CN115951072B - 一种糖化血红蛋白-c肽联合检测试剂盒 - Google Patents

Abstract

本申请涉及医学检验的技术领域，具体公开了一种糖化血红蛋白‑C肽联合检测试剂盒。所述糖化血红蛋白‑C肽联合检测试剂盒由检测卡和稀释液组成，所述检测卡的C肽检测线上包被的抗体为C肽单克隆抗体；所述糖化血红蛋白‑C肽联合检测试剂盒在使用时，将样本稀释15‑30倍。本申请的糖化血红蛋白‑C肽联合检测试剂盒可以实现糖化血红蛋白和C肽的联合检测和精确定量。

Description

一种糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒

技术领域

本申请涉及医学检验的技术领域，更具体地说，涉及一种糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒。

背景技术

糖化血红蛋白是红细胞中的血红蛋白与血清中的糖类通过非酶反应相结合的产物。形成糖化血红蛋白的非酶反应具有持续、缓慢、不可逆的特点，因此，糖化血红蛋白的含量不受即时血糖浓度的影响，能够准确反映糖尿病患者糖代谢状况以及近3个月内的平均血糖水平，是评估糖尿病患者长期血糖控制水平的重要指标。

C肽是含31个氨基酸的多肽，由胰岛素原裂解产生。胰岛素原存在于胰岛β细胞中，一分子胰岛素原裂解产生一分子C肽和一分子的A链、B链，而A链、B链用于合成胰岛素，故C肽与胰岛素共同从β细胞分泌，且摩尔量相等。同时，C肽主要由肾脏分解，且C肽的含量不受体内、体外胰岛素等影响，也不被肝脏灭活或者代谢，因此，C肽的含量能较准确的反映胰岛β细胞的功能。

同时参考糖化血红蛋白与C肽两项重要指标的检测结果，能更准确地了解患者糖代谢状况和胰岛素分泌情况。因此，有必要开发一种适于在临床中推广的糖化血红蛋白-C肽联合检测手段。

荧光定量免疫层析技术具有操作简便、检测快速、便携性强等优点，能同时适用于糖化血红蛋白检测和C肽检测。但是，血液样本中糖化血红蛋白浓度远超免疫层析试纸条抗体的定量范围，现有的糖化血红蛋白检测试剂盒在使用时需要对样本进行稀释，通常为100倍以上；而C肽在血液中的浓度低，现有的C肽检测试剂盒在使用时尽量避免对样本进行稀释，如果按照糖化血红蛋白检测的操作对样本进行稀释，C肽浓度会低于定量限，显著影响结果的准确性。在检测前，无论对样本稀释与否，都无法使上样量同时处于糖化血红蛋白和C肽的定量范围内，因此，现有基于荧光定量免疫层析原理开发的试剂盒，只能单独对其中一个指标进行检测。

发明内容

为了实现糖化血红蛋白和C肽的联合检测，本申请提供一种糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒。

本申请提供的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，采用如下技术方案：

一种糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，所述试剂盒包括检测卡和稀释液，

所述检测卡的C肽检测线上包被的抗体为C肽单克隆抗体，所述C肽单克隆抗体；

所述糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒在使用时，样本稀释15-30倍。

本申请的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒基于荧光定量免疫层析技术，采用双抗体夹心法对糖化血红蛋白和C肽分别定量检测。检测卡由底板和沿样本层析方向顺次搭接粘贴于底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫组成。检测卡的结合垫和检测垫上分别具有能与待测物质特异性结合的抗体。在层析过程中，含有待测物质的液体自样品垫流向结合垫，结合垫上带有荧光微球标记的抗体能与待测物质结合，并随待测物质继续流向检测垫，使待测物质也带上荧光标记；检测垫上的抗体通过包被的方式固定在特定位置，形成检测线，当待测物质流经检测线时，会与检测线上的抗体结合，被固定在检测线上。层析结束后，当光源照射到检测卡上时，检测线激发出荧光信号，被光电转换器接收后转化为电信号，电信号的强弱反映出待测物质的浓度。

在本申请中，同时对糖化血红蛋白和C肽两种物质进行检测，所以检测卡的结合垫上具有分别能与糖化血红蛋白和C肽特异性结合的两种荧光微球标记的抗体；检测垫上通过在不同的位置包被糖化血红蛋白单克隆抗体和C肽单克隆抗体分别形成糖化血红蛋白检测线和C肽检测线。

本申请中，C肽检测线上包被的C肽单克隆抗体，与现有试剂盒使用的C肽抗体相比，具有更高的灵敏度，有效降低了C肽定量限，即使在样本进行了一定倍数的稀释，上样时C肽浓度较低的情况下，仍然能实现准确定量。

对C肽检测线上的抗体进行优化后，能够满足对C肽进行准确定量的样本稀释倍数最高可达30倍。但是，目前采用荧光定量免疫层析法对糖化血红蛋白进行检测时样本稀释倍数在100倍以上，而本申请选择的最大稀释倍数为30倍。当采用稀释倍数为30倍的情况下，对于糖化血红蛋白检测来说，仍然存在上样量超出定量范围的可能性。

本申请检测卡的结合垫上荧光微球标记的血红蛋白抗体(血红蛋白分为糖化血红蛋白和非糖化血红蛋白；此荧光微球标记的血红蛋白抗体既能结合糖化血红蛋白又能结合非糖化血红蛋白)的喷涂量低于血红蛋白上样量，使样本中的糖化血红蛋白与非糖化血红蛋白在层析过程中与结合垫上的血红蛋白抗体饱和反应且成比例结合。

糖化血红蛋白检测线上，糖化血红蛋白单克隆抗体的包被量高于糖化血红蛋白上样量，使得样本中所有的糖化血红蛋白均能与检测线上的抗体结合，与标记荧光抗体结合的糖化血红蛋白在糖化血红蛋白检测线上发出的荧光信号强度与样本中糖化血红蛋白占总血红蛋白的比例成正比。

本方式无需测定样本中糖化血红蛋白和总血红蛋白的绝对含量，采用糖化血红蛋白占总血红蛋白的比例(％)来表示糖化血红蛋白浓度，与临床及实验室的表示方式一致，即使在样品过量的情况下依然能够实现糖化血红蛋白浓度的准确定量。从而解决了样本稀释倍数低导致上样量超出糖化血红蛋白定量范围的问题。

血红蛋白位于红细胞内，对糖化血红蛋白进行检测需要裂解红细胞，因此，稀释液在检测中的除了起到稀释样本，还起到裂解细胞的重要作用。若稀释液对细胞裂解不充分，不仅不能充分释放血红蛋白，影响糖化血红蛋白检测结果的准确性；未能被裂解的细胞还会作为有形成分，干扰免疫层析过程，进一步影响各项结果的准确性。

因此，样本稀释倍数的确定除了要考虑糖化血红蛋白和C肽的定量范围，稀释液的裂解细胞效果也是重要的考虑因素。

本申请提供的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，在样本检测前，将样本稀释15-30倍。当将样本稀释30倍时，稀释后的样本中C肽的浓度高于C肽定量限，可以实现C肽定量检测；当将样本稀释15倍时，使用0.25％ Triton 100的磷酸盐缓冲液能够裂解样本中的细胞，检测结果的准确性符合临床分析要求。

本申请通过在C肽检测线上采用灵敏度更高的C肽单克隆抗体，使得样本稀释后仍能对C肽进行准确定量。本申请还采用只检测糖化血红蛋白占总血红蛋白的比例的策略，使得样本稀释倍数低，血红蛋白上样量超出定量范围的情况下，仍能够对糖化血红蛋白进行定量检测。本申请还对样本检测前的稀释倍数进行限定，能够保证使稀释液充分裂解样本中的细胞，使样本稀释后糖化血红蛋白和C肽的浓度均处于定量范围，实现了糖化血红蛋白和C肽的联合检测和精确定量。

进一步地，所述糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒在使用时，样本稀释18-25倍。

在一个具体的实施方式中，所述糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒在使用时，样本稀释15倍、18倍、20倍、25倍、30倍。

在一些具体的实施方式中，所述糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒在使用时，样本稀释15-18倍、15-20倍、15-25倍、15-30倍、18-20倍、18-25倍、18-30倍、20-25倍、20-30倍、25-30倍。

为了进一步提高本申请提供的试剂盒定量检测的准确性，本申请也提供了一种新的稀释液。本申请提供的稀释液与0.25％ Triton 100的磷酸盐缓冲液相比，能更加高效、充分地裂解样本中的细胞，获得更准确的检测结果。

进一步地，所述稀释液包含以下组分：烷基硫酸盐、鱼精蛋白和小分子酰胺类化合物。

本申请中的稀释液使用的烷基硫酸盐是一类典型的阴离子表面活性剂。单独使用鱼精蛋白或小分子酰胺类化合物时，稀释液没有裂解效果。将鱼精蛋白和烷基硫酸盐同时使用，或将小分子酰胺类化合物和烷基硫酸盐同时使用时，稀释液的裂解效果仍然不能满足试剂盒检测要求。而将鱼精蛋白、小分子酰胺类化合物和烷基硫酸盐三者同时使用时，稀释液的细胞裂解效率才能充分发挥，即使在血液样本稀释倍数很低的情况下，稀释液也能高效、完全地裂解血液中的细胞，充分释放血红蛋白，避免未裂解的细胞作为有形成分对于免疫层析结果的干扰。

进一步地，所述稀释液中各组分的重量份如下：每1000份所述稀释液中，包含所述烷基硫酸盐2.5-5份、所述鱼精蛋白4-8份、所述小分子酰胺类化合物10-20份。

进一步地，所述稀释液中各组分的重量份如下：每1000份所述稀释液中，包含所述烷基硫酸盐3-4份、所述鱼精蛋白5-7份、所述小分子酰胺类化合物15-18份。

在一个具体的实施方式中，每1000份所述稀释液中，所述烷基硫酸盐的重量份可以为2份、2.5份、3份、4份、5份、6份。

在一些具体的实施方式中，每1000份所述稀释液中，所述烷基硫酸盐的重量份可以为2-2.5份、2-3份、2-4份、2-5份、2-6份、2.5-3份、2.5-4份、2.5-5份、2.5-6份、3-4份、3-5份、3-6份、4-5份、4-6份。

在一个具体的实施方式中，每1000份所述稀释液中，所述鱼精蛋白的重量份可以为3份、4份、5份、6份、7份、8份、10份。

在一些具体的实施方式中，每1000份所述稀释液中，所述鱼精蛋白的重量份可以为3-4份、3-5份、3-6份、3-7份、3-8份、3-10份、4-5份、4-6份、4-7份、4-8份、4-10份、5-6份、5-7份、5-8份、5-10份、6-7份、6-8份、6-10份、7-8份、7-10份、8-10份。

在一个具体的实施方式中，每1000份所述稀释液中，所述小分子酰胺类化合物的重量份可以为8份、10份、15份、17份、18份、20份、25份。

在一些具体的实施方式中，每1000份所述稀释液中，所述小分子酰胺类化合物的重量份可以为8-10份、8-15份、8-17份、8-18份、8-20份、8-25份、10-15份、10-17份、10-18份、10-20份、10-25份、15-17份、15-18份、15-20份、15-25份、17-18份、17-20份、17-25份、18-20份、18-25份、20-25份。

通过采用上述技术方案，本申请将每1000份稀释液中，烷基硫酸盐添加量控制在2.5-5份，鱼精蛋白添加量控制在4-8份，小分子酰胺类化合物添加量控制在10-20份，能够更有效发挥裂解细胞的作用，同时对免疫层析过程的干扰最小，能够保证本试剂盒对糖化血红蛋白和C肽的联合定量检测效果。

进一步地，所述烷基硫酸盐为烷基数为八到十八的烷基硫酸盐。

通过采用上述技术方案，由于烷基数为八到十八的烷基硫酸盐具有长链疏水基团，对细胞膜的吸附性更好，裂解细胞效果更佳，所以稀释液中的烷基硫酸盐为烷基数为八到十八的烷基硫酸盐时，裂解细胞效果更好，试剂盒对糖化血红蛋白和C肽的联合定量检测效果更好。

进一步地，所述鱼精蛋白选自鲱精蛋白、鲑精蛋白和虹鳟精蛋白中的一种或多种。

通过采用上述技术方案，由于鲱精蛋白、鲑精蛋白和虹鳟精蛋白对烷基硫酸盐裂解细胞膜的促进作用最强，所以当稀释液中的鱼精蛋白选自鲱精蛋白、鲑精蛋白和虹鳟精蛋白中的一种或多种时，裂解细胞效果更好，试剂盒对糖化血红蛋白和C肽的联合定量检测效果更好。

进一步地，所述小分子酰胺类化合物选自乙酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺中的一种或多种。

通过采用上述技术方案，由于乙酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺对烷基硫酸盐在裂解细胞过程中的协同作用最强，所以当稀释液中的小分子酰胺类化合物选自乙酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺中的一种或多种，裂解细胞效果更好，试剂盒对糖化血红蛋白和C肽的联合定量检测效果更好。

进一步地，所述检测卡的检测线与质控线相比，更远离加样端。

所述加样端为检测卡上样本滴加的一端，是层析的起点。通过采用上述技术方案，由于待测液体由样本垫迁移至吸水垫的过程中，流体前端迁移速率逐渐减慢，将检测线设置在相较于质控线更远离加样端的位置，使待测液体在检测线处流速较慢，抗原(糖化血红蛋白、C肽)与检测线包被的抗体反应时间延长，结合更加充分，有效提高了检测试剂盒准确度。

综上所述，本申请的技术方案具有以下有益效果：

1.本申请通过在C肽检测线上采用灵敏度更高的C肽单克隆抗体，使得样本稀释后仍能对C肽进行准确定量。本申请还对样本检测前的稀释倍数进行限定，能够保证使稀释液充分裂解样本中的细胞，使样本稀释后糖化血红蛋白和C肽的浓度均处于定量范围，实现了糖化血红蛋白和C肽的联合检测和精确定量。

2.本申请采用只检测糖化血红蛋白占总血红蛋白的比例的策略，使得样本稀释倍数低，血红蛋白上样量超出定量范围的情况下，仍能够对糖化血红蛋白进行定量检测。

3.本申请针对提供的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒的检测需求，改进了稀释液的配方，将鱼精蛋白和小分子酰胺类化合物与烷基硫酸盐联合使用，保证了血液样本稀释倍数很低的情况下，稀释液对样本中细胞的裂解效果。本申请的稀释液与现有稀释液相比，能更加高效、充分地裂解样本中的细胞，获得更准确的检测结果。

4.本申请所提供的试剂盒，在检测卡上使用了检测线相较于质控线更远离加样端的设计，使待测液体在检测线处流速较慢，抗原抗体在检测线上的结合更加充分，进一步提高了试剂盒灵敏度。

附图说明

图1为糖化血红蛋白质控品检测试验中拟合的标准曲线。

图2为C肽质控品检测试验中拟合的标准曲线。

具体实施方式

本申请提供了一种糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，由检测卡和稀释液组成。具体如下：

1.检测卡

试剂盒中的检测卡基于荧光定量免疫层析技术，采用双抗体夹心法对糖化血红蛋白和C肽分别定量检测，所述检测卡还包括结合垫和检测垫，所述结合垫表面喷涂有荧光微球标记的血红蛋白抗体、荧光微球标记的C肽抗体以及荧光微球标记的质控抗体。检测垫上平行设置有质控线(C线)、检测线1(T1线)和检测线2(T2线)。本申请中，荧光微球标记的C肽抗体为lgG1亚型，浓度为≥2mg/ml，纯度(SDS-PAGE)≥90％，缓冲液为0.02M Tris-NaCl(pH7.5)；制备方法为：利用纯化的C肽免疫BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交得到杂交瘤克隆制备的C肽单克隆抗体。

在本申请中，荧光微球标记的血红蛋白抗体可以是荧光微球标记的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体。

在本申请中，荧光微球标记的C肽抗体可以是荧光微球标记的鼠抗人C肽单克隆抗体。

在本申请中，荧光微球标记的质控抗体可以是荧光微球标记的鸡免疫球蛋白IgY，也可以是荧光微球标记的DNP-BSA(牛血清白蛋白)。

其中，C线包被有与荧光微球标记的质控抗体特异性结合的抗体，为质控线。

在本申请中，当荧光微球标记的质控抗体为荧光微球标记的鸡免疫球蛋白IgY时，C线可以包被有兔抗鸡IgY多克隆抗体。

在本申请中，当荧光微球标记的质控抗体为荧光微球标记的DNP-BSA时，C线可以包被有兔抗DNP多克隆抗体。

其中，T1线包被有糖化血红蛋白单克隆抗体，为糖化血红蛋白检测线。

其中，T2线包被有C肽单克隆抗体，为C肽检测线。本申请中，C肽单克隆抗体为lgG1亚型，浓度为≥2mg/ml，纯度(SDS-PAGE)≥90％，缓冲液为0.01M PB+0.1M NaCl(pH7.4)；制备方法为：利用纯化的C肽免疫BALB/c小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞杂交得到杂交瘤克隆制备的C肽单克隆抗体。

进一步地，所述糖化血红蛋白检测线和C肽检测线相较于质控线更远离加样端。

(2)稀释液

本申请提供的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，在检测前，需要将样本与稀释液按照一定比例混匀，待样本中的细胞在稀释液的作用下裂解完全后，即可取一定体积进行检测。

所述稀释液可以为0.25％ Triton 100的磷酸盐缓冲液。

所述稀释液也可以为本申请所设计的稀释液。

本申请针对提供的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒专门设计了一种稀释液，与现有稀释液相比，在血液样本稀释倍数低的情况下，能更高效、充分地裂解细胞，进一步提高本试剂盒的检测效果。

本申请针对试剂盒提供的稀释液，包括烷基硫酸盐、鱼精蛋白和小分子酰胺类化合物。

进一步地，所述稀释液中各组分的重量份如下：每1000份所述稀释液中，包含所述烷基硫酸盐2.5-5份、所述鱼精蛋4-8份、所述小分子酰胺类化合物10-20份。

进一步地，所述稀释液中各组分的重量份如下：每1000份所述稀释液中，包含所述烷基硫酸盐3-4份、所述鱼精蛋白5-7份、所述小分子酰胺类化合物15-18份。

进一步地，所述稀释液中各组分的重量份如下：每1000份所述稀释液中，包含所述烷基硫酸盐3份、所述鱼精蛋白6份、所述小分子酰胺类化合物17份。

进一步地，所述烷基硫酸盐为烷基数八到十八的烷基硫酸盐。

进一步地，所述鱼精蛋白选自鲱精蛋白、鲑精蛋白和虹鳟精蛋白中的一种或多种。

进一步地，所述小分子酰胺类化合物选自乙酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺中的一种或多种。

在一些实施方式中，所述稀释液中还含有缓冲组分，使稀释液的pH稳定于7.0-8.0。

进一步地，所述缓冲组分可以为浓度在10-50mM的碳酸盐、磷酸盐或硼酸盐。

(3)样本稀释倍数

本申请提供的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒在使用时，样本稀释15-30倍。

进一步地，所述糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒在使用时，样本稀释18-25倍。

(4)试剂盒检测步骤

取新鲜静脉全血样本，将一定体积的样本加入到一定体积的稀释液中，颠倒混匀，作用一段时间，使稀释液将样本中的细胞充分裂解，取一定体积稀释后的样本加入加样孔，等待一段时间，待层析反应完成后，通过荧光免疫分析仪读取C线、T线荧光信号，根据标准曲线，得出样本中糖化血红蛋白和C肽的实际含量。

以下结合制备例、实施例、对比例、性能测试实验和附图对本申请作进一步详细说明，以下实施例不能用以限制本申请所要求保护的范围。

检测卡制备例

本制备例的检测卡由试纸条和卡壳组成，所述试纸条宽0.4cm，由底板和沿样本层析方向顺次搭接粘贴于底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫组成，所述卡壳的盖板上在样品垫和检测垫的正上方依次设置有加样孔和观察窗。

所述结合垫表面喷涂有荧光微球标记的鼠抗人血红蛋白单克隆抗体、荧光微球标记的鼠抗人C肽单克隆抗体以及荧光微球标记的鸡免疫球蛋白IgY。

所述检测垫上沿样本层析方向依次平行设置有质控线(C线)、检测线1(T1线)和检测线2(T2线)。其中C线包被有兔抗鸡IgY多克隆抗体，T1线包被有糖化血红蛋白单克隆抗体，为糖化血红蛋白检测线；T2线包被有C肽单克隆抗体，为C肽检测线。

检测卡的制备方法包括以下步骤：

1.检测垫抗体包被：使用含有5％蔗糖的20mM的pH 7.2的磷酸盐缓冲液，分别将兔抗鸡IgY多克隆抗体、糖化血红蛋白单克隆抗体和C肽单克隆抗体浓度调整为1mg/mL，使用定量喷膜仪分别以1μL/cm的量按顺序以0.5cm的间隔包被于材质为硝酸纤维素膜的检测垫上，形成C线、T1线和T2线，37℃烘干过夜。

2.制备荧光微球标记的鸡免疫球蛋白IgY、血红蛋白单克隆抗体和C肽单克隆抗体，并喷涂于结合垫上。以荧光微球标记的血红蛋白单克隆抗体为例，对抗体标记步骤进行说明：(1)抗体的预处理：4℃条件下，采用20mM的pH 7.2的磷酸盐缓冲液将血红蛋白单克隆抗体透析过夜，再将透析后的血红蛋白单克隆抗体浓度调整为1mg/mL。

(2)活化荧光微球：使用10mM的pH 6.0的MES缓冲液洗涤微球，震荡混匀，再依次加入100mg/mL的碳二亚胺和100mg/mL的N-羟基琥珀酰亚胺，避光活化30min，MES缓冲液充分洗涤微球，复溶至微球浓度为0.2mg/mL。

(3)抗体的荧光微球标记：将经过预处理的血红蛋白单克隆抗体与活化的荧光微球悬液等体积混合，室温反应2小时，加入含有0.5％BSA，0.1％甘氨酸的50mM，pH 8.0的Tris-HCl封闭液，封闭1小时后，用含有0.5％BSA，0.05％Tween-20的50mM，pH8.0的Tris-HCl保存液洗涤并复溶至抗体浓度为2mg/mL。

鸡免疫球蛋白IgY和C肽单克隆抗体的标记方法同上，本步骤所用C肽单克隆抗体与步骤2所用C肽单克隆抗体所识别抗原表位不同。将荧光微球标记的抗体按一定比例混合后，使用定量喷膜仪以1.5μL/cm的量喷涂于玻璃纤维膜(结合垫)上，避光，37℃烘干过夜。

3.在底板上依次搭接粘贴样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫，切割成宽度为0.4cm大小，组装到卡壳中，即得检测卡。

检测卡性能检测试验(一)糖化血红蛋白质控品检测试验

取不同浓度的糖化血红蛋白质控品，分别用20mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液稀释20倍后，取100μL稀释后的质控品加入加样孔，层析5min后，通过荧光免疫分析仪读取C线、T线荧光信号，计算T/C值，每个浓度做4个平行，实验数据及统计分析见表1。

表1糖化血红蛋白质控品检测结果

以糖化血红蛋白质控品理论浓度和信号T/C平均值绘制标准曲线，线性方程为y＝0.1379x+0.1873，标准曲线如图2所示，线性相关系数R²为0.9986，表明本试剂盒在糖化血红蛋白浓度为2-14％的测量范围内，检测结果与样本浓度线性相关性良好。

(二)C肽质控品检测试验

使用20mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液配制不同浓度的C肽质控品，分别用20mM，pH8.0的磷酸盐缓冲液稀释20倍后，取100μL稀释后的质控品加入加样孔，层析5min后，通过荧光免疫分析仪读取C线、T线荧光信号，计算T/C值，每个浓度做4个平行，实验数据及统计分析见表2。

表2C肽质控品检测结果

以C肽质控品浓度和样本信号T/C平均值绘制标准曲线，线性方程为y＝0.052x+0.022，标准曲线如图2所示。线性相关系数R²为0.9988，表明本试剂盒在C肽浓度为0.2-30ng/mL的测量范围内，检测结果与样本浓度线性相关性良好。

稀释液制备例

制备例1-3

制备例1-3分别提供了一种稀释液。上述制备例的区别之处在于：稀释液中鱼精蛋白的种类，具体如表3所示。

上述稀释液的制备方法具体包括以下步骤：

(1)将4.107g磷酸二氢钾溶解于800mL超纯水中，制得缓冲液；

(2)将烷基硫酸盐、鱼精蛋白和小分子酰胺类化合物加入步骤(1)制得的缓冲液中充分溶解，定容至1000mL，调整pH至7.5，制得稀释液。其中，烷基硫酸盐具体为十二烷基硫酸钠；小分子酰胺类化合物具体为天冬酰胺。各组分的添加量具体如表1所示。

制备例4-5

制备例4-5分别提供了一种稀释液，上述稀释液与制备例2的区别之处在于：小分子酰胺类化合物的类型不同，具体如表3所示。

制备例6-11

制备例6-11分别提供了一种稀释液。上述稀释液与制备例2的区别之处在于：鱼精蛋白的添加量不同，具体如表3所示。

制备例12-17

制备例12-17分别提供了一种稀释液，上述稀释液与制备例2的区别之处在于：小分子酰胺类化合物的添加量不同，具体如表3所示。

制备例18-23

制备例18-23分别提供了一种稀释液，上述制备例与制备例2的区别之处在于：稀释液中各组分的添加情况不同，具体如表3所示。

表3稀释液制备例和对比例各组分添加情况

试剂盒实施例

实施例1-17

实施例1-17分别提供一种试剂盒。上述试剂盒包括检测卡和稀释液。其中，检测卡为上述检测卡制备例提供的检测卡；稀释液分别为制备例1-17提供的稀释液，具体如表4所示。

上述试剂盒的检测步骤具体如下：

①标准曲线拟合：

a.糖化血红蛋白标准曲线拟合：

取糖化血红蛋白含量分别为2％、4％、6％、8％、10％、12％和14％的质控品，稀释20倍数后，取100μL稀释后的质控品加入检测卡加样孔，层析5min后，通过荧光免疫分析仪读取C线、T线荧光信号，建立糖化血红蛋白质控品理论浓度和信号T/C值的标准曲线。

b.C肽标准曲线拟合：

与糖化血红蛋白标准曲线拟合操作步骤一致，不同之处在于质控品为浓度分别为0.3ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、4ng/mL、8ng/mL、15ng/mL和20ng/mL的C肽质控品。

②实际样本检测：

取新鲜静脉全血样本，稀释20倍后，颠倒混匀，作用1min后，取100μL稀释后的样本加入加样孔，层析5min后，通过荧光免疫分析仪读取C线、T线荧光信号，根据标准曲线，得出样本中糖化血红蛋白和C肽的实际含量。

实施例18-21

实施例18-21分别提供一种试剂盒。上述试剂盒与实施例2的区别之处在于：在加样前，样本的稀释倍数。具体如表5所示。

实施例22

实施例22提供一种试剂盒。上述试剂盒与实施例1-17的区别之处在于：试剂盒中的稀释液为0.25％ Triton 100的磷酸盐缓冲液。

试剂盒对比例

对比例1-6

对比例1-6分别提供一种试剂盒。上述试剂盒与实施例2的区别之处在于：试剂盒中的稀释液分别为制备例18-23提供的稀释液，具体如表4所示。

对比例7-8

对比例7-8分别提供一种试剂盒。上述试剂盒与实施例2的区别之处在于：在加样前，样本的稀释倍数。具体如表5所示。

表4实施例1-22以及对比例1-8提供的试剂盒中稀释液的来源

表5实施例1-22以及对比例1-8提供的试剂盒中样本与稀释液的混合情况

试剂盒性能检测试验

利用实施例1-22和对比例1-8的试剂盒分别对5份新鲜静脉全血样本进行糖化血红蛋白和C肽的定量检测，具体步骤如下：

按照表5所示样本与稀释液的混合体积，取一定体积的全血样本，加入到一定体积的稀释液中，颠倒混匀，作用1min后，取100μL稀释后的样本加入加样孔，层析5min后，通过荧光免疫分析仪读取C线、T线荧光信号，计算T/C值，基于糖化血红蛋白-C肽联合检测卡性能检测试验拟合的标准曲线，计算样本中糖化血红蛋白和C肽含量。

以HPLC法和放射免疫分析法的检测结果分别作为样本糖化血红蛋白浓度和C肽浓度的参考值，用实施例和对比例的检测结果与参考值之间的平均相对误差衡量检测结果的准确性。检测结果如下：

表6糖化血红蛋白临床样本检测结果

表7C肽临床样本检测结果

综合实施例2和对比例1-6的检测结果可知，本申请提供的稀释液中含有烷基硫酸盐、鱼精蛋白和小分子酰胺类化合物。由对比例1-6的检测结果可知，当稀释液中仅添加烷基硫酸盐、鱼精蛋白和小分子酰胺类化合物中的一种或两种的情况下，检测结果与参考值相比明显偏小，糖化血红蛋白检测值的误差超过了10％，C肽检测值的误差超过了7％。稀释液细胞裂解效果不佳，无法满足糖化血红蛋白和C肽检测的准确性要求。实施例2的糖化血红蛋白和C肽检测结果与参考值相比误差在2％以内。表明稀释液中同时添加烷基硫酸盐、鱼精蛋白和小分子酰胺类化合物三种成分时，才能同时保证细胞裂解效果，进一步保证试剂盒的检测准确性。

实施例1-3的区别在于，鱼精蛋白的添加种类不同。实施例1-3的糖化血红蛋白检测值的误差均在5％以内，C肽检测值的误差均在4％以内，表明添加鲱精蛋白、鲑精蛋白和虹鳟精蛋白的稀释液均能起到较好的细胞裂解效果，检测结果较为准确，其中添加鲑精蛋白的实施例2裂解效果最好，检测结果最准确。

实施例2、4和5的区别在于，小分子酰胺类化合物的添加种类不同。实施例2、4和5的糖化血红蛋白和C肽的检测值误差均在4％以内，结合表1数据，表明添加乙酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺的稀释液均能起到较好的细胞裂解效果，检测结果较为准确，其中添加天冬酰胺的实施例2裂解效果最好，检测结果最准确。

综合实施例2和实施例6-11的检测数据可知，本申请中每1000份稀释液中鱼精蛋白的添加范围在3-10份。实施例2和实施例7-10的检测值误差均在4％以内，表明每1000份稀释液中鱼精蛋白添加量在4-8份的范围内时均能起到较好的细胞裂解效果，检测结果较为准确。其中，实施例2、8和9的检测值误差均在3％以内，表明每1000份稀释液中鱼精蛋白添加量在5-7份的范围内时检测结果更为准确。

综合实施例2和实施例12-17的检测数据可知，本申请中每1000份稀释液中小分子酰胺类化合物的添加范围在8-25份。实施例2和实施例13-16的检测值误差均在5％-内，表明每1000份稀释液中小分子酰胺类化合物添加量在10-20份的范围内时均能起到较好的裂解效果，检测结果较为准确。其中，实施例2、14和15的检测值误差均在3％以内，表明每1000份稀释液小分子酰胺类化合物添加量在15-18份的范围内时检测结果更为准确。

本试验中，实施例2、18-21和对比例7-8的差异在于，在加样前，样本的稀释倍数。因此，实施例2、18-21和对比例7-8的检测数据能够反映样本稀释不同倍数时的检测效果。

实施例2、18-21糖化血红蛋白检测值和C肽检测值误差均在5％以内，表明在检测前，样本的稀释倍数在15-30倍的范围内，能够同时保证糖化血红蛋白和C肽的准确定量。实施例2、26和27糖化血红蛋白检测值误差在2％以内，C肽检测值误差在3％以内，表明在检测前，样本的稀释倍数在18-25倍的范围内，能进一步提高糖化血红蛋白和C肽检测的准确性。

实施例1-17与实施例22的差异在于，实施例1-17采用本申请提供的稀释液，而实施例22的试剂盒采用0.25％ Triton 100的磷酸盐缓冲液。实施例1-17的糖化血红蛋白和C肽检测值误差均在5％以内；而实施例22的糖化血红蛋白检测值误差超过了5％，C肽检测值误差超过了7％。表明本申请提供的稀释液与0.25％ Triton 100的磷酸盐缓冲液相比，对样本中细胞的裂解效果更好，能有效提高试剂盒对糖化血红蛋白和C肽的检测准确性。

检测线(T2线)位置不同的检测卡的检测结果对比

利用“检测卡制备例”中的方法制备对比检测卡，上述检测卡与对比检测卡的区别之处在于：检测线的位置。对比检测卡的检测垫上，沿样本层析方向依次平行设置有检测线2(T2线)、检测线1(T1线)和质控线(C线)。相对于C线，对比检测卡中T2线的位置更靠近加样端。

使用20mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液配制不同浓度的C肽质控品，分别用20mM，pH8.0的磷酸盐缓冲液稀释20倍后，取100μL稀释后的质控品加入加样孔，层析5min后，通过荧光免疫分析仪读取C线、T线荧光信号，计算T/C值，实验数据及统计分析见表8。

表8检测线(T2线)位置不同的检测卡的C肽检测结果

由上述检测结果可知，检测卡的灵敏度明显高于对比检测卡的灵敏度，说明检测线(T2线)远离加样端，更有利于提高检测卡的灵敏度。

使用不同稀释液的检测结果对比

试剂盒A：试剂盒A与实施例1-17的区别之处在于：试剂盒中的稀释液为0.1％ SDS的磷酸盐缓冲液。

试剂盒B：试剂盒B与实施例1-17的区别之处在于：试剂盒中的稀释液为0.1％EDTA-Na₂的磷酸盐缓冲液。

使用20mM，pH 8.0的磷酸盐缓冲液配制不同浓度的C肽质控品，分别利用实施例22以及试剂盒A、试剂盒B进行检测，用稀释液稀释20倍后，取100μL稀释后的质控品加入加样孔，层析5min后，通过荧光免疫分析仪读取C线、T线荧光信号，计算T/C值，实验数据及统计分析见表9。

表9检测线(T2线)位置不同的检测卡的C肽检测结果

由上述检测结果可知，实施例22的灵敏度明显高于试剂盒A和试剂盒B的灵敏度，说明相对于使用0.1％ SDS的磷酸盐缓冲液或0.1％ EDTA-Na₂的磷酸盐缓冲液作为稀释液，使用0.25％ Triton 100的磷酸盐缓冲液更有利于提高检测灵敏度。

本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (4)

1.一种糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，其特征在于，

所述试剂盒包括检测卡和稀释液，所述检测卡由底板和沿样本层析方向顺次搭接粘贴于底板上的样品垫、结合垫、检测垫和吸水垫组成；所述结合垫上具有分别能与糖化血红蛋白和C肽特异性结合的两种荧光微球标记的抗体；所述检测垫上通过在不同的位置包被糖化血红蛋白单克隆抗体和C肽单克隆抗体分别形成糖化血红蛋白检测线和C肽检测线；所述糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒在使用时，用所述稀释液将样本稀释15-30倍；

所述稀释液包含以下组分：烷基硫酸盐、鱼精蛋白和小分子酰胺类化合物；

所述稀释液中各组分的重量份如下：每1000份所述稀释液中，包含所述烷基硫酸盐2.5-5份、所述鱼精蛋白4-8份和所述小分子酰胺类化合物10-20份；

所述烷基硫酸盐为十二烷基硫酸钠；

所述鱼精蛋白选自鲱精蛋白、鲑精蛋白和虹鳟精蛋白中的一种或多种；

所述小分子酰胺类化合物选自乙酰胺、谷氨酰胺和天冬酰胺中的一种或多种；

所述稀释液中还含有缓冲组分，使所述稀释液的pH稳定于7.0-8.0；

所述缓冲组分为浓度在10-50mM的碳酸盐、磷酸盐或硼酸盐。

2.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒在使用时，将样本稀释18-25倍。

3.根据权利要求1所述的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述稀释液中各组分的重量份如下：每1000份所述稀释液中，包含所述烷基硫酸盐3-4份、所述鱼精蛋白5-7份和所述小分子酰胺类化合物15-18份。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的糖化血红蛋白-C肽联合检测试剂盒，其特征在于，所述检测卡的检测线与质控线相比，更远离加样端。