DE69725878T2

DE69725878T2 - Zusammensetzungen zur polynukleotidabgabe

Info

Publication number: DE69725878T2
Application number: DE69725878T
Authority: DE
Inventors: Ronald Zukermann; Nathalie Dubois-Stringfellow; Varavani Dwarki; A. Michael INNIS; E. John MURPHY; Fred Cohen; Tetsuo Uno
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1996-08-13
Filing date: 1997-08-13
Publication date: 2004-07-29
Anticipated expiration: 2017-08-14
Also published as: DE69725878D1; EP0941122B1; CA2264012C; US20030185890A1; WO1998006437A3; JP4320054B2; US6468986B1; US20080089938A9; CA2264012A1; ATE252914T1; WO1998006437A2; EP0941122A2; US7462592B2; US6251433B1; JP2006257088A; JP2001503385A

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf Zusammensetzungen zur Verstärkung der Aufnahme von Polynukleotiden in Zellen. Die Erfindung bezieht sich spezifischerweise auf polykationische Agentien. Die polykationischen Agentien sind fähig, (1) die Häufigkeit der Aufnahme von Polynukleotiden in eine Zelle zu erhöhen, (2) Polynukleotide zu kondensieren und (3) den Serum- und/oder Nuklease-Abbau von Polynukleotiden zu hemmen.
Hintergrund der Erfindung
Polykationen, z. B. Polylysin, wurden verwendet um die Abgabe von Nukleinsäuren ins Zellinnere zu erleichtern. Diese Eigenschaft haben sowohl in vitro- als auch in vivo-Anwendungen genutzt. Siehe z. B. Gao et al., 1996, Biochem. 35: 1027–1036.
Polynukleotide, typischerweise DNA, können über einen Rezeptor-vermittelten Endocytose-Stoffwechselweg, einen zellulären Mechanismus, der spezifische Makromoleküle einführt, in eine Zelle aufgenommen werden. Im Allgemeinen enthalten Komplexe, die entwickelt wurden um in dieser Weise abgegeben zu werden, Nukleinsäuren, die für das Gen von Interesse codieren, und ein polykationisches Agens, das als ein DNA-bindender Träger wirkt und sowohl die Ladung an den Nukleinsäuren neutralisiert, als auch kondensiert.
Eine Kondensation erleichtert den Eintritt von Nukleinsäuren in Zellvesikelsysteme durch Simulieren einer makromolekularen Struktur. Beispielsweise kondensiert Polylysin DNA zu einer Toroid- oder Doughnut-artigen Struktur. (Wagener et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. 88: 4255–4259).
Polykationen, die früher zur Nukleinsäureabgabe in das Zellinnere verwendet wurden, umfassen Polylysin, Protamine, Histone, Spermin, Spermidin, Polyornithin, Polyarginin und Putrescin.
Zusammenfassung der Erfindung
Eine Ausführungsform der Erfindung ist ein polykationisches Agens, das eine positive elektrische Nettoladung bei physiologischem pH aufweist und die folgende Formel hat:
worin:
n eine ganze Zahl von 10 bis 100 ist;
für jedes Monomer:
R₂ und R₃ Wasserstoff sind und R₁ unabhängig aus Gruppierungen, die ein Molekulargewicht von 1 bis 200 Dalton haben, ausgewählt ist;
wobei das polykationische Agens repetitive Trimere umfasst, so dass zwei R₁-Gruppen in jedem Trimer neutrale Gruppierungen sind und eine R₁-Gruppe in jedem Trimer eine kationische Gruppierung ist;
Ta und Tc Terminierungsgruppen sind; und
R₁ für mindestens ein Monomer nicht Wasserstoff ist. Noch bevorzugter sind Polymere, die mindestens eine unnatürliche Aminosäure umfassen.
Eine Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung, umfassend das polykationische Agens und ein Polynukleotid, wobei das polykationische Agens fähig ist, einen Eintritt eines Polynukleotids in eine Zelle zu vermitteln. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Verfahren zur Komplexierung eines Polynukleotids mit einem polykationischen Agens, wobei das Verfahren umfasst:

(i) Bereitstellen eines Polynukleotids und
(ii) In-Kontakt-Bringen des Polynukleotids mit dem erfindungsgemäßen polykationischen Agens.

Die erfindungsgemäßen polykationischen Agentien sind fähig, die elektrische Ladung von Nukleinsäuren zu neutralisieren. Eine Untergruppe dieser Verbindungen ist fähig, (1) die Struktur von Polynukleotiden zu kondensieren und/oder (2) Polynukleotide vor Serumund/oder Nuklease-Abbau zu schützen.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung sind polykationische Agentien, die (1) auf die Bindung von Nukleinsäuren an Zelloberflächen abzielen; (2) eine Zellmembrandestabilisierung auslösen; (3) Endosomen-Pufferungs-Kapazität aufweisen; (4) Endocytose auslösen; (5) die Auslösung der Freisetzung von Polynukleotid/Lipid-Komplexen aus Endosomen unterstützen oder (6) Kerntropismus aufweisen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung, die ein Polynukleotid von Interesse und eine wirksame Menge des polykationischen Agenzes zur Neutralisierung der Ladung des Polynukleotids umfasst, zur Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der Häufigkeit einer Polynukleotidaufnahme in eine Zelle durch In-Kontakt-Bringen der Zusammensetzung mit der Zelle. Gegebenenfalls umfasst die Zusammensetzung einen Liganden, der den Komplex zu besonderen Zellen steuert, die einen Liganden-Bindungspartner exprimieren, und/oder ein endosomolytisches Agens, das dazu dient, ein Aufbrechen des Endosoms, das den Komplex enthält, zu verursachen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zum Kondensieren eines Polynukleotids durch Bereitstellen einer wirksamen Menge der polykationischen Agentien der Erfindung und In-Kontakt-Bringen des Agenzes mit dem gewünschten Polynukleotid in einer Menge, die ausreicht um die Größe des Polynukleotids zu reduzieren.
Auch eine Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Inhibierung des Serum-Abbaus eines Polynukleotids durch In-Kontakt-Bringen des Polynukleotids mit dem erfindungsgemäßen polykationischen Agens, wobei das polykationische Agens in einer Menge vor liegt, die wirksam ist um den Serum-Abbau des Polynukleotids mindestens 10 Minuten zu inhibieren.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Erleichterung des Eintritts eines Polynukleotids in eine Zelle, wobei das Verfahren umfasst:

(i) In-Kontakt-Bringen eines Polynukleotids mit dem erfindungsgemäßen polykationischen Agens in einer Menge, die wirksam ist um das Polynukleotid zu neutralisieren, unter Bildung eines Komplexes und
(ii) In-Kontakt-Bringen des Komplexes mit einem Lipoprotein. Eine Ausführungsform der Erfindung ist eine Zusammensetzung, umfassend:
(i) Ein Lipoprotein;
(ii) das oben genannte polykationische Agens; und
(iii) ein Polynukleotid, wobei die Zusammensetzung fähig ist, die Häufigkeit einer Polynukleotidaufnahme in eine Zelle zu erhöhen.

Eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Häufigkeit der Polynukleotidaufnahme in eine Zelle durch In-Kontakt-Bringen einer Zelle mit einer Zusammensetzung, die umfasst: (i) ein Lipoprotein, (ii) das erfindungsgemäße polykationische Agens, und (iii) ein Polynukleotid.
Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung ist ein Verfahren zur Erhöhung der Häufigkeit der Aufnahme von Polynukleotiden in einen spezifischen Zelltyp durch In-Kontakt-Bringen einer Zellpopulation mit einer Zusammensetzung, die (i) ein Lipoprotein; (ii) ein Polynukleotid-bindendes Molekül; und (iii) ein Polynukleotid umfasst.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 ist ein Schema einer Monomer-Anfügungsreaktion in zwei Schritten.
2 ist ein Schema einer Monomer-Anfügungsreaktion in drei Schritten.
3 ist eine Plasmidkarte von Vektor pCMVKmITR-EP1.
4 ist eine Plasmidkarte von Vektor CMVkm2.
5 ist eine Plasmidkarte von Vektor pCMV-KM-cmEPO.
6 ist eine Plasmidkarte von Vektor CMVKmLeptinWt.
7A veranschaulicht die Transfektionseffizienz für einen unterschiedlichen Satz polykationischer Agentien. Die polykationischen Agentien wurden mit DNA in einem + zu – Ladungsverhältnis von 2 : 1 formuliert und entweder zu HT1080 (ausgefüllter Balken) oder COS (gepunkteter Balken) in Gegenwart von 10% Serum gegeben. Die Luciferaseaktivität wurde 48 Stunden nach Transfektion analysiert. Das Gesamtzellprotein wurde unter Anwendung eines Pierce-BCA-Assays gemessen, und die Luciferaseaktivität wurde gegen Gesamtzellprotein normalisiert.
7B veranschaulicht den Effekt der Oligomerlänge auf die Transfektionseffizienz von polykationischen Agentien, die verschiedene Anzahlen derselben Trimer-Repetiergruppe haben. Sowohl für A, als auch B stellt jeder Datenpunkt den Durchschnitt von zwei Experimenten dar.
8(A–C) zeigt eine durch RZ145-1-Peptoid-vermittelte Transfektion und eine Transfektion, die durch im Handel verfügbare kationische Liposomenpräparationen vermittelt wurde. RZ145-1 oder das angegebene Lipid wurde formuliert und in Gegenwart (ausgefüllter Balken) oder Abwesenheit (gepunkteter Balken) von 10% Serum zu Zellen gegeben. 48 Stunden nach der anfänglichen Transfektion wurden die Luciferase- und die Gesamtzellproteinaktivität gemessen. Zelllinien sind (8A) humane Embryonen-Nierenzellen 293, (8B) humane HT1080-Fibrosarkomzellen und (8C) Maus-NIH03T3-Fibroblastenzellen. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert plus Standardabweichung des Mittels aus drei Transfektionen dar.
9 veranschaulicht den Effekt von Chloroquin auf die Transfektion mit RZ145-1 in (A) 293-Zellen und (B) HT1080-Zellen. Die Zellen wurden in Gegenwart (schwarzer Balken) oder Abwesenheit (gepunkteter Balken) von 100 μM Chloroquin transfiziert. Die Zellen wurden 48 Stunden nach der Transfektion lysiert, und die Luciferaseaktivität und der Gesamtproteingehalt wurden gemessen.
Detaillierte Beschreibung
Definitionen
"Lipoproteine" bezeichnen Polypeptide, die nicht-kovalent mit Lipiden im Blutstrom assoziiert sind und zur Bindung an zelluläre Rezeptoren fähig sind. Vorzugsweise sind Lipoproteine solche, die beim Transport und der Lagerung von Lipiden involviert sind. Solche Proteine umfassen z. B. Chylomikrone, Lipoprotein niedriger Dichte (LDL), Lipoprotein sehr niedriger Dichte (VLDL), Lipoprotein mittlerer Dichte (IDL) und Lipoprotein hoher Dichte (HDL). In dem Ausdruck mit umfasst werden auch Mutanten, Fragmente oder Fusionen der natürlich auftretenden Lipoproteine. Es können auch Modifikationen von natürlich auftretenden Lipoproteinen, z. B. acetyliertes LDL, verwendet werden.
Mutanten, Fragmente, Fusionen oder Modifikationen der natürlich vorkommenden Lipoproteine sind Aminosäuresequenzen, die wesentliche Sequenzintensität zu den natürlich vorkommenden Lipoproteinen oder einem Fragment davon aufweisen. Diese Polypeptide werden mehr als etwa 80% Aminosäureidentität, typischer mehr als etwa 85% und noch typischer mindestens 90% Aminosäureidentität beibehalten. Vorzugsweise werden diese Polypeptide mehr als etwa 92% Aminosäuresequenzidentität mit natürlich auftretenden Lipoproteinen oder einem Fragment davon, bevorzugter mehr als etwa 94%, noch bevorzugter mehr als etwa 96%, noch weiter bevorzugt mehr als 98%, noch weiter bevorzugt mehr als 99%, Aminosäuresequenzidentität mit natürlich vorkommenden Lipoproteinen oder einem Fragment davon aufweisen. Alle diese Polypeptide weisen Rezeptorbindungseigenschaften natürlich vorkommender Lipoproteine auf. Üblicherweise weisen solche Polypeptide mindestens etwa 20% Rezeptorbindung von natürlich vorkommenden Lipoproteinen auf. Typischer weisen die Polypeptide mindestens etwa 40%, noch typischer weisen die Polypeptide mindestens etwa 60%, noch typischer mindestens 70%, noch typischer mindestens etwa 80%, noch typischer mindestens etwa 85%, noch typischer mindestens etwa 90%, noch typischer mindestens etwa 95% der Rezeptorbindung der natürlich vorkommenden Lipoproteine auf.
"Polynukleotid-bindendes Molekül" betrifft solche Verbindungen, die mit Polynukleotiden assoziieren; die Assoziation ist nicht sequenzspezifisch. Beispielsweise können solche Moleküle (1) die Neutralisierung der elektrischen Polynukleotidladung unterstützen oder (2) eine Kondensation von Nukleotiden erleichtern oder (3) Serum- oder Nuklease-Abbau inhibieren. "Polykationisches Agens" bezieht sich allgemein auf ein Polymer, das einzelne positiv geladene Einheiten umfasst, obgleich auch einige nicht-positiv geladene Einheiten im Polymer vorliegen können. Die erfindungsgemäßen Agentien weisen bei physiologischem pH eine positive elektrische Nettoladung auf. Solche Agentien sind fähig, die Ladung von Nukleinsäuren zu neutralisieren und können zusätzliche Eigenschaften, z. B. Kondensation und/oder Serumschutz von Nukleinsäuren, aufweisen. Vorzugsweise umfassen die Agentien sowohl Aminosäuren, als auch NSGs als Monomereinheiten; bevorzugt sind auch Agentien, die NSGs als monomere Einheiten umfassen.
Der "physiologisch relevante pH" variiert zwischen in vitro- und in vivo-Anwendungen etwas. Typischerweise ist der physiologische pH mindestens 5,5, typischer mindestens 6,0, noch typischer mindestens 6,5. Üblicherweise ist der physiologisch relevante pH nicht höher als 8,5, noch üblicher nicht höher als 8,0, noch üblicher nicht höher als 7,5.
"Polynukleotid" oder "Nukleinsäure" bezieht sich auf DNA, RNA, Analoga davon, Peptid-Nukleinsäuren und DNA oder RNA mit nicht-Phosphat enthaltenden Nukleotiden. Außerdem können diese Nukleinsäuren einzelsträngige, doppelsträngige oder chimäre einzel- oder doppelsträngige Moleküle sein.
Der Ausdruck "Oligomer" umfasst Polymere, wie z. B. Poly-NSGs, hergestellt durch das Submonomerverfahren, das hierin und auch bei Zuckermann et al., oben, beschrieben ist, und umfasst Polymere, Copolymere und Interpolymere beliebiger Länge. Spezifischer können Oligomere ein einzelnes Repetiermonomer, zwei alternierende Monomereinheiten, zwei oder mehr Monomereinheiten, die statistisch verteilt sind und/oder im beliebigen Abstand voneinander verteilt sind, umfassen. Ungeachtet des produzierten Polyamidtyps kann das erfindungsgemäße Polyamid durch dasselbe allgemeine Verfahren produziert werden, welches ein Wiederholen eines Zwei-Stufen- oder Drei-Stufen-Zyklus beinhaltet, wobei in jedem Zyklus eine neue Monomereinheit zugesetzt wird, bis ein Oligomer gewünschter Länge erhalten wird. Das Oligomer hat vorzugsweise eine Länge von 10 bis 100 Monomeren, bevorzugter von 10 bis 50 oder von 18 bis 28 Monomeren oder 24 bis 48 Monomeren.
Der Ausdruck "Häufigkeit der Aufnahme von Polynukleotiden in eine Zelle" bezieht sich auf die Zunahme in der Menge von Polynukleotiden, die tatsächlich durch die Zelle aufgenommen werden, bezogen auf die Menge, die an die Zelle verabreicht wird. Die Häufigkeit der Aufnahme von Polynukleotiden in eine Zelle ist erhöht, wenn sie höher ist als die Häufigkeit der Aufnahme von nackten Polynukleotiden. Unter Verwendung von in vitro-Transfektionsverfahren ist beispielsweise die Aufnahme von nackten Polynukleotiden in Säugetierzellen gegenüber dem Hintergrund üblicherweise nicht detektierbar. Eine gewisse Häufigkeit der Aufnahme kann allerdings nachgewiesen werden, wenn nackte Polynukleotide in vivo abgegeben werden. Die Häufigkeit der Aufnahme in vivo und in vitro hängt vom Gewebetyp ab. Die Häufigkeit der Aufnahme kann durch bekannte Verfahren zur Detektion des Vorliegens von Nukleotiden gemessen werden, z. B. durch Northern-, Southern- oder Polymerase-Kettenreaktions(PCR)-Techniken.
Üblicherweise ist eine Zusammensetzung oder Verbindung fähig, die Häufigkeit der Polynukleotidaufnahme in eine Zelle zu erhöhen, wenn sie eine Häufigkeit der Aufnahme induziert, die mindestens 10% größer, üblicherweise mindestens 15% größer, noch üblicher 20% größer, noch üblicher mindestens 30% größer und bis zu 40% und bis zu 100% und sogar bis 1.000% und 10.000% größer ist als die Häufigkeit der Aufnahme von nacktem Polynukleotid.
Der Ausdruck "nackte Polynukleotide" betrifft Polynukleotide, die im Wesentlichen frei von einem Abgabevehikel sind, welches in der Weise wirkt, dass es den Eintritt in die Zelle erleichtert. Beispielsweise sind Polynukleotide nackt, wenn sie frei von einem Material sind, das eine Transfektion begünstigt, wie z. B. liposomale Formulierungen, geladene Lipide, z. B. Lipofectin^®, oder präzipitierende Mittel, wie Ca₃(PO₄)₂.
"Wirksame Menge um die Häufigkeit einer Polynukleotidaufnahme in Zellen zu erhöhen" bezeichnet eine Menge, die eine Häufigkeit der Polynukleotidaufnahme in eine Zelle induziert, die mindestens 10% größer, üblicher mindestens 15% größer, noch üblicher 20% größer, noch üblicher mindestens 30% größer und sogar noch üblicher mindestens 40% größer ist als die Frequenz der Aufnahme von nacktem Polynukleotid.
"Menge, die wirksam ist um Nukleinsäuren zu neutralisieren" bezieht sich auf die Menge, die verwendet wird um mindestens 10% der elektrischen Ladung der Nukleinsäurezusammensetzung zu neutralisieren; bevorzugter bezieht sich der Ausdruck auf die Menge, die verwendet wird um mindestens 40% zu neutralisieren, noch bevorzugter die Menge um 50% der elektrischen Ladung zu neutralisieren, noch bevorzugter die Menge um 60% der elektrischen Ladung zu neutralisieren, noch bevorzugter die Menge um 70% der elektrischen Ladung zu neutralisieren, sogar noch bevorzugter die Menge um 80% der elektrischen Ladung zu neutralisieren, und am vorteilhaftesten die Menge um mindestens 90% der elektrischen Ladung der interessierenden Nukleinsäurezusammensetzung zu neutralisieren.
Eine "Kondensation von Nukleinsäuren" tritt auf, wenn das polykationische Agens, das mit Nukleinsäuren kombiniert wird, die elektrische Ladung der Nukleinsäuren neutralisiert und bewirkt, dass sie im Vergleich zu nicht-komplexierten Nukleinsäuren eine reduzierte Struktur annehmen. Vorzugsweise reduziert eine Kondensation die Struktur von Nukleinsäuren auf eine Größe, die durch Strukturen, die an Zelloberflächenmembranen vorliegen, ins Innere aufge nommen werden kann. Eine Kondensation kann gemessen werden, indem die Ladung des Komplexes Nukleinsäure/polykationisches Agens z. B. durch Elektrophorese gemessen wird. Alternativ kann eine wirksame Menge zum Kondensieren von Nukleinsäuren auch durch die Endgröße des polykationisches Agens/Nukleinsäure-Komplexes gemessen werden.
"Wirksame Menge um einen Serum- oder Nuklease-Abbau von Nukleinsäuren zu inhibieren" bezieht sich auf die Menge, die verwendet wird um die Halbwertszeit des Polynukleotids, wenn dieses Serum- und/oder Nukleasen ausgesetzt ist, um mindestens 10 Minuten zu erhöhen; noch bevorzugter die Menge, die verwendet wird um den Abbau um mindestens 30 Minuten zu verzögern; noch bevorzugter die Menge, die verwendet wird um einen Abbau um mindestens 45 Minuten zu verzögern; noch bevorzugter die Menge, die verwendet wird um einen Abbau um mindestens 60 Minuten zu verzögern; noch bevorzugter die Menge, die verwendet wird um einen Abbau um mindestens 90 Minuten zu verzögern, und vorzugsweise die Menge, die verwendet wird um einen Abbau um mindestens 120 Minuten zu verzögern.
Eine Zusammensetzung, die A enthält, ist "im Wesentlichen frei von" B, wenn mindestens 85 Gew.-% der Summe A + B in der Zusammensetzung A ist. Vorzugsweise umfasst A mindestens etwa 90 Gew.-% der Summe A + B in der Zusammensetzung, bevorzugter mindestens etwa 95% oder sogar 99 Gew.-%.
"Immunogenität" bezieht sich auf die Fähigkeit eines gegebenen Moleküls oder einer Determinanten davon, die Erzeugung von Antikörpern mit Bindungskapazität für das Molekül nach Verabreichung in vivo zu induzieren, eine cytotoxische Antwort zu induzieren, das Komplementsystem zu aktivieren, allergische Reaktionen zu induzieren, und dergleichen. Eine Immunantwort kann durch Assays, die den Level spezifischer Antikörper im Serum messen, durch Assays, die das Vorliegen einer Serumkomponente, welche den polykationisches Agens/Nukleinsäure-Komplex oder ein konjugiertes Genabgabevehikel inaktiviert, oder durch andere Assays, die eine spezifische Komponente oder Aktivität des Immunsystems messen, gemessen werden. Wie unten detaillierter diskutiert wird, kann durch diese Assays eine niedrige Immunogenität entwickelt werden. Die Ausdrücke "niedrige Immunogenität", "reduzierte Immunogenität", "erniedrigte Immunogenität", und ähnliche Ausdrücke, sollen äquivalente Ausdrücke darstellen.
Ein "Replikationsursprung" ist eine Polynukleotidsequenz, die eine Replikation von Polynukleotiden initiiert und reguliert, z. B. ein Expressionsvektor. Der Replikationsursprung verhält sich als autonome Einheit der Polynukleotidreplikation in einer Zelle, die zur Replikation unter ihrer eigenen Kontrolle fähig ist. Mit bestimmten Replikationsursprüngen kann ein Expressionsvektor in Gegenwart geeigneter Proteine in der Zelle mit hoher Kopienzahl reproduziert werden. Beispiele für Ursprünge sind die 2 μ- und autonom replizierende Sequenzen, die in Hefe wirksam sind, sowie das virale T-Antigen, das in COS-7-Zellen wirksam ist.
Allgemeine Verfahren und detaillierte Beschreibung
POLYNUKLEOTIDE
Polynukleotide, die zur Verwendung in der vorliegende Erfindung geeignet sind, können verwendet werden um gewünschte Polypeptide zu exprimieren, oder können selbst therapeutisch sein, z. B. Ribozyme oder Antisense-Polynukleotide. Solche Polynukleotide können in in vitro-, ex vivo- und in vivo-Anwendungen eingesetzt werden.
Die Polynukleotide können Vektoren sein, die Polypeptide, Ribozyme oder Antisensemoleküle exprimieren. Vektoren enthalten mindestens einen Promotor zur Transkriptionsinitiation funktionell an die codierende Region, Riboszym oder Antisensemolekül gebunden. Andere Komponenten, die im Vektor enthalten sein können, sind z. B.: (1) eine Terminatorsequenz; (2) eine Sequenz, die für ein Leaderpeptid zur Steuerung der Sekretion codiert; (3) ein selektierbarer Marker, und (4) ein Replikationsursprung. Ein Replikationsursprung ist nicht notwendig. Die abzugebenden Polynukleotide können entweder replizierend oder nicht-replizierend sein. Wenn es gewünscht wird und zweckdienlich ist, können andere Komponenten zugesetzt werden.
Die Polynukleotide und Verfahren der Erfindung können mit einem beliebigen Wirtszelltyp verwendet werden. Die Auswahl von Promotor, Terminator und anderen fakultativen Elementen eines Expressionsvektors wird von der gewählten Wirtszelle abhängen. Die Erfindung ist von der ausgewählten Wirtszelle nicht abhängig. Zweckdienlichkeit und der gewünschte Level der Proteinexpression werden die optimale Wirtszelle diktieren. Auf dem Fachgebiet ist eine Vielzahl von Wirten zur Expression bekannt, und von der American Type Culture Collection (ATCC) (Rockville, Maryland, U.S.A.) erhältlich. Geeignete Bakterienwirte umfassen, ohne Beschränkung: Campylobacter, Bacillus, Escherichia, Lactobacillus, Pseudomonas, Staphylococcus und Streptococcus. Hefewirte der folgenden Gattungen können verwendet werden: Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces und Yarrowia, Aedes aegypti, Bombys mori, Drosophila melanogaster und Spodoptera frugiperda (PCT-Patent-Publikation Nr. WO 89/046699; Carbonell et al., 1985, J. Vitrol. 56: 153; Wright, 1986, Nature 321: 718; Smith et al., 1983, Mol. Cell. Biol. 3: 2156; und siehe allgemein Fraser et al., 1989, In Vitro Cell. Dev. Biol. 25: 225).
Verwendbare Säugezelltypen für in vitro-Anwendungen umfassen z. B. solche Zelllinien, die von der American Type Culture Collection (ATCC) erhältlich sind, Eierstockzellen von chinesischen Hamstern (Chinese hamster ovary (CHO)), HeLa-Zellen, Baby-Hamsternieren (BHK)-Zellen, Affennierenzellen (COS), humane hepatozelluläre Karzinomzellen (z. B. Hep G2), humane Embryonen-Nierenzellen, Babyhamster-Nierenzellen, Maus-Sertoli-Zellen, Kaninchen-Nierenzellen, Buffalo-Ratten-Leberzellen, humane Lungenzellen, humane Leberzellen, mammäre Tumorzellen von der Maus, sowie andere.
Für in vivo- oder ex vivo-Anwendungen einsetzbare Zelltypen umfassen, ohne Beschränkung, einen beliebigen Gewebetyp, z. B. Muskel-, Haut-, Hirn-, Lungen-, Liter-, Milz-, Blut-, Knochenmark-, Thymus-, Herz-, Lymph-, Knochen-, Knorpel-, Pankreas-, Nieren-, Gallenbla sen-, Magen-, Darm-, Hoden-, Eierstock-, Uterus-, Rektum-, Nervensystem-, Augen-, Drüsengewebe und Bindegewebe.
A. In vitro- und ex vivo-Vektoren
Die Polynukleotide, die für die gewünschten Polypeptide oder Ribozyme codieren, oder Antisense-Polynukleotide, können unter Verwendung der folgenden Promotoren und Enhancer als Beispiele transkribiert und/oder translatiert werden. Die Beispiele umfassen ohne Beschränkung: das 422(aP2)-Gen und das Stearoyl-Co-A-Desaturase 1 (SCD1)-Gen, das geeignete Adipozyten-spezifische Promotoren enthält, wie es von Christy et al., 1989, Genes Dev. 3: 1323– 1335, beschrieben ist. Synthetische, nicht-natürliche Promotoren oder Hybridpromotoren können hier ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise kann ein T7T7/T7-Promotor konstruiert und gemäß Chen et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 2114–2120, verwendet werden, wobei die T7-Polymerase unter der Regulationskontrolle ihres eigenen Promotors steht und die Transkription einer Polynukleotidsequenz steuert, die unter die Kontrolle eines anderen T7-Promotors gestellt ist. Die primäre Determinante für die Fett-spezifische Expression ist ein Enhancer, der bei etwa > 5 kb stromaufwärts der Transkriptions-Startstelle lokalisiert ist, wie es in Ross et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 87: 9590–9594 und Graves et al., 1991, Genes Dev. 5: 428– 437, beschrieben ist. Zur Verwendung hier ist auch das Gen für das CCAAT/Enhancerbindende Protein C/EBPα, das in hohem Maße exprimiert wird, wenn 3T3-L1-Adioblast in den Differenzierungsstoffwechselweg und in reife post-mitotische Adipozyten übertragen wird, wie es bei Birkenmeier et al., 1989, Gene Dev. 3: 1146–1156, beschrieben wird, geeignet. Der kürzlich isolierte Transkriptionsfaktor PPARγ2, der ausschließlich in Adipozytengeweben exprimiert wird, wie es von Tontonoz et al., 1994, Cell 79: 1147–1156, beschrieben wird, kann hier ebenfalls verwendet werden.
Typische Promotoren für die Säugetierzellexpression umfassen den frühen SV40-Promotor, den CMV-Promotor, den mammären Maustumor-Virus-LTR-Promotor, den späten Adenovirus-Hauptpromotor (Ad MLP) und den Herpes simplex-Virus-Promotor als Beispiele. Andere nicht-virale Promotoren, z. B. ein Promotor, der aus dem murinen Metallothionein-Gen stammt, wird in Säugetierkonstrukten ebenfalls Verwendung finden. Eine Expression kann entweder konstitutiv oder reguliert (induzierbar) sein, und zwar in Abhängigkeit vom Promotor. Typischerweise werden auch Transkriptionsterminations- und Polyadenylierungssequenzen vorliegen, die bezüglich des Translations-Stopkodons 3' lokalisiert sind. Vorzugsweise ist auch eine Sequenz zur Optimierung der Translationsinitiation, lokalisiert 5' zur codierenden Sequenz, vorhanden. Beispiele für Transkriptionsterminator/Polyadenylierungssignale umfassen die, die vom SV40 stammen, wie es in Sambrook et al., 1989, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", zweite Ausgabe, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York, beschrieben ist. Introns, die Spleißdonor- und -akzeptorstellen enthalten, können auch in die Konstrukte eingebaut werden.
Enhancer-Elemente können hier ebenfalls verwendet werden um Expressionslevel der Säugerkonstrukte zu erhöhen. Beispiele umfassen den Gen-Enhancer des frühen SV40, wie er in Dijkema et al., 1985, EMBO J. 4: 761, beschrieben ist, und den Enhancer/Promotor, der aus der langen terminalen Wiederholung (LTR) des Rous Sarcoma Virus stammt, was in Gorman et al., 1982b, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 79: 6777, beschrieben ist, und humanes Cytomegalovirus, das in Boshart et al., 1985, Cell 41: 521, beschrieben ist. Es kann auch eine Leadersequenz vorliegen, die eine Sequenz umfasst, welche für ein Signalpeptid codiert, um so für die Sekretion des Fremdproteins in Säugerzellen zu sorgen. Vorzugsweise gibt es Prozessierungsstellen, die zwischen dem Leaderfragment und dem interessierenden Gen codiert sind, so dass die Leadersequenz entweder in vivo oder in vitro gespalten werden kann.
Andere regulatorische Regionen aus Viren können in den Polynukleotiden enthalten sein um Transkriptions- und Translationslevel zu erhöhen oder die Dauer der Transkription und Translation zu erhöhen. Beispielsweise können die langen terminalen Wiederholungen von HIV eingeschlossen sein. Alternativ können die invertierten terminalen Wiederholungen des Epstein-Barr-Virus eingesetzt werden.
Es gibt Expressionsvektoren, die für die transiente Expression von DNA, die für das Ziel-Polypeptid codiert, in Säugetierzellen sorgen. Im Allgemeinen beinhaltet eine transiente Expression die Verwendung eines Expressionsvektors, der fähig ist, effizient in einer Wirtszelle zu replizieren, so dass die Wirtszelle viele Kopien des Expressionsvektors akkumuliert und dann wieder hohe Level eines gewünschten Polypeptids, das vom Expressionsvektor codiert wird, synthetisiert. Transiente Expressionssysteme, die einen geeigneten Expressionsvektor und eine Wirtszelle umfassen, erlauben die zweckdienliche positive Identifizierung von Polypeptiden, die durch clonierte DNAs codiert werden, wie auch die schnelle Durchmusterung solcher Polypeptide auf gewünschte biologische oder physiologische Eigenschaften. Somit sind transiente Expressionssysteme zu Zwecken einer Identifizierung von Analoga und Varianten des Ziel-Polypeptids, die Ziel-Polypeptid-artige Aktivität haben, besonders nützlich.
B. In vivo-Vektoren
Zur Abgabe unter Verwendung viraler Vektoren kann eine ganze Reihe viraler Vektoren verwendet werden, wie sie in Jolly, 1994, Cancer Gene Therapy 1: 1–64, beschrieben werden. Beispielsweise kann die codierende Sequenz eines gewünschten Polypeptids oder von Ribosomen oder Antisensemolekülen in Plasmide insertiert werden, welche zur Transkription und/oder Translation in retroviralen Vektoren, wie in Kumura et al., 1994, Human Gene Therapy 5: 845– 852, beschrieben, adenoviralen Vektoren, wie in Connelly et al., 1995, Human Gene Therapy 6: 185–193, beschrieben, Adeno-assoziierte virale Vektoren, wie in Kaplitt et al., 1994, Nature Genetics 6: 148–153, beschrieben, und Sindbisvektoren konzipiert sind. Promotoren, die zur Verwendung mit diesen Vektoren geeignet sind, umfassen die retroviralen Moloney-LTR, den CMV-Promotor und den Maus-Albumin-Promotor. Replikations-kompetentes freies Virus kann produziert werden und direkt in das Tier oder den Menschen injiziert werden oder durch Trans duktion einer autologen Zelle ex vivo, gefolgt von einer Injektion in vivo, verabreicht werden, wie es in Zatloukal et al., 1994, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 91: 5148–5152, beschrieben ist.
Das Polynukleotid, das für ein gewünschtes Polypeptid oder Ribozym codiert, oder Antisense-Polynukleotid kann zur Expression des gewünschten Polypeptids in vivo auch in Plasmid insertiert werden. Für eine in vivo-Therapie kann die codierende Sequenz direkt durch Injektion in Gewebe oder über orale Verabreichung als Aerosol abgegeben werden. Promotoren, die zur Verwendung auf diese Weise geeignet sind, umfassen endogene und heterologe Promotoren, z. B. CMV. Ferner kann ein synthetischer T7T7/T7-Promotor gemäß Chen et al., 1994, Nucleic Acids Res. 22: 2114–2120, konstruiert werden, worin die T7-Polymerase unter der regulatorischen Kontrolle ihres eigenen Promotors steht und die Transkription der Polynukleotidsequenz steuert, die auch unter die Kontrolle eines T7-Promotors gestellt ist. Das Polynukleotid kann in eine Formulierung injiziert werden, die die codierende Sequenz stabilisieren kann und eine Transduktion derselben in Zellen unterstützen kann und/oder ein Targeting liefern kann, wie es in Zhu et al., 1993, Science 261: 209–211, beschrieben ist.
Eine Expression der codierenden Sequenz eines gewünschten Polypeptids oder die Replikation eines Ribozym- oder Antisense-Polynukleotids in vivo nach Abgabe zu Gentherapiezwecken durch entweder virale oder nicht-virale Vektoren kann für eine maximale Wirksamkeit und Sicherheit durch Verwendung regulierter Genexpressionspromotoren reguliert werden, wie dies in Gossen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 5547–5551, beschrieben ist. Beispielsweise kann die Polynukleotidtranskription und/oder -translation durch auf Tetrazyklin reagierende Promotoren reguliert werden. Diese Promotoren können in positiver oder negativer Art durch Behandlung mit dem Regulatormolekül reguliert werden.
Für eine nicht-virale Abgabe der codierenden Sequenz des gewünschten Polypeptids kann die Sequenz in herkömmliche Vektoren insertiert werden, welche herkömmliche Kontrollsequenzen für eine Expression in hohem Level enthalten.
C. Bevorzugter Vektor
Ein bevorzugter Vektor umfasst: (1) einen Replikationsursprung (EBV) oder ein BKV (BK-Virus), ein Parvovirus, Replikationsursprung; (2) eine codierende Region für ein EBV- oder BKV-Ursprung-Bindungsprotein; (3) mindestens eine invertierte terminale Wiederholung; (4) einen Promotor; (5) einen Enhancer; (6) einen Terminator; (7) gegebenenfalls einen selektierbaren Marker.
Vorzugsweise ist der Replikationsursprung EBV-ori p; bevorzugter werden die Nukleotide 2623 bis 4559 von SEQ ID NO: 1 verwendet. Die Sequenz ist aus dem Vektor pCEP4 erhältlich, der von Invitrogen, San Diego, Californien, USA, zu beziehen ist.
Vorzugsweise codiert die codierende Region für das EBV-Kern-Antigen A, das an EBV-ori p bindet; bevorzugter wird die Nukleotidsequenz der Nukleotide 14 bis 2594 von SEQ ID NO: 1 verwendet. Die Sequenz ist aus dem Vektor pCEP4 zu erhalten, der von Invitrogen, San Diego, Californien, USA, im Handel ist.
Fragmente und Mutanten des bevorzugten Ursprungs und Bindungsproteins, die fähig sind, die Replikation des Vektors in der gewünschten Wirtszelle zu initiieren, können eingesetzt werden. Vorzugsweise werden die Fragmente und Mutanten mehr als etwa 80% Sequenzidentität mit den Nukleotiden 14 bis 2594 oder 2623 bis 4559 von SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon, typischer mehr als etwa 85%, noch typischer mindestens 90%, der Sequenzidentität beibehalten. Diese Polynukleotide weisen vorzugsweise eine mehr als etwa 92%ige Sequenzidentität mit den Nukleotiden 14 bis 2594 oder 2623 bis 4559 von SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon auf, bevorzugter eine mehr als etwa 94%ige Identität, noch bevorzugter eine mehr als etwa 96%ige Identität, noch bevorzugter eine mehr als etwa 98%ige Identität, und noch bevorzugter eine mehr als etwa 99%ige Identität, auf.
Vorzugsweise sind die invertierten terminalen Wiederholungen solche Sequenzen, die im Adeno-Virus (AV) oder Adeno-assoziierten Virus (AAV) gefunden werden; bevorzugter sind die invertierten terminalen Wiederholungen solche, die in AAV gefunden werden; noch bevorzugter ist die Polynukleotidsequenz 4938 bis 5104 oder 7189 bis 7355 von SEQ ID NO: 1. Die Sequenz von AAV wird in Samulski et al., 1987, J. Virol. 61: 3096–3101, beschrieben.
Fragmente und Mutanten der bevorzugten invertierten terminalen Wiederholung, die fähig sind, eine Replikation des Vektors in der gewünschten Wirtszelle zu initiieren, können verwendet werden. Vorzugsweise werden die Fragmente und Mutanten eine mehr als etwa 80%ige Sequenzidentität mit den Nukleotiden 4938 bis 5104 oder 7189 bis 7355 von SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon beibehalten, typischerweise eine mehr als etwa 85%ige Identität; typischerweise eine mindestens 90%ige Identität beibehalten. Vorzugsweise weisen diese Polynukleotide eine mehr als 92%ige Sequenzidentität mit den Nukleotiden 4938 bis 5104 oder 7189 bis 7355 von SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon auf bevorzugter weisen sie eine mehr als etwa 94%ige Identität, sogar noch bevorzugter eine mehr als etwa 96%ige Identität; noch bevorzugter eine mehr als etwa 98%ige Identität; weiter bevorzugt eine mehr als etwa 99%ige Identität, auf.
Vorzugsweise wird der Cytomegalovirus-Enhancer/Promotor verwendet; bevorzugter ist die CMV-Promotorsequenz die Nukleotidsequenz 5112 bis 6734 von SEQ ID NO: 1.
Es können Mutanten und Fragmente des bevorzugten Enhancers und Promotors, die zur Initiierung der Transkription und/oder Translation fähig sind, verwendet werden. Vorzugsweise werden die Fragmente und Mutanten eine mehr als etwa 80%ige Sequenzidentität mit den Nukleotiden 5112 bis 6734 von SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon; typischerweise eine mehr als etwa 85%ige Sequenzidentität; noch typischer eine mindestens 90%ige Sequenzidentität, beibehalten. Vorzugsweise weisen diese Polynukleotide eine mehr als etwa 92%ige Sequenzidentität mit den Nukleotiden 5112 bis 6734 von SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon; bevorzugter eine mehr als etwa 94%ige Identität; noch bevorzugter eine mehr als etwa 96%ige Identität; noch bevorzugter eine mehr als etwa 98%ige Identität; noch bevorzugter eine mehr als etwa 99%ige Identität, auf.
Ein bevorzugter Terminator ist die Rinderwachstumshormon-PolyA-Sequenz; bevorzugter ist die Polynukleotidsequenz Nukleotid 6818 bis 7050 von SEQ ID NO: 1.
Mutanten und Fragmente des bevorzugten Terminators, die fähig sind, die Transkription und/oder Translation zu terminieren, können verwendet werden. Vorzugsweise werden die Fragmente und Mutanten eine mehr als etwa 80%ige Sequenzidentität mit den Nukleotiden 6818 bis 7050 von SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon; typischerweise mehr als eine etwa 85%ige Identität; noch typischer eine mindestens 90%ige Identität, beibehalten. Vorteilhafterweise zeigen diese Polynukleotide eine mehr als etwa 92%ige Sequenzidentität mit den Nukleotiden 6818 bis 7050 von SEQ ID NO: 1 oder einem Fragment davon; bevorzugter eine mehr als etwa 94%ige Identität; noch bevorzugter eine mehr als etwa 96%ige Identität; noch bevorzugter eine mehr als etwa 98%ige Identität; noch bevorzugter eine mehr als etwa 99%ige Identität.
Die Sequenz des bevorzugten Vektors ist in SEQ ID NO: 1 gezeigt. Polynukleotide, die für Polypeptide, wie z. B. Erythropoietin oder Leptin codieren, und Ribozyme und Antisense-Polynukleotide können in den Vektor insertiert werden.
D. Beispiele für codierende Regionen, Ribozyme und Antisense-Moleküle
Das Folgende sind Beispiele für codierende Regionen, Ribozyme und Antisense-Moleküle, die zur Behandlung verschiedener Indikationen bei Säugetieren verwendet werden können. Die Nukleotidsequenz der interessierenden Gene kann z. B. in öffentlich zugänglichen Datenbanken, z. B. Genbank, gefunden werden. Polynukleotide, die abgegeben werden sollen, können zur Behandlung viraler Infektionen oder einer chronischen Pathogeninfektion verwendet werden.
1. Hämophilie
Ein Genersatz durch in vivo-Abgabe von Polynukleotiden kann bei der Behandlung von Hämophilie effektiv sein. Das Folgende sind Beispiele für Polypeptide, die durch die abzugebenden Polynukleotide codiert werden: Faktor VIII:C, Mutante von Faktor VIII:C, insbesondere solche, die nicht spaltbar sind. Zur Behandlung von Hämophilie sind auch Ribozym- und Antisense-Polynukleotide als Inhibitoren des Gewebefaktor-Plasminogen-Inhibitors (TFPI) nützlich.
Die Abgabewege zur Behandlung von Hämophilie umfassen z. B. intravenöse/intrahepatische Injektion, ex vivo-Transduktion von Stammzellen oder Lymphozyten unter Verwendung retroviraler Vektoren.
2. Behandlung der Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit
Eine in vivo-Abgabe von Polynukleotiden, die Prodrugs codieren, kann für eine direkte Ablation zur Behandlung der Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit, z. B. bei Leukämie-Knochenmarkstransplantation, verwendet werden. Zu diesem Zweck kann Herpes-Thymidinkinase in Verbindung mit Gancyclovir eingesetzt werden. Weitere Beispiele für Prodrugs werden im Abschnitt Krebs beschrieben.
Die Abgaberouten zur Behandlung der Transplantat-gegen-Empfänger-Krankheit umfassen z. B. eine ex vivo-Transduktion von T-Lymphozyten unter Verwendung retroviraler Vektoren.
3. Vakzine
Eine in vivo-Abgabe von Polynukleotiden, die für ein gewünschtes Antigen codieren, kann ausgenutzt werden um eine Immunantwort zu induzieren. Diese Antwort kann sowohl eine zelluläre, wie auch eine humorale Antwort umfassen. Dieser Vakzin-Typ kann verwendet werden um Krebs, wie auch infektiöse Krankheiten, zu behandeln. Ferner kann eine solche Behandlung entweder eine prophylaktische oder eine therapeutische Immuntherapie sein.
Beispiele für infektiöse Krankheiten umfassen die, die durch humanes Immundefizienz-Virus (HIV), Hepatitis A, B, C, usw. (HAV, HBV, HCV, usw.), durch humanes Papiloma-Virus (HPV), Cytomegalovirus (CMV), Herpes simplex 1 und 2 (HSV), usw. verursacht werden. Bevorzugte Antigene umfassen nicht-strukturelle Proteine 3, 4a und 5b (NS3, NS4 und NS5b) von HCV; gB2 und gD2 von HSV; die env- und rev-Proteine von HN.
In Vakzinen können auch Krebsantigene sowohl zu therapeutischen, als auch zu prophylaktischen Zwecken verwendet werden.
Die Antigene können im Zusammenhang mit Klasse I-Haupt-Histokompatibilitätsantigenen präsentiert werden oder um eine zelluläre cytotoxische T-Zell-Reaktion zu induzieren oder um eine humorale Reaktion zu induzieren, die die Synthese von Antikörpern umfasst.
Ferner kann zur Verabreichung mit einem Vakzin ein Antisense- oder Ribozym-Ziel auf ein immunsupprimierendes Molekül, z. B. IL-10, TGF-β und CTLA-4, zur Verabreichung mit einem Vakzin nützlich sein.
Die Wege zur Verabreichung von Vakzinen umfassen z. B. intramuskuläre Injektion, auf dendritischen Zellen basierende Immunisierung oder eine orale Immunisierung durch virale und nicht-virale Vektoren.
4. Diabetes mellitus
Diabetes ist eine andere Indikation, die durch eine in vivo-Abgabe eines Ersatzgens behandelt werden kann. Die Folgenden sind Beispiele für nützliche Polypeptide, die durch ein Ersatzgen zu codieren sind: Insulin, Insulin-artiger Wachstumsfaktor I und II (IGF-I und II).
Zur Behandlung von Diabetes sind auch Polynukleotide nützlich, die für IAS-L codieren, das an der Oberfläche von B-Zellen im Pankreas gefunden wird, um Zellen vor einer Immunzerstörung zu schützen.
Die Abgabewege zur Behandlung von Diabetes umfassen z. B. auf die Leber gerichtete, auf die Parotis gerichtete, auf das Pankreas gerichtete, auf die Speicheldrüse gerichtete Wege, die sowohl virale, wie nicht virale Vektoren verwenden.
5. Hyperlipidämie
Hyperlipidämie kann durch in vivo-Abgabe der folgenden Polynukleotide, die für Apoproteine oder Lipoproteinrezeptoren codieren, behandelt werden. Eine ausgedehntere Beschreibung von Lipoproteinen und Apoproteinen wird nachfolgend geliefert.
Die Abgabewege zur Behandlung von Hyperlipidämie umfassen z. B. eine auf die Leber gerichtete intravenöse Verabreichung, sowohl von viralen, wie auch von nicht-viralen Vektoren.
6. Myokardiale Ischämie oder Infarkt
Im Folgenden werden Beispiele für Nukleotide angeführt, die bei Abgabe in vivo zur Behandlung von myokardialer Ischämie oder Infarkt nützlich sind:
Polynukleotide, die für basischen Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Fibroblastenwachstumsfaktor 5 (FGF-5) und IGF-I codieren.
Die Abgabewege zur Behandlung myokardialer Ischämie oder von Infarkt umfassen z. B. die intraperikardiale Abgabe von viralem Vektor oder nicht-viralen Vektoren.
7. Darmerkrankung
Das Folgende sind Beispiele von Polynukleotiden, die in vivo abgegeben werden können um eine Darmerkrankung zu behandeln:

(i) Ribozyme oder Antisense-Polynukleotide als Inhibitoren einer Makrophagen/ inflammtorischen Zellen-Rekrutierung oder -Aktivierung, z. B. NFκB;
(ii) Ribozyme oder Antisense-Polynukleotide um als anti-apoptotische Agentien zu wirken, z. B. Inhibitoren der Interleukin 1b umwandelnden Enzymfamilie;
(iii) Polynukleotide, die Komplementblocker codieren, z. B. Zerfallsbeschleunigungsfaktor (DAF), Membran-Cofaktor-Protein (MCP) und Fusionen von DAF und MCP, auch bekannt als CAB-2;
(iv) Cyclooxygenaseinhibitoren;
(v) anti-proliferative Agentien, z. B. Ribozyme, Antisense-Oligonukleotide, Antikörper, Proteine oder Peptide gegen c-myb, ras/raf PI3-Kinase, Cycline;
(vi) Polynukleotide, die für Suizidproteine/Gene codieren, z. B. Herpes-Thymidinkinase;
(vii) Polynukleotide, die für Ersatzgene oder Proteine codieren, die defizient sind oder während der Entwicklung der inflammatorischen Darmerkrankung herabreguliert werden;
(viii) Polynukleotide, die für IκB codieren.

B. Prostatakrebs und gutartige Prostatahyperplasie
Die folgenden Polynukleotide können abgegeben werden um Prostatakrebs und gutartige Prostatahyperplasie zu behandeln:

(i) ein Polynukleotid, das für ein pro-apoptotisches Agens codiert, einschließlich z. B. fas, fas-Ligand, fadd, fap-1, tradd, faf rep, Reaper, Apoptin, Interleukin-2-umwandelndes Enzym;
(ii) ein Polynukleotid, das für ein anti-angiogenisches Agens codiert, einschließlich z. B. löslicher bFGF-Rezeptor und Fragmente, Angiostatin, transformierender Wachstumsfaktor-β (TGF-β), Interferon-α (IFNα), mit Proliferin verwandtes Protein, ein Urokinase-Plasminogenaktivator-Rezeptor-Antagonist, Plättchenfaktor 4 (PF4), Thrombospondin, Gewebeinhibitor von Metalloproteinase und Prolaktin;
(iii) ein Polynukleotid, das für ein immunmodulierendes Agens codiert, einschließlich z. B. Interleukin-2 (IL-2), IFNα, IFNβ, IFNγ, Granulozyten-Makrophagenkolonie-stimulierender Fraktor (GM-CSF) und Makrophagenkolonie-stimulierender Faktor (M-CSF);
(iv) ein Ribozym oder Antisense-Polynukleotid als anti-proliferatives Agens, einschließlich z. B. ein Inhibitor eines Signaltransduktionswegs, z. B. eines Inhibitors eines Signaltransduktionswegs, vermittelt durch myb, ras, die ras-Superfamilie, raf Phosphoinosit (PI3-Kinase), eine Phosphortyrosinbindungs(PTB)-Domäne, eine SRC-Homologie-2(SH2)-Domäne, eine SRC-Homologie-3(SH3)-Domäne, eine Plextrin-Homologie(PH)-Domäne, JUN-Kinase und eine stressaktivierte Kinase, Signalinositphosphatasen und ein Inhibitor eines Cyclins;
(v) ein Ribozym oder Antisense-Polynukleotid als ein Inhibitor eines Wachstumsfaktors oder Inhibitor eines Rezeptors eines Wachstumsfaktors, einschließlich z. B. epidermaler Wachstumsfaktor (EGF), TGF-α, FGF, TGF-β, von Plättchen abgeleiteter Wachstumsfaktor (PDGF), Keratinozyten-Wachstumsfaktor (KGF) oder irgendein Prostatazellen-spezifischer Wachstumsfaktor;
(vi) ein Polynukleotid, das für ein Tumorsuppressorgen oder ein Gen codiert, das während des Beginns eines hyperplastischen Krankheitsbildes in der Prostata herabreguliert worden ist; und
(vii) ein Antisense- oder Ribozym-Ziel auf ein immunsuppressives Molekül, z. B. IL-10, TGF-β und CTLA-4.

9. Anämie, Leukopenie und Thrombozytopenie
Anämie kann durch in vivo-Abgabe eines Polynukleotids, das für Erythropoietin, GM-CSF, G-CSF, M-CSF und Thrombopoietin zum Beispiel codiert, behandelt werden. Beispiele für Abgabewege für diese Indikation umfassen, ohne Beschränkung: eine auf die Leber abzielende intravenöse Verabreichung von viralen Vektoren und nicht-viralen Vektoren. Siehe die folgenden Beispiele.
10. Kardiomyopathie
Das Folgende sind Beispiele von Polynukleotiden, die in vivo zur Behandlung von Kardiomyopathie abgegeben werden können: Polynukleotide, die für IGF-1, L-Aminosäuredecarboxylase, Inhibitoren von β-adrenergen Rezeptorkinasen (BARK), Troponin und β-adrenergen Rezeptoren codieren.
Beispiele für Abgabewege für diese Indikation umfassen, ohne Beschränkung, eine perikardiale Expression von IGF-1 und für die anderen Gene eine intramyokardiale Injektion oder ein myokardiales Targeting über eine intrakoronäre Injektion oder eine intraperikardiale Verabreichung von viralen Vektoren oder nicht-viralen Vektoren.
11. Rheumatoide Arthritis
Das Folgende sind Beispiele für Polynukleotide, die in vivo abgegeben werden können um rheumatoide Arthritis zu behandeln, Polynukleotide, die für ein Prodrug codieren, z. B. für Herpes-Thymidinkinase, MMP-Inhibitoren, fas und pro-apoptotische Proteine, die oben beschrieben wurden, sowie Interleukin-1-Rezeptor A, Interleukin-10, IκB.
Auch Antisense- und Ribozym-Polynukleotide als Inhibitoren von NFκB.
Beispiele für Abgaberouten für diese Indikation umfassen, ohne Beschränkung, intraartikuläre Injektion von viralen und nicht-viralen Vektoren.
12. Osteoarthritis und Psoriasis
Das Folgende sind Beispiele für Polynukleotide, die in vivo abgegeben werden können um Osteoarthritis und Psoriasis zu behandeln: Polynukleotide, die für IGF-1 codieren; Ribozym- und Antisense-Polynukleotide als Inhibitoren von Metalloproteinase-Inhibitoren.
Auch das Folgende sind Beispiele für Polynukleotide, die in vivo zur Behandlung von Osteoarthritis und Psoriasis abgegeben werden können, Polynukleotide, die für ein Prodrug, wie z. B. Herpes-Thymidinkinase, MMP-Inhibitoren, fas und pro-apoptotische Proteine, die oben beschrieben wurden, und Interleukin-1-Rezeptor A, Interleukin-10, IκB, codieren.
Auch Antisense- und Ribozym-Polynukleotide als Inhibitoren von NFκB.
Beispiele für Abgaberouten für diese Indikation umfassen, ohne Beschränkung, intraartikuläre Injektion.
13. Restenosierung
Das Folgende sind Beispiele für Polynukleotide, die in vivo zur Behandlung von Restenosierung abgegeben werden können:

(i) Polynukleotide, die für ein Prodrug, z. B. Thymidinkinase, oder andere Beispiele, die im Abschnitt Krebs beschrieben werden, codieren;
(ii) Polynukleotide, die für Gewebefaktor-Plasminogen-Inhibitor (TFPI) codieren;
(iii) Polynukleotide, die für c-myb rbz, c-ras rbz codieren;
(iv) Polynukleotide, die für pro-apoptotische Agentien, die oben beschrieben wurden, codieren;
(v) Polynukleotide, die für IκB codieren.

Beispiele für Abgaberouten für diese Indikation umfassen, ohne Beschränkung, eine intrakoronare Abgabe von viralen und nicht-viralen Vektoren.
14. Krebs
Genabgabevektoren sind bei der Abgabe therapeutischer Gene zur Behandlung von hyperproliferativen Krankheiten, einschließlich Malignität, zur Behandlung einer infektiösen Erkrankung und zur Behandlung von inflammatorischen Erkrankungen, einschließlich Autoimmunerkrankung, einsetzbar. Beispielsweise können Gentherapievektoren eingesetzt werden um Cytokine oder Proteine zu exprimieren, welche ein inaktives oder partiell aktives Prodrug in ein aktives Arzneimittel umwandeln. In vielen Fällen führt eine Umwandlung des Prodrugs in seine aktive Form zu einer Verbindung mit cytolytischer Aktivität.
a. Prodrug-umwandelnde Enzyme
In der vorliegenden Erfindung kann eine Reihe von "Suizidgenen" eingesetzt werden, die für verschiedene Proteine codieren, welche bei der Prodrug-Umwandlung einsetzbar sind. Beispielsweise sind Nukleosidkinasen, wie z. B. Thymidinkinase, besonders nützlich. Insbesondere das HSV-TK-System hat für die Antitumor-Zelltherapie wichtige Vorteile. Siehe PCT-Publikations-Nr. WO 91/02805 mit dem Titel "Recombinant Retroviruses Delivering Vector Constructs to Target Cells" und die PCT-Publikations-Nr. WO 95/14091 mit dem Titel ("Compositions and Methods for Utilizing Conditionally Lethal Genes" bezüglich einer Beschreibung der Behandlung von Krebs und anderen Krankheiten durch Genabgabevektoren, die Thymidinkinase und andere Prodrug-umwandelnde Enzyme exprimieren. HSV-TK-transduzierte Tumorzellen können einen signifikanten, abtötenden "Bystander"-Effekt auf nicht-transduzierte Nachbarzellen in vitro und in vivo vermitteln (Moolten et al., supra., Freeman et al., 1993, Cancer Res. 53: 5274), am häufigsten als Resultat eines Transfers auf den toxischen Ganciclovirmetaboliten, GCV-Triphosphat, zwischen benachbarten Zellen durch interzelluläre gap junctions (Bi et al., 1993, Human Gene Therap. 4: 725). Endothelialzellen in Kapillarwänden werden durch gap junctions miteinander verbunden, so dass ein dramatischer "Bystander"-Effekt, der durch einen GCV-Triphosphat-Transfer zwischen benachbarten Endothelialzellen erzeugt wird, und die massiven Amplifikationseffekte der Gerinnungskaskade sowie das Tumor-zu-Endothelialzellen-Verhältnis daraus folgen könnten (Denekamp et al., 1986, Cancer Topics 6: 6; Denekamp et al., 1984, Prog. Appl. Microcir. 4: 28). Ein neuerer Beweis legt nahe, dass die gelegentliche Transduktion von Tumorendothelialzellen während der intraläsionalen Therapie mit retroviralen HSV-TK-Vektoren für eine signifikante Komponente der Antitumoraktivität der Vektoren verantwortlich ist (Ram et al., 1994, J. Neurosurg. 81: 256). Zusätzlich ist das Suizidgen für die Zielzellen nur konditionell cytotoxisch (d. h., nur wenn GCV gegeben ist).
Folglich kann eine ex vivo-Verabreichung verwendet werden. Bei diesem Protokolltyp können z. B. Endothelialzellen aus Tumorbiopsien isoliert werden (Medzelewski et al., 1994, Cancer Res. 54: 336), mit geeigneten Mitogenen zur Proliferation induziert werden (Ferrara et al., supra) und in vitro mit TK transduziert werden. Transplantiertes EC wird nach intratumoraler Injektion in Tagen bis Wochen in die Gefäßneuanordnung eingebaut (Lal et al., 1994, Cancer Gene Therap. 1: 322), so würde eine GCV-Behandlung einer geeigneten "lag-Phase" folgen um das transduzierte EC funktionell in das Tumorgefäßsystem zu integrieren. Das Zwei-Stufen-Enzym-Prodrug-System bietet eine größere Flexibilität bei der schwierigen klinischen Handhabung, da das Ende einer GCV-Infusion bei dem Event (potentiell sehr ernster) Komplikationen, die aus einer Schädigung an normalem EC entstehen, die Toxizität blockieren würde, ohne dass die Notwendigkeit der Blockierung der Transgen-Aktivität in situ bestehen würde.
Eine Reihe alternativer "Suizidgene" zusätzlich zu Thymidinkinase kann für die Krebs-Gentherapie auch nützlich sein (Moolten et al., supra.). Eine Einführung des bakteriellen Cytosindesaminasegens (Huber et al., 1993, Cancer Res. 53: 4619) in Tumorzellen verleiht Empfindlichkeit gegenüber dem antifungalen Agens 5-Fluorcytosin (5-FC). Cytosindesaminase wandelt 5-FC in 5-Fluoruracil (5-FU, Nishiyama et al., 1985, Cancer Res. 45: 1753) um. Da 5-FU ein allgemein verwendetes chemotherapeutisches Arzneimittel für Brustkrebs ist, haben verschiedene Gruppen für diese Krankheit Therapiemodelle mit "Suizidgen" auf Cytosindesaminase-Basis entwickelt. Die Tumorspezifität kann ferner durch Einführen der c-erbB2-Promotor/Enhancer-Elemente 5' zu dem Cytosindesaminasegen erhöht werden, so dass das therapeutische Transgen vorzugsweise in c-erbB2-überexprimierenden Brusttumorzellen transkribiert wird (Harris et al., 1994, Gene Therap. 1: 170). Alkalische Phosphatase wurde in großem Umfang als Prodrug-aktivierendes Enzym auf dem verwandten Gebiet der auf Antikörper gerichteten Enzym-Prodrug-Therapie (ADEPT) entwickelt. Dieses Enzym hat den Vorteil, dass es einen weiten Bereich phosphorylierter Derivate von Anti-Krebs-Agentien (z. B. Mitomycin C, Etopsid, etc.) aktivieren kann, die die Zellmembranen nicht durchqueren können, bis die geladene Phosphatgruppe abgespalten ist; so könnte ein einzelnes Enzym de novo einen Cocktail chemotherapeutischer Mittel in der Tumormasse erzeugen (Senter et al., 1993, Bioconjugate Chem. 4: 3). Andere Suizidgene können für ein Polypeptid oder Polypeptide (mit einem entsprechenden nicht-cytotoxischen Agens) codieren, z. B. für Herpes simplex-Virus-Thymidinkinase (Gancyclovir oder Acyclovir), Varizella Zoster-Virus-Thymidinkinase (6-Methoxypurinarabinonukleosid; Huber et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88: 8039), E. coli-Cytosindesaminase (Fluoruracil; Mullen et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 33), E. coli-Xanthin-Guanin-Phosphoribosyltransferase (Thioxanthin; Beshard et al., 1987, Mol. Cell Biol. 7: 4139), E. coli- oder Leishmania-Purinnukleotidphosphorylase (verschiedene nicht-toxische Purindesoxy-adenosin-, Adenosin-, Desoxyguanosin- oder Guanosinderivate (Koszalka und Krenitsky, 1979, J. Biol. Chem 254: 8185, 1979; Sorscher et al., 1994, Gene Theran. 1: 233), Cytochrom-pla50 2B1- oder Cytochrom-p450-Reduktase (z. B. 3-Amino-1,2,4-benzotriazin-1,4-dioxid (Walton et al., 1992, Biochem. Pharmacol. 44: 251), alkalische Zelloberflächenphosphatase (z. B. Etoposidmonophosphat; Senter et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85: 4842, 1988), Nitroreduktase (z. B. Metronidazol oder Nitrofurantoin; Hof et al., 1988, Immunität und Infektion 16: 220), N-Desoxyribosytransferase (1-Deazapurin; Betbeder et al., 1989, Nucleic Acids Res 17: 4217), Pyruvatferrodoxin-Oxidoreduktase (Metronidazol; Upcroft et al., 1990, Int. J. Parasitolog, 20: 489), Carboxypeptidase G2 (Aminoacylat-Stickstoff-yperits; Antoniw et al., 1990, Brit J. Cancer 62: 909), Carboxypeptidase A (Methotrexat-alpha-Alanin; Haenseler et al., 1992, Biochemistry 31: 891), Lactamase (Cephalosporinderivate; Meyer et al., 1993, Cancer Res. 53: 3956; und Vradhula et al., 1993, Bioconjugate Chemistry 4: 334), Actinomycin D-Synthetasekomplex (synthetische Pentapeptidlactonvorstufen; Katz et al., 1990, J. Antibiotics 43: 231), und -Glucuronidase (verschiedene Glucuronidderivate toxischer Arzneimittel, z. B. Doxorubicin; Bosslet et al., 1994, Cancer Res. 54: 2151; Haeberlin et al., 1993, Pharmaceutical Res. 10: 1553).
Irgendeins einer Vielzahl anderer Enzyme, die inaktive Prodrugs in aktive Arzneimittel umwandeln und die dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt sind, können ebenfalls in Gen-Abgabevehikeln eingesetzt werden. Siehe z. B. PCT-Publikationsnummer WO 95/14014091 mit dem Titel "Compositions and Methods for Utilizing Conditionally Lethal Genes" und europäische Patentpublikationsnummer EP90309430 mit dem Titel "Molecular Chimeras Useful for Cancer Therapy -- Comprising Regulatory Sequences and heterologous enzyme, e. g. Varicella Zoster Virus Thymidin Kinase" bezüglich einer Beschreibung weiterer Prodrug/Enzymsysteme, die für eine Gentherapie nützlich sind. Als weiteres Beispiel siehe die PCT-Patentpublikation Nr. WO 95/13095 mit dem Titel "New Prodrugs and Enzyme Targeting Molecule Conjugates – Useful in Antibody Direct Enzyme Prodrug Therapy of e. g. Viral Infections".
Eine Vielzahl von Tumoren können Ziel für die Behandlung durch Gen-Abgabevehikel sein. Im Allgemeinen sind feste Tumoren bevorzugt, obgleich Leukämie und Lymphome auch behandelt werden können, wenn sie eine feste Masse entwickelt haben oder wenn geeignete, mit dem Tumor assoziierte Marker vorliegen, so dass die Tumorzellen physikalisch von nicht-pathogenen, normalen Zellen getrennt werden können. Typische Beispiele für geeignete Tumoren umfassen Melanome, colorektale Karzinome, Lungenkarzinome (einschließlich großzelliger, kleinzelliger, schuppiger und Adenokarzinome), Nierenzellenkarzinome und Brustadenokarzinome. Gen-Abgabevehikel, die Thymidinkinase und andere Prodrug-umwandelnde Enzyme exprimieren, sind auch in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten, einschließlich rheumatoider Arthritis, Osteoarthritis und Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion nützlich. Siehe z. B. die PCT-Patentpublikation Nr. WO 95/14091 mit dem Titel "Compositions and Methods for Utilizing Conditionally Lethal Genes" bezüglich einer Beschreibung der Krankheitsbehandlung mit Gentherapievektoren, die Prodrug-umwandelnde Enzyme exprimieren.
b. Cytokine
Durch die Gen-Abgabevehikel der vorliegenden Erfindung kann eine Vielzahl von Polynukleotiden, die für Cytokine und Immunsystemmodulatoren codieren, zur Behandlung einer Reihe verschiedener Krankheiten abgegeben werden. Typische Beispiele umfassen Cytokine, wie z. B. IL-1, IL-2 (Karupiah et al., 1990, J. Immunology 144: 290–298; Weber et al., 1987, J. Exp. Med. 166: 1716–1733; Gansbacher et al., 1990, J. Exp. Med. 172: 1217–1224; US-Patent Nr. 4 738 927), IL-3, IL-4 (Tepper et al., 1989, Cell 57: 503–512; Golumbek et al., 1991, Science 254: 713–716, 1991; US-Patent Nr. 5 017 691), IL-5, IL-6 (Brakenhof et al., 1987, J. Immunol. 139: 4116–4121; WO 90/06370), IL-7 (US-Patent Nr. 4 965 195), IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13 (Cytokine Bulletin, Summer 1994), IL-14 und IL-15, insbesondere IL-2, IL-4, IL-6, IL-12 und IL-13, alpha-Interferon (Finter et al., 1991, Drugs 42(5): 749–765; US-Patent Nr. 4 892 743; US-Patent Nr. 4 966 843; WO 85/02862; Nagata et al., 1980, Nature 284: 316–320; Familletti et al., 1981, Methods in Enz. 78: 387–394; Twu et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2046–2050; Faktor et al., 1990, Oncogene 5: 867–872), Beta-Interferon (Seif et al., 1991, J. Virol. 65: 664–671), gamma-Interferone (Radford et al., The American Society of Hepatology 2008–2015, 1991; Watanabe et al., PNAS 86: 9456–9460, 1989; Gansbacher et al., 1990, Cancer Research 50: 7820–7825; Maio et al., 1989, Can. Immunol. Immunother. 30: 34–42; US-Patent Nr. 4 762 791; US-Patent Nr. 4 727 138), G-CSF (US-Patent Nrn. 4 999 291 und 4 810 643), GM-CSF (WO 85/04188), Tumomekrosefaktoren (TNFs) (Jayaraman et al., 1990, J. Immunology 144: 942–951), CD3 (Krissanen et al., 1987, Immunogenetics 26: 258–266, 1987), ICAM-1 (Altman et al., 1989, Nature 338: 512–514; Simmons et al., 1988, Nature 331: 624–627), ICAM-2, LFA-1, LFA-3 (Wallner et al., 1987, J. Exp. Med. 166(4): 923–932), MHC-Klasse I-Moleküle, MHC-Klasse II-Moleküle, B7.1-.3, ₂-Mikroglobulin (Parnes et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. 78: 2253–2257), Chaperone, wie z. B. Calnexin, MHC-gebundene Transporterproteine oder Analoga davon (Powis et al., 1991, Nature 354: 528–531, 1991).
Gene, die für irgendeins der Cytokin- und immunmodulatorischen Proteine, die hier beschrieben werden, codieren, können in einem Gen-Abgabevehikel der Erfindung exprimiert werden. Andere Formen dieser Cytokine, die dem Fachmann bekannt sind, können ebenfalls verwendet werden. Beispielsweise können Nukleinsäuresequenzen, die für natives IL-2 und gamma-Interferon codieren, erhalten werden, wie es im US-Patent Nr. 4 738 927 beziehungsweise 5 326 859 beschrieben ist, während nützliche Muteine dieser Proteine erhalten werden können, wie es im US-Patent Nr. 4 853 332 beschrieben ist. Als zusätzliches Beispiel können Nuldeinsäuresequenzen, die für die kurzen und langen Formen von mCSF codieren, erhalten werden, wie es im US-Patent Nr. 4 847 201 bzw. 4 879 227 beschrieben ist.
Andere Nukleinsäuremoleküle, die für Cytokine codieren, wie auch andere Nukleinsäuremoleküle, die zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung vorteilhaft sind, können in einfacher Weise aus einer Vielzahl von Quellen, einschließlich z. B. Hinterlegungs-stellen, wie die American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, Maryland), oder aus kommerziellen Quellen, wie British Bio-Technology Limited (Cowley, Oxford, England), erhalten werden. Repräsentative Beispiele umfassen BBG 12 (enthaltend das GM-CSF-Gen, das für das reife Protein aus 127 Aminosäuren codiert), BBG 6 (das Sequenzen enthält, die für gamma-Interferon codieren), ATCC-Nr. 39656 (enthaltend Sequenzen, die für TNF codieren), ATCC-Nr. 20663 (enthaltend Sequenzen, die für alpha-Interferon codieren), ATCC-Nrn. 31902, 31902 und 39517 (enthaltend Sequenzen, die für Beta-Interferon codieren), ATCC-Nr. 67024 (enthaltend eine Sequenz, die für Interleukin-1b codiert), ATCC-Nrn. 39405, 39452, 39516, 39626 und 39673 (die Sequenzen enthalten, die für Interleukin-2 codieren), ATCC-Nrn. 59399, 59398 und 67326 (die Sequenzen enthalten, die für Interleukin-3 codieren), ATCC-Nr. 57592 (enthaltend Sequenzen, die für Interleukin-4 codieren), ATCC-Nr. 59394 und 59395 (enthaltend Sequenzen, die für Interleukin-5 codieren) und ATCC-Nr. 67153 (enthaltend Sequenzen, die für Interleukin-6 codieren).
Gen-Abgabevehikel, die die obigen Cytokine exprimieren, sind in der Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten nützlich. Siehe z. B. PCT-Publikationsnummer US 94/02951 mit dem Titel "Compositions and Methods for Cancer Immunotherapy" bezüglich einer Beschreibung der Gentherapiebehandlung der Malignität.
15. Neurologische Störungen und Krankheiten
Polynukleotide, die für Tyrosinhydroxylase codieren, können bei der Behandlung der Parkinson-Krankheit nützlich sein.
Für Schlaganfall oder beliebige akute Hirnverletzungen sind Polynukleotide, die für IGF-1, bFGF, vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor (VEGF) codieren, nützlich.
16. Lungenkrankheiten
Zur Behandlung von Emphysem sind Polynukleotide, die für α1-Anti-Trypsin codieren, nützlich.
Zur Behandlung von Lungenfibrose sind Polynukleotide, die für Superoxiddismutase (SOD) codieren, nützlich.
Zur Behandlung zystischer Fibrose sind Polynukleotide, die für CFTR codieren, einsetzbar.
ZUSÄTZLICHE AGENTIEN
Zusammen mit den gewünschten Polynukleotiden, die abgegeben werden sollen, können zusätzliche Agentien enthalten sein. Diese zusätzlichen Agentien können z. B. eine Endozytose der gewünschten Nukleinsäuren erleichtern oder eine Bindung der Nukleinsäuren an die Zelloberfläche unterstützen oder beides.
A. Polypeptide
Ein Beispiel sind Polypeptide, die, ohne Beschränkung, umfassen: Asialoorosomucoid (ASOR); Transferrin; Asialoglycoproteine; Antikörper; Antikörperfragmente; Ferritin; Interleukine; Interferone, Granulozyten-Makrophagen-Kolonien-stimulierender Faktor (GM-CSF), Granulozyten-Kolonien-stimulierender Faktor (G-CSF), Makrophagen-Kolonien-stimulierender Faktor (M-CSF), Stammzellfaktor und Erythropoietin. Virale Antigene, z. B. Hüllenproteine, können ebenfalls eingesetzt werden. Auch Proteine von anderen invasiven Organismen, z. B. das 17-Aminosäurepeptid aus dem Circumsporozoitprotein von Plasmodium falciparum, bekannt als RII.
B. Hormone, Vitamine, usw.
Andere Gruppen, die enthalten sein können, sind z. B. Hormone, Steroide, Androgene, Östrogene, Schilddrüsenhormon oder Vitamine, Folsäure.
C. Polyalkylene, Polysaccharide, usw.
Mit den gewünschten Polynukleotiden können Polyalkylenglykole enthalten sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polyalkylenglykol Polyethylenglykol. Außerdem können Mono-, Di- oder Polysaccharide enthalten sein. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts ist das Polysaccharid Dextran oder DEAE-Dextran. Auch Chitosan und Poly(lactid-co-glykolid).
D. Lipide und Liposome
Das gewünschte Polynukleotid kann vor Abgabe an das Subjekt oder an Zellen, die von diesem stammen, in Lipide eingekapselt werden oder in Liposome gepackt werden.
Eine Lipideinkapselung erfolgt im Allgemeinen unter Verwendung von Liposomen, die fähig sind, die Nukleinsäure in stabiler Weise zu binden oder einzuschließen und zurückzuhalten. Das Verhältnis von kondensiertem Polynukleotid zu Lipidpräparation kann variieren, wird aber im Allgemeinen ungefähr 1 : 1 (mg DNA : Mikromol Lipid) sein oder mehr Lipid enthalten. Für eine Übersicht über die Verwendung von Liposomen als Träger zur Abgabe von Nukleinsäuren siehe Hug und Sleight, 1991, Biochim. Biophys. Acta. 1097: 1–17; Straubinger et al., in METHODS OF ENZYMOLOGY (1983), Bd. 101, S. 512–527.
Liposomale Präparationen zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung umfassen kationische (positiv geladene), anionische (negativ geladene) und neutrale Präparationen. Von kationischen Liposomen wurde gezeigt, dass sie eine intrazelluläre Abgabe von Plasmid-DNA (Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7416); mRNA (Malone et al., 1989, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 6077–6081); und gereinigten Transkriptionsfaktoren (Debs et al., 1990, J. Biol. Chem. 265: 10189–10192) in funktioneller Form vermitteln.
Kationische Liposome sind leicht verfügbar. Beispielsweise sind N-[1-2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-triethylammonium (DOTMA)-Liposome als Produktlinie Lipofectin^® von GIBCO BRL, Grand Island, NY, erhältlich. (Siehe auch Felgner et al., 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84: 7413–7416). Andere im Handel verfügbare Liposome umfassen Transfectace (DDAB/DOPE) und DOTAP/DOPE (Boehringer). Andere kationische Liposome können aus leicht verfügbaren Materialien unter Anwendung fachbekannter Techniken hergestellt werden. Siehe Szoka et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198; PCT-Publikation Nr. WO 90/11092 bezüglich einer Beschreibung der Synthese von DOTAP (1,2-Bis(oleyloxy)-3-(trimethylammonio)propan)-Liposomen.
In ähnlicher Weise sind anionische und neutrale Liposome in einfacher Weise verfügbar, z. B. von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) oder können unter Verwendung einfach verfügbarer Materialien in einfacher Weise hergestellt werden. Solche Materialien umfassen unter anderem Phosphatidylcholin, Cholesterin, Phosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC), Dioleoylphosphatidylglycerin (DOPG), Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE). Diese Materialien können auch in passenden Verhältnissen mit den DOTMA- und DOTAP-Ausgangsmaterialien vermischt werden. Verfahren zur Herstellung von Liposomen unter Verwendung dieser Materialien sind auf dem Fachgebiet gut bekannt.
Die Liposome können mehrschichtige Vesikel (MLVs), kleine einschichtige Vesikel (SUVs) oder große einschichtige Vesikel (LUVs) umfassen. Die verschiedenen Liposom-Nukleinsäure-Komplexe werden unter Anwendung fachbekannter Methoden hergestellt. Siehe z. B. Straubinger et al., in METHODS OF IMMUNOLOGY (1983), Bd. 101, S. 512–527; Szoka et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 4194–4198; Papahadjopoulos et al., 1975, Biochim. Biophys. Acta 394: 483; Wilson et al., 1979, Cell 17: 77; Deamer und Bangham, 1976, Biochim. Biophys. Acta 443: 629; Ostro et al., 1977, Biochim Biophys. Res. Commun. 76: 836; Fraley et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 3348); Enoch und Strittmatter, 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 145); Fraley et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 10431; Szoka und Papahadjopoulos, 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75: 145; und Schaefer-Ridder et al., 1982, Science 215: 166).
E. Lipoproteine
Außerdem können Lipoproteine mit dem abzugebenden Polynukleotid enthalten sein. Beispiele für Lipoproteine, die verwendet werden können, umfassen: Chylomicrone, HDL, IDL, LDL und VLDL. Mutanten, Fragmente oder Fusionen dieser Proteine können ebenfalls eingesetzt werden. Es können auch Modifikationen von natürlich auftretenden Lipoproteinen verwendet werden, z. B. acetyliertes LDL. Diese Lipoproteine können die Abgabe von Polynukleotiden auf Zellen richten, die Lipoproteinrezeptoren exprimieren. Wenn Lipoproteine mit dem abzugebenden Polynukleotid enthalten sind, ist vorzugsweise in der Zusammensetzung kein anderer Targeting-Ligand enthalten.
Wenn Lipoproteine mit den gewünschten abzugebenden Polynukleotiden eingeschlossen sind, umfasst die Zusammensetzung: (1) Lipoprotein; (2) Polynukleotid und (3) ein Polynukleotid-bindendes Molekül.
Natürlich auftretende Lipoproteine umfassen einen Lipid- und einen Proteinteil. Der Proteinteil ist als Apoproteine bekannt. Bis jetzt wurden die Apoproteine A, B, C, D und E isoliert und identifiziert. Mindestens zwei dieser enthalten verschiedene Proteine, die mit römischen Zahlen bezeichnet werden, AI, AII, AN; CI, CII, CIII.
Ein Lipoprotein kann mehr als ein Apoprotein umfassen. Beispielsweise umfassen natürlich auftretende Chylomicrone A, B, C und E, mit der Zeit verlieren diese Lipoproteine A und erwerben C- und E-Apoproteine. VLDL umfasst die Apoproteine A, B, C und E, LDL umfasst Apoprotein B, und HDL umfasst die Apoproteine A, C und E.
Die Aminosäuren dieser Apoproteine sind bekannt und werden z. B. in Breslow, 1985, Annu Rev. Biochem 54: 699; Law et al., 1986, Adv. Exp Med. Biol. 151: 162; Chen et al., 1986, J. Biol Chem 261: 12918; Kane et al., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 2465; und Utermann et al., 1984, Hum Genet 65: 232 beschrieben.
Lipoproteine enthalten eine Vielzahl von Lipiden, einschließlich Triglyceriden, Cholesterin (frei und Ester) und Phospholipiden. Die Zusammensetzung der Lipide variiert bei den natürlich auftretenen Lipoproteinen. Beispielsweise umfassen Chylomicronen hauptsächlich Triglyceride. Eine detailliertere Beschreibung des Lipidgehalts natürlich auftretender Lipoproteine kann z. B. in Meth. Enzym. 128 (1986) gefunden werden. Die Zusammensetzung der Lipide wird so gewählt, dass sie die Konformation des Apoproteins für Rezeptorbindungs-Aktivität unterstützt. Die Zusammensetzung von Lipiden kann auch so gewählt werden, dass sie eine hydrophobe Wechselwirkung und eine Assoziation mit dem Polynukleotid-bindenden Molekül erleichtert.
Natürlich vorkommende Lipoproteine können z. B. durch Ultrazentrifugation aus Serum isoliert werden. Solche Verfahren sind z. B. in Meth. Enzym., supra; Pitas et al., 1980, J. Biochem. 255: 5454–5460; und Mahey et al., 1979, J. Clin. Invest 64: 743–750, beschrieben.
Lipoproteine können auch durch in vitro- oder Rekombinationsverfahren durch Expression der Apoproteingene in einer gewünschten Wirtszelle produziert werden. Siehe z. B. Atkinson et al., 1986, Annu Rev Biophys Chem 15: 403, und Radding et al., 1958, Biochim. Biophys Acta 30: 443.
Lipoproteine können auch von Handelslieferanten, wie Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA, bezogen werden.
Mutanten, Fragmente und eine Fusion der natürlich auftretenden Apoproteine sind zur Abgabe von Polynukleotiden einsetzbar. Diese Polypeptide werden mehr als eine etwa 80%ige Aminosäureidentität, typischerweise eine mehr als etwa 85%ige Identität, sogar noch typischer eine mindestens 90%ige Aminosäureidentität, beibehalten. Vorzugsweise werden diese Polypeptide eine mehr als etwa 92%ige Aminosäuresequenzidentität mit natürlich auftretenden Lipoproteinen oder einem Fragment davon, vorzugsweise eine mehr als etwa 94%ige Aminosäureidentität, noch bevorzugter eine mehr als etwa 96%ige Identität, noch bevorzugter eine mehr als 98%ige Identität, und noch weiter bevorzugt eine mehr als etwa 99%ige Sequenzidentität, beibehalten.
Solche Mutanten, Fragmente und Fusionen können konstruiert werden, indem die Polynukleotide, die für die gewünschten Lipoproteine codieren, durch DNA-Rekombinationstechniken verändert werden. Siehe z. B. Sambrook et al., (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2. Ausgabe (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, New York). Diese Polynukleotide können in Expressionsvektoren insertiert werden, und Wirtszellen können ausgenutzt werden um das gewünschte Apoprotein zu produzieren.
Außerdem können natürlich auftretende Lipoproteine, Mutanten, Fragmente und Fusionen chemisch verändert werden. Beispielsweise hat acetyliertes LDL biologische Aktivität. Siehe z. B. Nagelkerke et al., 1983, J. Biol. Chem. 258(20): 12221–12227; Weisgraber et al., 1978, J. Biol. Chem. 253: 9053–9062; Voyta et al., 1984, J. Cell Biol. 99: 2034–2040; Goldstein et al., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 76: 333–337; und Pitas, 1981, Arterosclerosis 1: 177–185.
Chemisch modifizierte Lipoproteine können auch von kommerziellen Lieferanten, wie z. B. Biomedical Technologies, Inc., Stoughton, Massachusetts, USA, bezogen werden.
Alle diese Polypeptide weisen Rezeptorbindungseigenschaften natürlich vorkommender Lipoproteine auf. Üblicherweise weisen solche Polypeptide mindestens etwa 20% der Rezeptorbindung von natürlich vorkommenden Lipoproteinen auf. Typischer weisen die Polypeptide mindestens etwa 40%, noch typischer weisen die Polypeptide mindestens etwa 60%, noch typi scher mindestens etwa 70%, noch typischer mindestens etwa 80%, noch typischer mindestens etwa 85%, noch typischer mindestens etwa 90%, noch typischer mindestens etwa 95%, der Rezeptorbindung der natürlich vorkommenden Lipoproteine auf.
Typischerweise sind Lipoproteine in einer Menge vorhanden, die wirksam ist um die Häufigkeit eines Einbaus von Polynukleotiden in eine Zelle zu erhöhen. Eine derartige Menge ist ausreichend um die Häufigkeit eines Einbaus von Polynukleotiden in eine Zelle um mindestens 10%, verglichen mit der Häufigkeit eines Einbaus von nackten Polynukleotiden, üblicherweise um mindestens 15%, noch üblicher um 20%, noch üblicher um mindestens 30%, zu erhöhen. Die Zunahme kann auch zwischen 40 und 100% sein und sogar einer Erhöhung von 1000% und 10.000% sein.
"Polynukleotid-bindendes Molekül" bezieht sich auf solche Verbindungen, die mit Polynukleotiden assoziieren, wobei die Assoziierung nicht Sequenz-spezifisch ist. Beispielsweise können solche Moleküle (1) eine Neutralisierung der elektrischen Ladung eines Polynukleotids unterstützen, oder (2) eine Kondensation von Nukleotiden erleichtern, oder (3) den Serum- oder Nukleaseabbau inhibieren. Gegebenenfalls können Polynukleotid-bindende Moleküle mit Lipoproteinen entweder durch hydrophobe Assoziierung oder durch Ladung wechselwirken. Polynukleotid-bindende Moleküle umfassen, ohne Beschränkung, Polypeptide, Mineralverbindungen, Vitamine, usw.
Beispiele für Polynukleotid-bindende Moleküle umfassen: Polylysin, Polyargenin, Polyornithin und Protamin. Beispiele für organische Polykationen umfassen: Spermin, Spermidin und Purtrescin. Andere Beispiele umfassen Histone, Protaminem, humanes Serumalbumin, DNA-Bindungsproteine, chromosomale Nicht-Hoston-Proteine, Hüllenproteine aus DNA-Viren, z. B. ϕX174; Transkriptionsfaktoren enthalten auch Domänen, die DNA binden und können daher als Nukleinsäure-kondensierende Mittel verwendbar sein. Kurz ausgedrückt, Transkriptionsfaktoren, wie z. B. C/CEBP, c-jun, c-fos, AP-1, AP-2, AP-3, CPF, Prot-1, Sp-1, Oct-1, Oct-2, CREP und TFIID, enthalten basische Domänen, die DNA-Spezies binden.
Beispiele für andere positiv geladene Gruppierungen umfassen Polypren, DEAE-Dextran und kationische Lipide. Verwendbare kationische Lipide und Liposome sind oben beschrieben. Lipide und Liposome werden nach diesem Aspekt der Erfindung nicht verwendet um Polynukleotid und Lipoprotein beide einzukapseln. Das Lipoprotein muss freiliegen um seinen Zelloberflächenrezeptor zu binden.
Andere synthetische Verbindungen, die fähig sind, negativ geladene Polynukleotide zu binden, sind nützlich, z. B. Polymere von N-substituierten Glycinen und andere, wie es nachfolgend noch beschrieben wird.
In einer Zusammensetzung mit einem Lipoprotein kann das Polynukleotid-bindende Molekül in einer Menge vorliegen, die wirksam ist um das Polynukleotid zu neutralisieren. Allerdings kann das Polynukleotid-bindende Molekül auch im Überschuss zu einer wirksamen Menge zur Neutralisierung des abzugebenden Polynukleotids vorliegen. Ein derartiger Über schuss kann eine positive elektrische Nettoladung produzieren, wenn eine Komplexierung mit den abzugebenden Polynukleotiden erfolgt. Der positiv geladene Komplex kann dann mit Lipoproteinen Wechselwirken, welche negativ geladene Lipide, z. B. Phospholipide, umfassen.
Typischerweise ist das Polynukleotid-bindende Molekül im Überschuss, wenn die Menge 10% höher ist als die Menge um die Polynukleotidladung zu neutralisieren; typischer ist die Menge 50% höher, noch typischer 100% höher, sogar noch typischer 150% höher, noch typischer 200% höher, noch typischer 500% höher, noch typischer 20.000% höher, noch typischer 22.000% höher, noch typischer 25.000% höher, sogar noch typischer 30.000% höher, noch weiter typisch höher als 40.000% höher als die Menge, die zur Neutralisierung der elektrischen Ladung des gewünschten Polynukleotids wirksam ist.
POLYKATIONISCHE AGENTIEN
Die erfindungsgemäßen polykationischen Agentien können mit oder ohne Lipoprotein in einer Zusammensetzung mit dem gewünschten Polynukleotid, das abzugeben ist, enthalten sein.
Funktionelle Eigenschaften
A. Positive Nettoladung
Polykationische Agentien weisen typischerweise bei physiologisch relevantem pH eine positive Nettoladung auf und sind fähig, die elektrische Ladung von Nukleinsäuren zu neutralisieren um eine Abgabe an einen gewünschten Ort zu erleichtern. Diese Agentien finden sowohl in vitro, ex vivo und in vivo Anwendung. Beispielsweise können diese polykationischen Agentien verwendet werden um Zellen zu transfizieren, die zum Produzieren rekombinanter Proteine verwendet werden.
Alternativ können die erfindungsgemäßen polykationischen Agentien eingesetzt werden um Nukleinsäuren intramuskulär, subcutan, usw., an ein lebendes Subjekt abzugeben.
Der physiologisch relevante pH variiert zwischen in vitro- und in vivo-Anwendungen etwas. Typischerweise ist der physiologische pH mindestens 5,5, noch typischer mindestens 6,0, noch typischer mindestens 6,5. Üblicherweise ist der physiologisch relevante pH nicht höher als 8,5, noch üblicher nicht höher als 8,0, und noch üblicher nicht höher als 7,5.
Vorzugsweise ist der isoelektrische Punkt der erfindungsgemäßen polykationischen Agentien zur Neutralisierung von Nukleinsäuren mindestens 9.
B. Nicht-Toxizität und nicht-immunogene Eigenschaften
Die Zusammensetzung der polykationischen Agentien der Erfindung wird die gewünschte Toxizität und die gewünschten immunogenen Eigenschaften aufweisen. Eine in vitro-Zellkultur wird andere immunogene Beschränkungen haben als in vivo-Anwendungen bei Säugetieren.
Die erfindungsgemäßen polykationischen Agentien können in einfacher Weise auf Toxizität getestet werden. Beispielsweise können die Agentien Medium für Zellen zugesetzt werden, die in in vitro-Assays verwendet werden, z. B. cos-7-Zellen, chinesische Hamster-Eierstock zellen, usw. Alternativ können die Agentien in Standard-Tierversuchen auf Sicherheit untersucht werden.
C. Kondensationseigenschaften
Infolge der elektrischen Ladung ist eine Untergruppe dieser polykationischen Agentien fähig, die gewünschten Polynukleinsäuren zu einer komprimierten Größe zu kondensieren um eine Abgabe zu erleichtern. Typischerweise "kollabiert" eine Kondensation Polynukleotide oder Nukleinsäure zu makromolekularen Strukturen, üblicherweise zu einer Toroidform. Die kleinere Größe von kondensierten Nukleinsäuren vereinfacht die Abgabe, indem z. B. Nukleinsäuren in Liposome gepackt werden und/oder reduziert das Ausgesetztsein an Proteasen und/oder Nukleasen.
Die kondensierten Nukleinsäuren weisen im Vergleich zu "entspannten" Nukleinsäuren unterschiedliche Eigenschaften auf, z. B. (1) eine Verringerung bei der Interkalation von Ethidiumbromid oder anderen Interkalationsfarbstoffen, oder (2) eine verringerte Mobilität bei der Gelelektrophorese. Auf diese Weise kann eine Kondensation durch mindestens zwei verschiedene Assays, einen Assay mit Interkalationsfarbstoff oder einen Assay mit Bandenverschiebung, gemessen werden.
Ein Typ eines Assays mit Interkalationsfarbstoff verwendet Ethidiumbromid. In diesem Assay werden Test-Nukleinsäuren, zweckmäßigerweise Plasmid-DNA, mit einem polykationischen Agens vermischt, und zwar im Verhältnis von etwa 1 : 1 bis 1 : 50, als Gewichtsverhältnis von Plasmid zu Kondensationsmittel. Nach Inkubation wird Ethidiumbromid der Reaktion zu einer Endkonzentration von 1 μg/ml zugesetzt. Wenn eine Nukleinsäure, wie z. B. RNA, als Test-Nukleinsäure verwendet wird, kann Acridinorange als Interkalationsfarbstoff eingesetzt werden. Die Reaktionsgemische werden in UV-transparente Kunststoffröhrchen, die mit Agarosegel gepunktet sind, transferriert oder auf UV-transparenten Kunststoff c gegeben und mit Licht einer Wellenlänge von 260 nm belichtet. Die Emission aus dem DNA-Ethidiumbromid-Komplex wird mit einer Kamera, die mit einem geeigneten UV-Filter ausgestattet ist, auf einem Film aufgezeichnet. Die Fähigkeit eines Agens, DNA zu kondensieren, ist umgekehrt proportional zur Intensität der Fluoreszenz in jedem Reaktionsgemisch.
Der genauere Test ist der Bandenverschiebungsassay. Kurz ausgedrückt, dieser Assay wird durch Inkubieren von Nukleinsäuren, entweder markiert oder unmarkiert, mit verschiedenen Konzentrationen an Kandidaten-Kondensationsmitteln durchgeführt. Test-Nukleinsäuren, zweckdienlicherweise Plasmid-DNA, und Kondensationsmittel werden in Gewichtsverhältnissen von 1 : 1 bis 1 : 50 vermischt. Nach Inkubation wird jede Probe auf ein 1% Agarosegel geladen und einer Elektrophorese unterzogen. Das Gel wird entweder mit Ethidiumbromid gefärbt oder getrocknet und autoradiographiert. Eine DNA-Kondensation wird durch die Unfähigkeit, im Vergleich zu einem nicht-kondensierten Standard in das Gel einzutreten, bestimmt. Eine ausreichende Kondensation wird erreicht, wenn mindestens 90% der DNA nicht in signifikantem Ausmaß in das Gel eintreten.
Eine Kondensation kann auch ein Maß für die direkte Bestimmung der Größe des Komplexes unter Verwendung eines Lichtstreuungsinstruments, z. B. der Coulter N4MD-Submicron-Analyzer, gemessen werden. Polynukleotide und ein Kondensationsmittel werden in einem geeigneten Verhältnis, entweder alleine oder in Gegenwart von 2% PEG-2000 (Fisher Scientific) und 0,6 NaCl, inubiert und dann in 3 ml Wasser verdünnt. Diese verdünnte Lösung wird mit dem Coulter-Zählgerät analysiert, welches Partikel mit einer durchschnittlichen Größe von 0 bis 1.000 Nanometer (nm) detektieren wird. Kondensationsmittel, z. B. Poly-L-lysin, liefern typischerweise Partikel mit einem mittleren Durchmesser von etwa 5 bis 200 nm. Siehe Lee et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 8481–8487.
D. Serum- und/oder Nuklease-Schutzeigenschaften
Die erfindungsgemäßen polykationischen Agentien sind fähig, Nukleinsäuren vor einem Abbau in Serum oder vor Nukleasen, einschließlich Nukleasen, die in biologischen Flüssigkeiten, wie Serum, Prostata-Flüssigkeit, synovialer Flüssigkeit, usw., vorliegen, zu schützen. Ein Vorteil dieses Schutztyps ist der, das geringere Mengen der gewünschten Nukleinsäuren zur effizienten Verabreichung benötigt werden.
Wenn diese polykationischen Agentien in wirksamen Mengen vorliegen, können sie einen Serumabbau um mindestens 10 Minuten verzögern; noch üblicher reicht die verwendete Menge aus um einen Abbau um mindestens 30 Minuten zu verzögern; noch üblicher reicht die verwendete Menge aus um einen Abbau um mindestens 45 Minuten zu verzögern; noch üblicher reicht die verwendete Menge aus um einen Abbau um mindestens 60 Minuten zu verzögern; und noch üblicher reicht die verwendete Menge aus um einen Abbau um mindestens 90 Minuten zu verzögern, und noch üblicher reicht die verwendete Menge aus um eine Abbau für mindestens 120 Minuten zu verzögern.
Ein erhöhter Serumschutz kann in einfacher Weise durch Inkubation des Polykation/Polynukleotid-Komplexes, beispielsweise mit Mausserum, gemessen werden. Vorzugsweise wird das Serum nicht hitzeinaktiviert sein. Nach Inkubation kann das Gemisch durch Gelelektrophorese analysiert werden um die Menge der restlichen Polynukleotide nach Inkubation zu bestimmen.
Alternativ können den polykationisches Agens/Nukleinsäure-Komplexen Nukleasen zugesetzt werden. Das resultierende Gemisch kann durch Gelelektrophorese analysiert werden um den Abbaugrad zu bestimmen. Es können auch andere biologische Flüssigkeiten, wie Prostataflüssigkeit, untersucht werden.
E. Vermittlung des Eintritts von Polynukleotiden in eine Zelle
Die polykationischen Agentien können einen Eintritt von Polynukleotiden in eine Zelle vermitteln. Ein Einbau von Polynukleotiden in eine Zelle kann beispielsweise entweder durch Protein-Expressionsassays oder Polynukleotid-Hybridisierungstechniken gemessen werden.
Ein Verfahren zum Detektieren der Häufigkeit des Einbaus besteht darin, ein Gen einzuschließen, das für ein Markerprotein, wie z. B. Luciferase, codiert. Zellen, die die abgegebenen Polynukleotide eingebaut haben, werden das Markerprotein exprimieren. Das Protein kann durch Standard-Immunassays oder durch biologische oder enzymatische Aktivität, wie im Fall von Luciferase, detektiert werden.
Alternativ können Standard-Hybridisierungstechniken, z. B. Southern- oder Northern-Blots- oder Polymerasekettenreaktions (PCR)-Techniken verwendet werden um das Vorliegen der gewünschten Polynukleotide zu detektieren.
F. Zusätzliche Eigenschaften
Um den Eintritt von Nukleinsäuren in das Innere von Zellen zu erleichtern, können die vorliegenden Agentien fähig sein,

(a) das Polynukleotid an der Zelloberfläche zu binden;
(b) die Zellmembran zu destabilisieren;
(c) eine Endocytose auszulösen;
(d) Endosom-Pufferungskapazität zu zeigen;
(e) DNA/Lipid-Komplexe aus Endosomen freizusetzen; oder
(f) Kerntropismus zu zeigen.

Assays zum Detektieren dieser Charakteristika sind Standard und dem Fachmann auf diesem Gebiet bekannt.
Physikalische Eigenschaften
Die folgenden physikalischen Charakteristika sind Faktoren, die zu betrachten sind, wenn die Zusammensetzung der polykationischen Agentien bestimmt wird:

(a) Abstand zwischen den Substituenten und der Hauptkette;
(b) die Gesamtlänge der Kette;
(b) Hydrophobität und/oder Aromazität;
(c) Anzahl der Wasserstoffbindungsgruppen; und
(c) Ladung, einschließlich
(i) Typ der Ladungsgruppe, (ii) Dichte der Ladung, und (iii) Position.

Andere relevante Charakteristika umfassen strukturelle Flexibilität. Beispielsweise kann eine Helixkonformation des polykationischen Agenzes für einige Anwendungen bevorzugt sein.
Spezifische Abmessungen, die zu berücksichtigen sind, umfassen

(a) den Abstand von Phosphatgruppen im interessierenden Polynukleotid; und
(b) den Abstand von Monomergruppen in den interessierenden Agentien.

Synthetische polykationische Agentien
Die polykationischen Agentien der vorliegenden Erfindung haben die folgende allgemeine Formel (I):
worin:
n eine ganze Zahl von 10 bis 100 ist; und
für jedes Monomer:
R₂ und R₃ Wasserstoff sind und R₁ unabhängig aus Gruppierungen, die ein Molekulargewicht von 1 bis 200 Dalton haben, ausgewählt ist;
wobei das polykationische Agens repetitive Trimere umfasst, so dass zwei R₁-Gruppen in jedem Trimer neutrale Gruppierungen sind und eine R₁-Gruppe in jedem Trimer eine kationische Gruppierung ist;
Ta und Tc Terminierungsgruppen sind;
R₁ für mindestens ein Monomer nicht Wasserstoff ist; und
das polykationische Agens bei physiologischem pH eine positive elektrische Nettoladung aufweist.
Noch bevorzugter sind Polymere, die mindestens eine natürliche Aminosäure umfassen. Polymere, in denen R₂ und R₃ beide Wasserstoff sind, werden als poly-N-substituierte Glycine oder Poly-NSGs bezeichnet.
A. Monomere
Das polykationische Agens der Erfindung umfasst Monomere mit der folgenden Struktur (II):
Im Allgemeinen sind R₂ und R₃ Wasserstoff und hat R₁ ein Molekulargewicht von 1 bis 200 Dalton. Typischerweise ist das Molekulargewicht nicht mehr als 175.
Typischerweise umfasst jedes Monomer ein Wasserstoff an R₂ und R₃, die Struktur eines NSG.
Monomere, die in den polykationischen Agentien verwendet werden sollen, können entweder positiv geladen oder neutral sein.
Abbaustellen können in das Polymer eingebaut sein, z. B. indem Substituenten aus einer natürlichen Aminosäure eingebaut sind, wenn R₁ und R₃ Wasserstoff sind.
Als allgemeine Regel gilt, ein basisch geladenes Monomer hat einen pKa-Wert für die Seitenkette von mindestens 7,5. Positiv oder basisch geladene Monomere umfassen, ohne Begrenzung, solche, die die folgenden funktionellen Gruppen enthalten: Amino, Guanidino, Hydrazido und Amidino. Diese funktionellen Gruppen können entweder aromatisch oder aliphatisch sein.
Die Substituenten, die bei L-Aminosäuren gefunden werden, können ebenfalls an den R₁-Positionen der erfindungsgemäßen polykationischen Agentien eingebaut sein.
Natürlich vorkommende Aminosäuren und Analoga werden D-Aminosäuren genannt um die Chiralität dieser Moleküle anzuzeigen. In die polykationischen Agentien können auch L-Aminosäuren als Monomere eingebaut werden. Die Substituenten von L-Aminosäuren können z. B. dieselben sein wie die, die für die D-Aminosäuren genannt werden.
Vorteilhafte Monomere umfassen N-substituierte Glycinmonomere. Beispiele für N-Substitutionen umfassen Alkylphenyl, Indolylalkyl, Alkoxyphenyl, Halogenphenylalkyl und Hydroxyphenylalkyl, wie auch die nachfolgend dargestellten N-Substitutionen.
Die polykationischen Agentien können neutrale Monomere umfassen. Wie bei den positiv geladenen Monomeren, sind D-Aminosäure, L-Aminosäure und NSGs zur Einarbeitung als Monomere bevorzugt.
Nachfolgend sind Beispiele für solche Monomere angegeben:
B. Polykationische Polymere
Typischerweise weisen die polykationischen Agentien einen vorausgesagten isoelektrischen Punkt von mindestens 9 auf, ausgenommen die terminalen Gruppen, auf. Darüber hinaus enthalten die Agentien, ausgenommen die terminalen Gruppen, mindestens 33% positiv geladene Monomere. Typischerweise umfassen die Agentien keine sauren Monomeren.
Die Ladungsdichte und die Zusammensetzung des polykationischen Agens kann verändert werden um die spezifische Nukleinsäuresequenz, den Typ und andere Komponenten, die mit dem Komplex aus Nukleinsäuren und polykationischem Agens eingeschlossen sind, anzupassen.
Die Länge des Polymers ist mindestens 10 Monomere, üblicherweise 12 Monomere, noch üblicherweise 18 Monomere. Typischer werden die polykationischen Agentien eine Länge von mindestens 24 Monomereinheiten, typischer 30 Monomereinheiten, noch typischer 36 Monomereinheiten, sogar noch typischer 48 Monomereinheiten, haben. Das polykationische Agens kann eine Länge von bis zu 50 bis 75 bis 100 Monomereinheiten haben.
Das polykationische Agens umfasst Monomere, in denen alle R₂ und R₃ Wasserstoff sind. Wenn alle R₂ und R₃ Wasserstoff sind, umfasst das polykationische Agens noch bevorzugter repetitive Trimere mit der folgenden Monomersequenz (vom Amino- zum Carboxy-Terminus): (1) neutrales Monomer, (2) neutrales Monomer, und (3) positiv geladenes Monomer.
Vorzugsweise umfasst das neutrale Monomer eine aromatische Gruppe in der R₁-Position; bevorzugter umfasst die aromatische Gruppe einen einzelnen Ring, noch bevorzugter umfasst die aromatische Gruppe einen sechsgliedrigen Ring.
Typischerweise ist das positiv geladene Monomer Aminoalkyl in der R₁-Position, typischer umfasst das Aminoalkyl 1 bis 6 Kohlenstoffatome, und noch bevorzugter ist das Aminoalkyl Aminoethyl.
Typischer umfasst das polykationische Agens 5 bis 20 repetitive Trimere, Trimere mit zwei neutralen Gruppen und einer positiv geladenen R₁-Gruppe sind bevorzugt, z. B. Trimere mit der Sequenz neutrales Monomer, neutrales Monomer, positiv geladenes Monomer. Bevorzugter umfasst das polykationische Agens 5 bis 18 Trimere, bevorzugter 8 bis 16 Trimere, und sogar noch bevorzugter 12 bis 16 Trimere.
D. Verknüpfung von Polymeren miteinander
Polymere können miteinander verknüpft werden, indem terminierende Gruppen oder Seitenketten, die eine Vernetzung der Polymere erlauben, eingebaut werden. Beispielsweise können Polymere durch eine Disulfidbindung verknüpft werden. Andere Terminierungsgruppen, die zur Kupplung von Polymere nützlich sind, umfassen Carbonat, Harnstoff und dergleichen.
E. Zusätzliche Gruppen die in das Polymer einzuarbeiten sind
Zusätzliche Komponenten können in die polykationischen Agentien der vorliegenden Erfindung eingeschlossen werden, z. B. Targeting-Liganden. Solche zusätzlichen Gruppen können eine Endozytose der gewünschten Nukleinsäuren erleichtern oder eine Bindung der Nukleinsäuren an die Zelloberfläche unterstützen.
Polypeptide können in die polykationischen Agentien eingearbeitet werden. Beispiele umfassen, allerdings ohne Beschränkung: Asialoorosomucoid (ASOR); Transferrin; Asialoglykoproteine; Antikörper; Antikörperfragmente; Ferritin; Interleukine; Interferone, Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (GM-CSF), Granulozyten-Kolonie-stimulierender Faktor (G-CSF), Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor (M-CSF), Stammzellfaktor und Erythropoietin. Virale Agentien, z. B. Hüllproteine, können ebenfalls verwendet werden. Proteine aus anderen invasiven Organismen sind ebenfalls nützlich, z. B. das 17-Aminosäure-Peptid aus dem Circumsporozoitprotein von Plasmodium falciparum, das als RII bekannt ist.
Außerdem können Lipoproteine in das polykationische Agens eingearbeitet werden, z. B. Lipoprotein niedriger Dichte, Lipoprotein hoher Dichte oder Lipoprotein sehr niedriger Dichte. Es können auch Mutanten, Fragmente oder Fusionen dieser Proteine verwendet werden.
Andere Gruppen, die eingearbeitet werden können, umfassen, ohne Beschränkung: Hormone, Steroide, Androgene, Östrogene, Schilddrüsenhormon oder Vitamine, Folsäure. Folsäure kann z. B. gemäß Mislick et al., 1995, T. J. Bioconjugate Chem. 6: 512, in das polykationische Agens eingearbeitet werden.
Die polykationischen Agentien der vorliegenden Erfindung können chemisch mit Polyalkylenglykol konjugiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Polyalkylenglykol Polyethylenglykol. PEG kann gemäß Lu et al., 1994, Int. J. Pept. Protein Res. 43: 127, in ein polykationisches Agens eingearbeitet sein.
Außerdem kann das polykationische Agens chemisch mit Mono-, Di- oder Polysaccharid konjugiert sein. In einer bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts ist das Polysaccharid Dextran.
Diese zusätzlichen Gruppen können im polykationischen Agens eingearbeitet sein. Beispielsweise können R₁, R₂ und R₃ ein Substituent sein, der fähig ist, aktiviert zu werden um mit einer der obigen Gruppen zu vernetzen. Beispielsweise könnte eine Thiolgruppe enthalten sein um mit einer anderen Gruppe unter Bildung einer Disulfidbindung zu vernetzen.
F. Terminale Gruppen
Die terminalen Gruppen der erfindungsgemäßen polykationischen Agentien können so ausgewählt werden, dass sie zweckdienlich sind. Geeignete terminale Gruppen (d. h., Ta und Tc) umfassen z. B. -NH₂, -OH, -SH und -OOOH. Terminale Gruppen können so ausgewählt werden, dass sie die Targetingeigenschaften des polykationischen Agenzes verstärken und können beliebige der zusätzlichen Gruppen, die oben beschrieben wurden, sein.
Die oben beschriebenen zusätzlichen Gruppen können am Ende des polykationischen Agenzes eingebaut sein. Beispielsweise kann das polykationische Agens (1) mit einer Vielzahl von Carbonsäuren acyliert sein; (2) mit Sulfonylchloriden sulfonyliert sein, oder (3) mit Isocyanaten oder Isothiocyanaten derivatisiert sein. Sobald der Terminus aktiviert ist, kann er mit beliebigen der oben genannten Gruppen reagieren, z. B. einem Polypeptid, Lipoprotein niedriger Dichte oder Folsäure.
Ein Mittel zum Anfügen einer terminalen Gruppe an das polykationische Agens besteht z. B. darin, (1) den Aminoterminus mit Fmoc-Aminohexansäure zu acylieren, und (2) die Schutzgruppe Fmoc zu entfernen, wodurch ein primäres Amin gebildet wird, das weiter funktionalisiert werden kann.
Alternativ können die aminoterminalen Gruppen ohne Beschränkung umfassen: Acyl, z. B. Acetyl, Benzoyl; oder Sulfonyl, wie z. B. Dansyl.
Carboxyterminale Gruppen können z. B. Amid oder Alkylamid umfassen.
Synthese von polykationischen Agentien
Polykationische Agentien der vorliegenden Erfindung können entweder durch Fest- oder Lösungsphasenverfahren synthetisiert werden. Das Folgende ist ein Festphasenverfahren für die Synthese von NSGs, die allgemein für eine breite Vielzahl von Seitenkettensubstituenten verwendet werden. Dieses Verfahren kann unter Verwendung von Geräten zur automatisierten Peptidsynthese durchgeführt werden um so eine schnelle Synthese interessierender polykationischer Agentien zu ermöglichen. Solche Apparaturen sind im Handel beispielsweise von Applied Biosystems and Milligan erhältlich.
A. Aneinanderfügen von Monomeren in zwei Schritten
Ein Syntheseverfahren besteht darin, das Monomer aus zwei Submonomeren im Verlauf der Verlängerung eines Polymers, das ein NSG-Monomer umfasst, zusammenzufügen. Diese Technik wird bei Zuckermann et al., 1992, J. Amer Chem Soc 114(26): 10646–10647, und Zuckermann et al., PCT-Patentpublikation Nr. WO 94/06451, beschrieben. Die NSGs können auch als alternierende Kondensation eines Copolymers aus einem Acylierungsmittel und einem Amin angesehen werden.
Die Richtung der Polymersynthese mit den Submonomeren erfolgt in Richtung Carboxy zu Amino. Das Anfügen jedes Monomers im Verlauf einer Polymerbildung an der Festphase eliminiert die Notwendigkeit für Nα-geschützte Monomere, da nur reaktive Seitenkettenfunktionalitäten geschützt werden müssen.
Jede Monomeraddition umfasst zwei Schritte, einen Acylierungsschritt und einen Schritt der nukleophilen Verdrängung, wie es in 1 dargestellt ist.
Spezifischerweise besteht jeder Zyklus der Monomeraddition aus zwei Schritten:

(1) Acylierung eines sekundären Amins, das an den Träger gebunden ist, mit einem Acylierungsmittel, das eine Abgangsgruppe, die für eine nukleophile Verdrängungsreaktion durch ein Amin geeignet ist, und eine Carbonylgruppe, vorzugsweise Carboxyl, umfasst. Ein Beispiel ist Halogenessigsäure; und
(2) nukleophile Verdrängung der Abgangsgruppe mit einer ausreichenden Menge eines Submonomers, das eine primäre Aminogruppe umfasst, zur Einführung einer Seitenkette. Das eine Aminogruppe enthaltende Submonomer kann ein Alkoxamin, Semicarbazid, Acylhydrazid, substituiertes Hydrazin, oder dergleichen, sein.

Eine Acylierung kann mit Carbodiimid oder durch ein anderes geeignetes Carboxylat-Aktivierungsverfahren aktiviert werden.
Die Effizienz der Verdrängung wird durch die Wahl des Halogenids moduliert, z. B. I>Cl. Ein Schutz von aliphatischen Hydroxylgruppen, Carbonsäuren, Carboxy, Thiol, Amino, einigen Heterocyclen und anderen reaktiven Seitenkettenfunktionalitäten ist bevorzugt um unerwünschte Nebenreaktionen auf ein Minimum zu beschränken. Allerdings kann die milde Reaktivität einiger Seitenkettengruppierungen gegenüber einer Verdrängung oder Acylierung ihre Verwendung ohne Schutz erlauben, z. B. Indol, Imidazol und Phenol.
B. Anfügen von Monomer in drei Schritten
NSGs können auch unter Verwendung eines Verfahrens zur Anfügung jedes Monomers in drei Stufen, wenn das Polymer ausgedehnt wird, konstruiert werden. Die Hauptkette des Monomers wird zunächst durch einen Acylierungsschritt, gefolgt von einer nukleophilen Verdrängung, verlängert. Die Seitenkette wird durch einen zweiten Acylierungsschritt eingeführt. Das Reaktionsschema ist in 2 dargestellt.
Die Hauptkette aus dem Monomer wird in den ersten zwei Schritten des Synthesezyklus zusammengefügt. Die erste Reaktion ist ein Acylierungsschritt, in dem die Carbonylgruppe des Acylierungsreagenzes mit einem Amin reagiert. Das Acylierungsagens umfasst eine Carbonylgruppe; eine Hauptkette R_a und eine Abgangsgruppe, L. Vorzugsweise ist die Carbonylgruppe Carboxyl.
Der zweite Schritt ist eine nukleophile Verdrängung der Austrittsgruppe durch die erste Aminogruppe des Verdrängungsagens. Das Verdrängen des Agens umfasst eine erste und eine zweite Aminogruppe und eine Hauptkette, R_d. Die erste Aminogruppe ist ein primäres Amin, und der zweite Schritt produziert ein sekundäres Amin.
Der dritte Schritt ist eine weitere Acylierung, in der ein weiteres Acylierungssubmonomer mit der ersten Aminogruppe des Verdrängungsagens unter Herstellung eines tertiären Amids reagiert. Das Acylierungsagens umfasst eine Carbonylgruppe; einen fakultativen Linker und eine Seitenkette. Die Carbonylgruppe ist vorzugsweise Carboxyl.
Pharmazeutische Zusammensetzungen
Die polykationischen Agens/Polynukleotid-Komplexe, ob in Liposomen eingekapselt oder nicht, können in pharmazeutischen Zusammensetzungen verabreicht werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen umfassen eine therapeutisch wirksame Menge an Nukleinsäuren.
Der Ausdruck "therapeutisch wirksame Menge", wie er hier verwendet wird, bezieht sich auf eine Menge eines therapeutischen Agens, die ausreicht um eine besondere Krankheit oder einen besonderen Zustand nachweisbar zu behandeln, zu verbessern oder zu verhindern, d. h. eine Menge, die ausreicht, einen nachweisbaren therapeutischen oder präventiven Effekt zu induzieren. Der Effekt kann z. B. chemische Marker- oder Antigenlevel umfassen. Therapeutische Effekte umfassen auch eine Verringerung der physikalischen Symptome, z. B. gesenkte Körpertemperatur. Die genaue effektive Menge wird für ein Subjekt von der Größe und Gesundheit des Subjekts, der Natur und dem Grad des kardiovaskulären Zustands und den Therapeutika oder der Kombination von Therapeutika, die zur Verabreichung ausgewählt wurden, abhängen. Somit ist es nicht sinnvoll, im Voraus eine genaue wirksame Menge zu spezifizieren. Allerdings kann die wirksame Menge für eine gegebene Situation durch Routineexperimente bestimmt werden und unterliegt der Beurteilung des Arztes. Zu Zwecken der vorliegenden Erfindung wird eine wirksame Dosis etwa 0,01 mg/kg bis 50 mg/kg oder 0,05 mg/kg bis etwa 10 mg/kg der DNA-Konstrukte in dem Individuum, dem sie verabreicht werden, liegen.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung kann auch einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthalten. Der Ausdruck "pharmazeutisch annehmbarer Träger" bezieht sich auf einen Träger zur Verabreichung eines therapeutischen Agens, z. B. Antikörper oder ein Polypeptid, Gene und andere therapeutische Agentien. Der Ausdruck bezieht sich auch auf irgendeinen pharmazeutischen Träger, der selbst keine Produktion von Antikörpern, die für das Individuum, das die Zusammensetzung empfängt, gefährlich sind, induziert und der ohne unzulässige Toxizität verabreicht werden kann. Geeignete Träger können große, langsam metabolisierte Makromoleküle, wie Proteine, Polysaccharide, Polymilchsäuren, Polyglykolsäuren, polymere Aminosäuren, Aminosäurecopolymere und inaktive Viruspartikel sein. Solche Träger sind dem Fachmann auf diesem Fachgebiet gut bekannt.
Pharmazeutisch annehmbare Salze können hierin verwendet werden, z. B. Mineralsäuresalze, wie Hydrochloride, Hydrobromide, Phosphate, Sulfate, und dergleichen; und die Salze von organischen Säuren, wie Acetate, Propionate, Malonate, Benzoate, und dergleichen. Eine ausführliche Diskussion pharmazeutisch annehmbarer Exzipientien steht in Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Pub. Co., N.J. 1991) zur Verfügung.
Pharmazeutisch annehmbare Träger in therapeutischen Zusammensetzungen können Flüssigkeiten, wie Wasser, Kochsalzlösung, Glycerin und Ethanol enthalten. Außerdem können in solchen Vehikeln Hilfssubstanzen, wie z. B. Netzmittel oder Emulgiermittel, den pH puffernde Substanzen, und dergleichen, vorhanden sein. Typischerweise werden die therapeutischen Zusammensetzungen als injizierbare Präparate, entweder als flüssige Lösungen oder Suspensionen, hergestellt; feste Formen, die zur Lösung oder Suspension in flüssigen Vehikeln vor der Injektion geeignet sind, können ebenfalls hergestellt werden. In der Definition eines pharmazeutisch annehmbaren Trägers sind Liposome mit umfasst.
Abgabeverfahren
Sobald die Zusammensetzungen der Erfindung formuliert sind, können sie (1) dem Subjekt direkt verabreicht werden; (2) ex vivo an Zellen abgegeben werden, die aus dem Subjekt stammen; oder (3) zur Expression von rekombinanten Proteinen in vitro verabreicht werden. Die zu behandelnden Subjekte können Säugetiere oder Vögel sein. Es können auch Menschen behandelt werden.
Eine direkte Abgabe der Zusammensetzungen wird im Allgemeinen durch Injektion, entweder subcutan, intraperitoneal, intravenös oder intramuskulär, oder durch Abgabe in den interstitiellen Raum eines Gewebes erfolgen. Die Zusammensetzungen können auch in einen Tumor oder eine Läsion verabreicht werden. Andere Modi der Verabreichung umfassen eine orale Verabreichung und eine Verabreichung in die Lunge, Suppositorien und transdermale Anwendungen, Nadeln und Genpistolen oder Hyposprays. Eine Dosierungsbehandlung kann ein Einzeldosis-Behandlungsschema oder ein Schema mit mehreren Dosen sein.
Verfahren für die ex vivo-Abgabe und Reimplanation von transformierten Zellen in ein Subjekt sind auf dem Fachgebiet bekannt und z. B. in der internationalen Publikation WO 93/14778 (veröffentlicht am 5. August 1993) beschrieben. Beispiele für Zellen, die bei ex vivo-Anwendungen nützlich sind, umfassen z. B. Stammzellen, insbesondere hämatopoetische Stammzellen, Lymphzellen, Makrophagen, dendritische Zellen oder Tumorzellen.
Im Allgemeinen kann eine Abgabe von Nukleinsäuren sowohl für ex vivo-, wie auch in vitro-Anwendungen durch die folgenden Verfahren erreicht werden: z. B. Dextran-vermittelte Transfektion, Calciumphosphat-Präzipitation, Polybren-vermittelte Transfektion, Protoplastenfusion, Elektroporation, Einkapselung des Polynukleotids (der Polynukleotide) in Liposome und eine direkte Mikroinjektion der DNA in Kerne, wobei diese Verfahren alle auf dem Fachgebiet bekannt sind.
Die nachfolgend aufgeführten Beispiele werden als weiterer Leitfaden für den ausführenden Fachmann angeführt und sollen die Erfindung in keiner Weise beschränken.
Beispiel 1
Synthese von polykationischen Agentien
Dieses Beispiel beschreibt die Synthese von polykationischen Agentien mit der folgenden Struktur:
worin R₃ und R₂ für alle Monomeren Wasserstoff sind. Alle in diesem Beispiel beschriebenen Polymeren enden in einer Amino- und einer Carboxylgruppe, wenn nichts anderes spezifiziert ist, z. B. eine Folat-Terminierungsgruppe.
Die hierin beschriebenen polykationischen Agentien wurden nach den Verfahren synthetisiert, die in Figliozzi et al., 1996, Meth. Enzy. 267: 437–447, und Zuckermann et al., 1992, J. Amer. Chem. Soc. 114(26): 10646–10647, beschrieben sind.
Alle Polymere wurden unter Verwendung von Bromessigsäure und primären Aminen synthetisiert. Das Folgende sind Substituenten der primären Amine, die an R₁ unter Aufbau der polykationischen Agentien positioniert sind:
Peptoid-Folsäure-Konjugate
Die synthetisierten polykationischen Agentien umfassen:
(Es wird betont, dass nicht alle der folgenden polykationischen Agentien in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen)
Um das Verfahren zusammenzufassen, wird Fmoc-Rink-Amidharz (NovaBiochem, San Diego, Californien, USA) als fester Träger verwendet. Dies ist dasselbe Harz, wie das, das für die Fmoc-Synthese von C-terminalen Peptidamiden eingesetzt wird. Die polykationische Synthese beginnt mit der Entschützung der Fmoc-Gruppe am Harz mit 20% (V/V) Piperidin-Dimethylformamid (DMF). Das Aminoharz wird dann mit Bromessigsäure acyliert. Darauf folgt eine nukleophile Verdrängung des Bromids mit einem primären Amin um das NSG-Monomer aufzubauen. Die zuletzt genannten zwei Schritte werden dann in sich wiederholender Weise fortgesetzt um das gewünschte Oligomer aufzubauen.
Alle Reaktionen und Waschvorgänge wurden bei Raumtemperatur durchgeführt, wenn nichts anderes angegeben ist. Ein Waschen des Harzes bezieht sich auf die Zugabe eines Waschlösungsmittels (üblicherweise DMF oder Dimethylsulfoxid (DMSO)) zu dem Harz, Rühren des Harzes, so dass eine gleichmäßige Aufschlämmung erhalten wird (typischerweise für etwa 20 Sekunden), gefolgt von einem gründlichen Ablaufenlassen des Lösungsmittels vom Harz. Lösungsmittel wurden durch Vakuumfiltration durch den Frittenboden des Reaktionsbehälters, bis das Harz trocken schien (typischerweise etwa 5 Sekunden) entfernt. In allen Synthesen wurden Harzaufschlämmungen durch Einblasen von Argon durch den Boden des mit einer Fritte ausgestatteten Gefäßes gerührt.
Ein mit Fritte ausgestattetes Reaktionsgefäß wurde mit 100 mg (50 μmol) Fmoc-Rink-Amidharz mit einem Substitutionslevel ungefähr 0,50 mml/g Harz beschickt. Zwei Milliliter DMF wurden zu dem Harz gegeben, und die Lösung wurde für 1–2 Minuten bewegt um das Harz zu quellen. Dann wurde das DMF abtropfen gelassen. Danach wurde die Fmoc-Gruppe durch Zusatz von 2,0 ml 20% Piperidin in DMF zu dem Harz entfernt. Dieses wurde für 1 Minute gerührt und dann abtropfen gelassen. Weitere 2 ml 20% Piperidin in DMF wurden zu dem Harz gegeben und 15 Minuten gerührt und dann abtropfen gelassen. Das Harz wurde dann sechsmal mit 2 ml DMF gewaschen.
Das von einer Blockierung befreite Amin wurde dann acyliert, indem 850 μl 0,6 M Bromessigsäure in DMF zu dem Harz gegeben wurden und danach 200 μl 3,2 M N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) in DMF zugegeben wurde. Diese Lösung wurde für 30 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und dann abtropfen gelassen. Dieser Schritt wurde ein zweites Mal wiederholt. Das Harz wurde dann zweimal mit 2 ml DMF gewaschen und dann einmal mit 2 ml DMSO gewaschen. Dadurch wurde ein Reaktionszyklus beendet.
Der zweite Zyklus wurde durch den Acylierungsschritt mit Bromessigsäure und DIC initiiert, worauf sich eine Verdrängung mit dem zweiten Amin anschloss. Dieser Acylierungs-Nerdrängungs-Zyklus wurde wiederholt, bis das gewünschte Oligomer erhalten wurde.
Eine Spaltung des Harzes vom polykationischen Agens geschieht wie folgt. Das getrocknete Harz wurde in eine Szintillations-Glasphiole gegeben, die einen teflonbeschichteten Mikrorührstab enthielt, und es wurden etwa 5 ml 95%ige Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser zugesetzt. Die Lösung wurde für 20 Minuten gerührt und dann durch eine 8 ml-Festphasenexlxaktions(SPE)-Säule, die mit einer 20 μm-Polyethylenfritte ausgestattet war, in ein konisches 50 ml-Polypropylen-Zentrifugenröhrchen filtriert.
Das Harz wurde mit 1 ml 95%iger TFA gewaschen. Die kombinierten Filtrate wurden dann dreimal aus Acetonitril : Wasser 1 : 1 lyophilisiert. Das Material wurde zu einer Konzentration von 5 mmol in 5% Acetonitril in Wasser wieder aufgelöst.
Herstellung von Guanidinoalkyl-enthaltenden Polymeren
Die Guanidinoalkyl-Seitenketten wurden durch Modifikation von Aminoalkyl-Seitenketten nach der Synthese in die Polymeren eingeführt. Polymere wurden durch das Submonomerverfahren, wie es oben beschrieben ist, außer dass Methoxybenzhydrylamin (MBHA)-Harz anstelle des Rink-Harzes verwendet wurde, synthetisiert. Wo immer eine Guanidinoalkyl-Seitenkette gewünscht war, wurde im Verdrängungsschritt ein Mono-boc-alkandiamin eingebaut. Nach Aufbau der Polymeren wurden die Seitenketten-boc-Gruppen durch Behandlung mit 95% TFA/Wasser für 20 Minuten bei Raumtemperatur entfernt (dies entfernt das Oligomer nicht vom festen Träger). Die freien Aminogruppen wurden dann durch Behandlung mit 1H-Pyrazol-1-carboxamidin (1 M in DMF, 2 × 1 h, 40°C) guanidinyliert. Nach Waschen mit DMF und Methylenchlorid, wurde das Oligomer mit Fluorwasserstoffsäure vom Harz abgespalten und lyophilisiert.
Herstellung von Folsäure-Polymer-Konjugaten:
Folsäure-Polymer-Konjugate wurden hergestellt, indem ein Linker an das N-Ende des Harz-gebundenen Polymers angefügt wurde, welches dann mit Folsäure acyliert wurde. Spezifi scher ausgedrückt, nach Bildung des Polymers wurde das N-Ende mit Fmoc-Aminohexansäure (0,5 M in DMF, 0,5 M Hydroxybenzotriazol, 0,5 M Diisopropylcarbodümid (DIC), 1 × 1 h, Raumtemperatur) acyliert. Nach Entfernung der Fmoc-Gruppe (20% Piperidin/DMF, 1 × 20 Minuten, Raumtemperatur) wurde die freie primäre Aminogruppe mit Folsäure (0,1 M in DMSO, 0,1 M DIC, 1 × 2 h, 50°C) acyliert. Nach Waschen des Harzes wurde das Konjugat mit 95% TFA/Wasser in üblicher Weise abgespalten.
Beispiel 2
Kondensation von Polynukleotiden
Polykationische Agentien wurden synthetisiert und in einer Endkonzentration von 5 mmol isoliert, wie es in Beispiel 1 beschrieben ist. Polynukleotide wurden mit Verbindungen der Serien RZ110, RZ112 und RZ120 nach dem folgenden Verfahren kondensiert.

(1) Verdünne alle polykationischen Agentien zu einer Endkonzentration von 3 nmol positive Ladung pro Mikroliter.
(2) Gebe 1 μg DNA zu 1 bis 2 μl verdünnter polykationischer Agentien.
(3) Stelle das Volumen auf 10 μl ein. Das Gemisch kann über Nacht bei 4°C gelagert werden.
(4) Gebe 5 μl DNA/polykationisches Agens-Gemisch zu 2 μl 5XPuffer, der kein SDS enthält, um den Komplex aufrecht zu erhalten. (5XPuffer = 40% Saccharose, 0,25% Bromphenolblau und 200 mmol Trisacetat, 4 mmol EDTA (pH 7,8)).
(5) Stelle das Volumen auf 10 μl ein.
(6) Lasse die Probe an 1% Agarosegel unter Anlegung von 75 Volt für 1,5 Stunden laufen.

Es wurde festgestellt, dass zwischen 1 und 2 μl alle polykationischen Agentien die Wanderung von DNA in Agarosegel verzögern.
Beispiel 3
Inhibierung des Serumabbaus
Die Verbindungen der Reihen RZ110, RZ112 und RZ120 wurden mit Polynukleotid vermischt, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. 5 Mikroliter der Über-Nacht-Mischung wurden zu 5 μl BaIbC-Mausserum gegeben. Das Serum war nicht hitzebehandelt, aber gefroren und aufgetaut. Das Serum, polykationisches Agens und Polynukleotidgemisch wurden typischerweise für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Inkubationszeit variierte zwischen 5 und 60 Minuten.
Als nächstes wurden 2 μl 5XPuffer, der 0,5% (GN) SDS enthielt, zu dem inkubierten Gemisch gegeben. Diese Endlösung wurde auf ein 1% Agarosegel aufgeladen und für 1,5 Stunden einer Elektxophorese bei 75 Volt unterzogen.
Alle getesteten Verbindungen, d. h. die gesamte RZ110-, -112- und -124-Reihe, lieferten in einem direkten Vergleich einen deutlichen Schutz. Die gesamte RZ112-Reihe sowie RZ110-3 und RZ110-8 hemmten den Serumabbau besser als Poly-L-lysin.
Beispiel 4
Pentoid-vermittelte in vitro-Abgabe
DNA, die ein Luciferasegen umfasst, 1 μg/μl, wurde in Endotoxin-freiem Wasser verdünnt. Die Plasmid-DNA war CMVKm-Luciferase, die in Beispiel 5 detaillierter beschrieben ist.
Das Transfektionsprotokoll für eine in vitro-Abgabe war wie folgt:

(A) Es wurden HT1080-Zellen verwendet. Diese Zellen sind von der American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA, Zugangs-Nr. CCL 121, erhältlich. Dies ist ein Fibrosarkom. Das Waschstumsmedium war Dulbecco's modifiziertes Eagle-Medium (DME) mit 10% hitzeinaktiviertem fötalen Kälberserum.
(B) Vierundzwanzig Stunden vor Transfektion wurden die Zellen mit 5 × 10⁴ pro Vertiefung in eine Platte mit 24 Vertiefungen in 1 ml Medium gegeben.
1. Zellen werden mit 500 μl DME-10% fötales Kälberserum (FCS) oder 500 μl Opti-Mem^® ernährt. Opti-Mem^® kann von Gibco BRL, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, Maryland, USA, bezogen werden.
2. 200 μl Opti-Mem^® werden in jedes Röhrchen gegeben.
3. 3 μl des gewünschten polykationischen Agens werden zu den 200 μl Opti-Mem® gegeben.
4. Es werden 2 μl 1 μg/μl Luciferase-DNA zugesetzt, und es wird vermischt.
5. Inkubiere das Gemisch für 5 Minuten bei Raumtemperatur.
6. Es werden 100 μl des polykationischen Agens/DNA-Gemisches zu einer Platte mit DME-FCS gegeben, 100 μl zu Zellen, die mit Opti-Mem^® gefüttert werden.
7. Die Zellen und polykationisches Agens/DNA-Gemisch werden für ungefähr 4 Stunden bei 37°C inkubiert.
8. Das Medium wird für alle Zellen in DME-FCS gewechselt.
9. DME-FCS wurde als positive Kontrolle verwendet. Als Kontrolle wurde ein Transfektant, LT1, von Panvera, Inc., Madison, Wisconsin, USA, verwendet um Zellen Serum und Zellen in Opti-Mem zu transfizieren.
10. Zellen wurden unter Verwendung eines Promega Luciferase-Assaysystems von Promega, Madison, Wisconsin, USA, nach Anweisungen des Herstellers getestet.

Resultate:
Beispiel 5
Targeting-Ligand
A. Zellen, Vektor und Zusammensetzungen, die verwendet wurden.
In einem ersten Experiment wurden murine Endothelialzellen (Py-4-1), die hohe Level an acetylierten LDL-Rezeptoren exprimieren, verwendet. Die Zellen und die LDL-Rezeptoren werden in Dubois et al., 1991, Exp. Cell Res. 196: 302–313, beschrieben.
Ein Luciferase-enthaltendes Plasmid (pCMVkmLUC) wurde verwendet um zu bestimmen, ob Polynukleotide in Endothelialzellen abgegeben und exprimiert werden könnten, wenn sie mit polykationischen Agentien, die in Beispiel 1 beschrieben sind, mit acetyliertem LDL (Ac-LDL) verbunden sind. Eine Beschreibung der Identifizierung und Isolierung von Endothelialzellen, basierend auf ihrer erhöhten Aufnahme von acetyliertem Lipoprotein niedriger Dichte, ist in Voyta et al., 1984, J. Cell Biol. 99: 2034–2040, beschrieben.
Das in diesen Experimenten verwendete Plasmid pCMVkmLUC wurde konstruiert, indem das luc +-Gen aus pSP-luc+ (Promega Corporation, Madison, WI) in den Expressionsvektor pCMVkm2 insertiert wurde. Kurz ausgedrückt, pSP-luc+ wurde mit den Restriktionsenzymen Nhel-EcoRV (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) verdaut, und ein Fragment mit 1691 bp wurde durch Standardverfahren isoliert. Dieses Fragment wurde in pCMVkm2, welches mit XbaI und EcoRV verdaut worden war, unter Verwendung des Rapid Ligation Kit (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) insertiert. Die Sequenz von pCMVkm2 ist in SEQ ID NO: 2 gezeigt und wird nachfolgend beschrieben. Das luc+-Gen wurde in pCMVkm2 cloniert, so dass die Expression durch den CMV-unmittelbar frühen Enhancer-Promotor gesteuert wird und durch das Rinderwachstumshormon-Polyadenylierungssignal terminiert wird.
Die Luciferase-Expression wurde mit Leveln verglichen, die mit demselben Vektor erhalten werden, der in Verbindung mit Lipofectamin, ein Agens, das üblicherweise verwendet wird um Zellen in vitro zu transfizieren, abgegeben wird (Hawley-Nelson et al., 1993, Focus 15: 73). Die Resultate sind in der untenstehenden Tabelle angegeben.
B. Transfektionsverfahren:
Kurz beschrieben, die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen plattiert, zu etwa 80%iger Konfluenz wachsen gelassen, transfiziert und 24 Stunden später auf Luciferase-Aktivität untersucht. Alle Transfektionen erfolgten in Serum-enthaltendem Medium. Während der Herstellung des Transfektionsgemisches wurde zunächst pCMVkmLUC mit RZ112 vermischt, und dann wurden die DNA-kationischen polykationischen Agens-Komplexe zu Ac-LDL gegeben. Danach wurde Serum-enthaltendes Medium zu den Gemischen gegeben um das Volumen, das an jede Vertiefung abgegeben wurde, auf 0,5 ml einzustellen.
Lipofectamin wurde als positive Kontrolle verwendet. Zu dieser positiven Kontrolle wurde kein Lipoprotein gegeben. Lipofectamin ist eine 3 : 1 (G/G)-Liposomenformulierung des polykationischen Lipids 2,3-Dioleylosy-N-[2-(spermincarboxamido)ethyl]-N,N-dimethyl-1-propanaminiumtrifluoracetat (DOSPA) und des neutralen Lipids Dioleoylphosphatidyl- Ethanolamin (DOPE) in Membran-gefiltertem Wasser. Lipofectamin kann von Life Technologies, Gaithersburg, Maryland, USA, bezogen werden.
C. Assay auf Luciferase
Die Luciferase-Aktivität wurde unter Verwendung des Promega Luciferase-Assay-Systems, Madison, Wisconsin, analysiert.
D. Resultate
Tabelle 1 zeigt die Resultate eines Experiments, in dem das polykationische Agens RZ-112-2 mit Lipofectamin verglichen wurde um das Luciferasegen an Zellen abzugeben, die den acetylierten LDL-Rezeptor umfassen.
Tabelle 1 Luciferase-Aktivität
Beispiel 6
Vergleich von Zellen mit und ohne acetylierte LDL-Rezeptoren
A. Zellen mit Rezeptoren für acetyliertes LDL
Für dieses Experiment wurden K1735-Maus-Epithelial-Melanomzellen verwendet. Diese Zellen exprimieren niedrige oder nicht-existente Level an Ac-LDL-Rezeptoren. Eine Beschreibung der Zellen ist in J. Natl. Cancer Inst. 69(4): (1982), zu finden.
B. Verfahren
Kurz ausgedrückt, die Zellen wurden in Platten mit 24 Vertiefungen mit 10.000 Zellen pro Vertiefung in DME mit 10% FCS, ergänzt mit 2 mM L-Glutamin, plattiert. Die Py-4-1-Zellen wurden in 10% CO₂ bei 37°C kultiviert. Die K1735-Zellen wurden in 5% CO₂ bei 37°C kultiviert. Die Zellen wurden zu etwa 50% Konfluenz wachsen gelassen, transfiziert und 24 Stunden später auf Luciferase-Aktivität untersucht. Alle Transfektionen erfolgten in Serum-enthaltendem Medium.
Während der Herstellung des Transfektionsgemisches wurde pCMVkmLUC zuerst mit RZ112-2 vermischt, und die DNA-polykationisches Agens-Komplexe wurden dann zu Ac-LDL gegeben. Serum-enthaltendes Medium wurde zu den Gemischen gegeben um das Volumen, das in jede Vertiefung abgegeben wurde, auf 0,5 ml einzustellen.
C. Resultate Tabelle 2 Luciferase-Aktivität
Beispiel 7
Infektion von Polynukleotiden die für Erytroprotein codieren
A. Polynukleotide
CMVkm2 ist der in diesen Untersuchungen verwendete Standardvektor. CMVkm2 ist ein Vektor, der für die Expression in Säugetierzellen optimiert ist. Das Gen von Interesse wird in einen Polylinker cloniert, der in 3' einer humanen CMV-Expressionskassette insertiert wird. Diese Kassette enthält den humanen CMV-unmittelbar frühen Promotor/Enhancer, gefolgt von einem Intron A der humanen CMV-unmittelbaren frühen Region (Chapman et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 3937–3986). Die Transkription wird durch eine Polyadenylierungsstelle aus dem Rinderwachstumshormongen terminiert, die unmittelbar 3' des Polylinkers cloniert worden war. Siehe SEQ ID NO: 2 für den CMVkm2-Vektor.
Der CMV-km-cmEPO-Vektor wurde wie folgt aus CMVkm2 konstruiert. Die Cynomolgus-Affen-EPO-cDNA wurde von der ATCC (Zugangs-Nr. 67545, Rockville, MD) bezogen. Dieses Plasmid wurde mit AvrII und BglII geschnitten und die XbaI und BamHI-Stellen des CMVkm2-Vektors insertiert. Die insertierte Sequenz enthält die gesamte codierende Region von cmEPO (Genbank-Zugang M18189). Siehe SEQ ID NO: 3.
B. Mäuse
Mäuse mit schwerem kombiniertem Immundefekt (SCID) wurden von Charles River Labs, Wilmington, Massachusetts, USA, erhalten.
Es wurden intramuskuläre Injektionen wie folgt durchgeführt. Mäuse wurden mit 50 μl einer Lösung, die 80 mg/ml Ketamin und 4 mg/ml Xylazin enthielt, anästhesiert. Der Bereich, der den vorderen Tibialismuskel umgibt, wurde rasiert. 50 μl DNA mit einer Konzentration von 2,7 μg/μl in 0,9% Kochsalzlösung wurden in den vorderen Tibialismuskel beider Beine injiziert, wobei eine Nadel Nr. 28 verwendet wurde. Vierundzwanzig Stunden nach der ersten Injektion wurde eine zweite Injektion mit dem identischen Protokoll durchgeführt. Zur Bestimmung der Hämatokritwerte wurde wöchentlich Blut aus dem Sinus orbitalis entnommen.
C. Resultat
Die Hämatokritwerte bei 6 Mäusen, denen Plasmid, CMVkm-cmEpo (der die Cynomolgus-Affen-EPO-cDNA exprimiert), injiziert worden war, sind in der folgenden Tabelle 3 angegeben. Die Reihe, die als Kontrolle bezeichnet ist, zeigt den Durchschnittswert für drei Mäuse, die keine Injektion erhielten. Die Ausgangsdaten für die drei Kontrollmäuse sind im unteren Teil von Tabelle 3 angegeben. Die Maus 2 der injizierten Gruppe starb zwischen Woche 4 und 5 nach Injektion.
Beispiel 8
Infektion von Polynukleotiden die für Leptin codieren
A. Polynukleotide
Der oben beschriebene CMV-km2-Vektor wurde für diese Experimente eingesetzt. In den Vektor wurde entweder die Wildtyp- oder HA-Version der für Leptin codierenden Region insertiert. Die Karte des Plasmids ist in 4 dargestellt, und die Sequenz des Vektors mit Wildtyp-Leptin ist in SEQ ID NO: 4 gezeigt.
B. Mäuse
ob/ob-Mäuse wurden von Jackson Labs, Bar Harbor, Maine, USA, erhalten. Als erste der rezessiven Fettsuchtmutationen wurde die obese-Mutation (ob) 1950 von Ingall et al., 1950, J. Hered. 41: 317–318, identifiziert und beschrieben. Anschließend wurden 5 Einzelgenmutationen bei Mäusen beobachtet, die einen Fettsucht-Phenotyp erzeugen, wie es in Fiedmann et al., 1990, Cell 69: 217–220, beschrieben ist (in jüngerer Zeit wurde das Maus-obese-Gen und sein humanes Homologon cloniert, wie es in Zhang et al., 1994, Nature 372: 425, beschrieben ist).
C. Verfahren
Intramuskuläre Injektionen wurden wie folgt durchgeführt: Mäuse wurden mit derselben Ketaminlösung, die in Beispiel 7 beschrieben wurde, anästhesiert, und der Bereich um den vorderen Tibialismuskel wurde rasiert.
50 μl DNA mit einer Konzentration von 3,3 μg/μl in 0,9%iger Kochsalzlösung wurden in den vorderen Tibialismuskel beider Beine injiziert, wobei eine Nadel Nr. 28 verwendet wurde.
72 Stunden nach der ersten Injektion wurde eine zweite Injektion nach demselben Protokoll durchgeführt.
ob/ob-Mäusen der Gruppe 1 wurde ein Plasmid (CMVkM-Leptin-wt) injiziert, das für das Wildtyp-Maus-Leptinprotein codiert.
ob/ob-Mäusen der Gruppe 2 wurde ein Plasmid (CMVkm-Leptin-HA) injiziert, das für eine Form des Mausleptins codiert, die mit dem Epitop modifiziert ist, das durch den Antikörper 12CA5 erkannt wird. Die Aminosäuresequenz des Epitops ist SYPYDVPDYASLGGPS (Wilson et al., 1984, Cell 37: 767–778).
ob/ob-Mäusen der Gruppe 3 wurde eine 0,9%ige Kochsalzlösung injiziert.
Die Mäuse wurden jeden Tag gewogen (siehe Tabelle 4), und die proportionale Gewichtszunahme wurde für jede Maus während der ersten acht Tage errechnet. Die Resultate sind in Tabelle 5 angegeben. Für einen gegebenen Tag wurde das Gewicht vom Gewicht der individuellen Maus am Tag 0 abgezogen, und die Differenz wurde durch das Gewicht am Tag 0 dividiert. Die Daten für die proportionale Gewichtsänderung ab Tag 8 wurden unter Verwendung eines ungepaarten t-Tests analysiert. Beim Vergleich mit Kontrollmäusen der Gruppe 3 war der p-Wert für Mäuse der Gruppe 2 0,004. Beim Vergleich mit Kontrollmäusen der Gruppe 3 war der p-Wert für Mäuse der Gruppe 1 0,0038.
Anmerkung: Die Mäuse wurden an Tag 1 und Tag 2 nicht gewogen, die Werte für diese Tage wurden aus Tag 3 extrapoliert.
Tabelle 5
Beispiel 9
Peptoid-vermittelte in vitro-Abgabe in COS-, HT1080- und 293-Zelllinien
COS-Zellen (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, mit der Zugangs-Nr. CRL 1651) und HT1080-Zellen (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, mit der Zugangs-Nr. CCL 121) wurden kultiviert und mit pCMVkmLUC und verschiedenen polykationischen Agentien der vorliegenden Erfindung (beschrieben in Beispiel 1) nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Transfektionsprotokoll transfiziert. Die Luciferase-Aktivität wurde nach dem in Beispiel 4 beschriebenen Verfahren analysiert. Das Gesamtzellprotein wurde unter Verwendung eines Pierce-BCA-Kits nach Anweisungen des Herstellers gemessen.
Die in 7A angegebenen Resultate zeigen, dass die Fähigkeit der polykationischen Agentien, eine Transfektion zu vermitteln, nicht vom Zelllinientyp abhängig ist. Polykationische Agentien, die eine repetitive Trimergruppierung aus neutralen und kationischen Seitenketten haben, waren bei der Vermittlung der Transfektion besonders wirksam.
Für eine homologe Reihe kationischer Peptoide wurde die Transfektionswirksamkeit beurteilt. Spezifischer ausgedrückt, die kationischen Peptoide RZ-110-1 (18-mer), RZ-120-3 (24-mer), RZ120-7 (36-mer) und RZ120-11 (48-mer), die dieselbe repetitive (HHP)-Gruppierung haben, wurden bezüglich ihrer Fähigkeit, COS- und HT1080-Zellen zu transfizieren, beurteilt. Diese polykationischen Agentien wurden mit pCMVkmLUC im + zu -Ladungsverhältnis von 2 : 1 komplexiert. Die Konzentration der negativen Ladungen an DNA wurde unter Verwendung von 3,03 nmol Phosphat pro 1 μg DNA auf der Basis des durchschnittlichen Molekulargewichts von 330 für jedes Nukleotid errechnet. Das Formelgewicht des polykationischen Agens wurde als Semi-Trifluoracetat-Salz (50% der Aminogruppen bilden mit TFA ein Salz) errechnet, und die Konzentration des polykationischen Agens wurde auf der Basis des Gewichts des lyophilisierten Peptoids bestimmt. Aminogruppen wurden formal als vollständig protoniert angesehen um die Zahl der positiven Ladungen auf dem interessierenden polykationischen Agens zu erhalten, wenn die + zu -Ladung errechnet wurde.
Wie in 7B gezeigt ist, waren die Transfektionswirksamkeiten für diese besondere Reihe kationischer Peptoide in großem Umfang für Peptoide mit 24 oder mehr Monomereinheiten von der Oligomerlänge unabhängig.
Transfektionseffizienzien unter Verwendung des polykationischen Agens RZ145-1 und im Handel erhältlicher kationischer Lipide, DMRIE-C^TM, Lipofectin^® und Lipofectamin, wurden beurteilt. In diesen Experimenten wurde RZ145-1 mit pCMVkmLUC in einem + zu -Ladungsverhältnis von 2 : 1 komplexiert. Die Transfektion mit DMRIE-C^TM, Lipofectin^® und Lipofect-amin wurde nach Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Die kationischen Lipide wurden auch in einem + zu -Ladungsverhältnis von 2 : 1 verwendet. Humane 293-Embryonen-Nierenzellen (Microbix, Toronto, Ontario, Canada), HT1080-Zellen und NIH-3T3-Zellen (erhältlich von der American Type Culture Collection, Rockville, MD, Zugangs-Nr. CRL 1658) wurden transfiziert, entweder in Gegenwart oder Abwesenheit von 10% Serum kultiviert, dann auf Luciferaseproduktion untersucht, wobei das in Beispiel 4 beschriebene Protokoll angewendet wurde. Die Luciferase wurde, wie in Beispiel 4, 48 Stunden nach Transfektionsbeginn gemessen. Das Gesamtzellprotein wurde unter Verwendung eines Pierce-BCA-Kits nach den Anweisungen des Herstellers gemessen.
Die Resultate, die in 8 gezeigt sind, geben an, dass ein Gentransfer, der durch das polykationische Agens RZ145-1 vermittelt wurde, im Gegensatz zu einer Vermittlung durch Lipofectin^® und Lipofectamin, die jeweils in Gegenwart von Serum 10- und 100fach weniger wirksam waren gegenüber einem Serumvorliegen, unempfindlich war.
Eine Transfektion, die durch polykationische Polymere, wie z. B. Polylysin und Histone, vermittelt wird, wird durch Zusatz von Chloroquin zu dem Transfektionsmedium stark erhöht. Um zu bestimmen, ob Chloroquin eine Transfektion, die durch polykationische Agentien der vorliegenden Erfindung vermittelt wird, beeinträchtigt wird, wurden HT1080- und 293-Zellen unter Verwendung von RZ145-1 in Gegenwart und Abwesenheit von Chloroquin transfiziert. Als Kontrolle wurden dieselben Zelllinien mit Polylysin, sowohl in Gegenwart, als auch in Abwesenheit von Chloroquin, transfiziert. Die in 9 angegebenen Resultate zeigen, dass das polykationische Agens RZ145-1 bei der Vermittlung von Transfektion sowohl mit, als auch ohne Chloroquin gleich wirksam war. Dagegen war eine durch Polylysin vermittelte Transfektion in Abwesenheit von Chloroquin 100 Mal geringer als eine durch Polylysin vermittelte Transfektion in Gegenwart von Chloroquin. Außerdem geben die Resultate an, dass eine durch kationisches Peptoid vermittelte Transfektion wirksamer ist als eine durch Polylysin vermittelte Transfektion.
Beispiel 10
Herstellung einer stabilen Formulierung eines DNA/polykationisches Agens-Komlexes
A. Bildung eines DNA/polykationisches Agens-Komplexes (2 : 1 + zu -Ladungsverhältnis)
Alle Arbeitsgänge wurden bei Umgebungstemperatur durchgeführt. DGPW (gereinigtes Wasser mit Diagnosequalität) wurde zur Herstellung von Stammlösungen verwendet. Sowohl das polykationische Agens, als auch DNA-Proben, hatten niedrige Salzkonzentrationen (d. h., > 1 mM) um eine Präzipitatian zu vermeiden.
(1) Chargenverfahren
Komplexe aus polykationischem Agens RZ145-1 und pCMVkmLUC, wie folgt, für bis zu 250 μg DNA. DNA (d. h. pCMVkmLUC) wurde mit 30% (V/V) Ethanol in Wasser zu einer Konzentration von 50 μg/ml verdünnt, was 151 μM negativer Ladung entspricht. RZ145-1 wurde in 30% Ethanol in Wasser auf 23,2 μM verdünnt. Zu einem Teil der Lösung des polykationischen Agens wurde so schnell wie möglich unter sanftem Rühren ein Teil DNA-Lösung gegeben. Die DNA-Lösung wurde zu der Lösung des polykationischen Agens (eher als umgekehrt) gegeben um eine Präzipitation zu vermeiden. Ein langsamer Zusatz der zwei Lösungen wurde vermieden um eine Präzipitation und Bildung großer Komplexe zu vermeiden.
(2) Kontinuierliches Verfahren
Für mehr als 250 μg DNA ist ein kontinuierliches Verfahren zur Herstellung konzentrierter Formulierungen des polykationisches Agens/DNA-Komplexes bevorzugt. Die DNA- und Peptoid-Lösung wurden wie oben hergestellt und in getrennte Flaschen gegeben. Jede Flasche wurde mit einer Öffnung eines Misch-T-Stücks verbunden. Die Flaschen wurden gleichzeitig mit 2 bis 3 psi unter Druck gesetzt um zwei Ströme mit derselben Strömungsgeschwindigkeit (z. B. 20 ml/min oder höher) dem Misch-T-Stück zuzuführen.
B. Konzentrierungschritt
Zwei Milliliter des DNA-polykationisches Agens-Komplexes aus Teil A wurden in eine Centricon^®-100 (Amico Inc. Beverly, MA) gegeben und mit 1.000 × g für 30 Minuten oder bis das Volumen des Retentats, das polykationisches Agens-DNA-Komplex enthielt, etwa 50 μl war, zentrifugiert. Das Filtrat wurde vom Bodenaufnehmer entfernt. Das Retentat wurde mit 2 ml 5%iger Glucose verdünnt und erneut auf 50 μl konzentriert. Dieser Vorgang wurde wiederholt um eine konzentrierte Komplexlösung herzustellen, die 1 mg/ml DNA in 5% Glucose enthielt. Dieser Konzentrierungsschritt kann entweder bei 4°C oder bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Der Ethanolgehalt der endgültigen konzentrierten Lösung war weniger als 0,1%. In der konzentrierten Lösung wurde keine Präzipitation beobachtet.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Polykationisches Agens, das die folgende Formel hat.
worin n eine ganze Zahl von 10 bis 100 ist; für jedes Monomer:
R₂ und R₃ Wasserstoff sind und R₁ unabhängig aus Gruppierungen, die ein Molekulargewicht von 1 bis 200 Dalton haben, ausgewählt ist; wobei das polykationische Agens repetitive Trimere umfasst, so dass zwei R₁-Gruppen in jedem Trimer neutrale Gruppierungen sind und eine R₁-Gruppe in jedem Trimer eine kationische Gruppierung ist; Ta und Tc Terminierungsgruppen sind; R₁ für mindestens ein Monomer nicht Wasserstoff ist und das polykationische Agens bei physiologischem pH eine positive elektrische Nettoladung aufweist.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1, wobei jedes R₁ aus Substituenten ausgewählt ist, die bei Aminosäuren gefunden werden.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1, wobei jedes R₁ eine aromatische oder aliphatische Gruppe ist.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1, wobei mindestens ein R₁ ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Alkylammonium, Aminoalkyl, Guanidinoalkyl, Amidinoalkyl, Aminocyclohexyl, Piperidyl, Guanidinobenzyl, Amidinobenzyl, Pyridylmethyl, Aminobenzyl, Alkylphenyl, Indolylalkyl, Alkoxyphenylalkyl, Halogenphenylalkyl und Hydroxyphenylalkyl.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1, wobei die kationische Gruppierung Aminoethyl ist.
Polykationisches Agens nach Anspruch 5, wobei die neutralen Gruppierungen aus der Gruppe, bestehend aus Phenethyl, Benzyl, Phenylpropyl, (R) alpha-Methylbenzyl, (S) alpha-Methylbenzyl, Methoxyphenethyl und Chlorphenetyl, ausgewählt sind.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1, wobei n 36 ist.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1, wobei n 24 ist.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1, wobei n 18 ist.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1, wobei n 12 ist.
Polykationisches Agens nach Anspruch 5, wobei Ta und Tc aus der Gruppe, bestehend aus -NH₂, -OH, -SH, -COOH, Polypeptid, Lipid, Lipoprotein, Vitamin, Hormon, Polyalkylenglycol und Saccharid, ausgewählt sind.
Zusammensetzung, umfassend: (i) ein Polynukleotid und (ii) das polykationische Agens nach Anspruch 1, wobei das polykationische Agens fähig ist, einen Eintritt eines Polynukleotids in eine Zelle zu vermitteln.
Zusammensetzung nach Anspruch 12, die außerdem einen pharmazeutisch annehmbaren Träger umfasst, wobei das polykationische Agens in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, um das Polynukleotid zu neutralisieren.
Verfahren zur Komplexierung eines Polynukleotids mit einem polykationischen Agens, umfassend: (i) Bereitstellen eines Polynukleotids und (ii) Inkontaktbringen des Polynukleotids mit dem polykationischen Agens nach Anspruch 1.
Verfahren zum Kondensieren eines Polynukleotids, umfassend: Inkontaktbringen des Polynukleotids mit dem polykationischen Agens nach Anspruch 1 in einer Menge, die ausreicht, um die Größe des Polynukleotids zu reduzieren.
Polykationisches Agens nach Anspruch 1 zur Verwendung in einem Verfahren zur Inhibierung des Serumabbaus eines Polynukleotids durch Inkontaktbringen des Polynukleotids mit dem polykationischen Agens, wobei das polykationische Agens in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, um den Serumabbau des Polynukleotids für mindestens 10 Minuten zu inhibieren.
Zusammensetzung, umfassend: (i) ein Lipoprotein; (ii) ein polykationisches Agens nach Anspruch 1 und (iii) ein Polynukleotid, wobei die Zusammensetzung fähig ist, die Häufigkeit einer Polynukleotidaufnahme in eine Zelle zu erhöhen.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Lipoprotein aus der Gruppe, bestehend aus Lipoprotein mit hoher Dichte, Lipoprotein mit mittlerer Dichte, Lipoprotein mit geringer Dichte und Lipoprotein mit sehr geringer Dichte, ausgewählt ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Lipoprotein eine Mutante, ein Fragment oder eine Fusion des Proteins, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Lipoprotein mit hoher Dichte, Lipoprotein mit mittlerer Dichte, Lipoprotein mit geringer Dichte und Lipoprotein mit sehr geringer Dichte, ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Lipoprotein acetyliertes Lipoprotein mit geringer Dichte ist.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das polykationische Agens in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, um die negative Ladung des Polynukleotids zu neutralisieren.
Zusammensetzung nach Anspruch 17, wobei das Lipoprotein mit dem polykationischen Agens elektrostatisch einen Komplex bildet.
Verfahren zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Erleichterung des Eintritts eines Polynukleotids in eine Zelle, wobei das Verfahren umfasst: (i) Inkontaktbringen eines Polynukleotids mit einem polykationischem Agens, wie es in Anspruch 1 definiert ist, in einer Menge, die wirksam ist, um das Polynukleotid zu neutralisieren, unter Bildung eines Komplexes und (ii) Inkontaktbringen des Komplexes mit einem Lipoprotein.
Zusammensetzung, umfassend (a) ein Polynukleotid und (b) das polykationische Agens von Anspruch 1 in einer Menge, die wirksam ist, um die negative Ladung des Polynukleotids zu neutralisieren, zur Verwendung in einem Verfahren zur Erhöhung der Häufigkeit einer Polynukleotidaufnahme in die Zelle durch Inkontaktbringen der Zusammensetzung mit der Zelle.
Zusammensetzung nach Anspruch 24, wobei die Zusammensetzung außerdem ein Lipoprotein umfasst.