DE69711609T2

DE69711609T2 - Verfahren zum entfernen von unkonventionellen krankheitserregern aus proteinlösungen

Info

Publication number: DE69711609T2
Application number: DE69711609T
Authority: DE
Inventors: Michel Grandgeorge; Rene Labatut; Jean-Marc Rouzioux; Jean-Louis Tayot; Jean-Luc Veron
Original assignee: IMEDEX CHAPONOST; Aventis Pasteur SA
Current assignee: IMEDEX CHAPONOST; Sanofi Pasteur SA
Priority date: 1996-03-15
Filing date: 1997-03-14
Publication date: 2002-11-28
Anticipated expiration: 2017-03-15
Also published as: AU2165797A; NZ332323A; AU731770B2; EP0888131A1; EP0888131B1; WO1997034642A1; DE69711609D1; ATE215387T1; US6372510B1

Description

Die Erfindung betrifft die Entfernung von unkonventionellen transmissiblen Agenzien (UTAs) und insbesondere ein Verfahren zur Entfernung von UTAs aus einer Proteinlösung.
Unkonventionelle transmissible Agenzien (UTAs), zu denen Prione gehören, sind die Ursache für subakute transmissible spongiforme Enzephalopathien, bei denen es sich um langsame degenerative Erkrankungen des Zentralnervensystems mit stets tödlichem Verlauf handelt, deren Erreger immer noch nicht eindeutig identifiziert worden sind.
Diese subakuten transmissiblen spongiformen Enzephalopathien betreffen sowohl Menschen als auch Tiere:
- beim Menschen: Kuru, Creutzfeldt-Jakob-Krankheit, Gerstmann-Sträussler-Scheinker-Syndrom, fatale familiäre Insomnie und in bestimmten Fällen Alpers-Krankheit.
- bei Tieren: natürliche Schaf-Scrapie, transmissible Nerz-Enzephalopathie, Chronic Wasting Disease bei wilden Wiederkäuern in Gefangenschaft und in Freiheit und bovine spongiforme Enzephalopathie.
Die Entfernung von UTAs aus Produkten biologischen Ursprungs stellt sehr schwierige und abgesehen von einigen Ausnahmen gegenwärtig nur schlecht gelöste Probleme.
Die bislang aufgefundenen Inaktivierungsverfahren, wie Behandlung mit Natriumhydroxid oder Eau de Javel oder Erhitzen auf Temperaturen von mehr als 130ºC sind für die meisten biologischen Substanzen ungeeignet, die für derartige physikalisch-chemische Bedingungen zu empfindlich sind.
Als Trennverfahren zur Entfernung von UTAs können zwar theoretisch die gleichen Verfahren wie für Proteine im allgemeinen angewandt werden, d. h. Filtration, selektive Adsorption, Chromatographie und Ultrazentrifugation, jedoch stößt man dabei auf eine sehr große Schwierigkeit. Diese Verfahren werden heutzutage nicht zur Entfernung von herkömmlichen Viren angewandt, da immer ein Teil der Infektivität übrig bleibt, der zwar nur minimal sein kann, aber noch zur Übertragung der Krankheit nach Injektion des Produkts ausreicht. Inaktivierungsmethoden werden zu Recht vor diesen Verfahren bevorzugt. Die Transmissibilität von Prionen ist ebenso groß wie die der meisten Viren, und gegenwärtig stehen keine chromatographischen Verfahren zur Verfügung, mit denen sich die letzten Spuren, die eine komplexe Proteinlösung kontaminieren können, mit Sicherheit entfernen lassen. Zu diesem Zweck sind bereits Filtrationsverfahren vorgeschlagen worden, die sich bei der Klärung von Lösungen von Proteinen mit einem Molekulargewicht von weniger als 100 Kilodalton als wirksam erwiesen haben. Darüber stößt man bei diesen Siebverfahren auf die folgende Schwierigkeit: die zur Zurückhaltung der Prionen gewählte Porengröße hält auch große Proteine zurück, entweder weil der mittlere hydratisierte Durchmesser des Proteins über demjenigen der Poren liegt oder weil die Filtration des Proteins durch Adsorptionsphänomene kompliziert wird. Diesen Problemen begegnet man insbesondere bei der Reinigung von Tierseren, die bei Zellkulturverfahren zur Herstellung von Impfstoffen oder Arzneimitteln Verwendet werden.
Ebenso ist es bei der Extraktion von zur therapeutischen Verwendung bestimmtem Albumin aus einem menschlichen oder tierischen biologischen Material unerläßlich, das Albumin zur Entfernung der darin möglicherweise vorhandenen unkonventionellen transmissiblen Agenzien zu behandeln.
Aus dem Aufsatz "Viral validation of the manufacturing process of high purity albumin from placentas", veröffentlicht in Brown F. (Hrsg.): Virological Safety Aspects of Plasma Derivatives Dev. Bio Stand. Basel, Karger, 1993, Band 81, S. 237-244, ist ein Verfahren zur Reinigung von Albumin aus menschlicher Plazent a bekannt, das alle Sicherheitsgarantien bezüglich möglicher Viruskontaminationen bietet. Gemäß dem Aufsatz "Safety of placental blood derivatives", der am 15. Januar 1994 in Lancet, Band 343, veröffentlicht wurde, wurde dieses Verfahren als besonders gut für die Entfernung von Prionen geeignet erachtet. Zu den bei diesem Verfahren durchgeführten Reinigungsschritten gehören nämlich drei Schritte FC1, FC2 und Hcol der Alkoholausfällung in saurem Medium in Kombination mit Filtrationen. Da Prionen zur Copräzipitation mit denaturierten Proteinen neigen, sind diese drei Schritte, die durch Entfernung von großen Mengen an Proteinausfällungen gekennzeichnet sind, zur Entfernung von Prionen besonders gut geeignet.
Dieses Verfahren eignet sich zwar gut zur Reinigung von Plazenta-Albumin, aber beileibe nicht zur Reinigung beliebiger Proteinlösungen und insbesondere nicht für Albuminlösungen plasmatischen Ursprungs. Beispielsweise wird unter den Bedingungen des Fällungsschritts FC1 Hämoglobin selbst denaturiert und spezifisch gefällt; im Fall von Plasma ist die Hämoglobinmenge sehr gering; dieser Schritt würde daher nicht die gleichen Merkmale aufweisen und insbesondere würde Albumin selbst einer Denaturierung durch das chemische Agenz unterliegen.
Es ist daher wünschenswert, über ein Verfahren zur Entfernung von unkonventionellen transmissiblen Agenzien aus einer Proteinlösung zu verfügen, bei dem die Eigenschaften der in der Lösung vorliegenden Proteine nicht beträchtlich verändert werden.
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, ein derartiges Verfahren bereitzustellen, das zur Behandlung einer wäßrigen Proteinlösung geeignet ist, bei der es sich um eine gereinigte oder ungereinigte Lösung und insbesondere eine Albuminlösung, ein zur Verwendung zur Zellkultivierung vorgesehenes Tierserum, eine Serum-Immunglobulinzubereitung oder eine Zubereitung von in die Koagulation eingreifenden Faktoren handeln kann.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung besteht in der Bereitstellung eines für die technische Anwendung geeigneten Verfahrens.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß ein Verfahren zur Entfernung von unkonventionellen transmissiblen Agenzien aus einer wäßrigen Proteinlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man dabei im wesentlichen die Proteinlösung mittels gleichzeitiger elektrostatischer und hydrophober Adsorptionschromatographie behandelt und das Filtrat auffängt.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung behandelt man die Proteinlösung mittels elektrostatischer und hydrophober Chromatographie in zwei Schritten, wobei man einen Schritt bei saurem pH und den anderen. Schritt bei weitgehend neutralem pH vornimmt.
Nach einer besonderen Ausführungsform führt man den Schritt bei saurem pH vor dem Schritt bei weitgehend neutralem ph durch.
Nach einer anderen Ausführungsform der Erfindung behandelt man die Proteinlösung außerdem auch noch mittels Anionenaustauschchromatographie.
Gemäß einem anderen Merkmal führt man im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens außerdem auch noch eine Vorfiltration der Proteinlösung mit Hilfe eines Filters mit einer Trenngrenze von im wesentlichen 0,2 um durch.
So werden die Chromatographiesäulen vor Verstopfung und bakterieller Kontamination geschützt.
Die Erfindung wird nun anhand der nachfolgenden Beschreibung näher erläutert.
Die Proteinlösung, aus der eventuell vorhandene UTAs zu entfernen sind, kann verschiedenen Ursprungs sein. Es kann sich dabei um ungereinigte Proteinlösungen, die gegenüber Kontamination durch Prionen anfällig sind, oder um gereinigte Lösungen, die sich gegebenenfalls von Seren ableiten, wie Serum-Immunglobulinzubereitungen und Koagulationsfaktoren enthaltende Zubereitungen, handeln. Insbesondere handelt es sich um eine Albuminlösung plasmatischen Ursprungs, die nach einem Verfahren einschließlich der Cohn- Fraktionierungstechnik erhalten wird. In allen Fällen handelt es sich bei der zu behandelnden Proteinlösung um eine wäßrige Lösung.
Bei dem zur Durchführung der erfindungsgemäßen elektrostatischen und hydrophoben Adsorptionschromatographie verwendeten Gel handelt es sich um ein makroporöses Gel mit funktionellen Gruppen, wie vernetztes Diethylaminopolystyrol oder Dietlylaminopolyphenyl oder eine andere Kombination von Resten mit positiver Ladung und hydrophoben Molekülen, die an eine inerte Matrix (beispielsweise Siliciumoxid, Cellulose, Sepharose, Acrylamid) gebunden sind. Vorzugsweise verwendet man DEA-Spherosil/LS® von der Firma BIOSEPRA (USA, französische Niederlassung: 35 avenue Jean Jaures-92390 VILLENEUVE LA GARENNE).
Der Säulenträger kann mit herkömmlichen Puffern, beispielsweise Natriumphosphat-Puffern, vorzugsweise mit Natriumchlorid-Zusatz, äquilibriert werden.
In dem besonderen Fall der Durchführung dieser Chromatographie in 2 Schritten kann man für jeden der Schritte den gleichen Träger verwenden, wobei lediglich der pH-Wert verändert wird.
Nach einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens behandelt man die Proteinlösung außerdem auch noch mittels Anionenaustauschchromatographie, insbesondere durch Hindurchleiten durch eine Säule, die mit auf eine inerte Matrix (beispielsweise Dextran-Siliciumoxid, Cellulose, Sepharose, Acrylamid) aufgepfropfte Diethylaminoethylgruppen beladen ist; beispielsweise verwendet man eine DEAE-Spherodex/LS®-Säule von der Firma BIOSEPRA (siehe oben), die vorher mit einem Puffer so äquilibriert wird, daß die elektrische Oberflächenladung positiv ist. Hierzu kann man beispielsweise einen Mononatriumphosphat-Puffer mit pH 6,8 verwenden.
Je nach Beschaffanheit und erwarteter Verwendung der behandelten Proteinlösung kann man dem erfindungsgemäßen Verfahren aus Sicherheitsgründen außerdem auch noch einen zusätzlichen Chromatographieschritt mit unspezifischer Adsorption mit Hilfe beispielsweise einer Siliciumoxid-Säule hinzufügen. So kann man eventuell bei den vorhergehenden Schritten freigesetzte Komponenten entfernen.
Nach einer besonderen Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man nach jeder Behandlung die Chromatographiesäulen beispielsweise mit HCl-Lösungen oder einem Ethanol/HCl-Gemisch waschen sowie mit einer NaOH-Lösung eine Spezialwäsche mit frei gewählter Häufigkeit, beispielsweise alle 5 Zyklen, durchführen.
Nach dem Waschen können die Säulen gelagert werden, beispielsweise in einer 70%igen Ethanollösung.
Dadurch, daß dieselben Säulen mehrmals verwendet werden können, kann man das erfindungsgemäße Verfahren in technischem Maßstab durchführen.
Überraschenderweise wurde festgestellt, daß man mit dem erfindungsgemäßen Verfahren UTAs aus einer wäßrigen Lösung von Proteinen und insbesondere Albumin abtrennen konnte, obwohl Proteine und insbesondere Albumin dazu neigen, wie die UTAs an einem hydrophoben Träger adsorbiert zu werden.
Die folgenden Beispiele erläutern einige Ausführungsformen der Erfindung, ohne sie einzuschränken.

Beispiel 1 - Herstellung einer kontaminierten Tierserumpobe

Zur Demonstration der Vorzüge des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es notwendig, eine kontaminierte Tierserumprobe herzustellen (in den gewählten Beispielen Kälberserum, jedoch ist dies gleichermaßen auf andere Spezies oder andere Proteinlösungen anwendbar). Als Prionenquelle dient ein Hirnhomogenat von männlichen C 57 BL/6-Mäusen, die mit experimentellem Maus-Scrapie-Agenz (Stamm C506/M3, 7. Passage, von Dr. D. C. GAJDUSEK und P. BROWN, NIH, Bethesda, USA, mit Infektionstiter von etwa 10&sup8; LD50 pro Gramm Gehirn) infiziert worden waren und das Endstadium der Erkrankung erreicht hatten:
1 ml Hirnhomogenat wird mit Ultraschall behandelt und mit 20 ml Serum vermischt.

Beispiel 2 - Erster Behandlungsmodus der kontaminierten Kälberserumprobe

Man stellt eine DEA-Spherosil/LS -Säule her, die 50 ml mit einem 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, mit 2 g/l NaCl äquilibrierten Träger enthält. 10 ml mit dem Scrapie-Stamm gemäß Beispiel 1 kontaminiertes Kälberserum mit NaCl-Zusatz (2 g/l Serum) werden auf pH 6,8 eingestellt, über eine 0,2-um- Membran filtriert und auf die Chromatographiesäule aufgegeben. Die Durchflußrate wird auf 100 ml/h für einen Säulenquerschnitt von 5 cm² eingestellt, was einer Lineargeschwindigkeit von 20 cm/h entspricht. Das dem UV-Adsorptionspeak bei 280 nm entsprechende Filtrat wird gesammelt und über eine Membran mit einer Porosität von 0,2 um sterilfiltriert; es werden Proben entnommen und für biologische Kontrollen bei -70ºC gelagert.
Nach der Behandlung wird die Säule mit fünf Volumina der folgenden Lösungen gewaschen:
1/ 0,1 N HCl
2/ 70%iges Ethanol - 0,1 N HCl
3/ 0,1 N NaOH.
Die Säule wird in 70%igem Ethanol gelagert.

Beispiel 3 - Zweiter Behandlungsmodus der kontaminierten Kälberserumprobe

In diesem Fall wird außerdem auch noch eine DEAE- Spherodex/LS®-Säule mit 50 ml mit einem 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8, mit 2 g/l NaCl äquilibrierten Träger hergestellt.
Diese Säule wird vor die DEA-Spherosil/LS®-Säule gemäß Beispiel 2 geschaltet.
Die zu behandelnde Lösung ist die gleiche wie in Beispiel 2.
Es wird unter den gleichen Bedingungen wie in Beispiel 2 verfahren, jedoch mit der Abwandlung, daß die Lösung nacheinander mittels Anionenaustauschchromatographie an der DEAE-Spherodex/LS®-Säule und dann mittels elektrostatischer und hydrophober Adsorptionschromatographie an der DEA-Spherosil/LS®-Säule behandelt wird.
Die entnommenen Proben werden ebenfalls für biologische Kontrollen bei -70ºC gelagert.

Beispiel 4 - Verifizierung der Abwesenheit von Säulenkontamination

Nach einem ersten. Reinigungszyklus gemäß Beispiel 2 oder Beispiel 3 und 15 h Lagerung der Säulen in 70%igem Ethanol wird ein neuer Reinigungszyklus mit 10 ml unkontaminiertem Kälberserum durchgeführt. Das Filtrat wird ebenfalls gesammelt, und es werden Proben für biologische Titrationen entnommen. Diese Proben werden analysiert, um die Abwesenheit von transmissiblen Prionenteilchen, die aus dem vorhergegangenen Reinigungszyklus stammen können, zu demonstrieren.

Beispiel 5 Dritter Behandlungsmodus der kontaminierten Kälberserumprobe

Das gleiche Experiment wie in Beispiel 3 wird nicht bei pH 6,8, sondern bei pH 5,0 durchgeführt.
Die DEAE-Spherodex/LS®-Säule und die DEA-Spherosil/LS®- Säule werden mit einem 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 5,0, mit 2 g/l NaCl äquilibriert. Das Serum wird mit 2 g/l NaCl versetzt, durch Zusatz von HCl auch auf pH 5,0 eingestellt und über eine Membran mit einer Porosität von 0,2 um filtiert. Der Versuch wird analog Beispiel 3 durchgeführt. Am Ende der Reinigung wird das Serum gesammelt und durch Zusatz von N NaOH auf einen neutralen pH-Wert eingestellt, wonach Proben entnommen und für biologische Kontrollen gelagert werden.

Beispiel 6 Vierter Behandlungsmodus der kontaminierten Kälberserumprobe

In diesem Fall wird das Serum zunächst durch die DEAE- Spherodex/LS®-Säule und dann durch die DEA- Spherosil/LS®-Säule hindurchgeleitet.
Der Durchgang durch DEAE-Spherodex/LS® erfolgt bei pH 6,8 nach 0,2-um-Filtration unter den Bedingungen gemäß Beispiel 3 (ohne DEA-Spherosil/LS®-Säule).
Die aufgefangene Fraktion wird dann auf pH 5,0 eingestellt und dann unter den Bedingungen gemäß Beispiel 5 (ohne DEAE-Spherodex/LS®-Säule) auf die DEA- Spherosil/LS®-Säule aufgegeben.
Am Ende der Reinigung wird das Serum gesammelt und durch Zusatz von N NaOH auf einen neutralen pH-Wert eingestellt, wonach Proben entnommen und für biologische Kontrollen gelagert werden.

Beispiel 7 - Fünfter Behandlungsmodus der kontaminierten Kälberserumprobe

Dieses Beispiel ist eine Abwandlung von Beispiel 6, bei dem die Durchgangsbedingungen durch die erste DEAE- Spherodex/LS®-Säule verschieden sind.
Das kontaminierte Serum wird gegen einen 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8 (ohne NaCl-Zusatz), dialysiert. Die gleiche so behandelte Serummenge wird über eine Membran mit einer Porosität von 0,2 um filtriert und auf eine identische, mit 0,02 M Natriumphosphatpuffer, pH 6,8 (ohne NaCl-Zusatz), äquilibrierte DEAE-Spherodex/LS®-Säule aufgegeben.
Unter diesen Bedingungen wird ein großer Teil der Proteine am Träger fixiert, während ein anderer Teil nicht fixiert wird und in einer ersten Fraktion (Filtrat) aufgefangen wird.
Die fixierte Fraktion wird durch Aufgeben von Puffer mit 10 g/l NaCl-Zusatz eluiert. Die dem Eluat entsprechende zweite Fraktion wird aufgefangen. Die gesamte Menge der beiden Fraktionen (Filtrat und Eluat) wird gemischt, über eine Membran mit einer Porosität von 0, 2 um filtriert und auf die wie in Beispiel 2 bei pH 6,8 äquilibrierte DEA-Spherosil/LS®-Säule aufgegeben.
Aus dem schließlich aufgefangenen Filtrat werden Proben entnommen und für biologische Kontrollen gelagert.

Beispiel 8 - Sechster Behandlungsmodus der kontaminierten Kälberserumprobe

Dieses Beispiel ähnelt Beispiel 7, jedoch wird das am Ausgang der DEAE-Spherodex/LS®-Säule aufgefangene Gemisch auf pH 5,0 eingestellt und die Chromatographie an der zweiten DEA-Spherosil/LS®-Säule in 0,02 M Phosphatpuffer, pH 5,0, mit S g/l NaCl-Zusatz durchgeführt.

Beispiel 9 - Biologische Kontrollen der behandelten Kälberserumproben

Die nach jeder der Behandlungen gemäß den Beispielen 2 bis 8 entnommenen und bei -70ºC gelagerten Proben werden mit Hilfe von herkömmlichen biologischen Tests an Mäusen kontrolliert, wobei sich zeigt, daß:
- das so behandelte Tierserum keine Komponenten mehr enthält, die zur Übertragung von Scrapie auf Mäuse befähigt sind,
- das so behandelte Tierserum seine zellvermehrungsstimulierenden Eigenschaften behält und anstelle des derzeit verfügbaren Tierserums verwendet werden kann.

Beispiel 10 - Behandlung einer ersten Albuminlösung

Es werden 150 ml einer nach den 4 Fällungsschritten und dem Verdünnungsschritt gemäß S. 239 des weiter oben erwähnten Aufsatzes "Viral Validation of the Manufacturing Process of High Purity Albumin From Placentas" teilgereinigten Plazenta-Albuminlösung bereitgestellt.
Bei dieser Lösung handelt es sich um eine wäßrigethanolische Albuminlösung mit 50 g/l Albumin.
Diese Lösung wird absichtlich mit 2% (v/v) eines UTAs enthaltenden Inokulums kontaminiert. Dieses Inokulum wird durch Homogenisierung der Gehirne von Tieren (männliche C57BL/6-Mäuse), die mit experimentellem Maus-Scrapie-Agenz (Stamm C506/M3, 7. Passage, von Dr. D. C. Gajdusek und P. Brown, N. I. H., Bethesda, USA, mit Infektionstiter von etwa 10&sup8; LD50 pro Gramm Gehirn) infiziert worden waren und das Endstadium der Erkrankung erreicht hatten, erhalten. Die Herstellung des Homogenats erfolgt in einer sterilen Lösung von 5% Glucose entsprechend einem Gewicht/Volumen-Verhältnis von 10%. Das Inokulum wird mit Ultraschall behandelt, dann durch Zentrifugation geklärt und vor der Verwendung über ein 0,45-um-Filter filtriert.
Die kontaminierte Albuminlösung wird über ein 0,2-um- Filter filtriert und dann nacheinander an DEAE- Spherodex/LS®, danach an DEA-Spherosil/LS® bei pH 4,8 und schließlich an DEA-Spherosil/LS® bei pH 6,8 chromatographiert.
Die erste DEAE-Spherodex/LS®-Säule, die 30 g Gel enthält, wird zunächst mit Mononatriumphosphatpuffer bei pH 6,8 äquilibriert.
Dann wird die Albuminlösung auf die Säule aufgegeben. Das negativ geladene Albumin wird durch ionische Wechselwirkung progressiv am Träger fixiert. Der Alkohol und die Proteinverunreinigungen, die elektrisch neutral oder positiv geladen sind, werden direkt entfernt.
Die Säule wird dann mit einer 12,5%igen Alkohollösung und dann mit gereinigtem Wasser gewaschen.
Danach wird das Albumin mit einer Lösung mit 10 g/l NaCl aus der Säule eluiert. Hiernach wird die Säule mit einer Lösung von 60 g/l NaCl regeneriert und mit Hilfe einer Säureregenerationsphase durch Waschen mit 0,1 N HCl sterilisiert, wonach die Säule mit einer 70%igen Alkohollösung gewaschen und in dieser Lösung aufbewahrt wird.
Die erhaltene kochsalzhaltige Albuminlösung wird dann an einer DEA-Spherosil/LS®-Säule mit 15 g Gel bei pH 4,8 chromatographiert. Diese Chromatographie kombiniert elektrostatische Adsorption durch Diethylaminogruppen und hydrophobe Adsorption durch vernetztes Polystyrol. Der Säulenträger wird vorher mit einer Lösung von 0,7 g NaCl äquilibriert. Beim Durchgang der Albuminlösung durch diese Säule werden bestimmte hydrophobe Verunreinigungen gebunden, während das Albumin in Lösung bleibt.
Dann wird die Säule mit einer Lösung von 4 g/l NaCl gewaschen.
Danach wird die Säule durch Waschen mit 0,1 N HCl regeneriert und dann mit einer 70%igen Alkohollösung gewaschen und in dem Alkohol gelagert.
Die am Ausgang dieser Säule erhaltene Albuminlösung wird dann an einem identischen Träger, aber diesmal bei pH 6,8, erneut chromatographiert. Die Säule enthält hier 3 g Gel und ist mit einer Säule mit 3 g Siliciumoxid kombiniert. In diesem Schritt werden bei dem pH-Wert des vorhergegangenen Schritts nicht fixierte hydrophobe Verunreinigungen adsorbiert und außerdem jegliche DEAE-Dextran-Moleküle aus der ersten Chromatographie entfernt.
Die beiden Säulen werden dann einer ersten Wäsche mit einer Lösung von 6 g/l NaCl unterworfen, um eventuell zurückgehaltenes Albumin zurückzugewinnen. Danach werden die Säulen einer zweiten Wäsche mit einer konzentrierten Lösung von 60 g/l NaCl unterworfen, um eventuelle Spuren von denaturiertem Albumin zu entfernen.
Dann regeneriert man die Säulen durch Waschen mit 0,1 N HCl, sterilisiert sie durch Waschen mit 70%iger Alkohollösung und lagert sie in dem Alkohol. Am Ausgang der Siliciumoxidsäule erhält man 7,6 ml einer konzentrierten reinen Albuminlösung.
Zur Verifizierung der Gegenwart von UTAs wird ein Test an etwa 200 gesunden männlichen C 57BL/6-Mäusen mit einem Gewicht von 18 bis 20 Gramm durchgeführt, von denen jede auf intracerebralem Wege in der rechten Hemisphäre mit 20 ul Albuminlösung inokuliert wird. Die ersten 24 Mäuse erhielten die konzentrierte Albuminlösung. Danach wurde die Albuminlösung in Zehnerschritten verdünnt, wonach jede der Verdünnungen 12 Mäusen injiziert wurde.
Die Tiere werden unter Beobachtung gehalten, um Anzeichen für das Auftreten von experimenteller Maus- Scrapie zu verifizieren. Nach der zweiten positiven Evaluierung eines klinischen Anzeichens wird eine Maus als positiv erachtet. Beim Tod einer Maus wird ihr Gehirn bei -80ºC eingefroren und eine histopathologische Untersuchung zur Bestätigung der Todesursache durchgeführt.
Die erhaltenen Ergebnisse belegen, daß durch das erfindungsgemäße Verfahren die Verringerung des Infektionstiters der Albumin-Ausgangslösung, ausgedrückt in LD50 (dieser Wert wird nach der Methode von Reed und Muench für Verdünnungen der getesteten Probe in Zehnerschritten bestimmt), sich auf 105,5 beläuft, was einer Titerdifferenz von 5,5 log entspricht.

Beispiel 11 - Verifizierung der Abwesenheit von Säulenkontamination

Nach Durchführung von Beispiel 10 werden 150 ml einer Albuminlösung mit 50 g/l Albumin bereitgestellt, die abgesehen von der absichtlichen Kontamination mit einem UTAs enthaltenden Inokulum mit derjenigen aus Beispiel 10 identisch ist; diese Albuminlösung wird den gleichen Chromatographieschritten wie in Beispiel 10 unterworfen, um zu verifizieren, daß die durch die Chromatographiesäulen in Beispiel 10 adsorbierten UTAs nicht in die neue Albuminlösung abgegeben werden. Hierbei erhält man 6,6 ml gereinigte Lösung. Es wird der gleiche Test wie in Beispiel 10 durchgeführt, d. h. intracerebrale Inokulation jedes Tiers mit 20 ul der so erhaltenen Albuminlösung und dann mit der in Zehnerschritten verdünnten Albuminlösung. Ungefähr 100 Mäuse werden auf diese Weise inokuliert.
Die erhaltenen Ergebnisse belegen, daß die Mäuse nicht kontaminiert sind; die Albuminlösung ist daher völlig UTA-frei.
Daher kann man die Chromatographiesäulen mehrmals verwenden.

Beispiel 12 - Behandlung einer zweiten Albuminlösung

Es wird analog Beispiel 10 verfahren, wobei man jedoch diesmal von einer Albuminlösung ausgeht, die aus der Fraktion V gemäß der COHN-Technik besteht und über ein 0,45-um-Filter filtriert worden ist.
Die dann erhaltene Albuminlösung weist die gleichen Eigenschaften wie die in Beispiel 10 erhaltene Lösung auf.

Claims

1. Verfahren zur Entfernung von unkonventionellen transmissiblen Agenzien (UTAs) aus einer wäßrigen Proteinlösung, dadurch gekennzeichnet, daß man dabei im wesentlichen die Proteinlösung mittels gleichzeitiger elektrostatischer und hydrophober Adsorptionschromatographie behandelt und das Filtrat auffängt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die gleichzeitige elektrostatische und hydrophobe Adsorptionschromatographie in zwei Schritten durchführt, wobei man einen Schritt bei saurem pH und den anderen Schritt bei weitgehend neutralem pH vornimmt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man den Schritt bei saurem. pH vor dem Schritt bei weitgehend neutralem pH durchführt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem auch noch die wäßrige Proteinlösung mittels Anionenaustauschchromatographie behandelt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die elektrostatische und hydrophobe Adsorptionschromatographie mit Hilfe eines Gels mit funktionellen Gruppen, wie vernetztem Diethylaminopolystyrol, Diethylaminopolyphenyl oder einer anderen Kombination von Resten mit positiver Ladung und hydrophoben Molekülen, die an eine inerte Matrix gebunden sind, durchführt.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die elektrostatische und hydrophobe Adsorptionschromauographie mit Hilfe eines makroporösen Trägers mit Diethylaminogruppen durchführt.

7, Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die elektrostatische und hydrophobe Adsorptionschromatographie mit Hilfe von DEA-Spherosil/LS®-Gel durchführt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem auch noch die Proteinlösung zunächst mit Hilfe eines Filters mit einer Trenngrenze von im wesentlichen 0,2 um filtriert.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Albuminlösung behandelt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Kälberserum enthaltende Lösung behandelt.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Plasmaproteine enthaltende Lösung behandelt.