DE19616992C1 - Verwendung von Ethylendiamindisuccinat zur Behandlung von Infektionen mit Cytomegalieviren - Google Patents

Description

Die Erfindung geht aus von der Verwendung von Ethylendiamindisuccinat ein­ schließlich verträglicher salzbildender Ionen und der protonierten Form als Medikament zur Behandlung von Infektionen, vgl. dazu insbes. GB 2288812 A, US 5466867 A, US 5292446 A oder US 4704233 A.

(S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat wird ausführlich in der Publikation von Takaaki NISHIKIORI et al. (1934) The Journal of Antibiotics, Vol. 37, Nr. 4: 426-427 beschrieben. (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat kann aus Aktinomyceten gewonnen werden und läßt sich ebenfalls synthetisch herstellen. (J. A. NEAL and N. J. ROSE (1968) Inorg. Chem. Vol. 7: 2405-2412). Es inhibiert die Phospholipase C und D. Wird (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat Mäusen intraperitoneal verabreicht, wird die Antikörperproduktion und die DTH-Reaktion (delayed type hypersensitivity) unterdrückt. Die Blastogenese der B-Zellen und T-Zellen wird in vitro supprimiert. Jedoch wird keine antimikrobielle Wirkung in dieser Publikation beschrieben. Die Toxizität bei Mäusen ist relativ gering.

Die Cytomegalieviren (CMV) bilden eine Gruppe artverwandter Viren, die zu den Herpes Viren zählen (Lutz SCHNEIDER (1990) Pharmazeutische Zeitung, Vol. 135 Nr. 27, 2396-2400). Nach einer Erstinfektion verbleiben die Viren latent im Körper. Erst wenn das Immunsystem durch eine medikamentöse oder durch Krankheit bedingte Immunsuppression geschwächt wird, werden die Viren reaktiviert. Den Namen erhielten die Viren, weil sie histopatologisch nachweisbare Riesenzellen mit randständigem großem Kern und Viren als Einschlußkörper verursachen.

Die Viren sind ubiquitär. Die Durchseuchung der Population schwankt von 30% bis 85, ja 95%. Die Infektion verläuft bei Erwachsenen mit einem funk­ tionstüchtigen Immunsystem unauffällig und zeigt höchstens unspezifische Symptome, wie Abgeschlagenheit und leicht erhöhte Körpertemperatur.

Bei immungeschwächten Erwachsenen stehen bei CMV-Infektionen pulmonale Erkrankungen, Adernetzhaut-Entzündungen und Magen-Darm-Erkrankungen im Vordergrund. Bei AIDS-Patienten verursachen CMV-Infektionen die meisten Todesfälle.

Da mit steigendem Alter auch die Inzidenz der CMV-Infektionen steigt, wird au­ genblicklich diskutiert, inwieweit die Cytomegalieviren an der arteriellen Plaque- Bildung beteiligt sind. Die Viren sind in der Lage, Endothelzellen der Ge­ fäßwände zu schädigen.

Verschieden Substanzen werden zur Behandlungen gegen das Cytomegalie­ virus diskutiert.

In der Publikation von J. CINATL et al. (1994) Antiviral Research, Vol. 25: 73-77 wird Desferrioxamin beschrieben, das Eisenchelate bildet. Diese Substanz kann in in vitro-Versuchen gegen Herpes simplex Viren, Varicella zoster Viren, Epstein-Barr Viren und humane Cytomegalieviren erfolgreich eingesetzt wer­ den. Dabei wird die Wirkung der Substanz auf eine Chelatbildung mit den Ei­ sen-Ionen zurückgeführt. Weiterhin soll auch die zelluläre Ribonukleotid Reduktase inhibiert werden. Jedoch sind die bisherigen Befunde zum Teil in der Theorie widersprüchlich. Die Substanz zeigt eine geringe Toxizität.

Foscarnet ist eine antivirale Substanz mit in Zellkulturen nachgewiesener se­ lektiver Aktivität gegen Humanviren der Herpes-Gruppe, wie zum Beispiel Her­ pes simples, Varicella zoster, Epstein-Barr und Cytomegalie-Viren, sowie He­ patitis Viren. Die antivirale Wirkung beruht auf einer Hemmung viraler Enzyme, wie DNA-Polymerasen und reversen Transkriptasen. Auf Cytomegalieviren wirkt Foscarnet virostatisch, jedoch können die Viren nicht eliminiert werden (Lutz SCHNEIDER (1991) Pharmazeutische Zeitung, Vol 136, Nr. 46, 33-36). Eine wesentliche Problematik der Cytomegalievirus-Infektion stellt die Notwendigkeit der bisweilen lebenslangen Dauerbehandlung der Patienten dar. Nachteilig ist weiterhin, daß die Cytomegalieviren in der letzten Zeit resistenter gegen diese Substanz geworden sind. (Stanat et al. (1991) Antimicrob. Agents, Chemother. Vol 35, Nr. 11: 2191-2197 und Knox et al. (1991) Lancet, Vol 337: 1292-1293).

Ganciclovir wird in der Publikation von Lutz SCHNEIDER (1990) Pharmazie, Vol 135, Nr. 37, 2396 bis 2400 beschrieben. Ganciclovir gehört zu den Nucleosid- Antimetaboliten, die sich vom 2′-Desoxiguanosin ableiten. Es trägt anstelle der 2′-Desoxyribose eine acyclische Seitenkette und unterscheidet sich von Aciclovir nur durch eine zusätzliche Hydroxymethylgruppe in der Seitenkette. Ganciclovir ist zugelassen zur Behandlung lebens- oder augenlichtbedrohender Cytomegalieviren-Infektionen bei Patienten mit erworbener Immunschwäche oder medikamentöser Immunsuppression zum Beispiel nach Organ­ transplantationen. Obwohl Ganciclovir auch bei anderen menschenpathoge­ nen Herpesviren (HSV 1 und 2, Varicella zoster und Epstein-Barr) wirksam ist, verbietet sich wegen der hohen Nebenwirkungsrate die Verwendung bei derar­ tigen Infektionen. Ganciclovir führt dabei zu Neutropenie, weiterhin wurde beobachtet, daß Mäuse Tumoren unter der Behandlung ausbildeten. Nachteilig ist weiterhin, das die Cytomegalieviren in der letzten Zeit resistenter gegen diese Substanz geworden sind. (Stanat et al. (1991) Antimicob. Agents, Che­ mother. Vol 35, Nr. 11: 2191-2197 und Knox et al. (1991) Lancet, Vol 337: 1292-1293).

In der WO 94/22438 A1 wird Diethylen­ triaminpentaessigsäure zur Behandlung von Herpes simples, Varicella zoster, Encephalomyelitis, Polyradiculoneuritis, multiple Sklerose, nicht jedoch von Cytomegalieviren beschrieben.

Es ist Aufgabe der Erfindung, eine weitere Substanz anzubieten, welche als Medikament erfolgreich zur Bekämpfung von Cytomegalieviren eingesetzt wer­ den kann, insbesondere ist dabei auf eine Reduktion der Nebenwirkungen im Vergleich mit bisher bekannten Medikamenten, die bei derselben Indikation eingesetzt werden, abzustellen.

Die Aufgabe wird durch die Verwendung von (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat zur Be­ handlung einer Infektion mit Cytomegalieviren gelöst, wobei (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat die folgende Formel I aufweist:

Es war anzunehmen, daß die erfindungsgemäße Substanz ähnlich wie Diethy­ lentriaminpentaessigsäure (Aisen and Listowsky (1980) Annu. Rev. Biochem. Vol 49: 357-393) wegen seines stark hydrophilen Charakters nicht in die Zelle eindringen und deshalb nur freie, d. h. nicht in die Zelle inkorporierte Metalle oder Ionen komplexieren kann. Von zum Beispiel Desferrioxamin ist dagegen bekannt, daß es in die Zelle einzudringen vermag. Da die Virusvermehrung aus dem Inneren der Zelle heraus erfolgt, mußte davon ausgegangen werden, daß ein hemmender Wirkstoff auch in die Zelle eindringen muß, um wirksam zu werden. Überraschenderweise ist jedoch gemäß in-vitro-Versuchen in der Zellkultur die erfindungsgemäße Substanz dennoch wirksam.

Gegenüber der Substanz Diethylentriaminpentaessigsäure ist die erfindungs­ gemäße Substanz deutlich wirksamer. Gegenüber der Substanz Desferri­ oxamin ist die erfindungsgemäße Substanz um den Faktor 30 wirkungsvoller.

Weiterhin ist überraschend, daß lediglich die erfindungsgemäße Substanz (S,S-Form) als Medikament einsetzbar ist. Nicht dagegen sind die anderen Formen einschließlich der Modifikationen (Propylen und Glutamat) gegen Cytomegalieviren erfolgreich einsetzbar.

Der antivirale Effekt der erfindungsgemäßen Substanz läßt sich durch Zusetzen von Eisen(II)- und Eisen(III)-Ionen modulieren. Die antivirale Aktivität wird um etwa den Faktor 2 bis 3 herabgesetzt, jedoch nicht vollständig aufgehoben. Somit wird offensichtlich, daß die Eisenchelatbildung einen beobachtbaren Effekt bei der Wirkung als antivirales Mittel aufweist, jedoch wird auch offen­ sichtlich, daß dieser Effekt allein nicht ausreicht, um die antivirale Wirkung zu erklären.

Überraschenderweise hat sich herausgestellt, daß die erfindungsgemäße Substanz sehr selektiv gegen Cytomegalieviren einsetzbar ist. Konzentratio­ nen an erfindungsgemäßer Substanz, die voll antiviral sind, haben keinen Ein­ fluß auf das Zellwachstum. Der therapeutische Index ist also sehr hoch. Somit hat die erfindungsgemäße Substanz eine hohe klinische Bedeutung.

Ungewöhnlich ist, daß die erfindungsgemäße Substanz gegen Cytomegalie­ viren einsetzbar ist, jedoch keinen Einfluß auf bestimmte andere Viren wie Adenoviren (ATTC-Stamm: GB Typ 3), Varizella Zoster Viren (ATCC-Stamm: MacIntyre) und Herpes simplex Viren (HSV-Vero) hat.

Die Erfindung umfaßt weiterhin das erfindungsgemäße Ethylendiamindisuccinat und dessen Salze und/oder Wasserstoff-Ionen. Die Salze ergeben sich zwangsläufig durch die Umgebung und den Aggregatzustand der Substanz.

Die Erfindung betrifft auch die Verwendung von (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat, bei dem die Salze Katio­ nen aus der Gruppe mit den Ordnungszahlen 3-5,11-13, 19-29, 37-49 oder 55-81 umfassen oder Gemische der zuvor aufgezählten Kationen umfassen.

Mehr bevorzugt ist das (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat, bei dem die Katio­ nen aus der Gruppe von Magnesium(II)-, Aluminium(III)-, Calcium(II)-, Man­ gan(II)-, Eisen(II)-, Eisen(III)-, Cobald(II)-, Nickel(II)-, Kupfer(II)-, Zink(lI)-Ionen und weiterhin Lithium-, Kalium- und Natrium-Ionen ausgewählt sind oder Mischungen dieser zuvor genannten Ionen sind. Besonders bevorzugt sind weiterhin Lithium-, Mangan(II)-, Calcium(II)-, Kalium- und Natrium-Ionen.

Daneben ist das (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat bevorzugt bei dem die Salze organische Kationen umfassen.

Ebenfalls bevorzugt ist das (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat, bei dem die Katio­ nen aus der Gruppe der primären, sekundären oder tertiären Amine (z. B. Etha­ nolamin, Diethanolamin, Triethanolamin, Morpholin, Glucamin, N,N-Dimethyl­ glucamin und N-Methylglucamin), Lysin, Arginin oder Ornithin ausgewählt sind oder die Kationen Gemische der zuvor angeführten Kationen sind.

Eine Mischung aus organischen und anorganischen Salzen wird von der Erfin­ dung mitumfaßt.

Als Medikament ist die Substanz (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat bevorzugt, wenn sie eine Zusammensetzung mit pharmakologisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen bildet. Derartige Hilfs- und Trägerstoffe sind in Remington′s Pharmaceutical Science, 15th ed. Mack Publishing Company, East Pennsylva­ nia (1980) beschrieben. Die Zusammensetzungen können nach bekannten Verfahren hergestellt werden.

Beispiele

Das erfindungsgemäße (S,S)-N,N′-Ethylendiamindisuccinat besitzt pharmako­ logische Eigenschaften und ist deshalb als pharmazeutischer Wirkstoff ver­ wendbar.

Insbesondere zeigt die erfindungsgemäße Substanz (S,S)-N,N′-Ethylen­ diamindisuccinat eine Wirkung gegenüber Cytomegalieviren.

Die erfindungsgemäße Substanz zeigt eine antivirale Hemmung (IC₅₀-Wert) bei Konzentrationen von 4 µg/ml. Höhere Konzentrationen sind anwendbar, ohne das Testsystem zu stören. Somit ist die erfindungsgemäße Substanz in einer Konzentration von 0,5 bis 100 µg/ml einsetzbar.

Die Versuchsergebnisse dieses in-vitro-Tests zeigen, daß die erfindungsge­ mäße Substanz als Arzneimittel oder zur medizinischen Behandlung verwendet werden kann. Diese Versuchsergebnisse lassen sich von dem in-vitro-Test­ system auf ein in-vivo-System problemlos übertragen, da es sich bei dem antivi­ ralen Testsystem um eine etablierte Versuchsanordnung handelt, die zum Nachweis der antiviralen Aktivität dient (Gerna et al. (1992) Antiviral Res. Vol 19: 333-345).

Die erfindungsgemäße Substanz kann deshalb zur Behandlung von Cytomega­ lieviren eingesetzt werden. Sie kann als Inhibitor bei Säugern, insbesondere bei Menschen, zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankung verwendet werden.

Die Erfindung garantiert somit die Verwendung der erfindungsgemäßen Substanz zur Behandlung von Cytomegalieviren; und liefert ein Beispiel für eine pharmakologische Zusammensetzung zur Behandlung von Cyto­ megalieviren, welche Behandlung die erfindungsgemäße Substanz und wenigstens einen pharmazeutischen Hilfs- und/oder Trägerstoff umfaßt.

Für die therapeutische Wirkung sind unterschiedliche Dosen geeignet. Sie hängen beispielsweise von den verwendeten Salzen, vom Wirt, von der Art der Verabreichung und von der Art und der Schwere der zu behandelnden Zu­ stände ab.

Im allgemeinen sind jedoch bei Tieren zufriedenstellende Resultate zu erwarten, wenn die täglichen Dosen einen Bereich von 1 bis 500 mg pro kg Körpergewicht umfassen. Bei größeren Säugetieren, beispielsweise dem Menschen, liegt eine empfohlene tägliche Dosis im Bereich von 1 bis 200 mg pro kg Körpergewicht. Bevorzugt ist eine Dosis von 1 bis 50 mg pro kg Körpergewicht, am meisten bevorzugt ist eine Dosis von 5 bis 30 mg pro kg Körpergewicht. Zum Beispiel wird diese Dosis zweckmäßigerweise in Teildosen bis viermal täglich verabreicht. Zufriedenstellende Resultate sind zu erwarten, wenn die erfindungsgemäße Substanz subkutan oder intravenös verabreicht werden. Auch die orale Verabreichung ist möglich.

Verwendete Zellen und Viren

Menschliche Vorhautfibroblasten (human foreskin fibroblasts, HFF) werden in einem Nährmedium aus Eagle′s minimal essential medium (EMEM) mit 10%igen Zusatz von fötalem Kälberserum angezüchtet.

Es wird der CMV-Labor-Stamm AD169 eingesetzt. Die Viren werden in EMEM- Nährmedium mit 4%igen Zusatz von fötalem Kälberserum vermehrt (Erhaltungsmedium). Der Virustiter wird durch Bestimmung von sogenannten immediate early antigen forming units (I.E.F.U.) ermittelt, die in dem Erhal­ tungsmedium gebildet werden (Gerna et al. (1992) Antiviral Res. Vol 19: 333-345).

Antivirale Wirkung

Die antivirale Wirkung der Substanzen auf die Vermehrung von Cytomegalie­ viren wird durch verschiedene Parameter bestimmt:
In einem ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay)-Test wird die Produktion and CMV-Late Antigenen ermittelt. Ausgedrückt wird dieses Ergebnis durch den IC₅₀-Wert, der die Konzentration an Wirkstoff repräsentiert, die die Produktionsrate des Antigens um 50% senkt. Die erfindungsgemäßen Sub­ stanzen haben einen IC₅₀-Wert von 4 µg/ml±µg/ml.

Die Zellvitalität wird in einer HFF-Zellkultur unter Verwendung eines MTT- Assays gemessen. Ausgedrückt wird das Ergebnis durch den TC₅₀-Wert, das ist die Konzentration, bei der 50% der getesteten Zellen noch vital sind. Sie beträgt in HFF-Zellen für die erfindungsgemäßen Substanzen 435 µg/ml.

Aus beiden Werten wird der Quotient TC₅₀/IC₅₀ gebildet, um den therapeu­ tischen Index festzustellen. Dieser liegt bei den erfindungsgemäßen Substan­ zen bei 109 (Gerna et al. (1992) Antiviral Res. Vol 19: 333-345).

Tabelle der Meßwerte

Formulierungsbeispiel

10 mg Ethylendiamindisuccinat Tetranatriumsalz pro ml Infusions­ lösung werden in einer herkömmlichen Infusionslösung angesetzt und in üblichen Volumina portioniert. Die Zusammensetzung der Lösung beträgt 10 g Ethylendiamindisuccinat Tetranatriumsalz in 340 ml 0,1 normaler HCl-Lösung und 660 ml Wasser für Injektions­ zwecke. Der pH-Wert der Lösung beträgt zwischen 6,5 bis 7,5. Die Abgabe erfolgt per Infusion in einer Menge von 60 mg/kg Körper­ gewicht pro Tag (Gesamtmenge). Vorzugsweise werden 3 tägliche Infusionen im Abstand von jeweils acht Stunden (je 20 mg/kg Körpergewicht) verabreicht.

Claims (4)

1. Verwendung von (S,S)-N,N′-Ehtylendiamindisuccinat ("EDDS") mit der Formel I zur Behandlung von Infektionen durch Cytomegalieviren,
Formel I

2. Verwendung von "EDDS" nach Anspruch 1 zusammen mit dessen Salzen und/oder Wasserstoffionen.

3. Verwendung von "EDDS" nach Anspruch 2, wobei die Salze Kationen aus der Gruppe mit den Ordnungszahlen des Periodi­ schen Systems 3-5, 11-13, 19-29, 37-49 oder 55-81 sind oder deren Gemische umfassen, insbesondere die Kationen aus der Gruppe der Li-, Na-, K-, Ca-, Mg- oder Al-Ionen ausgewählt sind.

4. Verwendung von "EDDS" nach Anspruch 2, wobei die Salze organische Kationen umfassen, insbesondere ausgewählt aus der Gruppe der primären, sekundären oder tertiären Amine, Lysin, Arginin oder Ornithin oder deren Gemische mitein­ ander.