Technischer Bereich
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Die vorliegende Erfindung betrifft TKR2648, das ein Antibiotikum zur
Verwendung als therapeutisches Mittel für Pilzinfektionskrankheiten ist,
ein Verfahren zur Herstellung und Mikroorganismen, die das
Antibiotikum produzieren.
Stand der Technik
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Es ist bekannt, dass Pilze bei Menschen, Tieren und Pflanzen eine
Reihe von Infektionskrankheiten auslösen. Beim Menschen lösen sie
beispielsweise oberflächliche Mykosen aus, die die Haut, die Mundhöhle
usw. betreffen und systemische Mykosen, die die Eingeweide, das
Gehirn usw. betreffen. Sie lösen ähnliche Infektionen auch bei Haustieren
und Nutztieren aus. Außerdem bedingen Pilze eine Reihe schädlicher
Auswirkungen auf Pflanzen wie Obstbäumen und Gemüsen.
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Als hauptsächliche pathogene Pilze, die systemische Mykosen beim
Menschen auslösen sind unter anderen die der Gattungen Candida,
Cryptococcus und Aspergillus bekannt. Bei den oberflächlichen
Mykosen werden Candida-Spezies, die die Haut, Mundhöhle und Vagina
befallen und Trichophyton, die die Haut der Extremitäten infizieren, als
die überwiegenden pathogenen Pilze betrachtet. Neben diesen Pilzen
gibt es viele andere Pilze in der Umwelt und sie stehen im Verdacht, die
Lebensräume von Tieren und Pflanzen zu verseuchen.
Durch die Erfindung zu lösende Probleme
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Es sind nur sehr wenige Antimykotika zur Verwendung in der Verhütung
und Behandlung solcher Pilzinfektionen und -verseuchungen bekannt.
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Als therapeutische Arzneistoffe für systemische Mykosen bei Menschen
und Tieren können beispielsweise Amphotericin B, Flucytosin,
Miconazol und Fluconazol genannt werden. Diese Verbindungen sind jedoch
nicht ganz zufriedenstellend in ihrer Wirkungskraft, ihrem toxischen
Potenzial oder Antipilzspektrum, so dass sie deshalb als therapeutische
Arzneistoffe nicht unwidersprochen sind.
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In Hinblick auf den oben genannten Stand der Technik stellt sich die
vorliegende Erfindung die Aufgabe, ein neues Antibiotikum zur
Verfügung zu stellen, das als therapeutischer Wirkstoff für Pilzinfektionen von
Bedeutung ist.
Mittel zum Lösen der Probleme
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Bei ihrer Suche nach einem neuen Antibiotikum haben die Erfinder der
vorliegenden Erfindung eine große Zahl von Mikroorganismen aus dem
natürlichen Lebensraum isoliert, die von ihnen produzierten Antibiotika
isoliert und ihre biologischen Eigenschaften genau untersucht. Als
Ergebnis davon wurde entdeckt, dass die Kulturbrühe eines Stammes des
Mikroorganismus der Gattung Penicillium ein Antibiotikum enthielt, das
Antipilzaktivität gegen pathogene Pilze wie Candida albicans,
Cryptococcus neoformans und Aspergillus fumigatus aufweist.
Dementsprechend haben die Erfinder dieses Antibiotikum isoliert und seine
physikochemischen Eigenschaften untersucht. Als Ergebnis davon wurde
entdeckt, dass das oben genannte Antibiotikum eine neue Substanz ist, die
bestimmte physikochemische Eigenschaften aufweist und es wurde
TKR2648 genannt.
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Die vorliegende Erfindung ist daher in einem ersten Aspekt auf das neue
Antibiotikum TKR2648 gerichtet, das durch die folgende chemische
Formel (I) dargestellt ist, oder ein pharmakologisch akzeptables Salz
davon.
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Die vorliegende Erfindung ist ferner in einem zweiten Aspekt auf ein
Verfahren zur Herstellung des neuen Antibiotikums TKR2648 gerichtet,
das Kultivieren eines Stammes von Mikroorganismen, die der Gattung
Penicillium angehören und in der Lage sind, das Antibiotikum TKR2648
auszubilden, und Isolieren der Substanz aus der erhaltenen Kulturbrühe
umfasst.
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In einem dritten Aspekt ist die vorliegende Erfindung auf einen
Mikroorganismus gerichtet, der zur Gattung Penicillium gehört und in der Lage
ist, das Antibiotikum TKR2648 zu produzieren.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Fig. 1 stellt ein Schaubild dar, das das Ultraviolettabsorptionsspektrum
des Antibiotikums TKR2648 zeigt.
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Fig. 2 stellt ein Schaubild dar, das das Infrarotabsorptionsspektrum des
Antibiotikums TKR2648 zeigt.
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Fig. 3 stellt ein Schaubild dar, das das ¹H-NMR-Spektrum des
Antibiotikums TKR2648 zeigt.
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Fig. 4 stellt ein Schaubild dar, das das ¹³C-NMR-Spektrum des
Antibiotikums TKR2648 zeigt.
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Fig. 5 ist ein HPLC-Schaubild des Antibiotikums TKR2648, das seine
Elutionsposition zeigt.
Ausführliche Beschreibung der Erfindung
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Die vorliegende Erfindung wird nun ausführlich beschrieben.
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Das Antibiotikum TKR2648 der Erfindung weist die folgenden
physikochemischen Eigenschaften (1), (2), (3), (4), (5) und (6) auf.
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(1) Massenspektrum (FAB-MS): m/z 229 [M + H]&spplus;
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(2) Molekularformel: C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub6;O&sub5;. Hochauflösendes FAB-MS: 229.1090
[M + H]&spplus; (berechneter Wert 229.1076)
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(3) Spezifische optische Drehung [α]D²&sup0; + 126º (c 1.0, Methanol)
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(4) UV-Spektrum (in Methanol): die Anzahl der Wellenlängen (nm)
maximaler Absorption beträgt 232 (E1cm1% 510) wie es in Fig. 1 gezeigt ist.
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(5) IR-Spektrum (KBr-Methode): die Anzahl der Wellenlängen (cm&supmin;¹) der
Hauptabsorption betragen 2960, 1730, 1630, 1390, 1210, 1010, 930 wie
es in Fig. 2 gezeigt ist.
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(6) Löslichkeit: löslich in Chloroform und Methanol, kaum löslich in
Hexan und Wasser.
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Außerdem weist das oben genannte TKR2648 das in Fig. 3 gezeigte ¹H-
NMR-Spektrum auf und das in Fig. 4 gezeigte ¹³C-NMR-Spektrum und
ist dadurch gekennzeichnet, dass es bei der
Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie in der in Fig. 5 angegebenen
Position eluiert wird.
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Außerdem stellt die Abszisse in Fig. 1 die Wellenlänge (nm) dar. Die
Abszisse in Fig. 2 stellt die Wellenzahlen (cm&supmin;¹) dar. Die Abszisse in Fig.
3 und 4 stellt den chemischen Verschiebungswert (ppm) dar. In Fig. 5
stellt die Ordinate die relative Intensität der Ultraviolettabsorption und die
Abszisse stellt Retentionszeit (min) dar.
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Das oben genannte TKR2648 kann hergestellt werden durch Kultivieren
eines Stammes des Mikroorganismus, der zur Gattung Penicillium
gehört und in der Lage ist, das TKR2648 in einem Kulturmedium zu
produzieren, und Isolieren der Substanz aus der erhaltenen Kulturbrühe.
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Es gibt keine Einschränkung bezüglich des Stammes des
Mikroorganismus, der in der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann,
vorausgesetzt, er gehört zur Gattung Penicillium und ist in der Lage, das
TKR2648 zu erzeugen. Auf diese Weise kann beispielsweise der Stamm
Penicillium sp. TKR2648 (nachfolgend als TKR2648-Stamm bezeichnet)
genannt werden.
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Der oben genannte TKR2648-Stamm ist ein neuer Stamm, der bisher
nicht in der Literatur beschrieben wurde und der von den Erfindern der
vorliegenden Erfindung das erste Mal isoliert und charakterisiert wurde.
Der Stamm besitzt die Eigenschaft, TKR2648 mit Vorteil zu erzeugen.
Die mykologischen Merkmale dieses TKR2648-Stammes werden nun
ausführlich beschrieben.
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Die Farben der Kolonien des TKR2648-Stammes auf verschiedenen
Medien sind in Tabelle 1 gezeigt. Die Beschreibungen von Farben in der
Tabelle beruhen auf den zuvor im japanischen Industriestandard (JIS)
Z8102 (1985) beschriebenen und geben die Ergebnisse von
Beobachtungen am Tag 7 der Kultur bei 25ºC nach Beimpfung im
entsprechenden Medium an.
Tabelle 1
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Der obige TKR2648-Stamm wächst üppig auf Malzextraktagar,
Kartoffeldextroseagar und Czapek-Agar usw, wobei sich Kolonien ergeben,
die eine samtige Oberflächentextur mit einem leicht erhabenen Zentrum
zeigen. Der Konidienfaden des TKR2648-Stammes misst 90 bis 270 ·
1,8 bis 3,0 um und weist eine glatte Oberfläche auf, wobei sich
üblicherweise symmetrische bivertillate Fäden (penicilli) bilden. Die Metula
misst 12,0 bis 14,0 · 2,8 bis 3,2 um, wobei sie in Gruppen von 2 bis 4
auftreten, und die Phialiden sind gewunden und messen 9,0 bis 10,0 ·
1,8 bis 2,4 um. Die Konidien sind kugelförmig bis subkugelförmig, und
weisen jeweils eine glatte Oberfläche auf und messen 2,2 bis 3,2 · 2,4
bis 4,0 um.
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Unter den mykologischen Merkmalen des TKR2648-Stammes sind die
physiologischen Eigenschaften wie folgt.
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Temperaturbereich für das Wachstum: der Temperaturbereich für das
Wachstum beträgt 10 bis 25º'C und der optimale Temperaturbereich für
das Wachstum liegt bei ungefähr 20ºC.
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Der pH-Bereich für das Wachstum: der pH-Bereich für das Wachstum
beträgt pH 3 bis 9 und der optimale pH-Bereich für das Wachstum liegt
bei ungefähr pH 5.
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Wenn die obigen mykologischen Merkmale mit den Beschreibungen von
Penicillium-Spezies in Carlos Ramirez, Manual and Atlas of the
Penicillia, Elsevier Biomedical Press, 1982 und anderen Literaturstellen
vergleichen werden, kann der TKR2648-Stamm als Stamm identifiziert
werden, der zur Gattung Penicillium gehört.
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Es ist jedoch über Pilze der Gattung Penicillium kein Bericht über einen
Mikroorganismenstamm verfügbar, der die Fähigkeit besitzt, TKR2648
zu produzieren. Deshalb haben die Erfinder der vorliegenden Erfindung
ihn als neuen Stamm angesehen und Penicillium sp. TKR2648 benannt.
Der Stamm wurde beim National Institute of Bioscience and Human-
Technology, Agency of Industrial Science and Technology (Adresse: 1-
3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japan (Zip code 305)) unter
der Registriernummer FERM BP-6093 hinterlegt (ursprüngliches
Hinterlegungsdatum: 8. Oktober 1996; Datum des Antrags auf
Übertragung zur internationalen Hinterlegung: 2. September 1997).
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Die vorliegende Erfindung kann nicht nur mit dem oben genannten
TKR2648-Stamm praktisch ausgeführt werden, sondern auch mit
irgendeiner spontanen oder künstlichen Mutante des TKR2648-Stammes
oder irgendeinem anderen Mikroorganismenstamm, der zur Gattung
Penicillium gehört und in der Lage ist, TKR2648 zu produzieren.
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Gemäß der vorliegenden Erfindung wird TKR2648 durch Kultivieren
eines TKR2648 produzierenden Stammes in einem Nährmedium
produziert. Für das Medium verwendete Nährstoffe umfassen verschiedene
Kohlenstoffquellen wie Glucose, Fructose, Saccharose, Stärke, Dextrin,
Glycerin, Melasse, Malzsirup, Öle und Fette und organische Säuren.
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Stickstoffquellen als Nährstoffe umfassen organische und anorganische
stickstoffhaltige Substanzen wie Sojabohnenmehl, Baumwollsaatmehl,
Maismaischeflüssigkeit, Casein, Pepton, Hefeextrakt, Fleischextrakt,
Weizenkeime, Harnstoff, Aminosäuren, Ammoniumsalze usw. Salze als
Nährstoffe sind verschiedene anorganische Salze wie Salze von
Natrium, Kalium, Calcium, Magnesium usw. und Salze der
Phosphorsäure. Diese Substanzen können unabhängig oder in einer
geeigneten Kombination verwendet werden.
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Wo es notwendig ist, kann das Nährstoffmedium mit
Schwermetallsalzen wie Eisensalzen, Kupfersalzen, Zinksalzen, Cobaltsalzen usw.,
Vitaminen wie Biotin, Vitamin B&sub1; usw. und anderen organischen oder
anorganischen Substanzen ergänzt sein, die die Kultur des
Mikroorganismus unterstützen und die Herstellung von TKR2648 fördern.
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Außer den obigen Komponenten kann ein Antischaummittel und/oder
ein oberflächenaktiver Stoff beispielsweise Siliconöl,
Polyalkylenglycolether usw. dem Nährstoffmedium zugesetzt sein.
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Beim Kultivieren eines Mikroorganismenstammes, der in der Lage ist, in
dem Nährmedium TKR2648 zu produzieren, können eine Reihe von
Kulturmethoden eingesetzt werden, die allgemein bei der Herstellung
von Antibiotika mit Hilfe von Mikroorganismen verwendet werden.
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Die Kultivierung wird bevorzugt bei 15 bis 25ºC durchgeführt. Der pH
des Mediums kann im Bereich von pH 3 bis 8 liegen, aber bevorzugt um
pH 5. In Hinblick auf die Inkubationszeit kann im allgemeinen eine
ausreichende Ausbeute des Antibiotikums nach 3 bis 8 Tagen Kultur
erwartet werden.
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Durch die obige Kultivierung wird TKR2648 sowohl intrazellulär wie
extrazellulär erhalten und in der Kulturbrühe akkumuliert. Bei der
vorliegenden Erfindung kann in der Kulturbrühe akkumuliertes TKR2648 unter
Nutzung seiner physikochemischen Eigenschaften und wo notwendig,
durch weitere Aufreinigung, aus der Brühe gewonnen und isoliert
werden.
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Die oben genannte Gewinnung kann durch Extrahieren der gesamten
Brühe mit einem nicht hydrophilen organischen Lösemittel wie
Ethylacetat, Butylacetat, Chloroform, Butanol, Methylisobutylketon oder
dergleichen erreicht werden. Als Alternative ist es möglich, die Brühe einer
Zentrifugierung oder Filtrierung zu unterziehen, um sie in Medium und
Zellen aufzutrennen und die Antibiotika sowohl aus dem Medium und
den Zellen zu isolieren.
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Das TKR2648 kann aus dem Medium nicht nur durch das oben
genannte Extraktionsverfahren unter Verwendung eines nicht hydrophilen
organischen Lösemittels abgetrennt werden, sondern auch nach dem
Verfahren, das in Kontakt bringen des Mediums mit einem
Adsorptionsmittel umfasst, so dass TKR2648 auf dem Adsorptionsmittel adsorbiert
wird, und seine Desorption oder Elution mit einem Lösemittel. Das
verwendbare
Adsorptionsmittel umfasst beispielsweise Aktivkohle,
Cellulosepulver und Adsorptionsharze. Als das oben genannte Lösemittel
können eine Reihe von Lösemitteln gemäß der Art und der Eigenschaften
des Adsorptionsmittels und entweder allein oder in Kombination selektiv
verwendet werden. Auf diese Weise kann eine wässrige Lösung von
einem oder mehreren wasserlöslichen organischen Lösemitteln wie
wässriges Aceton, wässriger Alkohol usw. eingesetzt werden. Zur Abtrennung
des TKR2648 von den Mikroorganismen kann die Extraktionstechnik
unter Verwendung eines hydrophilen organischen Lösemittels wie
Aceton eingesetzt werden.
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Bei der vorliegenden Erfindung kann der Rohextrakt von TKR2648 nach
herkömmlichen Techniken für die Abtrennung gereinigter hydrophober
Antibiotika gereinigt werden, z. B. durch Säulenchromatographie oder
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung einer
Säulenpackung mit einer stationären Phase wie Silicagel, aktiviertem
Aluminiumoxid, Aktivkohle, Adsorptionsharz usw. Das Elutionsmittel, das
zur Silicagelsäulenchromatographie verwendet werden kann, umfasst
Chloroform, Ethylacetat, Methanol, Aceton, Wasser, Mischungen davon
usw.
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Das Harz für Hochleistungsflüssigkeitschromatographie umfasst
chemisch derivatisiertes Silicagel wie Silicagelderivate mit Octadecyl-,
Octyl- oder Phenylgruppen und auf Polystyrol beruhende poröse
Polymergele, während die mobile Phase, die verwendet werden kann,
wässrige Lösungen von wasserlöslichen organischen Lösemitteln wie
wässriges Methanol, wässriges Acetonitril usw. umfasst.
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TKR2648 kann jeweils als solches oder in Form eines pharmakologisch
akzeptablen Salzes in medizinischen Anwendungen verwendet werden.
Es gibt keine spezielle Einschränkung für die Art des pharmakologisch
akzeptablen Salzes. Daher umfasst das Salz Salze von Mineralsäuren
wie Salzsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure, Phosphorsäure,
Flusssäure, Bromwasserstoffsäure usw. Salze von organischen Säuren wie
Ameisensäure, Essigsäure, Weinsäure, Milchsäure, Zitronensäure,
Fumarsäure, Maleinsäure, Bernsteinsäure, Methansulfonsäure,
Ethansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure,
Naphthalensulfonsäure, Camphersulfonsäure usw. und Salze von Alkalimetallen oder
Erdalkalimetallen wie Natrium, Kalium, Calcium usw.
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Zur Verabreichung von TKR2648 oder seines pharmakologisch
akzeptablen Salzes als Arzneistoff kann es entweder als solches oder in Form
einer pharmazeutischen Zusammensetzung, die typischerweise 0,1 bis
99,5%, bevorzugt 0,5 bis 90% davon in einem pharmazeutisch
akzeptablen, nicht toxischen und inerten Träger enthält, an Tiere und
Menschen verabreicht werden.
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Der oben genannte Träger umfasst feste, halbfeste oder flüssige
Verdünnungsmittel, Füllstoffe, andere Formulierungshilfsmittel usw. und
solche Träger können allein oder in Kombination verwendet werden.
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Die oben genannte pharmazeutische Zusammensetzung wird bevorzugt
in Form von Einheitsdosen verabreicht und kann oral, parenteral, topisch
(z. B. transdermal) oder rektal verabreicht werden. Natürlich sollten
diese pharmazeutischen Zusammensetzungen in Dosisformen
verabreicht werden, für die den entsprechenden Verabreichungsweg geeignet
sind.
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Zur Verabreichung von TKR2648 oder seines pharmakologisch
akzeptablen Salzes als Arzneistoff, ist die Dosis als Antipilzwirkstoff bevorzugt
in Bezug auf Patientenfaktoren ausgewählt wie Alter und Körpergewicht,
Verabreichungsweg, Art und Schwere der Erkrankung usw. Beim
Menschen beträgt die tägliche Dosis des Wirkstoffs üblicherweise jedoch für
einen Erwachsenen 10 bis 2000 mg.
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Während eine tägliche Dosis von weniger als dem obigen Bereich in
einigen Fällen ausreichend sein kann, kann eine höhere Dosis als der
Bereich in anderen Fällen erforderlich sein. Wenn eine hohe Dosis
verwendet wird, wird die tägliche Dosis bevorzugt in mehreren unterteilten
Dosen verabreicht.
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Die orale Verabreichung kann unter Verwendung fester, pulverförmiger
oder flüssiger Dosierungsformen vorgenommen werden wie Pulvern,
gestreckten Pulvern, Tabletten, Dragees, Kapseln, Tropfen,
sublingualen Tabletten usw.
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Für die parenterale Verabreichung können flüssige Einheitsdosisformen
für subkutane, intramuskuläre oder intravenöse Verabreichung,
typischerweise Lösungen und Suspensionen eingesetzt werden. Diese
Präparate können durch Suspendieren oder Auflösen einer bestimmten
Menge an TKR2648 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes
davon, in einem für eine Injektion geeigneten nicht toxischen flüssigen
Träger, wie einem wässrigen Medium oder einem öligen Medium und
Sterilisieren der erhaltenen Suspension oder Lösung hergestellt werden.
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Die topische Verabreichung (z. B. transdermale Verabreichung) kann
unter Verwendung einer Reihe von topischen Dosisformen wie
Flüssigkeiten, Cremes, Pulver, Pasten, Gelen und Salben vorgenommen
werden. Diese Dosisformen können unter Verwendung einer bestimmten
Menge an TKR2648 oder eines pharmazeutisch akzeptablen Salzes
davon, in Kombination mit einem oder mehreren aus Parfum, Farbstoff,
Füllstoff, oberflächenaktiver Substanz, Feuchthaltemittel, Weichmacher,
Gelatinierungsmittel, Träger, Konservierungsstoff, Stabilisator usw. die
für topische Dosierungsformulierungen geeignet sind, hergestellt
werden.
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Die rektale Verabreichung kann unter Verwendung beispielsweise von
Suppositorien vorgenommen werden, wobei jeweils eine bestimmte
Menge an TKR2648 oder seines pharmazeutisch akzeptablen Salzes
mit einer niedrig schmelzenden festen Basis vermischt wird, wie
höheren Estern z. B. Myristylpalmitat, Polyethylenglycol, Kakobutter oder
einer Mischung davon.
Beste Art zur Ausführung der Erfindung
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Die folgenden Beispiele dienen der weiteren Erläuterung der
vorliegenden Erfindung, sind aber in keiner Weise einschränkend auf den
Rahmen der Erfindung.
Beispiel 1
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Es wird eine Probenmenge des TKR2648-Stammes (FERM BP-6093)
aus einer Kultur verwendet, die in einen Erlenmeyerkolben von 500 ml
eingesetzt wird, der 100 ml flüssiges Medium (Difco
Kartoffeldextrosebrühe, 2,4% (Gew.-/Vol)) enthält, und auf einem Rüttler bei 25ºC 2
Tage lang inkubiert, um eine Impfkultur herzustellen. Von dieser
Impfkultur werden 1,0 ml in 20 Erlenmeyerkolben von 500 ml
Fassungsvermögen übertragen, deren jeder 125 ml desselben flüssigen Mediums
wie oben enthält und bei 25ºC (unter Schütteln bei 220 Upm) 5 Tage
lang inkubiert. Die erhaltene Kulturbrühe wurde zentrifugiert und der
Überstand wurden von den Zellen abgetrennt.
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Dem Überstand wurde Ethylacetat (3 L) zugesetzt. Nach ausreichendem
Vermischen, wurde der Extrakt mit Ethylacetat unter reduziertem Druck
aufkonzentriert, so dass 505 mg eines Rückstandes gewonnen wurden.
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Der so erhaltene Rückstand wurde in 0,8 ml Methanol aufgelöst und
einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen, so dass sich
84 mg rohes TKR2648 ergaben. Die
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
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Gerät: LC6A (hergestellt von Shimadzu)
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Säule: YMC Pack C18 (2,0 cm · 25 cm) (hergestellt von YMC)
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Mobile Phase: 25 bis 100% (Vol/Vol) Methanol/Wasser
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Das rohe TKR2648 wurde in 0,8 ml Methanol aufgelöst und auf einer
Säule (150 ml) mit Sephadex LH-20 (hergestellt von Pharmacia) im
Gleichgewicht mit Methanol aufgegeben. Die Säule wurde mit Methanol
eluiert, so dass eine aktive Fraktion isoliert wurde. Diese Fraktion wurde
unter reduziertem Druck aufkonzentriert, so dass sich 43 mg Rückstand
ergaben.
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Der Rückstand wurde in 0,4 ml Methanol aufgelöst und einer
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unterzogen, so dass eine aktive
Fraktion isoliert wurde. Diese Fraktion wurde unter reduziertem Druck
aufkonzentriert, so dass 3,2 mg reines TKR2648 als weißes Pulver
erhalten wurden: Diese zweite Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt.
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Gerät: LC6A (hergestellt von Shimadzu)
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Säule: YMC Pack C18 (2,0 cm · 25 cm) (hergestellt von YMC)
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Mobile Phase: 36% (vol/vol) Acetonitril/Wasser
Physikochemische Eigenschaften
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Es wurde Massenspektrometrie mit einem Massenspektrometer JMS-
DX302 (hergestellt von Jeol Ltd.) vorgenommen. ¹H-NMR (in
deuteriertem Chloroform mit Tetramethylsilan als Referenz) und ¹³C-NMR (in
deuteriertem Chloroform mit deuteriertem Chloroform als Referenz)
wurden in einem Nuklearmagnetresonanzspektrometer JNM-A500 (Jeol
Ltd.) durchgeführt. Die spezifische optische Drehung (in Methanol)
wurde in einem digitalen Polarimeter DIP370 (hergestellt von Jasco Ltd.)
bestimmt. Die Ultraviolettspektrophotometrie (in Methanol) wurde mit
einem selbstaufzeichnenden Spektrophotometer UV-250 (hergestellt
von Shimadzu) vorgenommen und die Infrarotabsorptionsspektrometrie
(KBr-Methode) wurde mit einem Infrarotspektrophotometer 270-30
(hergestellt von Hitachi) vorgenommen. Die physikochemischen
Eigenschaften der Substanz TKR 2648 sind nachfolgend bechrieben.
(1) Massenspektrometrie
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Das nach Vakuumaufkonzentration der aktiven Fraktion bei der zweiten
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erhältliche gereinigte weiße
pulverförmige Produkt wurde bei FAB-MS als eine Substanz mit einem
Peak bei m/z 229 [M + H]&spplus; gefunden.
(2) Molekularformel
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Das nach Vakuumaufkonzentration der aktiven Fraktion bei der zweiten
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erhältliche gereinigte weiße
pulverförmige Produkt wurde bei Hochleistungs-FAB-MS als eine
Substanz mit einem Peak bei m/z 229.1090 [M + H]&spplus; gefunden. Dieses
Ergebnis und die ¹H-NMR- und ¹³C-NMR-Analysen zeigten, dass die
gereinigte Verbindung eine Molekularformel von C&sub1;&sub1;H&sub1;&sub6;O&sub5; aufweist
(berechneter Wert 229.1076).
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Das ¹H-NMR-Spektrum und ¹³C-NMR-Spektrum dieses Produktes sind
in Fig. 3 bzw. Fig. 4 dargestellt.
(3) Spezifische optische Drehung
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Die spezifische optische Drehung in Methanol des nach
Vakuumaufkonzentration der aktiven Fraktion bei der zweiten
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erhältlichen gereinigten weißen pulverförmigen
Produkts wurde wie folgt gefunden.
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Spezifische optische Drehung [α]D²&sup0; + 126º (c 1.0, Methanol)
(4) Ultraviolettabsorptionsspektrum
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Die UV-Absorption in Methanol des nach Vakuumaufkonzentration der
aktiven Fraktion bei der zweiten
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erhältlichen gereinigten weißen pulverförmigen Produkts
wurde wie folgt gefunden.
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UV (nm) (E1cm1%): 232 (510)
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Das UV-Absorptionsspektrum ist in Fig. 1 gezeigt.
(5) Infrarotabsorptionsspektrum
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Die IR-spektrophotometrische Charakterisierung (KBr-Methode) des
nach Vakuumaufkonzentration der aktiven Fraktion bei der zweiten
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erhältlichen gereinigten
weißen pulverförmigen Produkts zeigte die folgenden Wellenlängenzahlen
der Hauptabsorption.
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IR (KBr) (cm&supmin;¹): 2960, 1730, 1630, 1390, 1210, 1010, 930
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Das IR-Absorptionsspektrum ist in Fig. 2 gezeigt.
(6) Löslichkeit
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Das obige Pulver war in Chloroform und Methanol löslich, aber praktisch
unlöslich in Hexan und Wasser.
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Ausgehend von den obigen Analysen wurde das nach
Vakuumaufkonzentration der aktiven Fraktion bei der zweiten
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie erhältliche gereinigte weiße pulverförmige Produkt
als TKR2648 identifiziert und das nach Vakuumaufkonzentration der
aktiven Fraktion bei der zweiten Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
erhältlichen gereinigten weißen pulverförmigen Produkt wurde als
TKR2648 identifiziert.
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Das obige TKR2648 wurde durch
Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Verwendung einer
Hochleistungsflüssigkeitschromatographie LC-10A (hergestellt von Shimadzu)
analysiert. Diese HPLC-Analyse wurde unter den folgenden
Bedingungen vorgenommen.
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Säule: CAPELLPAK C&sub1;&sub8; (6 mm · 150 mm) (hergestellt von Shiseido)
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Mobile Phase: 0,05% Trifluoressigsäure enthaltendes 40% (Vol./Vol.)
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Acetonitril/Wasser
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Säulentemperatur: 40ºC
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Detektion UV-Wellenlänge: 220 nm
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In der Folge wurde das obige TKR2648 in der in Fig. 5 angegebenen
Position eluiert.
Biologische Eigenschaften
(1) Antipilzaktivität
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Es wurden die Antipilzspektren des obigen TKR2648 gegen
verschiedene Mikroorganismen bestimmt. Unter Verwendung des
Flüssigkeitsverdünnungsverfahrens wurde die Konzentration, die eine im
Wesentlichen vollständige Inhibierung des Pilzwachstums bewirkt, als
minimale Inhibitorkonzentration (ug/ml) bestimmt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 2 angeführt. In der Tabelle steht YNBG für ein Medium, das 0,67
% Hefestickstoffbase (hergestellt von Difco) und 1,0% Glucose enthält,
und BHI steht für ein Medium, das 0,5% Gehirn-Herzinfusionslösung
(hergestellt von Nihon Pharmaceutical) enthält.
Tabelle 2
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Es ist aus Tabelle 2 ersichtlich, dass TKR2648, das Antibiotikum gemäß
der vorliegenden Erfindung, gegen pathogene Pilze wie Candida
albicans, Candida kefyr, Cryptococcus neoformans, Aspergillus
fumigatus usw. aktiv ist.
(2) Inhibierende Aktivität bei Tumormetastasen
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Die Wirkung des obigen TKR2648 auf Tumorzellen wurde durch Messen
der inhibierenden Aktivität der Fähigkeit von Tumorzellen zur Metastase
untersucht, die nach einigen Stunden Inkubation mit TKR2648 in Tiere
eingeimpft wurden.
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Es wurden EL-4-Lymphom- oder B16-Melanomzellen in Medium RPMI
1640 kultiviert, das 10% fötales Kalbsserum enthielt und es wurden
verschiedene Konzentrationen an TKR2648 zur Kultur der Tumorzellen
hinzugefügt. Nach Kultur über Nacht wurde die Zytotoxizität von TKR2648
auf die Zellen nach dem Alamarblau-Verfahren (Biosource International)
bestimmt und die mit TKR2648 behandelten Zellen wurden gewonnen
und in Mäuse C57BL/6 (weiblich) über die Schwanzvene injiziert. Zehn
Tage nach der Injektion von EL-4 wurden die Mäuse getötet und ihre
Lebern entnommen und gewogen, um metastasierende Tumorzellen als
Gewichtszunahme zu bestimmen. Vierzehn Tage nach der Injektion von
B16-Zellen, wurden die Mäuse getötet und ihre Lungen entnommen und
metastasierende Melanomkolonien ausgezählt. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 3 angegeben. Es ist aus Tabelle 3 ersichtlich, dass TKR2648 die
Metastase von EL-4- und B16-Tumorzellen in normalem Gewebe bei
Konzentrationen inhibiert, die geringe Zytotoxizität zeigen. Dies
bedeutet, dass TKR2648 als Antikrebsmittel nützlich sein kann, indem es die
Metastaseeigenschaften von Tumorzellen inhibiert, ohne die
Proliferationseigenschaften der Tumorzellen zu beeinflussen.
Tabelle 3
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Sternchen (*) bedeuten signifikante Unterschiede beim Risiko von
p < 0001
(3) Toxizität
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Intraperitoneale Verabreichung von oben erhaltenem TKR2648 in einer
Dosis von 50 mg/kg an ICR-Mäuse bewirkte keine toxischen Anzeichen.
Vorteile der Erfindung
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Wie oben beschrieben stellt die vorliegende Erfindung
Antipilzsubstanzen TKR2648 zur Verfügung, die in der klinischen Medizin von Nutzen
sind, beispielsweise in der Therapie von infektiösen Pilzerkrankungen
oder Krebs, und ein Verfahren zur Herstellung der Substanz.