JP2002065297A - 下痢原性腸内細菌検出用増菌培地 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 下痢原性腸内細菌を検出する際に、夾雑菌の
腸球菌、緑膿菌、プロテウス、プロビデンシアなどの影
響を受けず、正確に且つ短時間で検出することができる
増菌培地を提供する。 【解決手段】 少なくともペプトン、エキス、マンニト
ール、還元剤及びグラム陽性菌抑制剤を含む下痢原性腸
内細菌検出用増菌培地を用いる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、病原大腸菌、サル
モネラなどの下痢原性腸内細菌検出用増菌培地に関す
る。

【０００２】

【従来の技術】近年、食中毒の発生が増加しており、そ
の原因を早期に、且つ正確に把握することは、適切な治
療及び感染拡大の防止にとって重要となる。例えば、患
者大便、食品、飲料水、及び環境材料からのサルモネ
ラ、病原大腸菌などの下痢原性腸内細菌を検出するに
は、通常、まず緩衝ペプトン水で６時間前培養したの
ち、更に次のような工程を要する。即ち、サルモネラの
場合には、前記培養液の一部を特殊な選択培地（例え
ば、ＸＬＤ、ＤＨＬ、ＭＬＣＢ培地等）に移し菌分離を
行わなければならない。また、病原大腸菌の場合には、
前記前培養後、更に１８時間培養を続けて菌分離を行う
必要がある。どちらも、結果が判定できるまで、二日間
もの長時間を要する。特に、病原大腸菌中志賀毒素産生
性大腸菌を証明するためには、菌分離培養後、別個に毒
素産生性を確かめる方法が用いられるため、従来方法で
は、結果が分かるまで更に長時間を必要とする。

【０００３】また、緩衝ペプトン水を用いて下痢原性腸
内細菌を検出する場合、これらの菌以外にも腸球菌、緑
膿菌、プロテウス（Ｐｒｏｔｅｕｓ）、プロビデンシア
（Ｐｒｏｖｉｄｅｎｃｉａ）などの夾雑菌も増殖してし
まうという問題点がある。特に、適当な選択増菌培地の
ない病原大腸菌の場合、夾雑菌の存在は病原大腸菌を分
離する際の障害となり、正確な判定ができなくなるとい
う重大な問題が発生してしまう。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、下痢原性腸
内細菌の増殖には影響を及ぼさずに、夾雑菌の腸球菌、
緑膿菌、プロテウス、プロビデンシアなどの発育を抑制
することによって、短時間で下痢原性腸内細菌の検出を
容易にする増菌培地の提供を目的とする。

【０００５】

【課題を解決するための手段】上記課題は、本発明によ
って一挙に解決される。即ち、本発明は、少なくともペ
プトン、エキス、マンニトール、還元剤及びグラム陽性
菌抑制剤を含むことを特徴とする下痢原性腸内細菌検出
用増菌培地、に関する。以下、本発明を詳述する。

【０００６】本発明によれば、ペプトン及びエキスを含
む細菌培養用培地にマンニトール、還元剤及びグラム陽
性菌抑制剤を添加した培地によって、下痢原性腸内細菌
の発育には影響を与えずに、それらの分離の障害となる
プロテウス、プロビデンシア、腸球菌や緑膿菌といった
グラム陽性菌の発育を阻害し、目的の菌を正確に検出す
ることが可能となる。

【０００７】本発明の培地に使用されるペプトンとして
は、公知のカゼイン消化ペプトン、獣肉消化ペプトン、
またはゼラチン消化ペプトンが挙げられ、これらを単独
あるいは組み合わせても良い。好ましくは、カゼイン−
獣肉混合ペプトンであり、培地１リットルあたり１０〜
２０ｇを添加する。また、エキスとしては、公知の肉エ
キスまたは酵母エキスが挙げられ、培地１リットルあた
り肉エキスでは５〜１０ｇ、酵母エキスでは３〜５ｇを
加えて用いればよい。

【０００８】炭素栄養源は、プロテウス、プロビデンシ
アが利用できない糖類であるマンニトールを使用し、そ
の添加量は、大腸菌及びサルモネラの発育を促進する最
小濃度であればよい。例えば１リットルあたり１〜１０
ｇ、好ましくは１〜５ｇを添加して用いる。１ｇより少
ないと菌の発育が遅れ、１０ｇを越える過剰量だと、糖
代謝産物である酸が大量に生成され培地が強く酸性化さ
れるため、菌の発育には不適であり好ましくない。

【０００９】還元剤としては培地の酸化還元電位を低下
させる作用があればよく、チオグリコール酸塩、Ｌ−シ
スチン、Ｌ−システイン、ジチオスレイトール、メルカ
プトエタノール、メルカプトエチルアミンなどが挙げら
れる。これらを単独、あるいは複数種組み合わせて用い
ることができる。特に、チオグリコール酸ナトリウム及
びＬ−シスチンを組み合わせて使用した場合、下痢原性
腸内細菌の発育には影響を及ぼさず、緑膿菌の発育を抑
制できるので好ましい。これらの添加濃度は、培地の酸
化還元電位を低下させることができる濃度であればよ
く、例えばチオグリコール酸ナトリウムは、１リットル
あたり０．１〜２．０ｇ、好ましくは０．２〜１．０ｇ
を添加して用いる。０．１ｇより少ないと緑膿菌の発育
抑制効果がなくなり、２．０ｇを越える過剰量では、下
痢原性腸内細菌の発育も抑制してしまい好ましくない。
また、Ｌ−シスチンは１リットルあたり０．０５〜１．
０ｇ好ましくは０．１〜０．５ｇを添加して用いる。
０．０５ｇより少ないと緑膿菌の発育抑制効果がなくな
り、１．０ｇを越えるとＬ−シスチン自体の溶解が困難
となり不都合である。

【００１０】グラム陽性菌抑制剤として、グラム陽性菌
の発育を抑制することができる物質であればよく、胆汁
酸塩、クエン酸塩、抗生物質（バンコマイシン、セフィ
キシム、セフスロジンなど）及び色素（マラカイトグリ
ーンなど）が挙げられる。これらを単独あるいは複数種
組み合わせて用いることができる。特に、胆汁酸ナトリ
ウム及びクエン酸ナトリウムを組み合わせて使用した場
合、下痢原性腸内細菌の発育に影響を及ぼさず、グラム
陽性菌の発育を抑制できるので好ましい。これらの添加
濃度は、グラム陽性菌の発育を抑制できる濃度であれば
よく、例えば胆汁酸ナトリウムは、１リットルあたり
０．１〜２．０ｇ、好ましくは０．２〜１．０ｇを添加
して用いる。０．１ｇより少ないとグラム陽性菌の発育
抑制効果がなくなり、２．０ｇを越える過剰量では、下
痢原性腸内細菌の発育も抑制してしまうため好ましくな
い。クエン酸ナトリウムは、１リットルあたり１〜２０
ｇ、好ましくは２〜１０ｇを添加して用いる。１ｇより
少ないとグラム陽性菌の発育抑制効果がなくなり、２０
ｇを越える過剰量では、下痢原性腸内細菌の発育も抑制
してしまうため好ましくない。

【００１１】また、志賀毒素産生性大腸菌を証明する場
合には、前記培地成分に更に志賀毒素産生促進剤を添加
することができる。志賀毒素産生促進剤としては、マイ
トマイシンＣ、ポリミキシンＢなどの抗生物質が挙げら
れる。好ましくはマイトマシンＣを１リットルあたり
０．０１〜１．５ｍｇ、好ましくは０．０５〜１．０ｍ
ｇ添加して用いる。０．０１ｍｇより少ないと志賀毒素
産生量が少なくなり、１．５ｍｇを越えると、下痢原性
腸内細菌の発育も抑制してしまい好ましくない。

【００１２】本発明増菌培地は、上記濃度でペプトン、
エキス、炭素栄養源、還元剤及びグラム陽性菌抑制剤を
精製水に溶解し、例えば１１５℃で１５分間高圧滅菌
後、冷水中で急冷し調製することができる。また、マイ
トマイシンＣを含む培地の場合は、上記で調製した培地
に、別途調製したマイトマイシンＣ水溶液を濾過滅菌し
たものを加えて調製することができる。本発明増菌培地
は、上記のような液体培地以外にも、その濃縮液、ある
いは乾燥粉末として作製することも可能であり、使用時
にその濃縮液を希釈したり、乾燥粉末を再溶解して用い
ることができる。

【００１３】上記のように作製した本発明の増菌培地を
用いて、例えばサルモネラや病原大腸菌による汚染が疑
われる検体を調べる場合、試料を本発明増菌培地に加え
て、例えば３７℃で６〜２４時間静置培養後、培地の一
部を採取する。この時、培養液の採取には、緑膿菌など
の好気性菌が培地上層部に限局して増殖しているので、
できるだけ上層部を取り込まないように注意する必要が
ある。これをそれぞれの検出に適した選択増菌培地（例
えばＥＥＭ培地、ＧＮ培地など）、あるいは菌分離用寒
天培地（例えばＸＬＤ、ＤＨＬ、ＭＬＣＢ、マッコンキ
ー培地など）に移植し、その培養結果から菌の有無を判
定する。また検査対象が志賀毒素産生性大腸菌のとき
は、マイトマイシンＣを含む本発明増菌培地で例えば３
７℃で６時間培養後、その遠心上清について志賀毒素の
存在を調べる。

【００１４】本発明の増菌培地には、下痢原性腸内細菌
を含む可能性のあるすべての試料を適用対象とする。す
なわち、下痢患者由来の試料には大便、吐物、尿などが
挙げられ、また食品及び環境由来試料としては食肉及び
肉製品、牛乳及び乳製品、魚介類及びその加工製品、冷
凍食品、日配食品、野菜、環境拭き取り材料、飲料水、
家畜の大便、飼料、土壌、水道水、井戸水、下水、河川
水などが含まれる。

【００１５】夾雑菌であるプロテウスは、その遊走性の
ため菌分離の際にどの菌にも混入してしまい、目的菌の
分離を不可能にするため、菌分離の際には抑制しなけれ
ばならない菌である。また、検体に混入した環境に常在
するグラム陽性菌は、一般の好気培養下ではよく発育す
るため、その後に選択性の高い分離培養手段がない場合
は、菌の分離効率を大きく妨げる。更に、グラム陽性菌
に対する抗生物質、色素などの薬剤を添加しても、逆に
その強選択性から下痢原性腸内細菌を含む多くの菌の発
育が強く抑制されることが多く、グラム陽性菌だけを選
択的に抑制する手段はなかった。加えて、志賀毒素産生
性大腸菌汚染の疑いがある場合には、志賀毒素産生性大
腸菌の検出方法が、菌分離培養後、別個に毒素産生性を
確かめなくてはならないために、結果が分かるまで検査
時間が長くかかってしまうことが問題であった。しかし
ながら、本発明によれば、これらの問題点を一挙に解決
することができ、本下痢原性腸内細菌検出用増菌培地
は、病原大腸菌及びサルモネラを正確に検出できるよう
になり極めて有用である。

【００１６】更には、志賀毒素産生促進剤としてマイト
マイシンＣをさらに添加し増菌培養することで、検出十
分量の毒素が産生されることから、短時間（例えば６時
間）に志賀毒素産生性大腸菌の検出を容易にできるよう
になる。

【００１７】

【実施例】以下に実施例によって本発明を具体的に説明
する。ただし、それらは本発明の範囲を限定するもので
はない。

【実施例１】本発明の増菌培地は、ポリペプトン（ベク
トンアンドディッキンソン）２０ｇ、酵母エキス（オリ
エンタル酵母工業）２ｇ、胆汁酸ナトリウム０．５ｇ、
クエン酸ナトリウム５ｇ、リン酸水素二カリウム４ｇ、
リン酸二水素カリウム１．５ｇ、マンニトール３ｇ、塩
化ナトリウム５ｇ、チオグリコール酸ナトリウム０．５
ｇ及びＬ−シスチン０．２ｇを精製水１０００ｍｌに加
熱溶解して作製した。培地はｐＨ７．０±０．２に修正
後、１０ｍｌずつを試験管に分注し、１１５℃で１５分
間高圧滅菌し、冷水中で急冷し調製した。また本培地の
対照とした緩衝ペプトン水は、バッファードペプトンウ
オーター乾燥粉末（オクソイド）２０ｇを精製水１００
０ｍｌに溶解した後、１０ｍｌずつを試験管に分注し、
１２１℃で１５分間高圧滅菌した。緩衝ペプトン水には
１リットルあたりペプトン１０ｇ、塩化ナトリウム５
ｇ、リン酸水素二ナトリウム３．５ｇ、リン酸二水素カ
リウム１．５ｇが含まれる。

【００１８】上記のように調製した本発明の増菌培地の
評価に、試験菌として大腸菌（ＡＴＣＣ２５９２２及び
ＪＣＭ１６９４）、プロテウスミラビリス（Ｐｒｏｔｅ
ｕｓｍｉｒａｂｉｌｉｓ、ＡＴＣＣ２９９０６）及び緑
膿菌（ＡＴＣＣ２７８５３）のほか、患者便及び食肉か
ら分離した志賀毒素産生性大腸菌２株（Ｏ１５７：Ｈ
７）、サルモネラ２株［サルモネラ血清型エンテリティ
ディス（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ，血清型Ｅｎｔｅｒｉｔ
ｉｄｉｓ）、サルモネラ血清型ティフィムリウム（Ｓａ
ｌｍｏｎｅｌｌａ，血清型Ｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ
ｍ）］、プロテウスミラビリス１株及び緑膿菌１株、計
１０株を用いた。これらの試験菌はハートインヒュージ
ョン培地の３７℃、１夜培養液をリン酸緩衝液で希釈
し、２〜７個／ｍｌになるように本発明の増菌培地１０
ｍｌに加え、３７℃で６時間培養した。これらの増菌培
養液及び最初に接種に用いたハートインヒュージョン培
養希釈液はリン酸緩衝液で１０^−８まで段階希釈し、ミ
スラ法に準拠して菌数を計算した。

【００１９】結果を表１に示す。本発明の増菌培地に接
種した２〜７個／ｍｌの病原性菌株を含む大腸菌及びサ
ルモネラは、６時間培養後１０^４個／ｍｌに達し、その
増殖率は緩衝ペプトン水におけるそれと同等であった。
一方、緑膿菌及びプロテウスの増殖は培養６時間以内で
は著しく遅れ、１０^２個以下／ｍｌを数えたに過ぎなか
った。グラム陽性菌の発育はまったく認められず、本発
明培地の選択増菌効果が確認された。なお、表中のＢＰ
Ｗとは、従来法である緩衝ペプトン水を意味する。また
「＊」を付した菌株は分離株を表す。

【００２０】

【表１】

【００２１】

【実施例２】実施例１と同様の操作により高圧滅菌・急
冷処理した培地に、さらにマイトマイシンＣ（和光純薬
工業）０．１％水溶液を０．２μｇ／ｍｌになるように
加えて増菌培地を調整した。また本培地の対照法は、ベ
ロトックス−Ｆの指定するＣＡＹＥ培地法に従った。Ｃ
ＡＹＥ培地法は、カザミノ酸（日水製薬）２０ｇ、酵母
エキス（オリエンタル酵母工業）６ｇ、塩化ナトリウム
２．５ｇ、リン酸水素二カリウム８．７１ｇ及び別に調
製した塩類溶液を精製水１０００ｍｌに溶解して作製し
た。前記塩類溶液は、硫酸マグネシウム５ｇ、塩化マン
ガン０．５ｇ、塩化第二鉄０．５ｇを０．５ｍＭ硫酸水
溶液（硫酸を精製水で希釈し調製）１００ｍｌに溶解
し、調製した。培地はｐＨ８．５に修正後、１０ｍｌず
つを試験管に分注し、１１５℃で１５分間高圧滅菌して
調製した。また、ＣＡＹＥ培地に添加するポリミキシン
Ｂ溶液として、硫酸ポリミキシンＢ（和光純薬工業）を
５０００単位／ｍｌになるように生理食塩水に溶解した
ものを調製した。

【００２２】上記のように調製した本発明の増菌培地の
評価に、試験菌として患者便から分離した志賀毒素産生
性大腸菌１１株を用いた。これらの試験菌はハートイン
ヒュージョン培地の３７℃、１夜培養液をリン酸緩衝液
で希釈し、１００〜３００個／ｍｌになるように本発明
の増菌培地１０ｍｌ及びベロトックス−Ｆの指定するＣ
ＡＹＥ培地１０ｍｌに加えた。本法では、３７℃で６時
間培養後の遠心上清中の志賀毒素力価（志賀毒素Ｉ及び
志賀毒素ＩＩ）をベロトックス−Ｆ（入手先：デンカ生
研）で測定した。ＣＡＹＥ培地法では、３７℃で１６時
間培養を行った後、ポリミキシンＢ溶液１ｍｌを加え更
に３７℃で３０分間培養し、その遠心上清中の志賀毒素
力価をベロトックス−Ｆで測定した。接種菌数はハート
インヒュージョン培養液をリン酸緩衝液で１０^−８まで
段階希釈し、ミスラ法に準拠して計算した。

【００２３】結果を表２に示す。志賀毒素の力価は本発
明の増菌培地法のほうがＣＡＹＥ培地法よりも１６〜６
４倍高かった。

【００２４】

【表２】

【００２５】

【発明の効果】本発明培地を用いれば、グラム陽性菌、
好気性菌及びプロテウス、プロビデンシアの発育を抑制
して下痢原性腸内細菌を選択的に増殖させ、それらの分
離を容易にすることができるのみならず、志賀毒素産生
性大腸菌に対しては増菌培養中に検出に十分量の毒素の
産生を促し、その検査時間を大幅に短縮できる。

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 少なくともペプトン、エキス、マンニト
   ール、還元剤及びグラム陽性菌抑制剤を含むことを特徴
   とする下痢原性腸内細菌検出用増菌培地。
2. 【請求項２】 請求項１の培地に志賀毒素産生促進剤を
   更に添加した下痢原性腸内細菌検出用増菌培地。
3. 【請求項３】 還元剤がチオグリコール酸塩及びＬ−シ
   スチンの組み合わせである請求項１に記載の下痢原性腸
   内細菌検出用増菌培地。
4. 【請求項４】 グラム陽性菌抑制剤が胆汁酸塩及びクエ
   ン酸塩の組み合わせである請求項１に記載の下痢原性腸
   内細菌検出用増菌培地。
5. 【請求項５】 志賀毒素産生促進剤がマイトマイシンＣ
   である請求項２に記載の下痢原性腸内細菌検出用増菌培
   地。