DE69803565T2

DE69803565T2 - Antivirale pharmazeutische zusammensetzungen welche glycyrrhizinsäure und mindestens ein protein mit antiviraler wirksamkeit enthalten

Info

Publication number: DE69803565T2
Application number: DE69803565T
Authority: DE
Inventors: Mario Pinza; Raffaello Pompei
Original assignee: Aziende Chimiche Riunite Angelini Francesco ACRAF SpA
Current assignee: Angelini Acraf SpA
Priority date: 1997-05-14
Filing date: 1998-05-06
Publication date: 2002-08-08
Anticipated expiration: 2018-05-07
Also published as: HU224956B1; AU740944B2; ATE212232T1; PT980254E; AU7764698A; KR20010012419A; CA2289550A1; GEP20022672B; ZA983917B; EA199901024A1; HUP0002985A2; CZ291932B6; HUP0002985A3; ES2170501T3; KR100592193B1; US6329339B1; IL132651A; PL336802A1; EP0980254A1; WO1998051334A1

Description

Die Erfindung betrifft eine pharmazeutische, antivirale Zusammensetzung, umfassend Glycyrrhizinsäure und mindestens ein Protein, das mit einer antiviralen Aktivität versehen ist.
Es ist bekannt, dass das Herpes Simplex Virus Typ 1 faciale und oropharyngeale Läsionen erzeugt ("Manual of Clinical Microbiology", Murray, Baron, Pfaller, Tenover, Yolken, 6. Aufl., Seiten 876-883, American Society for Microbiology, Washington, D. C., 1993).
In der Vergangenheit wurden Infektionen mit Herpes Simplex Virus Typ 1 mit Vidarabin behandelt (Goodman & Gilman, "Le basi farmacologiche della terapia", Zanichelli, Bologna, 7. Aufl., Seite 1156, 1991), jedoch wurde dieses aufgrund seiner Toxizität fast vollständig durch Aciclovir ersetzt (Goodman & Gillman, "The Pharmacological Basis of Therapeutics", McGraw Hill Companies, 9. Auf., Kapitel 50, Seite 1193, 1996; "Am. J. Med." 73, Ergänzung, 186-192, 1982 und "Clin. Pharmacokinet.", 8, 187-201, 1983).
Daher ist Aciclovir zur Zeit das meistverwendete Arzneimittel für die Behandlung von Mund- und Lippenläsionen (Hautausschlag durch Fieber), jedoch führt seine topische Verwendung häufig zu einem Brennen und einer Irritation der mucösen Membranen. Ausserdem ist Aciclovir ziemlich effizient, wenn es während der ersten Infektion verabreicht wird, ist jedoch nicht sehr effektiv im Fall wiederholter Infektionen, so dass es nicht zu einer Lösung führt und keine Reinfektion durch Herpes Simplex Virus Typ 1 verhindern kann.
Zusätzlich weist die orale Behandlung den Nachteil einer Auslösung von Nebenwirkungen auf, wie z. B. Übelkeit, Diarrhoea, Jucken, Kopfschmerzen, Nierenstörungen und Nephrotoxizität.
Daher besteht nach wie vor ein wirklicher Bedarf an einem Arzneimittel, das für die Behandlung von Infektionen mit Herpes Simplex Virus Typ 1 aktiv ist, selbst im Fall von wiederauftretenden Infektionen, und das frei von Nebenwirkungen ist.
Tatsächlich war auch bekannt, dass Glycyrrhizinsäure eine bestimmte antivirale Aktivität aufweist. Bei antiviralen Dosierungen inhibiert es stark die Synthese viraler Glycoproteine und nur bei sehr hohen Dosierungen inhibiert es auch die Zellglycoproteinsynthese. Tatsächlich zeigt die Synthese von Glycoproteinen einen substantiellen Unterschied bei normalen und infizierten Zellen, während die Wirkung von Glycyrrhizinsäure auf die Synthese von Proteinen sowohl in normalen Zellen als auch in infizierten Zellen sogar bei Dosierungen von 4 mM praktisch irrelevant ist. Tatsächlich löst Glycyrrhizinsäure mit einer Konzentration von 0,5 mM (was 50% der viralen Replikation inhibiert) eine Reduktion der Inkorporation von Glucosamin-H³ von mehr als 10% in infizierten Zellen aus und keine Inhibition bei normalen Zellen. Eine erhöhte Dosierung der Glycyrrhizinsäure von bis zu 1 mM erzeugt eine 80%-ige Reduktion des Virus, keine Inhibition der Synthese der Glycoproteine in der Kontrolle und eine 20%-ige Reduktion der Synthese von Glycoprotein in infizierten Zellen, Bei 4 mM ist die Synthese der Glycoproteine in normalen Zellen ebenfalls leicht verändert, jedoch ist die Produktion des Virus um 99% inhibiert ("L'Igiene Moderna", R. Pompei und M. A. Marcialis, 83, 385-391, 1985)
Weiterhin zeigt Tabelle A die Ergebnisse von Tests, die durchgeführt wurden, indem mit HSV1 infizierte Zellen mit 8 mM Glycyrrhizinsäure behandelt wurden. Die infizierten Zellen wurden in Kontakt mit der Glycyrrhizinsäure für 2 Stunden bei 37ºC gehalten. Die in der Tabelle angegebenen experimentellen Ergebnisse zeigen, dass es eine starke Abnahme der Infektion 12, 17 und 22 Stunden danach ergab und dass die Zellen ihre zelluläre Integrität erhielten. Die Inhibition ist etwa 2 Logarithmen bei 12 Stunden nach Infektion und 3 Logarithmen (99,9%) 22 Stunden nach Infektion ("Nature", R. Pompei et al., 281, Nr. 5733, 689-690, 1979). TABELLE A
* PFU = plaquebildende, virale Einheit
In der Literatur sind auch die antivirale Aktivität oder spezifischer die Antiherpes (HSV1)-Aktivität von verschiedenen Arten von Lysozymen bekannt, wie z. B. Truthahnlysozym, menschlichem Lysozym, Hühnerlysozym, denaturiertem (wärmeinaktivierten) Hühnerlysozym und mit Trypsin verdautem Hühnerlysozym ("Current Microbiology", Cisani et al., 10, 35-40, 1984).
Lysozyme sind tatsächlich Enzyme, die in der Natur weitverbreitet sind und die zur Verteidigung des Organismus gegen einige infektiöse Agenzien durch Auslösung oder Cooperation der Spaltung (d. h. Lyse) derselben cooperieren ("Mol. Cell. Biochem.", Jollès et al., 63, 165-189, 1984; "Anticancer Res.", Save et al., 9, 583-592, 1989).
Ausserdem ist in der Literatur die antivirale Aktivität und insbesondere die Antiherpes (HSV1)-Aktivität von Lactoferrin beschrieben (T. Fujihara und H. Hayashi, "Lactoferrin inhibits herpes simplex virus type 1 (HSV1) infection to mouse cornea", "Arch. Virol.", 140, 1469-1472, 1995; M. C. Harmsen et al., "Antiviral effects of plasma and milk protein: lactoferrin shows potent activity against both human immunodeficiency virus and human cytomegalovirus replication in vitro", "J. Inf. Dis.", 172, 380-388, 1994).
Es wurde nun überraschend festgestellt, dass Glycyrrhizinsäure eine synergistische Wirkung auf Proteine ausübt, die mit einer antiviralen Aktivität ausgestattet sind.
Daher ist es eine erste Aufgabe der Erfindung, eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitzustellen, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie Glycyrrhizinsäure umfasst und mindestens ein Protein mit einer antiviralen Aktivität.
Vorzugsweise ist das Protein ausgewählt aus der Gruppe, umfassend Lysozyme und Lactoferrine.
Typische Beispiele für Lysozyme sind Truthahnlysozym, menschliches Lysozym, Hühnerlysozym, wärmeinaktiviertes Hühnerlysozym und mit Trypsin verdautes Hühnerlysozym. Vorzugsweise ist das Lysozym ein Hühnerlysozym oder ein menschliches Lysozym.
Typische Beispiele für Lactoferrine sind bovine und menschliche Lactoferrine.
Im typischen Fall ist die pharmazeutische Zusammensetzung dieser Erfindung für die Behandlung topischer viraler Infektionen geeignet. Vorzugsweise ist das Virus vom Herpes-Typ. Noch bevorzugter handelt es sich um Herpes Simplex Virus Typ 1 (HSV1).
Vorzugsweise werden die pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung in Form geeigneter Dosierungsformen hergestellt. Beispiele für geeignete Dosierungsformen sind Cremes, Salben und mit dem Arzneimittel versehene Pflaster für die topische Verabreichung.
Die Dosierungsformen können auch andere konventionelle Bestandteile enthalten, wie z. B. Konservierungsmittel, Stabilisatoren, oberflächenaktive Stoffe, Puffer, Salze zur Regulation des osmotischen Drucks, Emulgatoren, Süssstoffe, Färbemittel, Geschmacksmittel und dergleichen.
Die Menge der aktiven Bestandteile in der pharmazeutischen Zusammensetzung dieser Erfindung kann in einem weiteren Bereich variieren, abhängig von bekannten Faktoren, wie z. B. Stadium und Schwere der Infektion, Körpergewicht des Patienten, Art der Dosierungsform, Weg der Verabreichung, Anzahl der Dosierungsformen, die pro Tag verabreicht werden, und Wirksamkeit der aktiven Bestandteile. Die optimale Menge wird jedoch einfach und in routineartiger Weise durch den Fachmann bestimmt werden.
Die Dosierungsformen der pharmazeutischen Zusammensetzung dieser Erfindung können gemäss Verfahren hergestellt werden, die dem pharmazeutischen Chemiker bekannt sind, und umfassen Mischen, Granulieren, Kompression, Lösung und dergleichen.
Die folgenden Beispiele sollen diese Erfindung illustrieren, ohne sie in irgendeiner Weise zu begrenzen.
Die in den Experimenten verwendeten Verbindungen waren:
- Glycyrrhizinsäure (als Ammoniumsalz), bereitgestellt von FLUKA AG;
- Herpes Simplex Virus Typ 1, bereitgestellt von NIH, Rockville, Maryland;
- Hühnerlysozym, bereitgestellt von SIGMA;
- Lactoferrin, bereitgestellt von SIGMA;
- VERO-Zellen von Nieren der afrikanischen grünen Meerkatze von ICN FLOW,
Costa Mesa, C. A.;
- Eagle-Medium, modifiziert durch Dulbecco (DMEM), dem fötales Kälberserum zugefügt wurde, inaktiviert bei 56ºC für 30 Minuten, bereitgestellt von ICN FLOW, Costa Mesa, C. A..

BEISPIEL 1

Monolayer aus VERO-Zellen wurden auf Platten mit 24 Vertiefungen ausplattiert und mit etwa 1 HSV1 viralen Infektionseinheit · 100 Zellen für 1 Stunde bei Raumtemperatur infiziert. Dann wurden unterschiedliche Mengen von 0 bis 8 mg/ml Hühner-, Truthahn- und menschlichen Lysozymen in einem Thermostaten bei 37ºC und in Gegenwart von CO&sub2; (5%) zugefügt.
Nach 48 Stunden, als der cytopathische Effekt in der Kontrolle total war, wurden die Zellen zweimal eingefroren und wiederaufgetaut, um ein Aufbrechen auszulösen und dadurch das Freisetzen des Virus.
Die Konzentration von infizierenden viralen Partikeln, die für jede Verdünnung von Lysozym erzeugt wurden, wurde nach Zentrifugation titriert. Die Titration wurde durch Verdünnung des Gehalts jeder Vertiefung von 10&supmin;¹ bis 10&supmin;&sup7; durchgeführt und durch In-Kontakt-Bringen mit Zellmonolayern in einer Platte mit vielen Vertiefungen mit 6 Vertiefungen jeweils für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
Nachdem die Infektion aufgetreten war, wurden die Zellen mit einer Schicht Nähragar bedeckt und wurden nach 48 Stunden Inkubation mit Neutralrot angefärbt und die makroskopisch sichtbaren, viralen Plaques wurden gezählt. So wurde eine erhaltene Inhibitionsprozentzahl auf die viralen Plaques durch Lysozym, im Vergleich mit der Kontrolle, etabliert.
Die auf diese Weise erhaltenen experimentellen Daten sind in Tabelle 1 angegeben. TABELLE 1
*Prozentsatz Kontrolle ± Standardabweichung
Tabelle 1 zeigt dass:
(1) Hühnerlysozym
(i) die Bildung von Herpes Virus Plaques auf VERO-Zellen signifikant inhibiert;
(ii) die Wirkung Dosisabhängig ist;
(iii) bei einer Dosis von 8 mg/ml HSV1 mit etwa 92% inhibiert;
(iv) die 50% Inhibitionsdosis (ID&sub5;&sub0;) etwa 1 mg/ml beträgt;
(2) die Truthahn- und menschlichen Lysozyme eine Antiherpesaktivität zeigten, die der von Hühnerlysozym ähnlich war.

BEISPIEL 2

Dieses wurde durchgeführt wie Beispiel 1, ausser dass unterschiedliche Mengen von 0 bis 1 mg/ml Glycyrrhizinsäure allein den Monolayern der VERO-Zellen zugefügt wurden, die mit HSV1 infiziert waren. Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2

BEISPIEL 3

Dieses wurde durchgeführt wie Beispiel 1, ausser dass 0,5 mg/ml Glycyrrhizinsäure und unterschiedliche Mengen Hühnerlysozym von 0 bis 1 mg/ml den Monolayern der mit HSV1 infizierten VERO-Zellen zugefügt wurden.
Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3
Wie aus Tabelle 3 abgelesen werden kann, sind die Assoziationen von Glycyrrhizinsäure mit Lysozymen durch eine deutliche synergistische Wirkung gekennzeichnet. Zum Beispiel beträgt im Hinblick auf die Summe der Aktivitäten, die getrennt gemessen wurden (Tabellen 1 und 2) die für eine Assoziation erwartete Inhibition (%), umfassend 0,5 mg/ml Hühnerlysozym und 0,5 mg/ml Glycyrrhizinsäure etwa 35 bis 40%. Demgegenüber belegen die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse, dass die Inhibition (%) dieser Assoziation etwa 84% beträgt.
Die Synergie wird durch den FIC-Index bestätigt, der in dem Fall dieser Überprüfung 0,125 beträgt.
Wie bekannt ist, wird der FIC-Index (fraktionierte Inhibitionskonzentrationen) erhalten, indem 50% virale Inhibitionskonzentration der Mischung der zwei Produkte durch die 50%-ige virale Inhibitionsdosierung von jedem Produkt einzeln geteilt wird. Ein FIC-Index von ≤0,5 bedeutet, dass eine signifikante Synergie zwischen zwei Produkten besteht.

BEISPIEL 4

Dieses wurde durchgeführt wie Beispiel 1, ausser dass unterschiedliche Mengen bovines und menschliches Lactoferrin den Monolayern der mit HSV1 infizierten VERO-Zellen zugefügt wurden.
Die auf diesem Weg erhaltenen experimentellen Daten sind in Tabelle 4 angegeben. TABELLE 4
* Toxizität, ausgedrückt als minimale toxische Dosis auf 50% der Zellen
** Dosis, die 50% der viralen Plaques auf VERO-Zellen inhibiert
Tabelle 4 zeigt, dass die Lactoferrine nicht sehr toxisch sind und dass ihre virale Aktion schon bei Niveaus sehr ausgeprägt ist, die signifikant unterhalb der toxischen liegen.

BEISPIEL 5

Dieses würde wie Beispiel 1 durchgeführt, ausser dass 0,5 mg/ml Glycyrrhizinsäure und unterschiedliche Mengen von 0 bis 1 mg/ml menschliches Lactoferrin den Monolayern der VERO-Zellen, die mit HSV1 infiziert waren, zugefügt wurden.
Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. TABELLE 5
Wie aus Tabelle 5 abgelesen werden kann, weisen die Assoziationen von Glycyrrhizinsäure und Lactoferrin eine deutliche synergistische Wirkung auf. Zum Beispiel beträgt im Hinblick auf die Summe der getrennt gemessenen Aktivität (Tabellen 2 und 4) die erwartete Inhibition (%) einer Assoziation, die 0,25 mg/ml Lactoferrin und 0,5 mg/ml Glycyrrhizinsäure umfasst, etwa 65 bis 75%. Demgegenüber belegen die in Tabelle 5 dargestellten Ergebnisse, dass die Inhibition (%) dieser Assoziation etwa 100% beträgt.
Die Synergie wird durch den FIC-Index bestätigt, der 0,06 beträgt.

BEISPIEL 6

Dieses wurde wie Beispiel 1 durchgeführt, ausser dass 0,5 mg/ml Glycyrrhizinsäure, 0,1 mg/ml menschliches Lactoferrin und unterschiedliche Mengen von 0 bis 1 mg/ml Hühnerlysozym den Monolayern der mit HSV1 infizierten VERO-Zellen zugefügt wurden.
Die experimentellen Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6
Wie aus Tabelle 6 abgelesen werden kann, sind die Assoziationen von Glycyrrhizinsäure, Lactoferrin und Lysozymen durch eine deutliche synergistische Wirkung gekennzeichnet. Zum Beispiel beträgt im Hinblick auf die Summe der getrennt gemessenen Aktivität die erwartete Inhibition (%) einer Assoziation, die 0,1 mg/ml Lactoferrin, 0,5 mg/ml Glycyrrhizinsäure und 0,5 mg/ml Lysozym umfasst, etwa 65%. Demgegenüber zeigen die in Tabelle 6 dargestellten Ergebnisse, dass die Inhibition (%) dieser Assoziation etwa 98% beträgt.

Claims

1. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, dass sie Glycyrrhizinsäure und mindestens ein Protein mit einer antiviralen Aktivität umfasst, mit der Massgabe, dass, wenn das Protein ein Lysozym ist und sich die Zusammensetzung in Form einer wässrigen Lösung befindet, sie kein Salz eines Alkali- oder Erdalkalimetalls enthält.

2. Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Protein ein Lysozym und/oder ein Lactoferrin ist.

3. Zusammensetzung gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lysozym ausgewählt ist aus der Gruppe, umfassend Hühnerlysozym, Truthahnlysozym, menschliches Lysozym, hitzeinaktiviertes Hühnerlysozym, Hühnerlysozym, verdaut mit Trypsin.

4. Zusammensetzung gemäss Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Lactoferrin ein menschliches oder bovines Lactoferrin ist.