DE69800640T2

DE69800640T2 - Pegylationsverfahren

Info

Publication number: DE69800640T2
Application number: DE69800640T
Authority: DE
Inventors: Derek Fisher; Elizabeth Francis; Farooq Malik
Original assignee: Polymasc Pharmaceuticals PLC
Current assignee: Polymasc Pharmaceuticals PLC
Priority date: 1997-01-29
Filing date: 1998-01-28
Publication date: 2001-07-05
Anticipated expiration: 2018-01-29
Also published as: EP0921817A1; WO1998032466A1; EP0921817B1; JP2001508783A; ATE200030T1; AU5773798A; DE69800640D1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Bindung eines Polyethylenglycolrestes (PEG) an ein Zielsubstrat. Verfahren für eine solche Bindung werden nachfolgend als "PEGylierung" des Substrates bezeichnet. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur direkten kovalenten PEGylierung eines Substrates mit der Reaktion eines halogenierten PEG mit dem Substrat, worin das Halogen des halogenierten PEG in der PEGylierungsreaktion als eine austretende Gruppe wirkt.
Kovalente Bindung von PEG an Moleküle, wie Proteine oder Strukturen, wie Liposomen, verbessert bekanntermaßen ihre pharmakologischen und physiologischen Eigenschaften.
Die EP-A-354 855 beschreibt ein Liposom, welches ein PEG-gebundenes Phospholipid umfaßt, worin der PEG-Rest an ein Phospholipid gebunden wird, welches in der Liposomenmembran vorliegt. Dies soll eine Verminderung der Absorption von Proteinen an dem Liposom in vivo ergeben und somit seine in vivo-Stabilität erhöhen.
Die EP-A-154 316 beschreibt ein Verfahren zur chemischen Modifizierung von Lymphokinen durch Anfügen eines PEG-Restes, wobei das PEG an wenigstens eine primäre Aminogruppe des Lymphokins gebunden wird. Dies soll zu dem verzögerten Spielraum für Lymphokine bei Verwendung als Arzneimittel führen und ihre Antigenität mindern.
Es gibt viele Methoden, um eine kovalente Kopplung von PEG an Substrate zu bekommen. Alle diese Methoden erfordern die Aktivierung des PEG durch Anfügung einer gewöhnlich als "aktivierender Rest" bezeichneten Gruppe oder durch Umwandlung eines endständigen Restes des PEG in einen aktivierenden Rest. Hierauf folgt eine zweite Stufe, in der sich das PEG an das Zielmolekül bindet, gewöhnlich über einen zurückbleibenden Abschnitt des aktivierenden Restes, welcher als der "Kopplungsrest" bezeichnet werden kann.

Beispiele bekannter Techniken schließen ein:

Succinimidylaktive Estermethoden: siehe z. B. US-Patent Nr. 4 412 989, WO 86/04 145, WO 87/00 056, EP-A-0 247 860, C. Monfardini, O. Shiavon, P. Caliceti, M. Morpurgo, J. M. Harris und F. M. Veronese "Ein verzweigtes Monomethoxypoly-(ethylenglycol) für Proteinmodifizierung", Bioconjugate Chem., 6, Seiten 62 bis 69 (1995), S. Zalipsky et al. (1991) in "Polymere Arzneimittel und Arzneimittelabgabesysteme" (R. L. Dünn & R. M. Ottenbrite, Herausgeber) ACS. Washington, D. C., Kapitel 10, S. Zalipsky et al. (1992) Biotechnol. Appl. Biochem., 15 : 100, H.-C. Chiu et al. (1993) Bioconjugate Chem.4 : 290, G. Sirokman & G. Fasman (1993) Protein Bei. 2 : 1161, F. M. Veronese et al. (1989) J. Controlled Release 10 : 145, A. Abuchowski et al. (1984) Cancer Biochem. Biophys. 7 : 175, M. Joppich & P. L. Luisi (1979) Macromol. Chem. 180 : 1381, A. L Klibanov et al. (1990) FEBS Letters 268 : 235, L. Sartore et al. (1991) Appl. Biochem. Biotech. 31 : 213.
Carbonyldiimidazolmethode: siehe z. B. EP-A-0 154432.
Phenylchlorformiatmethoden: siehe z. B. WO 89/06546 und WO 90/15 628.
PEG-Succinatmischanhydridmethoden: siehe z. B. Ahlstedt et al. (1983) Int. Aren. Allergy Appl. Immunol., 71, Seiten 228 bis 232, Richter und Akerblom (1983) Int. Aren. Allergy Appl. Immunol., 70, Seiten 124 bis 131.
Organische Sulfonylhalogenidmethoden: siehe z. B. US-Patent Nr. 4 415 665.
PEG-Maleimid- und verwandte Methoden: siehe z. B. Goodson & Katre (1990) Biotechnology, 8, Seiten 343 bis 346.
Phenylglyoxalmethode: siehe z. B. EP-A-0 340 741.
Succinimidcarbonatmethode: siehe z. B. WO 90/13 540, WO 91/07 190.
Cyanogenbromidmethode: siehe US-Patentschrift Nr. 4 301 144.
Poly-PEG-Maleinsäureanhydridmethode: Yoshimoto et al. (1987) Biochem, and Biophys. Res. Commun. 148, Seiten 876 bis 882.
Cyanurchloridmethode: A. Abuchowski. T. von Es, N. C. Palczuk & F. F. David (1977). Änderung immunologischer Eigenschaften von Rinderserumalbumin durch kovalente Bindung von Polyethylenglycol, J. Biol. Chem., 252, Seiten 3578 bis 3581.
PEG-Acetaldehydmethoden: G. P. Roger, US-Patent Nr. 4 002 531, EP-A-0 154 316, M. M. Harris, K. Yoshinaga, M. S. Paley & M. R. Herati (1989). Neue aktivierte PEG-Derivate für Affinitätstrennung. In D. Fisher & l. A. Sutherland (Herausgeber) Trennungen unter Verwendung wäßriger Phasensysteme. Anwendungen in der Zellbiologie und Biotechnologie (Seiten 203 bis 210). London Plenum Press.
Aminacylierungsmethoden (sowohl PEG-COOH als auch PEG-NHa): siehe z. B. EP-0 072 111 und EP-0 401 384.
Vinylsulfonmethode: M. Morpurgo, F. M. Veronese, D. Kachensky und J. M. Harris, J. Bioconj. Chem., 7, Seiten 363 bis 368 (1996).
PEG-Epoxidmethoden: L. Elling & M. R. Kula (1991) Biotech. Appl. Biochem. 13, Seite 354.
PEG-lsocyanatmethode: R. B. Greenwald, A. Pendri und D. Bolikal, J. Org. Chem., 40, Seiten 331 bis 336 (1995).
PEG-Orthopyridyldisulfid: C. Woghiren, B. Sharma und S. Stein, Bioconj. Chem., 4, Seite 314 (1993).
PEG-Propionaldehyd: M. J. Harris, J. M. Dust, McGill, P. A. Harris, M. J. Edgell, R. M. Sedaghat- Herati, L. J. Karr & D. L. Donnelly (1991). Neue Polyethylenglycole für biomedizinische Anwendungen. Kapitel 27 in S. W. Shalaby, C. L. McCormick & G. B. Butler (Herausgeber), Water-Soluble Polymers Wahington D. C.: American Chemical Society.
Diese Methoden leiden an einem oder mehreren der folgenden Nachteile: Wesentlicher Verlust an biologischer Aktivität (z. B. 20 bis 95% Verlust von Bioaktivität) findet man häufig mit der Cycanurchloridmethode.
K. V. Savoca, A. Abuchowski, T. von Es, F. F. Davis, N. C. Palczuk (1979), Biochem. Biophys. Acta 578: Seiten 47 bis 53, Y. Ashihara, T. Kono, S. Yamizaki, Y. Inada (1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 83, Seiten 385 bis 391, Y. Kamisaki, H. Wada, T. Yagura, A. Matsushima, Y. Inada (1981) J. Pharmacol. Exp. Ther. 216, Seiten 410 bis 414, K. J. Wieder, N. C. Palczuk, T. von Es, F. F. Davis (1979) J. Biol. Chem. 254, Seiten 12579 bis 12587, H. Nishimura, A. Matsushima, Y. Inada (1981) Enzyme, 26, Seiten 49 bis 53 und P. S. Pyatak, A. Abuchowski, F. F. Davis (1980) Res. Commun. Chem. Pathol. Pharmacol. 29, Seiten 113 bis 127).
Die Bindung von PEG (oder anderer Polymere) an Proteine (oder andere Zielmoleküle) erfolgt mit wenigen Ausnahmen auf eine Weise, die einen Teil des aktivierenden Restes, einen Kopplungsrest, zwischen dem PEG und dem Zielmolekül entläßt. Von den obigen Methoden binden nur die organischen Sulfonylhalogenidmethoden und die PEG-Acetaldehydmethoden, die in Royer, US-4 002 531 (1977) und Harris (1989, a. a. O.) PEG direkt ohne Kopplungsreste, d. h. um ein "verbinderloses" PEGylierungsprodukt zu erzeugen. Mit der Ausnahme einiger anderer PEG-Acetaldehydmethoden, bei denen der Kopplungsrest Ethylenoxid ist (und so vom PEG selbst nicht unterscheidbar ist), und die obigen direkten Bindungsmethoden führen alle anderen Bindungsverfahren einen von dem Polymer und der Zielverbindung unterschiedlichen Kopplungsrest ein und werden somit als "indirekte" Kopplungsmethoden betrachtet.
Die Einarbeitung eines Kopplungsrestes erzeugt weitere Probleme, die von der Natur des Kopplungsrestes abhängen:
(i) Einige Kopplungsreste liefern Zielsubstanzen für enzymatische Spaltung oder Hydrolyse (siehe nachfolgend).
(ii) Einige Kopplungsreste ergeben eine immunogene/antigene Gruppe (z. B. den Triazinring der Cyanurchloridmethode oder die Succinylgruppe der Succinimidylsuccinatmethode und derPEG-Succinatmischanhydridmethode).
(iii) Einige Kopplungsreste sind potentiell toxisch oder selbst von unbekannter Toxizität, stammen aber von einer Verbindung ab, die als toxisch bekannt ist (z. B. der Triazinring der Cyanurchloridmethode und Reagenzien in der Phenylchlorformiatmethode).
(iv) Einige Kopplungsreste ergeben reaktive Gruppen, die weitere Moleküle an die PEG- Zielkonstruktion über den Kopplungsrest binden können (z. B. den Triazinring der Cyanurchloridmethode. M. Leonard et al., Tetrahedron, 40, Seite 1585 [1984]).
(v) Einige Kopplungsgruppen ändern die Oberflächenladung an der Stelle der Bindung des Polymers.
Die Kopplung verläuft in manchen Fällen somit über eine instabile Bindung, die durch in Serum, Plasma, Zellen oder anderen biologischen Materialien vorhandene Enzyme oder durch Verfahren, die in dem PEG-Zielprodukt durchgeführt werden, gespalten werden. Dies hat zwei mögliche schädliche Konsequenzen.
(i) Die PEG-Zielkonstruktion wird enzymatisch oder durch die für die anschließenden Reaktionsstufen erforderlichen Bedingungen abgebaut. Das erstere verläuft insbesondere mit Esterbindungen erzeugenden Methoden und wahrscheinlich auch mit Aminbindungen.
(ii) Entfernung des PEG-Restes ändert das Zielmolekül. Dies erfolgt mit einigen succinimidylaktiven Estermethoden und Mischanhydridmethoden.
Eines von beiden oder beides kann auftreten.
Viele der obigen Methoden empfehlen lange Kopplungszeiten und/oder einen nichtphysiologischen pH-Wert für die PEGylierungsreaktion, was einige Zielmoleküle weniger aktiv oder inaktiv macht (z. B. die Cyanurchloridmethode, Phenylchlorformiatmethode, Acetaldehydmethode und Propionaldehydmethode).
Viele dieser Methoden verwenden aktiviertes PEG und/oder erzeugen Coprodukte, welche in einem weiten Bereich von biologischen Versuchen toxisch und in vivo potientiell toxisch sind, wenn sie nicht von dem Produkt abgetrennt werden (z. B. die Phenylchlorformiatmethode und Cyanurchloridmethode).
Einige Methoden sind ungeeignet für die Verwendung in wäßriger Lösung, so daß sie die Zielmoleküle auf jene beschränken, die nichtwäßrige Bedingungen zulassen, z. B. die organische Sulfonylhalogenidmethode unter Verwendung von Trifluormethansulfonylchlorid).
Einige der aktivierten PEG-Zielkonstruktionen sind instabil, da sie beispielsweise Gegenstand einer Hydrolyse entweder während der Aktivierung oder Kopplungsreaktionen (z. B. der Phenylchlorformiatmethode) sind. Beispielsweise ist PEG-Acetaldehyd empfindlich für Zersetzung unter basischen Bedingungen und kann unreproduzierbare Ergebnisse erbringen.
T. Ouchi et al. [(1987), J. Macromol. Sci. Chem. A24 Seiten 1011 bis 1032] diskutieren die PEGylierung von 5-Fluoruracil mit verschiedenen PEG-Derivaten, um methoxy-PEG-ether-, -ester oder -amidverkettete Konstruktionen zu erzeugen. Die Herstellung von Methoxy-PEG-ether-5- fluoruracil aus einem Methoxy-PEG-Br-Derivat in Chlorbenzol unter Verwendung von Tetra-nbutylammoniumbromid als einen Basenüberführungskatalysator ist beschrieben. Keines der Methoxy-PEG-ether-5-fluoruracilderivate, die so erzeugt wurden, zeigte biologische Aktivität (d. h. Antiturmoraktivität).
Zheng Hu et al. (1987), Acdta Pharmaceutcial Sinica, 22 (8), Seiten 637 bis 640 diskutieren die Synthese von PEG-Östrogenverbindungen aus chloriertem Polyethylen in nichtwäßrigen Lösungsmitteln unter Verwendung der Williamson-Reaktion.
Wahrscheinlich ist die bis heute verwendete, vorteilhafteste PEGylierungsmethode die TMPEG-Methode, die in der WOA-90/04 606 erwähnt ist und eine Aktivierung von Monomethoxy- PEG ("MPEG") mit 2,2,2-Trifluorethansulfonylchlorid (Tresylchlorid) umfaßt, um Tresyl-MPEG ("TMPEG") zu erzeugen, welches anschließend mit einem Zielproteinmolekül umgesetzt wird, um monomethoxyPEGylierte Produkte zu erzeugen. Bei physiologischem pH ist die TMPEG-Methode eine "direkte" Kopplungsmethode, bei der der PEG-Rest direkt an das Zielsubstrat ohne einen Kppplungs- oder Bindungsrest gekoppelt wird. Eine ähnliche Technik ist in der WO 90/04 650 zur Kopplung von Monomethoxy-PEG-Resten an DANN/Protein-Komplexe beschrieben.
Es ist auch bekannt, daß die Verwendung von TMPEG als das aktivierte PEG zur Verwendung in der PEGylierung, insbesondere bei sehr hohem pH, zur Eliminierung von HF auf einem Alternativweg führen kann. Dieser alternative Eliminierungsweg kann beispielsweise benutzt werden, wenn man TMPEG mit einem Protein umsetzt und die Freisetzung von HF einschließt, welche TMPEG in ein Zwischenalken umwandelt, worauf eine Hydratisierung und weitere Beseitigung von HF folgen, um das Acylfluorid zu erzeugen, welches über weitere Hydrolyse in die a-Sulfonatsäure umgewandelt wird. Das Alken und Acylfluorid-MPEG-Derivate können mit Zielmolekülen unter Bildung eines Sulfonatamidderivates umgesetzt werden.
Es ist klar erwünscht, ein fuktionalisiertes PEG zu entwickeln, welches einfach und billig herzustellen ist, welches zur PEGylierung eines weiten Bereiches möglicher Substrate verwendet werden kann, welches ein bindegliedloses oder direkt gekoppeltes PEGyliertes Substrat erzeugt, ein Substrat sowohl in wäßrigen als auch nichtwäßrigen Lösungsmitteln PEGylieren kann und nicht zu unerwünschten Nebenwirkungen führen kann, die oben aufgelistet sind. Es ist auch erwünscht, ein PEGylierungsverfahren zu haben, welches unter physiologischen Bedingungen rasch funktioniert, da dies für die Beibehaltung biologischer Aktivität bei der PEGylierung zahlreicher Proteine kritisch ist.
Somit bekommt man nach der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur PEGylierung eines Substrates unter Umsetzung eines halogenierten PEG der allgemeinen Formel I oder der allgemeinen Formel II
X-PEG-Y (I)
(PEG)n-Yi (II)
worin in der Formel I PEG eine zweibindige Gruppe der Formel -(-CH&sub2;CH&sub2;O-)m-CH&sub2;CH&sub2;- ist, worin m gleich oder größer als 1 ist und die sich von einem Polyethylenglycol herleitet, X ein Halogenatom, eine blockierende Gruppe oder eine aktivierende Gruppe ist, die in der Lage ist, den PEG-Rest an einen anderen Rest zu binden, Y ein Halogen ist, n die Zahl der PEG- Endgruppen bedeutet und n gleich wie oder größer als 2 ist, i gleich wie oder kleiner als n ist und i/n PEG-Endgruppen durch Y in Verbindungen der Formel II substituiert sind, mit dem Substrat, worin das Halogen des halogenierten PEG als eine austretende Gruppe wirkt und das PEG direkt an das Substrat bindet, unter der Voraussetzung, daß das Substrat ein Steroid ist oder, wenn das halogenierte PEG PEG-Bromid ist, das Substrat nicht 5-Fluoruracil ist.
Halogenierte PEGs der Formel I können monofunktionelle, homobifunktionelle oder heterobifunktionelle aktivierte PEGs sein, d. h. ein halogeniertes PEG der Formel I kann zwei endständige Halogene haben (X und Y sind Halogene, die gleich oder verschieden sind), oder wenn nur ein endständiges Halogen vorliegt, kann die andere endständige Gruppe X entweder eine blockierende Gruppe oder eine aktivierende Gruppe sein. Halogenierte PEGs der Formel II können von verzweigter kreuzförmiger oder sternförmiger Struktur sein. Bei bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist X eine blockierende Gruppe, die unter Methyl-, Tertiärbutyl- und Benzylethern ausgewäht ist.
Bei weiteren bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist X eine aktivierende Gruppe mit einem Atom, das nukleophilem Angriff zugänglich oder in der Lage ist, das endständige Kohlenstoffatom des PEG, das nukleophilem Angriff oder äquivalenter alternativer Substitution zugänglich ist und vorzugsweise ein Sulfonatester, ein substituiertes Triazin, ein N-hydroxysuccinimidaktiver Ester, ein Anhydrid, ein substituiertes Phenylcarbonat, Oxycarbonylmidazol, ein Maleimid, ein Aldehyd, ein Glyoxal, Carboxylat, ein Vinylsulfon, ein Epoxid, ein Isocyanat, ein Disulfid, ein Acrylat, ein Allylether, ein Silan oder ein Cyanatester ist, zu machen. Stärker bevorzugt ist X ein aktivierende Gruppe, die unter den folgenden ausgewählt ist: 2,2,2-Trifluorethansulfonat, Pentafluorbenzolsulfonat, Fluorsulfonat, 2,4,5-Trifluorbenzolsulfonat, 2,4-Difluorbenzolsulfonat, 2-Chlor-4-fluorbenzolsulfonat, 3-Chlor-4-fluorbenzolsulfonat, 4-Amino-3- chlorbenzolsulfonat, 4-Amino-3-fluorbenzolsulfonat, o-Trifluomethylbenzolsulfonat, m- Trifluormethylbenzolsulfonat, p-Trifluormethylbenzolsulfonat, 2-Trifluormethoxybenzolsulfonat, 4- Trifluormethoxybenzolsulfonat, 5-Fluor-2-methylbenzolsulfonat, 4,6-Dichlortr/azin, 6-Chlortriazin, N-Hydroxysuccinimidylsuccinat, N-Hydroxysuccinimidylglutarat, N-Hydroxysuccinimidylsuccinamid, N-Hydroxysuccinimidylalkandicarbonsäure, N-Hydroxysuccinimidyl-Derivate von carboxymethylierten Polymeren, N-Hydroxysuccinimidylester von Aminosäuren, Succinatmischanhydrid, Bernsteinsäure, Trichlorphenylcarbonat, Nitrophenylcarbonat, Maleimid, N-substituiertes Maleimid, Acetaldehyd, Propionaldehyd und chemisch äquivlante Schwefelanaloge, Glyoxal, Phenylglyoxal, Acrylat, Methacrylat.
Bevorzugte Halogene für die Gruppen X und Y schließen Chlor, Brom und Jod ein. Chlor ist am meisten bevorzugt.
Bei den am meisten bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung ist das halogenierte PEG
Monomethoxy-PEG-Cl
Monomethoxy-PEG-Br
Monomethoxy-PEG-I
Cl-PEG-Cl
Br-PEG-Br
I-PEG-I
Obwohl einige halogenierte PEGs bekannte Verbindungen sind, ist es besonders überraschend, daß sie als PEG-Derivate brauchbar sind, die für direkte Verwendung in einer PEGylierungsreaktion geeignet sind. Es wurde früher angenommen, daß Halogene erheblich schlechtere Aktivität als bekannte austretende Gruppen, wie Tosylat oder Tresylat, haben. Beispielsweise zitiert J. McMurry in "Organic Chemistry", 4. Auflage (1996) Chlorid als mit 300fach geringerer Reaktivität als Tosylat austretende Gruppe. Wenn man berücksichtigt, daß Tresylat als mit 100fach größerer Reaktivität als Tosylat beschrieben ist (J. March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure, 4. Auflage [1992]), kann man erwarten, daß Chlor 30 OOOfach geringere Reaktivität als Tresylat hat.
Halogenierte PEGs können nach bekannten Methoden synthetisiert werden. PEG kann gewerblich synthetisiert oder gekauft werden und dann mit Halogen, aktivierenden Gruppen oder blockierenden Gruppen, wie erforderlich, derivatisiert werden, indem man Methoden verwendet, die zum Beispiel von E. Bayer et al. In Polymer Bulletinf, 8, Seiten 585 bis 592 (1982), S. Zalipsky et al., Eur. Polym. J., Band 19, Nr. 12, Seiten 1177 bis 1183 (1983), A. F. Buckmann, M. Morr und G. Johansson in Makromol. Chem. 182, Seiten 1379 bis 1384 (1981), J. M. Harris in Macromol Bei. Rev. Polym. Phys., C 25 (3), Seiten 325 bis 373 (1985), J. M. Harris, E. C. Struck, G. M. Case et al. In J. Poly. Sci. Poly. Chem. Ed.. 22, Seiten 341 bis 352 (1984), S. Zalipsky und C. Lee in Polyethylen Glycol) Chemie: Biotechnische und biomedizinische Anwendungen (Herausgeber J. M. Harris), Seiten 347 bis 370 (Plenum Press, New York, 1992) und in S. Zalipsky, Bioconjugate Chem. (1995), 6, Seiten 150 bis 165, wo MPEG-Cl verwendet wurde, um aktivierte PEGs herzustellen, die anschließend an Substrate gebunden wurden, beschrieben sind.
Multihalogenierte PEGs können unter Verwendung entweder natürlich verzweigter PEGs, wie des kreuzförmigen PEG, das in einigen Präparaten von PEGs mit hohem Molekulargewicht gefunden wird, oder aus mehrfach verzweigten PEGs des Patentinhabers, die als "Stern"-PEGs bekannt sind, hergestellt werden. Eine Derivatisierung der freien PEG-Endgruppen mit Halogen erreicht man für die obigen halogenierten PEGs.
Reaktionsbedingungen für das Verfahren der vorliegenden Erfindung werden klar von der Natur von X, Y und des Substrates abhängen.
Wie oben angegeben, können die PEG-Reste der halogenierten PEGs, die nach der Erfindung verwendet werden, gegebenenfalls aus handelsüblichen PEGs hergeleitet werden. Diese Materialien sind allgemein durch ihre mittleren Molekulargewichte (Zahlenmittel und Gewichtsmittel) gekennzeichnet. Beispielsweise ist PEG-5000 ein Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht (Zahlenmittel) von etwa 5000. Die Größe des PEG-Restes, der an das Zielsubstrat gebunden werden soll, wird gewöhnlich nach der Natur des Substrates und danach, welche Eigenschaften erwünschtermaßen durch die Bindung des PEG-Restes modifiziert werden sollen, ausgewählt. Beispielsweise wenn das Zielsubstrat ein Liposom für die Verabreichung an ein Tier ist und es erwünscht ist, die Zirkulationshalbwertszeit des Liposoms nach Verabreichung zu steigern, kann ein PEG mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 5000 ausgewählt werden. Es sollte jedoch festgestellt werden, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung allgemein auf die Bindung von PEG-Resten irgendeiner Größe an Zielsubstrate anwendbar ist.
Besonders nach der vorliegenden Erfindung erzeugte PEGylierte Substrate schließen jene ein, die ihre biologische Aktivität in bezug auf unPEGylierte Substrate nicht verlieren. So kann PEGylierung nach der vorliegenden Erfindung die spezielle Aktivität eines Substrates beibehalten oder steigern, oder sie kann die Halbwertszeit eines Substrates, welches verminderte, beibehaltene oder gesteigerte spezifische Aktivität hatte, durch PEGylierung steigern. Außerdem kann PEGylierung nach der vorliegenden Erfindung die spezifische Aktivität pleiotroper Substanzen, wie bestimmter Proteine, unterschiedlich modifizieren.
Der Begriff "Substrat", wie er hier verwendet wird, soll irgendein Molekül, Makromolekül oder irgendeine Struktur einschließen, welche in der Lage ist, kovalent an einen PEG-Rest gebunden zu werden und dabei eine Modifizierung der chemischen, biologischen, physiologischen oder physikalischen Eigenschaften erfahren. Es ist nicht beabsichtigt, Moleküle einzuschließen, welche, wenn sie mit halogeniertem PEG umgesetzt werden, nur ein weiteres aktiviertes PEG-Derivat produzieren, welches als ein Zwischenprodukt verwendet wird, um den PEG-Rest an ein anderes Substrat zu koppeln. Das Substrat ist kein Steroid.
Geeignete Substrate, an welche PEG gemäß der vorliegenden Erfindung gebunden werden kann, schließen Materialien mit biologischer Aktivität ein, welche beispielsweise bei der Diagnose oder Therapie brauchbar und dem Fachmann bekannt sind. Sie enthalten alle wenigstens eine Gruppe, die mit dem halogenierten PEG reagieren kann. Beispiele solcher reaktiver Gruppen sind etwa primäre, sekundäre und tertiäre Aminogruppen, Diolgruppen und aromatische Hydroxylgruppen
Spezieller schließen Substrate für die Verwendung nach der vorliegenden Erfindung Proteine, Peptide, Aminosäuren und ihre Derivate, wie Antikörper und Bruchstücke hiervon, Cytokine und Derivate oder Fragmente hiervon, wie beispielsweise die Interleukine (IL) und speziell die IL-1-, IL-2-, IL-3-, IL-4-, IL-5-, IL-6-, IL-7-, IL-8-, IL-9-, IL-10-, IL-11- und IL-12- Untertypen hiervon, koloniestimulierende Faktoren, wie beispielsweise granulocyt-markophagkoloniestimulierender Faktor, glanulocytkoloniestimulierender Faktor (alpha- und beta-Formen), makrophagkoloniestimulierender Faktor (auch als CSF-1 bekannt), Hämopoietine, beispielsweise Eryhtropoietin, Hämopoietin-alpha und und Kit-Ligand (auch als Stammzellenfaktor oder Steel- Faktor bekannt), Interferone (IFNS), wie beispielsweise IFNalpha, IFNbeta und IFNgamma, Wachstumsfaktoren und bifunktionelle Wachstumsmodulatoren, wie beispielsweise epidermalen Wachstumfaktor, sich aus Blutplättchen herleitenden Wachstumsfaktor, Umwandlungswachstumsfaktor (alpha - und beta-Formen), Amphiregulin, Somatomedin-C, Knochenwachstumsfaktor, Fibroplast-Wachtstumfaktoren, insulinartige Wachstumsfaktoren, heparinbindende Wachstumsfaktoren und Tumorwachstumsfaktoren, Differenzierungsfaktoren und dergleichen, wie beispielsweise makrophagunterscheidenden Faktor, differenzierungsinduzierenden Faktor (DIF) und Leukämieinhibitorfaktor, aktivierende Faktoren, wie beispielsweise Blutplättchen aktivierenden Faktor und Makrophag-Aktivierungsfaktor, Koagulierungsfaktoren, wie fibrinolytische/antikoagulierende Mittel einschließlich Heparin und Protasen und ihre Profaktoren, wie beispielsweise Klumpungsfaktoren VII, VIII, IX, X, XI und XII, Antithrombin III, Protein C, Protein S. Streptokinase, Urokinase, Prourokinase, Gewebe- Plasminogenaktivator, Fibrinogen und Hirudin, Peptidhormone, beispielsweise Insulin, Wachstumshormon, Gonadotrophine, follikelstimulierendes Hormon, Leutenisinghormon, Wachstumshormon freisetzendes Hormon und Calcitonin, Enzyme, wie Superoxiddismutase, Glucocerebrosidase, Asparaginase und Adenosindeaminase, Vaccine, wie beispielsweise Hepatitis-B-Vaccin, Malariavaccin, Melanomvaccin und HIV-1-Vaccin.Transkriptionsfaktoren und Transkriptionsmodulatoren, Kohlenhydrate, Glycosoaminoglycane, Glycoproteine und Polysaccharide, Lipide, beispielsweise Phosphatidylethanolamin, Phosphatidylserin und Derivate hiervon, Sphingosin und Derivate hiervon, Nucleotide, Nucleoside, heterozyklische Basen, DMA, RNA, synthetische und nichtsynthetische Oligonucleotide einschließlich jener mit nucleasebeständigen Grundgerüsten, Vitamine, Antibiotika, einschließlich Lantibiotika, bakteriostatische und bakterizide Mittel, antifungale, anthelminthische und andere Mittel, die gegen Infektmittel wirksam sind, einschließlich einzelliger Pathogene, kleine Effektormoleküle, wie Noradrenalin, alphaadrenergische Rezeptorliganden, Dopaminrezeptorliganden, Histaminrezeptorliganden, GABA/Benzodiazepinrezeptorliganden, Serotoninrezeptorliganden, Leukotriene und Triodothyronin, cytotoxische Mittel, wie Doxorub icin, Methotrexat und Derivate hiervon, ein.
Das Substrat kann auch Teil einer größeren multimolekularen Struktur sein. Diese schließen Zellen oder Teile hiervon ein, wie beispielsweise Erythrozyten, Erythrozyt-"Geister", Leukozyten, Viren, einzellige Organismen, Liposomen, wie multilamellare Bläschen und unilamellare Bläschen, Micellen und micellartige Strukturen sowie Aggregate, Mikroemulsionen, Koacervate, Emulsionen und Suspensionen der obigen Stoffe. Das Substrat kann auch eine Oberfläche auf einer Vorrichtung, wie einem Katheter, einem Stent, Kontaktlinsen und künstlichen Ventilen sein.
Es liegt auf der Hand, daß, wenn das Substrat Teil einer solchen Struktur ist, in jeder Struktur allgemein viele reaktive Gruppen sein werden. Eine Behandlung nach der Erfindung kann daher eine viele PEG-Reste tragende Struktur erzeugen. Wenn das PEG bi- oder multivalent ist, kann eine Umsetzung mit einem multimolekularen Substrat zu intermolekularer Vernetzung durch das PEG zwischen Molekülen der gleichen Zielstruktur und/oder Molekülen unterschiedlicher Zielstrukturen sowie intramolekularer Bindung des PEG an mehr als eine Position an dem gleichen Molekül einer Zielstruktur führen.
Substrate, denen eine reaktive Gruppe fehlt, können so modifiziert werden, daß eine oder mehrere reaktive Gruppen erzeugt werden. Dies liegt innerhalb der Fähigkeit des Fachmannes und kann durch bekannte Techniken erzielt werden.
Einige Substrate (z. B. RNA und Einzelstrang-DNA) ergeben spezielle Probleme, da sie zu viele reaktive Gruppen liefern können, an welche das PEG in einer Standardreaktion gebunden würde. Daher können gegebenenfalls einige Gruppen temporär durch Einbeziehung in eine geeignete Konformation geschützt werden, welche nukleophilen Angriff auj das halogenierte PEG ausschließt, wie beispielsweise durch die Wasserstoffbindung, die mit einer Basenpaarung von DNA verbunden ist (siehe nachfolgend).
Der Begriff "blockierende Gruppe", wie er hier verwendet wird, soll einen Rest bedeuten, welcher, wenn er kovalent an eine PEG-Endgruppe gebunden ist, die Bindung einer aktivierenden Gruppe an die Endgruppe während des Aktivierungsverfahrens verhindern kann.
Eine Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens schließt eine stellenspezifische Modifizierung von DNA, RNA und synthetischen Oligonucleotidzielen (oder irgendeines Moleküls, das eine Aminogruppe oder andere reaktive Gruppe enthält, welche an Wechselwirkungen, wie Wasserstoffbindung mit einem anderen Molekül oder einer anderen Verbindung teilhat) ein, indem ein nucleophiler Angriff auf das halogenierte PEG durch reaktive Gruppen an der Zielverbindung ausgeschlossen wird. Die Basen Adenin (A), Cytosin (C) und Guanin (G) [aber nicht Uracil (U) oder Thymin (T)] liefern geeignete Ziele in DNA, RNA und synthetischen Oligonucleotiden zur Modifizierung mit PEG-Resten gemäß der Erfindung, und somit sind dies spezielle Ziele mit dem Problem, daß zu viele verfügbare reaktive Gruppen vorliegen können, an die das Polymer gebunden werden kann. Durch Verwendung verschiedener Restriktionsspaltungsstellen für das Fragment DNA als Modellsystem können ausgewählte Basen A, C oder G durch die Eignung austretender kurzer einstrangiger Erstreckungen (z. B. zwei bis vier Basen) modifiziert werden. Adeninbasen scheinen die empfänglichsten für solche Modifizierung zu sein. Offenendige doppelsträngige DNA wird nicht leicht unter den beschriebenen Bedingungen gekoppelt, was anzeigt, daß die Wasserstoffbindung zwischen Basenpaaren ausreichend ist, um eine Wechselwirkung der Aminogruppen von A-, C- und G-Basen mit dem aktivierten PEG auszuschließen.
Stellenspezifische DNA-Modifizierung durch Polymer kann durch das Hilfsmittel eines Einschließens einer oder mehrerer A-, C- oder G-Basen in einen kurzen einzelstrangigen Abschnitt von DNA durch geeigneten Restriktionsenzymaufschluß oder durch Hybridisieren von Oligonucleotiden unähnlicher Längen mit dem DNA erreicht werden, um Basen zu schützen, die nicht modifiziert werden sollen, oder durch Ausnutzung der natürlichen Strangasymmetrie von Polymerisationskettenreaktionsprodukten, die ein Basenpaar als Überhang haben, oder durch Ausnutzung lokalisierter Bereiche von Einstrangigkeit, die durch natürliches oder künstliches lokalisiertes Schmelzen der Doppelspirale erreicht werden. Die Reaktion von MethoxyPEGBr mit 5-FU ist in die vorliegende Erfindung nicht einbezogen.
Der Begriff "medizinische Therapie", wie er hier verwendet wird, schließt therapeutische, diagnostische und prophylaktische Bereiche ein.
Nichtbeschränkende Beispiele der Erfindung werden nun unter Bezugnahme auf die beiliegenden Figuren beschrieben, die folgendes zeigen:
Fig. 1 Elutionsprofile der Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie von
a) MPEG-Cl,
b) MPEG und
c) eines Gemisches von MPEG-Cl und MPEG;
Fig. 2a) ein repräsentatives Elutionsprofil der Reaktionsprodukte der PEGylierung von Lysozym unter Verwendung von MPEG-Cl, auf einer Superose 12-Säule getrennt,
b) ein weiteres Beispiel eines Experimentes ähnlich jenem, das in Fig. 2a gezeigt ist;
Fig. 3 ein repräsentatives Elutionsprofil von Reaktionsprodukten der PEGylierung von Lysozym unter Verwendung von TMPEG, auf einer Superose 12-Säule getrennt;
Fig. 4 Elutionsprofile von Reaktionsprodukten der PEGylierung von Lysozym durch MPEG-Cl bei alkalischem pH auf Superose 12;
Fig. 5 Elutionsprofile von Reaktionsprodukten der PEGylierung von Lysozym durch MPEG-Cl bei
a) 4ºC während 21 min und
b) 4ºC während 72,5 h,
auf Superose 12;
Fig. 6 Elutionsprofile von Reaktionsprodukten der PEGylierung von Lysozym unter Verwendung von TMPEG bei 3ºC, 15,5ºC und 22,5ºC auf Superose 12;
Fig. 7 Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie von Polymerarten (MPEG, MPEG-Cl und TMPEG jeweils in Peaks 1 bis 3) unter Verwendung des in Beispiel 5 angegebenen Verfahrens gebildet;
Fig. 8 das Elutionsprofil der Reaktionsprodukte der PEGylierung von Lysozym unter Verwendung von MPEG-Cl, erzeugt nach der Methode des Beispiels 5, von einer Superose 12- Säule unter Verwendung eines computergesteuerten FPLC);
Fig. 9 das Elutionsprofil von einer Superose 12-Säule (unter Verwendung eines computergesteuerten FPLC), wenn die Menge an TMPEG äquivalent 10% des gesamten aktivierten Polymers ist, das in Fig. 8 oben eingesetzt wird (d. h. ähnlich dem Gehalt von verschmutzendem TMPEG in der für PEGylierung in Fig. 8 verwendeten Probe;
Fig. 10 das Elutionsprofil der Reaktionsprodukte der PEGylierung von Lysozym, die in Beispiel 6 beschrieben ist, d. h. unter Verwendung von MPEG-Cl, erzeugt nach der Methode von Beispiel 5, woraus Spuren von TMPEG durch verlängerte Hydrolyse, wie in Beispiel 6 angegeben, entfernt wurden, von einer Superose 12-Säule (unter Verwendung eines computergesteuerten FPLC);
Fig. 11 Dosisansprechkurven von PEGyliertem GM-CSF, das unter Verwendung von MPEG-Cl, wie in Beispiel 5 beschrieben synthetisiert wurde, und scheinbehandelter Kontrollen für MPEG hergestellt wurde; die in den Rechtecken a, b und c gezeigten Ergebnisse stammen von drei unabhängigen Experimenten;
Fig. 12 Dosisansprechkurven von PEGyliertem EPO, das unter Verwendung von MPEG-Cl, synthetisiert wie in Beispiel 1 hergestellt wurde, und einer scheinbehandelten Kontrollprobe, die MPEG ausgesetzt wurde;
Fig. 13 Dosisansprechkurven von PEGyliertem EPO, welches unter Verwendung von MPEG-Cl, das gemäß den Ausführungen in Beispiel 5 synthetisiert wurde, hergestellt wurde, und von scheinbehandelten Kontrollen, die MPEG ausgesetzt wurden; Rechtecke a bis c zeigen drei unabhängige Experimente;
Fig. 14 Säureeliminierung durch MPEG-Cl bei pH 7 und Fluoridmessungen (im Vergleich mit Fig. 15);
Fig. 15 Fluorid- und Säureeliminierung durch TMPEG bei pH 7:
a) TMPEG nach der Methode von [WO 95/06 058] hergestellt,
b)
c) TMPEG nach zwei alternativen Herstellungsverfahren produziert;
Fig. 16 Säureeliminierung für MPEG-Cl bei pH 9 und Fluoridmessungen im Vergleich mit Fig. 17;
Fig. 17 Fluorid- und Säureeliminierung für TMPEG bei pH 9.

Beispiel 1

Herstellung und Kennzeichnung von MPEG-chlorid

MPEG-chlorid wurde synthetisiert, wie durch eine Modifizierung der Methode nach Bayer et et al. (1982) beschrieben ist. Methoxypolyethylenglycol (Molekulargewicht 5000, Shearwater Polymers Inc.) (5 g) wurde unter Rückfluß auf einem Ölbad mit zweimal destilliertem Thionylchlorid (10 ml) während 15 h unter Stickstoff erhitzt. Das Thionylchlorid wurde durch Destillation entfernt. 5 ml trockenes Toluol (Molekularsieb 3A, BDH) wurde zugegeben und abdestilliert. 5 ml trockenes Dichlormethan (Molekularsieb 3A, BDH) wurden dann zugegeben und abdestilliert. Der Rückstand wurde in 20 ml trockenem Dichlormethan aufgelöst, und 200 ml trockener Ether wurden bei Raumtemperatur zugegeben, und das Gemisch wurde in einem Eisbad gerührt. Nach Lagerung über Nacht bei -20ºC wurde der weiße Feststoff durch Filtration entfernt, in 20 ml trockenem Dichlormethan wieder aufgelöst und erneut mit 200 ml trockenem Ether ausgefällt. Die Ausfällung wurde durch Filtration entfernt und im Vakuum getrocknet (Ausbeute 3,8 g).
Das Produkt zeigte einen Einzelpeak bei Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie, welcher verschieden von dem Einzelpeak war, welcher von dem MPEG-Ausgangsmaterial (Fig. 1a bis 1c) gezeigt wird, was eine komplette Derivatisierung des Ausgangs-PEG zu MPEG-Cl anzeigt.
Alle Proben wurden als 0,2%ige (Gewicht/Volumen) Lösungen in 30% CH&sub3;CN/70% H&sub2;O auf einer Umkehrphasensäule PLRP-S 100 A 5 u von Polymer Laboratories unter Verwendung eines CH&sub3;CN-Gradienten von 30 bis 100% analysiert. Die Etutionsbedingungen waren folgende: Verwendung einer Fließgeschwindigkeit von 0,5 mil/min. 30 bis 50% CH&sub3;CN während 20 min. dann 50 bis 100% CH&sub3;CN während 2 min. gehalten bei 100% CH&sub3;CN während 3 min unter isokratischen Bedingungen, zurück umgekehrt auf 30% CH&sub3;CN während 1 min und schließlich bei 30% CH&sub3;CN während 5 min gehalten. Die Probe wurde über eine Beladungsschleife von 20 ul eingespritzt. Ein Verdampfungsmassendetektor (PL-EMD 960, Polymer Laboratories) bei 85ºC mit einem Gasfluß von 5,5 l/min wurde verwendet, um die Proben zu überwachen.
Fig. 1a zeigt ein typisches Elutionsprofil von MPEG-Cl. Ein größerer Peak ist ersichtlich, der mit einer Verweilzeit von 16,3 min (Bereich von 15,9 bis 16,3 min in drei Experimenten) eluiert. Fig. 1b zeigt ein typisches Elutionsprofil von MPEG-5K, das Ausgangsmaterial zur Herstellung von MPEG-Cl. Ein Einzelpeak ist zu sehen, der mit einer Verweilzeit von ca. 13,7 min (Bereich i13,0 bis 13,7 in fünf Experimenten) eluierte. Fig. 1c zeigt das Elutionsprofil eines Gemisches der MPEG-Cl- und MPEG-5K-Proben durch Poolbildung gleicher Volumina von MPEG-Cl und MPEG-5K, die verwendet wurden, um die Profile in den Fig. 1a und 1b oben zu erzeugen. Zwei gut aufgelöste Peaks sind bei Verweilzeiten entsprechend nahe bei jenen zu sehen, die man in den Fig. 1a und 1b erhält.
1H NMR des MPEG-Cl in d6-DMSO zeigte in Abwesenheit von -OH&supmin;Signal (welches typischerweise um 4,56 ppm für MPEG in DMSO zu sehen ist). Ein komplexes Multiplet in 3,7 ppm zentriert, war in Übereinstimmung mit Literaturwerten für O-CH&sub2;-CH&sub2;-Cl.

Beispiel 2

PEGylierung von Lysozym

51,25 mg aktiviertes MPEG-Cl, hergestellt wie in Beispiel 1, wurden mit 0,466 ml von 1 mg/ml Lysozym (Fluka) in Phosphatpuffer (20 mM, pH 7,0) während 21 min bei 27ºC umgesetzt. Die anfängliche Polymerkonzentration war 110 mg/ml. 100 ul des Reaktionsgemisches wurden mit 400 ul PBS-Puffer verdünnt, und dann wurden 200 ul auf eine Superose 12-Säule aufgegeben, die zu einem computergesteuerten FPLC-System von Pharmacia (Schweden) paßte. Die Säule wurde mit 50 ml PBS-Puffer mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min mit kontinuierlicher UV-Überwachung (214 nm) am Auslaß eluiert. Die Empfindlichkeit des UV-Detektors wurde mit 0,5 Absorbenzeinheiten eingestellt. Das unumgesetzte Lysozym eluierte bei etwa 19,52 ml, und die PEGylierten Lysozymkonjugate eluierten bei etwa 10,79, 13,02, 14,94 (Fig. 2a). Das Chromatogramm zeigt, daß eine wesentliche Reaktion zwischen dem MPEG-Cl und dem Lysozym unter den obigen Bedingungen stattfand. Diese Reaktivität wurde in weiteren unabhängigen Experimenten reproduziert.
Zum Beispiel wurden 48,15 mg MPEG-Cl mit 0,438 ml von 1 mg/ml Lysozym (Fluka) in Phosphatpuffer (20 mM, pH 7,0) während 21 min bei 28ºC umgesetzt. Die anfängliche Polymerkonzentration war 109 mg/ml. 100 ul des Reaktionsgemisches wurden mit 400 ml PBS- Puffer verdünnt, und dann wurde mit 200 ul in eine Superose 12-Säule geladen, die mit einem computergesteuerten FPLC-System von Pharmacia (Schweden) ausgestattet war. Die Säule wurde wie bei den obigen Beispielen eluiert, ausgenommen jedoch, daß die Empfindlichkeit des UV-Detektors auf 1,0 Absorbenseinheiten eingestellt wurde. Das bei etwa 19,65 ml eluierte unumgesetzte Lysozym und die PEGylierten Lysozymkonjugate werden bei etwa 10,49, 12,70, 14,32 und 15,17 (Fig. 2b) eluiert. Wiederum zeigt das Chromatogramm, daß wesentliche Umsetzung zwischen dem MPEG-Cl und dem Lysozym unter den obigen Bedingungen auftreten.

Vergleichsbeispiel 2

PEGylierung von Lysozym mit Tresylmonomethoxy-PEG als das aktivierte Polymer

68,3 mg tresyliertes MPEG (TMPEG), hergestellt wie oben beschrieben [WO 95/06 058], wurden mit 0,580 ml Lysozym in einem Gesamtvolumen von 0,580 ml 20 mM Phosphatpuffer, pH 7, während 21 min bei 23ºC hergestellt. Ein Anteil (100 ul) des Reaktionsgemisches wurde mit 400 ul PBS verdünnt, und 200 ul wurden innerhalb einer weiteren Minute auf einer Superose 12-Säule aufgegeben, die mit einem computergesteuerten FPLC-System von Pharmacia (Schweden) ausgestattet war. Die Säule wird mit 25 ml PBS bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min mit kontinuierlicher UV-Überwachung (214 nm) am Auslaß eluiert. Die Empfindlichkeit des UV-Detektors wurde auf 0,2 Absorbenseinheiten eingestellt. Das unumgesetzte Lysozym eluierte bei 19,40 ml, und die PEGylierten Lysozymkonjugate wurden bei etwa 12,05, 14,24 und 15,74 ml (Fig. 3) eluiert. Aus dem Profil ist ersichtlich, daß die PEGylierungsreaktion mit einer Geschwindigkeit ähnlich jener erfolgt, die mit der MPEG-Cl-Probe in Beispiel 2 erreicht wurde, was überraschend ist, wenn man die niedrige Reaktivität des PEG-Cl berücksichtigt.

Beispiel 3

PEGylierung von Lysozym bei alkalischem pH

Ein Nachteil der TMPEG-Methode, der durch die vorliegende Erfindung ausgeräumt wird, besteht darin, daß mit ersterer Fluorideliminierung erfolgt, wenn das aktivierte PEG einem hohen pH-Wert ausgesetzt wird und Fluorideliminierung erfolgt. Dies hat zwei Konsequenzen: Erstens wird das aktivierte Polymer rasch völlig aufgebraucht, und zweitens wird ein Teil der Bindungen zwischen dem Polymer und dem Zielmolekül eine alternierende Bindung haben (ein Sulfonat mit Bindung im Gegensatz zu einer sekundären Aminbindung). Diese Bindung ändert die Oberflächenladung und führt einen Kopplungsrest in das Produkt ein und ist die Bindung zwischen dem Polymer und dem Zielmolekül oder der Zielstruktur ist instabil, besonders bei alkalischem pH-Wert. MPEG-Cl wird nicht so rasch wie TMPEG bei alkalischem pH-Wert abgebaut (siehe das nachfolgende Beispiel 9).
50,0 mg aktiviertes MPEG-Cl wurden mit 0,455 ml 1 von mg/ml Lysozym (Fluka) in Phosphatpuffer (pH 8,66) während 21 min bei 26ºC umgesetzt. 100 ul des Reaktionsgemisches wurden mit 400 ul PBS-Puffer verdünnt, und dann wurden 200 ul auf eine Superose 12-Säule aufgegeben und wie in Beispiel 2 eluiert. Das Chromatogramm zeigt, daß ein Peak bei etwa 17,03 ml und andere Peaks bei etwa 12,64 und 14,32 (am größten) eluierten (Fig. 4). Es gab keinen Peak an der Stelle von unmodifiziertem Lysozym (etwa 19,2 ml), was anzeigt, daß das MPEG-Cl und Lysozym unter den obigen Bedingungen signifikant schneller reagieren. Es sei bemerkt, daß es keine Basis für die Bildung einer alternierenden Bindung mit der MPEG-Cl-Methode gibt.

Beispiel 4

PEGylierung von Lysozym bei 4ºC

Ein weiterer Nachteil der TMPEG-Methode, der durch die vorliegende Erfindung überwunden wird, besteht darin, daß mit dem ersteren, wenn das aktivierte PEG bei niedriger Temperatur verwendet wird, längere PEGylierungszeiten und/oder höhere Polymerkonzentrationen erforderlich sind, um den gleichen Grad an PEGylierung zu erreichen, wie bei Raumtemperatur erreicht wird. Mit TMPEG jedoch kann die Dauer der PEGylierungsreaktion nicht stark verlängert werden, da das aktivierte Polymer mit einer signifikanten Geschwindigkeit (siehe Beispiel 9 unten) hydrolysiert. Die Fähigkeit, Substrate bei niedrigen Temperaturen zu PEGylieren, kann mit Zielmolekülen oder -strukturen, die bei höheren Temperaturen instabil sind, von Vorteil sein. Zusätzlich können Polymerkonzentrationen signifikant erniedrigt werden, wenn längere Reaktionszeiten machbar sind.
49,80 mg MPEG-Cl wurden mit 0,453 ml von 1 mg/ml Lysozym (Fluka) in Phosphatpuffer (20 mM, pH 7,0) während 21 min bei 4ºC umgesetzt. Die anfängliche Polymerkonzentration war 110 mg/ml. 100 ul des Reaktionsgemisches wurden mit 400 ul PBS-Puffer verdünnt, und dann wurden 200 ul auf eine Superose 12-Säule aufgegeben und wie in Beispiel 2 eluiert. Das unumgesetzte Lysozym eluierte bei etwa 19,55 ml, und die PEGylierten Lysozymkonjugate eluierten bei etwa 10,61, 12,61, 14,28 und 15,10 (Fig. 5a). Das Chromatogramm zeigt, daß, obwohl einige Umsetzung zwischen dem MPEG-Cl und dem Lysozym aufgetreten war, der Anteil an unmodifiziertem Material höher ist als mit ähnlichen Reaktionen beobachtet wurde, die bei Raumtemperatur durchgeführt wurden (siehe Fig. 2a und 2b).
Diese Reaktion konnte verlängert werden, bis im wesentlichen alles Lysozym reagiert hatte. 47,89 ml MPEG-Cl wurden mit 0,435 ml von 1 mg/ml Lysozym (Fluka) im Phosphatpuffer während 72,5 h bei 4ºC umgesetzt. Wie oben war die anfängliche Lysozymkonzentration unter 10 mg/ml. 100 ul des Reaktionsgemisches wurden mit 400 ul PBS-Puffer verdünnt, und dann wurden 200 ml auf eine Superose 12-Säule aufgegeben und wie in Beispiel 2 eluiert. Das unumgesetzte Lysozym war unter drei Fragmenten bei 16,91, 18,02 und 19,31 ununterscheidbar. Die PEGylierten Lysozymkonjugate eluierten bei etwa 12,72 und 14,86 (Fig. 5b). Das Chromatogramm zeigt, daß fast vollständige Umsetzung zwischen MPEG-Cl und Lysozym erfolgt war.

Vergleichsbeispiel 4

PEGylierung unter Verwendung von TMPEG bei verminderter Temperatur

Fig. 6 zeigt das Ergebnis einer Lysozymreaktion mit TMPEG bei drei unterschiedlichen Reaktionstemperaturen.
135 mg TMPEG-12 K wurden mit 0,5 ml von 1 mg/ml Lysozym (Fluka) in Phosphatpuffer während 21 min umgesetzt. Die Umsetzung erfolgt dreimal bei verschiedenen Temperaturen: 3ºC, 15,5ºC und 22,5ºC. 100 ml jedes Reaktionsgemisches wurden mit 400 ul PBS-Puffer verdünnt, und dann wurden 200 ul auf eine Superose 12-Säule aufgebracht und wie in Beispiel 2 eluiert.
Die geschätzten Flächen unter der Kurve für den unmodifizierten Lysozympeak waren 52,5% bei 3ºC, 46,5% bei 15,5ºC und 23% bei 22,5ºC.

Beispiel 5

Ein zusätzlicher Syntheseweg für MPEG-Cl

MPEG-Cl wird auch durch Veränderung des obenbeschriebenen Herstellungsverfahrens für TMPEG [WO 95/06 058] hergestellt. Dieses Produkt wird intensiveren Waschstufen als MPEG-Cl, das aus der Thionylchloridmethode stammte, unterzogen und hier eingeschlossen, da dies die Basis der beobachteten besseren Beibehaltung biologischer Aktivität sein kann.
MPEG (Mr 5000, 18 g, Shearwater Polymers Inc., USA) wurde in Toluol (40 ml) gelöst, und das Azeotrop von Wasser und organischem Stoff wurde abdestilliert, gefolgt von der Masse des Toluols (109 bis 110ºC), wobei man etwa 35 ml Destillat erhielt. Das restliche Toluol wurde durch Rotationsverdampfung unter vermindertem Druck entfernt.
Das getrocknete MPEG wurde in trockenem Acetonitril (40 ml, über Nacht getrocknet mit Molekularsieb 3 A [3 Angstrom], BDH, UK, 10 g je 50 ml zugesetzt) bei Raumtemperatur aufgelöst und dann in einem Wasser-Eis-Bad auf 1ºC gekühlt und magnetisch gerührt. 1 ml eiskaltes Pyridin (BDH, UK) wurde während 1 min unter konstantem Rühren zugegeben. Tresylchlorid (1 ml, Fluka AG, Schweiz) wurde dann zu der gerührten Lösung während 5 min tropfenweise zugegeben. Die Lösung wurde dann bei Raumtemperatur gehalten, und das Rühren wurde weitere 2 h fortgesetzt. Acetonitril wurde dann unter vermindertem Druck und gelegentlichem Erwärmen in einem Wasserbad von 70ºC entfernt.
Das feste Produkt wurde in Methanol-HCl (300 ml, hergestellt unter Verwendung von 0,75 ml konzentrierter Salzsäure zu 2,5 l Methanol) aufgelöst und über Nacht auf -20ºC gekühlt. Der weiße Niederschlag wurde durch Zentrifugieren bei 0ºC gesammelt und in 200 ml Methanol- HCl wieder aufgelöst. Die Lösung wurde in Eis/Salz während 30 min gekühlt, und der Niederschlag wurde durch Zentrifugieren isoliert. Um die Probe von Pyridin zu befreien, wurde das Verfahren wiederholt, bis das Absorptionsvermögen des Obenschwimmenden bei 255 nm auf einem Minimum lag. Typischerweise sind zwölf Waschungen erforderlich, und das Mindestabsorptionsvermögen (1 cm Weglänge) ist in diesem Fall 0,02, das Minimum war 0,04, und vierzehn Waschungen wurden ohne weitere Verbesserung verwendet. Die Probe wurde dann in Methanol (200 ml) aufgelöst und zweimal ausgefällt, bevor sie durch Rotationsverdampfung und dann über Nacht in einem Gefriertrockner (Ausbeute 16 g) getrocknet wurde.
Analyse durch Umkehrphasenflüssigkeitschromatographie erfolgt wie in Beispiel 1 unter Verwendung einer PLRP-6-Säule von Polymer Laboratories und eines Massendetektors PL-EMD 960 (Fig. 7). Das Produkt enthielt vernachlässigbare Mengen an MPEG (< 1%, siehe Peak bei 15,0 min), und von dem aktivierten PEG waren 92,6% MPEG-Cl (Peak bei 17,7 min), und 7,4% waren TMPEG (Peak bei 19,3 min). 1H-NMR und 19-NMR zeigten, daß die Probe im wesentlichen MPEG-Cl mit etwas TMPEG war. Die Elementaranalyse stellte Chlor in einer Menge von 0,58% fest (theoretischer Chlorgehalt für 100% MPEG-Cl des Molekulargewichts von 5 K ist 0,7%).

Beispiel 5A

Hersteilung von PEG-Proteinkonjugaten

70,4 ml MPEG-Cl, hergestellt nach der Methode von Beispiel 5, wurden mit 0,640 mg Lysozym in einem Gesamtvolumen von 0,640 ml und 20 mM Phosphatpuffer, pH 7, während 21 min bei 23ºC umgesetzt. Ein Anteil (100 ul) des Reaktionsgemisches wurde mit 400 ul PBS verdünnt, und 200 ul wurden innerhalb weiterer 3 min auf eine Superose 12-Säule aufgegeben, die mit einem computergesteuerten FPLC-System von Pharmacia (Schweden) ausgestattet war. Die Säule wurde mit 25 ml PBS mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min mit kontinuierlicher UV-Überwachung (214 nm) im Auslaß eluiert. Die Empfindlichkeit des UV-Detektors wurde bei 0,2 Absorptionsvermögenseinheiten eingestellt. Das unumgesetzte Lysozym wird mit etwa 19,28 ml eluiert, und die PEGylierten Lysozymkonjugate wurden bei etwa 12,38, 14,38, 14,88 und 15,64 ml (Fig. 8) eluiert.
So zeigte die Umsetzung mit Lysozym (Fig. 8) nur eine geringfügig niedrigere Reaktivität als das MPEG-Cl, das wie in Beispiel 1 hergestellt und mit Lysozym in den Fig. 2a und 2b umgesetzt wurde. Daß die Reaktivität auf dem MPEG-Cl und nicht dem verunreinigenden TMPEG beruhte, wurde auf zwei Wegen demonstriert: erstens durch Aufzeigen, daß eine äquivalente Menge TMPEG zu jener, die das MPEG-Cl-Präparat verunreinigte, eine viel geringere Reaktivität hatte (Vergleichsbeispiel 5, Fig. 9), und zweitens, daß nach verlängerter Hydrolyse das restliche MPEG-Cl noch genügend reagierte, um das restliche TMPEG in MPEG umzuwandeln (Beispiel 6, Fig. 10).

Vergleichsbeispiel 5

PEGylierung von Lysozym mit Tresylmonomethoxy-PEG als das aktivierte Polymer

6,8 mg tresyliertes MPEG (92,2% Reinheit mit 8,8% MPEG-Cl und vernachlässigbarem, MPEG, veranschlagt durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer PLRP-6- Säule von Polymer Laboratories und eines Massendetektors PL-EMD 960) wurden mit 0,580 mg Lysozym in einem Gesamtvolumen von 0,580 ml von 20 mM Phosphatpuffer, pH 7, während 21 min bei 23ºC umgesetzt. Ein Anteil (100 ul) des Reaktionsgemisches wurde mit 400 ul PBS verdünnt, und 200 ul wurden in einer weiteren Minute auf eine Superose 12-Säule aufgegeben, die mit einem computergesteuerten FPLC-System von Pharmacia (Schweden) ausgestattet war. Die Säule wird mit 25 ml PBS mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min mit kontinuierlicher UV-Überwachung (214 nm) am Auslaß eluiert. Die Empfindlichkeit des UV-Detektors wurde auf 0,2 Absorptionsfähigkeitseinheiten eingestellt. Die in dieser Umsetzung verwendete Menge an tresyliertem MPEG wurde in bezug auf die in Beispiel 5 verwendete MPEG-Cl-Herstellung zehnfach reduziert (d. h. auf eine Menge von etwas mehr als das in Beispiel 5 vorhandene verunreinigende TMPEG), doch wurde viel weniger PEGylierung beobachtet (Fig. 9) als in dem MPEG-Cl-Beispiel (Fig. 8), ungeachtet dessen, daß in ähnlicher Weise TMPEG ausgesetzt wurde. Somit zeigte sich, daß die Umsetzung in Beispiel 5 auf MPEG-Cl beruhte.

Beispiel 6

Herstellung von PEG-Proteinkonjugaten nach Hydrolyse von restlichem TMPEG in der MPEG-Cl-Probe von Beispiel 5

Ein Anteil der MPEG-Cl-Probe (105 mg), hergestellt wie im Beispiel 5, wurde einer Hydrolyse in Wasser (525 ul) während 17 Tagen unterzogen. Danach enthielt die Probe 82,4% MPEG-Cl, 0% TMPEG und 17,6% MPEG (festgestellt durch Umkehrphasenchromatographie unter Verwendung einer PLRP-6-Säule und eines Massendetektors PL-EMD 960 der Polymer Laboratories).
275 ul dieser Probe wurden mit 0,5 mg Lysozym in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml von 20 mM Phosphatpuffer, pH 7, während 21 min bei 23ºC umgesetzt. Ein Anteil (100 ul) des Reaktionsgemisches wurde mit 400 ul PBS verdünnt, und 200 ml wurden innerhalb weitere 1 bis 2 min auf einer Superose 12-Säule aufgegeben, die mit einem computergesteuerten FPLC- System von Pharmacia (Schweden) ausgestattet war. Die Säule wurde mit 25 ml PBS mit einer Fließgeschwindigkeit von 0,3 ml/min eluiert, wobei kontinuierlich am Auslaß mit UV überwacht wurde (214 nm). Die Empfindlichkeit des UV-Detektors wurde auf 0,2 Absorptionsfähigkeitseinheiten eingestellt. Das unumgesetzte Lysozym eluierte bei 18,75 ml, und die PEGylierten Lysozymkonjugate werden als ein Schulterpeak bei etwa 14,33 ml mit zwei Unterschultern, die bei etwas höherem Eluiervolumen evident waren, eluiert (Fig. 10). Aus dem Profil ist ersichtlich, daß die PEGylierungsreaktion im Hinblick auf die theoretisch sehr niedrige Reaktivität von MPEG-Cl, die noch bei der signifikanten Rate ungeachtet der Abwesenheit von TMPEG und trotz der Umwandlung eines Teils des MPEG-Cl in MPEG auftritt, überraschend ist.

Beispiel 7

PEGylierung von GM-CSF und Beibehaltung der biologischen Aktivität.

10 ul GM-CSF (Hoechst) bei 10 ug/ml in PBS wurden mit 15 ul einer Lösung von MPEG- Cl (nach der Methode des Beispiels 5 produziert) bei ca. 250 mg/ml und 15 ul sterilem PBS (Gibco) in einem sterilen Eppendorf-Rohr vermischt. Scheinbehandlungskontrollen wurden mit MPEG-5K, erhalten von Union Carbide, durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines Rotationsmischers während 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. Es war vorher festgestellt worden, daß bei gegebener Reaktivitätsrate des aktivierten Polymers diese Reaktionsbedingungen ein statistisches Gemisch von PEGylierten GM-CSF-Produkten mit hauptsächlich 1 bis 3 PEG-Ketten je Molekül und über 75% Modifizierung erzeugen. 8 ul Reaktionsgemisch wurden dann zu 10 ml RPMI-1640-Medium zugegeben (ein Gehalt von 10% von durch Hitze inaktiviertem Foetuskälberserum, Life Technologies) zugesetzt, um eine Lösung von GM-CSF bei 2 ng/ml zu erhalten. Die biologische Aktivität der Proben wurde in Thymidinaufnahmeversuchen unter Verwendung einer GM-CSF-abhängigen Zellinie in 96 Mikrotiterplatten (Nunclon) getestet. Die Proben wurden mit voll ergänztem RPMI-1640, korrigiert bezüglich des PBS-Gehaltes (64 ul steriles PBS wurden zu 80 ml RPMI-1640 zugegeben), verdünnt, um einen Bereich von Konzentrationen an GM-CSF von 0,05 bis 0,5 ng/ml zu erhalten. Die 150 ul-Lösung von GM-CSF in jeder Vertiefung enthielt 5 · 10&sup5; TF-1-Zellen (ohne Nahrung während 24 h, d. h. 24 h ohne Zusatz von GM-CSF aufgewachsen), und die Platte wurde dann 18 h bei 37ºC unter einer Atmosphäre von 5% CC-2 inkubiert. Die Wachstumsstimulierung wird dann unter Verwendung von ³H-Thymidineinarbeitung quantifiziert. [³H]-Thymidinmaterial (Amersham - TRK 120-Ansatz: B 395) wurde 100mal verdünnt, und 50 ul dieser Lösung wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platte wurde weiter 4 h bei 37ºC unter 5%iger CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden auf einem Glasfilter geerntet (Wallac, Größe 90 · 120 mm), der Filter wurde 2 h bei 75ºC getrocknet, und der getrocknete Filter wurde in einen Beutel überführt (Wallac, Größe 90 · 120 mm), der 5 ml Szintillationsflüssigkeit (Wallac, Betaplate Scint.) enthielt. Die beta-Emission wurde unter Verwendung eines beta-Zählers (Wallac, 1450 Mikrobeta plus) quantifiziert. Die Daten wurden vom Hintergrund abgezogen, und der CPM-Hintergrund wurde gegen GM-CSF-Konzentration (ng/ml) aufgetragen. Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt (Fig. 11a bis 11c). Die Inkubation von GM-CSF mit diesem Ansatz von MPEG-Cl führte zu einer Umwandlung von biologischer Aktivität von 52,8 ± 5,8%.

Beispiel 8

PEGylierung von Erythropoietin (EPO) und Beibehaltung der biologischen Aktivität

5 ul EPO (Cilag) bei 3200 U/ml in PBS wurden mit 29 ul einer MPEG-Cl-Lösung bei ca. 250 mg/ml und 61 ul sterilem PBS (Gibco) in einem sterilen Eppendorf-Rohr vermischt. Das MPEG-Cl wurde mit der Methode von Beispiel 1 produziert. Scheinbehandelte Kontrollproben wurden auch unter Verwendung von MPEG (erhalten von Shearwater Polymers Inc.) hergestellt. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines Rotationsmischers 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. 705 ul RPMI-1640-Medium (enthaltend 10% mit Hitze inaktiviertes Fötuskälberserum) (Life Technologies) wurden dann zu 95 ul Reaktionsgemisch zugesetzt, um eine Lösung von EPO bei 20 U/ml zu erhalten. Die biologische Aktivität der Proben wurde in einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Nunclon) getestet. Die Proben wurden mit vollergänztem RPMI-1640, korrigiert für PBS (9,5 ml steriles PBS wurden zu 70,5 ml RPMI-1640 zugesetzt), verdünnt, um einen Bereich von EPO-Konzentrationen von 1 bis 10 U/ml zu erhalten. Die 150 ul- Lösung von EPO in jeder Vertiefung bekamen 5 · 10&sup5; TF-1-Zellen (während 24 h ausgehungert, d. h. 24 h ohne Zugabe von GM-CSF, den üblichen Zellwachstumsträger für diese Zellinie), und die Platte wurde 18 h bei 37ºC unter einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Die Wachstumsstimulierung wurde dann unter Verwendung von [³H]-Thymidineinarbeitung quantifiziert. [³H]-Thymidinmaterial (Amersham-TRK 120-Ansatz: B 395) wurde 100mal verdünnt, und 50 ul dieser Lösung wurden jeder Vertiefung zugesetzt. Die Platte wurde weiter 4 h bei 37ºC unter einer 5%igen CO&sub2;-Atmosphäre inkubiert. Die Zellen wurden auf einem Glasfilter (Wallac, Größe 90 · 120 mm) geerntet, der Filter wurde 2 h bei 75ºC getrocknet, und der getrocknete Filter wurde zu einem Beutel (Wallac, Größe 90 · 120 mm) überführt, der 5 ml Szintillationsflüssigkeit (Wallac, Betaplate Scint.) enthielt. beta-Emission wurde unter Verwendung eines beta-Zählers (Wallac, 1450 Miktrobeta plus) quantifiziert.
Die Daten wurden vom Hintergrund abgezogen, und der CPM-Hintergrund wurde gegen die EPO-Konzentration aufgezeichnet (als U/ml, d. h. ohne Einstellung für einen Verlust an natürlicher Aktivität, Fig. 12). Es gab keinen signifikanten Verlust an biologischer Aktivität.
5 ul EPO (Cilag) bei 3200 U/ml in PBS wurden mit 29 ul einer MPEG-Cl-Lösung bei etwa 250 mg/ml und 61 ul sterilem PBS (Gibco) in einem sterilen Eppendorf-Rohr vermischt. Das MPEG-Cl wurde wie in Beispiel 5 hergestellt. Scheinbehandelte Kontrolleprobe EPO wurde auch unter Verwendung von MPEG-5K hergestellt, welches von Union Carbide erhalten worden war. Das Reaktionsgemisch wurde unter Verwendung eines Rotationsmischers während 2 h bei Raumtemperatur inkubiert. 705 ul RPMI-1640-Medium (mit einem Gehalt von 10% durch Hitze inaktiviertem Fötuskälberserum, Life Technologies) wurden dann zu 95 ul Reaktionsgemisch zugegeben, um eine Lösung von EPO bei 20 U/ml zu erhalten. Die biologische Aktivität der Proben wurde wie für Fig. 12 beschrieben getestet.
Dieses Experiment wurde dreimal wiederholt. Die Daten wurden vom Hintergrund abgezogen, und CPM-Hintergrund wurde gegen die EPO-Konzentration (U/ml, Fig. 13a bis 13c) aufgetragen. Bei niedrigen Dosierungen der Reaktionsprodukte waren die Dosis-Ansprechkurven superbelastbar, doch bei höheren Dosierungen war in zwei Experimenten fortschreitende Abweichung zwischen den Test- und Kontrollkurven. Dies zeigt die Anwesenheit von etwas toxischem oder hemmendem Material (der EPO-Test ist gegenüber Hemmungen besonders empfindlich, viel mehr als der GM-CSF-Test). Der beobachtete Toxizitätswert ist niedriger als für mehrere andere PEGylierungsverfahren, die vorher geprüft wurden (siehe Cyanurchloridmethode und die Phenylchlorformiatmethode [G. E. Francis et al. {1996}, J. Drug Targeting 3, Seiten 321 bis 340]). Die Überausnutzung des aufwärtsgerichteten Teils des Tests und die Kontroll-Dosis- Ansprechkurven bei niedrigen Dosierungen an Testmaterial zeigen keinen signifikanten Verlust an biologischer Aktivität.

Beispiel 9 und Vergleichsbeispiel 9

Niedergang von MPEG-Cl und TMPEG in wäßriger Lösung

Ein Vorteil der vorliegenden Erfindung ist die relative Stabilität des aktivierten Polymers.
Fig. 14 zeigt die Wirkung von MPEG-Cl und die Fig. 15a bis 15c zeigen den Niedergang der drei TMPEG-Proben.
Fig. 14 und 15a bis 15c vergleichen die Niedergangsgeschwindigkeiten bei pH 7 für MPEG-Cl nach der Methode des Beispiels 1 und drei TMPEG-Proben, die mit unterschiedlichen Herstellungstechniken gewonnen wurden.
Die Abgabe von Säure und Fluorid aus Proben von aktivierten MPEGs bei pH 7 und auch bei pH 9 wurde in einem pH-Gerät (Mettler Toledo DL 77-Titrator) gemessen, das mit einer Fluoridelektrode (Mettler Toledo DX 219) und einer pH-Elektrode (Mettler Toledo DG 101-SC) ausgestattet war. 25 ml von 0,9%igem NaCl wurden auf pH 7 oder 9 mit etwa 0,01 M NaOH (standardisiert mit Kaliumhydrogenphthalattitration) eingestellt. MPEG-Cl oder TMPEG (etwa 100 mg, etwa 20 umol) wurden zu der Salzlösung zugegeben, und gleichzeitige Messungen der Fluoridkonzentration und des verbrauchten Alkali wurden bei Intervallen von 20 sec für bis zu 60 min gemacht. Die Resultate sind als umol Fluorid und als erzeugte Säure als Funktion der Zeit aufgezeichnet. Beispiele von aktivierten Polymeren, gelöst in dem NaCl, erforderten NaOH, um auf den Ausgangs-pH-Wert zu kommen, was anzeigt, daß sie nicht neutral, sondern etwas sauer waren. Dieser unmittelbaren Aufnahme von Alkali folgte dann eine ständige Aufnahme, wie Säure nach und nach freigegeben wurde, und ist ersichtlich als eine Nachricht bei dem Zeitpunkt null der Aufzeichnung der Alkaliaufnahme gegen die Zeit. Dieser Wert kann subtrahiert werden, um eine Aufzeichnung von Säurefreigabe bei dem ausgewählten pH-Wert zu liefern.
Die Veränderungen an Fluorid in Fig. 14 sind ein Nachweis des Auftreffens von OH-Ionen auf der Fluoridelektrode.
Fig. 15a zeigt eine Probe von TMPEG, hergestellt wie oben beschrieben [WO 95/06 058] mit sehr geringer Fluorideliminierung. Man bemerke, daß die Säureeliminierung wesentlich höher als jene der MPEG-Cl-Probe ist. Die Fig. 15b und 15c zeigen zwei Proben von TMPEG (erhalten von Sigma und Shearwater Polymers Inc.), durch verschiedene Herstellungsverfahren gewonnen und höhere Fluorideliminierung ergebend. Eine Kombination von Hydrolyse zu MPEG und Trifluorethansulfonsäure sowie Fluorideliminierung erzeugt somit wesentlich schnelleren Abbau von TMPEG gegen MPEG-Cl. Man bemerke, daß MPEG-Cl in Wasser während 17 Tagen noch gute Reaktivität behielt (siehe oben), was zeigt, daß die Säureeliminierungsraten bei saurem pH noch niedriger als bei pH 7 sind.
Fig. 16 und 17 zeigen vergleichbare Abbauraten für MPEG-Cl und TMPEG bei pH 9,0.

Claims

1. Verfahren zur PEGylierung eines Substrates unter Umsetzung eines halogenierten PEG der allgemeinen Formel I oder II

X-PEG-Y (I)

(PEG)n-Yi (II)

worin PEG eine zweibindige Gruppe der Formel -(CH&sub2;CH&sub2;O-)m-CH&sub2;CH&sub2;-, worin m ≥ 1 ist und die von einem Polyethylenglykol sich herleitet, X ein Halogenatom, eine blockierende Gruppe oder eine aktivierende Gruppe ist, die in der Lage ist, den PEG-Rest an einen anderen Rest zu binden, Y ein Halogen ist, n die Zahl der PEG-Endgruppen ist, n ≥ 2 ist, i ≤ n ist und i/n PEG-Endgruppen durch Y in Verbindungen der Formel II substituiert sind, mit dem Substrat und unter direkter Bindung des PEG an das Substrat unter der Voraussetzung, daß das Substrat kein Steroid ist oder, wenn das halogenierte PEG PEG-Bromid ist, das Substrat nicht 5-Fluoruracil ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem Y Cl, Br oder I ist.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, worin X eine blockierende Gruppe ist und Methyl, tert-Butyl oder Benzylether bedeutet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 oder 2, bei dem X eine Tresylaktivierungsgruppe ist.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem das halogenierte PEG eines von Methoxy-PEG-C1, Methoxy-PEG-Br, Methoxy-PEG-I, Cl-PEG-Cl, Br-PEG-Br oder I- PEG-I ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 und 2, bei dem das Substrat unter Proteinen, Peptiden, DNA, RNA, Nucleotiden, Nucleotidanalogen, Hormonen, Antibiotika, Liposomen, Viren, einzelligen Organismen, Micellen, Metall-, Kunststoff- oder Polymeroberflächen ausgewählt wird.