DE69815230T2

DE69815230T2 - Verwendung von transduzierten myogenischen Zellen zur Schmerzhinderung und zur Behandlung der Verhaltungs- und Wahrnehmungsbnormalitäten

Info

Publication number: DE69815230T2
Application number: DE69815230T
Authority: DE
Inventors: Peter K. Law
Original assignee: Individual
Current assignee: Law Peter K Memphis Tenn Us
Priority date: 1997-08-11
Filing date: 1998-04-07
Publication date: 2004-05-06
Anticipated expiration: 2018-04-08
Also published as: US7166279B2; ATE241992T1; EP0898967B1; JPH11147829A; CA2225185A1; HK1016897A1; EP0898967A1; US20020044925A1; DE69815230D1

Description

Hintergrund der Erfindung
Die vorliegende Erfindung stellt ein Verfahren zur Linderung von Schmerzen und zur Behandlung von Verhaltens- und Wahrnehmungsstörungen durch Anwendung einer Myoblastentransfertherapie zur Verfügung, um eine lang anhaltende, kontinuierliche in vivo-Zuführung von Peptiden, die analgetische Aktivität haben, zu erhalten.
Die moderne Analgesie entwickelte sich mit dem Vorschlag von Pomeranz et al., Exp. Neurol. 54: 172 (1977), dass ein morphinartiges hypophysäres Peptid die Akupunkturanalgesie vermittelt, deutlich weiter. Es wurde festgestellt, dass Elektroakupunktur bei anästhesierten Katzen die Reaktionen in Rückenmarkneutronen auf schädliche Stimuli reduziert und die Piepsschwelle bei wachen Mäusen erhöht. Der beobachtete, längere Zeitraum involvierte einen hormonellen Mechanismus für die Reaktion. Eine spinale Transaktion, Dezerebration oder Hypophysektomie eliminierten diesen Akupunktureffekt und intravenöse Injektionen von Naloxon, einem Morphinantagonisten, reduzierten sie ebenfalls deutlich.
Diese Resultate zeigen, dass Elektroakupunktur sensorische Nerven stimuliert, die die Hypophyse zur Freisetzung morphinartiger Hormone (Peptide) aktiviert, welche eine verlängerte Verringerung bei der Übertragung entlang nozizeptiver Bahnen bewirken. Es wird davon ausgegangen, dass dieser Mechanismus ein Hauptmediator allgemeiner und lokalisierter Analgesie ist.
Morphinartige Peptide wurden identifiziert und Rezeptoren für morphinartige Peptide und für andere Opioidpeptide wurden im Gehirn, im Darm, der Hypophyse, dem Pankreas und in der Plazenta gefunden. Hughes et al, Nature 258: 577 (1975); Pert et al., Science 179: 1011 (1979). Diese Peptide sind als β-Endorphine und Enkephaline bekannt. Cooper et al., THE BIO-CHEMICAL BASIS OF PHARMACOLOGY, 4. Ausg. (Oxford University Press, New York 1982). Darüber hinaus erzeugt eine Stimulation von Gehirnneuronen mit einem Opioidpeptid, zum Beispiel Endorphin, Analgesie. Fields et al., Ann. Rev. Physiol. 40: 217 (1978). Dieser Effekt kann durch Naloxon umgekehrt werden.
Opioidpeptide, speziell β-Endorphine, sind im Wesentlichen Nervenhormone oder Transmitter, die alle Körpergewebe durch Diffusion erreichen. Das Vorliegen von Endorphinrezeptoren in verschiedenen Bereichen des Dienzephalons und der Großhirnrinde in großen Mengen legt nahe, dass die konjugierten Opioidpeptide in der Analgesie eine Rolle spielen, die über die eines einfachen Modulators der Schmerzwahrnehmung hinausgeht. Covenas et al. Neuropeptides 30: 261 (1996); Bernstein et al., Neurosci. Lett. 215: 33 (1996); Bianchi et al., Brain Res. Bull. 40: 269 (1996). Tatsächlich wurde festgestellt, dass Erhöhungen der Spiegel an β-Endorphinen im Liquor cerebrospinalis und Plasma die Verhaltensmuster, die Patienten zeigen, welche an Stress, psychiatrischen Störungen, Alkoholismus, Drogenabhängigkeit, Fettsucht und Diabetes leiden, modulieren und optimieren. Ryu et al., Am. J. Chin. Med. 24: 193 (1996); Odagiri et al., Int. J. Sports Med. 17: 325 (1996); Dalayeun et al., Biomed. Pharmacother. 47: 311 (1993); Gianoulakis et al, J. Phsychiatry Neuroski. 18: 148 (1993). Diese Erhöhungen begünstigen auch die durch natürliche Killerzellen vermittelte Zytotoxizität. Jonsdottir et al., Regul. Pept. 23 : 113 (1996) ; Sacerdote et al., Regul. Pept. 63 : 79 (1996).
Analgesie wird auch durch Bindung eines Schmerzmediators, „Substanz P" genannt, an seinen Rezeptor beeinträchtigt. Es gibt viele Ähnlichkeiten zwischen den Endigungen von Opioidneuronen und den Endigungen von gegenüber der Substanz P empfindlichen Neuronen. Beispielsweise vermitteln beide Endigungstypen eine Schmerzempfindung im Rückenmark. Jessel et al., Nature 268 : 549 (1977). Wie zum Beispiel in der japanischen Patentschrift J 3133998 beschrieben wird, hat sich gezeigt, dass Substanz P-Rezeptoren als Analgetika wirken, indem sie die Aktivität der Substanz P maskieren. Gemäß der PCT Anmeldung WO 92/16547 bindet der NK-1-Rezeptor vorzugsweise Substanz P und kann zur Behandlung von Schmerzen, Entzündungskrankheiten, psychischen Krankheiten und Stress eingesetzt werden.
Patienten, die von Krankheitsbildern wie Stress, psychosomatischen Störungen, Alkoholismus, Drogenmissbrauch, Fettsucht und Diabetes geplagt werden, können ein gewisses Maß an Linderung durch einen Spiegel an endogenen Opioidpeptiden in ihrem Plasma übernormal erhalten. Eine klinische Linderung der Symptome dieser Krankheitsbilder waren mit der Bindung von Opioidpeptiden mit ihren Rezeptoren verbunden, was in direkter Korrelation mit dem Opioidpeptidspiegel im Blut des Patienten und im Liquor cerebrospinalis steht. Patienten können auch von erhöhten Spiegeln an Substanz P-Rezeptoren oder Substanz P-Analoga profitieren. Siehe WO 92/16547, supra, und PCT-Anmeldung WO 91/02745. Bis heute war noch keine nachteilige Reaktion mit physiologischen Erhöhungen der Spiegel an β-Endorphinen, Enkephalenen oder Substanz P-Rezeptoren im Plasma oder im Liquor cerebrospinalis bekannt.
Die Verwendung von Arzneimitteln zur Erhöhung der Produktion und/oder Sekretion von Opioidpeptiden kann eine zeitweilige Linderung liefern, allerdings werden unkontrollierbare Arz neimittelmetabolismus und eine grobe Dosierung gegebenenfalls die „kranken" Neuronen und ihre Gegenstücke zu sehr beanspruchen. Darüber hinaus sind die Nebenwirkungen von Arzneimitteln zahlreich und unerwünscht. Opioidpeptide selbst und Opioidpeptidrezeptoren wurden als Sedativa und Analgetika verabreicht, siehe US Patent Nr. 4,123,523, allerdings sind die Effekte solcher Verabreichungen kurzlebig.
Xenogene Tumorzellen, die β-Endorphin sezernieren, wurden in den Liquor cerebrospinalis-Raum im Rückenmark von Ratten transplantiert, um analgetische Wirkungen zu produzieren. Saitoh et al., Cell Trans. 4 (Supp. 1): S13–7 (1995). Es wurde beschrieben, dass die transplantierten Zellen einen Monat überlebten und in vitro-Untersuchungen gaben an, dass die Zellen β-Endorphin für einen Monat sezernieren. AtT-20-Zellen und AtT-20/hENK-Zellen, die β-Endorphin bzw. Enkephalin sezernieren, wurden in den spinalen subarachnoidalen Raum von Mäusen implantiert, um ihre Verwendung in der Schmerztherapie zu untersuchen. Wu et al., J. Neuroski. 14(8): 4806 (1994); J. Neural Transplant. Plast. 4(1): 15 (1993). Allerdings sind diese Verfahren sehr invasiv und daher sehr gefährlich, da sie die Transplantation von Zellen direkt in den Raum des Liquor cerebrospinalis oder des spinal subarachnoidalen Raums involvieren. Es wird auch nur eine begrenzte Anzahl von Zellen transplantiert, was die Menge an Opioidpeptid, die durch diese Verfahren bereitgestellt wird, begrenzt.
Daher besteht weiterhin ein Bedarf für ein Verfahren mit Langzeitanalgesie durch Zuführung eines Peptids, das an Opioid-Rezeptoren bindet oder die Bindung von Substanz P an ihre Rezeptoren in vivo über einen langen Zeitraum stört. Ein derartiges Verfahren wäre zur Behandlung chronischer Schmerzen und psychischer Störungen, die eine abnormale Wahrnehmung umfassen, zum Beispiel Depression, chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenmissbrauch, und anderer Krankheiten, bei denen Opioidneuronen und Substanz P-Endigungen eine Rolle spielen, nützlich.
Zusammenfassung der Erfindung
Demnach besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung psychischer Störungen, die eine abnormale Wahrnehmung umfassen, zum Beispiel Depression, chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenmissbrauch, chronische Schmerzen, und andere Krankheiten, bei denen Opioiodneuronen und gegenüber Substanz P empfindlicher Neuronen eine Rolle spielen.
Zur Lösung dieser und anderer Aufgaben der Erfindung wird eine Zusammensetzung zur kontinuierlichen Zuführung eines Peptids in vivo bereitgestellt, wobei das Peptid an Opioid-Rezeptoren bindet oder die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor beeinträchtigt, umfassend myogenische Zellen (1) die von einem zu behandelnden Patienten, einem Verwandten oder von einem anderen Menschen gewonnen wurden, wobei diese Zellen heterologe DNA enthalten, die das Peptid kodiert, so dass die myogenischen Zellen das Peptid exprimieren, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger, so dass die myogenischen Zellen zu Muskelfasern heranreifen oder in Fettzellen umgewandelt werden und das Peptid in vivo produziert wird, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Enkephalinen, β-Endorphinen, α-Endorphin, Gamma-Endorphin, Delta-Endorphin, Met sup 5, Opioid-Peptiden und Substanz P-Analoga.
In einer Ausführungsform werden die myogenischen Zellen aus der Gruppe bestehend aus Myoblasten, Myotubuli und Muskelzellen ausgewählt sind. In einer anderen Ausführungsform sind die Zellen mit DNA transduziert, welche für Mehrfachkopiensequenzen des Peptids, getrennt durch Spaltungszellen, kodiert. In einer anderen Ausführungsform sind die transduzierten Zellen durch intramuskuläre Injektion in den paraspinalen Muskel des Patienten zu verabreichen. In noch einer anderen Ausführungsform ist großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan oder Insulin zusammen mit den transduzierten myogenischen Zellen zu verabreichen. Eine gleichzeitige Verabreichung eines immunsupprimierenden Mittels kann in einigen Ausführungsformen ebenfalls durchgeführt werden.
Die Erfindung stellt auch die Verwendung von myogenischen Zellen, die von einem zu behandelten Patienten, von einem Verwandten oder von einem anderen Menschen gewonnen wurden, die heterologe DNA enthalten, die eine Peptid kodiert, das an eine Opioid-Rezeptor bindet oder das die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor beeinträchtigt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Zuführung des besagten Peptids in vivo bei einem Menschen zur Behandlung von chronischem Schmerz, psychiatrischen Zuständen, die anormaler Wahrnehmung einhergehen wie Depression, chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenabhängigkeit, bereit.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung zur kontinuierlichen Zuführung in vivo eines natürlich auftretenden αnalgetischen Peptids bereit, umfassend myogenische Zellen mit DNA, die für einen Promotor für ein endogenes Strukturgen, welches für das Peptid kodiert, enthält, so dass die Zellen das Peptid kontinuierlich produzieren können.
Die Erfindung stellt ferner eine Zusammensetzung zur kontinuierlichen Zuführung eines Peptids in vivo bereit, wobei das Peptid an einen Opioid-Rezeptor bindet oder die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor beeinträchtigt, umfassend myogenische Zellen, die heterologe DNA enthalten und die das Pep tid exprimieren, und einen pharmazeutisch verträglichen Träger. In einer Ausführungsform umfasst die heterologe DNA ein Gen, das für das Peptid kodiert, und einen Promotor. In einer anderen Ausführungsform umfasst die heterologe DNA einen Promotor für ein endogenes Strukturgen, das das Peptid kodiert. In einer anderen Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung zusätzlich großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan oder Insulin.
Weitere Aufgaben und Vorteile der Erfindung werden zum Teil in der folgenden Beschreibung ausgeführt oder werden zum Teil aus der Beschreibung deutlich oder können bei Durchführung der Erfindung gelernt werden.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Es wurde festgestellt, dass genetisch transduzierte myogenische Zellen verwendet werden können, um eine kontinuierliche Langzeitzuführung eines Peptids mit analgetischer Aktivität bereitzustellen. Dieses Verfahren ist zur Behandlung chronischer Schmerzen wie auch psychiatrischer Zustände (bzw. psychischer Störungen), die eine abnormale Wahrnehmung beinhalten, zum Beispiel Depression, chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenabhängigkeit, und anderer Krankheiten, bei denen Neuronen, die Opioide binden und/oder Neuronen, die die Substanz P binden, eine Rolle spielen, einsetzbar. Solche Krankheitsbilder wurden bisher noch nicht durch eine Langzeitverabreichung von analgetischem Peptid in vivo behandelt.
Analgetische Peptide, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, sind Peptide, die Opioid-Rezeptoren binden oder die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor stören. Unter diesen Peptiden sind Opioidpeptide, Polypeptide, die die Substanz P binden, und Peptide, die Substanz P-Analoga sind. In diesem Kontext bezeichnet der Ausdruck „Polypeptid, das die Substanz P bindet" ein Peptid oder Protein, das Affinität zur Substanz P hat, zum Beispiel Substanz P-Rezeptorprotein oder ein Peptid oder ein Peptidanalogon, das von diesem Rezeptor abgeleitet ist und das die Fähigkeit beibehält, Substanz P zu binden. Solche Peptide und Proteine binden die Substanz P und stören daher die Bindung der Substanz P an ihren Rezeptor. Der Arzt kann die Bindung an Substanz P mit einem Assay untersuchen. Substanz P-Analoga wirken als Analgetika, indem sie die Bindung zwischen Substanz P und ihrem Rezeptor stören. Beispielsweise offenbart die PCT-Anmeldung WO 91102745, supra, Analoga, die die natürliche Aktivität der Substanz P nicht aufweisen, aber als kompetitive Inhibitoren der Substanz P wirken.
Erfindungsgemäß werden myogenische Zellen ex vivo transduziert, so dass sie mindestens eins der oben aufgezählten Peptide entweder in Zellkultur oder nach Differenzierung in vivo exprimieren. Zellen, die mit einem Gen, das für ein solches Peptid kodiert, transduziert wurden, werden dem Patienten beispielsweise durch Injektion in Muskel- oder Fettgewebe des Patienten verabreicht. Die transduzierten Zellen können überleben und im Empfängergewebe wachsen. Beispielsweise können Zellen, die in Muskelgewebe injiziert wurden, Myotubuli bilden und zu Muskelfasern reifen. Zellen, die in Fettgewebe injiziert wurden, können überleben und in Fettzellen umgewandelt werden. Transduzierte Zellen, die in Badegewebetypen injiziert wurden, können das gewünschte analgetische Peptid kontinuierlich exprimieren. Das exprimierte Peptid verlässt die Zelle und wandert durch das Blut in andere Bereiche des Körpers, einschließlich Rückenmark und Gehirn.
Myoblastentransfertherapie (MTT) wurde angewendet, um Muskelschwäche und -degeneration zu behandeln und ist eine nützliche Technik zur Verabreichung von Zellen, die ein analgeti sches Peptid exprimieren. Siehe US Patent Nr. 5,130,141, dessen Inhalt hier durch Bezugnahme als aufgenommen gilt. Nach diesem Verfahren werden genetisch normale myogenische Zellen einem myompathischen Muskel des Patienten verabreicht, wodurch die Muskelfunktion, Bewegungsmuster und Atemfunktion verstärkt werden. Es hat sich gezeigt, dass die normale Myoblastentransfertherapie das fehlende Protein Dystrophin für bis zu sechs Jahren in Patienten mit Duchenne-Muskeldystrophie produziert. Law et al., Cell Transplantation 6: 95–100 (1997).
Obgleich früher Myoblastentransferuntersuchungen den Muskel als aufnehmendes Gewebe verwendeten, können auch andere Gewebe verwendet werden. Beispielsweise können Myoblasten nach ihrer Injektion oder chirurgischen Implantation in Fettgewebe wachsen, wie es von Satoh et al., Transplantation Proceedings 24: 3017–19 (1992) beschrieben wird.
Myoblasten wurden mit Genen für Faktor IX, Erythropoietin (EPO) und humanes Wachstumshormon sowie den Fas-Liganden transduziert, um die zirkulierenden Level dieser Proteine zu erhöhen. Thompson, Thromb. and Haemost. 74(1): 45 (1995); Hamamori et al., J. Clin. Invest. 95: 1808 (1995) und Human Gene Therapy 5: 1349 (1994); Barr et al., Science 254: 1507 (1991); Dhawan et al., Science 254: 1509 (1991); Lau et al., Science 273: 109 (1996). Der Erfolg dieser Verfahren war unterschiedlich. Nach Thompson (1995) zum Beispiel legen vorläufige Daten nahe, dass humane Myoblasten, die aus dem Körper entfernt wurden, weniger gut in Kultur überlebten und ihre Fähigkeit, Faktor IX zu exprimieren, progressiv verloren. Lau et al. (1996) beschreiben, dass eine Expression des Fas-Liganden lokal war und nach 80 Tagen aufzuhören schien. Andererseits berichten Hamamori et al. (1994), dass die in vivo-Implantation eines stabilen in hoher Konzentration EPO- produzierenden Muskel-Zell-Klons zu anhaltend hohen Serum-EPO-Spiegeln über drei Monaten führte; und Dhawan et al. (1991) stellen fest, dass transduzierte Myoblasten, nachdem sie zu Myotubuli differenziert waren, fortfuhren, hGH zu sezernieren, und zwar ohne Unterschied bei den Sekretionsleveln zwischen Myoblasten und Myotubuli.
Allerdings wurden transduzierte Myoblasten bisher noch nicht verwendet, um ein analgetisches Peptid kontinuierlich in vivo zuzuführen. Obgleich die Gentherapie als Mittel zur Zuführung von Opioidpeptiden in vivo untersucht wurde, wurden außerdem die transduzierten Zellen direkt ins Rückenmark, in den Raum des Liquor cerebrospinalis oder den spinalen subarachnoiden Raum injiziert. Saitoh et al., Cell Trans. 4 (Supp. 1) : 513-7 (1995) ; Wu et al., J. Neurosci., 14(8): 4806 (1994) ; Wu et al., J. Neural Transplant. Plast. 4(1): 15 (1993). Wie oben diskutiert wurde, sind diese Verfahren sehr invasiv, es wird nur eine begrenzte Anzahl von Zellen transplantiert und die transduzierten Zellen exprimierten die Opioidpeptide nur über einen Monat. Gemäß der vorliegenden Erfindung werden dagegen die transduzierten Myoblasten nicht in das Zentralnervensystem injiziert. Anders als die Kurzzeitexpression von Opioidpeptiden, die bei herkömmlichen Gentherapien durchgeführt wird, liefert die vorliegende Erfindung eine kontinuierliche Langzeitzuführung von Opioidpeptiden, die zum Beispiel bis zu mindestens sechs Jahren andauert. Diese Aspekte der vorliegenden Erfindung stellen deutliche Vorteile dar, die noch nicht erkannt wurden.
Myogenische Zellen, die für die vorliegende Erfindung geeignet sind, umfassen Myoblasten, Myotubuli und Muskelfaserzellen. Nach einer Ausführungsform der Erfindung sind Myoblasten besonders bevorzugt. Myoblasten sind einkernige Embryonenmuskelzellen, die zu mehrkernigen Myotubuli differenzieren. Jeder Nukleus eines Myoblasten enthält über 100.000 Gene, ein schließlich Gene für Opioidpeptide, zum Beispiel β-Endorphine und Enkephaline. Myoblasten teilen sich extensiv, wandern, fusionieren natürlicherweise unter Bildung von Syncytia, verlieren MHC-1-Anitgene bald nach Fusion und bilden etwa 50% des Trockengewichts von Menschen. Myoblasten sind dahingehend ungewöhnlich, dass sie zur natürlichen Zellfusion untereinander und mit reifen Muskelfasern fähig sind. Als Resultat dieser Fusion überträgt ein transduzierender Myoblast seinen Kern und daher alle seine Gene auf die Zelle, mit der er fusioniert, wobei diese eine genetisch normale oder abnormale Muskelzelle sein kann.
Myogenische Zellen können von einem zu behandelnden Patienten, einem Verwandten oder von einem anderen Menschen oder anderen Tierspender erhalten werden. In einem typischen Verfahren werden 1 bis 2 Gramm Skelettmuskel von einem Spender entnommen. Myogenische Zellen können auch durch Klonierungsverfahren, die dem Fachmann auf dem Gebiet bekannt sind und zum Beispiel im US Patent Nr. 5,130,141 geschrieben werden, kultiviert oder produziert werden.
Nach einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Muskelzellen aus einem humanem Spender oder Tierspender 0 bis 3 Tage vor dem Ernten stimuliert, um einen Vorrat an Satellitenzellen zu produzieren, welche Myoblastenreserven in reifen Muskeln sind. Die myogenischen Zellen können zum Beispiel durch Verletzen der Zellen mit einer Reihe von Nadelsonden oder durch Beschallung stimuliert werden.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden geerntete Zellen prozessiert, um eine Reinkultur von Myoblasten zu erhalten. Siehe Law et al. Cell Transplant. 1: 235 (1992); Cell Transplant. 2: 485 (1993); Muscle and Nerve 11: 525–33 (1988). Beispielsweise wird eine Muskelbiopsie mit 0,1% Kol lagenase und 0,2% rohem Trypsin in Phosphat gepufferter Salzlösung mit pH 7,3 disoziiert. Das Gemisch wird 45 Minuten gerührt, wobei drei Wechsel der Enzymlösung alternierend mit drei Wechsel eines neutralisierenden Medium, welches 100 Teile Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DNEM, Gibco), enthaltend 0,37% NaHCO₃ und 4 mM Glutamin, 10 Teile Pferdeserum und 1% Antibiotikum-Antimykotikum umfasst, vorgenommen wurden.
Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die geernteten myogenischen zellen ex vivo mit DNA transduziert, die für ein Peptid kodiert, welches entweder an einen endorphinen Rezeptor bindet oder die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor inhibiert. Peptide, von denen bekannt ist, dass sie geeignete Aktivität in diesem Zusammenhang haben, sind β-Endorphin, α-Endorphin, Gamma-Endorphin, Delta-Endorphin, Met sup 5 (ein Peptid mit fünf Aminosäureresten mit endorphinartiger Aktivität), aktive Endorphinpeptide, die Teile der β-Endorphinsequenz umfassen, Enkephalin, ein NK-1-Rezeptor, ein Polypeptid, das Substanz P bindet, oder ein Substanz P-Analogon, das kompetitiv die Bindung der Substanz P an ihren Rezeptor inhibiert. Der Ausdruck „Substanz P-Analogon" bezeichnet ein Peptid, das die Carboxy-terminale Aminosäuresequenz aus 5 Aminosäureresten von Substanz P umfasst (-Phe-Phe-Gly-Leu-Met) und das an den Substanz P-Rezeptor bindet, wodurch die Substanz P-Aktivität inhibiert wird. Siehe Payan, Ann. Rev. Med. 40: 341 (1989), und PCT-Anmeldung WO 91/03745.
Zusätzliche Peptide können durch kinetische Experimente gefunden werden, die zeigen, ob ein gegebenes Peptid an einen Opioid-Rezeptor bindet oder mit der Bindung zwischen Substanz P und ihrem Rezeptor konkurriert. Diese Experimente können routinemäßig durchgeführt werden. Siehe zum Beispiel die PCT-Anmeldung WO 92/16547.
DNA-Sequenzen, die für die Erfindung nützlich sind, sind bekannt oder können vom Fachmann aus bekannten Aminosäuresequenzen der Peptide aufgebaut werden. Beispielsweise offenbart Saitoh et al., Cell Trans. 4 (Supp. 1): 513-7 (1995) eine DNA-Sequenz, die für β-Endorphin kodiert; Wu et al. (1993, 1994), supra, offenbaren Sequenzen für β-Endorphin und Enkephalin; das US Patent Nr. 4,123,523 offenbart Aminosäuresequenzen von β-Endorphinpeptiden; die PCT-Anmeldung WO 92/16547 offenbart ein Gen, das für den Substanz P-Rezeptor NK-1 kodiert; die japanische Patentschrift JP 3133998 offenbart die Aminosäuresequenz eines Substanz P-Rezeptors und die PCT-Anmeldung WO 91/02745 offenbart die Aminosäuresequenzen verschiedener Substanz P-Analoga, zum Beispiel Deletions- und Additionsmutanten von Substanz P.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung kodiert die DNA für eine Vielzahl von Kopien eines Peptids, das Analgesie erzeugt. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Peptid ein Opioidpeptid und Regionen der DNA, die für mehrere Kopien kodieren, werden durch Spaltungsstellen getrennt (siehe PCT-Anmeldung WO 96/17941). Diese Ausführungsform kann eine amplifizierte Menge eines natürlich vorkommenden Peptids liefern.
Die Transduktion von myogenischen Zellen mit einer DNA-Sequenz kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden., zum Beispiel nach denen, die von Thompson (1995) und Hamamori et al. (1995), supra, beschrieben werden. Im Allgemeinen wird ein DNA-Konstrukt verwendet, das einen Promotor stromaufwärts des Strukturgens, welches das gewünschte Peptid kodiert, ent hält. Geeignete Promotoren sind zum Beispiel im US Patent 5,618,689 beschrieben.
Nach einer anderen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung werden die geernteten myogenischen Zellen ex vivo mit einer DNA transduziert, die einen Promotor enthält, der an endogenes Gen innerhalb des Kerns einer myogenischen Zellen binden und damit wirken kann (d.h. die Expression induzieren oder verstärken kann). In dieser Ausführungsform werden DNA, die eine regulatorische Sequenz, ein Exon und ein Splicedonor enthält, durch homologe Rekombination in das Zellgenom an einer vorher ausgewählten Stelle in eine Zelle eingeführt. Die Einführung dieser DNA führt zur Produktion einer neuen Transkriptionseinheit, in der die regulatorische Sequenz Exon und Splicedonorstelle funktionell an das endogene Gen gebunden sind.
Auf die Einführung von DNA folgt typischerweise eine Selektion von Zellen, die einen Promotor in einer gewünschten Stelle zur Änderung des gewünschten Gens aufgenommen haben. Eine anwendbare Selektionsmethodologie wird zum Beispiel in den US Patenten Nr. 5,641,670 und 5,272,071 beschrieben. Selektionstechniken werden auch von Mansour et al., Nature 136. 348, 349 (1988) beschrieben. Nach Selektion werden die Zellen, die das gewünschte Gen exprimieren, kultiviert und dann in einen Patienten eingeführt.
Die transduzierten myogenischen Zellen werden kultiviert, um eine ausreichende Menge an Zellen zur Verabreichung nach einem einer Vielzahl von Methoden, die auf dem Fachgebiet bekannt sind, an den Patienten zu produzieren. Siehe zum Beispiel Law et al. (1988, 1992) supra. Die Menge an Zellen, die kultiviert wird, wird vom Zustand des Patienten und der Schwere der Krankheit, die behandelt wird, abhängen. Beispielsweise können etwa eine Milliarde bis etwa 100 Milliar den Myoblasten zur Verabreichung an einen Patienten kultiviert werden. Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden Zellen im oben beschriebenen neutralisierenden Medium, das mit zwei Teilen Hühnerembryoextrakt ergänzt ist, kultiviert. Den Zellen wird alle zwei Tage frisches Wachstumsmedium zugeführt und sie werden für 35 bis 40 Tage in 7% CO₂ bei 37°C inkubiert.
Die transduzierten Zellen können dem Patienten durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden. Law et al., Cell Transplant. 1: 235 (1992); loc. cit. 2: 485 (1993), Law et al. Exp. Neurol., Transplant Proc. 29: 2234 (1997). Die Menge an Opioidpeptiden, die erfindungsgemäß bereitgestellt wird, kann kontrolliert werden, indem die Anzahl der Muskeln, denen injiziert wird, und die Anzahl der injizierten Zellen ausgewählt werden. Die Richtung der Injektion kann kontrolliert werden, indem die Anzahl der transduzierten Zellen, die an Empfängermuskelfasern abgegeben wird, optimiert wird. Beispielsweise hat sich gezeigt, dass ein Injizieren der verabreichten Zellen diagonal durch Muskelfaser die resultierende Zahl der Muskelfasern, die mit den verabreichten Zellen fusioniert werden, maximiert.
Transduzierte Zellen können spezifischen Muskeln verabreicht werden, die dabei helfen, dass die Zellen zu einer Zielstelle zwischen Laminae IV und V des Rückenmarks gelangen. Beispielsweise können die transduzierten Zellen in paraspinale Muskeln oder Nackenmuskeln, zum Beispiel den Levator scapulae, injiziert werden. Obgleich transduzierte myogenische Zellen, die irgendwo im Körper verabreicht werden, Peptide sezernieren werden, die durch das Blut wandern und die spinalen Rezeptoren erreichen werden, wird davon ausgegangen, dass eine gezielte Verabreichung der Zellen an paraspinale Muskeln oder Nackenmuskeln, die in der Nähe des Rückenmarks sind, dazu führen, dass mehr Peptide die Rezeptoren schneller erreichen, wodurch die Wirksamkeit des Verfahrens erhöht wird.
Die transduzierten Zellen können auch durch chirurgische Implantation in den Patienten verabreicht werden. Die Zellen können zum Beispiel in Fettgewebe implantiert werden.
In einer weiteren Ausführungsform wird dem Patienten auch eine wirksame Menge eines immunsupprimierenden Mittels gegeben, um die Abstoßung der transduzierten Zellen zu minimieren. Siehe US Patent Nr. 5,130,141, und Law et al. (1992, 1993), supra. Beispielsweise kann Cyclosporin A, ein anderes immunsupprimierendes Mittel, oder es können Kombinationen von immunsupprimierenden Mitteln nach bekannten Verfahren gegeben werden. Geeignete Dosierungsformen, Dosierungsmengen und Dosierungspläne sind auf dem Fachgebiet bekannt. Beispielsweise kann Syclosporin A oral in einer täglichen Dosis von etwa 7 mg/kg Körpergewicht gegeben werden. Ein typischer Dosierungsplan umfasst die Verabreichung der täglichen Dosis in zwei aufgeteilten Dosen; das Vollblut des Patienten kann überwacht werden, damit ein konstanter Level von etwa 250 mg/ml Cyclosporin A aufrecht erhalten wird.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung kann die Fusion der transduzierten Myoblasten durch Verabreichung von großem Chondroitin-6-sulfat-proteoglycan (LC6SP) erleichtert werden, wie es in der oben zitierten US-Anmeldung, Serial No. 08/477,377 beschrieben wird. Eine Verletzung aus der Injektion von Myoblasten in die extrazelluläre Matrix löst die Freisetzung von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor und großem Chondroitin-6-sulfat-proteoglycan aus. Diese freigesetzten Moleküle stimulieren die Myoblastenproliferation. Eine Erhöhung des Levels an großem Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan an der Injektionsstelle erleichtert die Myoblastenfusion und -proliferation. Nach einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan vorzugsweise mit den transduzierten Myoblasten verabreicht.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist das große Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan untersulfatiert. Siehe Hutchison et al., Deve1. Biol. 115: 78–83 (1986). Es wird angenommen, dass großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan vor der Fusion in einer untersulfatierten Form gebildet wird, aber nach Fusion höher sulfatiert wird. Der Ausdruck „untersulfatiertes großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan", wie er hier verwendet wird, bezeichnet einen Sulfatierungsgrad, der etwa derselbe ist wie der, der bei natürlich auftretendem großem Chondroitin-6-Sulfat-Proteoglykan aus Zellen vor der Fusion beobachtet wird. Nach diesem Aspekt der Erfindung wird untersulfatiertes großes Chondroitin-6-sulfat-proteoglykan mit einer Konzentration zwischen etwa 5 μM und etwa 5 mM verabreicht. Chondroitin-6-sulfat kann zusammen mit den transduzierten Zellen verabreicht werden oder kann in einer getrennten Formulierung als getrennte Injektion gegeben werden.
Insulin kann die Proliferation von Myoblasten ebenfalls unterstützen und die Myotubulientwicklung begünstigen. Nach einer Ausführungsform der Erfindung wird daher Insulin mit den transduzierten Myozyten verabreicht. Beispielsweise können etwa 0,2 mM Insulin entweder als Teil derselben Formulierung wie die Zellen gegeben werden oder als getrennte Formulierung zum Beispiel in einer getrennten Injektion gegeben werden.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung werden unerwünschte Effekte aus einer Überproduktion des gewünschten Peptids mit Agonisten wie zum Beispiel Naloxon oder SP-40,40 reguliert. Pomeranz et al., Altern. Thor. Health Med. 2: 85 (1996); Choi-Miura et al., Biol. Pharm. Bull. 16: 228 (1993); Pomeranz et al., Exp. Neurol. 54: 172 (1977). Wenn zum Beispiel der endogene Level des Peptids zu hoch wird, kann Naloxon oder SP-40,40 verabreicht werden, um den Wirkungen des Peptids entgegenzuwirken. Typische Symptome einer Überproduktion eines analgetischen Peptids umfassen extreme Schläfrigkeit, niedrige Atmungsfrequenz, Cyanose, niedrigen Blutdruck, symmetrische Nadelspitzenpupillen und verringerte Urinbildung. Der übliche Ablauf einer Naloxonbehandlung umfasst Verabreichung geringer intravenöser oder intramuskulärer Dosen von Naloxon (etwa 0.4 mg bis etwa 0.8 mg). Die Symptome verbessern sich häufig nach der ersten Dosis, diese kann nach 2 bis 3 Minuten bis zu einer Gesamtdosis von etwa 10 mg wiederholt werden.
Wie oben diskutiert wurde, liefert die Verabreichung von transduzierten myogenischen Zellen gemäß der vorliegenden Erfindung eine kontinuierliche Langzeitzuführung eines analgetischen Peptids in vivo. Das Peptid wandert von der Synthesestelle, zum Beispiel aus Muskel- oder Fettgewebe, und erreicht sensorische Nervenendigungen, das Rückenmark und das Gehirn, wo es sich mit Nervenzellrezeptoren unter Erzeugung von Analgesie kombiniert. Analgesie, die durch das Peptid erzeugt wird, ist zur Behandlung chronischer Schmerzen und psychiatrischer Zustände (psychischer Störungen), die eine abnormale Wahrnehmung beinhalten, zum Beispiel Depression, chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenabhängigkeit, und anderer Krankheiten, bei denen Opioidneuronen und Substanz P-Endigungen eine Rolle spielen, nützlich. Die kontinuierliche Langzeitzuführung eines analgetischen Peptids in vivo als medizinische Behandlung bietet eine neue Methodologie zur Behandlung dieser Krankheitsbilder.
Die Erfindung stellt auch eine Zusammensetzung bereit, die ein analgetisches Peptid herstellt, das an Opioid-Rezeptoren bindet oder die Bindung von Substanz P an seinen Rezeptor in vivo stört. In einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung myogenische Zellen, die heterologe DNA enthalten, welche für ein analgetisches Peptid kodiert, zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Träger oder mehreren pharmazeutisch verträglichen Trägern.
Beispiele für geeignete pharmazeutische Träger umfassen Verdünnungsmittel, Lösungsmittel, Puffer und/oder Konservierungsmittel. Ein Beispiel für einen pharmazeutisch verträglichen Träger ist Phosphatpuffer, der NaCl enthält. Andere pharmazeutisch verträgliche Träger umfassen wässrige Lösungen, nicht toxische Exzipienten, Salze, Konservierungsmittel, Puffer und dergleichen, wie sie in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, 15. Ausgabe, Easton: Mack Publishing Co., Seiten 1405–1412 und Seiten 1461–1487 (1975) und THE NATIONAL FORMU-LARY XIV., 14. Ausg. Washington: American Pharmaceutical Association (1975) beschrieben wurden. Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliches Öl und injizierbare organische Ester, wie z. B. Ethyloleat. Wässrige Träger umfassen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Kochsalzlösungen, parenterale Vehikel wie z. B. Natriumchlorid, Ringer's Dextrose, usw. Intravenöse Vehikel umfassen Flüssigkeits- und Nährstoff-Ergänzungsmittel. Konservierungsmittel umfassen antimikrobielle Mittel, Antioxidanzien, Gelatbildner und Inertgase. Der pH und die genaue Konzentration der verschiedenen Komponenten der Bindungszusammensetzung werden nach der Erfahrung des Fachmanns eingestellt. Siehe GOODMAN AND GILMRN`S THE PHARMACOLOGICAL BASIS FOR THERAPEUTICS (7. Ausgabe).
Nach einer Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung transduzierte myogenische Zellen, großes Chondroitin-6-sulfatproteoglykan und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Nach einer anderen Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung transduzierte myogenische Zellen, Insulin und einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Die Ausführungsformen der Erfindung werden durch die folgendenden Beispiele, die Aspekte der Erfindung detailliert zeigen, näher erläutert. Die Beispiele erläutern spezifische Elemente der Erfindung und sollen den Rahmen derselben nicht beschränken.
Beispiel 1.
Behandlung eines Patienten, der an Depression leidet, durch Injektion in Muskelgewebe
Die Skelettmuskeln eines Patienten, der an einem psychiatrischen Krankheitsbild, einschließlich Depression, leidet, werden durch zahlreiche Nadelsondierungen stimuliert, um ein Reservoir an Satellitenmyoblastenzellen zu produzieren. Drei Tage später wird der Patient unter Allgemeinnarkose gestellt und es werden 2 g Skelettmuskel aus dem Patienten entnommen. Der entnommene Muskel wird bearbeitet, um eine Myoblasten-Reinkultur zu erhalten. Der entnommene Muskel wird von Haut und anderem Gewebe frei geschnitten und die Zellen werden mit 0,1% Kollagenase und 0,2% rohem Trypsin in Phosphatgepufferter Kochsalzlösung mit pH 7,3 disoziiert. Das Gemisch wird 45 Minuten, mit dreimaligem Wechsel an Enzymlösung, die mit dreimaligem Wechsel eines neutralisierenden Mediums, umfassend 100 Teile Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DMEM, Gibco), enthaltend 0,37 NaHCO₃ und 4 mM Glutamin; 10 Teile Pferdeserum und 1% Antibiotikum-Antimykotikum abwechselt, gerührt.
Diese Myoblasten werden mit DNA, die ein Gen für Enkephalin und einen geeigneten Promotor enthält, transduziert. Die transduzierten Myoblasten werden dann in neutralisierendem Medium, das oben beschrieben wurde und mit zwei Teilen Hühnerembryonenextrakt ergänzt ist, kultiviert. Die Zellen werden alle zwei Tage mit frischem Wachstumsmedium gefüttert und 40 Tage lang in 7% CO₂ bei 37°C inkubiert, bis etwa 2 Milliarden Myoblastenzellen (Nachkommenschaft der transduzierten myogenischen Zellen) vorliegen.
Der Patient wird erneut unter Allgemeinnarkose gestellt und die Nachkommenschaft der transduzierten myogenischen Zellen werden intramuskulär in paraspinale Muskeln des Patienten injiziert. Eine Woche danach sollten sich die Symptome des Patienten zu bessern beginnen.
Beispiel 2.
Behandlung eines Patienten, der an Depression leidet, durch Injektion in Fettgewebe
Myoblasten werden, wie in Beispiel 1 beschrieben, erhalten und transduziert, um etwa 10 Milliarden Nachkommen-Myoblastenzellen zu bilden. Das Brustgewebe des Patienten wird anästhesiert und die Zellen werden in das anästhesierte Gewebe injiziert. Innerhalb einer Woche sollten sich die Symptome des Patienten zu bessern beginnen.
Beispiel 3.
Behandlung eines Patienten, der an Alkoholismus leidet
Die Skelettmuskeln eines Patienten, der an Alkoholismus leidet, werden durch Beschallung stimuliert, um ein Reservoir an Satellitenmyoblastenzellen zu produzieren. Drei Tage später wird der Patient unter Allgemeinnarkose gestellt und es werden zwei Gramm Skelettmuskel vom Patienten entnommen. Der entnommene Muskel wird verarbeitet, um eine Myoblasten-Reinkultur zu erhalten, wie es in Beispiel 1 oben beschrieben ist.
Diese Myoblasten werden mit DNA transduziert, die einen Promotor für ein endogenes β-Endorphingen enthält. Die transduzierten Myoblasten werden dann, wie in Beispiel 1 oben beschrieben, kultiviert, bis 50 Milliarden Zellen erhalten werden.
Der Patient wird erneut unter Allgemeinnarkose gestellt und die Nachkommenschaft der transduzierten myogenischen Zellen werden in paraspinalen Muskeln des Patienten injiziert.
Innerhalb einer Woche nach dem Verfahren beginnen sich die Symptome des Patienten zu bessern.
Beispiel 4.
Zusammensetzung zur Bereitstellung einer kontinuierlichen Langzeitzuführung von Enkephalin in vivo
Es wird die folgende Zusammensetzung bereitgestellt:
Eine Milliarde myogenische Zellen, die mit DNA transduziert sind, die für Enkephalin kodiert, und ein Phosphatpuffer, der NaCl und humanes Serum Albumin enthält, als pharmazeutisch verträglicher Träger.
Beispiel 5.
Zusammensetzung zur Bereitstellung einer kontinuierlichen Langzeitzuführung von β-Endorphin in vivo
Es wird die folgende Zusammensetzung bereitgestellt:
Eine Milliarde myogenische Zellen, transduziert mit DNA, die für einen Promotor eines humanen Endorphingens kodiert, und Wasser als pharmazeutisch verträglicher Träger.
Dem Fachmann wird klar sein, dass an den Verfahren und Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung verschiedene Modifikationen und Variationen durchgeführt werden können. So ist es beabsichtigt, dass die vorliegende Erfindung die Modifikationen und Variationen der Erfindung, vorausgesetzt, sie liegen im Rahmen der beigefügten Ansprüche und ihrer Äquivalente, abdeckt.

Claims

Zusammensetzung zur Zuführung eines Peptides bei einem Menschen in vivo, wobei das Peptid an einen Opioid-Rezeptor bindet oder die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor beeinträchtigt, umfassend (i) myogenische Zellen, die von einem zu behandelnden Patienten, einem Verwandten oder von einem anderen Menschen gewonnen wurden, wobei diese Zellen heterologe DNA enthalten, die das Peptid codiert, so dass die myogenischen Zellen das Peptid exprimieren, und (ii) einen pharmazeutisch verträglichen Träger, so dass die myogenischen Zellen zu Muskelfasern heranreifen oder in Fettzellen umgewandelt werden und das Peptid in vivo produziert wird, wobei das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Enkephalinen, β-Endorphinen, α-Endorphin, Gamma-Endorphin, Delta-Endorphin, Met sup 5, Opioid-Peptiden und Substanz P-Analoga.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der die heterologe DNA ein Strukturgen für das Peptid und einen Promotor umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 2, bei der die heterologe DNA multiple Kopien eines Gens für das Peptid umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Peptid ein Opioid-Peptid ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, bei der das Opioid-Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Endorphinen, α-Endorphin, Gamma-Endorphin, Delta-Endorphin und Met sup 5.
Zusammensetzung nach Anspruch 4, bei der das Opioid-Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Endorphinen und Enkephalinen, und bei der die heterologe DNA einen Promotor für ein endogenes Strukturgen, das das Peptid codiert, umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Peptid ein Polypeptid ist, das Substanz P bindet.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, bei der das Peptid ein Substanz P-Analogon, das die Sequenz Phe-Phe-Gly-Leu-Met umfasst, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zusätzlich großes Chondroitin-6-sulfat-Proteoglykan umfasst.
Zusammensetzung nach Anspruch 9, bei der das große Chondroitin-6-sulfat-Proteoglykan untersulfatiert ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, die zusätzlich Insulin umfasst.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1–11, bei der die myogenischen Zellen von einem zu behandelnden Patienten gewonnen werden.
Verwendung von myogenischen Zellen, die von einem zu behandelnden Patienten, von einem Verwandten oder von einem anderen Menschen gewonnen wurden, die heterologe DNA enthalten, die ein Peptid codiert, das an einen Opioid-Rezeptor bindet oder das die Bindung von Substanz P an ihren Rezeptor beeinträchtigt, zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung zur Zuführung des besagten Peptides in vivo bei einem Menschen zur Behandlung von chronischem Schmerz, psychiatrischen Zuständen, die mit anomaler Wahrnehmung einher gehen wie Depression, chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenabhängigkeit.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der das Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Opioid-Peptid, einem Polypeptid, das Substanz P bindet und einem Substanz P-Analogon.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der die myogenischen Zellen ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus Myoblasten-, Myotuben- und Muskelfaser-Zellen.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der die myogenischen Zellen von Skelettmuskelgewebe des Patienten gewonnen wurden.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der die myogenischen Zellen von Skelettmuskelgewebe eines normalen Spenders gewonnen wurden.
Verwendung nach Anspruch 16, bei der das Skelettgewebe vor dem Gewinnen zur Produktion eines Vorrats an Satelliten-Myoblastenzellen angeregt wurde.
Verwendung nach Anspruch 16, bei der die gewonnenen myogenischen Zellen aufbereitet worden sind, um eine gereinigte Probe von Myoblastenzellen herzustellen.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der die transduzierten myogenischen Zellen kultiviert werden, um eine Probe von transduzierten myogenischen Nachkommenzellen herzustellen, die mindestens eine Milliarde Zellen umfasst.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der das Peptid ein Opioid-Peptid ist.
Verwendung nach Anspruch 21, bei der das Opioid-Peptid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus β-Endorphinen, α-Endorphin, Gamma-Endorphin, Delta-Endorphin, Met sup 5 und Enkephalinen.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der das Peptid ein Polypeptid ist, das Substanz P bindet.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der das Peptid die Sequenz Phe-Phe-Gly-Leu-Met umfasst.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der die DNA zwei Nucleotidsequenzen, von denen jede das Peptid codiert, und ein Segment, das die zwei Nucleotidsequenzen trennt, wobei das Segment für eine Schnittstelle codiert, umfasst.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der die Zusammensetzung in einer Form vorliegt, die der Verabreichung durch intramuskuläre Injektion angepasst ist.
Verwendung nach Anspruch 26, bei der die Zusammensetzung der Verabreichung durch Injektion in einen paraspinalen Muskel des Patienten angepasst ist.
Verwendung nach Anspruch 26, bei der die Zusammensetzung der Verabreichung durch Injektion in einen Musculus levator scapulae des Patienten angepasst ist.
Verwendung nach Anspruch 26, bei der die Zusammensetzung der Verabreichung durch Injektion in einen Nackenmuskel des Patienten angepasst ist.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der die Zusammensetzung zusammen mit großem Chondroitin-6-sulfat-Proteoglykan zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der die Zusammensetzung zusammen mit Insulin zu verabreichen ist.
Verwendung nach Anspruch 13, bei der ein Immunsupressivum vor, gleichzeitig mit oder nachfolgend auf die Verabreichung der Zusammensetzung zu verabreichen ist.
Verwendung von myogenischen Zellen, die von einem zu behandelnden Patienten, von einem Verwandten oder von einem anderen Menschen gewonnen wurden, zur Herstellung einer Zusammensetzung für kontinuierliche Zuführung eines Opioidrezeptor-bindenden Peptids in vivo zur Behandlung von chronischem Schmerz, psychiatrischen Zuständen, die mit anomaler Wahrnehmung einhergehen wie Depression, chronisches Angstsyndrom, Paranoia, Alkoholismus und Drogenabhängigkeit, wobei die Herstellung die Schritte (a) Transduzieren einer Vielzahl von myogenischen Zellen, von denen mindestens einige (i) ein Gen, das für das Peptid codiert, und (ii) eine flankierende Region, die mit dem Gen verbunden ist, enthalten, unter Bedingungen, die homologer Rekombination zuträglich sind, mit DNA, die einen Promotor und ein Segment, das zu der flankierenden Region homolog ist, umfasst; (b) Auswahl von myogenischen Zellen, bei denen der Promotor und das Gen funktionell verbunden sind, aus der Vielzahl; (c) Vermehren der in Schritt (b) ausgewählten myogenischen Zellen, um Nachkommenzellen zu produzieren; und (d) Formulieren der Nachkommenzellen, die fortwährend das Peptid produzieren, als Zusammensetzung.