DE69717519T2 - Verfahren zur Herstellung von biologischem Implantationsmaterial - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von biologischem Implantationsmaterial, bei dem das zu implantierende Material mit einem Aldehyd fixiert wird und das überschüssige Aldehyd durch Behandlung mit einer Aminocarbonsäure gebunden wird.
• Die Verwendung von biologischen Geweben verschiedenen Ursprungs bei der Herstellung prothetischer Vorrichtungen ist mittlerweile auf verschiedenen Gebieten der Medizin etabliert. Die Quelle des zu diesem Zweck verwendeten Materials kann hinsichtlich sowohl der Gewebeart (Herzklappen, Perikard, Sehnen, Bänder, Dura mater, Haut, Gefäße, etc.) als auch der Tierarten (autologes, homologes oder heterologes Gewebe) unterschiedlich sein.
• Bei der Herstellung dieser Vorrichtungen ist es erforderlich, chemische Behandlungen anzuwenden, um die antigenen Eigenschaften dieser Gewebe und daher die Möglichkeit einer Abstoßung dauerhaft zu verringern und um deren mechanische Eigenschaften zu verbessern.
• Unter den am häufigsten zur Fixierung biologischer Materialien verwendeten Substanzen finden sich Aldehyde. Verwendet werden insbesondere Glutaraldehyd, Formaldehyd, die Glyoxale und andere Aldehyde. Diese Verbindungen können Netze von Bindungen schaffen, die das Gewebe stabilisieren, und Glutaraldehyd und Formaldehyd sind insbesondere für ihre sterilisierende Wirkung bekannt.
• Jedoch werden diesen Verbindungen und den Derivaten, die sie während des Fixierens erzeugen, schädliche Wirkungen wie Cytotoxizität, die Auslösung von Mineralisation, die Entwicklung von Entzündungsreaktionen etc. zugeschrieben. Tatsächlich haben viele Autoren die Anwesenheit von Aldehydrückständen als eine der Hauptmitursachen für Gewebeverkalkung beschrieben, wobei dieses Phänomen zum Beispiel bei biologischen Herzklappen-Prothesen die meisten der Komplikationen verursacht, die direkt auf die Prothese zurückgeführt werden können.
• Die Bildung von Calciumablagerungen kann tatsächlich eine Verringerung der Elastizität der Klappenlappen verursachen und kann zu einem Riß des Gewebes führen, der eine teilweise oder völlige Einschränkung der Funktionalität der Klappe zur Folge hat.
• Es ist bekannt, daß Glutaraldehyd wie andere Aldehyde mit den Aminoresten von Aminosäuren reagieren kann. Im Falle von Proteinen ist jedoch die chemische Natur der Produkte komplex und wird nicht völlig verstanden. Die einfachste bekannte Reaktion zwischen einer Aldehydgruppe von Glutaraldehyd und den Aminoresten von Lysin führt zur Bildung von Iminen. Jedoch können die oligomeren und polymeren Produkte, die Glutaraldehyd in einer neutralen oder alkalischen Umgebung erzeugt, auch an freie Aminogruppen der Proteine binden.
• Wie zur Bildung einfacher Imino-Bindungen, die allgemein als reversibel bei einem sauren pH-Wert angesehen werden, führt diese weitreichende Reaktivität auch zur Bildung der stabileren β-konjugierten Imine mit positiv geladenen cyclischen Strukturen des Pyridintyps.
• Um mit Glutaraldehyd behandelte biologische Materialien zu entgiften, ist in der Vergangenheit vorgeschlagen worden, die verbleibenden freien Aldehydgruppen mit Molekülen verschiedenster Art zu blockieren. Das US-Patent Nr. 5,188,834 beschreibt insbesondere die Verwendung von Aminodicarbonsäuren in einem sauren Medium zu diesem Zweck.
• Die Behandlung muß bei einem sauren pH-Wert erfolgen. Tatsächlich neigen die Oligomere und die Polymere von Glutaraldehyd dazu, in die monomere Form zurückzukehren und so entfernt zu werden; überdies wird angenommen, daß die während der Behandlung erzeugten chemischen Spezies β-ungesättigte Imine sind, die durch den leicht sauren pH-Wert begünstigt werden.
• Zur besseren Kontrolle des pH-Werts wird die Reaktion in Puffern zum Abschluß gebracht, die auf einen pH-Wert von etwa 3,0 eingestellt sind, wie Natriumcitrat/HCl, Kaliumhydrogenphthalat/HCl, Citronensäure/Phosphat und Citrat-Phosphat-Borat/HCl; andererseits kann die Pufferwirkung der Aminosäuren selbst genutzt werden, um innerhalb des gewünschten pH-Bereichs zu bleiben.
• Der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren der in der Einleitung zur vorliegenden Beschreibung erwähnten Art, dadurch gekennzeichnet, daß das überschüssige Aldehyd mittels einer Verbindung mit der allgemeinen Formel:
• in der n 1 oder 2 und X eine Sulfonsäure-(-SO&sub3;H) oder Phosphonsäuregruppe (-PO&sub3;H&sub2;) ist, oder einer Mischung solcher Verbindungen gebunden wird.
• Da die erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen löslicher als die gemäß dem bisherigen Stand der Technik verwendeten Aminodicarbonsäuren sind, wird die Herstellung und Handhabung der Lösungen während des Verfahrens von Grund auf vereinfacht; tatsächlich können die Verbindungen schnell bei Raumtemperatur gelöst werden, und es besteht auch eine drastische Verringerung der pro Einheit an behandeltem Gewebe verwendeten Volumina, was einen reichlichen Überschuß an Reagens sicherstellt.
• Unter den erwähnten Verbindungen werden 2-Amino-3-sulfopropionsäure (Cysteinsäure), 2- Amino-4-sulfobuttersäure (Homocysteinsäure), 2-Amino-3-phosphonopropionsäure und 2- Amino-4-phosphonobuttersäure bevorzugt; unter diesen wird Homocysteinsäure besonders bevorzugt.
• Da die betreffenden Verbindungen chirale Zentren aufweisen, können die Verbindungen im Rahmen der Erfindung in der racemischen (D,L)-Form oder in der (L)- oder (D)-Form verwendet werden.
• Die praktischen Vorteile der erfindungsgemäß verwendeten Verbindungen, die sich aus der besseren Löslichkeit ergeben, werden von Entgiftungseigenschaften begleitet, die nicht schlechter sind, als die der herkömmlich verwendeten Verbindungen. Die Wirksamkeit des Verfahrens ist sowohl mit Zellkulturen in vitro geprüft worden als auch in Versuchen an Tieren (subkutane und intramuskuläre Implantation bei Ratten; Karotis- und Klappenaustausch-Implantation bei Schafen); die Verkalkung schien bei vergleichbarer Histotoxizität verringert zu sein. Überdies ist insbesondere bezüglich der bevorzugten Verbindungen Cysteinsäure und Homocysteinsäure vorhersagbar, daß diese weniger thrombogen sein werden.
• Die Behandlung mit den erfindungsgemäßen Verbindungen wird mit wässerigen Lösungen durchgeführt, die vorzugsweise einen pH-Wert im Bereich von 2,5 bis 5, 5 und stärker bevorzugt zwischen 3 und 5 aufweisen; das Reaktionsmedium besteht vorzugsweise aus einem gepufferten Medium, das vorzugsweise zu der Gruppe Natriumcitrat/HCl, Kaliumhydrogenphthalat/HCl, Citronensäure/Phosphat und Citrat-Phosphat-Borat/HCl gehört. Die Konzentration der sauren Lösungen liegt allgemein im Bereich von 10 mM bis zu einer gesättigten Lösung, im Fall von Homocysteinsäure insbesondere zwischen 10 mM und 273 mM (50 g/l).
• Nach der Behandlung wird das Implantationsmaterial in einer biologisch verträglichen sterilisierenden Lösung konserviert, wofür insbesondere eine Paraben-Lösung (0,02% N- Propyl-p-hydroxybenzoat und 0,18% Methyl-p-hydroxybenzoat) bevorzugt wird.
Beispiel
• Rinder-Perikard vom örtlichen Schlachthof wurde in physiologische Lösung mit Eis gelegt. Innerhalb einer Stunde wurde es zur gewissenhaften Entfernung von Fettresten und Bindegewebe zum Labor transportiert, was wiederum in 0,9%iger Kochsalzlösung und Eis erfolgte. Das Perikard wurde dann für 48 Stunden bei 4ºC in 0,5%ige Glutaraldehydlösung (pH 7,4) gegeben. Ein Teil dieses Perikards wurde zur normalen Weiterverarbeitung in 4%ige Formaldehydlösung überführt und wurde dann in 0,5% Glutaraldehyd konserviert; eine zweite Charge wurde jedoch drei Mal für 20 Minuten in physiologischer Lösung gewaschen und wurde dann zwei Mal für 24 Stunden in einer 59 mM Homocysteinsäurelösung behandelt, die mit einem etwa 50 mM Natriumcitrat/HCl-Puffer, pH 3,3, zubereitet worden war. Nach Ablauf der 48 Stunden wurde das Waschen mit physiologischer Lösung wiederholt, und das Produkt wurde in einer Paraben-Lösung aufbewahrt.
• Aus den behandelten Perikardstücken wurden zu subkutanen und intramuskulären, das heißt nicht-orthotopischen. Implantationsversuchen bei Ratten entsprechend einem Tiermodell, das viele Male zur Induktion dystrophischer Verkalkung heterologer Gewebe und bei der Untersuchung von Gewebereaktivität verwendet worden war, verschiedene Proben entnommen.
• Zu diesem Zweck wurden 180-220 g schwere Sprague-Dawley-Ratten ausgewählt, und es wurden pro Tier vier Scheiben von 12 mm Durchmesser implantiert, von denen zwei (eine behandelte und eine Kontrolle) subkutan waren und zwei (eine behandelte und eine Kontrolle) intramuskulär waren.
• Die Tiere wurden entsprechend drei verschiedenen Implantationszeiträumen, 2, 4 und 8 Wochen, getötet. Die explantierten Proben wurden verarbeitet, um einer quantitativen Calciumbestimmung (Atomabsorption) und einer histologischen und mikroskopischen Betrachtung unterzogen zu werden.
• Die Werte in ug Ca/mg Gewebe der verschiedenen Proben sind in der Tabelle zusammengefaßt.
• Überdies war aus den histologischen Untersuchungen makro- oder mikroskopisch keine besondere Gewebereaktivität zu erkennen.

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von biologischem Implantationsmaterial, das mittels Aldehyden fixiert ist, bei welchem das überschüssige Aldehyd durch Behandlung mit einer Aminocarbonsäure gebunden wird, dadurch gekennzeichnet, daß die Säure aus Verbindungen mit den allgemeinen Formeln:

worin n 1 oder 2 ist und X eine Sulfonsäure-(-SO&sub3;H) oder Phosphonsäuregruppe (-PO&sub3;H&sub2;) ist, und Mischungen solcher Verbindungen ausgewählt wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem die Verbindung aus der Gruppe bestehend aus 2-Amino-4-sulfobuttersäure, 2-Amino-4-phosphonobuttersäure, 2-Amino-3- sulfopropionsäure und 2-Amino-3-phosphonopropionsäure ausgewählt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, bei dem die Behandlung mit einem sauren pH-Wert im Bereich von 2, 5 bis 5, 5, vorzugsweise zwischen 3 und 5, durchgeführt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, bei dem das Reaktionsmedium von einem gepufferten Medium gebildet wird, das aus Natriumcitrat/HCl, Kaliumhydrogenphthalat/HCl, Citronensäure/Phosphat und Citrat-Phosphat-Borat/HCl ausgewählt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, bei dem das Reaktionsmedium eine wässerige Lösung ist, welche die vorgenannten Verbindungen oder Mischungen davon enthält.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, bei dem die vorgenannte Verbindung Homocysteinsäure in wässeriger Lösung mit einer Konzentration von 10 mM bis 273 mM ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, bei dem nach Behandlung das Implantationsmaterial in einer biologisch verträglichen Sterilisationslösung konserviert wird.