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Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine einstufige Immunoassay-Methode zur
Messung des prozentualen Anteils von Hämoglobin A1c in einer Probe.
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Hämoglobin A1c (HbA1c) ist ein glycosyliertes Hämoglobin, das durch Verbindung
zwischen der Aminogruppe des N-terminalen Valins der β-Kette von Hämoglobin einerseits und
der Aldehydgruppe der Glucose andererseits entsteht, wobei zuerst eine Schiff'sche Base und
anschließend durch Amadori-Umlagerung ein stabiles Ketoamin entsteht. Da der prozentuale
Gehalt von HbA1c (im folgenden: HbA1c%) den Blutzuckergehalt ein bis zwei Monate vor
der Messung wiederspiegelt, ist er allgemein zur Kontrolle des Blutzuckerspiegels anerkannt.
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Bisher wurde die Messung des HbA1c% meist mit einem Glycohämoglobin-Analyzer
vorgenommen, einem Meßinstrument auf der Basis von
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) unter Anwendung von Ionenaustausch-Chromatographie. Obwohl diese
Methode eine ausgezeichnete Reproduzierbarkeit ergibt, weist sie einige Nachteile auf: Sie erfordert
ein spezielles HPLC-Analyzer-System, ihre Kapazität ist beschränkt, die Meßergebnisse bei
anderen Hämoglobinformen sind ungenau und der technische Wartungsaufwand sehr hoch.
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Um diese Probleme zu lösen, wurden in den letzten Jahren HbA1c-Meßtechniken
entwickelt, die die HPLC vermeiden, und entsprechende Reagenzien wurden auf den Markt
gebracht. Aufgrund seiner hohen Spezifität wurde besonders der Immunoassay zur Messung des
HbA1c% verwendet.
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Ein Immunoassay-Verfahren für HbA1c, das in Betracht gezogen wurde, war z. B. der
"Sandwich-Assay" unter Verwendung zweier Antikörper. Wohlbekannt ist auch eine
Adsorptions-Immunoassay-Technik, bei der die Hämoglobine einer Probe, darunter auch HbA1c,
physikalisch an eine feste Phase adsorbiert werden, und das adsorbierte HbA1c mit einem
Antikörper hoher Spezifität ermittelt wird. Bei dieser Methode, bei der Hämoglobine direkt
an eine feste Phase adsorbiert werden, nimmt man an, daß der Anteil des adsorbierten HbA1c
dessen Anteil im Gesamt-Hämoglobin entspricht, wenn ein Überangebot Hämoglobin an die
begrenzte Oberfläche der festen Phase zugegeben wird. Da HbA1c auf klinischem Gebiet als
prozentualer Anteil (%) der Gesamthämoglobinmenge ausgedrückt wird, kann sein
Prozentanteil im Blut bestimmt werden, ohne die absolute Menge von HbA1c oder des
Gesamthämoglobins zu messen, wenn der Prozentanteil von HbA1c des an eine feste Phase
adsorbierten Hämoglobins gleich dessen Anteil im Blut ist. Bei dieser Methode müssen die
Hämoglobine hinreichend an die feste Phase adsorbiert sein. Daher wird in
aufeinanderfolgenden Schritten verfahren, und zwar werden die Hämoglobine zunächst an die Oberfläche
einer festen Phase, wie Latexteilchen oder Polystyrenkügelchen adsorbiert, die so erhaltene
feste Phase wird gewaschen oder wenn nötig von nicht adsorbiertem Material getrennt, und
das an der festen Phase adsorbierte HbA1c wird spezifisch duch Anti-HbA1c-Antikörper
ermittelt, die spezifisch HbA1c binden. Im Handel sind Enzym-Immunoassay(EIA)-Reagenzien
erhältlich, die nach dieser Methode arbeiten.
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Bei diesem zweistufigen Test mit einem handelsüblichen EIA-Kit ist ein Waschvorgang
zwischen dem ersten Schritt (Adsorption) und dem zweiten Schritt (Immunreaktion)
erforderlich, was das Verfahren komplexer und zeitaufwendiger macht, als den simultanen oder
einstufigen Immunoassay. Weiterhin besteht auch die Gefahr, daß das an die feste Phase
adsorbierte Hämoglobin im Zug des Waschvorganges ausgewaschen werden könnte.
Darüberhinaus können bei Kits dieser Art, da sie den glycosylierten N-terminalen Rest der
β-Kette des Hämoglobins für die Reaktion mit einem spezifischen HBA1c-Antikörper
verwenden, in vielen Fällen stark denaturierende Bedingungen erforderlich sein, um die
glycosylierten N-terminalen Reste während oder vor der Adsorption an die feste Phase freizulegen.
Da jedoch die Enzym-Antikörper-Verbindung unter diesen Bedingungen mit hoher
Wahrscheinlichkeit inaktiviert würde, kann ein gleichzeitiger Adsorptions-Immunreaktions-Schritt
wegen dieser möglichen Inaktivierung des Enzyms und/oder des Antikörpers beim
enzymmarkierten Anti-HbA1c-Antikörper nicht angewandt werden. Aufgrund der stark
denaturierenden Bedingungen in solchen handelsüblichen Kits muß die denaturierte Blutprobe sofort
nach ihrer Herstellung verwendet werden, denn im Verlauf der Zeit treten Streuungen der
Meßwerte durch Bildung von Niederschlag usw. auf, was den Erhalt genauer Meßwerte
unmöglich macht. Daher eignet sich diese Methode nicht zur Bearbeitung einer großen
Probenzahl.
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Andererseits wurde ein Immunoassay auch schon für Agglutination an Latex statt in Form
eines EIA angewandt. Eine hämolyslierte Probe wird zunächst zu einer unsensibilisierten
Latexsuspension hinzugefügt, damit sich die Hämoglobine an die Oberfläche des Latex adsorbieren,
dann werden HbA1-spezifische monoklonale Antikörper von Mäusen und schließlich
polyklonale Anti-Maus-IgG-Antikörper hinzugefügt. Es kommt zur Agglutination, wobei der
Grad dieser Agglutination den HbA1c% der Probe widerspiegelt. Obwohl dieses Verfahren
kein Waschen erfordert, kann es, da eine große Menge Latex zur Adsorption der
Hämoglobine benötigt wird, zur unspezifischen Agglutination von Latex und damit zum Auftreten
abnorm hoher Meßwerte kommen, oder es besteht das Risiko, daß verstärkte Agglutination
aufgrund der Antikörper-Antigen-Reaktion des HbA1c schwer zu entdecken ist.
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Mit dem steigenden Anteil älterer Menschen an der Gesamtbevölkerung nimmt auch die
Verbreitung von Diabetes und anderen Alterskrankheiten stetig zu. Damit kommt
Diagnoseparametern wie dem HbA1c%, der weithin als Indikator für den Blutzuckerspiegel anerkannt
ist, besondere Bedeutung zu. Aufgrund des geschilderten Trends erscheint es nötig, die
Durchsatzkapazität der Testverfahren zu steigern. Es besteht daher ein gewaltiger Bedarf für
die Entwicklung eines Diagnosereagens, das die Bearbeitung der Proben leicht, exakt und in
großer Stückzahl ermöglicht. Die derzeit verfügbare HPLC-Methode hat eine geringe
Durchsatzkapazität und erfordert spezielle Instrumente mit hohem Wartungsaufwand. Die EIA und
die Latex-Agglutinationsmethode andererseits, die ebenfalls verfügbar sind, erfordern
komplexe Verfahren und geben aufgrund der obenerwähnten Gründe ungenaue Ergebnisse.
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Auf der Suche nach einer Methode zur leichten und exakten Messung des HbA1c% einer
Probe aufgrund eines hochspezifischen Immunoassays wurde mit der vorliegenden Erfindung
ein Verfahren entwickelt, das die Messung des HbA1c% in einem einzigen Schritt erlaubt,
wobei die Adsorption der Hämoglobine an die feste Phase und die Reaktion des Antigen-
HbA1c mit dem Anti-HbA1c-Antikörper gleichzeitig stattfinden und damit die vorliegende
Erfindung vollenden.
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Die vorliegende Erfindung offenbart eine Meßmethode für HbA1c%, die folgende Schritte
umfaßt: Die Probe, die HbA1c enthält, wird gleichzeitig mit einer festen Phase und mit
markierten Anti-Hämoglobin A1c-Antikörpern in Kontakt gebracht, wobei adsorbiertes, an die
markierten Antikörper gebundenes HbA1c entsteht. Die markierten Anti-HämoglobinA1c-
Antikörper, gebunden an Hämoglobin A1c, das seinerseits wiederum an die feste Phase
gebunden ist, werden von den ungebundenen markierten Anti-HämoglobinA1c-Antikörpern
abgetrennt. Der Betrag des Markers des gebundenen Anti-HämoglobinA1c-Antikörpers wird
festgestellt.
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Fig. 1 zeigt eine Standard-Meßkurve von HbA1c% unter Verwendung der einstufigen,
40minütigen Inkubationsreaktion aus Beispiel 1.
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Fig. 2 ist ein Korrelationsdiagramm zwischen der einstufigen 40minütigen Immunoassay-
Methode aus Beispiel 2 und einer konventionellen HPLC-Methode.
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Fig. 3 zeigt eine Standard-Meßkurve von HbA1c% unter Verwendung der einstufigen,
10minütigen Inkubationsreaktion aus Beispiel 4.
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Fig. 4 ist ein Korrelationsdiagramm zwischen der einstufigen Immunoassay-Methode mit
auf 10 Minuten verkürzter Inkubationszeit (aus Beispiel 4), und einer konventionellen HPLC-
Methode.
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Für die vorliegenden Erfindung ist es nötig, Blutproben vor der HbA1c%-Messung zu
hämolysieren. Es gibt keine besondere Einschränkung hinsichtlich der Hämolysemethode;
verschiedene Verfahren können angewandt werden, z. B. die Verwendung einer hypotonischen
Flüssigkeit wie Wasser oder ein Tensid.
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Nach der Hämolyse erfolgt die Vorbehandlung der Probe. Das HbA1c wird denaturiert,
instabiles HbA1c kann durch diese Vorbehandlung auch entfernt werden. Es gibt keine
besondere Einschränkung hinsichtlich der Vorbehandlungsmethode; auch hier können verschiedene
Verfahren angewandt werden, z. B. KSCN oder andere Chemikalien. Jedoch sollte, um
störende Einflüsse auf die im nächsten Schritt erfolgende Immunoassay-Methode zu minimieren
(nämlich die Niederschlagsbildung aufgrund noch verbliebener Vorbehandlungslösung im
Reaktionsgemisch), und um die Inaktivierung des Enzyms und/oder der Antikörper bei der
Verwendung enzymmarkierter Antikörper zu verringern, die Vorbehandlung vorzugsweise
unter milden Verhältnissen und mit geringerer Chemikalienmenge durchgeführt werden.
Somit ist eine Vorbehandlung z. B. unter schwach sauren Bedingungen vorzuziehen. "Schwach
sauer" bedeutet hierbei vorzugsweise pH 3,0 bis 6,9; noch besser 4,0 bis 6,0.
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Unter diesen Bedingungen können zur Vorbehandlung beispielsweise aliphatische
Carboxylatpuffer oder Boratpuffer verwendet werden. Aliphatische Carboxylatpuffer sind z. B.
Mono- und Dicarboxylatpuffer, genauer gesagt Succinat-, Malonat-, Fumarat-, Malat-, Glutarat-
oder Acetatpuffer. Succinat-, Glutarat- oder Acetatpuffer sind vorzuziehen, Succinatpuffer
sind besonders vorzuziehen.
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Die Vorbehandlung unter leicht sauren Bedingungen ermöglicht die Denaturierung von
HbA1c bei gleichzeitiger Beibehaltung der α2β2-Struktur des Hämoglobins und die Entfernung
des instabilen HbA1c. Hämolyse und Vorbehandlung können hintereinander oder
gleichzeitig erfolgen.
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Nachdem die Probe hämolysiert und vorbehandelt wurde, wird sie gleichzeitig mit einer
festen Phase und mit markierten Anti-HbA1c-Antikörpern in Kontakt gebracht. Es gibt keine
besondere Beschränkung hinsichtlich der festen Phase zur Adsorption des Hämoglobins; es
kann sich z. B. um Röhrchen, Kügelchen, Plättchen, Mikropartikel oder Papierfilter und um
Materialien wie Glas, Polystyren, Latex oder Papier handeln. Unabhängig davon, welche feste
Phase verwendet wird, ist eine möglichst große Oberfläche vorzuziehen, da eine solche mehr
Hämoglobin adsorbieren kann und damit eine genauere Messung ergibt.
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Auch für den Anti-HbA1c-Antikörper, der zur Reaktion verwendet wird, besteht keine
besondere Beschränkung, vorausgesetzt er erkennt spezifisch HbA1c. Monoklonale oder
Polyklonale Antikörper können ebenso verwendet werden wie Teilstücke von solchen. Der Anti-
HbA1c-Antikörper wird markiert, um seine Entdeckung nach der Immunreaktion zu
erleichtern. Es besteht keine besondere Beschränkung hinsichtlich des Markers, vorausgesetzt es
handelt sich um einen, der normalerweise für die Feststellung von Immunreaktionen eingesetzt
wird, z. B. Enzyme, radioaktive Isotope oder fluoreszierende Stoffe, wobei Enzymmarker
besonders zu bevorzugen sind. Beispiele für solche Enzyme sind alkalische Phosphatase,
Peroxidase und β-D-Galactosidase, ein Beispiel für radioaktive Isotope ist ¹²&sup5;I eins für
fluoreszierende Stoffe Fluorescin. Obwohl dies nicht Teil der vorliegenden Erfindung ist, kann man
einen weiteren Antikörper, der Anti-HbA1c-Antikörper erkennt (zweiter Antikörper),
markieren, an der Reaktion teilnehmen lassen und für die Feststellung verwenden. In diesem Fall
werden die gleichen Marker verwendet, wie vorhin beschrieben. Außerdem sollte eine
angemessene Menge von Anti-HbA1c-Antikörpern zur Bindung an das festkörperadsorbierte HbA1c
zugegeben werden.
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In der vorliegenden Erfindung wird das zu analysierende HbA1c einer Probe reagieren
gelassen, indem die Probe gleichzeitig mit der festen Phase und den Anti-HbA1c-Antikörpern in
Kontakt gebracht wird. Charakteristisch ist dabei, daß die Adsorption des HbA1c an die feste
Phase und seine Reaktion mit den Anti-HbA1c-Antikörpern in einem einzigen
Inkubationsschritt ausgeführt werden. Dies kann z. B. erreicht werden, indem die feste Phase und die
Anti-HbA1c-Antikörper gleichzeitig der Probe hinzugefügt werden oder aber indem die feste
Phase und die Anti-HbA1c-Antikörper zuerst vermischt und dann der Probe hinzugefügt
werden. Es bestehen keine besonderen Einschränkungen hinsichtlich der Bedingungen für die
Adsorption des HbA1c der Probe an die feste Phase und für die Reaktion mit den Anti-
HbA1c-Antikörpern; es können also die Bedingungen für gewöhnliche Immunoassay-
Reaktionen angewandt werden. Jedoch sollte die Reaktionszeit so kurz gehalten werden wie
ohne Beeinträchtigung der Feststellung möglich. Normalerweise dauert die Reaktion 5 bis 60
Minuten, vorzuziehen sind 5 bis 50 und noch stärker vorzuziehen 5 bis 15 Minuten. Dies
geschieht nicht nur, um die Wirksamkeit der Messung zu verbessern, sondern auch um die
Bildung von Niederschlägen in der Probe zu verringern, die durch im Reaktionsgemisch
verbliebene Reste der Vorbehandlungslösung verursacht werden. Verwendet man enzymmarkierte
Anti-HbA1c-Antikörper, so ist die kurze Inkubationsdauer auch nötig, um die Inaktivierung
des Enzyms und/oder der Antikörper durch die Vorbehandlungslösung möglichst gering zu
halten.
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Nach Adsorption des HbA1c an die feste Phase und der Reaktion mit den Anti-HbA1c-
Antikörpern wird der Komplex Antikörper-Hämoglobin-feste Phase von nichtgebundenem
Material abgetrennt und nötigenfalls gewaschen. Als nächstes werden Anti-HbA1c-
Antikörper bestimmt, die mit dem an der festen Phase adsorbierten HbA1c verbundenen sind,
um so den HbA1c% der Probe festzustellen. Diesmal erfolgt die Bestimmung über den
Marker am Anti-HbA1c-Antikörper. Dazu kann jede Methode angewandt werden, die zur
Bestimmung eines solchen Markers geeignet ist.
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Die vorliegende Erfindung ermöglicht es, den HbA1c% mit einem einstufigen
Immunoassay zu messen. Demzufolge kann die für die Messung erforderliche Zeit im Vergleich zu den
zweistufigen HbA1c-Messungen konventioneller Immunoassay-Methoden reduziert werden.
Folglich wird die Kontaktzeit mit der noch im Reaktionsgemisch verbliebenen
Vorbehandlungslösung verkürzt, um der Niederschlagsbildung in der Probe vorzubeugen. Außerdem
kann man mit einer kürzeren Inkubationszeit, falls die enzymmarkierten Anti-HbA1c-
Antikörper in einem einstufigen Immunoassay verwendet werden, die Inaktivierung des
Enzyms und/oder der Antikörper durch die verbliebene Vorbehandlungslösung verringern. Da
nur ein Arbeitsschritt zur Abtrenung der gebundenen Anti-HbA1c-Antikörper vom
ungebundenen Material in Lösung erforderlich ist, besteht darüberhinaus ein geringeres Risiko, das
Hämoglobin aus der festen Phase auszuwaschen.
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Nicht zuletzt ermöglicht es die vorliegende Erfindung, die jeweils aktuellsten HbA1c%-
Meßwerte zur Verfügung zu haben, indem man dem Patienten vor der Sprechstunde Blut
abnimmt und dessen HbA1c% mißt. Selbst wenn man das Blut während der Sprechstunde selbst
abnimmt, muß der Patient aufgrund der kürzeren Inkubationszeit der vorliegenden Methode
nicht so lange auf das Ergebnis warten.
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Wird die vorliegende Methode in Verbindung mit einem handelsüblichen automatisierten
Immunoassay-System angewandt, läuft der Vorgang mit Ausnahme der anfänglichen
Hämolyse und der Vorbehandlung vollautomatisch ab. Da die Notwendigkeit eines
Waschvorganges während der Immunreaktion entfällt, kann auch die Meßzeit verkürzt werden, was den
Nutzen für die Diagnose gewaltig erhöht.
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Darüberhinaus können, da die Messung mit einem handelsüblichen automatisierten
Immunoassay-System erfolgen kann, gleichzeitig weitere Diabetes-Marker, wie Insulin und
C-Peptide untersucht werden. Man erhält also eine größere Menge an Informationen leicht
und in einem Arbeitsgang.
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Nachstehende Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
Beispiel 1: Einrichtung der HbA1c-Meßmethode
und Ausarbeitung einer Standardkurve
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Es wurden mit alkalischer Phosphatase markierte Anti-HbA1c-Antikörper nach folgender
Beschreibung hergestellt: Nach Bindung von 2 mg monoklonalen Anti-HbA1c-Antikörpern
von Mäusen (DAKO) mit 2 mg handelsüblicher alkalischer Phosphatase, gewonnen durch S-
S-Bindung aus Rinderdünndarm (Biozyme), wurde das resultierende Produkt durch
Gelfiltration (Säule: G3000SW, Tosoh; Elution: 50 mM Phosphatpuffer (pH 7) mit 150 mM NaCl)
gereinigt (siehe Ishikawa, E. ed., Enzyme Immunoassay Methods, 3. Aufl., Igaku Shoin, S.
117). Die damit hergestellten, mit alkalischer Phosphatase markierten Anti-HbA1c-
Antikörper wurden zu 0,1 M Tris-Puffer (pH 8,0), enthaltend 5% Rinderserumalbumin,
10 mM MgCl&sub2;, 0,1 mM ZnCl&sub2; und 0,1% NaN&sub3; hinzugefügt, bis zu einer Konzentration von
1,5 mA (1 mA ist jene Konzentration, deren Absorption bei 280 nm 0,001 beträgt). 100 ul
dieser Reaktionslösung wurden in einen Becher gefüllt, und anschließend wurden 12
Polystyrenkügelchen (Durchmesser 1,4 bis 1,6 mm) hinzugefügt.
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Die Eichproben wurden vorbereitet, indem die roten Blutkörperchen von sechs Patienten
mit unterschiedlichen HbA1c%-Konzentrationen abgetrennt, gewaschen, mit gereinigtem
Wasser hämolysiert und schließlich gefriergetrocknet wurden. Nach ihrer Wiederherstellung
mit gereinigtem Wasser wurden die HbA1c%-Konzentrationen dieser Eichproben mittels
eines handelsüblichen Glycohämoglobin-Analyzers (HLC-723GHbIII, Tosoh) bestimmt. Um
die Probelösungen für den Immunoassay herzustellen, wurde jeweils 20 ul
der wiederhergestellten
Eichproben zu 580 ul 0,1 M Succinatpuffer (pH 5,0), enthaltend 0,1% Triton X-100
und 0,1% NaN&sub3; hinzugegeben, anschließend umgerührt und 30 Minuten bei Raumtemperatur
stehengelassen.
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Diese Probelösungen (jeweils 10 ul) wurden den Bechern mit den obenerwähnten
markierten Antikörpern und den Kügelchen hinzugefügt, dann erfolgte der einstufige Immunoassay
mittels eines handelsüblichen vollautomatischen Immunoaanlyzers (AIA-1200, Tosoh). Und
zwar wurden nach 40minütiger Inkubation bei 37ºC die Kügelchen mit dem adsorbierten
Antigen-Antikörper-Komplex (bestehend aus den enzymmarkierten Anti-HbA1c-Antikörpern
und dem HbA1c-Antigen) gewaschen, dann wurden 220 ul Substratlösung (pH 10),
enthaltend 0,26 mg/ml 4-Methylumbelliferyl-Phosphat (4-MUP) zugegeben. Dann wurde die
Bildungsrate von 4-Methylumbelliferon (4-MU) bei einer Exzitations-Wellenlänge von 362 nm
und einer Emissions-Wellenlänge vom 447 nm gemessen. Anmerkung: Die alkalische
Phosphatase wandelt 4-MUP in ein Fluorogen, eben 4-MU um.
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Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Die HbA1c%-Konzentration der Eichproben, wie
mit dem Glycohämoglobin-Analyzer bestimmt, ist auf der waagerechten Achse eingetragen,
die Rate der 4-MU-Bildung, umgewandelt durch die alkalische Phosphatase, auf der
senkrechten Achse. Die 4-MU-Bildungsrate steigt in Abhängigkeit von der Konzentration des
HbA1c (%) und ermöglicht somit die Ausarbeitung einer Standardkurve.
Beispiel 2: Korrelation mit der konventionellen HPLC-Methode
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Voll-Blutproben von 20 ul von normalen Erwachsenen und von Diabetespatienten, mit EDTA
als Gerinnungshemmer wurden zu 580 ul 0,1 M Succinatpuffer (pH 5,0), enthaltend 0,1%
Triton X-100 und 0,1% NaN&sub3; hinzugegeben, umgerührt und die Gemische 30 Minuten bei
Raumtemperatur stehengelassen, um Hämolyse und Vorbehandlung der Proben geschehen zu
lassen. Die so erhaltenen Lösungen wurden wie die Probelösungen für den Immunoassay
verwendet. Die HbA1c-Konzentration der Voll-Blutprobe eines Patienten wurde vorher mit
einem handelsüblichen Glycohämoglobin-Analyzer (HLC-723GHbIII, Tosoh) mit HPLC-
Technik bestimmt. Die einstufige Immunoassay-Messung zur Bestimmung der HbA1c%-
Konzentration wurde mit dem AIA-1200 nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren
ausgeführt.
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Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt. Die Figur zeigt die Meßergebnisse von 50
Diabetiker-Proben. Die HbA1c-Konzentrationen (%), die mit dem HPLC-Verfahren ermittelt
wurden, sind auf der waagerechten, die mit dem Verfahren der vorliegenden Erfindung ermittelten
Konzentrationen auf der senkrechten Achse eingetragen. Es wurde eine gute Korrelation
zwischen den beiden Methoden beobachtet; es ergab sich eine Korrelationsgleichung von
y = 1,63 + 0,69x und ein Korrelationskoeffizient von r = 0,907. Somit bestätigte sich der Trend
der Übereinstimmung der HbA1c%-Messungen zwischen der Methode der vorliegenden
Erfindung und der konventionellen HPLC-Methode.
Beispiel 3: Intra-Assay- und Inter-Assay-Reproduzierbarkeit
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Die Intra-Assay-Reproduzierbarkeit der oben beschriebenen einstufigen Immunoassay-
Methode wurde mit Hilfe von Proben von Patienten mit vier verschiedenen HbA1c-
Konzentrationen bewertet. Die Ergebnisse werden in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
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Die Intra-Assay-Reproduzierbarkeit war gut; sie hielt sich für alle Konzentrationen innerhalb
des Bereichs von 3,5 bis 4,3%.
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Die Inter-Assay-Reproduzierbarkeit wurde mit Proben von zwei verschiedenen
Konzentrationen beurteilt; es ergaben sich günstige Resultate (4% oder weniger), wie in Tabelle 2 gezeigt.
Tabelle 2
Beispiel 4: Einrichtung eines 10-Minuten-Assay-Systems
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Obwohl die einstufige Immunoassay-Methode aus den Beispielen 1 bis 3 eine Inkubationszeit
von nur 40 Minuten benötigt, wurde diese Methode so weiterentwickelt, daß die
Inkubationszeit auf 10 Minuten gesenkt werden konnnte. Dazu wurde der Immunoassay mit der Alkali-
Phosphatase markierten Anti-HbA1c-Antikörper-Lösung aus Beispiel 1 durchgeführt, deren
Konzentration auf 5 mA erhöht worden war. Die Standardkurve für diese Methode ist in
Fig. 3 dargestellt. Die Konzentration der Eichproben (bestimmt mit dem Glycohämoglobin-
Analyzer) ist auf der waagerechten Achse eingetragen, während die 4-MU-Bildungsrate
(durch die Einwirkung der Alkali-Phosphatase) auf der senkrechten Achse eingetragen sind.
Weiterhin sind in Fig. 4 die Resultate zur Untersuchung der Korrelation zwischen der
konventionellen HPLC-Methode und diesem 10-Minuten-Assay-System unter Verwendung
der gleichen Proben von Patienten wie in Beispiel 2 dargestellt. Dies sind die Meßergebnisse
für Material von 50 Patienten. Die mit der konventionellen Methode (HLC-723GHbIII)
ermittelten HbA1c%-Konzentrationen sind auf der waagerechten, die Meßergebnisse nach der
Methode der vorliegenden Erfindung auf der senkrechten Achse eingetragen. Die Korrelation
mit der HPLC-Methode war gut; es ergab sich eine Korrelationsgleichung von y = 0,579x +
1,125 und ein Korrelationskoeffizient von r = 0,933.
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Die Untersuchung der Intra-Assay-Reproduzierbarkeit in diesem 10-Minuten-Assay-
System (Beispiel 3) geschah in der gleichen Weise wie beim 40-Minuten-Assay-System, und
die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt, während die Ergebnisse der Inter-Assay-
Reproduzierbarkeit in Tabelle 4 gezeigt werden.
Tabelle 3
Tabelle 4
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Die Ergebnisse waren gut; es ergab sich eine Intra-Assay-Reprodzuzierbarkeit von 2,7 bis
4,0% und eine Inter-Assay-Reproduzierbarkeit von weniger als 4%. Die Korrelation zwischen
dem 40-Minuten-System aus Beispiel 2 und diesem 10-Minuten-Assay-System war ebenfalls
gut; es ergab sich eine Korrelationsgleichung von y = 0,493 + 0,721x und r = 0,921
Beispiel 5: Reaktivität mit Hämoglobinvarianten
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Es wurde die Messung der Konzentration glycosylierter Hämoglobinvarianten mit der in
Beispiel 1 beschriebenen Methode der vorliegenden Erfindung versucht. Dazu wurden sechs
Hämoglobinvarianten beschafft (UBE2, HAMADEN, TAKAMATSU, CAPE TOWN,
RIYADH UND HIKARI; davon sind UBE2 und CAPE TOWN α-Ketten-Varianten, während die
übrigen β-Ketten-Varianten sind). Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt.
Tabelle 5
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Name HbA1c% Meßergebnisse nach der vorliegenden Erfindung
(40-Minuten-System)
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UBE2 4,62
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HAMADEN 2,13
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TAKAMATSU 0
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CAPE TOWN 0,22
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RIYADH 0,42
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HIKARI 0,78
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Die Ergebnisse zeigen, daß diese Hämoglobin-Varianten mit dem vorliegenden Verfahren
überhaupt nicht erkannt werden, woraus sich schließen läßt, daß das vorliegende Verfahren
für normales HbA1c spezifisch ist und von der Anwesenheit von Hämoglobin-Varianten
überhaupt nicht beeinträchtigt wird.
Beispiel 6: Vergleich verschiedener Vorbehandlungslösungen
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Es wurden 580 ul Vorbehandlungslösung A in 0,1 M Succinatpuffer (pH 5,03), enthaltend
0,1% Triton X-100 und 0,1% NaN&sub3; oder 580 ul Vorbehandlungslösung A in destilliertem
Wasser (pH 7,15), enthaltend 0,1% Triton X-100 und 0,1% NaN&sub3; zu jeweils 20 ul Blutproben
(vollständiges Blut) von normalen Erwachsenen zugegeben, wobei EDTA als
Gerinnungshemmer verwendet wurde. Die Gemische wurden umgerührt und 30 Minuten bei
Zimmertemperatur stehen gelassen, um die Hämolyse stattfinden zu lassen. Diese Lösungen wurden
dann als Probelösungen für den Immunoassay verwendet. Der Einstufen-Immunoassay wurde
mit dem AIA-1200 wie in Beispiel 4 ausgeführt, um die HbA1c-Konzentrationen zu
ermitteln. Die Ergebnisse sind in der Tabelle 6 dargestellt.
Tabelle 6
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Wie aus der Tabelle klar hervorgeht, führt eine Vorbehandlung unter schwach sauren
Bedingungen zu einer höheren 4-MU-Bildungsrate.
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Die HbA1c-Konzentration der Blutprobe, gemessen mit einem Glycohämoglobin-Analyzer
(HLC-723GbIII, Tosoh) betrug 5,4%.