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CN1612691A - 纠正心脏传导障碍的方法和组合物 - Google Patents

纠正心脏传导障碍的方法和组合物 Download PDF

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CN1612691A
CN1612691A CNA028269055A CN02826905A CN1612691A CN 1612691 A CN1612691 A CN 1612691A CN A028269055 A CNA028269055 A CN A028269055A CN 02826905 A CN02826905 A CN 02826905A CN 1612691 A CN1612691 A CN 1612691A
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recombinant
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cardiac
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CNA028269055A
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R·J·李
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University of California San Diego UCSD
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Abstract

本发明提供了在心肌细胞和重组细胞之间建立电偶联的方法，所述重组细胞被遗传设计为表达一种连接蛋白，例如连接蛋白43(Cx43)。本发明以一项发现为基础，即对于骨骼肌细胞的遗传修饰而表达一种重组连接蛋白会使得遗传修饰的细胞通过缝隙连接和心肌细胞建立电交流。所述重组表达连接蛋白的细胞可用来修补心脏组织，并通过将其移植入心脏组织来治疗心脏疾病。

Description

纠正心脏传导障碍的方法和组合物
                      关于联邦政府资助研究的声明
本发明是经政府支持利用NIH授予的补助金DK47766实施的。政府在这项发明中有特定的权利。
                               发明领域
本发明通常涉及心脏传导障碍的治疗领域，更特定的涉及促进心脏组织恢复或修补的重组细胞移植。
                               发明背景
在西半球心律失常是一个导致发病的主要原因。发生致命室性心律失常的风险和心肌损伤的程度相关，并被认为是大约50％心血管死亡的主要原因(Myerburg RJ，Kessler KM，Castellanos A.，Circulation Jan，(85)Isuppl：I2-10，1992)。心动过缓和心传导阻滞，可由于正常的衰老过程而发生，它们会进一步增加和心律失常相关的致病率，并在美国每年导致永久性的植入超过160,000个起搏器。
传统的医学治疗方法主要是治标，并且通常不能阻止和预防发病率以及和心律失常相关的死亡率。缺血性室性心动过速的射频导管消融被认为是辅助治疗而不是治愈性的。除颤器和起搏器的植入，虽然通常是有效的，但也有问题，包括：(1)机械装置的植入并每4-7年需要更换一次，(2)植入装置导致的手术和机械并发症，(3)植入机械装置引起的负面身体和心理作用(4)普遍需要同时应用抗心律失常治疗和/或射频调节/消融。
在一些实例中，尤其在传导障碍是由于缺血引起的实例中，可仅应用更激进的选择，例如手术。然而，即使是手术技术也会达不到恢复病人心脏功能的治疗目标。例如，冠状动脉分流术经常不足以恢复在梗死区域有少量存活肌细胞病人的心脏功能。因此，就需要发展其他的方法来治疗心肌功能障碍，从而克服现行治疗方法的负面影响。和尝试刺激心脏生理过程的传统治疗方法的用药相比，应用组织工程技术纠正传导障碍将增加自然的生理过程。
组织工程技术对于这样的传统治疗来说是有吸引力的选择。组织工程技术通常包括将能够模仿特定心脏功能的细胞移植入心脏组织，从而对心肌修补起作用(Soonpaa，M.，Koh GY，Klug MG，Field LJ，Science，1994.264：p98-101；OrlicD，Kajstura J，Chimenti，S，Jakonluk I，Anderson SM，Li，B，Pickel J，Mc-Kay，R，Nadal-Ginard，B，Bodine，D，Leri A，Anversa P，Nature(2001)410：701-705ChiuRC-J，Zibaitis A，Kao RL，Amm Thorac Surg(1995)60：12-18)。
组织工程技术包括，例如将骨骼成肌细胞移植实现心肌修补已经获得了更大的关注，因为证明了骨骼成肌细胞能在正常和受损的心肌中存活并形成有收缩性的肌原纤维(Weisel RD等，J.Thoracic Cardiovascular Surgery 2001，121：835-836；Murry，C.，Wiseman RW，Schwartz SM，Hauschka S.，J Clin Invest(1996)98：2512-2523)。骨骼成肌细胞和干细胞的移植和组织工程技术为带有有限可利用肌细胞的病人提供了恢复功能的希望。然而，到此为止心肌修补的重点聚集在了保持心肌收缩能力之上，而很少注意组织工程技术对于心脏传导的作用。对于应用骨骼成肌细胞移植实现心肌修补所关注的是骨骼成肌细胞会不会繁殖电活性而成为心肌细胞。
心肌细胞通过闰盘电机械连接，包括粘附和缝隙连接。N-钙粘素是主要的粘附连接蛋白，然而连接蛋白43(Cx43)是心室肌中主要的缝隙连接蛋白质(Verheule S等，Circ.Res.1997，80：673-81)。由于心肌细胞和骨骼肌细胞有不同的细胞电生理特性，心肌细胞和骨骼细胞之间的紧密连接需要同步的电交流(Lee等，Annals ofBiomedical Engineering 28-1：S54，2000)。
在成肌细胞复制时，骨骼成肌细胞表达N-钙粘素和连接蛋白43，接着在分化和肌管形成后下调这两种蛋白的表达。在骨骼肌形成的早期就发现了功能性的缝隙连接，缝隙连接的细胞内交流已经被认为在成肌细胞融合和分化中起了重要的作用(MacCalman，C.D.等，Dev.Dyn.1992，195：127-132)。虽然许多研究已经表明骨骼成肌细胞在心脏移植后存活并形成肌管，这些研究没有显示骨骼肌纤维是否通过周围的心肌细胞形成功能性连接，而使宿主和移植细胞间存在电传递。大多数这些研究已经表明在移植进入宿主心肌的骨骼肌细胞分化(肌管形成)后，在其中不能发现连接蛋白43(Cx43)和N-钙粘素，这是因为在移植细胞和心肌细胞之间缺乏电机械连接(Murry CE等，J.Clin，Invest.1996，98：2512-2217；Robinson等，Cell Trans-plantation 1996，5(1)77-91；MacCalman，C.D.等，Dev.Dyn.1992，195：127-132；KnudsenKA等，Exp.Cell Res.1990，188：175-184；Balogh，S.等，Dev.Biol.1993，155：351-360；Dahl，E.等，Anat.Embryol.1995，191：267-278)。先前尝试将骨骼肌细胞移植进入心肌缺乏和心肌细胞的电连接，这对于心肌的协同活动是必需的。
当骨骼成肌细胞和心肌细胞或肌管和心肌细胞在活体外共培养时，发现这些细胞是电机械连接的(Reinecke，H.等，J.Cell Biology，2000，149(3)，731-740)。Reinecke，H.等报导心肌细胞能够在活体外和一些骨骼肌管形成电机械连接，并通过缝隙连接诱导它们同步收缩。在这项活体外研究中，在心肌细胞和骨骼肌管之间的接触部位同时发现了N-钙粘素和连接蛋白43，但这些蛋白质在形成缝隙连接中的作用或重要性，或所包含的机制仍未知。虽然这些研究举例说明了连接蛋白43的表达和与心肌功能性缝隙连接在活体外的关系，没有事实证明有少量Cx43表达的成年骨骼肌细胞能够在心脏组织中形成功能性缝隙连接。
因此，在所述领域中需要提供方法和组合物诱导和增加心肌细胞和移植细胞之间的电连接，例如成年骨骼肌细胞，从而实现心脏修补。
                               发明概述
本发明提供了在心肌细胞和重组细胞之间建立电连接的方法，所述重组细胞被遗传设计为表达一种连接蛋白，例如连接蛋白43(Cx43)。本发明以一项发现为基础，即对于骨骼肌细胞的遗传修饰而表达一种重组连接蛋白会使得遗传修饰的细胞通过缝隙连接和心肌细胞建立电交流。所述重组表达连接蛋白的细胞可用来修补心脏组织，并通过将其移植入心脏组织来治疗心脏疾病。
一方面，本发明描述了一种在重组哺乳动物细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法，所述方法包括使心肌细胞和经遗传修饰产生连接蛋白的重组哺乳动物细胞接触，其中以一种足以在心肌细胞和重组细胞之间提供产生电连接的方式使得细胞接触。在特殊的实施方案中，所述重组细胞是骨骼肌细胞、干细胞、成纤维细胞和心肌细胞。在一种有意义的实施方案中，所述重组细胞是骨骼肌细胞、特别是成年骨骼肌细胞或成纤维细胞。在特别有意义的实施方案中，所述连接蛋白是连接蛋白43。
在其他实施方案中，接触包括将所述重组细胞移植入受试者的心肌组织。在其他特别的实施方案中，在所述重组细胞和心肌细胞之间建立了电连接，所述重组细胞和所述心肌细胞有相似的传导性。
另一方面，本发明描述了一种在重组骨骼肌细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法，所述方法包括使心肌细胞和经遗传修饰产生连接蛋白的重组骨骼肌细胞接触，其中以一种足以在心肌细胞和重组骨骼肌细胞之间提供产生电连接的方式使得细胞接触。在特殊的实施方案中，所述骨骼肌细胞是成年人骨骼肌细胞或骨骼成肌细胞。在其他实施方案中，在所述重组细胞和心肌细胞之间建立了电连接，所述重组细胞和所述心肌细胞有相似的传导性。
仍是另一方面，本发明描述了一种在重组骨骼肌细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法，所述方法包括使心肌细胞和经遗传修饰产生连接蛋白43的重组骨骼成肌细胞接触，其中以一种足以在心肌细胞和重组骨骼成肌细胞之间提供产生电连接的方式使得细胞接触。所述重组成肌细胞和所述心肌细胞有相似的传导性。
另一方面，本发明描述了一种治疗宿主心脏传导障碍的方法，所述方法包括将治疗有效剂量的一种重组哺乳动物细胞导入宿主的心脏组织，所述重组细胞经遗传修饰而表达一种连接蛋白，使得导入有效的在重组细胞和宿主心脏组织的心肌细胞之间建立电连接。在特殊的实施方案中，所述重组细胞是骨骼肌细胞、干细胞、成纤维细胞和心肌细胞。骨骼肌细胞，特别是成年骨骼肌细胞或成肌细胞是特别有意义的。在其他实施方案中，所述重组细胞和所治疗的宿主是自体同源(autologus)的。在相关的实施方案中，导入通过将重组细胞移植入心脏组织的梗死区完成。
另一方面，本发明描述了一种治疗哺乳动物宿主心脏传导障碍的方法，所述方法包括将治疗有效剂量的一种骨骼肌细胞导入宿主的心脏组织，这种骨骼肌细胞经遗传修饰表达一种重组连接蛋白43，其中导入有效的在所导入的骨骼肌细胞和宿主心脏组织的心肌细胞之间建立电连接，从而治疗了心脏传导障碍。在特殊的实施方案中，所述骨骼肌细胞是成年人骨骼肌细胞或成肌细胞。在相关的实施方案中，导入通过将重组细胞移植入心脏组织的梗死区完成。在特殊的实施方案中，所述重组骨骼肌细胞和宿主是自体同源的。
本发明的一个方面就是发明一种在重组移植细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法。所述方法通常包括以一种方式将一种经遗传修饰表达连接蛋白的细胞和心肌细胞接触，这种方式可以在所述心肌细胞和经遗传修饰的细胞之间提供产生电连接。在一种特别有意义的实施方案中，所述连接蛋白是连接蛋白43。
在特定的实施方案中，所述方法通常包括以一种方式将经遗传修饰表达连接蛋白(例如连接蛋白43)的重组哺乳动物细胞和心肌细胞接触，这种方式可以在所述心肌细胞和重组细胞之间提供产生重组连接蛋白(例如表达或过分表达)的连接，例如在所述重组细胞和心肌细胞之间建立电连接。在特别有意义的实施方案中，所述接触步骤包括在活体内将重组细胞移植入受试者的心脏组织。在特定的实施方案中，所述重组细胞是骨骼肌细胞或成肌细胞，特定的是成年人骨骼肌细胞。所述重组连接蛋白(例如连接蛋白43)由重组细胞表达为一定的量，所述量足以诱导和/或维持重组细胞和心肌细胞之间的电连接。在特定的实施方案中，在重组细胞和心肌细胞之间的电连接建立后，所述重组细胞和心肌细胞有相似的传导特征。在特别有意义的实施方案中，所述连接蛋白是连接蛋白43。
在另一方面，本发明描述了一种改善心脏组织传导的方法(例如治疗心脏疾病)，包括将一种经遗传修饰而表达一种连接蛋白的哺乳动物细胞导入宿主的心脏组织，使得导入有效的在所导入的遗传修饰细胞和心脏组织的心肌细胞之间建立电连接。在特定的实施方案中，所述方法包括导入经遗传修饰表达连接蛋白43的骨骼肌细胞。在特定的实施方案中，所述骨骼肌细胞是成年人骨骼肌细胞或骨骼成肌细胞。在特别有意义的实施方案中，所述宿主是人类。在许多实例中，重组细胞的导入包括手术将细胞移植入心脏组织的梗死区域，从而实现心脏修补。在特定的实施方案中，所述经遗传修饰的细胞来源于宿主的活组织检查，所述活组织检查细胞在活体外经遗传修饰而表达重组连接蛋白。在其他实施方案中，所述经遗传修饰的细胞来源于在活体外经遗传修饰而表达重组连接蛋白的细胞索。
本发明的这些和其他方面、有利之处和特征对于文中那些技术人员来说，在阅读下面给出的本发明更完整的细节之后，变的显而易见。现在将对本发明进一步详述。
                               附图简述
图1A-1D是显示成肌肉细胞分化为肌管过程中不同时期的动作电位参数图。图1A：14天内的静止膜电位(RMP)；图1B：14天内的动作电位幅度(APA)；图1C：14天内的最大向上速度(Vmax)；图1D：14天内在50％(APD50)复极化时的动作电位持续时间。
图2A是对照细胞(TR/Z)和重组Cx43-表达细胞在第0、2、4和7天的mRNA Cx43RT-PCR实验琼脂糖凝胶电泳图。
图2B显示了由RT-PCR测定的三个对照样本和三个重组Cx43-表达细胞样本在第0、2、4和7天的Cx43mRNA平均水平。
图2C是Cx43蛋白质western印迹图，它显示了第0、2、4和7天时对照细胞和重组Cx43-表达细胞样本中存在的Cx43mRNA相对量。
图2D显示了Cx43western印迹实验图，这个实验用来测定第0、2、4和7天时三个对照细胞样本和三个Cx43-表达细胞样本中存在的Cx43蛋白质的相对量。
图3的一组图显示了骨骼成肌细胞或肌管之间显微注射研究的结果，这表明了若丹明或荧光黄染料的相对转移。行A：对照成肌细胞至对照成肌细胞；行B：Cx43成肌细胞至Cx43成肌细胞；行C：对照肌管至对照肌管；行D：Cx43不正常肌管至Cx43不正常肌管。
图4的一组图显示了成年大鼠心肌细胞(ARC)和骨骼成肌细胞或肌管之间显微注射研究的结果。注射细胞用若丹明或荧光黄标记。行A：ARC至对照成肌细胞；行B：ARC至重组Cx43-表达细胞；行C：ARC至对照肌管；行D：ARC至重组Cx43-表达非正常细胞。
图5的一组图显示了分析MHC和结蛋白表达水平的免疫荧光研究结果，上述两种物质是对照和Cx43细胞中成肌细胞分化为肌管的两种强标记物。
在描述这项发明之前，应该明白本发明不限于所描述的特定方法学、规则、细胞索、载体和试剂，当然它们会变化。也应该明白这里所应用的术语是仅仅为了描述特定实施方案的目的，并不是为了限定本发明的范围，它只会被附属的权利要求限定。
应该注意的是正如这里应用的和附属权利要求中应用的，单数形式“一个”、“一种”、“这种”包括复数对象，除非上下文清楚的规定。因此，例如，谈及“一个细胞”包括大量这样的细胞以及其功能性等价物，谈及“这种多核苷酸”包括指一种或多种多聚核苷酸和它们的等价物，这对于文中那些技术人员来说是知道的，等等。
除非另外限定，这里应用的所有技术和科学术语和本发明文中的一个普通技术人员所通常理解的有着相同的含义。虽然在本发明的实施或实验中可应用和这里描述的那些相似的方法、装置和材料，但所述优选的方法、装置和材料是现在所描述的。
所有这里提及的出版物由于描述和揭示在其中所述的例如细胞索、载体和方法学目的包含进来作为参考，所述出版物可以和现在所述的发明一起应用。这里所讨论的出版物在所述申请填写日期之前只是为了揭示而提供。这里没有认为承认了本发明者没有资格利用先前的发明将这样的发现提前。
                               发明详述
本发明以一项发现为基础，这项发现就是将心肌细胞和经遗传修饰而表达一种重组连接蛋白43(例如存在或缺乏内生性连接蛋白43的表达)的重组细胞，例如成年人骨骼肌细胞接触，会使得被修饰的骨骼肌细胞和心肌细胞建立电连接。因此，本发明提供的方法应用遗传修饰的重组细胞产生连接蛋白，从而在所述重组细胞和心肌细胞之间产生持久的功能性缝隙连接，以此在这些细胞之间获得电交流。表达重组Cx43(或其他连接蛋白)的重组细胞的应用增加和维持了重组细胞和心肌细胞之间的交流，因此提供了改善和协调的电偶联，使得心肌收缩力增效。本发明提供了一种治疗心脏疾病的方法，通过将修饰表达连接蛋白的重组细胞移植或转移至心脏组织内来实现心脏修补。充血性心力衰竭是一种可以用本发明的方法治疗的典型的心脏疾病。
定义
这里应用的“多核苷酸”指的是低聚核苷酸、核苷酸和它们的片段或部分，正如肽核酸(PNA)，其片段、部分或反义分子，也指基因或合成来源的DNA或RNA，可以是单-或双-链，代表同义或反义链。当应用“多核苷酸”指特殊的多聚核苷酸序列时(例如编码连接多肽43的多聚核苷酸)，“多核苷酸”指包括编码一种和所述多肽功能相似多肽的多聚核苷酸，例如多聚核苷酸的退化变异体(例如编码相同氨基酸序列的多聚核苷酸，但是由于遗传密码的兼并而使得多聚核苷酸序列不同)，或编码所述多肽生物活性变异体或片段的多聚核苷酸，包括和这里提供的序列完全相同或相似的多聚核苷酸序列。相似的，这里应用的“多肽”是指天然产生的蛋白质分子氨基酸序列，“多肽”和相似的名词的意思不是将氨基酸序列局限于和所述蛋白质分子相关的完整的、天然的氨基酸序列，但取而代之的意思也包括有生物学活性的变异体或片段，包括和这里提供的氨基酸序列完全相同或相似的多肽序列。
正如这里所应用的，“多肽”是指一种重组或非-重组多肽的氨基酸序列，所包含的氨基酸序列包括i)天然多肽，ii)生物活性的多肽片段，iii)生物活性的多肽类似物，或iv)生物活性的多肽变异体。在本发明中应用的多肽可从任何物种获得，例如哺乳动物或非-哺乳动物(例如爬行动物、两栖动物、鸟类(例如小鸡))，特别是哺乳动物，包括人类、啮齿动物(例如小鼠或大鼠)，牛、绵羊、猪、鼠或马，优选的是大鼠或人类，来源于任何材料，不管是天然的、合成的、半合成的或重组的。例如“人连接多肽43”指从人类获得的独立人类Cx43多肽的氨基酸序列，也包括所有天然存在的等位基因变异体，不将所述氨基酸序列局限于和所述蛋白质分子相关的完整的、天然氨基酸序列。
多肽的“变异体”定义为一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列(例如通过删除、加入、插入和/或取代)。通常，“加入”指将核苷酸或氨基酸残基加入到分子的一端，而“插入”指将核苷酸或氨基酸残基插入至天然存在的分子残基之间。所述变异体有“保守的”变化，其中取代的氨基酸有相似的结构或化学特点，例如，以异亮氨酸取代亮氨酸。更少的是，变异体有“非保守的”变化，例如以色氨酸取代甘氨酸。相似的较小变异体也包括氨基酸缺失或插入，或两者都。应用文中熟知的计算机程序，例如DNAStar软件可以找到测定哪种以及怎样将氨基酸残基取代、加入、插入或删除，但不丧失其生物或免疫活性的指导。
“感兴趣的核酸”的意思是指任何编码蛋白质或其他分子的核酸(例如DNA)，这些蛋白质和分子对于诱导或维持细胞间的电连接来说是理想的。大体上，所述核酸和其需要的调节和表达序列有效连接，例如促催化剂和调节成分。
名词“生物学活性”指的是例如有天然发生连接多肽的结构、调节或生物化学功能的人类连接多肽，特别是关于促使在修饰表达连接多肽的细胞和心肌细胞之间建立电化学连接。同样的，“免疫活性”将天然、重组或合成的人类连接多肽或其任何短肽的效力限定为能在合适的动物或细胞中诱导产生特殊的免疫反应，并结合连接蛋白特异性抗体。
这里应用的所述名词“衍生物”是指编码多肽的核酸或被编码多肽的化学修饰物。这种修饰的阐述可以是烃基、酰基或氨基取代氢。一种核酸衍生物将编码一种保持天然多肽本质生物学特点的多肽。
正如这里所应用的，所述名词“分离的”是指描述了一种有意义的化合物(例如多聚核苷酸或多肽)，它在一种和所述化合物天然产生不同的环境中。“分离的”指包括样本中的化合物，这种样本完全是为了所述有意义的化合物而浓缩的，和/或其中的所述有意义化合物是部分或完全纯净的。
正如这里所应用的，所述名词“充分纯化的”指的是一种从它的自然环境中取出的化合物(例如多聚核苷酸或多肽)，并且至少60％，优选的75％，最优选的95％没有和它天然联系的其他成分。
“转化”、“转导”或“转染”的意思是永久或暂时性的基因转变，优选的是永久性的基因转变，在细胞中诱导产生接着包含入新的核酸(例如细胞外源性的DNA或RNA)。基因转变可以通过在宿主细胞的基因组中包含入新的核酸或通过将新的DNA瞬间或稳定维持为游离成分而实现。
“转化细胞”、“转染细胞”或“转导细胞”是指一种通过重组DNA技术将编码有意蛋白质的DNA分子导入其中的细胞(或导入祖代细胞)。
“构建”是指为了表达特殊核苷酸序列的目的产生一种重组核酸，通常是重组DNA，或者将其应用于其他重组核苷酸序列的构建之中。在本发明中有用的结构体是那些包含有效的连接于促催化剂的编码连接蛋白的基因序列，所述促催化剂会使得连接蛋白在转形的细胞中表达。根据本发明，典型的用来表达人类和大鼠Cx43的结构体F描述于Shinoura，N等，J Neurosurg.1996 5月；84(5)：839-45以及Suzuki等，Ann.Thorac.Surg，2001，71：1724-33。
“启动子”是指足以在重组细胞中直接转录的最小序列。“启动子”也包括那些足以促催化剂依赖基因表达的成分，这种表达是细胞-种类特异性、组织特异性可控制的，或外部信号或试剂可诱导的；这种成分可位于天然基因的5’或3’区域(强化因子成分)。
“可操作地”或“可操作连接的”指的是当合适的分子(例如转录激活蛋白)和调节序列结合时，DNA序列和调节序列以这种方式连接而表达。
“连接蛋白基因”指的是编码连接多肽的开放可读结构，或内含子，或其生物活性片段。“连接蛋白基因”包括邻近5’和3’非编码核苷酸序列，它们参与表达的调节，超过所述编码区域总共大约10kb，但进一步可能在两个方向。所述编码连接蛋白的DNA序列可以是cDNA或基因DNA或其片段。可以将所述基因导入合适的载体，用于染色体外的保存或整合入宿主。
这里应用的所述名词“cDNA”旨在包括所有分享在天然mRNA种类中发现序列成分排序的核酸，其中序列成分是外显子(例如编码所述多肽开放可读结构的序列)以及3’和5’非编码区域。正常的mRNA种类有连续的外显子，而插入其中的内含子通过原子核RNA结合去除，从而产生了编码有意义多肽的连续开放可读结构。
“心肌细胞”是指一种心脏收缩细胞，它是一种心肌细胞。所述心肌细胞是独立的并可在活体外培养，或是宿主的部分心肌。
“骨骼肌细胞”是指在骨骼肌中发现的细胞，它包括但不局限于成肌细胞、肌管和成熟的骨骼肌细胞。
“重组细胞”是指一种包含通常和所述细胞不相关核酸的细胞(例如用编码特异蛋白，例如连接蛋白的结构体转化、转导或转染的细胞)。
“植入细胞”是指一种被导入宿主的细胞，以此和宿主内的细胞接触。例如，一种重组细胞可被移植入宿主的心脏组织。
心脏传导障碍治疗上下文中的“治疗有效剂量”是指一定有效的剂量可以减少心脏传导障碍的症状和/或改善心脏的传导力(传导的测定)。
基因产物(例如Cx43蛋白)的“过表达”是指特定的细胞或细胞类型在一个特定的发展阶段或分化阶段蛋白质的表达水平超过正常蛋白质表达水平。在特定的实施例中，过分表达可以是来自内源和重组基因蛋白质表达的累积作用，或基本上是来自重组基因的蛋白质表达。连接蛋白43(例如Cx43)的过分表达是指在特定细胞中连接蛋白的表达，它的表达水平通常在和正常或野生型细胞于特定分化阶段相联的连接蛋白表达水平之上。对于通常不表达明显或可见量连接蛋白(例如成年人骨骼肌细胞或肌管中的Cx43)的细胞，连接蛋白的过分表达意味着任何可见的连接蛋白表达，特别是表达的水平足以促进在所述表达增高的重组细胞和心肌细胞之间建立电连接。在特定的实施方案中，连接蛋白的过分表达是指表达增加至少大约2倍，在其他实施方案中至少大约5倍，仍在其他实施方案中至少大约10倍。
这里交换应用的名词“受试者”、“患者”、“宿主”和“个体”是指任何对于其来说诊断或治疗都是理想的哺乳动物受试者，特别是人类。其他受试者可包括牛、狗、猫、几内亚猪、兔、大鼠、小鼠、马等等。特别有意义的是患有心肌相关病症的受试者，所述病症可以通过将表达重组连接蛋白(例如Cx43)的细胞移植入受试者(例如通过在活体内将表达连接蛋白的细胞导入受试者，或通过移植表达连接蛋白(例如成年人骨骼成肌细胞、干细胞(例如间叶细胞、造血细胞)，成纤维细胞、心肌细胞等)而易于治疗(例如缓解病症相关的症状)。在许多实施方案中，所述宿主是人类。
“电偶联”是指细胞间的相互作用，它可促使细胞内的交流，这样提供了细胞间的电传导。活体内的电连接为电机械连接提供了基础，也通常伴有电机械连接，其中通过肌肉中缝隙连接的细胞电刺激导致肌肉收缩。
“心脏传导障碍”是指发起心脏收缩电活动的正常产生和传递的障碍。由于电传导障碍引起的心律不齐可导致威胁生命的室性心律失常、血液动力学损害的心动过缓和心脏传导阻滞。
“心脏传导障碍相关症状”是指和心脏传导障碍相关的疾病、症状或病症。和心脏传导障碍相关的疾病包括不正常的心脏搏动、疲劳、气短和缺乏同步心脏肌肉收缩。
“治疗”、“处理”或“医治”是指实现至少折磨病人疾病相关的症状改善，其中这里应用的改善广义上是指至少参数大小的减少，例如症状(例如不正常的心脏搏动、疲劳、气短、晕厥可以是和传导障碍相关的症状，例如心传导阻滞、室性心律失常或和与所治疗疾病相关的充血性心力衰竭(例如缺乏同步收缩)相关)。正如这个，治疗也包括完全抑制或终止了这些情况，例如病理状况或至少相关的症状，阻止它们的发生或终止它们，这样病人就不会再饱受疾病或至少疾病特有症状的痛苦。
在表达连接蛋白的细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法
本发明提供了在表达连接蛋白的重组细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法。所述方法通常包括使连接蛋白重组细胞(例如骨骼肌细胞、干细胞(例如间叶细胞、造血细胞)成纤维细胞、心肌细胞等)和心肌细胞接触，其中所用的方法足以在心肌细胞和重组细胞之间提供产生电连接。所述细胞是重组的，例如它经遗传修饰产生生物活性的连接蛋白，例如连接蛋白43(Cx43)。重组细胞中连接蛋白的产生提供了电连接，因此在所述重组细胞和心肌细胞之间产生了电机械连接。
编码连接蛋白的核酸
如上简述，本发明的方法应用了核酸组合物，包括基因组和cDNA核酸组合物，它们编码生物活性的连接蛋白43，或生物活性片段、同类物或类似物，适合在重组细胞中表达，接着所述细胞可与心肌细胞形成电化学连接。
“连接蛋白”是指一种来自在缝隙连接蛋白中发现的同类蛋白家族的蛋白质，如同类-或异六边形矩阵。连接蛋白是细胞电连接中的包含的主要缝隙连接蛋白质。缝隙连接调节了细胞内的分子通过，包括无机离子和第二信使，因此实现了细胞的电连接。超过15种亚单位同功型连接蛋白已知，大小变化在25kDa和60kDa之间，并通常有四个推断的跨膜α-螺旋扳手。不同心脏部位的连接蛋白都是特异的。在心血管系统中发现的连接蛋白家族蛋白质包括Cx37、Cx40、Cx43和Cx45(van Veen，AA；van Rijen，HV；Opthof，T.，Cardiovascular Research 2001 Aug 1，51(2)：217-29；Severs NJ；Rothery，S；Dupont，E；Coppen，SR；Yeh，HI；Ko，YS；Matsushita，T；Kaba，R；Halliday，D.，Microscopy Reasearch and Technique 2001Febl，52(3)：301-22；Kwong，KF；Schuessler，RB；Green，KG；Laing，JG；Beyer，EC；Boineau，JP；Saffitz，JE.，Circulation Research 1998 Mar 23，82(5)：604-12)。
正如这里所交换应用的，“连接蛋白43”和“Cx43”是指一种独立的Cx43多肽氨基酸序列，它具有和缝隙连接以及电化学连接相关的结构、调节或生物化学功能，它可从任何物种获得，特别是哺乳动物，包括人类、啮齿动物(例如鼠或大鼠)，牛、绵羊、猪、鼠或马，优选的是人类，也可能是天然、合成、半合成或重组的，并意味着包括所有天然产生的等位基因变异体，不使所述氨基酸序列局限于和所述蛋白质分子相关的完整、天然氨基酸序列。Cx43包括生物活性的Cx43片段。Cx43的例子包括人类Cx43(Genbank登录号XP_027460，XP_027459，XP_004121，P17302，AAD37802，A35853，NP_000156，AF151980，M65188和AAA52131)，鼠Cx43(Genbank登录号P23242，P18246，A39802，A36623，NP_034418，NM_012567，NM_010288，CAA44540)和大鼠Cx43发现于Genbank登录号P08050，S00532，NP_036699，AAA75194和1404339A。
有意义的连接蛋白基因组序列包括在启动子和终止子之间出现的核酸序列，连接蛋白43基因是特别有意义的，包括所有正常存在于天然染色体中的内含子。它进一步还包括特殊的转录和翻译调节序列，例如促催化剂和增强子等，在转录区域的5’或3’末端包括大约10kb，但可能更大的侧面基因组DNA。所述基因组DNA可以是独立的100kbp或更大的片段，或是一种完全没有侧面染色体序列的较小片段。在另外一种实施方案中，所述连接蛋白DNA是cDNA，它缺乏在基因组DNA中发现的内含子序列。所述cDNA可操作的连接于通常和连接蛋白序列相关的增强子(例如对于所述连接蛋白基因来说是内生的增强子)或连接蛋白的异种序列(例如一种来源于其他来源而不是连接蛋白序列的增强子)。
这个5’区域的序列，以及5’上游序列和3’下游序列，可应用为增强子成分，包括增强子结合位点，它提供了组织中的表达，所述连接多肽通常表达于组织中。所应用的连接蛋白序列可以任何物种的核苷酸序列为基础(例如哺乳动物或非-哺乳动物(例如爬行动物、两栖动物、鸟(例如小鸡))，特别是哺乳动物，包括人类、啮齿动物(例如鼠或大鼠)，牛、绵羊、猪、鼠或马，优选的是大鼠或人类)，它们可以是独立的或产生于任何来源，不管是天然的、人工合成的、半人工合成的或重组的。当重组细胞是人类细胞或细胞植入的心肌组织是人类时，所述连接蛋白优选的是人类连接蛋白或来源于人类连接蛋白。
在所述受试发明中应用的核酸组合物可编码所有或部分，通常基本上至少是所有连接多肽是合适的。片段是通过和传统方法一致的化学合成寡核苷酸获得的DNA序列，通过限制性酶消化，PCR放大等。对于绝大部分来说，DNA片段至少是大约100个连续的核苷酸，通常至少是大约200nt，更通常的是至少大约250nt-500nt。
所述连接蛋白基因是独立的并以完全纯净的获得，通常不同于完整的哺乳动物染色体。通常，DNA的获得完全不含有其他编码Cx43或其片段的核酸序列，通常至少是大约50％，通常至少是大约90％纯净并典型的是“重组的”，例如在侧面有一个或多个通常不和天然出现的染色体相关的核苷酸。
所述连接蛋白序列，包括侧面增强子区域和编码区域可以文中所知的不同方式变化，从而产生增强子长度，所编码的蛋白质序列的靶变化等。所述DNA序列或这样变化的产物将和这里提供的一种或多种序列相似，例如分别至少有一个核苷酸或氨基酸不同，也可能至少两个不同，或至少大约10个或更多核苷酸或氨基酸不同。大体上，序列变化可以是增加、取代、插入或删除。删除可进一步包括更大的变化，例如区或外显子的删除。这样改良的连接蛋白序列，为了促进电化学连接产生的目的可用来，例如产生一种导入细胞的结构。
应该注意的是优选的所述连接蛋白基因根据宿主的种类选择(例如其中人类接受Cx43-修饰的细胞，接着Cx43基因序列是人类Cx43)。
所述被编码的连接蛋白是生物活性的，例如当在骨骼肌细胞中产生时，生物活性的Cx43多肽促进了骨骼肌细胞和心肌细胞之间连接的建立。不拘泥于理论，所述连接蛋白(例如Cx43)在细胞表面表达，并插入原生质膜成为缝隙连接的一部分。为了在细胞间建立电连接，连接蛋白必须是形成缝隙连接性细胞间交流(GJIC)的功能性缝隙连接。两种细胞(例如成年人骨骼肌细胞和心肌细胞)之间电连接的辨认可由文中的技术人员容易的控制。可通过用可渗透缝隙连接的染料微注射细胞来评价缝隙连接，例如荧光黄(Molecular Probes，Or.)，当缝隙连接存在时，它由一个细胞转移至另外一个细胞。发现缝隙连接的微注射原则(例如Cx43的功能性表达)在实例部分中给出。
所述重组细胞可任选的经遗传修饰而表达其他蛋白质，例如N-钙粘蛋白。然而，所述细胞优选不是这样修饰，从而避免了移植细胞的附加遗传操纵。进而，所述重组细胞不需要被修饰表达或过分表达N-钙粘蛋白，正如这里的发明者所示的外源性(例如导入或重组)连接蛋白(存在或缺乏任何内源性连接蛋白)是足够的。
连接蛋白核酸结构
包含连接蛋白核酸的结构在文中是熟知的。例如，包含连接蛋白43基因的结构由El Oakley等描述，Ann.Thorac.Surg.，2001，71：1724-33。包含编码连接蛋白核酸的结构被用来转换、转染或转导特殊的有意义细胞，使得在修饰细胞中表达被导入的编码连接蛋白的核酸分子。
当表达的核酸是DNA时，任何可操作连接于有意义DNA的包含增强子(例如在真核细胞中起作用的增强子)的结构都可用于本发明。包含DNA序列(或相应的RNA序列)的结构，可根据本发明应用，它可以是任何适合在哺乳动物细胞中应用的表达结构，并包含有意义的DNA或RNA序列。这样的结构可包括质粒或病毒结构核酸(例如腺相关病毒、腺病毒等类似的)，可以是环状或直线的。所述结构优选的能够在真核和/或原核宿主中复制。合适结构是文中所知并可商业利用的。所述结构可应用文中熟知的技术配制。同样，获得遗传改变了的宿主细胞中外源性DNA或RNA序列表达的技术在文中也是所知的。
在一种实施方案中，所述DNA结构包含一种促进哺乳动物细胞中有意义DNA表达的增强子。所述增强子可以是在哺乳动物中起作用的强力增强子，例如来自巨细胞病毒(CMV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、lenti-病毒或腺病毒。更特殊的，典型的增强子包括来自人类CMV即刻早期基因的增强子(Boshart等，Cell41：521-530，1985)和来自RSV的长末端重复(LTR)的增强子(Gorman等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 79：6777-6781，1982)。作为选择，所应用的增强子可以是强普通真核增强子例如肌动蛋白基因增强子。在一种实施方案中，所应用的增强子可以是组织-特异性增强子。例如，在所述结构中应用的增强子可以是心肌细胞特异性增强子，成肌细胞特异性增强子或成人骨骼肌细胞特异性增强子(Luo等，Development 2001 Feb，128(4)：459-69；Lee等，J.Thor.Card.Sur.1999 Jul，118(1)：26-4，discussion 34-5)。来自新生大鼠的初级心肌已经由大鼠酰基-辅酶合成酶基因驱动被报导结构所转染(Kanda等，Heart Vessels 2000，15(4)：191-6)，同样也可以是α-和β-心肌球蛋白重链基因增强子(James等，Circulation 2000 Apr11，101(14)：1715-21)。
本发明的结构除了增强和调节修饰细胞中连接蛋白表达的增强子外，还包括其他序列。例如已经显示血清反应因子(SRF)基因调节许多肌肉和生长因子可诱导基因的转录。由于SRF不是肌肉特异性的，因此推测它是由恢复肌源性辅助因子激活肌肉基因。心肌因子是肌肉转录因子家族的一个成员，它提供了一种机制就是SRF将肌源性活动传递给肌肉基因。(Wang等，Cell.2001 Jun 29；105(7)：851-62)。
在另外一种实施方案中，所述增强子是一种调节增强子(例如可诱导增强子)，例如四环素-调节增强子，它的表达可通过暴露于外源性物质来调节(例如四环素)。另外一种在本发明中应用的调节增强子系统是紫胶操纵-抑制基因调节系统，它调节哺乳动物的增强子(Cronin等，Genes Dev.2001 Jun 15，15(12)：1506-17)。
对于真核生物的表达，所述结构应该包含最小量的可操纵的连接于有意义DNA的真核增强子，它反过来可操纵的连接于一种多聚腺苷酸信号序列。所述多聚腺苷酸信号序列可选自任何各种文中所知的多聚腺苷酸信号序列。一种典型的多聚腺苷酸信号序列是SV40早期多聚腺苷酸信号序列。所述结构也可包括一个或多个内含子，如果合适，它会提高有意义DNA的表达水平，特别是其中的有意义DNA是cDNA的时候(例如不包含天然发生序列的内含子)。任何各种文中所知的内含子都可以应用(例如人类β-球蛋白内含子，它在有意义DNA的5’位置插入所述结构)。
在一种作为选择的实施方案中，传输给细胞的核酸是一种编码连接蛋白的RNA。在这种实施方案中，所述RNA适合靶细胞中的表达(例如RNA的翻译)。制造编码有意义蛋白质RNA(mRNA)的方法在文中是熟知的，并且可以容易的应用于本发明中有用的编码连接蛋白RNA的产物。
重组连接蛋白的制造
被修饰表达重组连接蛋白的细胞包括任何可以通过连接蛋白-介导的缝隙连接和心肌细胞偶联的细胞，包括骨骼肌细胞、干细胞(例如间叶细胞、造血细胞)，成纤维细胞、心肌细胞等，它们之前先经遗传修饰而提供细胞中重组连接蛋白(例如Cx43)的表达。在特别有意义的实施方案中，所述细胞是骨骼肌细胞。
细胞可从宿主(例如内源性细胞)或从合适的培养细胞索获得。细胞根据宿主可以是自体同源的、同种异体的或异种的(例如灵长类动物、猪等)。在特定的实施方案中，所述细胞通过活组织检查从受试者或病人收集(例如肌肉活组织检查)。后面的那种实施方案使得将重组的表达连接蛋白的细胞自体同源的移植入宿主心肌。
适合用来制造重组的表达连接蛋白细胞的细胞包括骨骼肌细胞，特别是成人骨骼肌细胞，干细胞(例如间叶细胞、造血细胞)，成纤维细胞、心肌细胞等。然后将一种提供产生连接蛋白(例如Cx43)的表达结构在转化之前和/或之后导入在活体增殖和培养的细胞，从而提高了用来移植入心肌组织的重组连接蛋白表达细胞的数量。
在一种实施方案中，所述细胞是骨骼肌细胞或细胞索，用一种合适的载体增殖和转化，使其表达连接蛋白(例如Cx43)。这些重组的连接蛋白表达细胞在活体内培养，并用来移植入心肌。在另外一种实施方案中，所述细胞是一种新鲜初级培养细胞或冷冻培养细胞。
将连接蛋白结构导入哺乳动物细胞的方法包括为文中技术人员所知的标准规则。
连接蛋白表达的调节通过应用可操纵插入包含用来转导修饰细胞的连接蛋白基因的调节成分而实现。其他调节连接蛋白表达的方法包括对于重组细胞来说内源性的基因调节成分或通过加入调节连接蛋白表达的化合物(例如在植入所述重组细胞时或之后)。
修饰细胞中的连接蛋白表达可通过这样的技术探测，例如应用重组连接蛋白特异性的抗体的western印迹。其他证实转化细胞中重组连接蛋白表达的方法包括PT-PCR，它应用了连接蛋白mRNA特异性引物或对培养基中的转化细胞应用免疫荧光技术。连接多肽促进重组细胞和心肌细胞之间电连接产生的能力可在活体模型中测定。
重组连接蛋白细胞和心肌细胞之间功能性缝隙连接的产生
可以培养所述重组表达连接蛋白的细胞，从而在活体外扩增细胞数量。在获得理想数量的重组细胞后，将所述细胞导入心肌组织。作为选择或附加，将重组连接蛋白细胞和心肌细胞在活体外共培养接着移植。连接蛋白的产生使得修饰细胞通过缝隙连接诱导产生和心肌细胞的电连接。由于心肌细胞和非心肌细胞的细胞和电生理特性有差异，同步的电交流需要心肌细胞和非心肌细胞紧密连接。本发明阐述了两种不同细胞类型之间一种独特新型的作用，这种作用可用来治疗心肌疾病和病症。
治疗心脏疾病的方法
此发明提供了纠正心脏传导障碍的方法以及治疗心脏传导障碍相关心脏疾病的方法。本发明通过增加细胞与细胞之间的交流改善了标准细胞移植，因此使得更能同步收缩。所述方法通常包括将宿主心肌组织和表达连接蛋白(Cx43)的重组细胞接触，这样所述连接蛋白促进了重组细胞和心肌细胞之间电连接的产生。所述连接通过改善心脏传导促进心脏传导障碍的纠正。在特别有意义的实施方案中，所述重组细胞是骨骼肌细胞。
所述受试的方法用于治疗各种不同的疾病，其中心肌细胞改善的协同传导是理想的。
可按照本发明的方法治疗的典型疾病包括，但不局限于，完全性心脏传导阻滞、折反性心律失常(例如室性心律失常)充血性心力衰竭等等。任何从改善的同步收缩受益的疾病或病症可按照本发明的方法治疗。
重组连接细胞的移植
将重组连接蛋白细胞移植入受试者的心肌可应用熟知的外科技术，如将组织和/或独立细胞移植入心脏。大体上，有两种方法将所述重组细胞导入受试者的心脏组织：1)外科，直接注射；或2)经皮穿刺技术，如美国专利第6,059,726所述(Lee和Lesh，“定位心脏的AV连接及在其中注射活性物质的方法(Method for locating theAV junction of the heart and injecting active substances therein)”)。
所述重组连接蛋白细胞可移植入心脏的任何发生传导障碍的区域。移植重组细胞的量根据所治疗的心脏疾病类型，心肌组织的总体损害和细胞中连接蛋白表达的水平来决定。
在特定的实施方案中，所述重组表达连接蛋白的细胞通过经皮穿刺方法移植。如果心脏组织损害的部位可通过非侵入诊断技术在受试者中精确测定，那么所述重组连接蛋白细胞可被直接注入文中所知的心肌组织。治疗有效所必须的重组细胞量根据所治疗病症的类型以及发生心脏损害的范围变化而变化。
免疫抑制剂可与不是来自宿主的Cx43过分表达细胞联合应用，从而使得移植排斥的可能最小化，例如同种异体或异种细胞。
和其他治疗联合
如果合适，所述受试的方法也可以与其他心脏治疗的方法联合应用。在特定的实施方案中，可在移植重组连接蛋白细胞入受损心肌的同时联合施用治疗特定类型传导障碍的药物(例如在移植前、期间和/或后)。适合与本发明的方法联合治疗的心脏药物包括，但不局限于，生长因子、编码生长因子的多聚核苷酸、血管源性药物、钙通道阻滞剂、抗高血压药物、抗有丝分裂药物、影响肌肉收缩力的药物、抗动脉粥样化药物、抗凝剂、β-阻滞剂、抗心律失常药物、抗炎药物、血管舒张药、血栓溶解剂、强心苷、抗生素、抗病毒药物、抗真菌药物、抑制原虫的药物、抗心律失常药物(用来治疗室性心律失常)，硝酸盐、血管紧张素转换酶抑制剂(ACE)；脑利尿肽(BNP)；抗肿瘤药物、类固醇等等。
本发明也可以是冠状动脉分流术移植(CABG)的补充步骤。用有功能的肌肉取代无功能的心肌疤痕并同时血管再造比单独血管再造(分流术)改善心肌功能更明显。与CABG联合的移植重组连接蛋白细胞在手术期间提供了附加的治疗，通过减少壁压力和局部缺血负担阻止了连续的心肌重塑。可在CABG手术时移植重组细胞而省去将重组细胞输入心肌的附加外科步骤。
治疗的评估
根据本发明的方法进行治疗的效果可以各种方法监测。通常对于心脏传导阻滞来说，心电图(ECG)或holter检测器可用来测定治疗的效果。心脏由于在心脏内产生的电脉冲而收缩；ECG测定的是心脏节律和电脉冲。因此ECG是一种测定治疗是否已经改善或维持，阻止或缓解受试者心脏电传导恶化的十分有效和非-侵入性方法。应用holter检测器，以及很长时间才会用旧的便携式ECG来监测心脏的异常、心律失常等等，也是一种评价治疗效果的可靠方法。
也可应用电生理实验来评估治疗，所述实验包括在心脏内经皮置入导管来评估心脏的传导特性。
当所述治疗的疾病是充血性心力衰竭时，可应用超声心动图或核研究测定心室功能的改善。在将重组连接细胞移植入心肌组织前和后比较超声心动图可以可靠的评估所述治疗。
上述评估治疗效果的方法仅仅是典型的，并不局限于此。许多探测同步连接的合适测定(例如通过监测心脏功能)在文中是熟知的，并适合应用。
                              实施例
下面给出的实施例为文中的那些普通技术人员揭示和描述了如何制造和应用本发明，并且不是为了限制本发明者所考虑的发明范围，也不是为了表明下面的实验是所有或仅仅实施的实验。已经做了努力保证所用数字的精确性(例如数量、温度等等)，但一些实验错误和偏差应该解决。除非另外表示，各个部分是按重量分的，分子量是平均分子量，温度是摄氏温度，压力是大气压或接近大气压。
当参考特定的实施方案描述本发明时，文中的那些技术人员应该明白可做许多变化，并可用等价物取代而不偏离本发明的正确精神和范围。此外，可做许多修改使得特殊的情况、材料、重要组合物、方法、方法步骤或步骤适应本发明的客观精神和范围。所有的这样修改规定必须在附属权利要求的范围之内。
实施例1：骨骼成肌细胞/肌管电刺激心脏组织能力的描述
组织工程技术是治疗终末期心脏疾病和传导障碍传统方法的有吸引力的另外一种选择。细胞移植预计可恢复病人的功能。
骨骼肌活组织检查包括能分裂和繁殖的卫星细胞、骨骼成肌细胞。骨骼成肌细胞一开始表达Cx43。然而，当所述细胞成熟并分化为肌管时(发展为肌肉收缩纤维)，Cx43在骨骼肌管中是表达最少的。
骨骼成肌细胞和肌管有不同的细胞电生理特点。测定成肌细胞分化为肌管不同时期中动作电位参数的特点。通过酶弥散将骨骼成肌细胞从2-5天新生大鼠后肢肌肉分离出来。通过用分化介质(DM)(98％DMEM，2％马血清(HyClone)，青霉素G 100U/ml和链霉素100μg/ml)取代生长介质使得成肌细胞在培养基中分化为多核肌管。研究在DM中温育2-14天的成肌细胞和肌管。应用整个单元形状的膜片钳技术记录动作电位。获得了以下测定值：静息膜电位(RMP)、动作电位放大(APA)、50％(APD50)复极化时动作电位持续时间(表1)。
在第4天成肌细胞开始分化为多核的肌管，到10-14天形成自发收缩纤维网。
表1.不同天DM中动作电位参数的变化
组别 RMP(mV)   APA(mV)   Vmax (V/s) 阈值(nA) APD50(ms)
DM 2(n＝10) -27.4±2.9   60.1±5.8   27.44±4.2 31.14±6.5 15.1±1.7
DM 4(n＝4) -38.3±3.6   94.4±6.5   72.2±6.7 23.8±2.39 8.1±0.1
DM 6(n＝8) -50.6±3.6   113.9±3.4   102.9±9.0 18.1±0.9 7.4±0.5
DM 8(n＝11) -52.8±1.8   123.7±4.3   123.5±6.4 17.2±1.9 7.4±0.4
DM 10(n＝7) -53.1±2.5   133.1±2.7   153.4±8.9 29.2±5.3 7.4±0.5
DM 11(n＝10) -53±1.7   133.5±3.1   146.4±2.9 33±2.8 5.1±0.5
DM 12(n＝9) -52.4±3.2   127.4±2.9   142.7±6.4 30.7±6.8 5.4±0.7
DM 13(n＝9) -48.8±3.1   120.6±3.0   129.3±6.8 30±4.9 7.5±0.6
DM 14(n＝9) -46.8±0.9   120.2±5.4   114.6±3.9 43.3±4.3 6.4±0.6
新鲜分离的骨骼成肌细胞没有可测定的动作电位并且不能被电刺激。
RMP.第8天和第10-14天之间没有明显差异(图1A)。
APA.随着发育期间肌管的RMP变得更负，动作电位的放大值也上升并在第10-11天到达峰值。接着，APA平行下降直到13-14天。在第10天和第8天，第10-14天之间没有发现明显的差异。(图1B)
Vmax：注意到了和APA相似的变化。(图1C)
APD50：APD50的最小值出现在第11-12天，接着上升。各组间没有明显差异除了第2天。(图1D)
因此，成肌细胞分化为肌管不同时期的动作电位参数是改变的。
膜片钳实验数据显示了DM中少于7天的成肌细胞相对电不易刺激性。这些结果的含义就是移植的骨骼成肌细胞/肌管不会传播电脉冲，除非通过缝隙连接增加细胞偶联。
计算机模型用来评估骨骼成肌细胞和肌原纤维与心肌细胞之间的细胞-细胞电刺激(Lee R等，Annals of Biomedical Engineering 28-1：S54，2000)。通过包含每种细胞类型的测定细胞参数来做模型。所述计算机模型的结果测定了骨骼细胞的动作电位持续时间(APD)和心肌细胞相比是短的(成肌细胞和肌原纤维分别是1.6ms和2.8ms)，并且这是骨骼-骨骼以及骨骼-心脏兴奋的主要限制。对于骨骼肌细胞来说，足够快的刺激它们下游的邻居，在2.5ms之内，它们自己复极化之前，需要高度的细胞间偶联。心肌的APD较长(178ms)，并且对于心肌细胞来说，在带电荷的细胞复极化之前需要长时间使得它们下游的邻居带电。下降的细胞间偶联增加了使邻接细胞带电所需要的时间。细胞间偶联的减少使得相同纤维中的细胞-细胞兴奋，它的比列对于心室、骨骼成肌细胞和骨骼肌纤维细胞分别是45∶5∶1。在混合纤维中，兴奋的限制性因素是骨骼肌细胞是来源细胞。
这些结果表明：1)较短的骨骼肌动作电位通过限制了为心肌细胞提供足够兴奋电荷的能力限制了骨骼肌-心肌的传导；2)骨骼成肌细胞分化为肌原纤维进一步限制了兴奋能力；3)成功的骨骼肌至心肌传导需要非常高水平的缝隙连接偶联。
因此，减少细胞间偶联的情况将明显的减少移植的骨骼肌细胞和邻接心肌之间的电传递。电传导的减慢或阻滞会导致潜在的威胁生命的心律失常。
实施例2：骨骼肌移植的电生理结果
为了评估骨骼肌移植入心肌的电生理结果，我们应用一种活体模型评估心脏的传导。将基因转移至心脏传导系统特定区域的可能性已经在以前证实过了(Lee等.1198PACE 21-II：606；Gallinghouse等，1996年11月Am Heart Assoc；美国专利第6,059,726号)。例如，描述了大鼠和猪AV结节中重组β-半乳糖苷酶高效和特殊局部的表达。大鼠中AV阻滞的产生证实了AV结节注射的精确性和重复性(Lee等1998 J Appl Physiol.85(2)：758-763)。作为心房和心室间电传递的电绝缘导管，所述AV传导轴在关键的位置以研究心脏电生理。
为了测定骨骼肌移植是否改变AV结节电生理特性的传导，应用了一种AV结节注射大鼠模型(Lee等1998 J Appl Physiol.85(2)：758-763)。将动物化学性的去神经(应用阿托品和普萘洛尔抑制自主神经系统的影响)，并在注射前和处死时，用右心房增速整搏和心房程序性额外刺激研究。测定表面ECG PR间隔，和AV结节阻滞周期长度(AVBCL)(AV传导从而变得更长，接着不超导的率)以及有效不应期(ERP)(心房额外刺激不能通过AV结节传导的连接间隔)。将单剂量的骨骼成肌细胞(1×105，15μl)或载体注入大鼠(n＝8)的AVN。
移植骨骼成肌细胞的动物中AV连接的电生理特性明显改变了。记录了Wenkebach周期长度(70.0±4.4对57.0±5.0ms；p＜0.01)和AV结节不应期(113.8±5.6对87.0±6.2ms；p＜0.005)的明显改变，这是将注射骨骼成肌细胞的大鼠和对照动物作对比的结果。AVN的组织学检查揭示了大约10％的AVN最小限度没感染的包含进来。组织学上AV传导轴在对照载体注射中看上去是正常的。有趣的是，PR间期没有明显的改变，这反映了心脏传导特征，即表面EKG标记物的不敏感。
这些结果进一步加入了一个事实就是，移植的骨骼成肌细胞(甚至包含一小部分的AVN)改变了心脏的传导，并导致产生减慢传导或传导阻滞的区域。所以，当骨骼成肌细胞分化为肌管并丧失形成缝隙连接的能力时，传导电脉冲的能力就下降了。
方法和材料
下面的材料和方法应用于实施例3-7。
骨骼成肌细胞的分离和培养
这项规定由旧金山加利氟尼亚大学动物研究协会批准，根据联邦政府的指导方针实施。根据前述用酶分散将新生骨骼成肌细胞从2-5天的C3H新生小鼠中分离出来，并如前所述培养(Rando，T.和Blau，H.M.(1994)，J.Cell Biol.125，1275-1287)。分离之后，用生长介质培养细胞(GM)(80％F-10介质(GIBCO BRL)，20％FBS(HyCloneLaboratories，Inc.)，青霉素G 100U/ml和链霉素100μg/ml，bFGF 2.5ng/ml(人类，Promega Corp))。将骨骼成肌细胞保存在GM介质中，处于湿度为95％的空气和5％的CO2中。一旦培养基达到了75％汇合(第0天)，可在GM介质中培养成肌细胞或将其转移至分化介质(DM)(98％DMEM，2％马血清(HyClone)，青霉素G 100U/ml和链霉素100μg/ml))。在DM中培养的成肌细胞在湿度为95％的空气和5％的CO2中温育。在第0天、第2天、第4天和第7天收集成肌细胞，分别提取RNA和蛋白质。
连接蛋白43的产生
将大鼠连接蛋白43(Cx43)cDNA克隆入MFG逆转录病毒载体；并如前所述转导入鼠成肌细胞(Springer ML，Chen AS，Kraft PE，Bednarski M，Blau HM.，MolecularCell.1998，2：549-558)。已经显示这种载体在肌肉中是稳定表达的(Dhawan J，PanLC，Pavlath GK，Travis MA，Lanctot AM，Blau HM，Science 1991：254，1509-1512)。已经表达E.coliβ-半乳糖苷酶(β-gal)基因(TR/Z)的初级成肌细胞用作对照成肌细胞(Springer，M.L.，和Blau，H.M.，Som.Cell Mol.Genet.1997：23，203-209)。
应用RT-PCR测定mRNA水平
来自培养细胞的RNA应用Qiagen成套材料配制，Qiagen，Inc.CA并由分光光度测定法(A260和A280测量)量化。每个样本的RNA(1μg)在37℃下应用Olig-dT逆转录1小时，将相同量的cDNA分别为连接蛋白43、肌细胞生成蛋白、myoD、肌间线蛋白和GAPDH放大。表2描述了在这项研究中应用的不同引物。在94℃变性5分钟后，以特定的周期实施放大(94℃为30”，55℃为30”以及72℃为30”)，接着又是5分钟的72周期。半量化GAPDH和连接蛋白43产物的最佳周期是25；对于肌细胞生成蛋白、myoD和肌间线蛋白来说是22。通过在2％的琼脂糖(agrose)凝胶上电泳分解PCR产物，并用NIH软件进行光密度分析。使连接蛋白43、肌细胞生成蛋白、myoD和肌间线蛋白表达的水平标准化为GAPDH的水平；第0天的水平设定为1。
表2：在实验研究中应用的引物的总结
基因 引物(正向) 引物(反向)
连接蛋白43 5’-TACCACGCCACCACCGGCCCA-3’ 5’-GGCATTTTGGCTGTCGTCAGGGAA-3’
肌细胞生成蛋白 5’-CCTTAAAGCAGAGAGCATCC-3’ 5’-GGAATTCGAGGCATAATATGA-3’
myoD 5’-TTCTTCACCACACCTCTGACA-3’ 5’-GCCGTGAGAGTCGTCTTAACTT-3’
肌间线蛋白 5’-CCGGAGGCTTGGGGTCGCT-3’ 5’-CTGTTCCTGAAGCTGGGCCTGG-3’
GAPDH 5’-AAAGTGGAGATTGTTGCCAT-3’ 5’-TTGACTGTGCCGTTGAATT-3’
利用Western印迹探测蛋白质表达
从培养细胞中提取全部的可溶性蛋白，并通过Bradford方法量化。通过SDS-PAGE将可溶性蛋白(40μg)分离，应用10-20％的溶解凝胶进行连接蛋白43、MHC和P21探测。将蛋白质电印至HYBONDTM-ECL硝化纤维膜，并且如所述的应用ECL探测成套工具进行免疫反应。应用抗-连接蛋白43兔多克隆抗体(Zymed Laboratories，Inc.Ca.)(1∶1000)探测连接蛋白43。应用Mf-20抗体探测肌球蛋白重链蛋白质(Developmentalstudies hybridoma bank，University of Iowa)(1∶2000稀释)。应用P21抗体探测P21蛋白质(Chemicon international，Inc.Cz.)(1∶500稀释)。
免疫荧光分析
对于连接蛋白43、MHC、肌间线蛋白实施免疫荧光的方法由Tomakidi P，Cheng H，Kohl A，Komposch G，Alonso A，Cell Tissue Res，2000；301(2)：323-327描述。简要的说，将成肌细胞放置在带有GM培养基盒的载玻片上。在70％-80％融合时，将介质保存在GM中或转到DM中。在第0天、第2天、第4天和第7天收集细胞。在用PBS中4％的多聚甲醛固定后，用0.2％的三硝基甲苯X-100/PBS浸透，接着用3％的BSA阻滞细胞1小时，和初级抗体在室温下温育1小时。在用PBS洗涤3次后，应用FITC-连接的次级抗体温育1小时。肌间线蛋白抗体(Sigma，St.Louis，Mo)，连接蛋白43(Zymed Laboratories，Inc.Ca.)和MF-20(Developmental studieshybridoma bank，University of Iowa)分别是1∶100、1∶100和1∶50。
微注射技术
利用可透过缝隙连接的染料，荧光黄(Molecular Probes，Or.)通过微注射细胞评估缝隙连接。微注射的实施于：1)当70％-80％融合时，对照(TR/Z)和CX43成肌细胞，2)TR/Z和CX43肌管以及3)共培养的成人大鼠心肌细胞(ARC)和成年骨骼成肌细胞或肌管。染料溶液包含2％的荧光黄(可渗透缝隙连接)和1％的无菌蒸馏水中的四甲基若丹明-右旋糖苷(不能渗透缝隙连接；Molecular Probes)。用显微操作器5171(Femtojet，Eppendorf)通过0.5±0.2μm的尖嘴微量移液管(Femtojet，Eppendorf)在80hpa的脉冲压力下持续0.3秒实施微注射。清洗培养的细胞并用包含10％FBS的磷酸缓冲盐溶液(PBS)代替所述介质。用具有定相和荧光光学器件的Nikon TE300显微镜实施注射。
实施例3：缝隙连接蛋白的表达
如上所述将编码连接蛋白43的核酸导入骨骼肌细胞。评价表达Cx43的重组成肌细胞之间或分化为肌管的表达Cx43的重组成肌细胞和其他类型的成肌细胞或肌管之间的功能性缝隙连接的形成。一种对照(TR/Z)成肌细胞，在分化为肌管期间一开始表达Cx43接着下调Cx43的表达，用它作为对照成肌细胞中，但不是对照肌管中的功能性缝隙连接和染料转移的对照。
在图2A-2D中，显示了Cx43 mRNA(图2A和B)以及对照细胞和Cx43细胞中蛋白质的变化(图2C和D)。图2A是显示对照细胞(TR/Z)和重组表达Cx43细胞在第0天、第2天、第4天和第7天mRNA Cx43水平的RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图。图2B显示了通过RT-PCR测定的三组对照和三组重组表达Cx43细胞样本在第0天、第2天、第4天和第7天Cx43 mRNA的平均水平。图2A和2B显示了到第7天TR/Z对照(未转化)骨骼肌管中所述连接蛋白43mRNA的水平明显下调，然而相比之下，所述Cx43修饰细胞在第0天和第7天的Cx43mRNA表达没有表现出明显的差异，这表明完成了用连接蛋白43基因的逆转录病毒转导，并且成熟肌管中有Cx43的表达，这和对照肌管不一样(第7天)。
图2C和2D显示了和在图2A和2B中所述用来分析Cx43 mRNA的相同细胞相关的Cx43蛋白质水平。图2C是Cx43蛋白质的的Western印迹图，这表明了对照细胞中存在的Cx43蛋白质和重组表达Cx43细胞在第0天、第2天、第4天和第7天的相对量。图2D是测定第0天、第2天、第4天和第7天三组对照细胞样本和三组Cx43表达细胞样本中存在Cx43蛋白质的相对量的Cx43 Western印迹实验图。蛋白质表达的结果和RT-PCR的结果一致证明了在第7天重组Cx43的表达可挽救对照细胞中连接蛋白Cx43的丢失(图2C和2D)。在图2A和2B中显示的RT-PCR结果证明了如所期望的那样，对照细胞中Cx43 mRNA的水平逐渐下降，在第7天几乎没有，然而重组表达Cx43细胞的Cx43 mRNA水平从第0天至第7天是不变的。GAPDH在这些RT-PCR研究中用作内部对照。对照细胞中Cx43的抗体Western印迹杂交显示Cx43的表达在第2天是下调的，在第4天后几乎没有(在肌管形成期间)，然而重组表达Cx43的细胞没有显示任何下调，甚至在第7天可以探测到上调。骨骼成肌细胞在分化前后没有发现其N-钙粘蛋白mRNA和蛋白质表达水平有差异。
调查功能性缝隙连接形成的微注射研究在对照细胞(成肌细胞和肌管)以及重组表达Cx43细胞(成肌细胞和肌管)上完成。用若丹明右旋糖苷和荧光黄标记所注射的细胞，荧光黄能够通过功能性缝隙连接从一个细胞转移至另外一个。图3相衬组中的黑箭头先显示了每组实验中所注射的细胞。图3是显示骨骼成肌细胞或肌管之间微注射研究的图，它表明了若丹明或荧光黄染料的相对转移。图3的每一组都显示了有意义细胞在相衬显微镜检查和合适的荧光照明下的若丹明或荧光黄染料，图3行A是表达Cx43的对照成肌细胞图，它接触其他对照成肌细胞；行B是Cx43成肌细胞-Cx43成肌细胞图；行C显示了对照肌管(无Cx43表达)-对照肌管；行D显示了Cx43肌管-Cx43肌管。
这些微注射研究表明在骨骼成肌细胞中，在对照(TR/Z)和Cx43成肌细胞中都能观察到染料的转移(荧光黄)(图3；行A和行B)。在DM介质中培养7天后，在来源于对照成肌细胞的肌管中没有观察到任何染料转移，图3；行C。染料转移在置于分化介质的Cx43转导骨骼肌细胞中持续存在7天(图3；行D)。总的来说，这些微注射实验显示了放置在分化介质中的Cx43转导骨骼成肌细胞发生的染料转移，而在对照成肌细胞中没有。
实施例4：缝隙连接功能和共培养实验
为了评估在成肌细胞和所培养的成年大鼠心肌细胞(ARC)之间缝隙连接的形成，通过标准方法将单个成年大鼠心室肌细胞酶促的从重为200-250g雌性Sprague-Dawley大鼠分离出来。简单的说，就是在腹腔内麻醉后(戊巴比妥100mg/kg)，快速切除大鼠心脏并应用Langendorff技术通过主动脉逆行灌注。在37℃时应用溶液A(标准Ca2+自由溶液，NaCl 134mM，KCl 5.4mM，Hepes 10mM，葡萄糖10mM，MgCl21mM，NaH2PO4 0.33mM，用NaOH滴定至pH7.4)实施灌注5分钟，从而用溶液A，0.1mMCaCl2和1mg/ml胶原酶(类型B，Boehringer Mannheim，德国)持续15分钟，接着用溶液A和CaCl20.2mM清洗内部持续5分钟。然后，将左心室去除并剁碎为小片，将其放在玻璃锥形烧瓶中用20ml溶液A和0.1mM CaCl2在37℃下温育10分钟并不断摇动。过滤细胞悬浮液(200微目)并将滤液沉淀5分钟。用1mM包含Ca2+的溶液使得所述上层清液的Ca2+浓度逐渐增加直至0.5mM的最终浓度。ARC在用10％的FBS、100U/ml的青霉素G和100μg/ml的链霉素补充的HAM-F-12/M199(1∶1)中生长，它处于涂有层粘连蛋白的皿上，密度为104杆状细胞cm-2。
在包含血清的介质中，ARC经历了一种形态学上的变化，被描述为去分化/再分化，其特点是杆状的丢失，肌原纤维的分解以及随后的扩展，和收缩器的重组。在第3天，加入胞嘧啶阿糖核苷(arabinouranoside)(5μM)防止成纤维细胞过分生长。大多数的ARC到第7天就再分化了，并可观察到收缩活动。在去分化/再分化完成之后，在ARC培养基中加入骨骼成肌细胞(104/cm2)。将它们保存在HAM-F-12/M199(1∶1)中过夜，并在第二天实施微注射，从而评估成肌细胞和ARC之间的染料转移。为了诱导肌管的形成，将介质换成DM，并在肌管形成后(第7天)实施微注射。
调查心肌细胞和对照细胞(骨骼成肌细胞和肌管)或与表达Cx43细胞(骨骼成肌细胞和肌管)之间功能性缝隙连接形成的微注射研究完成了。用若丹明右旋糖苷和荧光黄标记注射细胞，荧光黄能够通过功能性缝隙连接从一个细胞转移至另外一个细胞。图4中的黑箭头表明了每组实验中的注射细胞。在共培养实验中，可在成年大鼠心肌细胞(ARC)和对照成肌细胞(它表达Cx43，图4，行A)或与Cx43成肌细胞(图4，行B)之间观察到染料转移。甚至在分化培养基中7天后，Cx43细胞能够将染料转移至ARC，这表明了功能性缝隙连接(图4，行D)。相比之下，如图4，行C所示，对照骨骼成肌细胞和ARC之间没有染料转移。总而言之，这些实验表明了本发明独特和新型的特征，证明了通过在一种细胞中表达重组的连接蛋白可能在两种不同的细胞之间形成功能性缝隙连接。特别是，那种功能性缝隙连接可在被修饰而过分表达Cx43的成年骨骼肌细胞和心肌细胞之间形成。
实施例5：连接蛋白43的表达对骨骼成肌细胞分化的作用
为了测定连接蛋白43的表达对骨骼成肌细胞分化的作用，分析了其他蛋白质的表达水平。图5显示了分析MHC和肌间线蛋白表达水平的免疫荧光研究结果，它们是对照和Cx43细胞中，两种较强的成肌细胞分化为肌管的标记物(MHC：图5，上组以及肌间线蛋白：图5，下组)。对照的骨骼成肌细胞在用DM温育7天后分化为多核的肌管。在连接蛋白43组，肌管不会形成，即使是在DM中14天之后。明显的，重组Cx43的表达阻止成肌细胞形成肌管。图5中显示的免疫荧光研究证明了两种较强的成肌细胞分化为肌管的标记物，MHC和肌间线蛋白在第7天出现在对照样本中，而Cx43表达样本中却没有。所述MHC和肌间线蛋白的结果分别显示于图5的上组和下组。来自Western印迹的MF-20表达研究和免疫荧光研究是一致的。细胞有丝分裂停止的标记物，P21的表达在这些组中有一致的变化，并从第0天-第7天逐渐上调，这反映了当介质变为DM时，TR/Z和Cx43细胞都停止分裂。
为了测定重组连接蛋白43的表达是否对于肌管有害，或仅仅在从成肌细胞分化为肌管期间是有害的，用带有Cx43基因的复制-缺陷腺病毒(Ad Cx43)转染骨骼成肌细胞和肌管。用Ad Cx43转染并转移至分化介质的成肌细胞肌管形成减少。相比之下，用Ad Cx43转染的完全分化的肌管保持正常外观，它们自己整齐的排列成一行，和对照肌管相似。用不含Cx43的对照腺病毒转染正常发展。
实施例6：骨骼肌中Cx43的表达改善了AV结中电传导
为可测定强制的连接蛋白表达是否会改善心脏的传导，用Cx43转导骨骼肌细胞(和活体外实验用的相同细胞)，并将其注入免疫缺陷大鼠的AV结中(Lee等，1998 JAppl Physiol.85(2)：758-763)。将注射Cx43转导骨骼成肌细胞(2.5×106细胞/25μl；n＝8)的动物和注射对照骨骼成肌细胞(2.5×106细胞/25μl；n＝5)的动物作比较。测定表面ECG PR间期，以及AV结阻滞周期长度(AVBCL)(AV传导从而变的更长，接着不传导的率)和AVN有效不应期(AVN ERP)(心房额外刺激不通过AV结传导的连接间期)。
和对照骨骼肌细胞注射动物相比注射Cx43转导的骨骼成肌细胞的动物中观察到了明显PR间期的缩短(40.6±1.9ms vs 47.6±2.5ms；p＜0.0001，成对T-检验)。和注射对照骨骼成肌细胞的动物相比，注射Cx43转导的骨骼成肌细胞的动物中AVBCL(96.7±10ms vs 112.0±11.0ms；p＜0.03，成对T-检验)和AVN ERP(80.0±9.2msvs 100.0±16.0ms；p＜0.001，成对T-检验)明显增加。
这些结果表明和对照骨骼成肌细胞相比，注射Cx43转导的骨骼成肌细胞的动物中通过AV连接的电传导明显改善了。因此，重组细胞中连接蛋白的产生为重组细胞和邻接心肌细胞之间提供了电连接，这反过来为心房和心室之间提供了更好的电机械同步性。
实施例7：以前心肌梗死病人中Cx43表达细胞的自体移植
人类心肌病的治疗如下开展。从经历前壁、侧壁或下壁心肌梗死的病人获得肌肉活组织检查，但不是从需要冠状动脉分流术(CABG)的病人获得。来自活组织检查的骨骼肌细胞是活体外培养的，并通过上述方法遗传修饰表达人类连接蛋白(Cx43)。通过连接蛋白免疫荧光测定分析被修饰骨骼肌的重组连接蛋白表达。在特定的实例中，通过上述的活体外荧光黄染料测定分析所述细胞和心肌细胞形成功能性缝隙连接的能力。
在分析所述修饰骨骼肌细胞后，将一治疗有效剂量的修饰骨骼肌细胞植入病人的心脏组织。在特定的实施例中，病人自己的骨骼肌细胞不能用作心脏治疗时，一种表达重组人类Cx43的重组肌肉细胞索可合适的和为文中那些技术人员所知的免疫抑制药物一起联合应用。接着用注射导管将表达Cx43的肌肉细胞静脉内植入，其中所述导管的来源有许多(例如可注射的导管，如Johnson的NOGA系统、BioHeart的Myocath、Biocardia、Boston Scientific的stiletto，Transvascular导管等)或CABG操作的皮下注射器。在手术后监测病人评估治疗的效果。
病人
所述病人是男性和女性，通常在18-75岁之间，诊断为陈旧性心肌梗死或非-缺血性心肌病。
活组织检查
所述骨骼肌活组织检查在病人预期的冠状动脉分流术几周内(例如3-4周)获得，其中所述操作是正确的。将同源的骨骼肌细胞(成肌细胞和肌管)从骨骼肌肉活组织检查中分离。在无菌的外科条件下，应用开放的活组织检查将骨骼肌从肌腹切割下来。所述活组织从病人的大腿(四头肌-股肌侧面)或腓肠(腓肠肌)中部获得。尝试从活组织将污染的筋膜切除。
四头肌-股肌侧面-在大腿的下三分之一沿着大腿前外侧部做纵向切割。切开软组织和筋膜，就可以确定和暴露四头肌-股肌侧面。沿着肌纤维的纵轴纵向切除一部份肌肉，并将其放入转移介质的容器中。
腓肠肌-在小腿中部后外侧腓肠肌区域纵向切割。切开至深筋膜暴露腓肠肌。沿着肌纤维的纵轴纵向切除一部份肌肉，并将其放入转移介质的容器中。
自体同源细胞的体外繁殖和遗传修饰
上面描述了利用人类连接蛋白结构在活体外分离、扩增和转导同源骨骼肌细胞的方法和原则。例如，将人类连接蛋白(例如Cx43)cDNA克隆入MFG逆转录结构，并用相似的方法转导入同源的骨骼肌细胞，正如Springer ML等所描述的，MolecularCell.1998，2：549-558。这种结构通常稳定的表达于同源肌细胞中。
培养所述经遗传修饰的细胞，使其浓度为大约106-109细胞/ml。所述经遗传修饰的细胞可在移植入病人之前于冷藏下存储(通常是大约0℃)。通过Trypan Blue DyeExclusion的细胞活性可作为细胞活性的测定。通过免疫荧光探测Cx43的表达和/或通过上述功能性缝隙连接的测定证实了效力。
通过经皮的方法移植重组连接蛋白表达细胞
将重组连接蛋白表达细胞移植入心肌包括通过应用导管输入系统施用重组细胞。将所述重组细胞注射入先前梗死部位不能运动的心肌疤痕。依赖于靶梗死区域的大小，注射400,000,000和1,000,000,000之间的细胞悬浮液。可应用多种注射输入重组细胞。
通过将针前移通过导管至预先决定的深度实施注射。针腔的近端连接于包含重组细胞悬液的校准注射器。在通过荧光检查法、心内超声心动术或磁共振成象引导下充分对准心脏内表面后，将针前移入心内膜并注射细胞悬浮液。在完成注射后，针退回导管。在目标区域重复这个方法直至细胞转移完成。尝试着覆盖整个疤痕区域，包括它的外周。如果在CABG期间给予细胞治疗，接着应用一根针和注射器将细胞从心外膜输入至上述的不能运动区域。
治疗的监测和评价
通过文中那些技术人员所知的方法和技术实施临床状况、副反应、12-导联的心电图、24小时行走心电图以及常规的实验室试验来评价局部左心室壁的功能。可实施跟踪并在选定的移植后时间和基准(例如治疗前)相比较(例如1，2，3，4，6，和12月)。在特定的实例中，治疗的评价包括移植区域(梗死区域)局部壁运动和壁厚度的多巴酚丁胺应激心电图评价，对比心室造影术或磁共振成像。治疗后的监测和评价可用来测定梗死中功能性肌肉退化和同步电机械传导的水平。
实施例8：心脏传导疾病病人重组Cx43表达细胞的自体同源移植
病人
病人是1-90岁的男性和女性，诊断为心脏传导疾病(例如心脏传导阻滞)。所述心脏传导阻滞可以是先天性的、后天的、医源性的(例如瓣膜手术或导管切除述的并发症)或是正常老化过程的一部分。应用例7中描述的方法，将1-100,000,000修饰细胞以0.2-0.5ml体积注射入AV结区域。可通过25规格注射器，通过AV结节动脉或通过经皮输入系统将重组连接蛋白细胞外科输入(见例如美国专利第6,059,726号)。
治疗的监测和评价
通过表面的ECG可很容易的发现心脏传导阻滞(以及它的治疗)。模拟应激试验、holter检测器或电生理研究是评价治疗可供选择的补充试验。

Claims (26)

1.一种在重组哺乳动物细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法，其特征在于，所述方法包括：
使心肌细胞和经遗传修饰产生连接蛋白的重组哺乳动物细胞接触，其中所述接触为足以在心肌细胞和重组细胞之间制造产生电连接的方式；
其中在重组细胞和心肌细胞之间建立了电连接。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述重组细胞选自骨骼肌细胞、干细胞、成纤维细胞和心细胞。
3.如权利要求1所述的方法，其中所述重组细胞是骨骼肌细胞。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述骨骼肌细胞是成年骨骼肌细胞。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述骨骼肌细胞是成肌细胞。
6.如权利要求3所述的方法，其中所述连接蛋白是连接蛋白43。
7.如权利要求1所述的方法，其中所述接触包括将重组细胞移植入受试者的心肌组织中。
8.如权利要求1所述的方法，其中在重组细胞和心肌细胞之间的电连接建立后，所述重组细胞和心肌细胞有相似的传导特征。
9.一种在重组骨骼肌细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法，其特征在于，所述方法包括：
使心肌细胞和经遗传修饰产生连接蛋白的重组重组骨骼肌细胞接触，其中所述接触为足以在心肌细胞和重组骨骼肌细胞之间制造产生电连接的方式；
其中在心肌细胞和重组骨骼肌细胞之间建立了电连接。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述骨骼肌细胞是成年骨骼肌细胞。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述骨骼肌细胞是骨骼成肌细胞。
12.如权利要求9所述的方法，其中在重组细胞和心肌细胞之间的电连接建立后，所述重组细胞和心肌细胞有相似的传导特征。
13.一种在重组骨骼肌细胞和心肌细胞之间建立电连接的方法，其特征在于，所述方法包括：
使心肌细胞和经遗传修饰表达重组连接蛋白43的重组骨骼成肌细胞接触，其中所述接触为足以在心肌细胞和重组骨骼成肌细胞之间制造产生电连接的方式；
其中在重组骨骼成肌细胞和心肌细胞之间建立电连接，所述重组骨骼成肌细胞和心肌细胞有相似的传导特征。
14.一种治疗宿主心脏传导障碍的方法，其特征在于，所述方法包括：
将治疗有效剂量的一种重组哺乳动物细胞导入宿主的心脏组织，所述重组细胞经遗传修饰而表达一种连接蛋白，所述导入可有效的在重组细胞和宿主心脏组织的心肌细胞之间建立电连接；
其中所述宿主的心脏传导障碍被治疗。
15.如权利要求14所述的方法，其中所述重组细胞选自骨骼肌细胞、干细胞、成纤维细胞和心细胞。
16.如权利要求14所述的方法，其中所述重组细胞是骨骼肌细胞。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述骨骼肌细胞是成年骨骼肌细胞。
18.如权利要求16所述的方法，其中所述骨骼肌细胞是成肌细胞。
19.如权利要求14所述的方法，其中所述连接蛋白是连接蛋白43。
20.如权利要求14所述的方法，其中所述导入包括将重组细胞移植入心脏组织的梗死区域。
21.如权利要求14所述的方法，其中所述重组细胞和宿主是自体同源的。
22.一种治疗哺乳动物宿主心脏传导障碍的方法，其特征在于，所述方法包括：
将治疗有效剂量的骨骼肌细胞导入宿主的心脏组织，所述骨骼肌细胞经遗传修饰而表达连接蛋白43，所述导入可有效的在导入的重组骨骼肌细胞和宿主心脏组织的心肌细胞之间建立电连接。
其中所述宿主的心脏传导障碍被治疗。
23.如权利要求22所述的方法，其中所述骨骼肌细胞是成年骨骼肌细胞
24.如权利要求22所述的方法，其中所述骨骼肌细胞是成肌细胞。
25.如权利要求22所述的方法，其中所述导入包括将重组细胞移植入心脏组织的梗死区域。
26.如权利要求22所述的方法，其中所述重组骨骼肌细胞和宿主是自体同源的。
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