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Gebiet der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung betriffst
eine Vorrichtung zur Verwendung bei der Analyse einer Körperflüssigkeitsprobe
auf einen gewählten
Analyten und insbesondere zur Verwendung bei automatischen mehrstufigen
Analysen.
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Entgegenhaltungen
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Black, D. u. a., Anal. Biochem. 169:
197–203 (1988).
Black,
D. u. a., Annals of Rheumatic Diseases 48: 641–644 (1989).
Cerelli,
M. J. u. a., PCT Pubn. Nr. 94/03814 (1994).
Cook, J. u. a.,
Ann. Clin. Biochem. 12: 219 (1975).
Harlow, E. u. a., "Antibodies:
A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Lab (1988).
Hewett,
G. E., US-Patent 5 110 724 (1992).
Hewett, G. E. u. a., US-Patent
5 171 683 (1992).
Leuvering u. a., US-Patent 4 313 734 (1982).
Macek,
J. u. a., Z. Rheumatol. 46: 237–240
(1987).
Robins, S. P., in "Collagen in Health and Disease" (Weiss,
J. B. u. a., Herausgeber), S. 160–178, Churchill Livingstone,
Edinburgh (1982).
Siebel u. a., J. Rheumatol. 16: 964–970 (1989).
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Hintergrund der Erfindung
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Es sind Analysen zum Erfassen des
Vorhandenseins und des Niveaus einer Vielzahl von Analysen. in Körperflüssigkeitsproben
bekannt. Dieses Analysen sind typischerweise für eine einfache Verwendung
ausgelegt, so daß sie
in einer Arztpraxis oder einer anderen klinischen Umgebung, in der
das Personal möglicherweise
wenig Übung
bei klinischen Analyseprozeduren oder beim Interpretieren von Analyseergebnissen
hat, zuverlässig
ausgeführt
werden können.
Um die Notwendigkeit des Einbeziehens eines Bedieners zu minimieren,
ist es bevorzugt, daß die
Analyse in einer automatischen und/oder in sich selbst abgeschlossenen
Weise ausgeführt
wird.
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Diese in sich selbst abgeschlossenen
Analysen waren typischerweise im Interesse der Einfachheit auf Einschrittprozeduren
beschränkt.
Eine Anzahl nützlicher
Analysen sind jedoch mehrstufig, so daß mehr als ein Reaktions- oder
Verbindungsschritt erforderlich ist oder ein getrennter Waschschritt
erforderlich ist, um ungebundene Materialien von einem Substrat
zu entfernen. Weil zusätzliche
Operationen, wie das Hinzufügen
oder Entfernen von Lösungen oder
das Bewegen eines Teststreifens von einer Lösung zu einer anderen, erforderlich
sind, lassen sich mehrstufige Analysen weniger leicht automatisieren und
benötigen
im allgemeinen mehr als einen Eingriff vom Benutzer, wodurch die
Möglichkeit
von Fehlern erhöht
wird.
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Es ist daher wünschenswert, eine automatische,
in sich selbst abgeschlossene Analysevorrichtung bereitzustellen,
die in der Lage ist, mehrstufige Analysen auszuführen, insbesondere jene, die
einen Reaktions- oder Verbindungsschritt, gefolgt von einem Waschschritt
enthalten, wobei ein minimaler Eingriff durch den Bediener erfolgt.
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Ein anderes Problem, das häufig bei
Durchfluß-Analysen
auftritt, die an absorbierenden Streifen ausgeführt werden, ist die ungleichmäßige Entwicklung
der detektierbaren Spezies in dem zur Detektion festgelegten Bereich.
Es ist daher auch wünschenswert,
Merkmale innerhalb eines Analysestreifens bereitzustellen, welche
die Gleichmäßigkeit
der Verteilung detektierbarer Spezies erhöhen, welche sich auf dem Streifen
entwickeln.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die Erfindung sieht in einer Hinsicht
eine Immunprobenkassette zur Verwendung beim Detektieren eines Analyten
in einer Körperflüssigkeitsprobe vor.
Die Kassette weist eine Basis, einen Reagensträger und Mittel zum Anbringen
des Trägers
an der Basis auf, wodurch eine Relativbewegung dieser zwei Komponenten
aus einer anfänglichen
Ruheposition ermöglicht
wird, um eine erste und eine zweite Betriebsposition anzunehmen.
Gemäß einer
Ausführungsform
sind die Anbringungsmittel komprimierbare Träger an der Basis, die entgegengesetzte
Enden des Reagensträgers
tragen können.
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An der Basis sind vorhanden: eine
Probenwanne zum Aufnehmen einer Probe, ein Probenübertragungsstreifen
zum Übertragen
der Probe von der Probenwanne zu einer Probenübertragungsposition, ein Waschmittelvorratsbehälter zum
Aufnehmen einer Waschlösung
und ein Waschmittelübertragungsstreifen
zum Übertragen
der Waschlösung
aus dem Waschmittelvorratsbehälter
zu einer Waschmittelübertragungsposition.
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Auf dem Reagensträger sind ein Reaktionsstreifen
und eine Analytdetektionszone vorhanden. Der Reaktionsstreifen besteht
aus einer Kapillareinrichtung, die eine Flüssigkeit übertragen kann. Der Reaktionsstreifen
kann insbesondere die Probenflüssigkeit
von der Probenübertragungsposition
in die Detektionszone übertragen,
wenn der Reagensträger
in seine erste Betriebsposition bewegt wird, und Waschlösung aus
der Waschmittelübertragungsposition
in die Detektionszone übertragen,
wenn der Reagensträger
in seine zweite Betriebsposition bewegt wird. Gemäß einer
bevorzugten Ausführungsform weist
die Kassette weiterhin einen Streifen eines gleichmäßigen Polymernetzes
auf, das zwischen dem Reaktionsstreifen und der Detektionszone und angrenzend
an diese angeordnet ist. Die Kassette weist auch, vorzugsweise an
der Basis, ein Aufnahmekissen auf, das die Waschlösung aus
der Detektionszone aufsaugen kann, wenn der Reagensträger in seine
zweite Betriebsposition bewegt wird.
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Die Relativbewegung des Reagensträgers und
der Basis zwischen der ersten und der zweiten Betriebsposition ist
wirksam, um den Kontakt zwischen der Probenübertragungsposition und dem
Reaktionsstreifen zu unterbrechen und Kontakt zwischen der Waschmittelübertragungsposition
und dem Reaktionsstreifen herzustellen. Gemäß einer Ausführungsform
hat der Probenübertragungsstreifen
einen Überhangbereich,
der die Probenübertragungsfunktion
enthält,
welcher dafür
ausgelegt ist, in der ersten Betriebsposition in Kontakt mit dem
Reaktionsstreifen zu gelangen, und in der zweiten Betriebsposition
zu einer Position verschoben zu werden, in der kein Kontakt mit
dem Reaktionsstreifen besteht.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform weist
der Reagensträger
weiterhin eine Kontrollreaktionszone auf. In diesem Fall ermöglichen
die Anbringungsmittel eine Relativbewegung zwischen dem Träger und
der Basis, um eine dritte Betriebsposition oder Kontrollbetriebsposition
einzunehmen, in der der Kontakt zwischen dem Probenübertragungsstreifen
und der Kontrollreaktionszone hergestellt ist.
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Die Kassette weist weiterhin Analysereagenzien
auf, die sich in dem Flüssigkeitsweg
befinden, der durch den Probenübertragungsstreifen,
den Reaktionsstreifen und die Detektionszone definiert ist. Diese
auch als Reagensmittel bezeichneten Reagenzien bewirken das Erzeugen
eines detektierbaren, vom Analyten abhängigen Reaktionsprodukts in
der Detektionszone. Die Reagensmittel können beispielsweise einen markierten
Liganden einschließen, der
sich selektiv mit dem Probenanalyten verbinden kann, wobei das Reaktionsprodukt
ein durch diese Bindung detektierbarer Analyt-Ligand-Komplex ist. Alternativ
können
die Reagensmittel (i) einen markierten Liganden, der sich selektiv
mit dem Probenanalyten verbinden kann, und (ii) eine Substanz, die sich
konkurrierend mit dem markierten Liganden verbinden kann, aufweisen,
wobei das Reaktionsprodukt in diesem Fall ein durch diese konkurrierende Verbindung
gebildeter detektierbarer Substanz-Ligand- Komplex ist. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform
wird das Reagensmittel in einem umgekehrten Konzentrationsgradienten
auf die Detektionszone aufgebracht, so daß die Konzentration in Stromabwärtsrichtung über die
Detektionszone zunimmt.
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In einer anderen Hinsicht sieht die
Erfindung eine Analysevorrichtung zum Detektieren eines Analyten
in einer Körperflüssigkeitsprobe
vor. Diese Vorrichtung weist eine Immunprobenkassette, wie sie vorstehend
beschrieben wurde, und einen Kassettenleser auf. Der Kassettenleser
weist eine Öffnung zum
Aufnehmen der Kassette und eine Einrichtung zum Bewegen des Reagensträgers der
Kasssette in bezug auf die Basis von ihrer Ruheposition zu den verschiedenen
Betriebsbedingungen zu vorbestimmten Zeiten auf. Die Vorrichtung
weist weiterhin Mittel zum Detektieren des Analysereaktionsprodukts
auf.
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Kurzbeschreibung
der Zeichnung
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Es zeigen:
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1 eine
gemäß einer
Ausführungsform aufgebaute
Immunprobenkassette, wobei sich die Kassette in einer anfänglichen
Ruheposition oder Probenladeposition befindet,
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2 die
Kassette in einer ersten Betriebsposition ("Reaktionsposition"),
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3A die
Kassette in einer zweiten Betriebsposition ("Waschposition"),
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3B die
Kassette in einer dritten Betriebsposition, welche weiterhin eine
Kontrollreaktion aufweist, und
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4 eine
Detailansicht eines Abschnitts des Reaktionsträgerelements der Kassette gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung, worin der Reaktionsstreifen und die Detektionszone
dargestellt sind.
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Detaillierte Beschreibung
der Erfindung
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I. Immunprobenkassette
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1 zeigt
eine gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung aufgebaute Immunprobenkassette 10. Die Kassette enthält zwei
plattenartige Elemente, ein Basiselement 12 und ein Reagensträgerelement 14,
das durch Standard-Formungs- oder Bearbeitungsverfahren
hergestellt werden kann. Der Reagensträger ist über hier auch als Anbringungsmittel
bezeichnete einstellbare Seitenelemente 16 an der Basis
angebracht. Die Anbringungsmittel ermöglichen das Einstellen der
relativen Positionen der Basis und des Reagensträgers von einer anfänglichen Ruheposition,
um verschiedene Betriebspositionen einzunehmen, wie nachstehend
beschrieben wird.
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Die Anbringungsmittel können aus
komprimierbaren Blöcken
bestehen, wie bei 16 dargestellt ist, welche entgegengesetzte Enden
des Reagensträgers
tragen. Diese Blöcke
werden weiter komprimiert, wenn die Kassette aufeinanderfolgende
Betriebspositionen annimmt, wie in den 1–3 dargestellt ist. Die Trägerblöcke könnten auch
durch Federn oder eine kolbenartige Wirkung komprimiert werden.
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Beim Betrieb ist die Kassette vorzugsweise innerhalb
eines Kassettenlesers enthalten. Das Reagensträgerelement berührt eine
Trägerfläche mit dem
Leser, und mechanische Einrichtungen innerhalb des Lesers greifen
in das Basiselement ein und sind wirksam, um es inkrementell zum
Reagensträger
hin zu bewegen. Alternativ könnte
die Basis stationär
gehalten werden, und der Reagensträger könnte inkrementell bewegt werden.
Die mechanischen Einrichtungen innerhalb des Kassettenlesers können herkömmliche
Komponenten, wie Klemmen, Kolben, Schrittmotoren, Schneckengetriebe
oder dergleichen aufweisen. Es ist auch zu verstehen, daß die Basis
und die Reagensträgerelemente
ohne die Verwendung der mit 16 bezeichneten Träger getrennt in Eingriff mit
dem Leser gebracht werden könnten und
innerhalb des Lesers verschoben werden könnten, wobei die mechanischen
Einrichtungen innerhalb des Lesers in diesem Fall die Anbringungsmittel aufweisen
würden.
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Innerhalb der Basis 12 ist
eine Probenwanne 18 zum Aufnehmen der zu analysierenden
Körperflüssigkeitsprobe
enthalten. Neben der Probenwanne befandet sich ein Proben bertragungsstreifen 20,
so daß sie
in Flüssigkeitsverbindung
gebracht werden können.
Wenn der Streifen 20 in Flüssigkeitsverbindung mit der
Probe gebracht ist, bewirkt der Streifen das Übertragen der Probe durch Kapillarwirkung
zur Probenübertragungsposition 22.
Diese Position ist als der Abschnitt des Probenübertragungsstreifens 20 definiert,
der während
des Betriebs in Kontakt mit dem Reaktionsstreifen der Kassette gelangt,
wie nachstehend beschrieben wird.
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Der Probenübertragungsstreifen besteht
aus einem Streifen eines saugfähigen,
faserigen Materials, das in der Lage ist, eine Flüssigkeit
durch eine kapillare Strömung
zu ziehen. Eine Vielzahl faseriger Materialien, die gemeinhin in
Fasermattenfiltern verwendet werden, einschließlich Zellulose, Zelluloseacetat
und Glasfasermatrizen, sind geeignete Materialien für den Übertragungsstreifen.
Die Fasern können,
falls erwünscht,
durch chemisches Vernetzen, Wärmeverschmelzen
oder dergleichen miteinander vernetzt werden. Auch geeignet sind
poröse
Substrate, wie gesintertes Glas, geschmolzene Polymerkügelchen
und dergleichen, deren Befeuchtbarkeit und Zwischenraumabmessungen
derart sind, daß eine Bewegung
eines wäßrigen Mediums
in den Streifen durch Oberflächenbefeuchtung
gefördert
wird. Ein als Beispiel dienendes Material ist ein Glasfaserfilter mit
einer Packungsdichte von etwa 0,2–0,5 g/cm3.
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Der Streifen kann an einer aus Kunststoff oder
einem anderen reaktionsträgen
Trägermaterial hergestellten
Unterlage angebracht werden. Das Material der Unterlage ist vorzugsweise
flexibel. Der Überhangabschnitt
des Streifens muß,
wie in den 1–3 dargestellt ist, aus seiner Ruheposition
gebogen werden können,
wie nachstehend näher
erörtert
wird. Der Streifen und die Unterlage werden von einem Probenblock 23 getragen,
der aus einem komprimierbaren Material, wie Schaumgummi, bestehen kann.
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Ein Docht kann auch zwischen der
Probenwanne und dem Probenübertragungsstreifen
bereitgestellt sein, wie bei 24 in 1 dargestellt ist. Der Docht besteht
typischerweise aus einem Material niedrigerer Dichte als der Probenübertragungsstreifen,
um eine schnellere Übertragung
einer Probe zu ermöglichen.
Ein geeignetes Material ist ein Bausch aus Polyethylenfasern mit
hohem Molekulargewicht, der auch für den Reaktionsstreifen verwendet
werden kann, wie nachstehend beschrieben wird.
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Ein Filter (nicht dargestellt) kann
in die Probenwanne oder den Docht aufgenommen werden, um Teilchen
und störende
Substanzen vor der Analyse aus der Probe zu entfernen. Die Auswahl
geeigneter Filtermaterialien ist beispielsweise in der PCT-Veröffentlichung
WO-A-94/03814 (Cerelli) beschrieben. Innerhalb der Basis 12 ist
auch ein Waschmittelvorratsbehälter 26 bereitgestellt,
der eine Waschlösung
enthält.
Ein Waschmittelübertragungsstreifen 28,
der auch aus einem saugfähigen Material
besteht, ist zum Übertragen
der Waschlösung
aus dem Vorratsbehälter 26 zu
einer Waschübertragungsposition 30 bereitgestellt.
Diese Position ist als der Abschnitt des Waschmittelübertragungsstreifens 28 definiert,
der während
des Betriebs in Kontakt mit dem Reaktionsstreifen der Kassette gelangt,
wie nachstehend beschrieben wird. Der Waschmittelübertragungsstreifen 30 ist
typischerweise an einem reaktionsträgen Unterlagenmaterial angebracht,
das demjenigen ähnelt,
das für
den Probenübertragungsstreifen 20 verwendet
wird und wie dargestellt von einem Trägerblock 31 getragen
wird, der vorzugsweise aus einem komprimierbaren Material, wie Schaumgummi,
besteht.
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Gemäß der dargestellten Ausführungsform enthält das Basiselement
auch eine Flüssigkeitsaufnahmestation,
die ein absorbierendes Waschmittelaufnahmekissen 32 aufweist.
Das Kissen ist in der Lage, Waschlösung aus der Detektionszone
der Kassette aufzusaugen, wenn es in Kontakt damit steht, wie nachstehend
beschrieben wird. Das absorbierende Kissen besteht vorzugsweise
aus einem komprimierbaren Material, oder es kann an einem komprimierbaren
Trägerblock
angebracht sein.
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Das Reagensträgerelement weist eine Analytdetektionszone 34 auf,
die aus einem absorbierenden Material besteht, durch das eine Flüssigkeit durch
Kapillarwirkung fließen
kann und auf dem ein nachstehend beschriebenes Reagensmittel immobilisiert
werden kann. Bevorzugte Materialien umfassen poröse, geschmolzene Polymermembranen
oder mikroporöse
Polymermembranen, wie Polysulfon, Polypropylen, Nylon, Nitrozellulose,
TeflonTM oder mikroporöse Polyvinylchloridmembranen.
Im vorliegenden Fall ist Nitrozellulose, wie sie von Millipore erhältlich ist,
welche auf eine Schicht von klarem MylarTM oder einem ähnlichen
Material gegossen ist, besonders bevorzugt. Eines oder mehrere Fenster,
wie dasjenige, das bei 35 dargestellt ist, sind vorzugsweise
mit dem Reagensträgerelement 14 versehen,
um eine bequeme Detektion optisch detektierbarer Reaktionsprodukte,
die innerhalb der Detektionszone gebildet sind, zu ermöglichen.
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Neben der Detektionszone befindet
sich ein Reaktionsstreifen 36, der hier auch als eine Kapillareinrichtung
bezeichnet wird. Der Reaktionsstreifen besteht auch aus einem absorbierenden
Material in der Art des vorstehend beschriebenen, das in der Lage
ist, eine Flüssigkeit
durch Kapillarwirkung zu transportieren. Hierbei handelt es sich
vorzugsweise um einen Filter aus Polyethylenfasern mit einem hohen
Molekulargewicht, wie er von Porex bereitgestellt wird. Geeignete
Materialien umfassen Porex 4588, das eine Dicke von 0,028" (etwa
700 μm)
und eine durchschnittliche Porengröße von 70 μm aufweist, und Porex T3, das
eine Dicke von 0, 022" (etwa 550 μm)
und eine durchschnittliche Porengröße von 7 μm aufweist. Der Reaktionsstreifen
ist auch an einer festen, reaktionsträgen Unterlage angebracht, die
in 4 mit 37 bezeichnet
ist.
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Der Filter, der Probenübertragungsstreifen und
die Detektionszone weisen typischerweise jeweils eine Länge von
etwa 1–5
cm, vorzugsweise von 1–2
cm und eine Breite von 1–10
mm auf, wobei die drei Komponenten in etwa die gleiche Breite aufweisen.
Der Übertragungsstreifen
und die Detektionszone weisen typischerweise eine Dicke von etwa 100–150 μm auf. Der
den Reaktionsstreifen bildende Filter ist im allgemeinen dicker,
wie vorstehend beschrieben wurde, wobei seine Dicke etwa 150–1000 μm und vorzugsweise
etwa 500–750 μm beträgt.
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Jeder der beschriebenen Bereiche,
einschließlich
des Probenübertragungsstreifens,
des Reaktionsstreifens und der Detektionszone, kann so dimensioniert
werden, daß er
ein definiertes Volumen der Probenflüssigkeit, typischerweise etwa
3–25 μl, und vorzugsweise
zwischen etwa 15–25 μl absorbiert,
wodurch ein Steuern des Probenvolumens ermöglicht wird. Bei einer typischen
Analyse, wie sie nachstehend beschrieben wird, absorbiert der Reaktionsstreifen
eine Probenmenge von 20 μl.
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Innerhalb des durch den Probenübertragungsstreifen,
den Reaktionsstreifen und die Detektionszone definierten Flüssigkeitswegs
befinden sich nachstehend beschriebene Reagenzien, die wirksam sind,
um ein detektierbares, vom Analysen abhängiges Reaktionsprodukt zu
erzeugen, das in der Detektionszone detektiert wird. Es können daher
verschiedene Analysen unter Verwendung der Kassette ausgeführt werden,
wie nachstehend beschrieben wird.
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Gemäß der dargestellten Ausführungsform enthält der Reagensträger auch
eine Kontrollreaktionszone 38. Die Kontrollzone enthält ein befeuchtbares,
absorbierendes Testkissen oder eine befeuchtbare, absorbierende
Membran, das oder die Reagenzien enthält, die wirksam sind, um eine
Kontrollreaktion mit einem Teil der Körperflüssigkeitsprobe auszuführen. Ein
bei 39 dargestelltes Fenster ist vorzugsweise bereitgestellt,
um eine bequeme Detektion in der Kontrollzone gebildeter optisch
detektierbarer Reaktionsprodukte zu ermöglichen.
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Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform ist
zwischen dem Reaktionsstreifen 36 und der Detektionszone 34 und
an diese angrenzend ein schmaler Streifen eines Polymernetzes, wie
bei 40 in 4 dargestellt
ist, angeordnet. Der Streifen weist im wesentlichen die gleiche
Breite wie der Reaktionsstreifen und die Detektionszone auf, er
ist jedoch, wie dargestellt, erheblich kürzer als diese Komponenten
und weist beispielsweise eine Länge
von etwa 0,5 bis 5 mm, vorzugsweise 1– 3 mm, auf. Das Netzmaterial weist
eine gleichmäßigere Zusammensetzung
auf als das für
den Reaktionsstreifen verwendete Material, typischerweise Glasfasern,
so daß jede
nicht homogene Lösung,
die vom Reaktionsstreifen in das Netz eindringt, innerhalb des Netzes
gleichmäßiger gemischt
wird. Ein geeignetes Material ist ein von Tetko Inc., Briarcliff
Manor, NY erhältliches
Polymernetz, beispielsweise Tetko 7-7/1. Durch die Aufnahme dieses Streifens
wird die Streifenbildung der Probenflüssigkeit mit nicht gelösten Reagenzien
verringert, wenn sie in die Detektionszone eindringt, und es wird dadurch.
eine gleichmäßigere Entwicklung
detektierbarer Spezies in der Detektionszone bereitgestellt.
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Gemäß einer anderen bevorzugten
Ausführungsform
werden die Reagenzien oder Spezies innerhalb der Detektionszone
in einem umgekehrten Gradienten angewendet, so daß sich die
niedrigste Reagenskonzentration am vorderen Rand der Detektionszone
befindet und die Konzentration in Stromabwärtsrichtung zunimmt. Durch
diese Modifikation wird die Überentwicklung
am vorderen Rand der Zone verringert, wo die ankommende Probe zuerst
in Kontakt gelangt, was zu einer gleichmäßigeren Entwicklung detektierbarer
Spezies führt.
Ein solcher Gradient kann durch Aufbringen des Reagens unter Verwendung
einer für
biologische Flüssigkeiten
angepaßten
Tintenstrahl-Sprüheinrichtung
erzeugt werden. Solche Sprüheinrichtungen
sind von Ivek Corporation, North Springfield, VT und von Synergy
Research, West Lebanon, NH erhältlich.
Eine bevorzugte Sprüheinrichtung
von Synergy Research, nämlich PicoJetTM 810, ist in der Lage, genaue Anzahlen
von Mikrotröpfchen
auf verschiedene Substratmaterialien abzugeben und eine genaue Steuerung
des Tröpfchenzählwerts
und der Anordnung bereitzustellen.
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Wie vorstehend erwähnt wurde,
befindet sich die Kassette während
des Betriebs vorzugsweise innerhalb eines Kassetten lesers, der eine Öffnung zum Aufnehmen
der Kassette und Mittel zum Einstellen der relativen Positionen
der Basis und des Reagensträgers,
beispielsweise durch interne Komponenten, die getrennt an diesen
Elementen angreifen, aufweist. Wie vorstehend beschrieben wurde,
greift das Reagensträgerelement
der Kassette bei einer bevorzugten Konstruktion an einer Trägerfläche an,
wenn die Kassette in den Leser eingeführt wird, und das Basiselement
wird inkrementell zum Reagensträger hin
bewegt. Diese Einstellungen werden zu vorbestimmten Zeiten während des
Betriebs vorgenommen, um die nachstehend beschriebenen Betriebspositionen
anzunehmen.
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Der Kassettenleser weist vorzugsweise
Mittel zum Detektieren von Analysereaktionsprodukten innerhalb der
Detektionszone der Kassette auf. Der optische Zugang zur Detektionszone
wird durch Fenster 35 und/oder 39 bereitgestellt.
Zu diesem Zweck können
an der oberen Fläche
des Reagensträgers
optische Ausrichtungsstifte (nicht dargestellt) zum Eingriff durch
die Fläche
innerhalb des Lesers, die den Reagensträger berührt, aufgenommen sein.
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Wenn die Reflexionsfähigkeitsspektroskopie,
ein bevorzugtes Verfahren, zur Detektion verwendet wird, weist der
Detektor eine Lichtquelle und einen Detektor für reflektiertes Licht auf.
Die Quelle, die einen fokussierten Lichtstrahl der ausgewählten Wellenlänge auf
die Meßposition
richtet, kann ein Niederleistungslaser, eine monochromatische, nichtkohärente Lichtquelle,
deren Strahl durch eine geeignete Linsenanordnung fokussiert wird,
eine LED oder dergleichen sein. Der Detektor ist typischerweise
ein herkömmlicher
Lichtsensor in der Art eines photovoltaischen Sensors, der einen
Lichtintensitäts-Signalwert
ausgibt. Die Signalwerte vom Detektor werden einem Digitalprozessor
zugeführt,
der die prozentuale Reflexionsfähigkeit
durch Vergleich mit der Reflexionsfähigkeit von Standardproben
nach auf dem Fachgebiet bekannten Prozeduren in das Analytniveau
umwandelt.
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II. Betriebspositionen der
Kassette
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Wie vorstehend erwähnt wurde,
sind die Basis und die Reagensträgerelemente
in der Lage, der Reihe nach unterschiedliche Relativpositionen,
einschließlich
einer Ruheposition und einer ersten und einer zweiten Betriebsposition,
anzunehmen. Gemäß einem
wichtigen Merkmal der Erfindung. bewegen sich die ausgewählten Komponenten
in und außer Kontakt
miteinander, wenn die verschiedenen Betriebspositionen angenommen
werden, wie nachstehend beschrieben wird.
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In der in 1 dargestellten Ruheposition tritt zwischen
dem Probenübertragungsstreifen 20 (der
die Probenübertragungsposition 22 aufweist), dem
Reaktionsstreifen 36 und der Detektionszone 34 kein
Kontakt auf. Diese Position ist in der Hinsicht auch eine Probenladeposition,
daß der
Probenfluß durch
den Probenübertragungsstreifen
eingeleitet wird, wenn der Streifen oder der Docht 24,
wenn vorhanden, in Kontakt mit der Probenflüssigkeit in der Probenwanne
gebracht wird.
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In der in 2 dargestellten ersten Betriebsposition
wird zwischen dem Probenübertragungsstreifen
an der Probenübertragungsposition 22 und dem
Reaktionsstreifen 36 Kontakt hergestellt, wodurch ermöglicht wird,
daß die
Probenflüssigkeit
von dem Probenübertragungsstreifen
zum Reaktionsstreifen und dadurch zur Detektionszone 34 transportiert
wird. Diese Position wird auch als eine Reaktionsposition bezeichnet.
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Wenn die Kassette von der ersten
zur zweiten Betriebsposition geschoben wird, wie in den 3A–3B dargestellt ist, wird der Kontakt zwischen der
Probenübertragungsposition 22 und
dem Reaktionsstreifen 36 unterbrochen, und es wird ein
Kontakt zwischen der Waschmittelübertragungsposition 30 und
dem Reaktionsstreifen hergestellt. Dementsprechend wird Waschflüssigkeit
aus dem Waschmittelvorratsbehälter 26 über den
Waschmittelübertragungsstreifen 28 und
die Waschmittelübertragungsposition 30 zum
Reaktionsstreifen und damit zur Detektionszone 34 und zum
Waschmittelaufnahmekissen 32 transportiert.
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In 3B ist
eine dritte Betriebsposition dargestellt, in der die Kontrollzone 38 in
Kontakt mit dem Probenübertragungsstreifen 20 gelangt,
wodurch eine Kontrollreaktion eingeleitet wird. Gemäß der dargestellten
Ausführungsform
nehmen der Trägerblock 31 und
das Kissen 32 eine komprimierte Position ein, damit dieser
Kontakt hergestellt wird, die Strömung der Waschlösung vom
Waschmittelvorratsbehälter
zum Waschmittelaufnahmekissen 32 bleibt jedoch unbeeinflußt. Demgemäß kann die
Reaktion an der Kontrollzone 38 gleichzeitig mit der Analyse
selbst und nicht danach auftreten. Weil im allgemeinen nur ein kurzer
Kontakt zwischen der Kontrollzone und dem Probenübertragungsstreifen für die Übertragung
der Probe erforderlich ist, bleibt die Kassette typischerweise nur
für einen
kurzen Zeitraum in der in 3B dargestellten
Position und kann dann zu der in 3A dargestellten
Position verschoben werden.
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Nach dem Bewegen von der ersten zur
zweiten Betriebsposition wird die Kassette im wesentlichen von einer
Reaktionsphase, in der die Probe zu Bereichen des Reagensträgers transportiert
wird und einer vom Analyt abhängigen
Reaktion unterzogen wird, zu einer Waschphase, in der ungebundene
Reagenzien oder andere Spezies vom Reaktionsstreifen und von der
Detektionszone entfernt werden, verschoben. Diese Schritte sind
in. verschiedenen Analysen enthalten und können unter Verwendung der vorliegenden
Kassette automatisch und wirksam ausgeführt werden.
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Wenngleich die zweite Betriebsposition
allgemein als eine Waschposition bezeichnet wurde und die darin
transportierte Lösung
als eine Waschlösung
bezeichnet wurde, ist zu verstehen, daß die zweite Betriebsposition
der Kassette, wie in den 3A oder 3B dargestellt ist, statt einer Waschlösung eine
weitere Reagenslösung
aufweisen könnte, wodurch
statt einer Waschphase eine zweite Reaktionsphase bereitgestellt
werden würde.
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Von den verschiedenen Konstruktionen,
die zum Unterbrechen des Kontakts zwischen der Probenübertragungsposition 22 und
dem Reaktionsstreifen 36 verwendet werden könnten, ist
eine bevorzugte Konstruktion in den 3A–3B dargestellt. Hierbei befindet sich eine
nicht absorbierende Barriere 42 neben dem Reaktionsstreifen
in der Umgebung seines Berührungspunkts
mit der Probenübertragungsposition.
Der die Übertragungsposition 22 enthaltende Überhangabschnitt
des Probenübertragungsstreifens
ist, wie vorstehend erwähnt
wurde, flexibel. In der ersten Betriebsposition berührt dieser
Abschnitt den Reaktionsstreifen, wie in 2 dargestellt ist. In der zweiten und
der dritten Betriebsposition, die in den 3A–3B dargestellt sind, wird er zu einer Nichtberührungsposition
mit dem Reaktionsstreifen, also durch Aufprallen auf die Barriere 42,
verschoben. Wie dargestellt ist, überbrückt die Barriere einen Zwischenraum
zwischen dem Reaktionsstreifen und dem Reagensträger 14 oder kann diesen
auffüllen. Alternativ
ist die Barriere 42 nicht vorhanden, und die Probenübertragungsposition 20 ist
in der zweiten Betriebsposition in der Lage, den Reaktionsstreifen 36 zu
umgehen und kann in diesem Zwischenraum liegen.
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Wie aus den 3A–3B ersichtlich ist, geschieht das Unterbrechen
des Kontakts zwischen dem Probenübertragungsstreifen
und dem Reaktionsstreifen gleichzeitig mit dem Herstellen von Kontakt
zwischen dem Waschmittelübertragungsstreifen 28 und
dem Reaktionsstreifen. Gemäß einem
von der Erfindung bereitgestellten Vorteil schaltet die Kassette
daher in automatischer und in sich abgeschlossener Weise von einer
ersten Reaktionsphase einer Analyse zu einer zweiten Phase in der
Art einer Waschphase um, ohne daß es erforderlich wäre, Lösungen hinzuzufügen oder
eine andere Bedienereingabe vorzunehmen. Es könnten auch andere Mittel zum
Unterbrechen des Kontakts vorgesehen werden, beispielsweise durch
eine seitliche Bewegung (also senkrecht zur Ebene der Figuren) zwischen dem
Probenübertragungs streifen
und dem Waschstreifen, der in diesem Fall seitlich verschoben werden
würde.
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III. Analysen und Analysereagenzien
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A. Analysetypen
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Die Immunprobenkassette ist für die automatische
und in sich abgeschlossene Ausführung
verschiedener immunchemischer Analysen geeignet. Zu diesem Zweck
sind hier auch als Reagensmittel bezeichnete immunchemische Reagenzien
in dem vom Probenübertragungsstreifen 20,
vom Reaktionsstreifen 36 und von der Detektionszone 34 definierten Flüssigkeitsweg
enthalten.
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Bei einem Beispiel einer Analyse
vom Typ einer konkurrierenden Bindung wird die Detektionszone mit
einem Analogon der Analytspezies in immobilisierter Form imprägniert.
Die den Analyten enthaltende Flüssigkeitsprobe
wird in Kontakt mit einer bekannten Menge eines markierten Liganden
gebracht, der sich unter Bildung eines Analyt-Antikörper-Komplexes selektiv mit
dem Analyten verbindet. Dieser Ligand kann in löslicher Form auf den Probenübertragungsstreifen
oder vorzugsweise auf den Reaktionsstreifen gebracht werden, so
daß die
den gegebenen Bereich durchquerende Probenflüssigkeit den Liganden löst, der
innerhalb der Probenflüssigkeit
mit dem Analyten verbunden ist. Die sich ergebende Lösung enthält nach
dem Erreichen der Detektionszone ungebundene Antikörper in
umgekehrtem Verhältnis zur
Analytmenge in der Probe. Dieser ungebundene markierte Antikörper verbindet
sich dann mit dem innerhalb der Detektionszone immobilisierten Analogon.
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Die vorstehenden Schritte finden
statt, während
sich die erfindungsgemäße Kassette
in ihrer ersten Betriebsposition oder Reaktionsphase befindet. Nach
einer geeigneten Inkubationsperiode, falls erforderlich, werden
die Basis und der Reagensträger
innerhalb der Kassette zur zweiten Betriebsposition verschoben,
so daß ein
Flüssigkeitsweg
zwischen dem Waschmittelvorratsbehälter, dem Reaktionsstreifen,
der Detek tionszone und der Waschmittelaufnahmestation hergestellt
wird, wie beispielsweise in 3A dargestellt
ist. Die Waschflüssigkeit
ist dadurch in der Lage, den Reaktionsstreifen und die Detektionszone
zu durchqueren und ungebundene Spezies zu entfernen, welche in diesem
Fall restliche ungebundene Antikörper
und ungebundenen Analyt-Antikörper-Komplex enthalten.
Der immobilisierte Analog-Antikörper-Komplex bleibt in
einer Menge, die in umgekehrtem Verhältnis zur Menge des Analyten
in der Körperflüssigkeitsprobe
steht, in der Detektionszone. Dieser Komplex wird dann durch herkömmliche
Verfahren, abhängig
vom Typ der für
die detektierbare Spezies verwendeten Markierung, detektiert.
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Es sind auf dem Fachgebiet zahlreiche
Verfahren zum Markieren eines zweiten Liganden, einschließlich der
Verwendung von Radiomarkern, Fluoreszenzmarkern und verknüpften Enzymen,
welche ein getrenntes Substrat in eine detektierbare Spezies umwandeln,
bekannt. Eine Vielzahl von Reporter-markierten Antikörpern, wie
Enzym-markierte Antikörper,
sind im Handel erhältlich
oder können
nach bekannten Verfahren (siehe beispielsweise Harlow, S. 319– 358) leicht
hergestellt werden. Optisch detektierbare Markierungsverfahren sind
zur Verwendung mit der vorliegenden Immunprobenkassette bevorzugt.
Enzyme, welche mit einem Substrat reagieren, um ein sichtbares Reaktionsprodukt
zu erzeugen, werden für
diesen Zweck weitverbreitet verwendet. Ein bevorzugtes Enzym ist
Alkaliphosphatase, die mit einem p-Nitrophenylphosphatsubstrat reagiert, um
ein gefärbtes
Produkt mit einer starken Absorptionsspitze bei 405 nm zu erzeugen.
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Ein besonders bevorzugter markierter
Ligand ist ein für
einen Analyten spezifischer Antikörper, der mit einem sichtbaren
Teilchen, wie einem gefärbten
Latexkügelchen
oder kolloidalem Gold, konjugiert ist. Diese Konjugate sind in US-A-4 313 734 (Leuvering)
beschrieben und können
auch von Herstellern, wie BB International (Cardiff, GB) und NanoProbes
(Stony Brook, NY), erhalten werden.
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Ein spezifisches Beispiel der vorstehend
beschriebenen Analyse mit konkurrierender Bindung wird nachstehend
in Abschnitt B beschrieben. Es sei bemerkt, daß ein Fachmann die beschriebene
Kassette verwenden könnte,
um eine Vielzahl verschiedener Analysen unter Verwendung verschiedener Analysereagenzien
auszuführen,
ohne vom Gedanken der Erfindung abzuweichen. Beispielsweise kann der
Probenübertragungsstreifen
einen löslichen
Antikörper
enthalten, der wirksam ist, um einen Probenanalyten zu binden, während der
Reaktionsstreifen Bindereagenzien enthält, die wirksam sind, um ungebundene
Antikörper
zu immobilisieren, wodurch es nur dem löslichen Analyt-Antikörper-Komplex
ermöglicht
wird, zur Detektionszone zu diffundieren. Der Antikörper kann
darin durch einen angehängten
Marker detektiert werden, wie vorstehend beschrieben wurde. Alternativ
kann die Detektionszone Reagenzien enthalten, die wirksam sind,
um ein detektierbares Reaktionsprodukt mit einem unmarkierten Antikörper-Analyt-Komplex
zu erzeugen. Beispielsweise kann die Detektionszone eine Oxidase,
eine Peroxidase und eine Verbindung, die mit einer detektierbaren
Spezies oxidierbar ist, wie einen Farbstoff, enthalten. Wenn der
Analyt-Antikörper-Komplex
ein Substrat für
die Oxidase enthält,
reagiert das in der sich ergebenden Reaktion erzeugte H2O2 mit der durch die Peroxidase katalysierten
oxidierbaren Verbindung unter Erzeugung des detektierbaren Farbstoffs.
Solche Analysen sind beispielsweise in Hewett u. a. beschrieben.
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Die Kassette ist auch zum Ausführen von sandwichartigen
Analysen geeignet, bei denen ein Molekül gleichzeitig einen "Einfanganteil"
und einen "Detektoranteil" bindet. Diese schließen herkömmliche Analysen ein, bei denen
der Analyt selektiv mit einem einen immobilisierten Liganden enthaltenden Substrat
verbunden wird, ungebundene Probenkomponenten durch Waschen entfernt
werden, ein detektierbarer selektiv bindender Ligand hinzugefügt wird und
ungebundener Ligand fortgewaschen wird. Gemäß einer Variation wird der
Ligand, der die Analytspezies selektiv bindet, innerhalb der Detektionszone
immobilisiert, und der Analyt wird durch selektives Verbinden mit
einem detektierbaren Sekundärliganden,
der in dem vorstehend definierten Flüssigkeitsweg, beispielsweise
innerhalb des Probenübertragungsstreifens
oder des Reaktionsstreifens vorhanden ist, detektiert.
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Es wird anhand der vorstehenden Beschreibung
klar geworden sein, wie sich die verschiedenen Aufgaben und Vorteile
der Erfindung lösen
bzw. erreichen lassen. Die beschriebene Kassette kann zum Ausführen einer
Vielzahl mehrstufiger Analysen unter Einschluß verschiedener Reagenzien
innerhalb der verschiedenen Zonen und Vorratsbehälter der Kassette in automatischer
Weise mit einem geringen oder keinem äußeren Eingriff während des
Betriebs verwendet werden. Die Kassette ist besonders nützlich zum
Ausführen
von Analysen, welche sequentielle Schritte aufweisen, bei denen
Reagenzien und/oder Waschlösungen über einen
festen Träger transportiert
werden. Wenn es erforderlich ist, könnten mehrere Vorratsbehälter und/oder
mehrere Reaktions-/Waschfolgen verwendet werden. Ein wichtiges Merkmal
der vorstehend beschriebenen Erfindung ist die automatische Bewegung
zwischen Betriebspositionen, die hier als Reaktion- und Waschpositionen
beschrieben sind, welche wirksam ist, um sequentiell verschiedene
Lösungen
in einer Konfiguration mit einem einzigen Strömungsweg über die festen Oberflächen zu übertragen.
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Vorzugsweise ist die Kassette mit
zuvor eingebrachten Lösungen
und Reagenzien versehen, und sie ist daher vollkommen in sich abgeschlossen, so
daß es
nicht erforderlich ist, daß ein
Bediener Lösungen
einfüllt.
Der die Kassette enthaltende Leser kann so programmiert werden,
daß er
die Kassette zu festgelegten Zeiten in ihre verschiedenen Betriebspositionen
bringt. Eine mehrstufige Analyse kann demgemäß mit der innerhalb eines Kassettenlesers
enthaltenen Kassette ausgeführt
werden, wobei kein Eingriff durch einen Bediener von außen erforderlich
ist.
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B. Als Beispiel dienende
Analyse: Bestimmung von Pyridin-Vernetzungsniveaus
in Urin
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Bei einer spezifischen Anwendung
der vorliegenden Vorrichtung wird eine Urinprobe auf Niveaus von
Pyridinolin (Pyd) oder Desoxypyridinolin (Dpd) analysiert. Es wurde
gezeigt, daß geänderte Niveaus
dieser Verbindungen, die Elemente einer als Pyridinvernetzungen
bekannten Verbindungsklasse sind, welche in Urin angetroffen werden,
Störungen diagnostizieren,
die durch ein abnormes Gleichgewicht zwischen der Knochenbildung
und der Knochenresorption, wie der Osteoporose (Robins, Macek, Black)
gekennzeichnet sind. Das Kreatininniveau wird zur Kontrolle gemessen,
um die Analytniveaus in bezug auf die Urinkonzentration und die Skelettmasse
zu normieren.
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Die Probe wird hergestellt, indem
in einem geeigneten Medium beispielsweise etwa drei Puffervolumen
(PBS, gepufferte Phosphat-Salzlösung), das
1% Rinderserumalbumin (BSA) enthält,
1% Tween 20 (Tween ist ein eingetragenes Warenzeichen) und 0,9%
NaCl verdünnt
werden. Die Probe wird dann durch ein Material gefiltert, das wirksam
ist, Materialien zu entfernen, die die Analyse stören können, wie
in der PCT-Veröffentlichung
94/03814 (Cerelli) beschrieben ist. Geeignete Filtermedien umfassen
auf Nitrozellulose basierende Materialien, hydrophobe bzw. stark
proteinbindende Materialien und geladene hydrophile Materialien.
Der Filter ist vorzugsweise in dem Probenvorratsbehälter 18 und/oder
dem Docht 24 enthalten.
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Der lösliche Ligand ist ein Dpd-
oder Pyd-spezifischer Antikörper,
dessen Herstellung bei Cerelli beschrieben ist. Der Antikörper wird
durch Konjugieren mit kolloidalem Gold oder anderen gefärbten Teilchen
konjugiert. Diese konjugierten Verbindungen können von gewerblichen Quellen
erhalten werden oder durch das Verfahren von Leuvering hergestellt
werden, wie vorstehend erwähnt
wurde. Wenn ein kolloidales Gold-Antikörper-Konjugat verwendet wird,
wird es im allgemeinen bei Anwesenheit mehrerer Gewichtsprozent
einer stabilisierenden Reagens, wie Sukrose, Trehalose oder BSA,
und/oder 0,1 bis 1 Gewichtsprozent eines Reinigungsmittels, wie
Tween 20 (Tween ist ein eingetragenes Warenzeichen) auf das Reaktionsstreifenmaterial
aufgebracht.
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Ein Analogon des Analyten, das auch
wirksam ist, den Antikörper
zu binden, wird innerhalb der Detektionszone immobilisiert. Ein
geeignetes Analogon ist eine Pyridinolin (Pyd) oder Desoxypyridinolin (Dpd)-Verbindung,
die wirksam ist, sich mit dem freien für den Analyten spezifischen
Antikörper
zu verbinden. Dpd, Pyd und Ableitungen können durch Fraktionieren von
Urin unter Verwendung von Protokollen beschrieben werden, die beispielsweise
bei Black, Siebel und Cerelli beschrieben sind.
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Das analoge Molekül wird vorzugsweise durch einen
Streptavidin-Schweineserumalbumin (PSA)-Biotinkomplex nach einer
Prozedur in der Art derjenigen, die bei Cerelli beschrieben ist,
auf den Träger
aufgebracht. Bei einer typischen Prozedur wird an Streptavidin gebundenes
Dpd oder Pyd mit einem PSA-Biotinkomplex gemischt, und die Mischung
wird mit einer Tintenstrahl-Sprüheinrichtung auf
Nitrozellulose aufgebracht. Die Reagenzien können für eine gleichmäßigere Produktentwicklung
in einem umgekehrten Gradienten aufgebracht werden, wie vorstehend
beschrieben wurde. Die beschichtete Nitrozellulose wird dann bei
50°C getrocknet,
um die Komponenten zu binden.
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Die Kontrollposition der Immunprobenkassette
wird verwendet, um, wie vorstehend erwähnt wurde, das Kreatininniveau
in der Probe zu bestimmen, indem eine Probenmenge in die Kontrollzone 38 übertragen
wird. Bei einem Verfahren zum Bestimmen von Kreatinin werden für den Analyten
spezifische Oxidasereagenzien verwendet. Kreatininamidohydrolase
wandelt Kreatinin in Kreatin um, das durch Amidinohydrolase in Harnstoff
und Sarkosin umgewandelt wird. Sarkosinoxidase wandelt wiederum
unter Erzeugung von H2O2 Sarkosin
in Glycin und Formaldehyd um (Hewett). Das entwickelte H2O2, dessen Niveau
dem Kreatininniveau in der Probe entspricht, reagiert bei Vorhandensein
einer Peroxidase unter Bildung eines detektierbaren Farbstoffs mit
einem Donatormolekül.
Die Urinkreatininkonzentration kann auch durch andere bekannte Verfahren
in der Art derjenigen, die auf der Reaktion mit Alkalipikrat beruhen
(Cook), bestimmt werden.
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Die Analyse wird in dem vorstehend
beschriebenen Format der konkurrierenden Bindung ausgeführt. Eine
typische Betriebsfolge, bei der die Kassette in einen Kassettenleser
aufgenommen ist, ist die folgende. Bei dieser Prozedur wird die
Kontrollreaktion eingeleitet, wenn die Analyse ausgeführt wird
(Phase 3) und nicht danach.
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Phase 1:
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Die Probenwanne und der Waschmittelvorratsbehälter werden
geladen.
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Der Reaktionsstreifen und die Kontrollzone werden
vom Probenübertragungsstreifen
getrennt (Ruheposition).
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Der Probenübertragungsstreifen wird in
Kontakt mit dem Probendocht bzw. Probenfilter gebracht: die Probe
wird eingeladen.
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Phase 2:
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Die Kassette wird in den Leser zurückgezogen.
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Eine optische Abtastung zum Ermitteln
des Reflexionsvermögens
der trockenen Membran wird in der Detektionszone vorgenommen.
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Es wird zwischen dem Reaktionsstreifen
und dem Probenübertragungsstreifen
Kontakt hergestellt (erste Betriebsposition).
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Der Reaktionsstreifen wird mit der
Probe gefüllt.
Das Volumen wird durch die Abmessungen des Reaktionsstreifens gesteuert
(Dauer etwa 3 Minuten).
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Phase 3:
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Die Verbindung zwischen dem Probenübertragungsstreifen
und dem Reaktionsstreifen wird unterbrochen.
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Es wird Kontakt zwischen dem Waschmittelvorratsbehälter, dem
Reaktionsstreifen und dem Waschmittelaufnahmekissen hergestellt,
indem die Waschmittel- und die Aufnahmeträgerblöcke komprimiert werden (zweite
Betriebsposition).
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Es wird die Waschflüssigkeitsströmung vom Waschmittelworratsbehälter durch
den Reaktionsstreifen zum Waschmittelaufnahmekissen eingeleitet.
Es wird Kontakt zwischen der Kontrollzone und dem Probenübertragungsstreifen
hergestellt (dritte Betriebsposition).
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Die Probe wird vom Probenübertragungsstreifen
in die Kontrollzone übertragen,
um die Kreatinin-Endpunktreaktion einzuleiten.
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(Nach etwa 4 Sekunden:) Der Kontakt
zwischen dem Probenübertragungsstreifen
und der Kontrollzone wird unterbrochen.
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Der Kontakt verbleibt zwischen dem
Waschmittelvorratsbehälter,
dem Reaktionsstreifen und dem Waschmittelaufnahmekissen.
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Die Waschflüssigkeit fließt weiterhin über den
Reaktionsstreifen (Dauer etwa 4 Minuten).
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Optische Ablesungen werden vorgenommen,
um den Testabschluß festzustellen.
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Das Niveau des markierten Antikörpers wird dann
in der Detektionszone detektiert. Ein zweckmäßiges Verfahren zum Quantisieren
des Niveaus eines gefärbten
Reaktionsprodukts in der Art eines Farbstoffs oder einer konjugierten
kolloidalen Goldverbindung erfolgt durch Reflexionsfähigkeitsspektroskopie nach
auf dem Fachgebiet bekannten Techniken. Kolloidales Gold wird bei
der 540-nm-Absorptionsspitze detektiert. Das prozentuale Reflexionsvermögen wird durch
Vergleich mit dem Reflexionsvermögen
von Standardproben in das Niveau des Analyten (Dpd oder Pyd) umgewandelt.