DE3883145T2

DE3883145T2 - Verfahren zur Messung von humanen Insulin.

Info

Publication number: DE3883145T2
Application number: DE19883883145
Authority: DE
Inventors: Kuniyo Inouye; Kazuki Satoh
Original assignee: Tosoh Corp
Current assignee: Tosoh Corp
Priority date: 1987-10-12
Filing date: 1988-10-12
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2008-10-13
Also published as: AU628298B2; EP0314338B1; JPH0198968A; EP0314338A1; AU2367988A; DE3883145D1; CA1337926C

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zum Messen von Humaninsulin in einer Probe durch Verwendung von einem monoklonalen Antikörper gegen Humaninsulin. Besonders bezieht sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Messen von Humaninsulin bei einer Humaninsulin-Konzentration, die sich von 1 pg/ml bis zu 1 ng/ml erstreckt.
Insulin ist ein Peptidhormon, das von Beta-Zellen der Langerhans-Inseln, die in der Bauchspeicheldruse vorhanden sind, ausgeschieden wird und hat die Funktion, den Metabolismus der Saccharide, Fette und Proteine in den Geweben der Leber und anderer Organe zu regulieren. Wenn die Insulinproduktion im lebenden Körper unzureichend ist, wird die Akkumulation der Saccharide in Form von Glykogen in der Leber schwierig, und daraus resultierend steigt abrupt der Blutzucker, und die Absorption von Glukose durch die Niere kann diese Zunahme des Blutzuckers nicht bewältigen, was Diabetes verursacht.
Folglich ist die Messung des Insulingehalts im lebenden Körper sehr wichtig für die Diagnose von Diabetes. Gegenwärtig werden Immunoassay-Methoden wie die Radioimmunoassay-Verfahren und die Enzymimmunoassay-Verfahren für die Bestimmung von Humaninsulin übernommen, aber da der Anti-Insulin-Antikörper, der in diesen Immunoassay-Methoden verwendet wird, ein Antiserum ist, das durch Immunisieren eines Tieres wie eines Meerschweinchens mit Rinderinsulin oder Schweineinsulin erhalten wird, ist die Menge des erhaltenen Anti-Insulin-Antikörpers sehr klein, und die Affinität zum Insulin oder der Titer ist oft in einzelnen Tieren verschieden. Folglich wird das Antiserum von Tieren gesammelt, und die so gesammelten Fraktionen werden gemischt, um ein Produkt zu erhalten, das eine einheitliche Qualität für die Verwendung des Immunoassays hat. Trotzdem kann noch ein Unterschied in der Affinität oder dem Titer zwischen den einzelnen Chargen beobachtet werden.
Als Weg dieses Problem zu losen, ist kürzlich ein Verfahren vorgeschlagen worden, in dem Insulin durch Verwendung von einem monoklonalen Antikörper nachgewiesen wird (siehe DE-A-3411472 oder Japanische ungeprüfte Patent-Anmeldung Nr. 60-57253). In diesem Verfahren wird die Affinität zum Insulin durch Radioimmnnoassay oder Doppelbindungsassay gemessen.
Außerdem berichten R. Committi et al. ein Verfahren, in der Insulin bei einer Konzentration, die sich von 0,08 ng/ml bis 7,5 ng/ml erstreckt, innerhalb von 3 bis 4 Stunden durch ein Enzym-Immunoassay gemessen wird unter Verwendung des Sandwich- Verfahrens (siehe Journal of Immunological Methods, Band 99, Seiten 25 bis 37). In diesem beschriebenen Verfahren werden von monoklonalen Antikörpern, die durch Verwendung von Schweineinsulin als Antigen erhalten wurden, monoklonale Antikörper ausgewählt, die zur Kreuzreaktion mit Humaninsulin fähig sind. Wenn das Sandwich-Immunoassay-System aufgebaut wird, wird außerdem ein erster Antikörper an eine Festphase immobilisiert, und ein zweiter Antikörper, der an Biotin gebunden ist, und eine Probenflüssigkeit, die Humaninsulin enthält, werden zu dem immobilisierten ersten Antikörper hinzugefügt, um einen Ersten Antikörper/Humaninsulin/Zweiten Antikörper/Biotin- Komplex zu bilden. Dann wird eine Avidin-gebundene Alkalische Phosphatase hinzugefügt, um einen Ersten Antikörper/Humaninsulin/Zweiten Antikörper/Biotin/Avidin/ Alkalische Phosphatase-Komplex zu bilden, und ein Substrat für die Alkalische Phosphatase wird hinzugefügt, um eine Enzymreaktion zu verursachen. ES wird gelehrt, daß von 71 Erste Antikörper/Zweite Antikörper-Paaren, die in dem Bericht beschrieben werden, zwei Antikörper nicht gleichzeitig an das an die Festphase gebundene Humaninsulin gebunden werden können.
Das mit den oben erwähnten Berichten und dem Stand der Technik verknüpfte Problem ist, daß der Antikörper nicht nur eine Kreuzreaktion mit Humaninsulin zeigt, sondern auch zu Insulinen anderer Tiere wie Schwein, Rind und Schaf. Weil monoklonale Antikörper durch Immunisieren von Mäusen oder Ratten mit Insulinen von anderen Tieren, als von Menschen, wie von Rindern und Schweinen, erhalten werden, ist es meistens auf dem Stand der Technik ganz offensichtlich, daß die erhaltenen monoklonalen Antikörper mit den Insulinen der Tiere, die als das Antigen verwendet wurden, reagieren. Zwischen diesen monoklonalen Antikörpern sind monoklonale Antikörper gefunden worden, die eine leichte Spezifität und Fähigkeit zur Kreuzreaktion mit Humaninsulin haben, und meistens werden auf dem Stand der Technik aus Schweine- oder Rinderinsulin produzierte monoklonale Antikörper, die zur Kreuzreaktion mit Humaninsulin fähig sind, verwendet.
Die Japanische ungeprüfte Patent-Anmeldung No. 60-237362 beschreibt ein Verfahren zur Insulinmessung durch den Sandwich- Assay, jedoch wird ein polyklonaler Antikörper, der von Capybara oder Meerschweinchen stammt, verwendet.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist, die oben erwähnten Mängel der konventionellen Verfahren zu überwinden und ein Verfahren bereitzustellen, mit der Humaninsulin bei einer hohen Empfindlichkeit gemessen werden kann.
Die Erfinder stellten gegen Humaninsulin spezifische monoklonale Antikörper her, die mit immunologischen Meßverfahren gemessen und geprüft werden sollten unter Verwendung dieser monoklonalen Antikörper und fanden als Ergebnis, daß die hergestellten monoklonalen Antikörper sehr nützlich als Reagenzien zum Messen von Humaninsulin sein können. Zwei monoklonale Antikörper, die spezifisch an Humaninsulin binden können, und welche eine unterschiedliche Antigen-Bindungsstelle (Antigendeciding site) haben und gleichzeitig und unabhängig an Humaninsulin ohne Kompetition gebunden werden können, werden verwendet. Diese monoklonalen Antikörper werden ausgewählt, um nur Humaninsulin nachzuweisen und so zu sein, daß sie nicht mit Insulin reagieren, das von einem heterogenen Tier wie Schwein, Rind, Ziege, Schaf oder Maus stammt. Die Detektion von Humaninsulin wird möglichst in der Größenordnung von 1 pg/ml gewünscht.
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung wird da ein Verfahren zum Nachweisen und/oder Messen von Humaninsulin in einer Probe geliefert, indem ein erster Antikörper und ein zweiter Antikörper mit der Probe in Kontakt gebracht wird, wobei einer der Antikörper immobilisiert und der andere Antikörper mit einem Marker markiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß beide Antikörper an Humaninsulin binden können, jedoch an verschiedenen antigenen Stellen, jedoch so sind, daß sie nicht mit Nicht-Humaninsulin reagieren.
Die monoklonalen Antikörper, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden, können erhalten werden aus kultivierten Produkten von Hybridomzellen durch Verschmelzen von Antikörper-produzierenden Milzzellen, nämlich lymphoiden Zellen in der Milz eines Tieres, zum Beispiel einer Maus, die mit Humaninsulin immunisiert wurde, mit Myelomzellen, um monoklonale Antikörper-produzierende Hybridomzellen zu erhalten, die das Insulin wiedererkennen.
Die Hybridomzellen, die den monoklonalen Antikörper produzieren, der Humaninsulin wiedererkennt, können durch die bekannte Zellfusionsmethode hergestellt werden (G. Kohler und c. Milstein, Nature, Band 256, Seite 495, 1975).
Gemäß der vorliegenden Erfindung werden die monoklonalen Antikörper, die Humaninsulin wiedererkennen, durch das oben erwähnte Verfahren erhalten. Die monoklonalen Antikörper umfassen zwei monoklonale Antikörper, die unterschiedliche antigene Stellen des Insulins erkennen, und daher kann das Festphasen- Enzymimmunoassay nach dem Sandwich-Verfahren unter Verwendung von zwei monoklonalen Antikörpern angewendet werden. Außerdem können monoklonale Antikörper, die nur mit Humaninsulin reagieren können, aber unfähig zu einer Kreuzreaktion mit Insulin sind, das von einem heterogenen Tier wie Rind, Schwein, Ziege, Schaf, Mäusen oder Ratten stammt, gemäß dem oben erwähnten Verfahren erhalten werden. Man vermutet, daß die erhaltenen monoklonalen Antikörper die Peptidstruktur erkennen, die Humaninsulin inhärent besitzt, aber nicht ein heterogenes Tier wie Rind, Schwein, Ziege, Schaf, Maus oder Ratte besitzt. Durch Verwendung dieser monoklonalen Antikörper als mindestens einer der ersten und zweiten Antikörper kann Humaninsulin allein nachgewiesen werden, ohne einen Nachweis des Insulins, das von einem heterogenen Tier stammt.
In der vorliegenden Erfindung wird der monoklonale Antikörper, der Insulin erkennt, als der erste Antikörper, immobilisiert, und die Immobilisierung kann durch die bekannten Verfahren ausgeführt werden. Für die Immobilisierung des Antikörpers können bevorzugt Kugeln oder Mikroplatten aus Polystyrol, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Latex, Agarose, Zellulose, Methacrylat oder Glas verwendet werden.
Das Verfahren oder Mittel zur Markierung des zweiten Antikörpers ist nicht besonders kritisch, und unbekannte Verfahren oder Mittel können übernommen werden. In dem Verfahren, das ein Enzym als Marker (EIA) verwendet, können Enzyme wie Peroxidase, Beta-D-Galaktosidase und Alkalische Phosphatase benutzt werden, und in dem Verfahren, das eine radioaktive Substanz (RIA) verwendet, können zum Beispiel ¹²&sup5;I und ³H benutzt werden. Fluorescein-Isothiocyanat wird in der Regel in dem Verfahren, das eine fluoreszierende Substanz (FIA) verwendet, benutzt, aber auch andere Marker können verwendet werden.
Wo der Marker ein Enzym ist, wird ein Substrat zur Messung der Aktivität verwendet. Zum Beispiel, als das Substrat für Meerrettich-Peroxidase, kann an dieser Stelle Diammonium - 2,2'-azino-di-[3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäurediammoniumsalz] (im folgenden bezeichnet als "ABTS")-H&sub2;O&sub2;&sub1; 5-Aminosalicylsäure-H&sub2;0&sub2; und o-Phenylendiamin-H&sub2;0&sub2; erwähnt werden. Als das Substrat für Beta-Galaktosidase, kann an dieser Stelle o- Nitrophenyl-beta-D-galaktopyranosid erwähnt werden, und als das Substrat für Alkalische Phosphatase kann an dieser Stelle p- Nitrophenylphosphat erwähnt werden.
Für die Messung können bekannte Reagenzien wie lösende Agenzien, waschende Agenzien und Reaktionsstopper zusätzlich zu den oben erwähnten Reagenzien verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann eine infinitesimale Menge (1 pg/ml) Humaninsulin bei einer hohen Empfindlichkeit mit einer guten Reproduzierbarkeit nachgewiesen werden in einer Meßkonzentration, die von 1 pg/ml bis 1 ng/ml reicht. Außerdem kann gemäß der vorliegenden Erfindung nur Humaninsulin nachgewiesen werden, ohne eine Reaktion mit Insulin, das von einem heterogenen Tier stammt.
Die vorliegende Erfindung wird nun im Detail beschrieben mit Hinweis auf die folgenden Beispiele.

Beispiel (A)

Herstellung von den monoklonalen Antikörpern gegen Humaninsulin

Die monoklonalen Antikörper gegen Humaninsulin wurden nach dem Verfahren von G. Kohler und C. Milstein hergestellt. In phosphatgepufferter Salzlösung wurden 100 ug Humaninsulin (geliefert von Sigma Co.) gelöst, und die Lösung wurde mit einer gleichen Menge Freundes vollständigem Adjuvanz emulgiert. Die Emulsion wurde in eine Maus intraperitoneal injiziert. Nach 20 Tagen wurde eine Lösung von 100 ug Humaninsulin in phosphatgepufferter Salzlösung in eine Maus intraperitoneal injiziert. Nach 3 Tagen wurden Milzzellen von der Maus gesammelt und mit Mäuse-Myelomzellen verschmolzen unter Verwendung von Polyethylenglykol. Die Zellen wurden auf Platten mit 96 Vertiefungen kultiviert, und die HAT-Selektion wurde in einer bekannten Art und Weise durchgeführt. Die Hybridomzellen wurden durch das bekannte Verfahren unter Verwendung einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gescreent. Bezüglich der Hybridomzellen, die Antikörper gegen Humaninsulin produzieren, wurde das Klonieren gemäß der limitierenden Verdünnung durchgeführt. Die so erhaltenen Hybridomzellen wurden in der Bauchhöhle einer Maus kultiviert, um Aszites-Flüssigkeiten zu erhalten, die monoklonale Antikörper enthalten.
Eine Vielzahl von Arten monoklonaler Antikörper gegen Humaninsulin wurden erhalten, indem die Aszites-Flüssigkeiten einer Ammoniumsulfat-Präzipitation und einer DEAE-Ionenaustauscherchromatographie unterzogen wurden.

Beispiel (B)

Immobilisierung des monoklonalen Antikörpers gegen Insulin

60 ul einer Lösung des monoklonalen Antikörpers gegen Humaninsulin [der in Beispiel (A) hergestellte monoklonale Antikörper, der mit Humaninsulin, reagieren kann, aber nicht mit Insulin, das von heterogenen Tieren stammt, reagieren kann, wird bezeichnet als "UMI"], welches bei einer Konzentration von 100 ug/ml in phosphatgepufferter Salzlösung gelöst war, wurde in die jeweiligen Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen gegeben (Immunoplatte von NVNK geliefert) und bei 37ºC für 2 Stunden stehengelassen. Dann wurde die Lösung aus jeder Vertiefung entfernt, und 200 ul phosphatgepufferte Salzlösung, die 1% BSA (Rinderserumalbumin) enthielt, wurde in jede Vertiefung gegeben, und jede Vertiefung wurde für 1 Stunde stehengelassen, um nicht-spezifische Adsorptionsstellen zu blockieren. Der monoklonale Antikörper, der auf der Mikrotiterplatte immobilisiert war, wurde in diesem Stadium bei 4ºC gelagert.

Beispiel (C)

Herstellung des Antikörpers, der mit Meerrettich- Peroxidase markiert war (im folgenden bezeichnet als "HRPO")

Zu einer HRPO-Lösung (5 mg/ml) in 0,3 M Natriumbikarbonatpuffer (pH = 8,1) wurde 0,1 ml einer 1%igen Lösung von 1-Fluor- 2,4-dinitrobenzol in Ethanol hinzugefügt, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 1 Stunde durchgeführt. Dann wurde 1,0 ml 60 mM Natriumperjodat zu dem Reaktionsgemisch gegeben, und die Reaktion wurde für 30 Minuten durchgeführt. Nichtreagiertes Natriumperjodat wurde durch Zugabe von 1,0 ml 0,16 M Ethylenglykol entfernt, und das Reaktionsgemisch wurde gegen 10 mM Natriumkarbonatpuffer (pH = 9,5) dialysiert. Dann wurden 5 mg des monoklonalen Maus-Antikörpers gegen Humaninsulin [monoklonaler Antikörper hergestellt in Beispiel (A), der eine antigene Stelle wiedererkannte, die unterschiedlich war zu der antigenen Stelle, die durch UMI wiedererkannt wurde, und mit Humaninsulin reagieren konnte, aber nicht mit Insulin, das von einem heterogenen Tier stammte, reagieren konnte; bezeichnet als "DEW"] zu dem Dialysat gegeben, und die Reaktion wurde für 6 Stunden durchgeführt. Dann wurden 5 mg Natriumborhydrid zum Reaktionsgemisch hinzugefügt, und die Mischung wurde bei 4ºC über Nacht stehengelassen.
Das so erhaltene Reaktionsprodukt wurde durch die Hochleistungs- Flüssigkeitschromatographie gereinigt unter Verwendung von TSK-Gel G-3000SW (Handelsname für das Produkt geliefert von TOSOH-Corp.), wobei ein monoklonaler Antikörper, der mit HRPO markiert war, erhalten wurde.

Beispiel (D)

Messung von Humaninsulin durch Enzym- Immunoassay

Der auf der Mikrotiterplatte immobilisierte monoklonale Antikörper gegen Humaninsulin, der durch das Verfahren, beschrieben in Beispiel (B), hergestellt worden war, wurde auf Raumtemperatur gebracht, und die Mikrotiterplatte wurde mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Dann wurden 50 ul einer Lösung von 1 pg/ml bis 1 ng/ml Humaninsulin (geliefert von Sigma Co.) in phosphatgepufferter Salzlösung zu jeder Vertiefung hinzugefügt.
Dann wurden 50 ul einer Lösung, die durch 1000-fache Verdünnung von 4,5 mg/ml des HRPO-markierten Antikörpers, hergestellt in Beispiel (C), mit phosphatgepufferter Salzlösung erhalten wurde, die 0,01% Myoglobin, 0,075% weißen Feinzucker und 0,05% Eieralbumin enthielt, in jede Vertiefung gegeben, und jede Vertiefung wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden stehengelassen. Die Lösung wurde entfernt und jede Vertiefung wurde dreimal mit phosphatgepufferter Salzlösung gewaschen. Dann wurden 50 ul einer Substratlösung, die aus 0,1 M Citratpuffer (pH = 4,1) bestand, der 0,3 mg/ml ABTS und 0,01% H&sub2;O&sub2; enthielt, in jede Vertiefung gegeben, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 50 ul 1 M Citronensäure gestoppt. Nachdem die Reaktion bezüglich jeder Vertiefung gestoppt wurde, wurde die Absorptionsintensität bei einer Wellenlänge von 415 nm (Referenz-Wellenlänge = 492 nm) durch einen automatischen Leser für Mikrotiterplatten (MPR-A4 geliefert von TOSOH Corp.) gemessen. Die Ergebnisse wurden wie in Tabelle 1 gezeigt erhalten, und eine Kalibrierungskurve wurde unter Verwendung dieser Ergebnisse erhalten.

Tabelle 1

Humaninsulin Konzentration Extinktion (pg/ml) in Probe (415 nm)
1 0,01
2 0,02
5 0,05
10 0,11
40 0,48
80 0,95
320 1,54
500 2,11
1000 2,46
An den vorangehenden Ergebnissen kann man sehen, daß das Verfahren der vorliegenden Erfindung für die mikroanalytische Bestimmung von Humaninsulin in verschiedenen Proben geeignet ist.

Vergleichendes Beispiel (E)

Messung von Rinder- und Schweineinsulinen durch Enzym-Immunoassay

Die Messung wurde durch das Enzym-Immunoassay in der gleichen Weise wie in Beispiel (D) durchgeführt, außer daß 10 pg/ml oder 1000 pg/ml Rinderinsulin (geliefert von Sigma Co.) oder Schweineinsulin (geliefert von Sigma) als Probe verwendet wurde. Die Ergebnisse werden in den Tabellen 2 und 3 gezeigt.

Tabelle 2

Rinderinsulin Konzentration Extinktion (pg/ml) in Probe (415 nm)
10 0,01
1000 0,02

Tabelle 3

Schweineinsulin Konzentration Extinktion (pg/ml) in Probe (415 nm)
10 0,01
1000 0,02
An den vorangehenden Ergebnissen kann man sehen, daß die monoklonalen Antikörper, die in den vorliegenden Beispielen verwendet werden, mit Humaninsulin reagieren, aber nicht mit Insulinen heterogener Tiere reagieren.

Claims

1. Verfahren zum Nachweisen und/oder Messen einer Menge von Humaninsulin in einer Probe, wobei das Verfahren das In-Kontakt-Bringen eines ersten Antikörpers und eines zweiten Antikörpers mit der Probe umfaßt, wobei einer der Antikörper immobilisiert und der andere Antikörper mit einem Marker markiert ist, dadurch gekennzeichnet, daß beide Antikörper an Humaninsulin binden können, jedoch an verschiedenen antigenen Stellen, jedoch so sind, daß sie nicht mit Nicht- Humaninsulin reagieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es das Messen einer Menge von Humaninsulin umfaßt, das in einer Probe bei einer Konzentration von 1 pg/ml bis 1 ng/ml vorhanden ist.

3. Verfahren zum Messen von Humaninsulin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der monoklonale Antikörper nicht mit Rinder-, Schweine-, Ziegen-, Schaf-, Maus- oder Ratteninsulin reagiert.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der immobilisierte Antikörper an Kugeln oder Mikroplatten aus Polystyrol, Polyethylen, Polyvinylchlorid, Latex, Agarose, Zellulose, Methacrylat oder Glas angeheftet ist.

5. Monoklonaler Antikörper, dadurch gekennzeichnet, daß er an Humaninsulin binden kann, aber so, daß er nicht mit Nicht-Humaninsulin reagiert.

6. Antikörper nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Nicht-Humaninsulin Rinder-, Schweine-, Ziegen-, Schaf-, Maus- oder Ratteninsulin ist.

7. Verfahren zum Herstellen eines monoklonalen Antikörpers, dadurch gekennzeichnet, daß er an Humaninsulin binden kann, aber so, daß er nicht mit Nicht-Humaninsulin reagiert, wobei das Verfahren umfaßt:

a) Das Immunisieren eines Säugetieres mit Humaninsulin;

b) Das Verschmelzen einer Milzzelle aus dem Säugetier mit einer Krebszelle zur Erzeugung von Hybridomzellen;

c) Das Kultivieren der Hybridomzellen; und

d) Das Auswählen einer Hybridomzelle, die einen Antikörper exprimiert, der an Humaninsulin binden kann, aber so, daß er nicht mit Nicht-Humaninsulin reagiert.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß das Nicht-Humaninsulin Rinder-, Schweine-, Ziegen-, Schaf-, Maus- oder Ratteninsulin ist.