DE69714966T2

DE69714966T2 - Antikörper gegen cd 18 zur verwendung gegen gehirnschlag

Info

Publication number: DE69714966T2
Application number: DE69714966T
Authority: DE
Inventors: M. Bednar; E. Gross; Roger Thomas
Original assignee: University of Vermont; Genentech Inc
Current assignee: University of Vermont; Genentech Inc
Priority date: 1996-01-23
Filing date: 1997-01-11
Publication date: 2003-04-24
Anticipated expiration: 2017-01-12
Also published as: CA2242414A1; ATE222774T1; EP1297847A3; JP4864175B2; WO1997026912A2; AU1827397A; CA2242414C; ES2183131T3; DK0877626T3; EP0877626A2; EP1297847A2; ZA97257B; WO1997026912A3; JP2000517289A; AU724449B2; EP0877626B1; DE69714966D1; PT877626E; AR005535A1; IL125255A

Description

Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein die Verwendung von Anti-CD18-Antikörpern zur Behandlung von Schlaganfällen. Insbesondere betrifft sie die Verwendung von Anti-CD18-Antikörpern zur Verbesserung des klinischen Ergebnisses durch Steigerung der Hirndurchblutung und/oder Reduzieren der Infarktgröße bei fokalem ischämischem Schlaganfall infolge des Verschlusses der Haupthirnarterie.

Beschreibung verwandter Gebiete

Schlaganfall ist der allgemeine Ausdruck für akute Hirnschädigung infolge einer Erkrankung der Blutgefäße. Der Schlaganfall ist ein großes gesellschaftliches Problem, wobei etwa 500.000 Menschen in den Vereinigten Staaten jedes Jahr daran sterben oder dauerhaft behindert werden. Der Schlaganfall kann in zwei Hauptkategorien unterteilt werden: hämorrhagischer Schlaganfall (infolge des Austretens von Blut aus den normalen Blutgefäßen) und ischämischer Schlaganfall (zerebrale Ischämie infolge mangelnder Blutversorgung); diese Anmeldung betrifft vor allem die Letztere.
Die drei Hauptmechanismen von ischämischem Schlaganfall sind Thrombose, Embolie und systemische Hypoperfusion (mit resultierender Ischämie und Hypoxie). In jeder dieser Schlaganfallkategorien wird die Hirnregion, die infolge mangelnder Blutversorgung abstirbt, als Infarkt bezeichnet. Der Verschluss der Zerebralarterie infolge eines Thrombus, der sich an der Wand einer Hirnarterie gebildet hat, wird als zerebrale Thrombose bezeichnet. Bei der zerebralen Embolie tritt das die Zerebralarterie blockierende verschließende Material stromabwärts im Blutkreislauf auf (z. B. wird ein Embolus vom Herzen zur Zerebralarterie getragen). Da es schwierig ist zu ermitteln, ob ein Schlaganfall durch Thrombose oder Embolie verursacht wurde, dient der Ausdruck "Thromboembolie" dazu, beide Arten des Schlaganfalls zu umschreiben. "Systemische Perfusion" kann sich als Folge verringerter Blutwerte, reduziertem Hämatokrit, niedrigem Blutdruck oder dem Unvermögen des Herzens, ausreichend Blut zu pumpen, ergeben.
Wenn die Symptome des Schlaganfalls weniger als 24 Stunden andauern und sich der Patient vollkommen erholt, hat er eine "transiente ischämische Attacke" (TIA) erlitten. Die Symptome der TIA sind eine temporäre Behinderung der Sprache, des Sehvermögens, der Sinneswahrnehmungen oder der Bewegung. Da TIA oft als Vorstufe des "kompletten" Schlaganfalls angesehen wird, sind Kandidaten, die eine TIA erlitten, Kandidaten für prophylaktische Schlaganfalltehrapie mit Antikoagulantien (z. B. Gumann und Heparin) oder Anti-Blutplättchen-Mitteln (z. B. Aspirin und Ticlopidin).
Thrombolytische Mittel, wie z. B. Gewebe-Plasminogenaktivator (t-PA), wurden zur Behandlung von thromboembolischem Schlaganfall herangezogen. Diese Moleküle funktionieren durch Lysieren des die Ischämie hervorrufenden Thrombus. Solche Medikamente gelten dann am sinnvollsten, wenn sie so bald wie möglich nach dem akutem Schlaganfall verabreicht werden (vorzugsweise innerhalb von 3 Stunden), um zumindest partiell die Zerebraldurchblutung in der ischämischen Region wiederherzustellen und die neuronale Lebensfähigkeit aufrechtzuerhalten. Da solche Medikamente die Blutung verstärken, ist ihr Einsatz bei hämorrhagischen Schlaganfall kontraindiziert.
Eine Familie von Adhäsions-Glykoproteinen auf Leukozyten wird als "Integrin"-Familie bezeichnet. Diese umfasst LFA-1 (CD11a/CD18), Mac-1 (CD11b/CD18) und p150,95 (CD11c/CD18). Ein weiteres Mitglied dieser Familie CD11d/CD18 wurde unlängst entdeckt. Danilenko et al., J. Immunol. 155, 35-44 (1995). jedes dieser Heterodimere besitzt eine einzelne α-Kette (CD11a, -b, -c oder -d) und die invariante β-Kette (CD18). CD18-Integrine auf Leukozyten können sich an interzelluläres Adhäsionsmolekül-1 (ICAM-1) binden, das auf vaskulärem Endothel und anderen Zellen exprimiert wird, wodurch Leukozyten-Adhäsion und transendotheliale Migration mediiert werden.
Man stellte fest, dass CD11a und CD18 in Patienten, die ischämischen Schlaganfall oder TIA erlitten, hinsichtlich der Leukozyten überreguliert sind. Kim et al., J. Neurolog. Sci. 128(1), 45-50 (1995). Schroeter et al., J. Neuroimmunology 55(2), 195-203 (1994) stellten fest, dass gesteigerte Expression von ICAM-1 auf Gefäßen und Leukozyten nach zerebraler Ischämie eintrat, die durch permanente Okklusion der mittleren Zerebralarterie (MCA) in Ratten induziert wurde.
Es wurde die Rolle von Zelladhäsionsmolekülen an der Hirnverletzung nach transienter MCA-Okklusion in Ratten untersucht (Matsuo et al., Brain Research 656, 344-352 (1994)). Matsuo et al. führten einen Nylonfaden vom Lumen der externen Arteria carotis (ECA) zu jenem der rechten internen Arteria carotis (ICA), um den Ursprung der rechten MCA zu verschließen. Die Okklusion war transient; nach 1 Stunde wurde der Nylonfaden entfernt, um die komplette Reperfusion des ischämischen Region über die rechte gemeinsame Arteria carotis (CCA) zu ermöglichen. Anti-CD11a- (WT1), Anti-CD18- (WT3) und Anti-ICAM-1 (IA29) Antikörper wurden vor Ischämie und unmittelbar nach Reperfusion verabreicht. Diese Forscher stellten fest, dass die Behandlung mit individuellen Antikörpern gegen Zelladhäsionsmoleküle Odembildung, Infarktgröße und Neutrophilen-Akkumulation nach Reperfusion reduzierte.
Andere erforschten die Wirkungen von Antikörpern gegen Zelladhäsionsmolekülen in solchen transienten Schlaganfallmodellen. Zhang et al., Brain Research 698, 79-85 (1995), untersuchten die Wirkungen monoklonaler Anti-CD11b- und Anti-CD18-Antikörper bei Ischämie/Reperfusions-Verletzung, worin die Antikörper bei und nach transienter MCA-Okklusion verabreicht wurden (der Ursprung der MCA wurde transient mit einem chirurgischen Nylonfaden blockiert). Mori et al., Stroke 23(5), 712-718 (1992), untersuchten die Wirkungen des Anti-CD18IB4-Antikörpers in ihrem Pavian-Modell reversibler MCA-Okklusion. In diesem Modell wurde arterieller Verschluss durch Aufblasen eines extrinsischen MCA-Ballons auf 100 ul erzielt. Die Reperfusion trat nach dem Luftauslassen aus dem Ballon ein. Siehe auch Chopp et al., Stroke 25(4), 869-876 (1994); und Chen et al., Annals of Neurology 35(4), 458-463 (1994); betreffend einen Anti-CD11b-Antikörper in einem transienten zerebralen Ischämiemodell. Chopp et al., sowie Chen et al. führten eine chirurgische Nylonnaht in die ICA, um den MCA-Ursprung zu blockieren. Die Reperfusion erfolgte durch Zurückziehen der Naht bis die Spitze das ICA-Lumen überschritt.
Takeshim et al., Stroke 23(2), 247-252 (1992), stellten fest, dass der Anti-CD18-Antikörper 60.3 keinen Schutz vor schwerer fokaler Ischämle und Reperfusion in einem transienten fokalen zerebralen Ischämiemodell bei Katzen bot. Takeshima et al. verwendeten eine mikrovaskuläre Klemme, um die MCA zu verschließen, und okkludierten die CCA durch Anziehen zuvor platzierter Ligaturen.
Lindsberg et al., J. Neurosurg. 82, 269-277 (1995), unterzogen Kaninchen schwerer Rückenmarks-Ischämie (durch Aufblasen des Ballons einer Katheterspitze, die in die Abdominalaorta eingeführt worden war), gefolgt von 30-minütiger Reperfusion, zu welchem Zeitpunkt entweder (1) Vehikel, (2) Anti-CD18-Antikörper oder (3) Anti-CD18-Antikörper und Blutplättchen-aktivierenden Faktor- (PAF-) Antagonist den Tieren verabreicht wurde. Die Wiedererlangung motorischer Funktionen wurde durch den Anti-CD18-Antikörper verbessert, doch keine weitere Verbesserung wurde durch den PAF-Antagonisten hervorgerufen.
Es wurde beobachtet, dass zwar ein Anti-CD18-Antikörper neurologische Defizite im reversiblen Rückenmarksmodell reduzierte (unter Mitwirkung einer Schlingenligatur-Okklusionsvorrichtung), er aber nicht in der Lage war, dies in einem irreversiblen Mikrosphärenmodell zu tun. Clark et al., Stroke 22(7), 877-883 (1991). Clark et al. zogen den Schluss, dass Leukozyten ihren Effekt in der Verletzung des Zentralnervensystems über Reperfusionsverletzung potenzieren. In Bezug auf Anti-CD11b-Antikörper berichteten Chopp et al., Stroke 25(1), 167 (1994), dass Vorteile aufgrund der Verabreichung solcher Antikörper unter Bedingungen transienter - jedoch nicht permanenter - MCA-Okklusion bei Ratten beobachtet wurden. Siehe auch Jiang et al., Neuroscience Research Communications 15(2), 85-93 (1994). Clark et al., J. Neurosurg. 75(4), 623-627 (1991), beobachteten auch, dass zwar Anti-ICAM-1 eine signifikante Reduktion der neurologischen Defizite im reversiblen Rückenmarks-Ischämiemodel 1 induzierte, ein solcher therapeutischer Nutzen aber im irreversiblen Zerebralischämie-Modell nicht zu beobachten war. Ähnliche Ergebnisse hinsichtlich Anti-ICAM-1-Antikörper wurden auch von Zhang et al., Stroke 26(8), 1438-1442 (1995) erzielt.
Bowes et al., Neurology 45, 815-819 (1995) bewerteten die Fähigkeit monoklonaler Antikörper gegen ICAM-1 und CD18, die Wirksamkeit der Thrombolyse in einem Kaninchen-Zerebralembolie-Schlaganfallmodell zu steigern. In diesem Modell wurden verschiedene kleine Blutgerinnsel (gebildet durch Fragmentieren eines Gerinnsels mit einem Gewebe-Homogenisator) in den Garotis-Kreislauf injiziert, um Embolisierung zu erzielen. Die neurologische Funktion wurde in jedem Tier 18 Stunden nach Embolisierung auf einer Drei-Punkt-Skala bewertet: (1) normale Aktivität; (2) abnormale Aktivität; oder (3) Tod. Die Menge an Blutgerinnsel, die für dauerhaften neurologischen Schaden in 50% der Kaninchen (ED&sub5;&sub0;) erforderlich ist, wurde für jede Behandlungsgruppe bestimmt. Bowes et al. stellten fest, dass bei verzögerter Verabreichung von Anti-CD18 oder Anti-ICAM-1 (15 oder 30 Minuten nach Embolisierung) eine statistisch signifikante Verbesserung der neurologischen Funktion nicht beobachtet wurde. Siehe auch Bowes et al., Experimental Neurology 119(2), 215-219 (1993), in Bezug auf die früheren Arbeiten dieser Forschergruppe zu Anti-ICAM-1 und t-PA in ihrem Kaninchen-Zerebralembolie-Schlaganfallmodel 1.
Bednar et al., Stroke 23(1), 152 (1992), beschreiben ein Kaninchenmodell von thromboembolischem Schlaganfall, in dem arterielle Okklusion (ein autologes Blutgerinnsel, das dem vorderen Hirnkreislauf zugeführt wird) während des Experiments nicht entfernt wird. Die Kaninchen erhielten entweder Anti-CD18-Antikörper IB4 (1 mg/kg) oder Vehikel 30 Minuten nach dem thromboembolischen Ereignis. Nach der Embolisierung wurden die Tiere insgesamt 4 Stunden lang untersucht (einschließlich einer anfänglichen 45-minütigen systemischen Hypotonie) Es konnte keine statistisch signifikante Differenz der zerebralen Durchblutung (CBF) oder Infarktgröße zwischen den mit IB4 und Vehikel behandelten Tieren festgestellt werden. IB4 schwächte jedoch die intrakraniale Hypertonie in diesem Modell ab.
Garcia et al., American Journal of Pathology 148, 241-248 (1996), bewerteten die Wirksamkeit der Behandlung von Ratten mit permanenter mittlerer Zerebralarterien-Okklusion mit einer Einzeldosis eines monoklonalen Anti-CD11b/18-Antikörpers, der 1 Stunde nach dem Arterienverschluss injiziert wird. Die meisten in dieser Studie analysierten Endpunkte waren unter den drei untersuchten Testgruppen, d. h. in den Ratten, die den monokloalen CD11b/18-Antikörper, einen nichtspezifischen Antikörper oder eine Pufferlösung erhielten, nicht signifikant unterschiedlich.
Es ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, ein Verfahren zur Verbesserung des klinischen Ergebnisses bei akutem ischämischem Schlaganfall bereitzustellen, indem die Hirndurchblutung erhöht und/oder die Infarktgröße reduziert wird. Außerdem ist ein Ziel der Erfindung die Bereitstellung einer Alternative zu thrombolytischer Therapie, um thromboembolischen Schlaganfall zu behandeln, insbesondere wenn die thrombolytische Therapie erfolglos war oder kontraindiziert ist wie z. B. wenn der zu behandelnde Patient Aspirin nimmt, oder wenn die zeitliche Verzögerung vom Einsetzen des Schlaganfalls bis zur Diagnose solcherart ist dass thromboembolytische Therapie nicht zu empfehlen ist. Andere Ziele der Erfindung ergeben sich aus der Beschreibung.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Anmeldung beruht auf der überraschenden Erkenntnis, dass Anti-CD18- Antikörper zu einer signifikanten Steigerung des zerebralen Durchblutung und/oder Reduktion der Hirninfarktgröße in fokalem ischämischem Schlaganfall führen können - ohne Entfernung des arteriellen Verschlusses.
Demzufolge bietet die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von Schlaganfall bei einem Säugetier (z. B. von fokalem ischämischem Schlaganfall infolge des Verschlusses der Haupthirnarterie), umfassend den Schritt des Verabreichens einer Menge an CD18- Antagonist und/oder CD11b-Antagonist an das Säugetier, die wirksam ist, die zerebrale Durchblutung zu erhöhen und/oder die zerebrale Infarktgröße im Säugetier zu reduzieren. Im Verfahren wird der Arterienverschluss (im Allgemeinen ein einzelner Thrombus oder Embolus) nicht durch mechanische Mittel (Z. B. durch chirurgische Entfernung des Verschlusses) oder chemische Mittel (z. B. durch Einsatz eines thrombolytischen Mittels zwecks Auflösen der arteriellen Okklusion) entfernt: Außerdem wird der Empfänger des CD18- oder CD11b-Antagonist keiner externen systemischen Hypotonie (z. B. über kontrolliertes Ausbluten) während des Verfahrens unterzogen, wie dies bei Bednar et al., Stroke 23(1), 152 (1992), der Fall war.
Vorzugsweise ist der Antagonist ein Anti-CD18-Antikörper wie z. B. humanisiertes F(ab')&sub2;-Fragment. Günstigerweise wird der Antagonist an das Säugetier in Form einer pharmazeutisch akzeptablen Formulierung verabreicht, wie dies weiter unten erläutert wird.
Der bevorzugte Verabreichungsweg des Antagonisten ist die intravenöse Bolus-Dosierung. In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung kann der Antagonist zumindest einmal zwischen etwa 15 Minuten und etwa 20 Stunden, vorzugsweise zwischen etwa 30 Minuten und etwa 12 Stunden, ab dem Einsetzen von fokalem ischämischem Schlaganfall verabreicht werden. Einzel- oder Mehrfachdosierungen sind möglich. Alternativ oder zusätzlich dazu kann der Antagonist mittels Dauerinfusion verabreicht werden.
In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Behandlung von ischämischem Schlaganfall infolge systemischer Hypoperfusion oder Hypoxie in einem Säugetier (z. B. infolge von Herzstillstand oder Ertrinken), umfassend den Schritt des Verabreichens einer therapeutisch wirksamen Menge an CD11b-Antagonist und/oder CD18- Antagonist an das Säugetier. Der bevorzugte Antagonist zur Verwendung in diesem Verfahren ist ein Anti-CD18-Antikörper. Vorzugsweise führt das Verfahren zu verstärkter Hirndurchblutung und einer Abnahme der Infarktgröße infolge der systemischen Hypoperfusion.
In einer weiteren Ausführungsform bietet die Erfindung ein Verfahren zur Steigerung der zerebralen Durchblutung und/oder Reduktion der Infarktgröße in fokalem ischämischem Schlaganfall aufgrund des Verschlusses einer Haupthirnarterie, umfassend den Schritt des zumindest einmal erfolgenden Verabreichens einer therapeutisch wirksamen Menge an CD18- und/oder CD11b-Antagonist an das Säugetier mehr als 15 Minuten (z. B. mehr als 30 Minuten), vorzugsweise weniger als 24 Stunden, ab dem Einsetzen von fokalem ischämischem Schlaganfall im Säugetier. Im Verfahren wird das behandelte Säugetier keiner externen systemischen Hypotonie ausgesetzt; siehe Bednar et al., Stroke 23(1), 152 (1992). Vorzugsweise ist der Antagonist ein Anti-CD18-Antikörper, der zumindest einmal zwischen etwa 30 Minuten bis etwa 12 Stunden ab dem Einsetzen von fokalem ischämischem Schlaganfall verabreicht wird.
Gemäß dem Verfahren des obigen Absatzes kann eine therapeutisch wirksame Menge eines thrombolytischen Mittels (z. B. t-PA) an das Säugetier entweder vor, nach oder gleichzeitig mit dem CD11b- oder CD18-Antagonist gemeinsam verabreicht werden. Vorzugsweise wird der Antagonist an das Säugetier vor der Verabreichung des thrombolytischen Mitteis verabreicht. Gemäß diesem Verfahren kann das thrombolytische Mittel an das Säugetier mehr als etwa 3 Stunden nach dem Einsetzen von ischämischem Schlaganfall verabreicht werden (z. B. zumindest einmal innerhalb von etwa 3-8 Stunden, vorzugsweise innerhalb von etwa 3-5 Stunden ab dem Einsetzen von Schlaganfall). Das thrombolytische Mittel kann z. B. mittels einer oder mehrerer Bolus-Dosen oder durch Dauerinfusion verabreicht werden.
Die Erfindung bietet auch Gegenstände zur Herstellung und Sets zur Verwendung in obigen Verfahren.

Kurzbeschreibung der Abbildungen

Fig. 1 ist ein Balkendiagramm, das die Hirninfarktgröße (% der infarzierten Hirnhälfte) bei embolisierten Kaninchen nach Behandlung mit MHM23 (Anti-CD18) und t-PA (n = 5); MHM23 alleine (n = 5); t-PA alleine (n = 10) oder Kochsalzlösungs-Vergleich (n = 10) darstellt, wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts).
Fig. 2 zeigt die regionale zerebrale Durchblutung (CBF; cm³/100 g/min) über der Zeit in embolisierten Kaninchen nach Behandlung mit MHM23 (Anti-CD18) und t-PA (n = 5); MHM23 alleine (n = 5); t-PA alleine (n = 10) oder Kochsalzlösungs-Vergleich (n = 10), wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist, MHM23 oder Kochsalzlösungs-Vergleich wurde 1 Stunde nach Embolisierung verabreicht. t-PA oder Kochsalzlösungs-Vergleich wurde durch Dauerinfusion im Verlauf von 3-5 Stunden nach Embolisierung verabreicht (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts).
Fig. 3 veranschaulicht den intrakranialen Druck (ICP; mmHg) in embolisierten Kaninchen nach Behandlung mit MHM23 (Anti-CD18) und t-PA (n = = 5); MHM23 alleine (n = 5); t-PA alleine (n = = 10) oder Kochsalzlösungs-Vergleich (n = 10), wie dies in Beispiel 1 beschrieben ist. MHM23 oder Kochsalzlösungs-Vergleich wurde 1 Stunde nach Embolisierung verabreicht. t-PA oder Kochsalzlösungs-Vergleich wurde durch Dauerinfusion im Verlauf von 3-5 Stunden nach Embolisierung verabreicht (Mittelwert ± Standardabweichung des Mittelwerts).
Die Fig. 4A und 4B zeigen eine Ausrichtung der relevanten Abschnitte der Konsens- Aminosäuresequenzen der Human-IgG&sub1;CH1-Domäne (Seq.-ID Nr. 1), der Human-IgG&sub2;- CH1-Domäne (Seq.-ID Nr. 2), der Human-IgG&sub3;-CH1-Domäne (Seq.-ID Nr. 3), der Human-IgG&sub4;-CH1-Domäne (Seq.-ID Nr. 4), der Human-κ-CL-Domäne (Seq.-ID Nr. 5) und der Human-λ-CL-Domäne (Seq.-ID Nr. 6) in Ausrichtung mit der Fabv1b-Variante aus einem Anti-CD18-Antikörper (Seq.-ID Nr. 7). In den Fig. 4A-4B sind die Aminosäurereste und/oder Positionen von Interesse und von größter Bedeutung zur Verwendung als Rettungs-Rezeptorbindungsepitope innerhalb der Sequenz von Fabv1b (d. h. Seq.-ID Nr. 8 und 9) unterstrichen bzw. durch Sternchen kenntlich gemacht.

Ausführliche Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen

1. Definitionen

"Fokaler ischämischer Schlaganfall" ist hierin als Hirnschädigung infolge der Unterbrechung der Durchblutung einer Hirnregion definiert. Der fokale ischämische Schlaganfall von Interesse wird hierin durch Verschluss einer oder mehrerer der "Haupthirnarterien" verursacht (z. B. der mittleren Zerebralarterie, vorderen Zerebralarterie, hinteren Zerebralarterie, inneren Arteria carotis, Vertrebralarterie oder Basilararterie) - im Gegensatz zu sekundären Arterien oder Arteriolen. Der "arterielle Verschluss" bzw. die "arterielle Okklusion" ist im Allgemeinen ein einzelner Embolus oder Thrombus. Fokaler ischämischer Schlaganfall unterscheidet sich demnach hierin vom Zerebralembolie-Schlaganfallmodell von Bowes et al., Neurology 45, 815-819 (1995), worin eine Vielzahl an Gerinnselpartikeln Sekundärarterien oder -arteriolen verschließen.
Der Ausdruck "ohne Entfernung des arteriellen Verschlusses" bedeutet hierin, dass die arterielle Okklusion durch mechanische Mittel (z. B. durch physisches Entfernen des Verschlusses, wie dies in den oben erwähnten transienten Schlaganfallmodellen beschrieben ist) oder durch chemische Mittel (z. B. Entfernung eines Thrombus oder Embolus mittels eines thrombolytischen Mittels; siehe z. B. Bowes et al., Neurology 45, 815-819 (1995)) vor dem Erzielen einer therapeutischen Wirkung durch Verabreichung des CD18- oer GD11b-Antagonisten (d. h. Erhöhung der Hirndurchblutung und/oder Reduktion der Infarktgröße) im Wesentlichen nicht entfernt wird. Dieser Ausdruck umfasst jedoch auch Situationen, in denen der arterielle Verschluss größenmäßig geringfügig reduziert wird - infolge endogener thrombolytischer Moleküle, die einen Teil des Thrombus/Embolus auflösen -, sofern zumindest ein Teil (z. B. etwa 50%, vorzugsweise etwa 80%) der arteriellen Okklusion nach einer solchen Größenreduktion intakt bleibt.
Unter "Steigerung der Hirndurchblutung oder Reduktion der Infarktgröße" ist hierin die Verbesserung des klinischen Ergebnisses zu verstehen, indem eine statistisch oder physiologisch signifikante Erhöhung der zerebralen Durchblutung und/oder eine statistisch oder physiologisch signifikante Reduktion der Infarktgröße in einem behandelten Säugetier relativ zu einem unbehandelten Säugetier hervorgerufen wird; dies wird durch auf dem Gebiet allgemein bekannte Techniken wie etwa Gefäßabbildung bestimmt. Vorzugsweise wird die Hirndurchblutung (bestimmt 2-4 Stunden nach der Verabreichtung des Antagonisten) um zumindest 30%, vorzugsweise zumindest 50%, relativ zu einem unbehandelten Tier gesteigert. Günstigerweise ist die 48 Stunden nach der Verabreichung des Antagonisten gemessene Infarktgröße 20% kleiner, vorzugsweise 50% kleiner, als jene eines unbehandelten Säugetiers.
Der Ausdruck "CD18-Antagonist" bezieht sich hierin auf ein Molekül, das sich an CD18 bindet (vorzugsweise Human-CD18) und die biologische Aktivität von CD18 hemmt oder im Wesentlichen reduziert. Normalerweise blockiert der Antagonist die Fähigkeit einer Zelle (z. B. eines Neutrophils), die die CD18-Untereinheit auf ihrer Zelloberfläche exprimiert, partiell oder vollständig, sich an Endothel zu binden. Nicht-einschränkende Beispiele für CD18-Antagonisten sind Antikörper, Proteine, Peptide, Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide, Polysaccharide, Oligosaccharide, Nucleinsäuren, bioorganische Moleküle, Peptidomimetika, pharmakologische Mittel und ihre Metaboliten, Transkriptions- und Translationssteuersequenzen u. dgl. In der bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist der CD18-Antagonist ein Antikörper.
Beispiele für Anti-CD18-Antikörper sind MHM23 (Hildreth et al., Eur. J. Immunol. 13, 202-208 (1983); M18/2 (IgG2a; Sanches-Madrid et al., J. Exp. Med. 158, 586 (1983)); H52 (American Type Culture Collection (ATCC) Hinterlegung Halogen-Basis 10160); Mas191c und IOT18 (Vermot Desroches et al., Scand. J. Immunol. 33, 277-286 (1991); und NA-8 (WO 94/12214). Der bevorzugte Antikörper ist einer, der sich an das CD18- Epitop bindet, an das sich entweder MHM23 oder H52 bindet. Vorzugsweise besitzt der Antikörper hohe Affinität für das CD18-Polypeptid. In bevorzugten Ausführungsformen besitzt der Antikörper eine Affinität für das CD18-Antigen von etwa 4 nM oder weniger. Vorzugsweise beträgt die Affinität etwa 3 nM oder weniger, noch bevorzugter 1 nM oder weniger. In bestimmten Ausführungsformen kann sich der Antikörper an eine Region in der extrazellulären Domäne von CD18 binden, die sich mit CD11b assoziiert; der Antikörper kann auch α- und β-Ketten dissoziieren (z. B. kann der Antikörper den GD11b- und CD18-Komplex dissoziieren, wie im Fall des MHM23-Antikörpers).
Der Begriff "CD11b-Antagonist" bezieht sich hierin auf ein Molekül, das sich an CD11b bindet und die biologische Aktivität von CD11b inhibiert oder wesentlich reduziert. Normalerweise sorgt der Antagon ist für partielles oder komplettes Blockieren der Fähigkeit einer Zelle (z. B. eines Neutrophils), die die CD11b-Untereinheit auf ihrer Zelloberfläche exprimiert, sich an Endothel zu binden. Nicht-einschränkende Beispiele von CD11b-Antagonisten sind Antikörper, Proteine, Peptide, Glykoproteine, Glykopeptide, Glykolipide, Polysaccharide, Oligosaccharide, Nucleinsäuren, bioorganische Moleküle, Peptidomimetika, pharmakologische Mittel und ihre Metaboliten, Transkriptions- und Translationssteuersequenzen u. dgl. Der bevorzugte CD11b-Antagonist ist ein Antikörper, insbesondere ein Anti-CD11b-Antikörper, der Human-CD11b bindet. Beispiele für CD11b-Antikörper sind MY904 (US-A-4.840.793); 1B6c (siehe Zhang et al., Brain Research 698, 79-85 (1995)); CBRN1/5 und CBRM1/19 (wo 94/08620).
Der Ausdruck "Antikörper" wird hierin im allgemeinsten Sinn verwendet und erfasst konkret Antikörper, Antikörper-Zusammensetzungen mit polyepitoper Spezifität, bispezifische Antikörper, Diakörper und einzelkettige Moleküle sowie Antikörperfragmente (z. B. Fab, F(ab')&sub2; und Fv), sofern sie die biologische Aktivität von CD11b oder CD18 antagonisieren.
Der Begriff "monoklonaler Antikörper" bezieht sich hierin auf einen Antikörper, der aus einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten wird, d. h. die die Population umfassenden individuellen Antikörper sind identisch bis auf möglich natürlich vorkommende Mutationen, die in kleinen Mengen vorhanden sein können. Monoklonale Antikörper sind hochspezifisch, wobei sie gegen eine einzelne antigene Stelle gerichtet sind. Außerdem ist im Gegensatz zu herkömmlichen (polyklonalen) Antikörperpräparaten, die typischerweise unterschiedliche Antikörper gegen verschiedene Determinanten (Epitope) enthalten, jeder monoklonale Antikörper gegen eine einzelne Determinante auf dem Antigen gerichtet. Zusätzlich zu ihrer Spezifität sind die monoklonalen Antikörper insofern vorteilhaft, als sie durch Hybridomkultur synthetisiert werden (unkontaminiert durch andere Immunglobuline). Das Adjektiv "monoklonal" zeigt den Charakter des Antikörpers an, der aus einer im Wesentlichen homogenen Population von Antikörpern stammt und soll nicht so ausgelegt werden, dass die Produktion des Antikörpers gemäß einem bestimmten Verfahren erforderlich wäre. Beispielsweise können die erfindungsgemäß zu verwendenden monoklonalen Antikörper durch das Hybridomverfahren hergestellt werden, das zum ersten Mal von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder durch DNA-Rekombinationsmethoden produziert werden (z. B. US-A-4.81 6.567). Die "monoklonalen Antikörper" können auch aus Phagen-Antikörper- Bibliotheken unter Einsatz z. B. der von Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991) und Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991) beschriebenen Techniken isoliert werden.
Die monoklonalen Antikörper umfassen hierin "chimäre" Antikörper (Immunglobuline), worin ein Teil der Schwerkette und/oder Leichtkette mit korrespondierenden Sequenzen in Antikörpern identisch oder homolog ist, die aus einer bestimmten Spezies abgeleitet sind oder einer bestimmten Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, während der übrige Teil der Kette(n) mit korrespondierenden Sequenzen in Antikörpern identisch oder homolog ist, die aus einer anderen Spezies abgeleitet sind oder einer anderen Antikörperklasse oder -unterklasse angehören, sowie Fragmente solcher Antikörper, sofern sie die gewünschte biologische Aktivität aufweisen (US-A-4.816.567; Mirrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855 (1984)).
"Humanisierte" Formen von Nicht-Human- (z. B. Mäuse-) Antikörpern sind chimäre Immunglobuline, Immunglobulin-Ketten oder Fragmente davon (z. B. Fv, Fab, Fab', F(ab')&sub2; oder andere Antigen-bindende Subsequenzen von Antikörpern), die minimale Sequenzen aus Nicht-Human-Immunglobulin enthalten. Zumeist sind humanisierte Antikörper Human-Immunglobuline (Rezipient-Antikörper), worin Reste aus einer Komplementaritäts-determinierenden Region (CDR) des Rezipienten durch Reste aus einer CDR einer Nicht-Humanspezies (Donor-Antikörper) wie z. B. einer Maus, einer Ratte oder eines Kaninchens mit der gewünschten Spezifität, Affinität und Kapazität ersetzt sind. In einigen Fällen sind Fv-Rahmenregion- (ER-) Reste des Human-Immunglobulins durch korrespondierende Nicht-Human-Reste ersetzt. Außerdem können humanisierte Antikörper Reste umfassen, die weder im Rezipienten-Antikörper noch in importierten CDR- oder Rahmensequenzen zu finden sind. Diese Modifikationen dienen dazu, die Antikörperleistung weiterzuentwickeln und zu optimieren. Im Allgemeinen umfasst der humanisierte Antikörper im Wesentlichen die Gesamtheit zumindest einer - typischerweise zweier - variabler Domänen, worin alle oder im Wesentlichen alle CDR-Regionen mit jenen einer Nicht-Human-Immunglobulins korrespondieren und alle oder im Wesentlichen alle FR-Regionen jene einer Human-Immunglobulinsequenz sind. Der humanisierte Antikörper umfasst optimalerweise auch zumindest einen Teil einer Immunglobulin-Konstantregion (Fc), typischerweise jene eines Human-Immunglobulins. Weitere Details finden sich in Jones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Reichmann et al., Nature 332, 323-329 (1988); und Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2, 593-596 (1992). Der humanisierte Antikörper enthält einen PrimatizedTM Antikörper, worin die Antigen-Bindungsregion des Antikörpers aus einem Antikörper stammt, der durch Immunisieren von Makakken-Affen mit dem Antigen von Interesse produziert wird.
"Einzelkettige Fv-" oder "sFv-" Anti körperfragmente umfassen die VH- und VL-Antikörperdomänen, worin diese Domänen in einer einzelnen Polypeptidkette vorhanden sind. Im Allgemeinen umfasst das Fv-Polypeptid zudem einen Polypeptid-Linker zwischen der VH- und VL-Domäne, wodurch sFv die gewünschte Struktur für die Antigenbindung schaffen kann. Ein Überblick über sFv findet sich in Puckthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, Bd. 113, Rosenburg and Moore (Hrsg.), Springer-Verlag, New York, S. 269-315 (1994).
Der Begriff "Diakörper" bezieht sich auf kleine Antikörperfragmente mit zwei Antigen- Bindungsstellen, welche Fragmente eine variable Schwerketten-Domäne (VH) in Verbindung mit einer variablen Leichtketten-Domäne (VL) in der gleichen Polypeptidkette (VH- VL) umfassen. Durch Verwendung eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung von zwei Domänen auf der gleichen Kette zu ermöglichen, werden die Domänen zwangsweise mit den Komplementärdomänen einer weiteren Kette gepaart und zwei Antigen- Bindungsstellen geschaffen. Diakörper sind ausführlicher z. B. in EP-A-404.097, WO 93/11161 und bei Hollinger etat., Proc. Natt. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschrieben.
Der Ausdruck "Rettungs-Rezeptorbindungsepitop" bezieht sich hierin auf ein Epitop der Fc-Region eines IgG-Moleküls (z. B. IgG&sub1;, IgG&sub2;, IgG&sub3; und IgG&sub4;), das für die Verlängerung der In-vivo-Serum-Halbwertszeit des IgG-Moleküls verantwortlich ist.
"Behandlung" umfasst sowohl therapeutische als auch prophylaktische Behandlung oder Präventionsmaßnahmen. Die zu behandelnden Personen sind jene, in denen die Störung bereits vorliegt, sowie jene, in denen die Störung verhindert werden soll. Die vorliegende Anmeldung betrifft vor allem die Behandlung von Personen, deren Diagnose auf akuter ischämischer Schlaganfall lautet.
Das "Säugetier" ist für die Zwecke der Behandlung jedes als Säugetier klassifiziertes Tier, z. B. Menschen, Haus- und Nutztiere, Zoo- und Sporttiere, z. B. Hunde, Pferde, Katzen, Kühe usw. Vorzugsweise ist das Säugetier ein Mensch.
Ein "thrombolytisches Mittel" ist ein Molekül, das einen Thrombus aufbricht oder auflöst. Beispiele dafür sind Streptokinase, acylierter Plasminogen-Streptokinase-Aktivatorkomplex (APSAC), Urokinase, einzelkettiger Urokinase-Plasminogen-Aktivator (scu-PAII, Thrombin-ähnliche Enzyme aus Schlangengift wie z. B. Ancrod (Beil, W. "Defibinogenating enzymes", in Golman et al. (Hrsg.), Hemostasis and Thrombosis, Lippincott, Philadelphia (1987), S. 886), Gewebe-Plasminogen-Aktivator (t-PA) und biologisch aktive Varianten davon. Das bevorzugte thrombolytische Mittel ist t-PA.
Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung werden die Ausdrücke "Gewebe- Plasminogen-Aktivator" und "t-PA" austauschbar verwendet und kennzeichnen extrinsischen (Gewebetyp) Plasminogen-Aktivator mit zumindest zwei fuktionellen Domänen, bestehend aus einer Protease-Domäne, die Plasminogen in Plasmin umwandeln kann, und einer N-terminalen Region, die vermutlich für Fibrin-Bindung verantwortlich ist. Diese Begriffe umfassen daher Polypeptide, die diese fuktionellen Domänen als Teil der gesamten Aminosäuresequenz enthalten, ungeachtet ihrer Quelle und ihres Herstellungsverfahrens (z. B. umfassen diese Ausdrücke Vampirfledermaus-t-PA; siehe EP 352- 119). Die Ausdrücke "Human-Gewebe-Plasminogen-Aktivator" und "Human-t-PA" werden austauschbar verwendet und kennzeichnen Human-Gewebe-Plasminogen-Aktivator der Wildform und fuktionelle Derivate davon. Beispiele für fuktionelle Derivate von t- PA sind Moleküle mit verlängerter Halbwertszeit und verbesserter Fibrin-Spezifität; siehe WO 93/24635; N-terminal gekürzte t-PA-Varianten (siehe EP 382.174); und C84S t- PA, beschrieben in Suzuki et al., J. Cardiovasc. Pharmacol. 22, 834-840 (1993).

2. Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Die Erfindung bietet ein Verfahren zur Behandlung von fokalem ischämischem Schlaganfall wie z. B. thromboembolischem Schlaganfall. Insbesondere kann die Hirndurchblutung gesteigert und/oder die Infarktgröße in fokalem ischämischem Schlaganfall reduziert werden, indem eine wirksame Menge eines GD11b- und/oder CD18-Antagonisten an das Säugetier verabreicht wird, das den Schlaganfall erlitt. In diesem Verfahren wird die arterielle Okklusion vor der Beobachtung des hierin definierten therapeutischen Nutzens nicht entfernt, wobei das Verfahren an sich keine vorherige Verabreichung eines thrombolytischen Mittels an das Säugetier voraussetzt, um einen Embolus/Thrombus zu entfernen und dadurch die zerebrale Durchblutung zu steigern oder die Infarktgröße zu reduzieren.
Man geht davon aus, dass der CD18- oder CD11a-Antagonist der Erfindung an einen Patienten möglichst bald nach der Diagnostizierung des Zustands des akuten ischämischen Schlaganfalls oder bei Vorliegen von durch neurologische Untersuchung festgestelltem fokalem Defizit sofort verabreicht wird. Neurologische Untersuchungen und gegebenenfalls neurologische Abbildungsverfahren, wie z. B. Computertomographie (CT) und Magnetresonanz-Abbi dung (MRI) (einschließlich diffusionsgewichteter Abbildung (DWI) und Perfusions-Abbildung (PI)); Gefäßabbildung (z. B. Duplex-Scannen und transkranialer Doppler-Ultraschall und Laser-Doppler); Angiographie (z. B. computerisierte digitale Subtraktions-Angiographie (DAS) und MR-Angiographie) sowie andere invasive oder nichtinvasive Techniken stehen zur Diagnose von akutem ischämischem Schlaganfall zur Verfügung.
Vorzugsweise wird der CD18- oder CD11a-Antagonist zumindest einmal oder kontinuierlich sofort nach Einsetzen des Schlaganfalls bis etwa 24 Stunden danach verabreicht. In bestimmten Ausführungsformen wird der CD18- oder CD11a-Antagonist zunächst etwa 15 Minuten (oder 30 oder 45 Minuten) bis etwa 5 Stunden (oder 12 oder 24 Stunden) ab dem Einsetzen des Schlaganfalls an den Patienten verabreicht. Beispielsweise kann der Antagonist zunächst durch Bolus-Dosierung verabreicht werden, sobald der Schlaganfall diagnostiziert ist, gefolgt von nachfolgender Bolus-Dosierung des Antagonisten (z. B. 5-24 Stunden nach der ersten Bolus-Dosierung).
Der bevorzugte Antagon ist zur Verwendung im obigen Verfahren ist humanisierter H52- Antikörper (huH52), insbesondere das huH52 F(ab')&sub2;-Antikörperfragment.
Die Sequenz der Schwerkette des huH52 Fab ist:
Die Sequenz der Leichtkette des huH52 Fab ist:
In anderen Ausführungsformen kann der IgG&sub2; huH52-Antikörper voller Länge das Molekül der Wahl sein. Die Schwerkette des IgG&sub2; huH52-Antikörpers voller Länge besitzt die Sequenz:
Die Leichtkette des IgG&sub2; huH52-Antikörpers besitzt die Sequenz:
Es folgt eine Beschreibung der Produktion der bevorzugten Antagonisten (d. h. Antikörper), Antagonisten mit langer Halbwertszeit, pharmazeutischer Formulierungen, Verabreichungsmethoden sowie von Sets und Herstellungsgegenständen zur Verwendung in den Verfahren der Erfindung. Die Beschreibung der Antagonisten mit langer Halbwertszeit, pharmazeutischen Formulierungen und Verabreichungsmethoden betrifft auch die Verwendung thrombolytischer Mittel in bestimmten Ausführungsformen der Erfindung.

A. Antikörper-Herstellung

Gemäß bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist CD18- oder CD11b-Antagonist ein Antikörper. Verschiedene Antikörper, die sich an CD18 und CD11b binden, stehen auf dem Gebiet zur Verfügung. Außerdem folgt eine Beschreibung der Herstellung von Anti-CD18- oder Anti-CD11b-Antikörpern zur Verwendung bei der Behandlung von Schlaganfall gemäß dem hierin erläuterten Verfahren.

(i) Polyklonale Antikörper

Polyklonale Antikörper werden im Allgemeinen durch mehrere subkutane (sc) oder intraperitoneale (ip) Injektionen des relevanten Antigens und eines Adjuvans in Tieren gebildet. Es kann sinnvoll sein, das relevante Antigen an ein Protein zu konjugieren, das in der zu immunisierenden Spezies immunogen ist, z. B. Napfschnecken-Hämocyanin, Serumalbumin, Rinder-Thyroglobulin oder Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor unter Einsatz eines bifunktionellen oder derivatisierenden Mittels, z. B. von Maleimidobenzoylsulfosuccinimidester (Konjugation über Cysteinreste). N-Hydroxysuccinimid (über Lysinreste), Glutaraldehyd, Bernsteinsäureanhydrid, SOCl&sub2; oder R¹N=C=NR, worin R und R¹ unterschiedliche Alkylgruppen sind.
Tiere werden gegen das Antigen, immunogene Konjugate oder Derivate immunisiert, indem 1 mg oder 1 ug des Peptids oder Konjugats (für Kaninchen bzw. Mäuse) mit 3 Volumina an komplettem Freundschem Adjuvans kombiniert und die Lösung intradermal an mehreren Stellen injiziert wird. Einen Monat später erhalten die Tiere eine neuerliche Injektion mit 1/5 bis 1/10 der ursprünglichen Menge an Peptid oder Konjugat in komplettem Freundschen Adjuvans mittels sc an mehreren Stellen. 7 bis 14 Tage später wird den Tieren Blut abgenommen und das Serum auf Antikörpertiter untersucht. Tiere erhalten Auffrischungsinjektionen, bis der Titer ein Plateau erreicht. Vorzugsweise erhalten sie Auffrischungsinjektionen mit dem Konjugat des gleichen Antigens, das aber an ein unterschiedliches Protein konjugiert ist, und/oder durch ein anderer Vernetzer. Konjugate können auch in rekombinanter Zellkultur als Proteinfusionen hergestellt werden. Aggregationsmittel wie z. B. Alaun, eignen sich auch dazu, die Immunreaktion zu verstärken.

(ii) Monoklonale Antikörper

Monoklonale Antikörper werden aus einer Population im Wesentlichen homogener Antikörper erhalten, d. h. die individuellen die Population umfassenden Antikörper sind bis auf mögliche natürlich vorkommende Mutationen, die in kleinen Mengen vorhanden sein können, identisch. Somit kennzeichnet das Adjektiv "monoklonal" die Beschaffenheit des Antikörpers, der kein Gemisch diskreter Antikörper ist.
Beispielsweise können die monoklonalen Antikörper unter Anwendung des Hybridomverfahrens, das zum ersten Mal von Kohler et al., Nature 256, 495 (1975), beschrieben wurde, oder durch DNA-Rekombinationsverfahren (US-A-4.816.567) produziert werden.
Im Hybridomverfahren wird eine Maus oder ein anderes geeignetes Wirtstier, wie z. B. ein Hamster, wie oben immunisiert, um Lymphozyten zu induzieren, die Antikörper produzieren oder zur Produktion solcher Antikörper fähig sind, die sich spezifisch an das für die Immunisierung verwendete Protein binden. Alternativ dazu können Lymphozyten in vitro immunisiert werden. Die Lymphozyten werden mit Myelomzellen unter Einsatz eines geeigneten Fusionierungsmittels, wie z. B. Polyethylenglykol, fusioniert, um eine Hybridomzelle zu bilden (Golding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", S. 59-103 (Academic Press, 1986)).
Die so hergestellten Hybridomzellen werden gesetzt und in einem zweckentsprechenden Kulturmedium gezüchtet, das vorzugsweise eine oder mehrere Substanzen enthält, die das Wachstum oder Überleben der unfusionierten Myelom-Stammzellen hemmen. Wenn beispielsweise die Myelom-Stammzel len das Enzym Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyl-Transferase (HGPRT oder HPRT) nicht besitzen, enthält das Kulturmedium für die Hybridome typischerweise Hypoxanthin, Aminopterin und Thymidin (HAT-Medium), welche Substanzen das Wachstum von HGPRT-defizienten Zellen verhindern.
Bevorzugte Myelomzellen sind jene, die wirkungsvoll fusionieren, stabile Produktion von Antikörper auf hohem Niveau durch die selektierten Antikörper-produzierenden Zellen unterstützen und gegenüber einem Medium wie z. B. HAT-Medium sensitiv sind. Davon sind bevorzugte Myelom-Zelllinien Mäuse-Myelomlinien, wie z. B. die aus MOP- C-21- und MPC-11-Mäusetumoren abgeleiteten aus dem Salk Institute Gell Distribution Genter, San Diego, CA, USA, und SP-2-Zellen aus der ATCC, Rockville, MD, USA. Human-Myelom- und Mäuse-Human-Heteromyelom-Zelllinien wurden auch für die Produktion monoklonaler Human-Antikörper beschrieben (Kozbor, J. Immunol. 133, 3001 (1984); Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Aplications", S. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., NY, 1987)).
Kulturmedium, in dem Hybridomzellen gezüchtet werden, wird auf Produktion monoklonaler Antikörper gegen das Antigen untersucht. Vorzugsweise wird die Bindungsspezifität monoklonaler, durch Hybridomzellen produzierter Antikörper durch Immunfällung oder durch einen In-vitro-Bindungstest bestimmt z. B. Radioimmuntest (RIA) oder Enzym-gebundener Immunosorptionstest (ELISA).
Die Bindungsaffinität des monoklonalen Antikörpers kann z. B. durch Scatchard-Analyse von Munson et al., Anal. Biochem. 107, 220 (1980), bestimmt werden.
Nach dem Identifizieren von Hybridomzellen, die Antikörper der gewünschten Spezifität, Affinität und/oder Aktivität produzieren, können die Klone durch Grenzverdünnungsverfahren subkloniert und durch Standardtechniken gezüchtet werden (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principles and Practice", S. 59-103 (Academic Press, 1986)). Geeignete Kulturmedien sind z. B. D-MEM oder RPMI-1640 Medium. Außerdem können die Hybridomzellen in vivo als Aszitestumoren in einem Tier gezüchtet werden.
Die durch die Subklone sekretierten monoklonalen Antikörper werden günstigerweise vom Kulturmedium, Aszitesflüssigkeit oder Serum durch konventionelle Immunglobulin-Reinigungsverfahren wie z. B. Protein A-Sepharose, Hydroxylapatit-Chromatographie, Gelelektrophorese, Dialyse oder Affinitätschromatographie getrennt.
Für die monoklonalen Antikörper kodierende DNA wird mittels konventioneller Techniken isoliert und sequenziert (z. B. mittels Oligonucleotid-Sonden, die zur spezifischen Bindung an Gene fähig sind, die für die Schwer- und Leichtketten von Mäuse-Antikörpern kodieren). Die Hybridomzellen dienen als bevorzugte Quelle solcher DNA. Sobald die DNA isoliert wurde, kann sie in Expressionsvektoren eingesetzt werden, die dann in Wirtzellen transfiziert werden, z. B. E. coli-Zellen, Affen-GOS-Zellen, Chinahamster-Eierstock- (CHO-) Zellen oder Myelomzellen, die ansonsten kein Immunglobulinprotein erzeugen, um die Synthese monoklonaler Antikörper in den rekombinanten Wirtszellen zu erzielen. Überblicksartikel über die rekombinante Expression in Bakterien von für den Antikörper kodierender DNA sind z. B. Skerra et al., Curr. Opinion in Immunol. 5, 256-262 (1993) und Pluckthun, Immunol. Rev. 130, 151-188 (1992).
In einer weiteren Ausführungsform können Antikörper oder Antikörperfragmente aus Antikörper-Phagen-Bibliotheken isoliert werden, die mittels der Techniken von McCafferty et al., Nature 348, 552-554 (1990), produziert werden. Clackson et al., Nature 352, 624-628 (1991), und Markus et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991), beschreiben die Isolierung von Mäuse- bzw. Human-Antikörpern unter Verwendung von Phagen-Bibliotheken. Spätere Publikationen besprechen die Produktion von Human-Antikörpern hoher Affinität (nM-Bereich) durch Ketten-Shuffling (Marks et al., Bio/Technology 10, 779-783 (1992)) sowie kombinatorische Infektion und In-vivo-Rekombination als Strategie zur Konstruktion sehr großer Phagen-Bibliotheken (Waterhouse et al., Nucl. Acids Res. 21, 2265-2266 (1993). Somit sind diese Techniken lohnende Alternativen zu traditionellen monoklonalen Antikörper-Hybridomtechniken zur Isolierung monoklonaler Antikörper.
Die DNA kann auch modifiziert werden, z. B. durch Substituieren der Kodierungssequenz für Human-Schwer- und -Leichtketten-Konstantdomänen anstelle der homologen Mäusesequenzen (US-A-4.816.567; Morrison et al., Proc. Natt. Acad. Sci. USA 81, 6851 (1984)) oder durch kovalentes Verknüpfen mit der 1 mmunglobulin-Kodierungssequenz der gesamten oder eines Teils der Kodierungssequenz für ein Nicht-Immunglobulin-Polypeptid.
Typischerweise werden solche Nicht-Immunglobulin-Polypeptide für die Konstantdomänen eines Antikörpers oder für die variablen Domänen einer Antigen-Kombinationsstelle eines Antikörpers substituiert, um einen chimären bivalenten Antikörper zu schaffen, der eine Antigen-Kombinationsstelle mit Spezifität für ein Antigen und eine weitere Antigen-Kombinationsstelle mit Spezifität für ein anderes Antigen umfasst.
Chimäre oder Hybrid-Antikörper können in vitro unter Anwendung bekannter Verfahren der synthetischen Proteinchemie hergestellt werden, z. B. unter Einsatz von Vernetzern. Beispielsweise können Immuntoxine mittels einer Disulfid-Austauschreaktion oder durch Bilden einer Thioether-Bindung konstruiert werden. Beispiele für geeignete Reagenzien sind Iminothiolat und Methyl-4-mercaptobutyrimidat.

(iii) Humanisierte und Human-Antikörper

Verfahren zur Humanisierung von Nicht-Human-Antikörpern sind auf dem Gebiet allgemein bekannt. Im Allgemeinen besitzt ein humanisierter Antikörper einen oder mehrere Aminosäurereste aus nichtmenschlicher Quelle. Diese nichtmenschlichen Aminosäurereste werden oft als "Importreste" bezeichnet, die typischerweise aus einer variablen "Importdomäne" entnommen sind. Die Humanisierung kann im Wesentlichen nach dem Verfahren von Winter et al. Uones et al., Nature 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332, 323-327 (1988); Verjoeyen et al., Science 239, 1534-1536 (1988)) durch Substituieren von Nagetier-CDRs oder CDR-Sequenzen für die korrespondierenden Sequenzen eines Human-Antikörpers erfolgen. Demzufolge sind solche "humanisierten" Antikörper chimäre Antikörper (US-A-4.816.567), worin wesentlich weniger als eine intakte variable Humandomäne durch die korrespondierende Sequenz aus einer Nicht-Humanspezies substituiert wurde. In der Praxis sind humanisierte Antikörper typischerweise Human-Antikörper, in denen einige CDR-Reste und möglicherweise einige FR-Reste durch Reste aus anderen analogen Stellen in Nagetier-Antikörpern substituiert sind.
Die Auswahl variabler Human-Domänen (sowohl leichter als auch schwerer) zur Herstellung der humanisierten Antikörper ist sehr wichtig, um die Antigenität zu reduzieren. Dem so genannten "Best-fit"-Verfahren zufolge wird die Sequenz der variablen Domäne eines Nagetier-Antikörpers gegen die gesamte Bibliothek bekannter Variabler Human- Domänsequenzen gescreent. Die Humansequenz, die jener des Nagetiers am nähesten kommt, wird dann als Humanrahmen (ER) für den humanisierten Antikörper akzeptiert (Sims et al., J. Immunol. 151, 2296 (1993); Chothia et al., J. Mol. Biol. 196, 901 (1987)). Ein weiteres Verfahren verwendet einen bestimmten Rahmen aus der Konsenssequenz aller Human-Antikörper einer bestimmten Untergruppe von Leicht- oder Schwerketten. Der gleiche Rahmen kann für mehrere unterschiedliche humanisierte Antikörper verwendet werden (Carter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 4285 (1992); Presta et al., J. Immunol. 151, 2623 (1993)).
Ferner ist es wichtig, dass Antikörper unter Beibehaltung der hohen Affinität für das Antigen und andere günstige biologische Eigenschaften humanisiert werden. Um dieses Ziel zu erreichen, werden gemäß einem bevorzugten Verfahren humanisierte Antikörper durch Analyse der Stammsequenzen und verschiedener konzeptueller humanisierter Produkte unter Anwendung dreidimensionaler Modelle der Stamm- und humanisierten Sequenzen hergestellt. Dreidimensionale Immunglobulin-Modelle stehen allgemein zur Verfügung und sind Fachleuten auf dem Gebiet bekannt. Es existieren Computerprogramme, die wahrscheinliche dreidimensionale Konformationsstrukturen ausgewählter Immunglobulinsequenz-Kandidaten anzeigen. Die Kontrolle dieser Anzeigen erlaubt die Analyse der wahrscheinlichken Rolle der Reste beim Funktionieren des Immunglobulin sequenz-Kandidaten, d. h. die Analyse von Resten, die die Fähigkeit des Immunglobulin- Kandidaten, sein Antigen zu binden, beeinflussen. Auf diese Weise können FR-Reste selektiert und aus den Rezipienten- und Importsequenzen kombiniert werden, so dass die gewünschte Antikörpereigenschaft, z. B. erhöhte Affinität für das bzw. die Zielantigen(e), erreicht wird. Im Allgemeinen sind die CDR-Reste direkt und äußerst stark an der Beeinflussung der Antigen-Bindung beteiligt.
Alternativ dazu ist es nunmehr möglich, transgene Tiere (z. B. Mäuse) zu schaffen, die nach Immunisierung ein volles Repertoire an Human-Antikörpern ohne endogene Immunglobulin-Produktion erzeugen können. Beispielsweise wurde beschrieben, dass die homozygote Deletion des Antikörper-Schwerketten-Verbindungsregion- (-JH-) Gens in chimären und Keimlinien-Mausmutanten zur kompletten Inhibition endogener Antikörper-Produktion führt. Der Transfer der Human-Keimlinien-Immunglobulin-Genanordnung in einer solchen Keimlinien-Mausmutante führt nach Antigen-Exposition zur Produktion von Human-Antikörpern. Siehe z. B. Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 2551 (1993); Jakobovits et al., Nature 362, 255-258 (1993); Bruggermann et al., Year in Immuno. 7, 33 (1993). Human-Antikörper können auch aus Phagen-Display-Bibliotheken abgeleitet sein (Hoogenboom et al., J. Mol. Biol. 227, 381 (1991); Marks et al., J. Mol. Biol. 222, 581-597 (1991)).

(iv) Bispezifische Antikörper

Bispezifische Antikörper (BsABs) sind Antikörper, die Bindungsspezifitäten für zum indest zwei unterschiedliche Epitope besitzen. Beispiele für BsABs können sich an zwei unterschiedliche Epitope des CD18-Antigens oder sowohl CD18 als auch CD11b binden. Solche Antikörper können aus Antikörpern voller Länge oder Antikörperfragmenten abgeleitet sein (z. B. F(ab')&sub2;-bispezifische Antikörper).
Verfahren zur Herstellung bispezifischer Antikörper sind auf dem Gebiet bekannt. Die traditionelle Produktion bispezifischer Antikörper voller Länge basiert auf der Co-Expression zweier Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paare, wobei die zwei Ketten unterschiedliche Spezifitäten aufweisen (Millstein et al., Nature 305, 537-539 (1983)). Aufgrund der willkürlichen Anordnung von Immunglobulin-Schwer- und Leichtketten erzeugen diese Hybridome (Quadrome) ein potenzielles Gemisch aus zehn unterschiedlichen Antikörpermolekülen, von denen nur eines die korrekte bispezifische Struktur besitzt. Die Reinigung des korrekten Moleküls, die üblicherweise durch Affinitätschromatographie-Schritte erfolgt, ist eher kompliziert, und die Produktausbeuten sind niedrig. Ähnliche Vorgangsweisen werden in der WO 93/08829 vom 13. Mai 1993 und von Traunecker et al., EMBO J. 10, 3655-3659 (1991), geoffenbart.
Gemäß einer anderen und bevorzugteren Vorgangsweise werden variable Antikörperdomänen mit den gewünschten Bindungsspezifitäten (Antikörper-Antigen-Kombinationsstellen) mit Immunglobulin-Konstantdomänen-Sequenzen fusioniert. Die Fusion erfolgt vorzugsweise mit einer Immunglobulin-Schwerketten-Konstantdomäne, die zumindest einen Teil der Hinge-, CH2- und CH3-Regionen umfasst. Es ist vorzuziehen, dass die erste Schwerketten-Konstantregion (CH1) mit der für die Leichtketten-Bindung notwendigen Stelle in zumindest einer der Fusionen vorhanden ist. Für die Immunglobulin- Schwerkettenfusionen kodierende DNAs und auf Wunsch die Immunglobulin-Leichtkette werden in getrennte Expressionsvektoren insertiert und in einen geeigneten Wirtsorganismus co-transfiziert. Dies sorgt für mehr Flexibilität bei der Anpassung der jeweiligen Proportionen der drei Polypeptidfragmente in Ausführungsformen, wenn ungleiche Verhältnisse der drei in der Konstruktion verwendeten Polypeptidketten die optimalen Ausbeuten liefern. Es ist jedoch möglich, die Kodierungsssequenzen für zwei oder alle drei Polypeptidketten in einen Expressionsvektor zu insertieren, wenn die Expression von zumindest zwei Polypeptidketten in gleichen Verhältnissen zu höheren Ausbeuten führt oder wenn die Verhältnisse ohne bestimmte Bedeutung sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Vorgangsweise bestehen die bispezifischen Antikörper aus einer Hybrid-Immunglobulin-Schwerkette mit einer ersten Bindungsspezifität in einem Arm und einem Hybrid-Immunglobulin-Schwerketten-Leichtketten-Paar (mit einer zweiten Bindungsspezifität) im anderen Arm. Es stellte sich heraus, dass diese asymmetrische Struktur die Trennung der gewünschten bispezifischen Verbindung von unerwünschten Immunglobulin-Ketten-Kombinationen erleichtert, da die Gegenwart einer Immunglublin-Leichtkette in nur einer Hälfte des bispezifischen Moleküls für problemlose Trennung sorgt. Diese Vorgangsweise ist in der WO 94/04690 vom 3. März 1994 geoffenbart. Weitere Details zur Erzeugung bispezifischer Antikörper finden sich z. B. in Suresh et al., Methods in Enzymology 121, 210 (1986). Unter Anwendung solcher Techniken kann ein bispezifisches Molekül, das ein thrombolytisches Mittel wie z. B. t-PA und einen Anti-CD18- oder Anti-CD11b-Antikörper kombiniert, für die hierin definierte Verwendung in der Behandlung von Schlaganfall hergestellt werden.
Bispezifische Antikörper umfassen auch vernetzte oder " Heterokonjugat"-Antikörper. Beispielsweise kann einer der Antikörper im Heterokonjugat an Avidin und der andere an Biotin gekoppelt sein. Solche Antikörper wurden z. B. vorgeschlagen, um Immunsystemzellen auf unerwünschte Zellen abzuzielen (US-A-4.676.980) und zur Behandlung von HIV-Infektion herangezogen zu werden (WO 91/00360, WO 92/200373 und EP 03089). Heterokonjugate Antikörper können unter Anwendung geeigneter Vernetzungsverfahren hergestellt werden. Geeignete Vernetzer sind auf dem Gebiet allgemein bekannt und in US-A-4.676.980 gemeinsam mit einigen Vernetzungstechniken geoffenbart.
Techniken zur Erzeugung bispezifischer Antikörper aus Antikörperfragmenten wurden in der Literatur ebenfalls beschrieben. Die folgenden Techniken können auch für die Produktion bivalenter Anti körperfragmente herangezogen werden, die nicht notwendigerweise bispezifisch sind. Beispielsweise können aus E. coli gewonnene Fab'-Fragmente chemisch in vitro gekoppelt werden, um bivalente Antikörper zu bilden. Siehe Shalaby et al., J. Exp. Med. 175, 217-225 (1992).
Verschiedene Techniken zur Herstellung und Isolierung bivalenter Antikörperfragmente direkt aus rekombinanter Zellkultur wurden ebenfalls beschrieben. Beispielsweise wurden bivalente Heterodimere unter Verwendung von Leucin-Zippern produziert. Kostelny et al., J. Immunol. 148(5), 1547-1553 (1992). Die Leucinzipper-Peptide aus den Fos- und Jun-Proteinen wurden an die Fab'-Abschnitte zweier unterschiedlicher Antikörper durch Genfusion gebunden. Die Antikörper-Homodimere wurden an der Hinge-Region reduziert, um Monomere zu bilden, und dann reoxidiert, um die Antikörper-Heterodimere zu bilden. Die von Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 6444-6448 (1993), beschriebene "Diakörper"-Technologie bietet einen alternativen Mechanismus zur Herstellung bispezifischer/bivalenter Antikörperfragmente. Die Fragmente umfassen eine variable Schwerketten-Domäne (VH), die mit einer variablen Leichtketten-Domäne (VL) verbunden ist; dies erfolgt mittels eines Linkers, der zu kurz ist, um die Paarung zwischen den zwei Domänen auf derselben Kette zu erlauben. Demzufolge müssen sich die VH- und VL-Domänen eines Fragments mit den komplementären VL- und VH-Domänen eines anderen Fragments paaren, wodurch zwei Antigen-Bindungsstellen entstehen. Eine weitere Strategie zur Herstellung bispezifischer/bivalenter Antikörperfragmente durch Verwendung einzelkettiger Fv- (sFv-) Dimere wurde ebenfalls geoffenbart. Siehe Gruber et al., J. Immunol. 152, 5368 (1994).

B. Antagonisten mit langer Halbwertszeit

In bestimmten Ausführungsformen der Erfindung ist es wünschenswert, die CD18- oder CD11b-Antagonisten zu verwenden, die konstruiert sind, im Serum eines damit behandelten Säugeriers eine verlängerte Halbwertszeit zu besitzen. Beispielsweise kann dies erfolgen, indem (i) ein Rettungs-Rezeptorbindungsepitop der Fc-Region eines IgG in einen Antagonisten inkorporiert wird, um seine Halbwertszeit im Kreislauf zu verlängern, ohne aber seine biologische Aktivität zu beeinträchtigen, oder (ii) durch kovalente Bindung eines nicht-proteinartigen Polymers an den Antagonisten. Diese beispielhaft erwähnten Techniken werden im Folgenden kurz beschrieben.

(i) Fusionen von Antagonist und Rettungs-Rezeptorbindungsepitop

Die Inkorporation eines Rettungs-Rezeptorbindungsepitops in den Antagonisten kann durch jedes beliebige Mittel erfolgen, z. B. durch Mutation der geeigneten Region im Antagonisten von Interesse, um die Fc-Region zu imitieren, oder durch Inkorporieren des Epitops in einen Peptidmarker, der dann mit dem Antagonisten an einem der beiden Enden oder in der Mitte oder durch DNA oder Peptidsynthese fusioniert wird.
Ein systematisches Verfahren zur Herstellung einer Antagonistenvariante mit verlängerter In-vivo-Halbwertszeit umfasst mehrere Schritte. Der erste beinhaltet das Identifizieren der Sequenz und die Konformation eines Rettungs-Rezeptorbindungsepitops einer Fc-Region eines IgG-Moleküls. Sobald das Epitop identifiziert ist wird die Sequenz des Antagonisten von Interesse modifiziert um die Sequenz und die Konformation des identifizierten Bindungsepitops zu beinhalten. Nach dem Mutieren der Sequenz wird die Antagonistenvariante getestet, um festzustellen, ob sie eine längere In-vivo-Halbwertszeit als der ursprüngliche Antagonist besitzt. Wenn der Test der Antagonistenvariante keine längere In-vivo-Halbwertszeit ergibt wird seine Sequenz weiter verändert, um die Sequenz und Konformation des identifizierten Bindungsepitops zu enthalten. Der modifizierte Antagonist wird auf längere In-vivo-Halbwertszeit untersucht, wobei dieser Prozess fortgesetzt wird, bis ein Molekül erhalten wird, das eine längere In-vivo-Halbwertszeit aufweist.
Das so in den Antagonisten von Interesse inkorporierte Rettungs-Rezeptorbindungsepitop ist jedes geeignete und oben definierte Epitop, wobei seine Beschaffenheit z. B. vom Typ des modifizierten Antagonisten abhängt. Der Transfer erfolgt solcherart dass der Antagonist von Interesse nach wie vor die biologische Aktivität von CD11b oder CD18 antagonisieren kann.
Wenn der Antagonist von Interesse ein Antikörper ist, enthält er eine Ig-Domäne oder Ig-ähnliche Domäne, und das Rettungs-Rezeptorbindungsepitop befindet sich innerhalb dieser Ig-Domäne oder Ig-ähnlichen Domäne. Noch bevorzugter stellt das Epitop eine Region dar, in der eine oder mehrere Aminosäurereste aus einer oder zwei Schleifen der Fc-Domäne in eine analoge Position der Ig-Domäne oder Ig-ähnlichen Domäne des Antikörpers übertragen werden. Noch bevorzugter werden drei oder mehr Reste aus einer oder zwei Schleifen der Fc-Domäne übertragen. Noch bevorzugter wird das Epitop aus der CH2-Domäne der Fc-Region (z. B. eines IgG) entnommen und in die CH1-, CH3- oder VH-Region ober mehrere solcher Regionen einer Ig- oder in eine Ig-ähnliche Domäne übertragen. Alternativ dazu wird das Epitop aus der CH2-Domäne der Fc-Region entnommen und in die CL-Region oder VL-Region oder beide einer Ig- oder in eine Ig-ähnliche Domäne des Antagonisten von Interesse übertragen.
Beispielsweise sei zur Besprechung der Varianten, in denen das Polypeptid von Interesse ein Antikörper ist, auf die Fig. 4A-4B verwiesen, die relevante Konsens-Primärstrukturen verscheidener Ig veranschaulichen, d. h. Human-IgG&sub1;-CH1-Domäne, Human-IgG&sub2;- CH1-Domäne, Human-IgG&sub3;-CH1-Domäne, Human-IgG&sub4;-CH1-Domäne, Human-κCL-Domäne und Human-λCL-Domäne sowie die spezifische Sequenz für Fabv1b, eine hierin bevorzugte Anti-CD18-Fab-Variante. Außerdem zeigen die Fig. 4A-4B die Reste von Fabv1b, die von Interesse und von größter Bedeutung sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die wichtigen Reste in den Fig. 4A-4B mit einem Sternchen versehen, d. h. in einer Schleife von Fabv1b.MIS mit einem T-Rest einer Aminosäure C-terminal zu MIS und in der anderen Schleife von Fbvlb HQN mit einem D-Rest zweier Aminosäuren C-terminal zu HQN sowie einem K-Rest einer Aminosäure C-terminal zu D-Rest.
In einer bevorzugtesten Ausführungsform umfasst das Rettungs-Rezeptorbindungsepitop die Sequenz (5'→3'): PKNSSMISNTP (Seq.-ID Nr. 8) und gegebenenfalls außerdem eine Sequenz, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus HQSLGTQ (Seq.-ID Nr. 14), HQN- LSDGK (Seq.-ID Nr. 9), HQNISDGK (Seq.-ID Nr. 15) oder VISSHLGQ (Seq.-ID Nr. 16), insbesondere wenn der Antagon ist von Interesse ein Fab oder F(ab')&sub2; ist.

(ii) Antagonist-Polymer-Konlugate

Das nichtproteinartige Polymer der Wahl ist für diesen Zweck üblicherweise ein hydrophiles synthetisches Polymer, d. h. ein Polymer, das ansonsten in der Natur nicht vorkommt. Polymere, die in der Natur existieren und durch Rekombinations- oder In-vitro- Verfahren produziert werden, sind ebenso nützlich wie Polymere, die aus nativen Quellen isoliert sind. Hydrophile Polyvinylpolymere fallen in den Schutzumfang der vorliegenden Erfindung, z. B. Polyvinylalkohol und Polyvinylpyrrolidon. Besonders geeignet sind Polyalkylenether wie etwa Polyethylenglykol (PEG); Polyelkylene wie etwa Polyoxyethylen, Polyoxypropylen und Blockcopolymere von Polyoxyethylen und Polyoxypropylen (Pluronics); Polymethacrylate; Carbomere; verzweigte oder unverzweigte Polysaccharide, umfassend die Saccharidmonomere D-Mannose, D- und L-Galactose, Fucose, Fructose, D-Xylose, L-Arabinose, D-Glucuronsäure, Sialsäure, D-Galacturonsäure, D- Mannuronsäure (z. B. Polymannuronsäure oder Alginsäure), D-Glucosamin, D-Galactosamin, D-Glucose und Neuraminsäure, umfassend Homopolysaccharide und Heteropolysaccharide wie etwa Lactose, Amylopectin, Stärke, Hydroxyethylstärke, Amylose, Dextransulfat, Dextran, Dextrine, Glykogen oder die Polysaccharid-Untereinheit von Säuremucopolysacchariden, z. B. Hyaluronsäure; Polymere von Zuckeralkoholen wie etwa Polysorbitol und Polymannitol; Heparin oder Heparon. Das Polymer muss vor dem Vernetzen nicht wasserlöslich sein, ist es aber vorzugsweise, doch das Endkonjugat muss wasserlöslich sein. Außerdem sollte das Polymer in Konjugatform weder hochimmunogen sein noch ein Viskosität besitzen, die mit intravenöser Infusion oder Injektion unvereinbar ist, wenn es auf diese Weise verabreicht werden soll.
Vorzugsweise enthält das Polymer nur eine reaktive Gruppe. Dies trägt dazu bei, die Vernetzung von Proteinmolekülen zu vermeiden. Es liegt jedoch auch im Schutzumfang der Erfindung, Reaktionsbedingungen so zu optimieren, dass die Vernetzung reduziert wird, oder die Reaktionsprodukte durch Gelfiltration oder chromatographische Siebe zu reinigen, um im Wesentlichen homogene Derivate zu erhalten.
Das Molekulargewicht des Polymers kann günstigerweise von etwa 100 bis 500.000, vorzugsweise von etwa 1.000 bis 20.000, reichen. Das ausgewählte Molekulargewicht hängt von der Beschaffenheit des Polymers und dem Substitutionsgrad ab. Im Allgemeinen gilt: je höher die Hydrophilie des Poymers und der Substitutionsgrad, desto niedriger das zu verwendende Molekulargewicht. Optimale Molekulargewichte werden durch Routineversuche bestimmt.
Das Polymer ist durch einen multifuktionellen Vernetzer, der mit dem Polymer und einer oder mehreren Aminosäuren oder mit einem oder mit mehreren Zuckerresten des zu verknüpfenden Antagonisten reagiert, im Allgemeinen kovalent an den Antagonisten gebunden. Es liegt jedoch im Schutzumfang der Erfindung, das Polymer durch Umsetzen eines derivatisierten Polymers mit dem Hybrid oder umgekehrt direkt zu vernetzen.
Die kovalente Bindung an Aminogruppen erfolgt durch bekannte Chemie auf Basis von Cyanurchlorid, Garbonyldilmidazol, reaktive Aldehyd-Gruppen (PEG-Alkoxid plus Diethylacetal von Bromacetaldehyd; PEG plus DMSO und Essigsäureanhydrid oder PEG- Chlorid plus Phenoxid von 4-Hydroxybenzaldehyd, aktive Succinimidyl-Ester, aktiviertes Dithiocarbonat-PEG, 2,4,5-Trichlorphenylchlorformiat oder p-Nitrophenylchlorformiat-aktiviertes PEG). Carboxylgruppen werden durch Anbindung von PEG-Amin unter Verwendung von Carbodiimid derivatisiert.
Polymere werden durch Oxidation unter Einsatz von Chemikalien, z. B. mit Metaperiodat oder Enzymen, z. B. Glucose- oder Galactose-Oxidase (beide produzieren das Aldehydderivat des Kohlenwasserstoffs) an Oligosaccharid konjugiert, gefolgt von der Reaktion mit Hydrazid oder aminoderivatisierten Polymeren gemäß der Vorgangsweise von Heitzmann et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71, 3537-3541 (1974) oder Bayer et al., Methods in Enzymology 62, 310 (1979), um die Oligosaccharide mit Biotin oder Avidin zu markieren. Außerdem sind andere chemische oder enzymatische Verfahren, die bislang dazu dienten, Oligosaccharide zu verknüpfen, besonders vorteilhaft da im Allgemeinen weniger Substitutionen als Aminosäurestellen für die Derivatisierung vorliegen und die Oligosaccharidprodukte daher homogener sind. Die Oligosaccharid-Substituenten werden auch gegebenenfalls durch Enzymspaltung modifiziert, um Zucker zu entfernen, z. B. Neuraminidase-Verdauung (vor der Polymerderivatisierung).
Das Polymer trägt eine Gruppe, die direkt mit einer Aminosäure-Seitenkette oder dem N- oder C-Terminus des verknüpften Antagonisten oder mit dem multifuktionellen Vernetzer reaktiv ist. Im Allgemeinen sind solche reaktiven Gruppen tragenden Polymere für die Herstellung immobilisierter Proteine bekannt. Um solche Chemien hier zu verwenden, sollte man ein wasserlösliches Polymer verwenden, das ansonsten in gleicher Weise wie unlösliche Polymere derivatisiert wird, die bislang für die Protein-Immobilisierung zum Einsatz kamen. Bromcyan-Aktivierung ist ein besonders geeignetes Verfahren zur Vernetzung von Polysacchariden.
"Wasserlöslich" bezieht sich in Bezug auf das Ausgangspolymer darauf, dass das Polymer oder sein für die Konjugation verwendetes reaktives Zwischenprodukt ausreichend wasserlöslich ist, um an der Derivatisierungsreaktion teilzunehmen. "Wasserlöslich" in Bezug auf das Polymerkonjugat bedeutet, dass das Konjugat in physiologischen Flüssigkeiten, wie z. B. Blut, löslich ist.
Der Substitutionsgrad bei einem solchen Polymer variiert und hängt von der Anzahl an reaktiven Stellen auf dem Antagonisten ab, ob die Gesamtheit oder ein Fragment des Antagonisten verwendet wird, ob der Antagonist eine Fusion mit einem heterologen Protein (z. B. Anti-CD18-Antikörper, mit einem Rettungs-Rezeptorbindungsepitop fusioniert) ist, wie hoch das Molekulargewicht ist, wie es sich mit der Hydrophilie und anderen Eigenschaften des Polymers verhält und welche Antagonisten-Derivatisierungsstellen ausgewählt wurden. Im Allgemeinen enthält das Konjugat etwa 1 bis 10 Polymermoleküle, während jede heterologe Sequenz mit einer im Wesentlichen ungebrenzten Zahl an Polymermolekülen substituiert sein kann, sofern die gewünschte Aktivität nicht substanziell beeinträchtigt ist. Der optimale Vernetzungsgrad wird durch eine Versuchsmatrix leicht bestimmt, in der die Zeit, Temperatur und andere Reaktionsbedingungen variieren, um den Substitutionsgrad zu verändern, und anschließend die Fähigkeit der Konjugate, in der gewünschten Weise zu funktionieren, bestimmt wird.
Das Polymer, z. B. PEG, wird durch eine Vielzahl an an sich bekannten Verfahren zur kovalenten Modifikation von Proteinen mit nicht-proteinartigen Polymeren, wie z. B. PEG, vernetzt.
Die Konjugate der Erfindung mit langer Halbwertszeit werden von den nichtumgesetzten Ausgangsmaterialien durch Gelfiltration getrennt. Heterologe Spezies der Konjugate werden voneinander in gleicher Weise gereinigt. Das Polymer als hydrophiles Gel kann auch wasserunlöslich sein.

C. Pharmazeutische Formulierungen

Therapeutische Formulierungen des CD11b- oder CD18-Antagonisten werden auf die Lagerung vorbereitet, indem der Antagonisten mit dem gewünschten Reinheitsgrad mit optionalen physiologisch akzeptablen Trägern, Exzipienten oder Stabilisatoren ("Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Ausgabe, Osol., A. (Hrsg.) (1980)) in Form von lyophilisierten Formulierungen oder wässriger Lösungen vermischt wird. Akzeptable Träger, Exzipienten oder Stabilisatoren sind für Rezipienten in den verwendeten Dosierungen und Konzentrationen nichttoxisch und umfassen Puffer, wie z. B. Phosphat, Citrat und andere organische Säuren; Antioxidanzien, wie z. B. Ascorbinsäure; niedermolekulare Polypeptide (weniger als etwa 10 Reste); Proteine, wie z. B. Serumalbumin, Gelatine oder Immunglobuline; Aminosäuren, wie z. B. Glycin, Glutamin, Asparagin, Histidin, Arginin oder Lysin; Monocaccharide, Disaccharide und andere Kohlenhydrate, wie z. B. Glucose, Mannose, Trehalose oder Dextrine; Chelatbildner, wie z. B. EDTA; Zuckeralkohole, wie z. B. Mannitol oder Sorbitol; salzbildende Gegenionen, wie z. B. Natrium; und/oder nichtionogene Tenside, wie z. B. Tween, Pluronics oder PEG.
Die aktiven Komponenten können auch in Mikrokapseln, die z. B. durch Koacervationstechniken oder durch Grenzflächen-Polymerisation hergestellt werden, z. B. in Hydroxymethylcellulose- oder Gelatine-Mikrokapseln bzw. Poly(methylmethacrylat)-Mikrokapsein, in kolloidalen Arzneimittelzufuhrsystemen (z. B. in Liposomen, Albumin-Mikrokügelchen, Mikroemulsionen, Nanopartikeln und Nanokapseln) oder in Makroemulsionen eingeschlossen sein. Solche Techniken sind in "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16. Ausgabe, Osol, A. (Hrsg.) (1980) geoffenbart.
Die für die In-vivo-Verabreichung zu verwendenden Formulierungen müssen steril sein. Dies erfolgt am besten durch Filtration durch sterile Filtrationsmembranen vor oder während der Lyophilisierung und Rekonstitution.
Es können Depotpräparate hergestellt werden. Geeignete Beispiele für Depotpräparate sind halbdurchlässige Matrizen fester hydrophober Polymere, die den CD18- oder CD11b-Antagonisten enthalten, welche Matrizen als Formteile, z. B. Filme, oder Mikrokapseln vorliegen. Beispiele für Depotmatrizen sind Polyester, Hydrogele (z. B. Poly(2- hydroxyethylmethacrylat) oder Poly(vinylalkohol)), Polylactide (US-A-3. 773.919), Copolymere von L-Glutaminsäure und γ-Ethyl-L-glutamat, nichtabbaubares Ethylenvi nylacetat, abbaubare Milchsäure-Glykolsäure-Copolymere wie etwa Lupron DepotTM (injizierbare Mikrokügelchen, bestehend aus Milchsäure-Glykolsäure-Copolymer und Leuprolidacetat) und Poly-D-(-)-3-hydroxybuttersäure. Während Polymere wie z. B. Ethylenvinylacetat und Milchsäure-Glykolsäure die Freisetzung von Molekülen über den Zeitraum von über 100 Tagen erlauben, setzen bestimmte Hydrogele Proteine über kürzere Zeiträume frei. Wenn eingekapselte Antikörper über einen langen Zeitraum im Körper bleiben, können sie infolge des Kontakts mit Feuchtigkeit bei 37ºC denaturieren oder aggregieren, was zu einem Verlust an biologischer Aktivität und möglichen Veränderungen der Immunogenität führt. Rationale Strategien können je nach dem vorliegenden Mechanismus zur Stabilisierung entwickelt werden. Wenn beispielsweise der Aggregationsmechanismus eine intermolekulare S-S-Bindung durch Thio-Disulfid-Austausch ist, kann die Stabilisierung durch Modifizieren von Sulfhydrylresten, Lyophilisieren aus sauren Lösungen, Regulieren des Feuchtigkeitsgehalts, Einsatz geeigneter Additive und Entwickeln spezifischer Polymermatrix-Zusammensetzungen erreicht werden.
GD18- oder CD11b-Depot-Antagonisten-Zusammensetzungen umfassen auch in Liposomen eingeschlossene Antagonisten. Liposomen mit dem CD18- oder CD11b-Antagonisten werden durch auf dem Gebiet bekannte Verfahren hergestellt; siehe Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82, 3688 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77, 4030 (1980); und US-A-4.485.045 und 4.544.545. Üblicherweise sind die Liposomen klein (etwa 200-800 Ångström) und unilamellar, worin der Lipidanteil über etwa 30 Mol-% Cholesterin liegt und der ausgewählte Anteil auf eine optimale CD18- oder CD11b-Antagonistentherapie abgestimmt ist. Liposomen mit verlängerter Kreislaufzeit werden in der US-A-5.013.556 geoffenbart.

D. Verabreichungsmethoden

Die CD18- oder CD11b-Antagonisten der Erfindung werden an ein Säugetier, vorzugsweise einen Menschen, in Einklang mit bekannten Verfahren verabreicht, z. B. durch intravenöse Verabreichung wie etwa Bolus- oder Dauerinfusion über einen Zeitraum, durch intramuskuläre, intraperitoneale, intrazerebrospinale, subkutane, intraartikulare, intrasynoviale, intrathekale, orale, topische oder Inhalationsverabreichung. Die intravenöse Verabreichung des Antagonisten ist vorzuziehen.
Die geeignete Dosierung des CD18- oder CD11b-Antagonisten hängt von der Art des zu behandelnden Schlaganfalls, der Schwere und dem Verlauf des Schlaganfalls, der Verabreichung des Antagonisten als präventive oder therapeutische Maßnahme, der vorherigen Therapie, der Krankengeschichte des Patienten und der Reaktion auf den CD18- oder CD11b-Antagonisten sowie vom Ermessensspielraum des behandelnden Arztes ab. Der CD18- oder CD11b-Antagonist wird günstigerweise dem Patienten einmal oder mehrmals in mehreren Behandlungen verabreicht und kann dem Patienten zu jedem beliebigen Zeitpunkt ab der Erstellung der Diagnose verabreicht werden. Beispielsweise kann der Antagonist von etwa 15, 30 oder 45 Minuten bis etwa 5, 12 oder 24 Stunden ab dem Einsetzen des Schlaganfalls verabreicht werden. In bevorzugten Ausführungsformen schließt sich an die Anfangsdosis zumindest eine Folgedosis (z. B. 5 bis 24 Stunden nach der Anfangsdosis). In bestimmten Situationen werden CD11b- und CD18-Antagonist gemeinsam an das Säugetier verabreicht.
Wenn der Antagonist ein Antikörper ist, sind etwa 100 ug/kg bis etwa 20 mg/kg, vorzugsweise etwa 500 ug/kg bis etwa 5 mg/kg, am bevorzugtesten etwa 1 mg/kg bis etwa 3 mg/kg des Anti-CD18- oder Anti-CD11b-Antikörpers ein Beispiel für eine Anfangsdosierung zur Verabreichung an den Patienten (durch eine oder mehrere getrennte Verabreichungen oder durch Dauerinfusion). Andere Dosierungsformate kommen allerdings auch in Frage. Der Therapiefortschritt wird durch konventionelle Techniken und hierin besprochene Tests problemlos überwacht.

E. Sets und Fertigartikel

In anderen Ausführungsformen der Erfindung werden Fertigartikel und Sets bereitgestellt, die Materialien enthalten, die sich zur Verbesserung des klinischen Ergebnisses im Fall von Schlaganfall durch Steigerung der Hirndurchblutung und/oder Reduktion der Infarktgröße eignen. Die Fertigartikel umfassen einen Behälter mit einem Etikett, z. B. Flaschen, Fläschchen und Reagenzgläser. Die Behälter können aus verschiedenen Materialien, wie z. B. Glas oder Kunststoff, bestehen. Die Behälter enthalten eine Zusammensetzung, die sich zur Behandlung von Schlaganfall (wie hierin definiert) eignet und eine sterile Zugriffsöffnung aufweisen kann (z. B. kann der Behälter ein Beutel mit intravenöser Lösung oder ein Fläschchen mit einem durch eine hypodermale Injektionsnadel durchstechbaren Stopfen sein). Der Wirkstoff in der Zusammensetzung ist ein CD11b- oder CD18-Antagon ist. Das Etikett auf dem Behälter gibt an, dass die Zusammensetzung zur Behandlung von Schlaganfall dient (s.o.), und kann auch Anweisungen für die In- vivo-Vewendung (s.o.) enthalten.
Das Set der Erfindung umfasst den oben beschriebenen Behälter und einen zweiten Behälter, der einen pharmazeutisch annehmbaren Puffer, wie z. B. Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung, Ringer-Lösung und Dextrose-Lösung, umfasst. Es können auch andere Materialien enthalten sein, die vom kommerziellen Standpunkt und von der Warte des Benutzers aus günstig sind, z. B. andere Puffer, Verdünner, Nadeln, Spritzen und Packungsbeilagen mit Bedienungsanleitungen.
Das folgende Beispiel dient lediglich der Veranschaulichung und soll die Erfindung keinesfalls einschränken.

Beispiel

Diese Studie untersuchte die Auswirkung von Anti-CD18-Antikörper (MHM23) und t-PA in einem Kaninchenmodell von thromboembolischem Schlaganfall. In diesem Modell wird ein einzelnes Blutgerinnsel in mittlere Zerebral- und hintere kommunizierende Arterie (die "Haupthirnarterien") eingesetzt. Der arterielle Verschluss (d. h. das Gerinnsel) verbleibt während des gesamten Experiments an dieser Stelle (sofern nicht enzymatisch durch t-PA entfernt. Man geht davon aus, dass das folgende Kaninchenmodell gut mit dem physiologischen Fortschritt von thromboembolischem Schlaganfall in Menschen korreliert.

Materialien und Verfahren

Das in der vorliegenden Studie verwendete Kaninchenmodell für thromboembolischen Schlaganfall wurde bereits im Detail beschrieben (Bednar et al., Neurol. Res. 16, 129- 132 (1994); Gross et al., Stroke 24, 558-562 (1993); Kohut et al., Stroke 23, 93-97 (1992); Wilson et al., Neurosurgery 31, 929-934 (1992)). Siehe auch Gross et al., Neurosurgery 36(6), 1172-1177 (1995).
Kurz zusammengefasst wurden weiße New Zealand-Kaninchen (Charles River, CA, USA; sowohl Männchen als auch Weibchen, 3,0-3,5 kg) mit einer Lösung von Ketamin (50 mg/kg; Aveco Co., Fort Dodge, IA, USA), Acepromazin (20 mg, Aveco, CO, USA) und Xylazin (5 mg/kg; Mobay Corp., Shawnee, KS, USA) anästhesiert, eine Lösung, die dann dazu diente, für ausreichende Anästhesie für einen schmerzlosen chirurgischen Eingriff zu sorgen (bestimmt durch Reaktionen auf verschiedene physiologische und autonome Reize, wie z. B. mittlerer Aarteriendruck und Reaktion auf Zwicken in die Pfote). Nach dem Einschnitt im rechten Trigonum femorale zur Freilegung der Oberschenkelvene und -arterie wurde ein PE-90-Katheter in die Femoralarterie kanüliert (BD Co., Parsippany, NJ, USA), an dem eine Platin-Iridium-Elektrode befestigt war. Diese Katheter-Elektrode erlaubte die kontinuierliche Messung des mittleren Arteriendrucks und Blutabnahmen für Messungen der arteriellen Blutgase (AUG) (pH, PCO&sub2;, PO&sub2;), Hämatokrit und Glucose sowie für die Bestimmung der Wasserstoff-Auswaschung, um den rCBF durch das Wasserstoff-Clearance-Verfahren zu bewerten (Young, Stroke 11, 552-564 (1980)). Nach dem Kanülieren der Femoralvene mit PE-90-Kathether für Medikamenteninfusionen erfolgte ein Schnitt entlang der Kopfhaut-Mittellinie, um das Calvarium freizulegen. Bilaterale Kraniektomien wurden durchgeführt und die folgenden Gegenstände platziert: Nummer 30-Platin-lridium-Elektroden zur Überwachung der regionalen Zerebraldurchblutung (rCBF); einen epiduralen intrakranialen Druck- (ICP-) Monitor (Princeton Medical Corp., Hudson, NH, USA); und ein Temperatursensor (Yellow Springs Instruments, Yellow Springs, OH, USA) zur Messung der Hirntemperatur. Alle kranialen Instrumente wurden vorsichtig mit schnell härtendem Epoxy befestigt. Durch einen Einschnitt entlang der Halsmittellinie wurde das Tier tracheostomiert und mechanisch ventiliert. Sowohl die Tiefe als auch die Rate der Ventilation wurden bedarfsgerecht angepasst, um ABGs im physiologischen Bereich beizubehalten.
Während des Experiments wurden die Hirn- und Kerntemperaturen, der mittlere Arteriendruck und der ICP kontinuierlich gemessen. Außerdem wurden die folgenden Parameter vor Embolisierung (Grundlinie), zum Zeitpunkt der Embolisierung und stündlich nach der Embolisierung gemessen: rCBF, Hämatokrit, Glucose und ABG. Die mittleren Arteriendrücke werden während des Versuchs zwischen 50 und 60 mmHg gehalten. Flüssigkeiten (Ringer-Lactat oder gepackte Zellen) wurden gegebenenfalls intravenös gegeben (etwa 2-4 ml/kg/h), um Euvolämie aufrechtzuerhalten. Kern- und Hirntemperatur wurden durch Einsatz von Heizdecken und Heizlampen innerhalb von 1ºC von der Grundlinie gehalten.
Das autologe Gerinnsel wurde durch Vermischen des Vollbluts (1 ml) mit 50 mg Zinngranulat hergestellt. Das Gerinnsel wurde in den PE-90-Katheter mit Thrombin eingesetzt und bei Raumtemperatur gereift.
Nach der Tracheostomie wurde die Region der Bifurkation der Arteria carotis communis identifiziert, gefolgt von 30- bis 60-minütiger Äquilibrierung, während Grundlinienwerte erhalten wurden. Alle chirurgischen Eingriffe waren innerhalb von 2 Stunden abgeschlossen. Sobald alle Grundlinienwerte erhalten worden waren, wurden die proximale Arteria carotis interna und die distale Arteria carotis communis aus dem Kreislauf isoliert. Es erfolgte eine Arteriotomie, und das autologe Gerinnsel bzw. der autologe Embolus wurde über einen Katheter in der proximalen Arteria carotis interna dem vorderen Hirnkreislauf zugeführt. Sobald die proximale Arteria carotis interna und die distale Arteria carotis communis embolisiert waren, wurden sie wieder vom Kreislauf isoliert, und es erfolgte eine Arteriorraphie unter Verwendung unterbrochener 10-0-Nylonnähte. Eine Dental-Röntgenmaschine von Philips diente dazu, ein Submental-Vertex-Radiogramm zu erhalten, das die Platzierung des Zinn-markierten Gerinnsels bestätigte. Embolisierte Gerinnsel wurden in der mittleren Zerebral- und vorderen kommunizierenden Arterie festgestellt.
t-PA oder Kochsalzlösung (0,9%ige Kochsalzlösung) wurden intravenös durch Dauerinfusion 3-5 Stunden nach der Embolisierung mit einer Gesamtdosis von 6,3 mg/kg verabreicht. MHM23 (2 mg/kg) wurde durch Bolusdosierung 1 Stunde nach Embolisierung verabreicht. In jedem Fall dauerte das Experiment 7 Stunden ab Embolisierung. Submental-Vertex-Radiogramme wurden nach der Embolisierung und am Ende des Experiments erhalten. Sofort nach der Embolisierung wurde die rCBF- wiederum gemessen: Das Experiment wurde fortgesetzt, wenn die rCBF ≤ 15 ml/100 g/min in einer der drei Elektroden in der embolisierten Hämisphere betrug (Jones et al., J. Neurosurg. 54, 773-782 (1981)).
Am Ende des Experiments wurden die Tiere mit einer Überdosis Natriumpentobarbital (150 mg/kg) getötet - eine Vorgangsweise, die gemäß den Euthanisie-Richtlinien der American Veterinary Medical Association als akzeptabel und schmerzlos eingestuft wird. Bilaterale Ihorakotomien erfolgten gemäß der Methodologie des Institutional Animal Gare and Utilization Committee der University of Vermont. Das Gehirn wurde rasch entnommen und oberflächlich auf Gegenwart und Position restlicher Blutgerinnsel untersucht. Es wurde wie Brotstücke in 2 mm breite Stücke geschnitten und in Triphenyltetrazoliumchlorid-Farbstoff inkubiert, um die Größe des Hirninfarkts zu definieren (Bose et al., Stroke 19, 28 (1988)). Dieses Verfahren ist eine praktikable Möglichkeit, die Größe des Hirninfarkts im vorliegenden Kaninchenmodell zu bestimmen, und korreliert gut mit Hematoxylin- und Eosin-Einfärbung (Bednar et al., Neurol. Res. 16, 129-132 (1994)). Jeder Hirnschnitt wurde auf klaren Acetatfolien für die spätere planimetrische Bestimmung der Infarktgröße vorsichtig abgesucht, für welchen Zweck ein IBM-Bildanalysator verwendet wurde. Die Infarktgröße wurde gemäß der Modifikation von Lin et al., Stroke 24, 117-121 (1993) ermittelt. In diesem Verfahren wird die Infarktregion bestimmt, indem das Volumen des nichtinfarzierten Teils der embolisierten Hämisphere vom Gesamtvolumen der nichtembolisierten Hämisphere subtrahiert wird. Diese Modifikation berücksichtigt, dass das Volumen eines Hirninfarkts aufgrund damit einhergehender Schwellung überschätzt wird.
Die Varianzanalyse wiederholter Mesungen diente zur Analyse von Hämatokrit, Glucose, ABG, rCBF und ICP in den Kontroll- und Behandlungsgruppen. Bei Vorliegen von Signifikanz wurden die Werte dieser Variablen unmittelbar vor t-PA- und/oder MHM23- Verabreichung durch den Student's t-Test verglichen. Falls erforderlich, diente die Kovarianzanalyse zum Vergleich der Kontroll- und Behandlungsgruppen. Nach einer signifikanten Behandlungs-Zeit-Interaktion wurden die individuellen Kontraste dazu verwendet, die Behandlungsmittel zu jedem Zeitpunkt zu vergleichen - wenn eine signifikante Behandlungs-Zeit-Interaktion festgestellt wurde, wurden die Behandl ungswirkungen zu jedem Zeitpunkt untersucht. Die Infarktgröße und das spezifische Gewicht des Gehirns wurden mittels des Student's t-Tests verglichen (Behandlungs- gegenüber Kontrollgruppe). Alle Ergebnisse waren zweiseitig und wurden mittels α = 0,05 ausgewertet.

Ergebnisse

Die Ergebnisse des obigen Versuchs sind in den Fig. 1-3 dargestellt. Wie aus den Fig. 1 und 2 ersichtlich, führte die Verabreichung von Anti-CD18-Antikörper alleine zu einer signifikanten Zunahme der Hirndurchblutung sowie einer substanziellen Reduktion der Infarktgröße gegenüber der Kontrollgruppe. Fig. 3 zeigt, dass Anti-CD18-Antikörper alleine, t-PA alleine oder eine Kombination dieser zwei Mittel zumeist den ICP innerhalb von 6-7 Stunden reduziert. Außerdem veranschaulichen die Experimente, dass Anti- CD18-Antikörper mit t-PA kompatibel ist und das Ergebnis von t-PA verbessert, wenn die Verabreichung 3-5 Stunden nach dem Einsetzen des Gerinnsels im Hirnkreislauf erfolgt.
Die Steigerung der Hirndurchblutung und die Verkleinerung der Infarktgröße in den obigen Experimenten sind möglicherweise die Vorboten einer Verbesserung des durch eine Standard-Schlaganfallskala gemessenen klinischen Ergebnisses. Die vorliegende Anmeldung liefert daher ein Verfahren zur Verbesserung des klinischen Ergebnisses bei Patienten, die einen hierin definierten Schlaganfall erlitten haben.
Das in diesem Beispiel beschriebene Modell unterscheidet sich von dem zuvor von Bednar et al., Stroke 21(1), 152 (1992), beschriebenen dadurch, dass die Tiere in der Studie keinem äußeren systemischen niederen Blutdruck (mittels Reduktion des mittleren Arteriendrucks im Tier auf 30 mmHg durch kontrollierte Ausblutung) ausgesetzt waren. Auch wurde der Anti-CD18-Antikörper mehr als 30 Minuten nach dem Thromboembolischen Ereignis gegeben, und die Dosis war eine andere.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATIONEN:
(i) ANMELDER: GEN ENTECH, INC. University of Vermont and State Agricultural College
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Anti-CD18-Antikörper bei Schlaganfall
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 16
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Genentech, Inc.
(B) STRASSE: 460 Paint San Bruno Blvd.
(C) STADT: South San Francisco
(D) BUNDESSTAAT: Kalifornien
(E) LAND: USA
(F) POSTLEITZAHL: 94080
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) ART DES MEDIUMS: 3,5 Zoll, 1,44 Mb Floppy Disk
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: WinPatin (Genentech)
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDUNGSNUMMER:
(B) EINREICHDATUM:
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) INFORMATIONEN ÜBER ANWALT/VERTRETER:
(A) NAME: Lee, Wendy M..
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER: 40.378
(C) KENNZAHL/ZEICHEN: PO987PCT
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSANGABEN:
(A) TELEFON: 415/225-1994
(B) TELEFAX: 415/952-9881
(C) TELEX: 910/371-7168
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 1:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 98 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 1:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 2:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 98 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG Seq.-ID Nr. 2:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 3:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 98 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 3:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 4:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 98 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 4:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 5:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 107 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 5:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 6:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 105 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 6:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 7:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 100 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 7:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 8:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 11 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 8:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 9:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 9:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 10:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 232 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 10:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 11:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 214 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG Seq.-ID Nr. 11:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 12:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 450 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 12:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 13:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 214 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 13:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 14:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 7 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 14:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 15:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 15:
(2) INFORMATIONEN FÜR Seq.-ID Nr. 16:
(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LANGE: 8 Aminosäuren
(B) TYP: Aminosäure
(D) TOPOLOGIE: linear (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: Seq.-ID Nr. 16:

Claims

1. Verwendung eines Anti-CD18-Antikörpers zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von fokalem ischämischem Schlaganfall bei einem Säugetier, der durch Verschluss einer Haupthirnarterie verursacht wurde, ohne dass der Arterienverschluss beseitigt wird.

2. Verwendung nach Anspruch 1, worin das Medikament die Hirndurchblutung verstärkt und die Infarktgröße beim Säugetier verringert.

3. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Anti-CD18-Antikörper ein Antikörperfragment ist.

4. Verwendung nach Anspruch 3, worin das Anti-CD18-Antikörperfragment an ein Rettungs-Rezeptorbindungsepitop fusioniert ist.

5. Verwendung nach Anspruch 3, worin das Anti-CD18-Antikörperfragment ein F(ab')&sub2; ist.

6. Verwendung nach Anspruch 1, worin der Anti-CD18-Antikörper humanisiert ist.

7. Verwendung nach Anspruch 6, worin der Anti-CD18-Antikörper humanisierter H52-Antikörper ist.

8. Verwendung nach Anspruch 7, worin der H52-Antikörpr ein F(ab')&sub2; ist.

9. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Medikament zur Verabreichung an ein Säugetier durch Bolus-Dosierung dient.

10. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Medikament zur intravenösen Verabreichung dient.

11. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Medikament zur Verabreichung über Dauerinfusion dient.

12. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin das Medikament zur Verabreichung an ein Säugetier zu einem Zeitpunkt zwischen etwa 15 min und etwa 20 h nach dem Einsetzen des fokalen ischämischen Schlaganfalls dient.

13. Verwendung nach Anspruch 12, worin das Medikament zur Verabreichung an das Säugetier zu einem Zeitpunkt zwischen etwa 45 min und etwa 5 h nach dem Einsetzen des fokalen ischämischen Schlaganfalls dient.

14. Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, worin das Säugetier ein Mensch ist.