelheiten siehe oben) wurde eine kleine überlappende Population von FG-positiven Neuronen beobachtet (d. h. einige Neuronen wurden sowohl mit RDA als auch mit FG markiert). In jedem analysierten Hirnstamm waren auch Zellen vorhanden, die nur mit dem ersten oder zweiten Tracer markiert waren.
Untersuchungen auf funktionale Unterschiede oder Verhaltensunterschiede während der 5-wöchigen Erholungsperiode nach der experimentellen Behandlung zeigten keine bemerkenswerten Unterschiede bezüglich der Bewegungsmuster zwischen verletzten Tieren und unverletzten Kontrolltieren (d. h. alle Tiere gingen, alle Tiere waren vergleichbar bezüglich grundlegender Reflexfunktionen). Diese traten unabhängig von der Behandlung auf, die intraspinal nach der Hemisektionsverletzung injiziert wurde (z. B. nur PBS, nur GalC-Antikörper, nur Serumkomplement oder Serumkomplement und GalC-Antikörper). Deshalb war es sehr schwierig, geringe Unterschiede zu beobachten oder zu quantifizieren und "große" Bewegungsmuster waren hauptsächlich gleich.
Verglichen mit dem Stand der Technik, bei dem spinale Transsektion angewandt wurde (Keirstead et al., 1992, 1995), wird die vorliegende Erfindung unter Verwendung eines Hemisektionsmodels demonstriert, so dass jedes Tier als seine eigene interne Kontrolle dienen konnte (d. h. die axonale Regeneration von verletzten spinalen Hirnstammprojektionen konnte leicht mit dem unverletzten kontralateralen Homolog verglichen werden). Zusätzlich war man bei der vorliegenden Erfindung bestrebt, den Grad der Bildung von Zystenkavitäten, die bei größeren Spinallesionen häufig auftritt, sowie das Leiden der Tiere über die relativ langen Erholungsperioden, die benötigt wurden, so gering wie möglich zu halten.
Die vorliegende Erfindung zeigt auch, dass die Demyelinierung, die durch die intraspinale Infusion von Serumkomplement und Myelin-spezifischem Antikörper (z. B. GalC) hervorgerufen wurde, an beiden Seiten der Infusionsstelle eine schnelle und aktive Demyelinierung über 1–2 Segmente des Marks mit einer Myelinunterbrechung, die sich über weitere 2 Segmente erstreckt, bewirkte. Bei vorkommenden Mikroglia und/oder eindringenden Makrophagen wurde beobachtet, dass sie Myelinreste enthielten. Die immunologische Unterdrückung von Rückenmarkmyelin, das die Thoraxhemisektion umgibt, erleichterte die erhebliche axonale Regeneration durch 2 spinale Hirnstammwege mit unilateraler Projektion, dem rubrospinalen und dem lateralen vestibulospinalen (jeweils RN und LVe) Trakt. Bei Tieren, die zur Kontrolle behandelt wurden (Hemisektionsverletzung und lokale intraspinale Infusion von lediglich PBS, lediglich GalC-Antikörper oder lediglich Serumkomplement) zeigte sich eine geringe oder keine retrograde Markierung innerhalb der verletzten RN oder LVe.
Tabelle 1

Claims

Zusammensetzung, die therapeutisch wirksame Mengen der folgenden Bestandteile umfasst: (a) ein oder mehrere menschliche oder chimäre Komplement-fixierende Antikörper oder Fragmente davon, die an ein Epitop von Myelin im Menschen binden; und (b) ein oder mehrere Komplement-Proteine oder Fragmente davon; worin die Bindung der Antikörper an Myelin eine vorübergehende Störung und/oder vorübergehende Demyelinisierung der Neuronen im Menschen verursacht.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die eine Zusammensetzung aus zwei Teilen ist, wobei die zwei Bestandteile (a) und (b) vor der Verabreichung, während der Verabreichung, oder nach der Verabreichung an einen Menschen, der die Behandlung benötigt, miteinander vermischt werden sollen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, worin das eine oder die mehreren Komplement-Proteine von menscheneigenem Serum abgeleitet sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die Antikörper monoclonal und/oder polyclonal sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Zusammensetzung zusätzlich einen oder mehrere Wachstumsfaktoren umfasst, und/oder Zellen zur Transplantation.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei einer oder mehrere der Antikörper markiert sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Antikörperfragmente immunreaktive Fragmente sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Fv, Fab, Fab', und F(ab')₂- Fragmenten.
Zusammensetzung nach Anspruch 7, worin die variablen Regionen des Fv-Fragments über Disulfidbindungen oder über einen Peptidlinker verknüpft sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei das Epitop von Myelin ein Myelinscheiden-Epitop ist, ausgewählt aus der Liste, die Galactocerebrosid (GalC), O4, Myelin-Oligodendrocyten-Glycoprotein (MOG), myelinassoziiertes Glycoprotein (MAG), NOGO, NI220, NI-35/250, und Arretin einschließt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei die Komplement-Proteine oder Fragmente davon die C3-Komponente oder ein Fragment, eine Variante, ein Analogon oder ein chemisches Derivat davon einschließen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die Komplement-Proteine oder Fragmente davon von einer nicht-menschlichen Art abgeleitet sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das eine oder die mehreren Komplement-Proteine oder Fragmente davon ein physikalisch unterscheidbarer Bestandteil von dem einen oder den mehreren Antikörpern oder Fragmenten davon sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 11, wobei das eine oder die mehreren Komplement-Proteine oder Fragmente davon kovalent oder nicht-kovalent direkt an den einen oder die mehreren Antikörper oder Fragmente davon gebunden sind.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 13, die weiterhin einen oder mehrere der folgenden Bestandteile umfasst: Wachstumsfaktoren, neurotrophische Faktoren, und/oder Zellen zur Transplantation.
Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei das Neurotrophin NT-3 oder FGF-1 ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 14, die ein Arzneimittel ist und weiterhin gegebenenfalls einen physiologisch verträglichen Träger umfasst.
Verwendung eines menschlichen oder chimären Komplement-fixierenden Antikörpers oder eines Fragmentes davon, das an ein Epitop von Myelin im Menschen bindet und geeignet ist zur Verwendung in Kombination mit einem oder mehreren Komplement-Proteinen oder Fragmenten davon, für die Herstellung eines Medikaments zur Förderung der Neuronenreparatur und/oder Regeneration im Menschen, wobei die Bindung des Antikörpers an Myelin in Anwesenheit des einen oder der mehreren Komplement-Proteine vorübergehende Störungen und/oder vorübergehende Demyelinisierung von Neuronen verursacht.
Verwendung nach Anspruch 17, wobei das Medikament auch für die Erzeugung einer Umgebung innerhalb des ZNS bestimmt ist, die für das Wachstum von transplantierten Zellen permissiv ist.
Verwendung nach Anspruch 17 oder 18, wobei das eine oder die mehreren Komplement-Proteine oder Fragmente davon von menscheneigenem Serum abgeleitet sind.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 19, wobei das Medikament Zellen zur Transplantation umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 20, wobei das Medikament einen oder mehrere Wachstumsfaktoren umfasst.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 21, wobei bei dem Menschen, eine Neuronenreparatur und/oder Regeneration auf Grund von Neuronendysfunktion erforderlich ist.
Verwendung nach Anspruch 22, wobei die Neuronendysfunktion durch Verletzung oder Trauma des ZNS oder durch Krankheit verursacht ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Verletzung eine Rückenmarksverletzung ist.
Verwendung nach Anspruch 23, wobei die Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alzheimer- und Parkinson-Krankheit.
Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 25, wobei der Mensch an einem chronischen Zustand leidet.
Kit zur Verwendung nach einem der Ansprüche 17 bis 26, umfassend: (a) einen oder mehrere menschliche oder chimäre Komplement-fixierende Antikörper oder Fragmente davon, die an ein Epitop von Myelin im Menschen binden, wobei die Bindung der Antikörper an Myelin eine Störung und/oder Demyelinisierung des Myelins im Menschen verursacht; (b) ein oder mehrere Komplement-Proteine oder Fragmente davon; und gegebenenfalls (c) einen oder mehrere Wachstumsfaktoren und/oder (d) Zellen zur Transplantation.
Menschlicher oder chimärer Komplement-fixierender Antikörper, oder ein Fragment davon, das an ein Epitop des Myelins im Menschen bindet, zur Verwendung in Kombination mit einem oder mehreren Komplement-Proteinen oder Fragmenten davon, um die Neuronenreparatur und/oder Regeneration im Menschen zu fördern, wobei die Bindung des Antikörpers an Myelin eine vorübergehende Störung und/oder vorübergehende Demyelinisierung der Neuronen verursacht.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 28, wobei die Verwendung auch zur Erzeugung einer Umgebung innerhalb des ZNS bestimmt ist, die für das Wachstum transplantierter Zellen permissiv ist.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 28 oder 29, worin das eine oder die mehreren Komplement-Proteine oder Fragmente davon von menscheneigenem Serum abgeleitet sind.
Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 28 bis 30 zur Verwendung in Kombination mit Zellen, die zur Transplantation verwendet werden.
Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 28 bis 31 zur Verwendung in Kombination mit einem oder mehreren Wachstumsfaktoren.
Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 28 bis 32, wobei bei dem Menschen eine Neuronenreparatur und/oder Regeneration auf Grund von Neuronendysfunktion erforderlich ist.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 33, wobei die Neuronendysfunktion durch Verletzung oder Trauma des ZNS verursacht ist, oder durch eine Krankheit verursacht wird.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 34, wobei die Verletzung eine Rückenmarksverletzung ist.
Antikörper oder Fragment davon nach Anspruch 34, wobei die Krankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Alzheimer- und Parkinson-Krankheit.
Antikörper oder Fragment davon nach einem der Ansprüche 28 bis 36, wobei der Mensch an einem chronischen Zustand leidet.