DE69738611T2

DE69738611T2 - Alkohol-Aldehyd-Dehydrogenasen

Info

Publication number: DE69738611T2
Application number: DE69738611T
Authority: DE
Inventors: Akira Fujisawa-shi Asakura; Tatsuo Kamakura-shi Hoshino; Setsuko Fujisawa-shi Ojima; Masako Kamakura-shi SHINJOH; Noribumi Fujisawa-shi Tomiyama
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 1996-09-19
Filing date: 1997-09-11
Publication date: 2009-04-30
Anticipated expiration: 2017-09-12
Also published as: EP1688499B1; CN1183472A; JPH10229885A; EP1688499A1; ATE493496T1; EP0832974A2; JP4187774B2; BR9704748A; JP2007275070A; CN1162540C; EP0832974B1; DE69738611D1; DE69740092D1; EP0832974A3; JP4173571B2; ATE391180T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft rekombinante Enzympräparationen von Alkohol-/Aldehyd-Dehydrogenase(n) (nachfolgend als AADH bzw. AADHs bezeichnet) mit Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität (-aktivitäten). Die vorliegende Erfindung betrifft ebenso ein neues rekombinantes DNA-Molekül bzw. neue rekombinante DNA-Moleküle, das bzw. die für AADH(s) codiert bzw. codieren, einen rekombinanten Expressionsvektor bzw. rekombinante Expressionsvektoren mit der DNA bzw. den DNAs sowie einen rekombinanten Organismus bzw. rekombinante Organismen mit dem rekombinanten DNA-Molekül bzw. den rekombinanten DNA-Molekülen und/oder dem rekombinanten Expressionsvektor bzw. den rekombinanten Expressionsvektoren. Weiterhin betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Enzympräparation bzw. rekombinanter Enzympräparationen von AADH bzw. AADHs sowie ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyd(en), Carbonsäure(n) und Keton(en), vor allem 2-Keto-L-gulonsäure (nachfolgend als 2KGA bezeichnet) unter Nutzung der rekombinanten Enzympräparation(en) sowie ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyd(en), Carbonsäure(n) und Keton(en), vor allem 2KGA, unter Nutzung des rekombinanten Organismus bzw. der rekombinanten Organismen.
2-KGA stellt eine wichtige Zwischenstufe bei der Herstellung von L-Ascorbinsäure (Vitamin C) dar. Es sind zahlreiche Mikroorganismen bekannt, die 2KGA aus D-Sorbit oder L-Sorbose produzieren. Aus der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 51-40154 (1976) ist die Produktion von 2KGA aus D-Sorbit durch Mikroorganismen der Gattung Acetobacter, Bacterium oder Pseudomonas bekannt. Gemäß Acta Microbiologica Sinica 21 (2), 185-191 (1981) kann 2KGA aus L-Sorbose durch eine Mischkultur von Mikroorganismen, vor allem Pseudomonas striata und Gluconobacter oxydans, produziert werden. Aus der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0221 707 ist die Produktion von 2KGA aus L-Sorbose durch Pseudogluconobacter saccharoketogenes mit und ohne gleichzeitig vorhandene Bakterien bekannt. Aus der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0278 447 ist ein Verfahren zur Produktion von 2KGA aus L-Sorbose durch eine Mischkultur, die aus dem Stamm DMS Nr. 4025 (Gluconobacter oxydans) und DSM Nr. 4026 (einem Bacillus megaterium-Stamm) besteht, bekannt. Aus der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 88116156 ist ein Verfahren zur Produktion von 2KGA aus L-Sorbose durch Gluconobacter oxydans DSM Nr. 4025 bekannt.
AADH wurde aus G. oxydans DSM Nr. 4025 aufgereinigt und charakterisiert, um die Oxidation von Alkoholen und Aldehyden zu katalysieren, und war somit in der Lage, die entsprechenden Aldehyde und Ketone aus Alkoholen sowie Carbonsäuren aus Aldehyden zu produzieren (siehe europäische Patentveröffentlichung Nr. 606621 ). Insbesondere wurde von der AADH die Oxidation von L-Sorbose zu 2KGA über L-Sorboson katalysiert. Die physikalisch-chemischen Eigenschaften der aufgereinigten Probe der AADH waren wie folgt:

a) pH-Optimum: etwa 7,0–9,0
b) Temperaturoptimum: etwa 20°C–40°C
c) Molekulargewicht: 135000 +/– 5000 dalton (bestehend aus zwei Untereinheiten in beliebiger Kombination einer solchen α-Untereinheit und β-Untereinheit mit einem Molekulargewicht von jeweils 64500 +/– 2000 bzw. 62500 +/– 2000)
d) Substratspezifität: aktiv gegenüber primären und sekundären Alkoholen sowie Aldehyden einschließlich L-Sorbose, L-Sorboson, D-Sorbit, D-Glucose, D-Mannit, D-Fructose, DL-Glycelaldehyd, Ethanol, 1-Propanol, 1-Butanol, 1-Pentanol, 1-Hexanol, 1-Heptanol, 2-Propanol, 2-Butanol, Propionaldehyd, PEG1000, PEG2000, PEG4000, PEG6000 sowie Polyvinylalkohol
e) Prosthetische Gruppe: Pyrrolochinolinchinon
f) Isoelektrischer Punkt: etwa 4,4

Nach dem Klonieren des Gens bzw. der Gene, das/die für die AADH codiert bzw. codieren, können diese zur Konstruktion eines zur Produktion einer großen Menge der rekombinanten Enzympräparation von AADH oder der verschiedenen Aldehyde, Ketone und Carbonsäuren, vor allem 2KGA, fähigen rekombinanten Organismus verwendet werden. Allerdings liegen bislang noch keine Berichte über die Klonierung solcher Gene vor.
Daher betrifft die vorliegende Erfindung eine neue rekombinante Enzympräparation bzw. neue rekombinante Enzympräparationen von AADH bzw. AADHs mit Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität (-aktivitäten). Die vorliegende Erfindung umfaßt dabei ein neues rekombinantes Molekül bzw. neue rekombinante Moleküle, das bzw. die für AADH(S) codiert bzw. Codieren, einen rekombinanten Expressionsvektor bzw. rekombinante Expressionsvektoren mit den DNAs, einen rekombinanten Organismus bzw. rekombinante Organismen, der bzw. die die DNA bzw. die DNAs und/oder den rekombinanten Expressionsvektor bzw. die rekombinanten Expressionsvektoren tragen, ein Verfahren zur Herstellung der rekombinanten AADH(s) sowie ein Verfahren zur Herstellung von Aldehyd(en), Carbonsäure(n) und Keton(en), vor allem 2KGA, unter Nutzung der rekombinanten AADH(s) oder des rekombinanten Organismus bzw. der rekombinanten Organismen.
Insbesondere betrifft ein Aspekt der vorliegenden Erfindung eine rekombinante Enzympräparation mit einer Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität, die ein durch SEQ ID NO: 5 identifiziertes oder von einer Nukleinsäure, die unter stringenten Hybridisierungs- und stringenten Waschbedingungen mit SEQ ID NO: 1 hybridisiert, codiertes enzymatisches Polypeptid umfaßt, wobei die Polypeptide Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität aufweisen. Zu Polypeptiden mit wenigstens 80% Identität zur SEQ ID NO: 5 gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, durch SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 und SEQ ID NO: 8 identifizierte Polypeptide.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein rekombinantes DNA-Molekül, das für ein durch SEQ ID NO: 5 oder eine Nukleinsäure, die unter stringenten Hybridisierungs- und stringenten Waschbedingungen mit SEQ ID NO: 1 hybridisiert, identifiziertes enzymatisches Polypeptid codiert.
Weiterhin richtet sich die vorliegende Erfindung auf DNA-Sequenzen, die für die Polypeptide mit Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität, wie sie beispielsweise im Sequenzprotokoll offenbart sind, codieren, ebenso wie auf deren komplementäre Stränge oder auf solche, die diese Sequenzen enthalten, DNA-Sequenzen, die unter Standardbedingungen mit solchen Sequenzen oder Fragmenten davon hybridisieren, sowie DNA-Sequenzen, die aufgrund der Degeneriertheit des genetischen Codes zwar nicht unter Standardbedingungen mit solchen Sequenzen hybridisieren, jedoch für Polypeptide mit genau der gleichen Aminosäuresequenz codieren.
Unter "Standardbedingungen" zur Hybridisierung versteht man in diesem Zusammenhang die Bedingungen, die im allgemeinen vom Fachmann zum Nachweis spezifischer Hybridisierungssignale verwendet werden und die beispielsweise bei Sambrook et al., "Molecular Cloning" zweite Auflage, Cold Spring Harbour Laboratory Press 1989, New York, beschrieben sind, oder vorzugsweise sogenannte stringente Hybridisierungs- und nichtstringente Waschbedingungen oder stärker bevorzugt sogenannte stringente Hybridisierungs- und stringente Waschbedingungen, die dem Fachmann geläufig sind und die beispielsweise in Sambrook et al. (s. o.) beschrieben sind. Weiterhin sind DNA-Sequenzen, die mittels Polymerasekettenreaktion unter Verwendung von auf Grundlage der hier offenbarten DNA-Sequenzen mit im Fachgebiet bekannten Verfahren konstruierten Primern hergestellt werden können, ebenso Gegenstand der vorliegenden Erfindung. Dabei versteht sich, daß die DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung auch synthetisch hergestellt werden können, wie beispielsweise in der EP 747 483 beschrieben.
Weitere Aspekte der vorliegenden Erfindung betreffen einen rekombinanten Expressionsvektor, der eines oder mehrere der oben definierten rekombinatnen DNA-Moleküle trägt, sowie einen rekombinanten Organismus, der den oben definierten rekombinanten Expressionsvektor trägt und/oder ein oder mehrere rekombinante DNA-Moleküle auf einem Chromosom trägt.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Enzympräparation mit einer wie oben definierten Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität, umfassend das Kultivieren eines oben definierten rekombinanten Organismus in einem entsprechenden Kulturmedium und Gewinnen dieser rekombinanten Enzympräparation.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Aldehyd-, Keton- oder Carbonsäureprodukts aus einem entsprechenden Substrat, umfassend das Umsetzen von besagtem Substrat in das Produkt unter Verwendung eines wie oben definierten rekombinanten Organismus.
Zudem betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend die Fermentation eines wie oben definierten rekombinanten Organismus in einem entsprechenden Medium, enthaltend L-Sorbose und/oder D-Sorbit.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Aldehyd-, Keton- oder Carbonsäureprodukts aus einem entsprechenden Substrat, umfassend die Inkubation eines Reaktionsgemisches, enthaltend eine rekombinante Enzympräparation der vorliegenden Erfindung.
Weiterhin betrifft ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend die Inkubation eines Reaktionsgemisches, enthaltend eine oben definierte rekombinante Enzympräparation sowie L-Sorbose und/oder D-Sorbit.
Ebenso besteht eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung darin, ein Verfahren zur Herstellung von Vitamin C aus 2-Keto-L-gulonsäure bereitzustellen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß ein Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, wie oben beschrieben, ausgeführt und die mit einem solchen Verfahren erhaltene 2-Keto-L-gulonsäure mit im Fachgebiet bekannten Verfahren in Vitamin C (L-Ascorbinsäure) überführt wird.
Bevor die vorliegende Erfindung ausführlicher beschrieben wird, erfolgt eine kurze Erläuterung der beigefügten Figuren.
Bei 1 handelt es sich um eine schematische Darstellung der Strukturen der rekombinanten Expressionsvektoren, die jeweils das für das rekombinante Enzym A oder B der vorliegenden Erfindung codierende rekombinante DNA-Molekül tragen.
In 5 ist die vergleichende Gegenüberstellung der Aminosäuresequenzen des reifen Enzyms A und Enzyms B dargestellt.
In 7 ist die Restriktionskarte der Gene für Enzyme A und B dargestellt.
In 9 ist eine stellengerichtete Mutagenese zur Einführung einer BamHI-Stelle stromaufwärts des Enzym-B-Gens dargestellt.
Bei 10 handelt es sich um die Darstellung eines Schemas für den Austausch des Promotors für das Enzym-B-Gen.
Die AADH-Gene der vorliegenden Erfindung codieren für die zur Katalyse der Oxidation verschiedener Alkohole und Aldehyde, wie oben beschrieben, fähigen AADH-Enzyme. Genauer gesagt wurden die jeweiligen Gene von in Gluconobacter vorhandenen AADHs kloniert und exprimiert. Dem Fachmann ist es unter Verwendung der Lehren der vorliegenden Erfindung durchaus möglich, unter den weiteren Organismen alternative Quellen zusätzlich zu Gluconobacter zu finden.
Ein spezifischer und bevorzugter Gluconobacter oxydans-Stamm wurde bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen in Göttingen unter DSM Nr. 4025 hinterlegt.
Zudem wurde auch eine Subkultur des Stamms bei der Agency of Industrial Science and Technology, Fermentation Research Institute, Japan unter der Hinterlegungsnr.: FERM BP-3812 hinterlegt. Die Eigenschaften dieses Stamms sind aus der europäischen Patentveröffentlichung Nr. 0278 477 bekannt.
Die in der vorliegenden Erfindung genutzten AADH-Gene und rekombinanten Mikroorganismen lassen sich mit den folgenden Schritten erhalten:

(1) Klonierung der AADH-Gene aus einer chromosomalen DNA mittels Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung, PCR-Klonierung, Western-Blot-Analyse, Southern-Blot-Hybridisierung und dergleichen.
(2) Bestimmen der Nukleotidsequenzen solcher AADH Gene mittels üblicher Verfahren sowie Konstruieren rekombinanter Expressionsvektoren, die AADH-Gene enthalten und effizient exprimieren.
(3) Konstruieren rekombinanter Mikroorganismen, die rekombinante AADH-Gene auf rekombinanten Expressionsvektoren oder auf Chromosomen tragen, mittels Transformation, Transduktion, Transkonjugation und Elektroporation.

Die auf den obigen Aspekt der vorliegenden Erfindung anwendbaren Materialien und Techniken sind im folgenden beispielhaft und ausführlich beschrieben:
Eine chromosomale Gesamt-DNA läßt sich nach einer im Fachgebiet allgemein bekannten Vorschrift aufreinigen (Marmur J., J. Mol. Biol. 3: 208, 1961). Anschließend kann eine genomische Bibliothek des Stamms für derartige Gene mit der chromosomalen DNA sowie den unten ausführlich beschriebenen Vektoren konstruiert werden. Dabei lassen sich die für AADHs codierenden Gene mit den nachfolgenden Verfahren aus der chromosomalen Gesamt-DNA entweder in Plasmid- oder Phagenvektoren klonieren:

(i) Bestimmen der Aminosäureteilsequenzen des aufgereinigten Enzyms gemäß den Sequenzangaben, Synthetisieren der Oligonukleotide und Selektionieren des gegenständlichen Gens aus der Genbibliothek mittels Southern-Blot-, Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung;
(ii) über Amplifizieren der Teilsequenz des gewünschten Gens mittels Polymerasekettenreaktion (PCR) mit den wie oben beschrieben synthetisierten Oligonukleotiden als Primer und dem PCR-Produkt als Sonde Selektionieren der vollständigen Sequenz des gegenständlichen Gens aus der Genbibliothek mittels Southern-Blot-, Kolonie- oder Plaque-Hybridisierung;
(iii) durch Herstellen des gegen das gewünschte Enzymprotein reagierenden Antikörpers mit einem solchen Verfahren, wie es bereits beispielsweise in Methods in Enzymology, Bd. 73, S. 46, 1981 beschrieben wurde, und Selektionieren des Klons, der das gewünschte Polypeptid exprimiert, mittels immunologischer Analyse, einschließlich Western-Blot-Analyse;
(iv) über vergleichende Gegenüberstellung der Aminosäuresequenzen der Homologen mit derjenigen des gewünschten Enzyms, Selektionieren der Aminosäuresequenzen, die gut konserviert sind, Synthetisieren der für die konservierten Sequenzen codierenden Oligonukleotide, Amplifizieren der Teilsequenz des gewünschten Gens mittels PCR mit den obigen Oligonukleotiden als Primer sowie Selektionieren der vollständigen Sequenz wie oben beschrieben (ii).

Die Nukleotidsequenz des gewünschten Gens läßt sich mit einem allgemein bekannten Verfahren, wie beispielsweise dem Dideoxykettenterminationsverfahren mit dem M13-Phagen (Sanger F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74: 5463-5467, 1977), bestimmen.
Unter Verwendung der Angaben der so bestimmten Nukleotidsequenz (unter Berücksichtigung der Codonverwendung) läßt sich ein für evolutionär divergente Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenasen codierendes Gen aus einem anderen Organismus über Kolonie- oder Southern-Hybridisierung mit einer gemäß der von besagter Nukleotidsequenz hergeleiteten Aminosäuresequenz synthetisierten Sonde oder über die Polymerasekettenreaktion mit ebenso gemäß besagten Angaben synthetisierten Primern, falls notwendig, isolieren.
Um das gewünschte Gen oder allgemein gesagt die gewünschte DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung effizient zu exprimieren, können verschiedene Promotoren eingesetzt werden; beispielsweise der ursprüngliche Promotor des Gens, Promotoren von Antibiotikaresistenz-Genen wie z. B. des Kanamycinresistenz-Gens von Tn5 (Berg, D. E., und C. M. Berg. 1983. Bio/Technology 1: 417-435), des Ampicillinresistenz-Gens von pBR322, ein Promotor des Beta-Galactosidase-Gens von Escherichia coli (lac), trp-, tac-trc-Promotor, Promotoren von Lambda-Phagen sowie alle Promotoren, die in den Wirten, bestehend aus Mikroorganismen einschließlich Bakterien, wie z. B. E. coli, P. putida, Acetobacter xylinum, A. pasteurianus, A. aceti, A. hansenii und G. oxydans, Säuger- und Pflanzenzellen, funktionsfähig sind.
Weiterhin lassen sich mit den oben beschriebenen Promotoren andere Regulationselemente, wie z. B. eine Shine-Dalgarno(SD)-Sequenz (beispielsweise AGGAGG usw., einschließlich in der Wirtzelle funktionstüchtiger natürlicher und synthetischer Sequenzen) sowie ein Transkriptionsterminator ("inverted repeat"-Struktur, einschließlich einer etwaigen in der Wirtzelle funktionstüchtigen natürlichen und synthetischen Sequenz), die in der Wirtszelle, in die die codierende Sequenz eingeführt wird, funktionstüchtig sind, verwenden.
Zur Expression periplasmatischer Polypeptide (AADHs) ist ein Signalpeptid, das üblicherweise 15 bis 50 vollkommen hydrophobe Aminosäurereste enthält, unverzichtbar. Eine für ein Signalpeptid codierende DNA läßt sich aus einer beliebigen, in der Wirtzelle funktionstüchtigen natürlichen oder synthetischen Sequenz auswählen.
Bei der Klonierung der Doppelstrang-DNA können viele verschiedene Wirt/Klonierungsvektor-Kombinationen eingesetzt werden. Bei dem Klonierungsvektor handelt es sich im allgemeinen um ein Plasmid oder einen Phagen, das bzw. der einen Replikationsursprung, Regulations elemente, eine Klonierungsstelle, einschließlich einer Mehrfachklonierungsstelle, sowie Selektionsmarker, wie z. B. Antibiotikaresistenz-Gene, einschließlich Resistenzgene für Ampicillin, Tetracyclin, Kanamycin, Streptomycin, Gentamicin, Spectinomycin usw., enthält.
Bevorzugte Vektoren zur Expression der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in E. coli werden aus beliebigen, üblicherweise in E. coli verwendeten Vektoren, wie z. B. pBR322 oder dessen Derivaten, einschließlich pUC18 und pBluescript II, pACYC177 und pACYC184 (J. Bacteriol., 134: 1141-1156, 1978) sowie deren Derivaten und einem von einem Plasmid mit einem breiten Wirtsspektrum, wie z. B. RK2 und RSF1010, abgeleiteten Vektor ausgewählt. Ein bevorzugter Vektor zur Expression der DNA-Sequenzen der vorliegenden Erfindung in Gluconobacter, einschließlich G. oxydans DSM Nr. 4025 und P. putida, wird aus allen Vektoren, die in Gluconobacter und/oder P. putida ebenso wie einem bevorzugten Klonierungsorganismus, wie z. B. in E. coli, replizieren können, ausgewählt. Als Vektor bevorzugt ist ein Vektor mit einem breiten Wirtsspektrum, wie beispielsweise ein Cosmidvektor, wie etwa pVK102 und dessen Derivate und RSF1010 und dessen Derivate, sowie ein Vektor, der einen in Gluconobacter funktionierenden Replikationsursprung sowie einen weiteren, in E. coli. funktionierenden Ursprung enthält. Für eine stabile und effiziente Expression des klonierten Gens und ebenso für eine effiziente Kultivierung der das klonierte Gen tragenden Wirtszelle sollte der Kopienzahl und Stabilität des Vektors sorgfältig Rechnung getragen werden. Transponierbare Elemente, wie z. B. Tn5, enthaltende DNA-Moleküle können ebenso als Vektor zur Einführung der DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung in den bevorzugten Wirt verwendet werden, vor allem auf einem Chromosom. DNA-Moleküle, die etwaige, aus dem bevorzugten Wirt isolierte DNAs zusammen mit der gewünschten DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung enthalten, sind ebenso zur Einführung der gewünschten DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung in den bevorzugten Wirt geeignet, vor allem auf einem Chromosom. Derartige DNA-Moleküle lassen sich in den bevorzugten Wirt über Transformation, Transduktion, Transkonjugation oder Elektroporation übertragen.
Zu möglichen geeigneten Wirten zählen Mikroorganismen, Säugerzellen und Pflanzenzellen und dergleichen. Als zu bevorzugende Mikroorganismen seien hier Bakterien, wie z. B. E. coli, P. putida, A. xylinum, A. pasteurianus, A. aceti, A. hansenii, G. oxydans sowie alle Gramnegativen Bakterien, die zur Produktion rekombinanter AADHs in der Lage sind zu nennen. Ebenso lassen sich funktionelle Äquivalente, Subkulturen, Mutanten und Varianten des Mikroorganismus in der vorliegenden Erfindung verwenden. Ein bevorzugter Stamm ist E. coli K12 und seine Derivate, P. putida oder G. oxydans DSM Nr. 4025.
Die funktionelle AADH codierende DNA-Sequenz der vorliegenden Erfindung wird in einen geeigneten Vektor, der einen Regulationsbereich, wie z. B. einen Promotor und eine in der oben beschriebenen Wirtszelle funktionstüchtige ribosomale Bindungsstelle, enthält, unter Verwendung im Fachgebiet allgemein bekannter Verfahren zur Herstellung eines Expressionsplasmids ligiert. Strukturen derartiger rekombinanter Expressionsvektoren sind spezifisch in 1 und 10 dargestellt.
Zur Konstruktion eines einen rekombinanten Expressionsvektor tragenden rekombinanten Mikroorganismus lassen sich verschiedene Genübertragungsverfahren, einschließlich Transformation, Transduktion, konjugative Paarung (Kapitel 14 und 15, Methods for general and molecular bacteriology, Philipp Gerhardt et al., Hrsg., American Society for Microbiology, (1994)) und Elektroporation, verwenden. Das Verfahren zur Konstruktion eines rekombinanten Organismus kann aus den auf dem Gebiet der Molekularbiologie allgemein bekannten Verfahren ausgewählt werden. Für E. coli, Pseudomonas und Acetobacter können übliche Transformationssysteme verwendet werden. Für E. coli kann auch ein Transduktionssystem verwendet werden. In Grampositiven und Gram-negativen Bakterien, einschließlich E. coli, P. putida und G. oxydans, lassen sich konjugative Paarungssysteme verbreitet einsetzen. Ein bevorzugtes konjugatives Paarungsverfahren ist in der WO89/06688 beschrieben. Die Konjugation kann dabei in Flüssigmedien oder auf einer festen Oberfläche stattfinden. Der bevorzugte Empfänger ist ausgewählt aus E. coli, P. putida und G. oxydans, die aktive AADHs mit einem geeigneten rekombinanten Expressionsvektor produzieren können. Als Empfänger für die 2KGA-Produktion ist G. oxydans DSM Nr. 4025 bevorzugt. Dem Empfänger bei der konjugativen Paarung wird üblicherweise ein Selektionsmarker zugesetzt; üblicherweise wird dabei beispielsweise auf eine Resistenz gegen Nalidixinsäure oder Rifampicin selektioniert.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten AADHs katalysieren die Oxidation von Alkoholen und/oder Aldehyden und sind somit in der Lage, Aldehyde, Ketone oder Carbonsäuren aus den entsprechenden Substraten zu produzieren. Insbesondere können die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten AADHs die Oxidation von L-Sorbose zu 2KGA über L-Sorboson und/oder die Oxidation von D-Sorbit zu L-Sorbose katalysieren. Insbesondere enthalten die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten AADHs Enzym A, das die in SEQ ID NO: 5 gezeigte Aminosäuresequenz aufweist. Weiterhin enthalten die AADHs der vorliegenden Erfindung Enzyme, die von einer Nukleinsäure, die unter stringenten Hybridisierungs- und stringenten Waschbedingungen mit der SEQ ID NO: 1 hybridisiert, codiert werden, wobei die Enzyme Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität aufweisen.
Die Gene für Enzym A, A', A'' bzw. B, die die in SEQ ID NO: 1, 2, 3 bzw. 4 gezeigten Nukleotidsequenzen aufweisen und für die Polypeptide mit den in SEQ ID NO: 5, 6, 7 bzw. 8 gezeigten Aminosäuresequenzen codieren, lassen sich aus dem G. oxydans-Stamm DSM Nr. 4025 ableiten.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten AADHs, einschließlich Enzyme A, A', A'' und B, lassen sich unabhängig voneinander präparieren, indem man einen entsprechenden Organismus kultiviert, die Zellen aufschließt und sie aus zellfreien Extrakten aufgeschlossener Zellen, vorzugsweise aus der löslichen Fraktion des Mikroorganismus, isoliert und aufreinigt.
Die in der vorliegenden Erfindung bereitgestellten rekombinanten Organismen können in einem mit entsprechenden Nährstoffen supplementierten wäßrigen Medium unter aeroben Bedingungen kultiviert werden. Dabei kann die Kultivierung bei einem pH-Wert zwischen etwa 4,0 und 9,0, vorzugsweise zwischen etwa 6,0 und 8,0, durchgeführt werden. Zwar variiert der Kultivierungszeitraum je nach pH-Wert, Temperatur und verwendetem Nährmedium, doch erhält man üblicherweise nach 2 bis 5 Tagen günstige Ergebnisse. Ein bevorzugter Temperaturbereich zur Durchführung der Kultivierung liegt bei etwa 13°C bis 45°C, vorzugsweise bei etwa 18°C bis 42°C.
Üblicherweise ist es notwendig, daß das Kulturmedium solche Nährstoffe wie assimilierbare Kohlenstoffquellen, verdaubare Stickstoffquellen und anorganische Substanzen, Vitamine, Spurenelemente und andere wachstumsfördernde Faktoren enthält. Als assimilierbare Kohlenstoffquellen lassen sich Glycerin, D-Glucose, D-Mannit, D-Fructose, D-Arabitol, D-Sorbit, L-Sorbose und dergleichen verwenden.
Ebenso können als Stickstoffquellen verschiedene organische oder anorganische Substanzen verwendet werden, wie beispielsweise Hefeextrakt, Fleischextrakt, Pepton, Casein, Maisquellwasser, Harnstoff, Aminosäuren, Nitrate, Ammoniumsalze und dergleichen. Als anorganische Substanzen können Magnesiumsulfat, Kaliumphosphat, Eisen(II)- und Eisen(III)-Chlorid, Calciumcarbonat und dergleichen verwendet werden.
Im folgenden sind die Eigenschaften der spezifisch aus P. putida aufgereinigten rekombinanten AADH-Enzyme sowie das Herstellungsverfahren zusammengefaßt.
(1) Enzymaktivität
Die AADHs der vorliegenden Erfindung katalysieren die Oxidation von Alkoholen und Aldehyden, einschließlich D-Sorbit, L-Sorbose und L-Sorboson in Gegenwart eines Elektronenakzeptors gemäß den folgenden Reaktionsformeln.
Alkohol + Elektronenakzeptor → Aldehyd + reduzierter Elektronenakzeptor
Alkohol + Elektronenakzeptor → Keton + reduzierter Elektronenakzeptor
Aldehyd + Elektronenakzeptor → Carbonsäure + reduzierter Akzeptor
Zuckeralkohol + Elektronenakzeptor → Aldose + reduzierter Elektronenakzeptor
Zuckeralkohol + Elektronenakzeptor → Ketose + reduzierter Elektronenakzeptor
Aldehydketose + Elektronenakzeptor → Ketocarbonsäure + reduzierter Elektronenakzeptor
Carbonsäure + Elektronenakzeptor → Ketocarbonsäure + reduzierter Elektronenakzeptor
Die Enzyme verwenden keinen molekularen Sauerstoff als Akzeptor. Als Akzeptor läßt sich 2,6-Dichlorphenol indophenol (DCIP), Phenazinmethosulfat (PMS), Wursters Blau, Eisen(III)-Cyanid, Coenzym Q oder Cytochrom c verwenden.
Eine Einheit Enzymaktivität wurde als diejenige Menge Enzym definiert, die die Reduktion von 1 μmol DCIP pro Minute katalysiert. Der Extinktionskoeffizient von DCIP bei pH 8,0 wurde als 15 mM^–1 angenommen. Der Standardreaktionsansatz (1,0 ml) enthielt 0,1 mM DCIP, 1 mM PMS, 2 bis 125 mM Substrat, 50 mM Tris-Malat-NaOH-Puffer (pH 8,0) sowie 10 μl der Enzymlösung. Eine Referenzküvette enthielt alle obigen Komponenten mit Ausnahme des Substrats.
(2) Eigenschaften der AADHs
(a) Substratspezifität und Produkte der enzymatischen Reaktion

Die Enzyme A, A', A'' und B wurden über ihre Substratspezifitäten, wie oben beschrieben, charakterisiert, wobei 8 Substrate verwendet wurden: n-Propanol, Isopropanol, D-Glucose, D-Sorbit, L-Sorboson, D-Mannit, L-Sorbose und D-Fructose. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 angegeben. Tabelle 1. Substratspezifität der Enzyme A, A', A'' und B

		(Einheiten/mg gereinigtes Protein)
Substrat		Enzym A	Enzym A'*	Enzym A''	Enzym B
50 mM	n-Propanol	139,6	180,7	262,3	40,0
50 mM	Isopropanol	76,8	108,9	154,9	72,3
50 mM	D-Glucose	2,4	0,0	17,8	943,9
125 mM	D-Sorbit	14,0	7,8	30,1	130,9
2 mM L	Sorboson	23,15	5,0	26,5	73,6
50 mM	D-Mannit	7,1	1,3	6,2	517,4
125 mM	L-Sorbose	47,4	1,6	30,3	8,4
125 mM	D-Fructose	30,7	2,9	17,3	2,1

*: die Werte für Enzym A' wurden mit einem Faktor von 1,5 korrigiert, da die Reinheit des Enzyms etwa 65% betrug.
Enzym B zeigte eine hohe Reaktivität für D-Glucose oder D-Mannit, doch eine relativ niedrige Reaktivität für n-Propanol und Isopropanol. Enzym A, Enzym A' und Enzym A'' zeigten eine hohe Reaktivität für n-Propanol und Isopropanol, doch eine geringe Aktivität für D-Glucose und D-Mannit; die Enzyme zeigten ähnliche Substratspezifitätsmuster, außer daß das Enzym A' eine sehr geringe Reaktivität für L-Sorbose oder D-Fructose aufwies.

Aus einem Substrat in der Reaktion mit Enzym A, Enzym A', Enzym A'' oder Enzym B gebildetes Produkt bzw. gebildete Produkte wurde bzw. wurden mittels Dünnschichtchromatographie (DC) und/oder Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) mit authentischen Verbindungen analysiert. Von Enzym A, Enzym A' und Enzym A'' (als A-Gruppe bezeichnet) wurden D-Sorbit, L-Sorbose, L-Sorboson, D-Mannit bzw. D-Fructose in D-Glucose mit L-Gulose, L-Sorboson mit 2KGA, 2KGA, D-Mannose bzw. 2-Keto-D-gluconsäure (2KD) umgewandelt. Von Enzym B (als B-Gruppe bezeichnet) wurden D-Glucose, D-Sorbit, L-Sorboson, D-Mannit, L-Idose, Glycerin, D-Gluconsäure, D-Mannonsäure in D-Gluconat, L-Sorbose, 2KGA, D-Fructose, L-Idonsäure, Dihydroxyaceton, 5-Keto-D-gluconsäure bzw. 5-Keto-D-mannonsäure umgewandelt. In Analogie zur Reaktivität gegenüber L-Sorboson läßt sich D-Glucoson von allen oben erwähnten AADHs in 2KD umwandeln; tatsächlich wurde von Enzymen der A-Gruppe 2KD aus D-Fructose produziert, deren mögliches direktes Produkt D-Glucoson ist. Alle Enzyme zeigten die Aktivität gegenüber Alkoholen, einschließlich Zuckeralkohol, wie z. B. D-Sorbit und D-Mannit, sowie Aldehyden, einschließlich Aldose, wie z. B. D-Glucose und Ketose, wie z. B. L-Sorboson.
b) pH-Optimum

Alle Enzyme weisen ihren optimalen Punkt bei pH 8,0–8,5 auf, wie in Tabelle 2 dargestellt. Die Enzyme A'' und B weisen im Vergleich mit den Enzymen A und A' zu niedrigeren pH-Werten hin einen relativ breiten pH-Bereich auf. Tabelle 2. pH-Optimum der Enzyme

		(relative Aktivität, %)
pH	Enzym A	Enzym A'	Enzym A''	Enzym B
6,0	6,5	2,1	35,0	21,0
6,5	13,0	9,3	57,3	51,6
7,0	33,1	22,5	74,8	61,6
7,5	57,7	46,8	90,0	75,3
8,0	100,0	100,0	100,0	100,0
8,5	113,2	142,7	85,6	62,2
9,0	50,0	2,1	46,5	8,0
9,5	19,6	1,8	23,9	0,0

c) pH-Stabilität

Die Enzyme A, A', A'' und B wurden in Puffern verschiedener pH-Werte 3 Stunden bei 25°C inkubiert, und die Restaktivitäten wurden getestet und als relative Werte gegenüber den ohne Inkubation bei pH 8 erhaltenen Werten ausgedrückt. Die Enzyme A, A', A'' und B waren zwischen pH-Werten von 6 bis 9 stabil, wie in Tabelle 3 gezeigt. Tabelle 3. pH-Stabilität der Enzyme

		(relative Aktivität, %)
pH	Enzym A	Enzym A'	Enzym A''	Enzym B
4,0	5,4	0,0	6,2	25,2
5,0	32,0	10,0	77,9	56,1
6,0	74,7	82,7	105,8	100,9
7,0	76,9	96,9	100,9	101,9
8,0	80,1	100,0	99,0	114,0
9,0	60,1	97,3	100,9	101,9
10,0	53,2	85,4	104,0	85,5
11,0	31,0	61,3	79,2	70,1

d) Temperaturstabilität

Die Restaktivitäten nach Behandlung der Enzyme bei 4, 20, 30, 40, 50 und 60°C über 5 Minuten sind in Tabelle 4 dargestellt. Tabelle 4. Temperaturstabilität der Enzyme

		(relative Aktivität, %)
Temperatur	Enzym A	Enzym A'	Enzym A''	Enzym B
4°C	100,0	100,0	100,0	100,0
20°C	91,5	100,8	96,0	97,2
30°C	78,0	103,6	86,1	95,4
40°C	19,9	78,9	72,8	84,6
50°C	4,1	0,6	26,6	29,2
60°C	2,9	0,0	13,3	0,0

e) Wirkung von Metallionen und Inhibitoren

Die Restaktivitäten nach Behandlung der Enzyme mit verschiedenen Metallen und Inhibitoren sind in Tabelle 5 dargestellt. Dabei waren MgCl₂ und CaCl₂ nahezu inert gegenüber den Enzymen, während die anderen Metallionen, vor allem CuCl₂, die Reaktivität in signifikanter Weise beeinflußten. Bemerkenswerterweise wurden die Enzyme A, A' und A'' durch EGTA und EDTA gehemmt. Allerdings wurde Enzym B durch EGTA und EDTA weniger gehemmt als die Enzyme der A-Gruppe. Tabelle 5. Wirkung von Metallen und Inhibitoren auf Aktivitäten der Enzyme A, A', A'' und B.

			(Relative Restaktivität)
Verbindung	Enzym	A	A'	A''	B
Verbindung	Substrat	L-Sorbose	n-Propanol	L-Sorbose	D-Sorbit
5 mM CoCl₂		16,6	7,9	46,9	23,6
5 mM CuCl₂		0,0	0,0	0,0	0,0
5 mM ZnCl₂		1,5	6,1	19,2	0,0
5 mM MgCl₂		96,3	85,3	78,8	100,0
5 mM CaCl₂		98,8	95,3	123,0	102,9
5 mM MnCl₂		0,0	45,7	0,0	0,0
5 mM FeCl₂		16,6	0,0	0,0	5,9
5 mM FeCl₃		7,8	0,0	44,7	0,0
5 mM NiSO₄		42,7	59,7	90,3	79,4
10 mM EDTA		43,1	55,1	52,6	91,3
10 mM EGTA		20,4	16,7	56,4	74,0
1 mM NaF		98,2	97,1	94,9	100,8
2 mM NEM		91,7	97,2	94,9	100,8
1 mM		97,2	78,3	95,3	100,2
ICH₂ COONa
0,5 mM		104,6	98,8	97,2	102,1
Hydroxylamin-HCl

f) Molekulargewicht und Untereinheit
Die aus P. putida-Transkonjuganten aufgereinigten Enzyme A, A', A'' und B bestehen jeweils aus einem Typ von Einheit mit dem Molekulargewicht von etwa 64000, 62500, 62500 bzw. 60000, wie mittels Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese gemessen. Sie können Heterodimere, bestehend aus beliebigen zwei Einheiten der Enzyme A, A', A'' und B, darstellen, wenn die Gene/DNA-Sequenzen für die Enzyme A, A', A'' und B im gleichen Wirt exprimiert werden.
g) N-terminale Aminosäuresequenz
Die N-terminalen Sequenzen der reifen Enzyme A und B sind wie folgt:
Enzym A: Gln-Val-Thr-Pro-Val-Thr-
Enzym A'': blockierter N-terminaler Rest
Enzym B: Gln-Val-Thr-Pro-Ile-Thr-Asp-Glu-Leu-Leu-Ala-.
Aufgrund unzureichender Reinheit der Probe wurde der N-Terminus des reifen Enzyms A' nicht bestimmt.
(3) Produktion der AADHs
Zellen werden durch Zentrifugation oder Filtration aus der Fermentationsbrühe geerntet. Die Zellen werden in der Pufferlösung suspendiert und mittels eines Homogenisators, Ultraschallgeräts oder durch Behandlung mit Lysozym und dergleichen aufgeschlossen, so daß man eine aufgeschlossene Lösung von Zellen erhält.
AADHs werden aus einem zellfreien Extrakt aufgeschlossener Zellen, vorzugsweise aus der löslichen Fraktion der Mikroorganismen, mit üblichen Proteinreinigungsverfahren, wie beispielsweise Ammoniumsulfatfällung, Dialyse, Ionenaustauschchromatographien, Gelfiltrationschromatographien und Affinitätschromatographien, isoliert und aufgereinigt.
(4) Enzymreaktion
Die Enzymreaktion wurde bei pH-Werten von etwa 6,0 bis etwa 9,0 und einer Temperatur von etwa 10°C bis etwa 50°C, vorzugsweise von 20°C bis 40°C, in Gegenwart eines Elektronenakzeptors, beispielsweise DCIP, PMS, Wursters Blau, Eisen(III)-Cyanid, Coenzym Q, Cytochrom c und dergleichen, in einem Puffer, wie z. B. Tris-HCl-Puffer, Phosphatpuffer und dergleichen, durchgeführt. Die Konzentration des Subtrats in einem Reaktionsansatz kann je nach den anderen Reaktionsbedingungen variieren, doch ist es im allgemeinen wünschenswert, daß sie etwa 1–200 g/l, am stärksten bevorzugt 1–100 g/l beträgt.
In der Enzymreaktion können AADHs auch in einem immobilisierten Zustand mit einem entsprechenden Träger verwendet werden. Dabei können alle im Fachgebiet allgemein bekannten Mittel zur Immobilisierung von Enzymen verwendet werden. So kann das Enzym beispielsweise direkt an Membrangranulat oder dergleichen eines Harzes mit einer funktionellen Gruppe bzw. funktionellen Gruppen gebunden werden oder es kann über eine funktionelle Gruppe bzw. funktionelle Gruppen aufweisende Brückenverbindungen, z. B. Glutaraldehyd, an das Harz gebunden werden.
Die enzymatischen Polypeptide der vorliegenden Erfindung werden üblicherweise in Form von Dimeren produziert. Solche Dimeren enthalten Homodimere des Enzyms A. Somit enthält die rekombinante Enzympräparation der vorliegenden Erfindung auch eines oder mehrere der besagten Homodimeren oder Enzyme, die von einer Nukleinsäure, die unter stringenten Hybridisierungs- und stringenten Waschbedingungen mit SEQ ID NO: 1 hybridisiert, codiert werden, wobei die Enzyme Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität aufweisen. Zu diesen Enzymen gehören, ohne jedoch darauf beschränkt zu sein, Enzym A', Enzym A'' bzw. Enzym B, die die in SEQ ID NO: 6, 7 bzw. 8 dargestellte Aminosäuresequenz aufweisen.
Die durch die vorliegende Erfindung bereitgestellten rekombinanten Organismen eignen sich sehr gut zur Produktion der rekombinanten Enzympräparationen von AADHs mit einer Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität. Die Organismen eignen sich ebenso zur Produktion von Aldehyden, Carbonsäuren und Ketonen, vor allem 2KGA, unter Nutzung der rekombinanten Enzympräparationen und unter Nutzung der rekombinanten Organismen.
Die Produktion von 2KGA mit den rekombinanten Organismen kann in der Fermentation mit dem Medium und Kulturbedingungen, wie oben beschrieben, erfolgen. Die Produktion von 2KGA kann man mit den oben beschriebenen rekombinanten Organismen zusammen mit den gleichzeitig vorhandenen Organismen, wie z. B. E. coli, P. putida und Bacillus megaterium, durchführen.
Beispiele
Beispiel 1. Klonierung von AADH-Genen
(1) Konstruktion einer genomischen Bibliothek von G. oxydans DSM Nr. 4025
Chromosomale DNA wurde wie folgt präpariert. G. oxydans DSM Nr. 4025 wurde auf einer Agarplatte mit 20 ml NS2-Medium, bestehend aus 5,0% D-Mannit, 0,25% MgSO₄·7H₂O, 1,75% Maisquellwasser, 5,0% Bäckerhefe (Oriental Yeast Co., Osaka, Japan), 0,5% CaCO₃, 0,5% Harnstoff (getrennt sterilisiert) und 2,0% Agar (pH 7,0 vor Sterilisierung) 3 Tage bei 27°C kultiviert. Die Zellen wurden von der Agarplatte eingesammelt, mit 10 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) mit 1 mM EDTA gewaschen und in 5 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) mit 20 mM EDTA resuspendiert. Die Zellsuspension wurde mit Lysozym (Sigma Chemicals Co., St. Louis, Mo., USA) bei einer Endkonzentration von 400 μg/ml 30 Minuten bei 37°C und anschließend 30 Minuten bei 37°C mit Pronase (400 Einheiten) und 1 Stunde bei 37°C mit 1% SDS behandelt. Chromosomale DNA wurde mit Phenol und RNase A (Boehringer Mannheim, GmbH, Mannheim) nach dem von Maniatis et al. (Molecular cloning: a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., (1982) beschriebenen Verfahren behandelt. Chromosomale DNA (200 μg) wurde mit 168 Einheiten SalI (Boehringer Mannheim) 5 bis 90 Minuten bei 37°C verdaut. Die erhaltenen teilverdauten Fragmente von 15–35 kb wurden über präparative Agarosegelelektrophorese (Agarose: 0,7%) isoliert; das die gewünschten Fragmente enthaltende Gelstückchen wurde ausgeschnitten und die DNAs aus dem Gel in TAB-Puffer, bestehend aus 40 mM Tris-Acetat und 2 mM EDTA, elektroeluiert. Auf diese Weise wurden 40 μg DNAs erhalten. Parallel dazu wurden 8 μg des Cosmidvektors pVK102 (ATCC 37158) vollständig mit SalI verdaut und mit alkalischer Phosphatase aus Kälberdarm (Boehringer Mannheim) nach Anweisung des Herstellers behandelt. pVK102 (0,4 μg) wurde mit den 15–35 kb großen SalI-Fragmenten (0,2–2 μg) mittels des Ligationskits (Takara Shuzo Co. Ltd., Kyoto, Japan) 10 Minuten bei 26°C ligiert. Die ligierten DNAs wurden dann zur in-vitro-Verpackung nach dem vom Zulieferer (Amersham) beschriebenen Verfahren verwendet: Mischen der ligierten DNAs mit den Phagenhüllproteinteilen. Die erhaltenen Phagenpartikel wurden zur Infektion von E. coli ED8767 (Murray, N. E., W. J. Brammar und K. Murray. Mol. Gen. Genet., 150: 53-61, 1977) verwendet. Es wurden etwa 3000 Km^rTc^s-Kolonien erhalten, wobei alle getesteten Kolonien (24 Kolonien) die DNA-Insertionen besaßen, deren Durchschnittsgröße 26,5 kb betrug. Eine weitere Cosmidbibliothek von G. oxydans DSM Nr. 4025 mit 55000 Klonen wurde unter Verwendung von mit EcoRI teilverdauter chromosomaler DNA aus G. oxydans DSM Nr. 4025 konstruiert, indem diese in die EcoRI-Stelle von pVK100 mit nahezu dem gleichen Verfahren wie oben beschrieben inseriert wurden. Alle getesteten Kolonien (24 Kolonien) besaßen DNA-Insertionen (Durchschnittsgröße: 27 kb).
Diese beiden Cosmidbibliotheken in E. coli ED8767 wurden dann in E. coli S 17-1 (Tra⁺, Bio/Technology, 1: 784-791, 1983) unter Verwendung des Gemischs aus rekombinanten, aus E. coli ED8767-Bibliotheken extrahierten Plasmid-DNAs übertragen. Es wurden etwa 4000 Km^r-Transformanten von E. coli S 17-1 aufgenommen, in Mikrotiterplatten mit 100 μl LB, bestehend aus 10 g/l Bactotrypton (Difco), 5 g/l Hefeextrakt (Difco) und 5 g/l NaCl und supplementiert mit 50 μg/ml Kanamycin, bei 37°C kultiviert und als Cosmidbibliotheken in E. coli S17-1 mit 15% Glycerin bei –80°C gelagert.
Die G. oxydans DSM Nr. 4025-SalI- und -EcoRI-Cosmidbibliotheken wurden in E. coli S17-1 konstruiert. Aus der Bibliothek wurden 1400 Klone einzeln von E. coli S17-1 in P. putida ATCC 21812 durch konjugative Paarung übertragen. 1400 in Mikrotiterplatten bei –80°C gelagerte Kulturen wurden aufgetaut und mit einer Plattentransfer-Kassette (Nunc) auf Mikrotiterplatten mit jeweils 100 μl frischem LB-Medium pro Vertiefung überführt und über Nacht bei 37°C kultiviert. Nalidixinsäureresistente (Nal^r) P. putida ATCC 21812 wurde über Nacht in 100 ml MB-Medium, bestehend aus 2,5% Mannit, 0,5% Hefeextrakt (Difco Laboratories, Detroit, Mich.) und 0,3% Bactotrypton (Difco), bei 30°C kultiviert. Die Kulturen der Cosmidbibliothek enthaltenden 1400 Vertiefungen wurden mit jeweils 50 μl der P. putida-Kultur versetzt. Die 1400 Zellansätze wurden mit Plattentransferkassetten auf auf der Oberfläche von FB-Agar-Medium, bestehend aus 5% Fructose, 1% Hefeextrakt (Difco), 1% Polypepton (Daigo Eiyo, Japan) und 1,8% Agar, plazierte Nitrocellulosefilter punktförmig aufgetragen und über Nacht bei 27°C kultiviert. Für die Gegenselektion von Transkonjuganten gegen Donor-E. coli wurde Nalidixinsäure verwendet. Die auf den Filtern gewachsenen Zellen wurden einzeln auf MB-Agar-Medium mit 50 μg/ml Nalidixinsäure und 50 μg/ml Kanamycin, nachfolgend als (MNK-Agarplatte) bezeichnet, ausgestrichen und 4 Tage bei 27°C zur Selektion von Transkonjuganten inkubiert. Die erhaltenen Kolonien wurden durch Ausstreichen auf MNK-Agarplatten, wie oben erwähnt, gereinigt. Somit wurden 1400 Transkonjuganten von P. putida [Genbibliothek von G. oxydans DSM Nr. 4025 in P. putida] präpariert.
(2) Immunologisches Screening von Klonen des AADH-Gens aus G. oxydans DSM Nr. 4025
Zunächst wurden 350 Transkonjuganten (175 aus der SalI-Bibliothek und 175 aus der EcoRI-Bibliothek), auf MNK-Agarplatten gehalten, einzeln in Teströhrchen mit 5 ml MNK-Medium kultiviert. Die Zellen wurden aus jeweils 1,5 ml Brühe gesammelt und für die Western-Blut-Analyse wie folgt behandelt. Die Zellen wurden in 50 μl Laemmli-Puffer, bestehend aus 62,5 mM Tris-HCl, pH 6,8, 10% Glycerin, 5% Mercaptoethanol und 2% SDS, suspendiert. Die Zellsuspension wurde 3 Minuten gekocht, und 10 μl des Zelllysats wurden auf eine SDS-PAGE aufgetragen. Die erhaltenen Proteinbanden wurden dann durch Elektroblotting auf ein Nitrocellulosefilter mittels einer Elektroblotting-Vorrichtung (Marysol Industrial Co., Ltd.), die bei 40 V, 200 mA betrieben wurde, 16 Stunden in 2,5 mM Tris-19,2 mM Glycin-Puffer, pH 8,6, mit 20% Methanol übertragen. Das Filter wurde anschließend 1 Stunde in 3% Gelatine in TBS-Puffer, bestehend aus 20 mM Tris, pH 7,5, und 500 mM NaCl, inkubiert. Nach kurzem Spülen in TTBS-Puffer, bestehend aus 20 mM Tris, pH 7,5, 500 mM NaCl und 0,05% Tween 20, wurde das Filter 1 Stunde mit einem ersten Antikörper, der 1:500 verdünnten Anti-AADH-Antikörper in TTBS-Puffer mit 1% Gelatine enthielt, inkubiert. Der Anti-AADH-Antikörper war hergestellt werden, indem die aus G. oxydans DSM Nr. 4025 aufgereinigten AADH-Proteine mit inkomplettem Adjuvans gemischt und das erhaltene Gemisch in ein weißes Kaninchen zweimal im Abstand von 2 Wochen injiziert wurde, Vollblut 1 Woche nach der zweiten Injektion gesammelt und die Serumfraktion als Anti-AADH-Antikörper präpariert wurde. Anschließend wurde das Filter zweimal (jeweils 5 Min.) in TTBS-Puffer gewaschen und 1 Stunde in einer Lösung des zweiten Antikörpers (Ziege-Anti-Kaninchen-IgG-Meerrettichperoxydase-Konjugat), die 1:3000 verdünnten zweiten Antikörper in TTBS mit 1% Gelatine enthielt, inkubiert. Nach zweimaligem Waschen in TTBS-Puffer und einmaligem Waschen in TBS wurde das Filter in eine Farbentwicklungslösung getaucht, bis blaue Banden mit dem Konica Immunostaining HRP Kit IS-50B (Konica, Tokyo, Japan) nach den Anweisungen des Zulieferers sichtbar wurden. Für ein tatsächliches Screening wurden fünf Zelllysate gemischt und für das erste Western-Blot-Screening in eine Vertiefung aufgetragen. Von 70 Ansätzen zeigten 14 positive Banden; neun Proben wiesen immunreaktive Proteine mit einem ungefähren Mr von 64000 auf, doch zeigten zwei von diesen schwache Signale; ein Ansatz wies ein immunreaktives Protein mit einem ungefähren Mr von 60000 auf, und vier Proben wiesen immunreaktive Proteine mit einem Mr von 55000 auf.
Sieben Ansatzproben, die starke Signale bei Mr 64000 zeigten, wurden einzeln einem zweiten Western-Blot-Screening unterzogen, um jeweils den Klon in jedem Ansatz zu identifizieren. Dabei wurde ein positiver Klon pro einer Ansatzprobe identifiziert; die Plasmide der sieben Klone wurden mit p6E10, p16C8, p16F4, p17E8, p1E2, p24D4 bzw. p26C3 bezeichnet. Mittels Restriktionsenzymanalyse stellte sich heraus, daß vier Plasmide, p6E10, p16C8, p16F4 und p17E8, den gleichen DNA-Bereich trugen und daß die anderen drei von dem Bereich jener vier Plasmide verschiedene Bereiche trugen.
(3) Screening der AADH-Gene aus den Cosmidbibliotheken mittels Kolonie-Blot und Southern-Blot-Hybridisierung
Um zusätzlich zu den durch das immunologische Screening, wie oben beschrieben, erhaltenen Genen die anderen AADH-Gene zu finden, wurden die ganzen Cosmidbibliotheken von G. oxydans DSM Nr. 4025 in E. coli ED 8767 (SalI-Bibliothek und EcoRI-Bibliotheken) einem Screening mittels Kolonie- und Southern-Blot-Hybridisierung mit einem 0,9 kb großen SalI-Fragment aus p24D4 unterzogen. Dabei hybridisierte das 0,9 kb große SalI-Fragment mit einer Oligonukleotidsonde, ATGATGGT(GATC)AC(GATC)AA(TC)GT, die gemäß einer internen Aminosäuresequenz des aus G. oxydans DSM Nr. 4025 aufgereinigten natürlichen AADH-Enzyms, MetMetValThrAsnValAspValGlnMetSerThrGlu, die durch Verdauung erhalten und mit einem Gasphasen-Sequenzierautomaten (Applied Biosystems 470A) sequenziert wurde, synthetisiert wurde. Die Zellen der Cosmidbibliotheken wurden entsprechend verdünnt und auf LK-Agarplatten verteilt, wobei die erhaltenen Kolonien auf Nylonfilter durch Blotting übertragen und durch Hybridisierung mit dem mit ³²P markierten 0,9 kb großen SalI-Fragment analysiert wurden. Etwa 1% der Kolonien zeigten positive Signale; 41 Kolonien wurden aus der SalI-Bibliothek und 20 aus der EcoRI-Bibliothek selektioniert und einer Restriktionsenzymanalyse mit anschließender Southern-Blot-Analyse unterzogen. In diesem Screening wurden sechs unterschiedliche, mit dem AADH-Gen verwandte DNA-Bereiche wie folgt isoliert: vier bereits isolierte Bereiche, getragen auf p24D4, p1E2, p26C3 und p17E8 sowie zwei neue Bereiche, getragen auf zwei separaten Plasmiden mit der Bezeichnung pSS31 und pSS53. Das andere Plasmid, pSS33, trug beide der zwei Bereiche, die auf p24D4 und pSS31 getragen wurden.
(4) Immunologische und enzymatische Charakterisierung der AADH-Klone
Die Western-Blot-Analyse von Zelllysaten von p24D4, p1E2, p26C3, pSS31 und p17E8 tragenden P. putida zeigte, daß die fünf Klone für Proteine mit Molekulargewichten von etwa 64000, 62500, 62500, 60000 bzw. 62000 codierten. Das Plasmid pSS33 codierte für zwei immunreaktive Proteine mit Molekulargewichten von etwa 64000 bzw. 60000, wohingegen pSS53 keine immunreaktiven Proteine produzierte.
Die Enzymaktivitäten der Klone (zellfreier Extrakt, lösliche Fraktion und Membranfraktion) wurden jeweils durch photometrische Analyse gemessen. Dabei wurden jeweils 5 ml MB-Medium in einem Teströhrchen mit den Zellen der Klone angeimpft und 24 Stunden bei 30°C kultiviert. Die erhaltene Brühe wurde in 200 ml frisches MB-Medium in einen 500-ml-Kolben überführt und der Kolben auf einem Kolbenrotationsschüttler 24 Stunden bei 30°C geschüttelt. Die Zellen wurden durch 10minütige Zentrifugation bei 6000 × g gesammelt und mit 40 ml kaltem Puffer, bestehend aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM MgCl₂ und 0,5 mM Phenylmethylsulfonylfluorid, gewaschen und mit dem gleichen Puffer unter Herstellung einer Zellsuspension von 1 g feuchten Zellen pro 5 ml suspendiert. Die Zellsuspension wurde zweimal mit einer French-Press-Zellaufschlußvorrichtung behandelt (1500 kg/cm²), und das erhaltene Homogenisat wurde 10 Minuten bei 6000 × g zur Abtrennung von Zelltrümmern zentrifugiert. Der so erhaltene zellfreie Extrakt (CFE) wurde 60 Minuten bei 100000 × g zentrifugiert. Der erhaltene Überstand bzw. das erhaltene Pellet wurde als Cytosolfraktion bzw. Membranfraktion gesammelt und einem PMS-DCIP-Test wie folgt unterzogen. Der Enzymreaktionsansatz (1,0 ml) enthielt 100 μM DCIP, 1 mM PMS, 50 mM Tris-Malat-NaOH-Puffer, pH 8,0, ein Substrat sowie das Enzym (10 μl). Die substratabhängige Abnahmegeschwindigkeit der Absorption von DCIP bei 600 nm wurde bei 25°C unter Verwendung eines Kontron-Spektrophotometers UVIKON 810 gemessen. In Tabelle 6 ist das Niveau der Enzymaktivitäten im zellfreien Extrakt und in den löslichen Fraktionen der Klone dargestellt. Gemäß der Substratspezifität wurden die auf den Plasmiden codierten Enzyme jeweils in drei große Gruppen, die A-, B- und C-Gruppe, eingeteilt: die A-Gruppe katalysiert die Oxidation von L-Sorbose, D-Sorbit und 1-Propanol; die B-Gruppe katalysiert die Oxidation von D-Glucose und D-Sorbit; die C-Gruppe zeigte keine deutlich nachweisbaren Aktivitäten gegenüber den verwendeten Substraten. In der A-Gruppe gab es drei Arten, A, A' und A'', die voneinander jeweils über ihre physikalische Karte der jeweils auf den Plasmiden getragenen DNA unterschieden wurden. Die B- bzw. C-Gruppe bestanden jeweils ausschließlich aus einer Proteinart, die aus einem Bereich der chromosomalen DNA stammte. Tabelle 6.

*1–*4: Das Oxidationsprodukt wurde für jedes Substrat jeweils über eine Reaktion der ruhenden Zelle und anschließende DC-Analyse bestimmt.
*1: Bei dem durch die Enzyme A, A', A'' und [A und B] erhaltenen Oxidationsprodukt von L-Sorbose handelte es sich um 2KGA.
*2: Bei dem durch Enzym B und Enzyme [A und B] erhaltenen Oxidationsprodukt von D-Glucose handelte es sich um D-Gluconsäure.
*3: Bei dem durch die Enzyme A, A' und A'' erhaltenen Oxidationsprodukt von D-Sorbit handelte es sich hauptsächlich um D-Glucose, bei dem durch Enzym B erhaltenen um L-Sorbose und bei dem durch die Enzyme [A und B] erhaltenen um ein Gemisch aus D-Glucose und L-Sorbose.
*4: Bei dem durch die Enzyme A, A', A'', B und [A und B] erhaltenen Oxidationsprodukt von L-Sorboson handelte es sich um 2KGA.

Beispiel 2. Nukleotidsequenzierung
Die Nukleotidsequenzen der Gene für die Enzyme A, A', A'' und B wurden mit den Plasmiden p24D4, p1E2, p26C3 bzw. pSS31 mit der Dideoxynukleotid-Kettenterminationsmethode unter Verwendung von M13mp18 und M13mp19 (Boehringer Mannheim) bestimmt. Dabei wurde für jedes Gen jeweils ein offenes Leseraster (open reading frame, ORF) gefunden; die Nukleotidsequenzen der vier Gene sind im Sequenzprotokoll der SEQ ID NO: 1 bis 4 gezeigt, wobei die von den Nukleotidsequenzen hergeleiteten Aminosäuresequenzen im Sequenzprotokoll der SEQ ID NO: 5 bis 8 dargestellt wurden. Die ORFs für die Gene der Enzyme A, A', A'' und B weisen eine Länge von 1737, 1737, 1734 und 1737 bp auf und codieren 579, 579, 578 bzw. 579 Aminosäurereste, die alle jeweils 23 Aminosäuren lange Signalsequenzen enthalten. Die Homologien zwischen den Enzymen A, A', A'' und B sind in Tabelle 7 dargestellt. Tabelle 7. Homologien der Aminosäuresequenzen zwischen AADHs.

(%)

Enzym A Enzym A' Enzym A'' Enzym B

Enzym A 100 - - -

Enzym A' 89 100 - -

Enzym A'' 85 86 100

Enzym B 83 82 81 100
In 5 sind die Aminosäuresequenzen der reifen Enzyme A und B dargestellt, die einander so gegenübergestellt sind, daß sie miteinander vergleichbar sind.
Die Homologiesuche der Enzyme A, A', A'' und B zeigte, daß die Enzyme A, A', A'' und B eine eher geringe Homologie (26–31% Homologie über die Polypeptide) mit mehreren Chino-Proteinen, einschließlich Alkohol-Dehydrogenase aus Acetobacter aceti (T. Inoue et al., J. Bacteriol. 171: 3115-3122) oder Acetobacter polyoxogenes (T. Tamaki et al., B. B. A., 1088: 292-300) sowie Methanol-Dehydrogenase aus Paracoccus denitrificans (N. Harms et al., J. Bacteriol. 169: 3966-3975), Methylobacterium organophilum (S. M. Machlin et al., J. Bacteriol. 170: 4739-4747), oder Methylobacterium extorquens (D. J. Anderson et al., Gene 90: 171-176), zeigten.
Beispiel 3. Subklonierung von AADH-Genen
Das Gen für Enzym A wurde ursprünglich als Cosmidklon von p24D4, das eine etwa 25 kb große Insertion in der EcoRI-Stelle von pVK100 aufweist, kloniert. Anschließend wurde es weiter zur Verwendung als eine Enzym-A-Genkassette subkloniert. Dabei wurde das 2,7 kb große EcoRV-Fragment, das das ORF des Enzym-A-Gens mit etwa 500 bp nichtcodierenden Bereichen an beiden Enden enthält, aus dem 3,4 kb großen NruI-Fragment, das aus p24D4 in M13mp18 isoliert wurde, ausgeschnitten und in die HindIII-Stelle von pUC18 mit einem HindIII-Linker (CAAGCTTG) ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde mit pSSA202 bezeichnet. Anschließend wurde die Enzym-A-Genkassette (2,7 kb großes HindIII-Fragment) an der HindIII-Stelle von pVK102 unter Bildung von pSSA102R inseriert. Das Plasmid pSSA102R wurde über ein konjugatives Paarungsverfahren, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, in nalidixinsäureresistente P. putida [ATCC 21812] eingeführt. Die pSSA102R tragende Transkonjugante von P. putida wurde auf MB-Agar-Medium mit 50 μg/ml Nalidixinsäure und 10 μg/ml Tetracyclin (MNT-Agar-Medium) selektioniert und einer Mini-Ruhezellreaktion unterzogen. Der Reaktionsansatz (100 μl), bestehend aus 20 g/l L-Sorbose, 3 g/l NaCl, 10 g/l CaCO₃ sowie den aus der MNT-Agar-Kultur mit einem Zahnstocher gesammelten Zellen, wurde bei Raumtemperatur unter leichtem Schütteln 24 Stunden inkubiert. Der Reaktionsansatz wurde mittels DC getestet, wobei 2KGA als Produkt identifiziert wurde, während mit der gleichen Ruhezellreaktion mit dem nalidixinsäureresistenten P. putida-Wirt [ATCC 21812] kein 2KGA beobachtet wurde.
Das Gen für Enzym B wurde ursprünglich als ein Cosmidklon von pSS31, das eine etwa 30 kb große Insertion in der SalI-Stelle von pVK102 aufweist, kloniert. Es wurde als 6,5 kb großes BglII-Fragment in die BglII-Stelle von pVK101 (ATCC 37157) unter Erhalt von pSS3102 subkloniert. Anschließend wurde es zur Verwendung als eine Enzym-B-Genkassette weiter subkloniert. Dabei wurde das 6,5 kb große BglII-Fragment in die BamHI-Stelle von pUC18 unter Erhalt von pSSB202 kloniert. Anschließend wurde das 2,3 kb große XhoII-Fragment aus pSSB202 ausgeschnitten. Das 2,3 kb große XhoII-Fragment enthält das ORF für Enzym β mit 120 bp 5'-nichtcodierendem Bereich und etwa 500 bp 3'-nichtcodierendem Bereich. Das Fragment wurde zum Auffüllen der kohäsiven Enden mit Klenow-Fragment behandelt und in die HindIII-Stelle von pUC18 mit einem HindIII-Linker unter Bildung von pSSB203 kloniert. Die Enzym-B-Genkassette (2,3 kb großes HindIII-Fragment) wurde an der HindIII-Stelle von pVK102 inseriert, so daß pSSB103R hergestellt wurde. Das Plasmid pSSB103R wurde mit einem konjugativen Paarungsverfahren in Nalidixinsäureresistente P. putida [ATCC 21812] eingeführt und die pSSB103R tragende Transkonjugante von P. putida auf MNT-Agar-Medium selektioniert und einer Miniruhezellreaktion unterzogen. pSSB103R tragende P. putida zeigten die Enzym-B-Aktivität (L-Sorbose-Bildung aus D-Sorbit) in der Ruhezellreaktion. (Übrigens stellte ich heraus, daß es sich bei dem XhoII-Fragment nicht um ein XhoII-XhoII-Fragment sondern um ein XhoII-XhoI-Fragment als Ergebnis der Nukleotidsequenzierung handelte. XhoI könnte in der XhoII-Präparation vorhanden sein.)
Die Gene für Enzym A' und Enzym A'' wurden ursprünglich als Cosmidklon von p1E2 bzw. p26C3, die eine etwa 30 kb große Insertion in der SalI-Stelle von pVK102 aufweisen, kloniert und im Grunde genommen wie oben beschrieben weiter subkloniert. Das Gen für Enzym A' im 3,5 kb großen XhoII-Fragment wurde in die BglII-Stelle von pVK102 subkloniert, so daß pSSA'101R konstruiert wurde, und das Gen für Enzym A'' im 2,7 kb großen EcoRV-Fragment wurde zunächst in M13mp19 subkloniert und danach nochmals zwischen der HindIII- und der BglII-Stelle von pVK102 subkloniert, so daß pSSA''102 konstruiert wurde.
Beispiel 4. Isolierung und Charakterisierung von AADHs aus Transkonjuganten von P. putida.
(1) Kultivierung der Mikroorganismen
Den Cosmidvektor pVK102 mit den Genen für Enzym A, A', A'' bzw. B, pSSA102R, p1E2, p26C3 bzw. pSSB103R, tragende P. putida [ATCC 21812] wurden in Gegenwart eines Antibiotikums in MB-Brühe kultiviert. Bei den dem Medium zugesetzten Antibiotika handelte es sich um: 5 μg/ml Tetracyclin für pSSA102R (Enzym A) und pSSB103R (Enzym B), 25 μg/ml Kanamycin für p1E2 (Enzym A') und p26C3 (Enzym A''). 10 Teströhrchen mit jeweils 5 ml MB-Medium mit dem entsprechenden Antibiotikum wurden mit den Zellen von der Agarplatte von MB mit dem entsprechenden Antibiotikum angeimpft und der Ansatz unter Schütteln bei 30°C kultiviert. Nach 2 Tagen Kultivierung wurden die Zellen in zehn 500-ml-Erlenmeyerkolben mit jeweils 100 ml des gleichen Mediums überführt und unter Schütteln bei 30°C kultiviert. Nach 1 Tag Kultivierung wurden die Animpfkulturen vereinigt und in 18 Liter Medium in einem 30-l-Fermentergefäß (Marubishi) überführt und 18 Stunden unter Rühren bei 300 UpM und 1,0 vvm Belüftung bei 30°C kultiviert. Die Zellen wurden durch 10minütiges Zentrifugieren bei 6000 × g geerntet, einmal mit 1,5 Liter 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, mit 5 mM CaCl₂, 1 mM MgCl₂, 0,2 M NaCl, 2,5% Saccharose und 0,5 mM PMSF gewaschen und bis zur Verwendung bei –20°C aufbewahrt. Als Ergebnis erhielt man etwa 150 g Zellen (Feuchtgewicht).
(2) Reinigung der klonierten Enzyme A, A', A'' und B.
Die Enzyme A, A', A'' und B wurden mit dem gleichen Verfahren im nahezu gleichen Maßstab aufgereinigt. Alle Arbeiten wurden, falls nicht anders angegeben, bei 4–10°C durchgeführt. Die Bestimmung der Enzymaktivität wurde für Enzym A, A', A'' und B mit den Substraten L-Sorbose, n-Propanol, n-Propanol bzw. D-Glucose mittels eines wie in Beispiel 1 beschriebenen spektrophotometrischen Tests über die gesamten Reinigungsschritte hindurch durchgeführt. Die Zellen (etwa 100 g Zellen (Feuchtgewicht) mit 8–10 g Gesamtproteinen) wurden aufgetaut und in etwa 200 ml 25 mM Tris-HCl, pH 8,0 suspendiert und durch zweimaliges Passieren durch eine French-Press (1500 kg/cm²) aufgeschlossen. Anschließend wurde die Suspension mit DNase und MgCl₂, in einer Endkonzentration von 0,01 mg/ml bzw. 1 mM versetzt, um die Viskosität der Lösung aufgrund der DNA zu verringern. Zelltrümmer wurden durch 10minütige Zentrifugation bei 6000 × g abgetrennt. Die Suspension wurde mit dem 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, auf 240 ml aufgefüllt und zur Abtrennung der unlöslichen Membranfraktion 90 Minuten bei 100000 × g zentrifugiert. Der lösliche Überstand wurde mit dem Tris-Puffer auf 240 ml aufgefüllt und anschließend mit Pyrrolochinolinchinon (PQQ) und CaCl₂ in einer Endkonzentration von 12,5 μM bzw. 5 mM versetzt, wonach die Lösung 15 Minuten bei Raumtemperatur kräftig gerührt wurde. Die wie oben präparierte lösliche Fraktion wurde über (NH₄)₂SO₄ aufgetrennt. Die Fraktion 35–60% gesättigtes (NH₄)₂SO₄ wurde gefällt und in 100 ml 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, mit 5 mM CaCl₂ und 5% Saccharose resuspendiert und anschließend wiederum mit PQQ in einer Endkonzentration von 12,5 μM versetzt. Die Enzymlösung wurde gegen 1000 ml des gleichen Puffers (ohne PQQ) über Nacht dialysiert. Das Dialysat wurde dann langsam unter leichtem Rühren mit 20 g festem Polyethylenglykol 6000 versetzt. Nach 30minütigem Rühren wurden die Niederschläge durch 20minütige Zentrifugation bei 10000 × g abgetrennt, und der Überstand wurde mit dem wie oben angegebenen Puffer auf 200 ml aufgefüllt.
Die wie oben hergestellte Enzymlösung wurde durch die folgenden drei Chromatographieschritte aufgereinigt.
Erster Schritt: DEAE-Toyopearl 650 M
Die Enzymrohlösung wurde einer Säule von DEAE-Toyopearl 650 M (2,5 × 40 cm), die mit 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0 mit 5 mM CaCl₂ und 5% Saccharose äquilibriert worden war, ausgesetzt. Die Säule wurde mit 400 ml des gleichen Puffers gewaschen und das Enzym durch 2000 ml eines linearen 0–0,5 M NaCl-Gradienten im Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 150 ml/Stunde eluiert. Die enzymaktiven Fraktionen wurden vereinigt und mit dem Puffer ohne NaCl zweifach verdünnt.
Zweiter Schritt: Q-Sepharose (Fast Flow)
Die Enzymlösung wurde einer Säule von Q-Sepharose (Fast Flow) (1,5 × 20 cm), die mit dem Puffer ohne NaCl äquilibriert worden war, ausgesetzt. Die Säule wurde mit 200 ml des Puffers mit 0,2 M NaCl gewaschen und das Enzym durch 600 ml eines linearen 0,2–0,6 M NaCl-Gradienten im Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 50 ml/Stunde eluiert. Die enzymaktiven Fraktionen wurden vereinigt und unter Verwendung eines Ultrafilters: Amicon, PM-30 unter N₂-Gas auf 2,5 ml eingeengt.
Dritter Schritt: Sephacryl S-300 HR (Gelfiltration)
Das aufkonzentrierte Enzym wurde durch eine Säule von Sephacryl S-300 HR (2,5 × 100 cm), die mit 25 mM HEPES, pH 7,5, mit 5 mM CaCl₂, 5% Saccharose und 0,2 M NaCl äquilibriert worden war, filtriert. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer bei einer Fließgeschwindigkeit von 20 ml/Stunde entwickelt. Die enzymaktiven Fraktionen wurden vereinigt und über das oben erwähnte Ultrafilter auf weniger als 1 ml eingeengt und danach bei –80°C aufbewahrt. Das im HEPES-Puffer konzentrierte Enzym war bei –80°C mindestens 2 Monate lang stabil.
Folglich wurden 26,0 mg Enzym A, 0,35 mg Enzym A', 0,41 mg Enzym A'' und 5,0 mg Enzym B erhalten.
(3) Eigenschaften der Enzyme A, A', A'' und B
a) Molekulargewicht und Untereinheit.
Die Enzyme A, A', A'' und B wurden an der gleichen Position aus der gleichen Gelfiltrationssäule an Sephacryl S-300HR unter der gleichen Bedingung eluiert. Das Molekulargewicht der Enzyme wurde auf ungefähr 135000 geschätzt, verglichen mit den Molekulargewichtsstandardproteinen (SDS-PAGE Standards, Low Range, Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, USA). Die Enzyme A, A', A'' und B zeigten homogene Einzelbanden bei der SDS-PAGE-Analyse mit Molekulargewichten von 64000, 62500, 62500 bzw. 60000. Alle Enzymbanden A, A', A'' und B wurden in einer Western-Blotting-Analyse unter Verwendung eines Anti-AADH-Kaninchenserums nachgewiesen. Daher wurde die Schlußfolgerung gezogen, daß die Enzyme aus zwei identischen Untereinheiten in Form eines Homodimers bestanden.
b) N-terminale Aminosäuresequenz und Aminosäurezusammensetzung.
Die N-terminalen Aminosäuresequenzen der reifen Enzyme A, A'' und B wurden mit dem Gasphasen-Sequenzierautomaten (470A; Applied Biosystems) mit dem Edman-Verfahren [Acta Chem. Scand., 4, 283-293, (1950)] analysiert. Die Analyse des Enzyms A' wurde aufgrund einer unzureichenden Reinheit der Probe nicht durchgeführt. Die Ergebnisse waren wie folgt:
Enzym A: Gln-Val-Thr-Pro-Val-Thr-
Enzym A'': blockierter N-terminaler Rest
Enzym B: Gln-Val-Thr-Pro-Ile-Thr-Asp-Glu-Leu-Leu-Ala-.
Die bestimmten Sequenzen von Enzym A und B waren identisch mit den von den in SEQ ID NO: 5 und 8 beschriebenen Nukleotidsequenzen hergeleiteten Sequenzen (beginnend mit dem vierundzwanzigsten Rest); diese Ergebnisse deuten darauf hin, daß es sich bei den ersten 23 Resten der Enzyme um die Signalsequenzen handelt. Über die Analogie zu den Enzymen A und B wurde hergeleitet, daß es sich bei den ersten 23 Resten von Enzym A' und A'' ebenso um die Signalsequenzen handelt.
Die Aminosäurezusammensetzung des Enzyms A wurde bestimmt. Dabei wurde das Protein 24 Stunden mit 6 N HCl bei 110°C oder 24 Stunden mit 4 M Methansulfonsäure (nach Oxidation mit Perameisensäure) bei 115°C hydrolysiert. Die Aminosäureanalyse wurde unter Verwendung eines Kontron-Aminosäureanalysegeräts (Ninhydrinsystem) durchgeführt. Die Analysedaten wurden mit der aus der DNA-Sequenz des Gens für Enzym A hergeleiteten Aminosäurezusammensetzung verglichen. Dabei zeigte sich, daß es sich bei dem aufgereinigten Enzym A mit Sicherheit um ein Produkt des Enzym-A-Gens handelte.
c) Substratspezifität
Die Enzyme A, A', A'' und B wurden an Hand ihrer Substratspezifitäten im PMS-DCIP-Test, wie oben beschrieben, charakterisiert, wobei 8 Substrate verwendet wurden, nämlich n-Propanol, Isopropanol, D-Glucose, D-Sorbit, L-Sorboson, D-Mannit, L-Sorbose und D-Fructose. Die Ergebnisse wurden in Tabelle 1 angegeben.
d) Physikalisch-chemische Eigenschaft
Physikalisch-chemische Untersuchungen des pH-Optimums, der pH-Stabilität und der Temperaturstabilität der Enzyme A (als L-Sorbose-Dehydrogenaseaktivität), A' (als n-Propanol-Dehydrogenaseaktivität), A'' (als L-Sorbose-Dehydrogenaseaktivität) und B (als D-Sorbit-Dehydrogenaseaktivität) wurden mit dem PMS-DCIP-Test durchgeführt.
In Tabelle 2 sind die Ergebnisse für das pH-Optimum der Enzyme zusammengefaßt. Die Enzymaktivität wurde mit dem spektrophotometrischen PMS-DCIP-Test unter Verwendung verschiedener pH-Puffer getestet. Bei den Puffern handelte es sich um 50 mM Tris-Malat-NaOH, pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0 und 8,5; 50 mM Glycin-NaOH, pH 9,0 und 9,5. Die Extinktionskoeffizienten für DCIP bei pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0 und 9,5 wurden als 10,8, 13,2, 14,5, 14,9, 15,0, 15,1, 15,1 bzw. 15,1 angenommen. Alle Enzyme zeigten ihre optimalen Punkte bei pH 8,0–8,5. Die Enzyme A'' und B wiesen zu niedrigeren pH-Werten hin einen relativ breiten pH-Bereich im Vergleich mit den Enzymen A und A' auf.
In Tabelle 3 sind die Ergebnisse der pH-Stabilitäten der Enzyme angegeben. Dabei wurde das Enzym (etwa 0,01 mg/ml) mit 50 mM Puffer mit 5% Saccharose, 0,2 M NaCl und 5 mM CaCl₂ 3 Stunden bei 25°C inkubiert und mit dem spektrophotometrischen PMS-DCIP-Verfahren getestet. Bei den Puffern handelte es sich um Natriumacetat, pH 4 und 5, Tris-Malat-NaOH, pH 6, 7 und 8, Glycin-NaOH, pH 9 und 10. Die Werte in der Tabelle sind als relative Aktivität gegenüber der ohne Inkubation bei pH 8,0 erhaltenen Aktivität ausgedrückt. Bei den für die Enzyme verwendeten Substraten handelte es sich um 125 mM L-Sorbose für die Enzyme A und A'', 50 mM n-Propanol für Enzym A' sowie 125 mM D-Sorbit für Enzym enzym B. Die Profile der pH-Stabilitäten der Enzyme A, A', A'' und B waren fast identisch; sie waren im Bereich von pH 6 bis 9 stabil.
In Tabelle 4 sind die Ergebnisse für die Temperaturstabilitäten der Enzyme angegeben. Dabei wurde das Enzym (etwa 0,05 mg/ml) in 25 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, mit 5% Saccharose, 0,2 M NaCl und 5 mM CaCl₂, bei der in der Tabelle angegebenen Temperatur (4–60°C) 5 Minuten inkubiert, im Eisbad abgekühlt und mit dem spektrophotometrischen PMS-DCIP-Verfahren getestet. Die Restaktivität wurde als relative Aktivität gegenüber der mit einer Inkubation bei 4°C erhaltenen Aktivität ausgedrückt. Bei den für die Enzyme verwendeten Substraten handelte es sich um 125 mM L- Sorbose für Enzym A und Enzym A'', 50 mM n-Propanol für Enzym A' sowie 125 mM D-Sorbit für Enzym B. Nach 5minütiger Behandlung der Enzyme bei 40°C betrug die Restaktivität des Enzyms A 20% und die Restaktivitäten der Enzyme A', A'' und B 70–85%.
e) Allgemeine Inhibitoren
Das Enzym (etwa 0,05 mg/ml) in 25 mM HEPES-Puffer, pH 7,5, mit 5% Saccharose, wurde mit Metall oder Inhibitor 30 Minuten bei 25°C inkubiert. Die Restaktivität wurde mit dem spektrophotometrischen PMS-DCIP-Test wie in Beispiel 1 beschrieben getestet. Die Restaktivität wird als relative Aktivität gegenüber einer Leerwertinkubation ausgedrückt. Die Effekte von Metallionen auf die Enzyme sind in Tabelle 5 aufgeführt. MgCl₂ und CaCl₂ waren gegenüber den Enzymen nahezu inert, während die anderen Metallionen, vor allem CuCl₂, einen signifikanten Einfluß ausübten. Die Effekte von Inhibitoren auf die Enzyme sind ebenso in Tabelle 5 enthalten. Bemerkenswerterweise wurden Enzym A, A' und A'' von EGTA und EDTA gehemmt. Allerdings wurde Enzym B durch EGTA und EDTA weniger gehemmt als die Enzyme der A-Gruppe.
Beispiel 5. Effiziente Produktion von Enzym B in E. coli
Der Signalpeptidbereich des Enzyms B wurde durch den des Maltose-bindenden Proteins (malE) aus E. coli wie folgt ersetzt. Zwei Oligonukleotide (SEQ ID NO: 9 und 10) wurden mit dem Applied Biosystem 381A DNA-Syntheseautomaten synthetisiert und zur Erzeugung eines für eine Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 11), MetLysIleLysThrGlyAlaArgIleLeuAlaLeuSerAlaLeuThrThrMetMet PheSerAlaSerAlaLeuAla(Gln), codierenden Doppelstrang-DNA-Fragments einer Annealing-Reaktion unterzogen, wobei das Fragment anschließend mit T4-Polynukleotidkinase [J. Biol. Chem., 259, 10606-10613, (1984)] behandelt wurde. pSSB203 (siehe Beispiel 3) wurde mit dem Restriktionsenzym SphI verdaut, mit T4-DNA-Polymerase behandelt und mit BstPI verdaut. Das erhaltene 1,72 kb große, das Enzym-B-Gen ohne den für die ursprüngliche Signalsequenz und den ersten Aminosäurerest (Gln) des reifen Enzyms B codierenden Bereich tragende DNA-Fragment wurde aus einem Agarosegel nach Agarosegelelektrophorese isoliert. Der E. coli-Expressionsvektor pTrc99A (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden), der mit den Restriktionsenzymen NcoI (am ATG-Startcodon) und SmaI verdaut wurde, wurde mit den beiden obigen DNA-Fragmenten ligiert. Das erhaltene Plasmid wurde als pTrcMal-EnzB bezeichnet und zur Transformation von E. coli JM109 verwendet. Die Transformante wurde in zwei 2-Liter-Kolben mit jeweils 600 ml LB mit 100 μg/ml Ampicillin bei 28°C angezogen und bei Erreichen einer Zellkonzentration von etwa 1,5 OD600 mit 0,1 mM (Endkonzentration) IPTG versetzt. Nach Zugabe des IPTG wurden die Zellen weitere 3–4 Stunden kultiviert. Die Zellen wurden durch 10 minütige Zentrifugation (4000 × g) bei 25°C geerntet, mit 500 ml 30 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 20% Saccharose bei 25°C suspendiert. Nach Zugabe von 1 mM EDTA zur Zellsuspension wurden die Zellen unter leichtem Rühren 5 Minuten bei 25°C inkubiert und durch 15minütige Zentrifugation (8000 × g) bei 4°C gesammelt. Die Zellen wurden mit 500 ml eiskalter 5 mM MgSO₄-Lösung resuspendiert und unter leichtem Schütteln 5 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Zellsuspension wurde 10 Minuten bei 4°C und 8000 × g zentrifugiert, so daß man einen Überstand in Form eines kalten osmotischen Schockextrakts erhielt, von dem sich zeigte, daß er das Proteinenzym B (Molekulargewicht: 60000) in einer Reinheit von mehr als 50–60% nach SDS-PAGE-Analyse enthielt. Der Überstand wurde zunächst mit Tris-HCl, pH 8,0, auf 20 mM ergänzt und erstens mit EDTA in einer Endkonzentration von 10 mM 10 Min., zweitens mit CaCl₂ in einer Endkonzentration von 20 mM 10 Minuten und schließlich mit PQQ in einer Endkonzentration von 25 μM bei 25°C inkubiert. Zur Stabilisierung des Enzyms wurde der Überstand mit α-Methyl-D-Glucosid (einem kompetitiven Inhibitor) in einer Endkonzentration von 20 mM versetzt. Das Enzym B wurde durch die folgenden zwei Chromatographien vollständig gereinigt. Zunächst wurde der Überstand auf eine Q-Sepharose-Säule (1,6 × 12 cm), die mit 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, mit 1 mM CaCl₂ und 20 mM α-Methyl-D-Glucosid äquilibriert worden war, geladen und das Enzym B mit 600 ml eines linearen 0–0,4 M NaCl-Gradienten im gleichen Puffer eluiert. Eine bei etwa 0,25 M NaCl eluierte rote Protein-Spitzenfraktion wurde gesammelt und auf etwa 0,5 ml mittels Centricon-30 (Amicon) eingeengt. Schließlich wurde das Enzym B über eine SephacrylS-300HR-Säule mit 20 mM HEPES, pH 7,8 mit 0,2 M NaCl, 1 mM CaCl₂ und 20 mM α-Methyl-D-Glucosid geleitet. Eine bei einer Position des Molekulargewichts um 135000 Dalton eluierte rote Protein-Spitzenfraktion wurde als endgültiges gereinigtes Enzym B gesammelt. Folglich wurden aus 1,2 Liter E. coli-Kulturbrühe etwa 8 mg des gereinigten Enzyms B erhalten.
Beispiel 6. Wirt-Vektor-System
Ein Wirt-Vektor-System für G. oxydans [DSM Nr. 4025] wurde unter Verwendung des konjugativen Paarungssystems mit einem Cosmid mit breitem Wirtsspektrum, pVK102, eingerichtet. Dabei wurde zunächst nur eine Transkonjugante aus G. oxydans [DSM Nr. 4025] mit nalidixinsäureresistenz isoliert. Ein neuer Wirt, GOS2, wurde aus den pVK102 tragenden Transkonjuganten G. oxydans [DSM Nr. 4025] durch Austreiben von pVK102 isoliert. Anschließend wurde ein zweiter Wirt GOS2R aus dem GOS2 durch Zugabe einer Rifampicinresistenz (100 μg/ml), wodurch eine leichte Selektion der Transkonjuganten vom E. co1i-Donor ermöglicht wird, abgeleitet. Die Plasmidübertragungsfrequenz in GOS2R betrug 10^–3~10^–4 Transkonjuganten/Empfänger. Allerdings lag die 2KGA-Produktivität von GOS2R um etwa 10% niedriger als die von G. oxydans [DSM Nr. 4025]. Der dritte Wirt, GORS6-35, wurde aus G. oxydans [DSM Nr. 4025] erhalten, indem der Stamm mit Rifampicinresistenz, hoher 2KGA-Produktivität und relativ hoher Kompetenz über eine Reihe von Experimenten, einschließlich Konjugation, Austreiben und 2KGA-Fermentation, selektioniert wurde.
(1) Isolierung von GOS2
G. oxydans [DSM Nr. 4025] wurde mit Resistenz gegen Nalidixinsäure versehen. Dabei wurden Zellen von G. oxydans [DSM Nr. 4025] auf Trypticase Soy Broth (BBL, Becton Dickinson Microbiology Systems Cockeysville, MD, USA) (T)-Agar-Medium mit 50 μg/ml Nalidixinsäure (TN-Agar-Medium) ausgestrichen und 5 Tage bei 27°C inkubiert. Die erhaltenen Kolonien wurden wiederum auf den gleichen Agarplatten ausgestrichen, so daß ein Nalidixinsäureresistenter G. oxydans [DSM Nr. 4025] GON, erhalten wurde. Das Cosmid mit breitem Wirtsspektrum, pVK102 (Km^r, Tc^r), wurde aus pVK102 tragenden E. coli in den GON-Stamm durch triparentale konjugative Paarung wie folgt übertragen. Ein pRK2013 tragender E. coli-Helferstamm sowie ein pVK102 tragender Donorstamm wurden in LB-Medium mit 50 μg/ml Kanamycin bei 37°C über Nacht kultiviert. Die Kulturen wurden in frisches LB-Medium mit Kanamycin überführt und 5–6 Stunden inkubiert. Der Empfängerstamm GON wurde in TN-Flüssigmedium bei 30°C über Nacht kultiviert. Die E. coli- und GON-Stämme wurden getrennt zentrifugiert und im gleichen bzw. einem Zehntel Volumen frischen T-Mediums resuspendiert. Jeweils 100 μl der Zellsuspensionen wurden zusammengemischt und ein 30 μl großer Teil des Gemischs auf ein auf der Oberfläche einer NS2-Agarplatte plaziertes Nitrocellulosefilter punktförmig aufgetragen. Transkonjuganten wurden auf dem T-Agar-Medium mit 50 μg/ml Nalidixinsäure und 50 μg/ml Kanamycin (TNK-Agar-Medium) selektioniert. Dabei wurden auf den Selektionsplatten mehrere Kolonien erhalten, wobei auch viele spontane Mutanten von E. coli(Nal^r, Km^r)-Kolonien auftraten. Die Plasmid- und chromosomalen DNAs der transkonjuganten Kandidaten wurden präpariert und mit der authentischen pKV102- bzw. chromosomalen DNA aus G. oxydans DSM Nr. 4025 durch Restriktionsanalyse und Southern-Blot-Hybridisierung verglichen. Infolgedessen wurde eine Transkonjugante von G. oxydans [DSM Nr. 4025], die pVK102 trug, GON8-1, identifiziert. Die aus GON8-1 präparierte Plasmid-DNA war mit der von pVK102 identisch und in E. coli replizierbar. Die chromosomale DNA von GON8-1 war mit der von G. oxydans [DSM Nr. 4025] identisch.
Zur Isolierung von Stämmen, die als Wirte mit höherer Kompetenz für die konjugative Paarung fungieren könnten, wurde das Plasmid pVK102 aus der Transkonjuganten GON8-1 ausgetrieben. Dabei wurde GON8-1 in T-Brühe ohne Antibiotika 2 Tage bei 30°C kultiviert und 2% der Kultur in frische T-Brühe überführt. Nach drei derartigen Kultivierungszyklen wurden die Zellen auf T-Agarplatten verteilt, 4 Tage bei 27°C inkubiert und die erhaltenen Kolonien auf TNK- und TN-Agarplatten zur Selektion von Kms-Stämmen übergepickt. Einer der Km^s-Stämme wurde mit GOS2 bezeichnet, wobei durch Southern-Blot-Hybridisierung bestätigt wurde, daß er keinen DNA-Bereich von pVK102 trug. Anschließend wurde pVK102 durch eine konjugative Paarung in den Stamm GOS2 übertragen; dieser Stamm zeigte eine 10²~10³ mal höhere Kompetenz (nämlich 10^–5~10^–6 Transkonjuganten/Empfänger) als G. oxydans [DSM Nr. 4025].
(2) Isolierung von GOS2R, einer rifampicinresistenten Mutante von GOS2.
Durch wiederholte Übertragung von GOS2-Zellen auf T-Agar-Medium mit 20–100 μg/ml Rifampicin wurden rifampicinresistente(Rif^r)-Mutanten von GOS2 isoliert; dabei wurde einer der Rif^r-Stämme mit GOS2R bezeichnet. Der Stamm GOS2R zeigte eine sehr hohe Kompetenz; 10^–2~10^–3 und 10^–4 Transkonjuganten/Empfänger auf TRK-Agar(T-Agar-Medium mit 100 μg/ml Rifampicin und 50 μg/ml Kanamycin)-Platte bzw. auf TRT-Agar(T-Agar-Medium mit 100 μg/ml Rifampicin und 3 μg/ml Tetracyclin)-Platte.
Die 2KGA-Produktivität aus L-Sorbose durch GOS2R wurde mit der von G. oxydans [DSM Nr. 4025] verglichen. 5 ml des Animpfkulturmediums, bestehend aus 8% L-Sorbose (getrennt sterilisiert), 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO₄·7H₂O, 1,75% Maisquellwasser, 5,0% Bäckerhefe, 1,5% CaCO₃ und 0,5% Harnstoff (getrennt sterilisiert) (pH 7,0 vor Sterilisierung), wurden mit den auf NS2-Agar-Medium gehaltenen Zellen angeimpft, und der Ansatz 24 Stunden bei 30°C inkubiert. Die erhaltene Animpfkultur (5 ml) wurde zum Animpfen in einen 500-ml-Erlenmeyer-Kolben mit 50 ml Produktionsmedium PMS10, bestehend aus 10% L-Sorbose (getrennt sterilisiert), 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO₄·7H₂O, 3% Maisquellwasser, 6,25% Bäckerhefe, 1,5% CaCO₃ und 1,6% Harnstoff (getrennt sterilisiert) (pH 7,5 vor Sterilisierung), gegeben und 4 Tage unter Schütteln (180 UpM) bei 30°C inkubiert. Die quantitative Bestimmung von 2KGA wurde in einem Test mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie durchgeführt. GOS2R bzw. G. oxydans [DSM Nr. 4025] produzierten 87,3 bzw. 97,3 g/l 2KGA.
(3) Isolierung von GORS6-35 als Wirt mit hoher 2KGA-Produktivität
Zur Beurteilung der Selbstklonierung von AADH-Genen im Stamm mit der gleichen Produktivität von 2KGA aus L-Sorbose wie G. oxydans [DSM Nr. 4025] wurde ein neuer Wirt durch (i) Zugabe von Rifampicinresistenz (200 μg/ml), (ii) Einführen und Austreiben von pVK102 und (iii) Selektionieren eines Stamms mit hoher 2KGA-Produktion aus L-Sorbose konstruiert. Der so erhaltene GORS6-35 zeigt die folgenden zwei Charakteristika: (i) fast die gleiche 2KGA-Produktivität (etwa 100 g/l 2KGA aus 10% L-Sorbose) wie der Elternstamm G. oxydans [DSM Nr. 4025], und (ii) eine Kompetenz (10^–6~10^–7 Transkonjuganten/Empfänger).
Beispiel 7. Konstruktion eines Enzym-B-Gens mit ausgetauschtem Promotor
Der Promotor des Enzym-A-Gens (PA) ist wahrscheinlich stark in G. oxydans [DSM Nr. 4025], da sich herausstellte, daß Enzym A hinsichtlich der Menge in der Zelle eines der am stärksten exprimierenden Proteine war, wenn ein zellfreier Gesamtextrakt von G. oxydans [DSM Nr. 4025] einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und das erhaltene Gel mit Coomassie Brilliant Blue R-250 angefärbt wurde. Der PA und ein weiterer Promotor, ein Promotor des kanamycinresistenten Gens von Tn5 (PTn5), der die Kanamycinresistenz in G. oxydans [DSM Nr. 4025] exprimieren könnte, wurden an das Strukturgen mit der SD-Sequenz des Enzym-B-Gens, wie in 10 gezeigt, angefügt.
Das das Enzym-B-Gen enthaltende 2,3 kb große HindIII-Fragment wurde in M13mp18 inseriert und die erhaltene Phagen-DNA einer stellengerichteten Mutagenese, die mit dem T7-GEN^TM In Vitro Mutagenesis Kit (TOYOBO Co., Ltd., Osaka, Japan) nach den Anweisungen des Zulieferers durchgeführt wurde, unterzogen (9). Zur Insertion verschiedener Promotoren stromaufwärts des Enzym-B-Gens anstelle des Enzym-B-Promotors wurde stromaufwärts von der SD-Sequenz eine BamHI-Stelle erzeugt. Ein Primer für die Mutagenese, GTTAGCGCGGTGGATCCCCATTGGAGG (27-mer, einschließlich BamHI-Stelle, SEQ ID NO: 12), wurde mit dem Applied Biosystems 381A DNA-Syntheseautomaten synthetisiert. Das erhaltene BamHI-HindIII-Fragment trägt Enzym-B-SD und Strukturgene ohne den Enzym-B-Promotor (PB).
Anschließend wurde der Promotor des Enzym-A-Gens (PA) mit dem PCR-Verfahren unter Verwendung von Primern mit den Sequenz-Tags für die HindIII- und BamHI-Stellen subkloniert. Die PCR-Reaktion wurde mit dem GeneAmp^TM DNA Amplification Reagent Kit (Takara Shuzo, Kyoto, Japan) mit einem Thermocycler, dem Zymoreactor II (Atto Corp., Tokyo, Japan), durchgeführt. Die Reaktion besteht aus einer Vorbehandlung vor Zugabe von Enzym (94°C, 5 Minuten); 30 Zyklen aus Denaturierungsschritt (94°C, 1 Minute), Annealing-Schritt (60°C, 1 Minute) und Syntheseschritt (72°C, 1 Minute); und Nachbehandlung (72°C, 5 Minuten). Als DNA-Matrize wurde das Plasmid pSSA202 (pUC18-Enzym-A-Gen in 2,7 kb-HindIII) verwendet. Der Reaktionsansatz enthielt 200 μM dNTPs, jeweils 1 μM der Primer, 1 ng DNA-Matrize und 2,5 U AmpliTaq^TM-DNA-Polymerase im mitgelieferten Puffer. Infolgedessen wurde ein 300 bp großes Fragment stromaufwärts von der SD-Sequenz amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in pUC18 zwischen die HindIII- und BamHI-Stellen inseriert und zur Nukleotidsequenzierung verwendet; die amplifizierten Sequenzen weisen keine durch Fehleinbau in der PCR verursachte Mutationen auf.
Der Promotor des kanamycinresistenten Gens, PTn5, wurde zunächst als HindIII-PstI-Fragment aus dem Plasmid pNeo (Pharmacia Co., Uppsala, Schweden) erhalten. Anschließend wurde das HindIII-PstI-Fragment in die Mehrfachklonierungsstelle pUC18 inseriert, und PTn5 wurde schließlich als HindIII-BamHI-Fragment ausgeschnitten.
Die den PA- bzw. PTn5-Promotor enthaltenden HindIII-BamHI-Fragmente wurden in die HindIII-Stelle von pUC18 zusammen mit dem das Enzym-B-Strukturgen, aus dem der P3-Promotor enfernt worden war, enthaltenden BamHI-HindIII-Fragment inseriert. Die HindIII-Fragmente aus den erhaltenen Plasmiden wurden in pVK100 subkloniert, so daß pSSAP-B und pSSPTn5-B erhalten wurden, die durch konjugative Paarung wie in Beispiel 6 beschrieben in GOS2R übertragen wurden.
Beispiel 8. 2KGA-Produktion durch Transkonjuganten von GOS2R im Kolben.
(1) 2KGA-Produktion aus L-Sorbose durch Enzym-A-Genamplifizierte Transkonjugante in Einzelkulturfermentation im Kolben
Das Enzym-A-Plasmid pSSA102R und das Vektorplasmid pVK102 wurden in GOS2R mit einem konjugativen Paarungsverfahren wie in Beispiel 6 beschrieben eingeführt. Die erhaltenen Transkonjuganten wurden auf NS2-Agar-Medium mit 30 μg/ml Tetracyclin gehalten und einer 2KGA-Fermentation aus L-Sorbose unterzogen. Dabei wurden 5 ml des in Beispiel 6 beschriebenen Animpfkulturmediums mit den Zellen der Transkonjuganten angeimpft und der Ansatz 24 Stunden bei 30°C inkubiert. Die erhaltene Animpfkultur (5 ml) wurde zum Animpfen in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml des in Beispiel 6 beschriebenen PMS10-Produktionsmediums oder des PMS12-Produktionsmediums, bestehend aus 12% L-Sorbose (getrennt sterilisiert), 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO₄·7H₂O, 3% Maisquellwasser, 10% Bäckerhefe, 1,5% CaCO₃ und 2% Harnstoff (getrennt sterilisiert) (pH 7,5 vor Sterilisierung), gegeben und 4 oder 5 Tage unter Schütteln (180 UpM) bei 30°C inkubiert. Als Ergebnis wurden von GOS2R (pSSA102R) bzw. GOS2R (pVK102) in 4 Tagen 92,2 bzw. 89,1 g/l 2KGA aus 10% L-Sorbose sowie in 5 Tagen 105,7 bzw. 99,9 g/l 2KGA aus 12% L-Sorbose produziert.
(2) 2KGA-Produktion aus D-Sorbit durch GOS2R (pSSB103R) in Einzelkulturfermentation im Kolben.

Das Enzym-B-Plasmid pSSA103R und das Vektorplasmid pVK102 wurden in GOS2R mit einem konjugativen Paarungsverfahren wie in Beispiel 6 beschrieben eingeführt. Die erhaltenen Transkonjuganten wurden auf NS2-Agar-Medium mit 30 μg/ml Tetracyclin gehalten und einer 2KGA-Fermentation aus D-Sorbit unterzogen. 5 ml des Animpfkulturmediums, bestehend aus 8% D-Sorbit, 0,05% Glycerin, 0,25% MgSO₄·7H₂O, 1,75% Maisquellwasser, 5,0% Bäckerhefe, 1,5% CaCO₃ und 0,5% Harnstoff (getrennt sterilisiert) (pH 7,0 vor Sterilisierung), wurden mit den Zellen der Transkonjuganten angeimpft und der Ansatz 24 Stunden bei 30°C inkubiert. Mit der erhaltenen Animpfkultur (5 ml) wurde ein 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml von drei, in Tabelle 8 dargestellten Produktionsmedien angeimpft und 3 Tage unter Schütteln (180 UpM) bei 30°C inkubiert. Als Ergebnis wurden von GOS2R (pSSB103R) etwa 61,5, 71,5 bzw. 73,0 g/l 2KGA aus 8%, 10% bzw. 12% D-Sorbit produziert, während von GOS2R (pVK102) 19,5, 25,4 bzw. 30,2 g/l 2KGA produziert wurden. Tabelle 8.

			(%)
Inhaltsstoffe	PMSL8	PMSL10	PMSL12
D-Sorbit	8,0	10,0	12,0
Glycerin	0,05	0,05	0,05
MgSO₄·7H₂O	0,25	0,25	0,25
Maisquellwasser	3,0	3,0	3,0
Bäckerhefe	5,0	6,25	10
Harnstoff*	1,25	1,6	2,0
CaCO₃	1,5	1,5	1,5

pH 7,5 vor Sterilisierung
*: getrennt sterilisiert

(3) 2KGA-Produktion aus D-Sorbit durch GOS2R (pSSAP-B) und GOS2R (pSSPTn5-B) in Einzelkulturfermentation im Kolben.

Die Zellen von GOS2R (pSSAP-B), GOS2R (pSSPTn5-B), GOS2R (pSSB103R) und GOS2R (pVK100) wurden im PMSL10-Produktionsmedium in Erlenmeyerkolben 3 Tage bei 30°C wie in Beispiel 8 (2) beschrieben kultiviert. Die produzierten Mengen an 2KGA wurden in Tabelle 9 dargestellt. Tabelle 9.

	Menge an 2KGA (g/l)
Stamm	1 Tag	2 Tage	3 Tage
GOS2R (pSSAP-B)	47,2	67,0	67,7
GOS2R (pSSPTn5-B)	23,4	28,6	29,4
GOS2R (pSSB103R)	30,5	54,3	62,7
GOS2R (pVK100)	10,2	18,3	19,3
GOS2R	6,7	14,7	16,4

Beispiel 9. 2KGA-Produktion aus D-Sorbit in 3-L-Gefäß-Fermentationen durch einen einzelnen Mikroorganismus
(1) Einzelkulturfermentation durch GOS2R (pSSB103R)
5-ml-Portionen der in Teströhrchen wie in Beispiel 8-(2) beschrieben hergestellten Animpfkultur wurden in vier 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml des gleichen Animpfkulturmediums überführt und 24 Stunden unter Schütteln (180 UpM) bei 30°C inkubiert. Ein 3-L-Fermentergefäß mit 1800 ml des PMSL10-Produktionsmediums mit 3 ml Antischaummittel wurde mit der erhaltenen Brühe (200 ml der Animpfkultur) angeimpft. Der Fermenter wurde bei 30°C, 700 UpM und 0,5 vvm betrieben. D-Sorbit wurde folgendermaßen zugeführt: (i) 200 ml 50% D-Sorbit wurden in 6 Stunden von der 24. bis zur 30. Stunde zugeführt, oder (ii) 280 ml 50% D-Sorbit wurden in 8,4 Stunden von der 24. bis zur 32,3. Stunde zugeführt. Als Ergebnis wurden durch die Fed-Batch(Satzkultur)-Fermentationen (i) bzw. (ii) in 51 Stunden 99,0 bzw. 103,4 g/l 2KGA produziert.
Beispiel 10. 2KGA-Produktion aus D-Sorbit durch Enzym-B-Gen-amplifizierten GOS2R in Mischkulturfermentation mit E. coli im Kolben.
(1) Mischkulturfermentationen mit B. megaterium, E. coli und P. putida.
B. megaterium [DSM Nr. 4026], E. coli HB101 und P. putida [ATCC 21812], Wachstumsfaktorlieferanten, wurden in 150 ml des Animpfkulturmediums, bestehend aus 0,3% Hefeextrakt (Difco), 0,3% Rindfleischextrakt (Kyokuto Seiyaku, Tokyo, Japan), 3% Maisquellwasser, 1% Polypepton (Kyokuto), 0,1% Harnstoff, 0,1% KH₂PO₄, 0,02% MgSO₄·7H₂O, 2% L-Sorbose, 0,1% CaCO₃ (pH 7,1 vor Sterilisierung), 24 Stunden bei 37, 37 bzw. 30°C kultiviert. Der Stamm GOS2R (pSSB103R) wurde in zwei Teströhrchen mit 5 ml des Animpfkulturmediums, wie in Beispiel 8-(2) beschrieben, 24 Stunden bei 30°C kultiviert. Vier ml GOS2R(pSSB103R)-Animpfkulturen sowie 3,5 ml Wachstumsfaktorlieferanten-Animpfkultur wurden zum Animpfen in einen 500-ml-Erlenmeyerkolben mit 50 ml des Produktionsmediums für Mischkulturfermentationen, bestehend aus 8% D-Sorbit, 0,01% MgSO₄·7H₂O, 1% Maisquellwasser, 0,1% KH₂PO₄, 0,6% CaCO₃, 1,5% Harnstoff (getrennt sterilisiert) und Antischaummittel (ein Tropfen pro Kolben) (pH 7,0 vor Sterilisierung), gegeben, und der Kolben wurde 46,5 Stunden bei 30°C geschüttelt. Als Ergebnis wurden von der Mischkultur mit B. megaterium DSM Nr. 4026, E. coli HB101 und P. putida ATCC 21812 49,9, 54,1 bzw. 31,3 g/l 2KGA produziert.
(2) Mischkulturfermentation von GOS2R (pSSAP-B) mit E. coli im Kolben.
Die Mischkulturfermentation von GOS2R (pSSAP-B) mit E. coli wurde auf die gleiche Weise wie oben beschrieben durchgeführt, außer daß das Animpfkulturmedium für E. coli statt 2% L-Sorbose 2% D-Sorbit enthielt. Aus 10% D-Sorbit wurden von GOS2R (pSSAP-B) 73,7 g/l 2KGA in 48,5 Stunden produziert.
Beispiel 11. 2KGA-Produktion durch rekombinante AADH
Ein Reaktionsansatz mit 1,7 mg/ml gereinigtem Enzym A (aufgereinigt gemäß Beispiel 4), 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM CaCl₂, 8 mg/ml Rinderserumalbumin (RSA), 1 mM PMS, 20 μg/ml PQQ und 4% L-Sorbose wurde unter leichtem Schütteln 20 Stunden bei 30°C inkubiert. Als Ergebnis wurden etwa 2 g/l 2KGA (DC-Test) produziert.
Der andere Reaktionsansatz mit jeweils 2,4 mg/ml gereinigtem Enzym A und Enzym B (aufgereinigt gemäß Beispiel 4), 50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM CaCl₂, 8 mg/ml RSA, 1 mM PMS, 20 μg/ml PQQ und 2% D-Sorbit wurde unter leichtem Schütteln 20 Stunden bei 30°C inkubiert. Als Ergebnis wurden 0,25 g/l 2KGA (HPLC-Test) und etwa 5 g/l L-Sorbose (DC-Test) produziert.
Beispiel 12. Produktion von Aldehyden aus Alkoholen, Ketonen aus Alkoholen oder Carbonsäuren sowie Carbonsäuren aus Aldehyden

Enzymreaktionen mit gereinigtem Enzym A oder Enzym B sowie verschiedenen Substraten wurden wie in Beispiel 11 beschrieben durchgeführt. Die erhaltenen Produkte wurden über DC und/oder HPLC wie in Tabelle 10 dargestellt identifiziert. Tabelle 10.

Enzym	Substrat	Produkt
Enzym A	D-Sorbit	D-Glucose, L-Gulose
	L-Sorbose	L-Sorboson, 2KGA
	L-Sorboson	2KGA
	D-Mannit	D-Mannose
	D-Fructose	2KD
Enzym B	D-Glucose	D-Gluconsäure
	D-Sorbit	L-Sorbose
	L-Sorboson	2KGA
	D-Mannit	D-Fructose
	L-Idose	L-Idonsäure
	Glycerin	Dihydroxyaceton
	D-Gluconsäure	5-Keto-D-gluconsäure
	D-Mannonsäure	5-Keto-D-mannonsäure

Enzym A wandelte D-Fructose zu 2KD um; dies bedeutet, daß D-Glucoson ebenso ein aus D-Fructose als Zwischenstufe gebildetes Produkt darstellte.
Beispiel 13. 2KGA- und L-Sorbose-Produktion durch eine Transkonjugante von P. putida.
Ein Ruhezellansatz (2 ml) mit 1% CaCO₃, 0,3% NaCl, 1 mM PMS, 5 μg/ml PQQ, 2% L-Sorbose und 10 OD600 Einheitenzellen von nalidixinsäureresistenten (Nal^r) P. putida [ATCC 21812], die pSSA102R oder pVK100 trugen, wurde unter leichtem Schütteln 17 Stunden bei 30°C inkubiert. Als Ergebnis wurden von Nal^r P. putida [ATCC 21812], pSSA102R tragend bzw. mit pVK100, 18,9 bzw. 0,0 g/l 2KGA produziert.
Ein Ruhezellansatz (2 ml) mit 1% CaCO₃, 0,3% NaCl, 1 mM PMS, 5 μg/ml PQQ, 2% D-Sorbit und 10 OD600-Einheitenzellen von Nal^r P. putida [ATCC 21812] mit pSSB103R oder mit pVK100 wurde unter leichtem Schütteln 17 Stunden bei 30°C inkubiert. Als Ergebnis wurden von Nal^r P. putida [ATCC 21812], pSSB103R tragend bzw. mit pVK100, 7,8 bzw. 0,0 g/l L-Sorbose produziert.

Claims

DNA-Molekül gemäss SEQ ID NO: 1 oder DNA-Sequenz, die mit dem DNA-Molekül unter stringenten Hybridisierungs- und Waschbedingungen hybridisiert, wobei die DNA für ein Polypeptid mit Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität codiert.
DNA-Molekül gemäss Anspruch 1, das in Form einer linearen oder zirkulären DNA oder eines DNA-Insertionsfragments auf einem Chromosom vorliegt.
Rekombinante Enzympräparation, die ein von dem DNA-Molekül gemäss Anspruch 1 oder 2 codiertes enzymatisches Polypeptid umfaßt.
Rekombinante Enzympräparation gemäss Anspruch 3, wobei das enzymatische Polypeptid in Form eines Homodimers vorliegt.
Rekombinanter Expressionsvektor, umfassend ein oder mehrere DNA-Moleküle wie in einem der Ansprüche 1 oder 2 definiert.
Rekombinanter Expressionsvektor gemäss Anspruch 5, wobei das DNA-Molekül bzw. die DNA-Moleküle mit einer oder mehreren genetischen Kontrollsequenz(en) funktionell verknüpft ist bzw. sind und zur Expression des enzymatischen Polypeptids bzw. der enzymatischen Polypeptide wie in einem der Ansprüche 3 oder 4 definiert, in einer entsprechenden Wirtszelle fähig ist bzw. sind.
Rekombinante Wirtszelle, die den rekombinanten Expressionsvektor nach einem der Ansprüche 5 bis 6 oder ein oder mehrere DNA-Moleküle, wie in einem der Ansprüche 1 bis 2 definiert, trägt.
Rekombinante Wirtszelle gemäss Anspruch 7, die aus der aus Mikroorganismen, einer Säugerzelle und Pflanzenzellen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.
Rekombinante Wirtszelle gemäss Anspruch 7 oder 8, wobei die Wirtszelle ein Mikroorganismus ist, ausgewählt aus der Gruppe der Bakterien, wie etwa Escherichia coli, Pseudomonas putida, Acetobacter xylinum, Acetobacter pasteurianus, Acetobacter aceti, Acetobacter hansenii und Gluconobacter oxydans.
Rekombinante Wirtszelle gemäss Anspruch 9, wobei es sich um unter der Hinterlegungsnummer DSM Nr. 4025 hinterlegtes Gluconobacter oxydans handelt.
Verfahren zur Herstellung einer rekombinanten Enzympräparation mit einer in Anspruch 3 oder 4 definierten Alkohol- und/oder Aldehyd-Dehydrogenaseaktivität, umfassend das Kultivieren einer in einem der Ansprüche 7 bis 10 definierten rekombinanten Wirtszelle in einem entsprechenden Kulturmedium und Gewinnen dieses rekombinanten Enzyms bzw. dieser rekombinanten Enzyme.
Verfahren zur Herstellung eines Aldehyd-, Keton- oder Carbonsäureprodukts aus einem entsprechenden Substrat, umfassend das Umsetzen von besagten Substrat in das Produkt mit Hilfe einer biochemischen Reaktion einer in einem der Ansprüche 7 bis 10 definierten rekombinanten Wirtszelle.
Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure aus L-Sorbose und/oder D-Sorbit, umfassend das Umsetzen von L-Sorbose und/oder D-Sorbit mit Hilfe einer biochemischen Reaktion einer in einem der Ansprüche 7 bis 10 definierten rekombinanten Wirtszelle zu 2-Keto-L-gulonsäure.
Verfahren zur Herstellung eines Aldehyd-, Keton- oder Carbonsäureprodukts aus einem entsprechenden Substrat, umfassend die Inkubation eines Reaktionsgemisches, enthaltend eine in einem der Ansprüche 1 oder 2 definierte rekombinante Enzympräparation sowie besagtes Substrat.
Verfahren zur Herstellung von 2-Keto-L-gulonsäure, umfassend Inkubation eines Reaktionsgemisches, enthaltend eine in einem der Ansprüche 3 oder 4 definierte rekombinante Enzympräparation sowie L-Sorbose und/oder D-Sorbit.
Verfahren zur Herstellung von L-Ascorbinsäure aus 2-Keto-L-gulonsäure, dadurch gekennzeichnet, daß ein Verfahren nach Anspruch 13 oder 15 ausgeführt und die mit einem solchen Verfahren erhaltene 2-Keto-L-gulonsäure mit einer im Stand der Technik bekannten Methode in L-Ascorbinsäure überführt wird.