DE69736177T2

DE69736177T2 - Mit aminosäuren stabilisierte erythropoietinlösung

Info

Publication number: DE69736177T2
Application number: DE69736177T
Authority: DE
Inventors: Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Tadao YAMAZAKI; Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Toshiari MORITA; Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha Hiroshi NAGAI
Original assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Chugai Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1996-04-26
Filing date: 1997-04-25
Publication date: 2007-05-16
Anticipated expiration: 2017-04-26
Also published as: EP1712237A2; TWI240627B; JP2004196824A; US6120761A; KR20000064995A; JPH10182481A; US6627187B2; US20010055582A1; JP2000302689A; JP3068033B2; TW518219B; ES2267140T3; US20040087507A1; DE69736177D1; TW200300340A; ATE477813T1; JP4589018B2; ATE330622T1; US7011825B2; JP3618633B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Erythropoietinlösungszubereitung.
Erythropoietin (nachstehend als EPO bezeichnet) ist ein saures Glykoproteinhormon, das die Differenzierung und Proliferation von Erythroidvorläuferzellen fördert. Das Hormon wird hauptsächlich durch die Niere abgesondert. Erythrocyten sind im Blut für bestimmte Zeiträume reichlich vorhanden und sie werden dann durch die Milz usw. zerstört (ihre mittlere Lebensdauer im Menschen beträgt etwa 120 Tage). Jedoch werden rote Blutzellen ständig aus dem Knochenmark geliefert, sodass die gesamte periphere Zahl von Erythrozyten in einem normalen Zustand konstant gehalten wird. EPO spielt eine zentrale Rolle bei der Aufrechterhaltung einer solchen Homöostase von Erythrozyten im lebenden Organismus.
Durch Reinigung von Urin von Patienten mit aplastischer Anämie aus einem großen Volumen wurde hoch reines menschliches EPO aus Harn erhalten. Das ermöglichte das Klonen von menschlichem EPO-Gen. Heutzutage ist es möglich, eine große Menge von rekombinantem menschlichen EPO in tierischen Zellen durch Gentechnologie herzustellen. Dem Anmelder der vorliegenden Erfindung ist es gelungen, eine Zubereitung (eine lyophilisierte Zubereitung) von gereinigtem EPO herzustellen und er bringt sie in Form von Mitteln in den Handel, die die Nierenanämie usw. lindern.
Die Arzneimittelausführung zur Belieferung des Handels mit stabilen EPO-Zubereitungen erfordert, dass chemische Veränderungen (Hydrolyse, Disulfidaustauschreaktion usw.) oder physikalische Veränderungen (Denaturierung, Agglutination, Adsorption usw.), die mit EPO beobachtet werden, unterdrückt werden. Produkte, die zur Zeit im Handel sind, enthalten menschliches Serumalbumin oder gereinigte Gelatine, welche allgemein als Stabilisator verwendet wird. Diese Substanzen wurden zu diesen Produkten zugegeben, um chemische oder physikalsiche Veränderungen zu unterdrücken. Da menschliches Serumalbumin ein Blutprodukt ist, welches für seine Versorgung von gespendetem Blut abhängt, wurde die Notwendigkeit für seine Zugabe in Frage gestellt. Was die Zugabe eines anderen Proteins als Albumin oder Gelatine als Stabilisator betrifft, ist es schwierig, das Risiko einer viralen Kontaminierung vollständig zu vermeiden.
Peptide als Arzneimittel werden oft zur Stabilisierung lyophilisiert. Jedoch die Lyophilisierung erhöht die Herstellungskosten und schließt durch mechanische Probleme ein erhöhtes Risiko ein.
Aus den vorstehenden Gründen wächst der Bedarf für eine EPO-Zubereitung als eine Alternative für eine lyophilisierte Zubereitung, wobei die EPO-Zubereitung frei von einem Einschluss eines Proteins als Stabilisator und stabil während einer langen Lagerung ist.
EP-A-0178665 betrifft eine Erythropoietinzubereitung, welche einen oder mehrere Stabilisatoren, ausgewählt aus Polyethylenglykol, Protein, Zucker, Aminosäure, anorganischem Salz, organischem Salz und einem Schwefel enthaltenden Reduktionsmittel, enthält, wobei der Aminosäurestabilisator Glycin, Alanin und Lysin einschließt.
EP-A-0430200 betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur subkutanen oder intramuskulären Verabreichung, umfassend ein Polypeptid und mindestens eine Aminosäure oder ein Salz, ein Derivat oder ein Homologes davon.
EP-A-0306824 betrifft eine pharmazeutisch verträgliche Zubereitung aus menschlichem Protein mit einer langen Haltbarkeit, umfassend ein menschliches Protein, einen physiologisch verträglichen Puffer und gegebenenfalls chelierende Mittel, Mittel, die die Isotonizität einstellen, Calciumchlorid und andere Bestandteile, die allgemein für Injektionszwecke verwendet werden, wobei diese Zubereitung 5 bis 50 g/l Harnstoff, 1 bis 50 g/l Aminosäure als auch 0,05 bis 5 g/l eines nichtionischen Netzmittels enthält.
WO-A-9303744 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von konservierten Arzneimitteln, die menschliche Proteine zur Infusion oder Injektion enthalten. Diese Arzneimittel können sowohl Erythropoietin als auch bestimmte Aminosäuren als Stabilisatoren enthalten.
Die Erfinder haben umfassende Studien durchgeführt. Als Ergebnis haben sie gefunden, dass EPO zu einer stabilen EPO-Lösungszubereitung, die frei von menschlichem Serumalbumin und gereinigter Gelatine ist, durch Zugabe einer bestimmten Aminosäure als Stabilisator umgewandelt werden kann. Diese Feststellung hat sie dazu gebracht, die vorliegende Erfindung fertigzustellen.
Das bedeutet, die vorliegende Erfindung stellt eine Erythropoietinlösungszubereitung bereit, welche eine Aminosäure, ausgewählt aus Histidin, Tryptophan und Serin, als Stabilisierungsmittel oder Stabilisator enthält und sie betrifft auch die Verwendung von einer oder von mehreren Aminosäuren, ausgewählt aus Tryptophan, Serin, Arginin und Histidin, als Stabilisator für eine Erythropoietinlösungszubereitung, wobei die Erythropoietinlösungszubereitung keinen Harnstoff enthält.
"Um zu stabilisieren; Stabilisieren" bezieht sich in dieser Beschreibung auf das Lagern oder auf die Erythropoietinlösungszubereitung, zum Beispiel, auf das Lagern von länger als 2 Jahren bei 10°C oder länger als 6 Monaten bei 25°C oder länger als 2 Wochen bei 40°C, wobei der zurückbleibende Anteil an Erythropoietin bei 90% oder höher, vorzugsweise bei 95% oder höher, stärker bevorzugt bei 98% oder höher, gehalten wird.
1 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Konzentration von L-Argininhydrochlorid und dem zurückbleibenden Anteil von Erythropoietin zeigt;
2 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Konzentration von L-Lysinhydrochlorid und dem zurückbleibenden Anteil von Erythropoietin zeigt;
3 ist eine graphische Darstellung, welche die Beziehung zwischen der Konzentration von L-Histidinhydrochlorid und dem zurückbleibenden Anteil von Erythropoietin zeigt; und
4 zeigt ein SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoresemuster, wobei die Wirkung der Unterdrückung des Abbauprodukts von Zubereitungen veranschaulicht wird, zu denen verschiedene Aminosäuren zugegeben wurden (ein Elektrophoretogramm), wobei die Reihe 1: einen Molekulargewichtsmarkierer, die Reihe 2: eine von Aminosäuren freie Zubereitung, die Reihe 3: eine L-Leucin enthaltende Zubereitung, die Reihe 4: eine L-Phenylalanin enthaltende Zubereitung, die Reihe 5: eine L-Tryptophan enthaltende Zubereitung, die Reihe 6: eine L-Serin enthaltende Zubereitung, die Reihe 7: eine L-Cystein enthaltende Zubereitung, die Reihe 8: eine Mononatrium-L-glutamatmonohydrat enthaltende Zubereitung, die Reihe 9: eine L- Argininhydrochlorid enthaltende Zubereitung und die Reihe 10: eine L-Histidinhydrochlorid enthaltende Zubereitung darstellt.
Das EPO für die Verwendung in der erfindungsgemäßen Lösungszubereitung hat im wesentlichen die gleiche biologische Wirkung wie das von Säugern, insbesondere wie das menschliche EPO, und es schließt natürlich vorkommendes EPO und EPO, das durch genetische Rekombination erhalten wird, ein. Das EPO aus genetischer Rekombination schließt EPO mit der gleichen Aminosäuresequenz ein, wie natürlich vorkommendes EPO, oder EPO mit dieser Aminosäuresequenz, aus der eine oder mehrere Aminosäuren getilgt wurden, oder in der eine oder mehrere Aminosäuren substituiert wurden, oder zu der eine oder mehrere Aminosäuren zugegeben wurden und das jedoch die vorstehend erwähnte biologische Wirkung behält. Das erfindungsgemäße EPO kann nach verschiedenen Verfahren, zum Beispiel nach einem Verfahren, umfassend die Extraktion aus menschlichem Urin, anschließende Trennung und Reinigung auf verschiedene Weise; und nach einem Verfahren, das die Produktion in E. coli, Hefe oder Eierstockzellen des chinesischen Hamsters, anschließende Extraktion, Trennung und Reinigung auf verschiedene Weise einschließt, hergestellt werden.
Die in der vorliegenden Erfindung als Stabilisator zugegebene Aminosäure schließt freie Aminosäuren und ihre Salze, wie Natriumsalze, Kaliumsalze und Hydrochloride, ein. Die erfindungsgemäße Lösungszubereitung kann eine oder mehrere dieser Aminosäuren in Kombination enthalten. Die Aminosäuren sind D-, L- und DL-Formen von Tryptophan, Serin, Arginin und Histidin und die Salze davon. Stärker bevorzugt sind L-Tryptophan, L-Arginin und L-Histidin und die Salze davon. Besonders bevorzugt sind L-Histidin und die Salze davon.
Die erfindungsgemäße Lösungszubereitung ist vorzugsweise im wesentlichen frei von einem Protein als Stabilisator.
Für die Menge der zu der erfindungsgemäßen Lösungszubereitung zugegebenen Aminosäure kann durch ein Versuchsverfahren (das später beschrieben wird) ein bevorzugter Bereich festgesetzt werden, der von dem Typ der verwendeten Aminosäure abhängt. Im Allgemeinen beträgt die Menge der zugegebenen Aminosäure 0,001 bis 50 mg/ml, aber vorzugsweise 0,1 bis 40 mg/ml, stärker bevorzugt 1 bis 10 mg/ml, für Arginin, vorzugsweise 0,5 bis 10 mg/ml, stärker bevorzugt 1,0 bis 4,0 mg/ml, am stärksten bevorzugt 1,0 bis 2,0 mg/ml, für Histidin. Wie nachstehend beschrieben, wurde der höchste zurückbleibende Anteil an EPO erhalten, wenn L-Argininhydrochlorid und L-Lysinhydrochlorid jeweils in einer Menge von etwa 1 bis 5 mg/ml als freie Aminosäure zugegeben wurden, oder wenn L-Histidinhydrochlorid in einer Menge, als freie Aminosäure, von 1 bis 10 mg/ml zugegeben wurde, bei einem beschleunigten Test, der 2 Wochen bei 40°C durchgeführt wurde, oder bei einer Menge von 0,5 bis 5 mg/ml bei einem beschleunigten Test, der 6 Monate bei 25°C durchgeführt wurde.
Die Menge an EPO, die in der erfindungsgemäßen Lösungszubereitung enthalten ist, kann entsprechend der Art der Krankheit, die behandelt werden soll, der Schwere der Krankheit, dem Alter des Patienten und so weiter bestimmt werden. Im allgemeinen beträgt die Menge 100 bis 500000 IU/ml, vorzugsweise 200 bis 100000 IU/ml, stärker bevorzugt 750 bis 72000 IU/ml. Die erfindungsgemäße Lösungszubereitung wird gewöhnlich auf einem parenteralen Weg, zum Beispiel durch Injektion (subkutan oder intravenös) oder perkutan, transmukosal oder transnasal verabreicht, aber die orale Gabe ist auch möglich.
Die erfindungsgemäße Lösungszubereitung kann außer EPO und der Aminosäure Bestandteile enthalten, die gewöhnlich zu einer Zubereitung in Form einer Lösung, wie Polyethylenglykol, zugegeben werden; wie Zucker, z. B. Dextran, Mannit, Sorbit, Inosit, Glucose, Fructose, Lactose, Xylose, Mannose, Maltose, Sucrose und Raffinose; anorganische Salze, z. B. Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumphosphat, Kaliumphosphat und Natriumhydrogencarbonat; organische Salze, z. B. Natriumcitrat, Kaliumcitrat und Natriumacetat; und, falls gewünscht, Schwefel enthaltende reduzierende Mittel, z. B. Glutathion, Thioctansäure, Natriumthioglykolat, Thioglycerin, α-Monothioglycerin und Natriumthiosulfat. Das bevorzugte Salz ist Natriumchlorid. Es wird auch bevorzugt, ein Mittel zum Vermeiden einer Adsorption, wie einen Polyoxyethylensorbitanalkylester, zu der erfindungsgemäßen Lösungszubereitung zuzugeben. Besonders bevorzugte Polyoxyethylensorbitanalkylester sind Polysorbat 20, 21, 40, 60, 65, 80, 81 und 85 und am stärksten bevorzugt sind Polysorbat 20 und/oder 80. Die bevorzugte Menge an Polysorbat 20 und/oder 80, die zugegeben wird, ist 0,01 bis 1 mg/ml, stärker bevorzugt 0,05 bis 0,1 mg/ml.
Die erfindungsgemäße Lösungszubereitung kann durch Auflösen der vorstehend erwähnten Komponenten in einem auf dem Gebiet von Lösungszubereitungen allgemein bekannten wässrigen Puffer, wie einem Phosphat- und/oder Citratpuffer, hergestellt werden. Der bevorzugte Phosphatpuffer ist ein Natriummonohydrogenphosphat-Natriumdihydrogenphosphat-Puffer, während der bevorzugte Citratpuffer ein Natriumcitratpuffer ist. Der pH der erfindungsgemäßen Lösungszubereitung ist 5,0 bis 8,0, vorzugsweise 6,0 bis 7,0.
Die nicht geprüfte japanische Patentveröffentlichung Nr. 64-71818 offenbart eine Zubereitung aus menschlichem Protein, dadurch gekennzeichnet, dass sie Harnstoff, eine Aminosäure und ein nichtionisches Netzmittel enthält. Jedoch die Lösungszubereitung der vorliegenden Erfindung enthält vorzugsweise keinen Harnstoff, da es nicht klar ist, ob Harnstoff zu der Stabilisierung eines Glykoproteins, wie Erythropoietin, für einen langen Zeitraum beiträgt. Es ist auch bekannt, dass eine Reaktion zwischen Harnstoffabbauprodukten und einem Protein stattfindet (Protein Chemistry 3, Kyoritsu Shuppan, Kapitel 12), welche die Zubereitung nachteilig beeinflussen kann. Außerdem können, je weniger Bestandteile zu der Zubereitung zugegeben werden, um so bessere Ergebnisse erwartet werden.
Die erfindungsgemäße Lösungszubereitung ist gewöhnlich in einem versiegelten, steriliserten Plastik- oder Glasbehälter enthalten. Die Lösungszubereitung kann als eine verschriebene Dosis in einer Ampulle, einem Fläschchen oder in einer Einwegspritze oder in einer mehrfachen Dosisform, wie einem Beutel oder einer Flasche, zur Injektion bereitgestellt werden.
EPO-Lösungszubereitungen, welche verschiedene Aminosäuren enthielten, wurden hergestellt und einem beschleunigten Test unterworfen, der 2 Wochen bei 40°C durchgeführt wurde. Der EPO-Gehalt in jeder Zubereitung wurde nach dem Test durch RP-HPLC gemessen (Umkehrphasenhochleistungsflüssigchromatographie), um die Wirkung der Zugabe der Aminosäure auf den Gehalt zu ermitteln. Als Ergebnis wurde gefunden, dass der zurückbleibende Anteil von EPO in den Lösungszubereitungen, die L-Leucin, L-Tryptophan, Mononatrium-L-Glutamatmonohydrat, L-Argininhydrochlorid, L-Histidinhydrochlorid und L-Lysinhydrochlorid enthielten, höher war, als in den Lösungszubereitungen, die keine Aminosäuren enthielten. Die Ergebnisse der SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese zeigten, dass L-Argininhydrochlorid und L-Histidinhydrochlorid bei der Unterdrückung der Bildung von EPO-Abbauprodukten wirksam sind, die in der Zubereitung nach dem beschleunigten Test beobachtet wurden.
Von den Aminosäuren, die demgemäß als wirksam nachgewiesen wurden, wenn sie zugegeben werden, wurden L-Argininhydrochlorid, L-Lysinhydrochlorid und L-Histidinhydrochlorid auf die Wirkung ihrer jeweiligen Konzentrationen auf die Stabilisierung der Zubereitung untersucht. Das bedeutet, es wurden EPO-Zubereitungen hergestellt, zu denen L-Argininhydrochlorid, L-Lysinhydrochlorid oder L-Histidinhydrochlorid in verschiedenen Konzentrationen zugegeben wurden, und ein bei 40°C während 2 Wochen beschleunigter Test mit diesen Zubereitungen durchgeführt. Nach Beendigung des Tests tendierten die zurückbleibenden Anteile an EPO in den Zubereitungen zu Spitzenwerten bei Konzentrationen von etwa 1 bis 5 mg/ml in dem Fall von L-Argininhydrochlorid und L-Lysinhydrochlorid. Mit L-Histidinhydrochlorid wurde der maximale zurückbleibende Anteil an EPO bei einer Konzentration von 1 bis 10 mg/ml erzielt. Ein beschleunigter Test bei 25°C während 6 Monaten wurde auch mit EPO-Zubereitungen durchgeführt, zu denen L-Histidinhydrochlorid in verschiedenen Konzentrationen zugegeben wurde. Der maximale zurückbleibende Anteil an EPO wurde bei Konzentrationen von 0,5 bis 5 mg/ml erzielt. Diese Feststellungen zeigten, dass L-Argininhydrochlorid, L-Lysinhydrochlorid und L-Histidinhydrochlorid die optimale Konzentration der Zugabe haben.
Die erfindungsgemäße EPO-Lösungszubereitung ist eine sichere Zubereitung, die frei von fremden Proteinen, wie menschlichem Serumalbumin oder gereinigter Gelatine, ist und kein Risiko von Virenkontamination aufweist. Die Aminosäure, die zugegeben wird, ist billiger als die üblichen Stabilisatoren und die während des Herstellungsverfahrens auftretenden Kosten sind auch geringer, als die für ein lyophilisiertes Produkt. Deshalb ist die erfindungsgemäße Zubereitung wirtschaftlich vorteilhaft. Außerdem braucht die erfindungsgemäße Lösungszubereitung nicht in einem Puffer aufgelöst zu werden, sondern sie kann, wie sie vorliegt, verwendet werden. Das vermindert den Arbeitsaufwand bei der Verwendung im Vergleich mit einer lyophilisierten Zubereitung. Mit diesen verschiedenen Vorteilen weist die vorliegende Erfindung eine große industrielle Anwendbarkeit auf.
Die vorliegende Erfindung wird nun weiter ausführlich unter Bezugnahme auf die nachstehenden Beispiele beschrieben, aber der Schutzbereich wird dadurch nicht eingeschränkt.
Beispiele
Testverfahren
Ein 5 ml Glasfläschchen wurde mit 1 ml einer zubereiteten Lösung beschickt, die die nachstehenden Bestandteile/ml enthielt und mit einem 10 mM Phosphatpuffer (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) auf pH 6,0 eingestellt:

EPO 1500 IU

Nichtionisches grenzflächenaktives Mittel 0,05 mg

(Polysorbat 80, Nikko Chemical Co., Ltd.)

Natriumchlorid 8,5 mg

Aminosäure (Sigma Chemical Company) 0 bis 40 mg
Das gefüllte Glasfläschchen wurde zugestöpselt, versiegelt und als eine Lösungszubereitung verwendet. Zu einem beschleunigten Test wurde die Zubereitung zwei Wochen in einer thermostatischen Kammer bei 40°C stehen gelassen. Dann wurde die Zubereitung durch eine RP-HPLC-Analyse (WATERS) und eine SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophoreseanalyse ausgewertet.
Beispiel 1: Wirkung der Zugabe von verschiedenen Aminosäuren auf den zurückbleibenden Anteil von EPO
In Übereinstimmung mit dem vorstehenden Testverfahren wurden die Lösungszubereitungen, die verschiedene Aminosäuren enthielten, die nachstehend tabellarisch aufgeführt sind, hergestellt und dem beschleunigten Test bei 40°C während 2 Wochen unterworfen. Dann wurden ihre zurückbleibenden Anteile an EPO durch das RP-HPLC-Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1: Zurückbleibende Anteile an EPO nach einem beschleunigten Test von Lösungszubereitungen, die verschiedene Aminosäuren enthielten
Wie vorstehend gezeigt, führten L-Leucin, L-Tryptophan, Mononatrium-L-glutamatmonohydrat, L-Argininhydrochlorid, L-Histidinhydrochlorid und L-Lysinhydrochlorid zu besonders markanten zurückbleibenden EPO-Anteilen. Mononatrium-L-glutamatmonohydrat, L-Leucin, L-Phenylalanin, L-Cystein und L-Lysinhydrochlorid sind nicht durch den beanspruchten Gegenstand der vorliegenden Anmeldung umfasst.
Beispiel 2: Wirkung der Zugabe einer Aminosäure in verschiedenen Konzentrationen auf den zurückbleibenden Anteil an EPO
In Übereinstimmung mit dem vorstehenden Testverfahren wurden EPO-Lösungszubereitungen hergestellt, die L-Argininhydrochlorid in verschiedenen Konzentrationen enthielten, die nachstehend angegeben sind, und dem gleichen beschleunigten Test bei 40°C während 2 Wochen unterworfen. Dann wurden ihre zurückbleibenden Anteile an EPO durch das RP-HPLC-Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2: Zurückbleibende Anteile an EPO nach einem beschleunigten Test von Zubereitungen, die L-Argininhydrochlorid enthielten
Die vorstehenden Ergebnisse sind als graphische Darstellung in 1 dargestellt.
Wie vorstehend gezeigt, führte L-Argininhydrochlorid zu maximalen zurückbleibenden Anteilen an EPO in einem Konzentrationsbereich von etwa 1 bis 5 mg/ml.
Dann wurde der gleiche Test unter Verwendung von L-Lysinhydrochlorid durchgeführt. Die zugegebenen Mengen von L-Lysinhydrochlorid und die zurückbleibenen Anteile an EPO nach einem beschleunigten Test sind in Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3: Zurückbleibende Anteile an EPO nach einem beschleunigten Test von Zubereitungen, die L-Lysinhydrochlorid enthielten
Die vorstehenden Ergebnisse sind als graphische Darstellung in 2 dargestellt.
Wie vorstehend gezeigt, führte auch L-Lysinhydrochlorid zu maximalen zurückbleibenden Anteilen an EPO in einem Konzentrationsbereich von etwa 1 bis 5 mg/ml.
Dann wurde der gleiche Test unter Verwendung von L-Histidinhydrochlorid durchgeführt. Die zugegebenen Mengen von L-Histidinhydrochlorid und die zurückbleibenden Anteile an EPO nach einem beschleunigten Test sind in Tabelle 4 gezeigt.
Tabelle 4: Zurückbleibende Anteile an EPO nach einem beschleunigten Test von Zubereitungen, die L-Histidinhydrochlorid enthielten
Die vorstehenden Ergebnisse sind als graphische Darstellung in 3 dargestellt.
Wie vorstehend gezeigt, führte L-Histidinhydrochlorid zu maximalen zurückbleibenden Anteilen an EPO in einem Konzentrationsbereich von etwa 1 bis 10 mg/ml.
In Übereinstimmung mit dem vorstehend erwähnten Testverfahren wurden EPO-Lösungszubereitungen hergestellt, die L-Histidinhydrochlorid in verschiedenen Konzentrationen enthielten, die nachstehend angegeben sind, und einem beschleunigten Test bei 25°C während 6 Monaten unterworfen. Dann wurden die zurückbleibenden Anteile an EPO davon durch das RP-HPLC-Verfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 gezeigt.
Tabelle 5: Zurückbleibende Anteile an EPO nach einem beschleunigten Test von Zubereitungen, die L-Histidinhydrochlorid enthielten
Wie vorstehend gezeigt, führte L-Histidinhydrochlorid zu maximalen zurückbleibenden Anteilen an EPO in einem Konzentrationsbereich von etwa 0,5 bis 5 mg/ml, insbesondere bei einer Konzentration von 1 mg/ml.
Beispiel 3: Wirkung der Zugabe von verschiedenen Aminosäuren auf EPO-Abbauprodukte
In Übereinstimmung mit dem vorstehend erwähnten Testverfahren wurden EPO-Lösungszubereitungen hergestellt, die verschiedene Aminosäuren enthielten, und einem beschleunigten Test bei 40°C während 2 Wochen unterworfen. Dann wurde die Bildung von EPO-Abbauprodukten durch die Analyse durch SDS-Polyacrylamidgel-Elektrophorese untersucht.
1) Herstellung einer Probe
Nach dem beschleunigten Test wurde ein 1 M Tris-Hydrochloridpuffer (pH 6,8), der SDS, Glycerin und Bromphenolblau enthielt, zu jeder EPO-Lösungszubereitung zugegeben, wobei jede Lösungszubereitung verschiedene Aminosäuren enthielt, die in Tabelle 1 des Beispiels 1 angegeben sind. Das Gemisch wurde 15 Minuten bei 60°C zur Verwendung als eine Probenlösung erwärmt.
2) Elektrophorese
Die Probenlösung (10 μl) wurde unter den nachstehenden Arbeitsbedingungen der Elektrophorese unterworfen:

a) Ausrüstung: Platten-Gelelektrophoreseapparat (Bio-Rad Laboratories)
b) Elektrophoresegel: SDS-PAG Emini 8–16 (Gelkonzentrationsgradient in Polyacrylamid-Konzentrationen von 8 bis 16%, Tefco)
c) Temperatur der Elektrophorese: 25°C
d) Bedingungen der Elektrophorese: 25 mA Gleichstrom/Gel

3) Färbungsverfahren (Westernblot)
Das der Elektrophorese unterworfene Gel wurde auf eine Polyvinylidendifluoridmembran übertragen. Dann wurden Anti-EPO-Kaninchen-Antiserum, mit Biotin markierter Anti-Kaninchen IgG-Ziegen-Antikörper und biotinylierte Meerrettichperoxidase zur Farbentwicklung mit 3,3'-Diaminobenzidin-Wasserstoffperoxid als Substrat verwendet.
4) Ergebnisse
Die erhaltenen Ergebnisse sind in 4 gezeigt. Verglichen mit der von Aminosäure freien Zubereitung (Reihe 2) zeigte die Mononatrium-L-glutamatmonohydrat enthaltende Zubereitung (Reihe 8), die L-Argininhydrochlorid enthaltende Zubereitung (Reihe 9) und die L-Histidinhydrochlorid enthaltende Zubereitung (Reihe 10) die markante Wirkung der Unterdrückung der Bildung von EPO-Abbauprodukten.

Claims

Erythropoietinlösungszubereitung, welche eine oder mehrere Aminosäuren, ausgewählt aus Histidin, Tryptophan und Serin und deren Salzen, als Stabilisator enthält.
Lösungszubereitung gemäß Anspruch 1, wobei der Stabilisator eine oder mehrere Aminosäuren ist, ausgewählt aus L-Histidin, L-Tryptophan und L-Serin und deren Salzen.
Lösungszubereitung gemäß Anspruch 1, wobei der Stabilisator eine oder mehrere Aminosäuren ist, ausgewählt aus Histidin und Tryptophan und deren Salzen.
Lösungszubereitung gemäß Anspruch 1, wobei der Stabilisator Histidin und/oder dessen Salze ist.
Lösungszubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Konzentration der Aminosäure 0,1 bis 40 mg/ml beträgt.
Lösungszubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Konzentration des Histidins 0,5 bis 5 mg/ml beträgt.
Lösungszubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, welche keinen Harnstoff enthält.
Lösungszubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7, welche kein Protein als Stabilisator enthält.
Lösungszubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, welche weiterhin ein grenzflächenaktives Mittel enthält.
Lösungszubereitung gemäß Anspruch 9, wobei das grenzflächenaktive Mittel Polyoxyethylensorbitanalkylester ist.
Lösungszubereitung gemäß Anspruch 9, wobei das grenzflächenaktive Mittel Polysorbat 20 und/oder 80 ist.
Lösungszubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 11, welches weiterhin ein Salz enthält.
Lösungszubereitung gemäß Anspruch 12, wobei das Salz Natriumchlorid ist.
Lösungszubereitung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 13, welche in einem Puffer gelöst ist.
Lösungszubereitung gemäß Anspruch 14, wobei der Puffer ein Phosphatpuffer und/oder ein Citratpuffer ist.
Verfahren zum Stabilisieren einer Erythropoietinlösungszubereitung, welches Zugeben eines Stabilisators, der eine oder mehrere aus Tryptophan, Histidin und Serin und deren Salzen ausgewählte Aminosäuren enthält, zu der Erythropoietinlösungszubereitung umfasst.
Verfahren zum Stabilisieren einer Erythropoietinlösungszubereitung, welches Zugeben eines Stabilisators, der eine oder mehrere aus Tryptophan, Serin, Arginin und Histidin und deren Salzen ausgewählte Aminosäuren enthält und der keinen Harnstoff enthält, zu der Erythropoietinlösungszubereitung umfasst.
Verwendung einer oder mehrerer Aminosäuren, ausgewählt aus Tryptophan, Serin, Arginin und Histidin und deren Salzen, als Stabilisator für eine Erythropoietinlösungszubereitung, wobei die Erythropoietinlösungszubereitung keinen Harnstoff enthält.