DE69027187T2

DE69027187T2 - Verfahren zur inaktivierung von viren in mit viren verunreinigten pharmazeutischen zusammensetzungen

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Publication number: DE69027187T2
Application number: DE69027187T
Authority: DE
Inventors: Alisa Rose D; Michael Hrinda; George Tarr
Original assignee: Rorer International Overseas Inc
Current assignee: Rorer International Overseas Inc
Priority date: 1989-06-15
Filing date: 1990-06-13
Publication date: 1996-10-31
Anticipated expiration: 2010-06-14
Also published as: DK0431129T3; ATE138575T1; EP0431129A1; EP0431129A4; CA2034489C; DE69027187D1; ES2087156T3; EP0431129B1; JPH04501429A; US5300433A; WO1990015613A1; JP3297433B2; CA2034489A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

1. Gebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft Verfahren zur Inaktivierung von Viren in mit Viren verunreinigten pharmazeutischen Zusammen- Setzungen, die proteinartige Komponenten, wie Gerinnungsfaktoren, enthalten, durch die Verwendung von chemischen Inaktivierungs- und/oder physikalischen Verfahren. Insbesondere betrifft die Erfindung Blutplasma oder andere Plasmaprotein-enthaltende Zusammensetzungen, die von viraler Infektiosität freigemacht werden sollen, wie Blutplasma oder Fraktionen davon mit wertvollen labilen Proteinen, wie beispielsweise Faktor IX. Ein spezifisches Verfahren der Erfindung benötigt die Verwendung von Natriumthiocyanat und Ultrafiltration.

2. Beschreibung des Stands der Technik

Blut besteht aus Feststoffen (Zellen, d.h. Erythrozyten, Leukozyten und Thrombozyten) und Flüssigkeit (Plasma). Die Zellen enthalten potentiell wertvolle Substanzen, wie Hämoglobin, und sie können dazu veranlaßt werden, andere potentiell wertvolle Substanzen, wie Interferone, Wachstumsfaktoren und andere Modulatoren der biologischen Antwort, zu produzieren. Das Plasma besteht hauptsächlich aus Wasser, Salzen, Lipiden und Proteinen. Vor der Verfügbarkeit einer ausführlicheren Beschreibung der einzelnen Proteinkomponenten wurden die Proteine in Gruppen eingeteilt, anfänglich als einfache "Albumine" und "Globuline". Typische Antikörper (Immunserumglobuline), die in menschlichem Blutplasma gefunden werden, umfassen diejenigen, die gegen infektiöse Hepatitis, Influenza H, etc. gerichtet sind.
Vollblut muß vor der Anwendung in Bluttransfusionen sorgfältig typisiert und auf seine Verträglichkeit getestet werden. Plasma jedoch benötigt im allgemeinen keine Vortestung. Für bestimmte Anwendungen wird nur eine geeignete Plasmafraktion benötigt, wie der Faktor-VIII-Komplex zur Behandlung von Hämophilie oder der von-Willebrand-Erkrankung. Die Logik zur Verwendung spezieller Blutfraktionen ist, daß Blut eine Anzahl von unterschiedlich gebildeten Elementen sowie verschiedene Plasmaproteine und Bestandteile enthält, die viele Funktionen besitzen. So kann eine einzelne Gabe einer Einheit Vollblut Erythrozyten, Thrombozyten, Plasma und cryopräzipitiertes Faktor VIII-Fibrinogenkonzentrat ergeben. Hämaphereseverfahren können große Mengen an Granulozyten, Thrombozyten und Plasma aus einzelnen Spendern erzeugen. Die Logik zur Verwendung von Blutkomponenten ist, daß ein Patient üblicherweise den Ersatz nur einer speziellen Komponente benötigt (vergleiche Greenwalt et al.: General Principles of Blood Transfusion, A.M.A.. Editorial Board, 1978). Die verbleibenden Komponenten können dann verwendet werden, um Patienten zu behandeln, die andere spezielle Komponenten benötigen, wodurch mehrere Patienten von jeder gespendeten Bluteinheit profitieren können, wodurch der daraus realisierbare Nutzen maximiert wird. Die Trennung von Blut in Komponenten und ihre anschließende Fraktionierung erlaubt die Konzentrierung von Proteinen. Von großer Bedeutung ist auch die Tatsache, daß die Plasmafraktionen für viel längere Zeitspannen gelagert werden können als Vollblut, und sie können in flüssigem, gefrorenem oder getrocknetem Zustand verteilt werden. Schließlich können in einigen Fällen so die Plasmaanteile von überlagertem Vollblut, das für die Verabreichung als Vollblut unsicher ist, aus Blutbanken gerettet werden.
In menschlichem Plasma befindliche Proteine umfassen Präalbumin, Retinol-bindendes Protein, Albumin, alpha-Globuline, beta-Globuline, die Gerinnungsproteine (Faktoren II, VII, IX, X, V, VIII, XI, XII, XIII und Inhibitoren, wie Protein C, Antithrombin III, etc.) Fibronectin, Immunglobuline (Immunglobuline G, A, M, D und E) und die Komplementkomponenten. Es gibt gegenwärtig mehr als 100 Plasmaproteine die beschrieben wurden. Eine zusammenfasesnde Liste findet sich in "The Plasma Proteins", Hrsg. Putnam, F.W., Academic Press, New York (1975).
In Blutzellfraktionen befindliche Proteine umfassen Hämoglobin, Fibronectin, Fibrinogen, Enzyme des Kohlehydratsund Proteinmetabolismus, etc. Zusätzlich kann die Synthese anderer Proteine, wie von Interferonen und Wachstumsfaktoren, induziert werden.
Plasma kann chemisch fraktioniert werden, wodurch eine Albumin- oder Plasmaproteinfraktion, Faktor-VIII-Konzentrat, Faktor-IX-Komplex und Immunserumglobulin bereitgestellt wird.
Die Fraktionierung von Blutplasma ist im allgemeinen mit der Verwendung von organischen Lösungsmitteln, wie Ethanol, Ether und Polyethylenglykol, bei niedrigen Temperaturen und kontrollierten pH-Werten verbunden, um die Fällung einer speziellen Fraktion, die ein oder mehrere Plasmaproteine enthälb, auszulösen. Der so erhaltene Überstand kann selbst dann ausgefällt werden und so weiter, bis der gewünschte Grad an Fraktionierung erhalten wird. Jüngst beruhen Trennungen auch auf chromatographischen Verfahren. Eine Übersicht der Blutfraktionierung erscheint in Kirk-Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Ausg., Interscience Publishers, Bd. 4, Seiten 25 bis 62.
Die Hauptkomponenten einer kalten ethanolischen Fraktionie rung von Blutplasma sind im folgenden angegeben: Tabelle I Fraktion Proteine Fibrinogen kaltes unlösliches Globulin Faktor Properdin; beta-Lipoprotein Prothrombin Plasminogen Plasmininhibitor Thrombin Antithrombin Isoagglutinine Coeruloplasmin Komplement alpha-1-Lipoprotein Coeruloplasmin Peptidase alpha- und beta-Globuline Transferrin Thyroxin-bindendes Globulin Serumesterase Albumin alkalische Phosphatase saures alpha-1-Glykoprotein
Das vorstehende Fraktionierungsschema kann als Basis für weitere Fraktionierungen dienen. Die Fraktionen II und III beispielsweise können weiter fraktioniert werden, wodurch Immunserumglobulin (ISG), ein Gemisch in erster Linie aus IGG-Antikörpern erhalten wird.
Bei einem weiteren Fraktionierungsschema wird gefrorenes Plasma verwendet, das in einem Cryopräzipitat aufgetaut wird, welches AHF (antihämophiler Faktor) und Fibronectin und einen Cryoüberstand enthält. Das Cryopräzipitat wird dann in Fibronectin und AHF fraktioniert.
Polyethylenglykol befindet sich unter den Mitteln, die verwendet wurden, um hochreines AHF und nichtaggregiertes ISG herzustellen.
Bei der Entwicklung neuer Produkte aus menschlichem Plasma treten mindestens drei Hauptprobleme immer auf. Diese sind die Verunreinigung mit Pyrogenen (Endotoxine), die Übertragung viraler Hepatitis oder anderer viraler Erkrankungen und die Aktivierung der Gerinnungsenzyme.
Lösungen von pharmazeutischen Präparaten, die dem Menschen (oder bei veterinärmedizinischen Anwendungen) parenteral verabreicht werden sollen, müssen frei von infektiösen Mikroorganismen, wie Bakterien und Pilzen, sterilisiert werden. Ein übliches Verfahren besteht darin, daß man die Zusammensetzung einer Dampfsterilisation (Autoklavieren) bei Temperaturen über 100ºC bei hyperbarischen Drücken für eine Zeitspanne, die für die Effizienz ausreicht, unterwirft. Diese Behandlung tötet Viren ab, kann aber für bestimmte hitzeempfindliche Zusammensetzungen, wie solche, die proteinartige Komponenten, wie die Gerinnungsfaktoren VIII, IX, II, VII, X und dergleichen, enthalten, schädlich oder zerstörend sein.
Pyrogene sind Lipopolysaccharide (LPS), die von der äußeren Zellwand von gramnegativen Bakterien abgeleitet sind. Sie sind toxische Materialien, die auch als Endotoxine bekannt sind, und so von toxischen Substanzen, die von dem intakten Bakterium synthetisiert und ausgeschieden werden, unterschieden werden. Pyrogene besitzen zahlreiche biologische Aktivitäten, die die Erzeugung von Fieber, die Aktivierung der Gerinnungsmechanismen und die Induktion von Schock umfassen. Folglich ist es zusätzlich zu der Notwendigkeit nach Sterilität vor infektiösen Erregern wesentlich, daß pyrogene Substanzen entfernt werden, und daß die verursachenden Bakterien durch Sterilisation oder eine andere derartige Behandlung des Plasmaendprodukts unschädlich gemacht werden.
Blutgerinnungsfaktoren spielen eine wichtige Rolle bei den normalen Gerinnungsmechanismen. Beispielsweise zeigen Patienten mit einem Faktor-IX-Defekt schwere Blutungsprobleme (Hämophilie B). Es würde wünschenswert sein, wesentliche Mengen an Faktor IX und anderen Vitamin K-abhängigen Proteinen für die therapeutische Verabreichung ebenso wie für die wissenschaftliche Untersuchung isolieren zu können.
Der Faktor-IX-Komplex ist ein lyophilisiertes Plasmasammelderivat, das reich an Faktoren IV, VII, IX und X ist. Es ist eine Alternative zur Plasmatherapie. Es liefert Vitamin A-abhängige Gerinnungsfaktoren in einem kleineren Volumen als Plasma aber mit einem signifikant höheren Hepatitisrisiko. Faktor IX enthaltende Konzentrate sind einzigartige und sehr wertvolle Blutprodukte, die bei Verwendung zur Kontrolle der Blutung bei Patienten, die an Faktor-IX-Defekt leiden (Hämophilie B) lebensrettend sind. Diese Produkte wurden auch verwendet, um diejenigen Patienten zu behandeln, die an Hämophilie A mit Inhibitoren leiden, obwohl die klinische Bestätigung zur Anwendung immer noch in Bearbeitung ist. Faktor IX enthaltende Konzentrate werden auch verwendet, um schwere Hämorrhagien zu stoppen, oder um operative und postoperative Blutungen bei Patienten mit anderen angeborenen Gerinnungsfaktordefekten oder bei mehrfachem Faktordefekt, der durch eine Überdosis an Arzneistoffen vom Warfarin-Typ, z.B. durch orale Antikoagulantien, induziert wurde, zu verhüten.
Handelskonzentrate von Faktor IX wurden früher unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen zur Bindung der Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren und zur Trennung dieser Proteine von der Masse der anderen Plasmaproteine hergestellt. Diese Gerinnungsfaktorkonzentrate werden von dein Harz eluiert und für die therapeutische Verwendung ohne weitere Reinigung in Ampullen abgefüllt. Solche Konzentrate neigen dazu, ein thrombogenes Potential zu besitzen, wahrscheinlich weil sie fremde Vitamin K-abhängige Gerinnungsfaktoren und/oder Phospholipide enthalten. Ferner gerieten solche Konzentrate in Verdacht, Träger für die Übertragung von viralen Erkrankungen einschließlich Hepatitis und des erworbenen Immundefektsyndroms (AIDS) zu sein. Ferner sind Rohkonzentrate von Faktor IX für lange Zeitspannen in Lösung nicht stabil und können daher nicht für eine konstante Infusionstherapie verwendet werden, was ihren Wert bei einer chronischen Ersatztherapie einschränkt.
Jüngste Bemühungen, einen Faktor IX unter Verwendung der rekombinanten DNA-Technik zu erzeugen, wurden durch die Schwierigkeit beim Abtrennen von Faktor IX aus Kulturüberständen mit gegenwärtig akzeptierten Techniken vereitelt (vergleiche Anson, D.S., Austen, D.E.G., und Brownless, GG., "Expression of Active Human Clotting Factor IX From Recombinant DNA Clones in Mammalian Cells", Nature, 1985, 315:683-685; de la Salle, H., Altenburger, W., Elkaim, R., Dott, K., et al., "Active Gamma-carboxylated Human Factor IX Expressed Using Recombinant DNA Techniquest", Nature, 1985, 316:268-270; und Busby, S., Kumar, A., Joseph, M., Halfpap, L., Insley M. et al., "Expression of Active Human Factor IX in Transfected Cells", Nature, 1985, 316:271- 273). So bleibt eine medizinische Notwendigkeit nach einer sicheren Herstellung von Faktor IX aus menschlichem Plasma.
Zahlreiche Versuche wurden unternommen, Viren, wie lipidhaltige Viren des Hepatitis B-Virus (HBV) und des menschlichen Immunschwächevirus (HIV) in Säugerblutplasma, insbesondere in menschlichem Blutplasma, zu inaktivieren. Es ist in einigen Ländern Praxis, die Inaktivierung des Hepatitis B-Virus in Blutplasma durch Kontaktieren des Plasmas mit einem Mittel zur Inaktivierung von Viren des Typs, der das proteinartige Protein des Hepatitis B-Virus vernetzt oder mit der Nukleinsäure des Viren wechselwirkt, durchzuführen. Beispielsweise ist es bekannt, eine Inaktivierung des Hepatitis B-Virus zu versuchen, indem man es mit einem Aldehyd (wie Formaldehyd) in Kontakt bringt, wodurch die Vernetzung an das Protein beeinträchtigt wird, und das Hepatitis B-Virus inaktiviert wird. Es ist auch bekannt, die Inaktivierung des Virus durch Kontakt mit beta- Propiolacton (BPL), einem Mittel, das auf die Nukleinsäure - ebenso wie auf die Proteinkomponenten des Virus einwirkt - zu erzielen. Es ist weiter bekannt, ultraviolettes (UV-) Licht, insbesondere nach einer beta-Propiolactonbehandlung, zu verwenden. Man nimmt an, daß diese Verfahren zur Inaktivierung des Virus im Plasma nicht geeignet sind, da beobachtet wurde, daß die meisten dieser Inaktivierungsmittel (Formaldehyd, beta-Propiolacton und Natriumhypochlorit) die wertvollen Proteinkomponenten des Plasmas, insbesondere sogenannte "labile" Blutgerinnungsfaktoren des Plasmas denaturierten oder veränderten.
Die Entfernung von Bakterien und Pilzen aus solchen hitzeempfindlichen proteinartigen Zusammensetzungen wird im allgemeinen durch die Verwendung eines Bakterien-zurückhaltenden Filters erzielt. Typische Beispiele sind die Membranfilter mit einem Porositätsbereich von 0,1 bis 0,2 µm (100 bis 200 nm), die von Pall Corporation und Millipore corporation hergestellt werden. Im allgemeinen bleiben die proteinartigen Komponenten in der pharmazeutischen Zusammensetzung unbeschädigt. Jedoch ist bekannt, daß Membranfilter bei der Zurückhaltung hochinfektlöser und gefährlicher Mikroorganismen, wie Virusteilchen, versagen können. Filtervorrichtungen können entwickelt werden, um einige Virusteilchen zurückzuhalten, wenn die effektive Filterporosität klein genug ist. Solche Vorrichtungen wurden manchmal verwendet, um virale Teilchen zu gewinnen, z.B. während der Herstellung von Virusimpfstoffen. Die meisten viralen Teilchen sind jedoch kleiner als die effektive Porosität des Membranfilters und werden nicht zurückgehalten. Beispielsweise besitzt das Hepatitis B-Virus, das in Gerinnungsfaktorlösungen aus menschlichem Plasma vorhanden sein kann, einen Durchmesser von 42 Nanometern (nm) und passiert leicht ein 100 nm (0,1 µm) Membranfilter.
Es ist gut bekannt, daß Plasmaprodukte aus Plasma Hepatitis übertragen können. Anfänglich konzentrierte sich das Interesse der Virusübertragung in erster Linie auf das Hepatitis B-Antigen (HBsAg) als Indikator der Anwesenheit eines verletzenden Erregers (Hepatitis B-Virus), und Versuche, diesen Erreger zu eliminieren, führten zum verbreiteten Durchmustern von jedem Plasma, das bei der Transfusion verwendet wird, durch im Handel erhältliche und anerkannte Laborverfahren. Während ein solches laboratoriumsmäßiges Durchmustern offensichtlich das Auftreten von Hepatitis B bei Patienten, die Vollbluttransfusionen empfangen, erniedrigt hat, besteht keine signifikante Verbesserung im Auftreten der Erkrankung, die durch Plasmaprodukte übertragen wird. Chronische Verwender von Blutprodukten sind dem Risiko einer Erkrankung ausgesetzt, außer sie werden durch Inokulation mit einem Impfstoff in einem Immunstatus gehalten. Während dies effektiv ist, kann dies andere damit assoziierte klinische Risiken besitzen. Versuche, das Virus durch verschiedene Adsorptionsverfahren oder Präzipitationstechniken, z.B. mit Polyethylenglykol, zu entfernen, erwiesen keine volle Eliminierung der Infektiosität. Es besteht ein gewisser Nachweis, daß die Kombination von ultraviolettem Licht und beta-Propiolacton bei der Inaktivierung von Viren in bestimmten Plasmaprodukten hilfreich sein kann. Jedoch besteht ein gewissser Verdacht, daß beta-Propiolacton karzinogene Eigenschaften besitzt.
Um die Sicherheit von pharmazeutischen Zusammensetzungen, die hitzeempfindliche proteinartige Komponenten enthalten, und die gefährliche Virusteilchen enthalten können, wird eine zusätzliche Verarbeitung benötigt. Diese Verarbeitung umfaßt die Erhitzung von Lösungen der proteinartigen Komponenten mit speziellen Stabilisatoren, um das biologische Potential zu schützen, die Erhitzung der lyophilisierten Präparate der proteinartigen Komponenten und die Behandlung der Lösungen der proteinartigen Komponenten mit organischen Lösungsmitteln und mit anderen virusabtötenden Mitteln. Die meisten dieser Verfahren sind umständlich, zeitaufwendig oder zerstörerisch für das Protein infolge der Radikalität der Behandlung. Es bestehen immer noch Fragen über die Effizienz jedes dieser Verfahren, das einzeln auf Plasmaprodukte angewendet wird.
Während die Entwicklung von Screeningtests auf Hepatitis B von begrenztem Wert bei der Verminderung der Übertragung der Erkrankung war, führte die Identifikation dieses Virus (ebenso wie des Hepatitis A-Virus) zur Erkennung eines dritten Virus, das offensichtlich für die Hauptzahl der durch Blutplasmaderivate übertragenen Hepatitisfälle verantwortlich ist. Dieses Virus wird als "non-A-, non-B-Hepatitis"-Virus bezeichnet.
Verfahren zur Inaktivierung des Hepatitis B-Virus in Plasma sind bekannt, aber üblicherweise unpraktisch. Bei einem Verfahren werden dem Plasma Antikörper zugesetzt, wodurch ein Immunkomplex gebildet wird. Die Ausgaben für die Antikörperbildung und -reinigung tragen signifikant zu den Kosten der Plasmaherstellung bei. Ferner besteht keine Gewährleistung, daß eine ausreichende Menge an non-A-, non-B- Virus inaktiviert wird, da das Verfahren für das Hepatitis B-Virus spezifisch ist. Es gibt gegenwärtig keinen anerkannten und verfügbaren Test für non-A-, non-B-Antikörper oder das Virus, obwohl es Berichte von Fortschritten bei dessen Erzielung gibt. Daher ist es bis jetzt nicht möglich, Plasma, das hohe Titer an anti-non-A-, anti-non-B-Antikörper enthält, auszusondern, noch anzugeben, daß dieses Verfahren praktikabel wäre.
Mit fortschreitender Entwicklung der von menschlichem Plasma abgeleiteten Therapeutika manifestierte sich die Notwendigkeit nach einer Virussterilisation. Stabile Plasmaproteinlösungen können eine Pasteurisierung überstehen, aber labile Blutgerinnungsfaktoren werden während einer solchen Erhitzung meist inaktiviert oder in ihrer Wirksamkeit signifikant reduziert. Dies beschränkt die praktischen Anwendungen. Als Ergebnis müssen Empfänger von Faktor VIII, gamma-Globulin, Faktor IX, Fibrinogen, etc. oft das Risiko akzeptieren, daß die verabreichten wertvollen Proteinkomponenten mit Hepatitisviren ebenso wie mit anderen infektiösen Viren verunreinigt sein können. Als Ergebnis stehen diese Empfänger der Gefahr gegenüber, durch diese Viren infiziert zu werden und müssen den Schaden, der das Virus an den Organsystemen verursacht, und die folgende Funktionseinschränkung und Krankheit, die zum Tode führen kann, ertragen. Daher besteht eine Notwendigkeit nach einem effektiveren und dennoch praktikablen Verfahren zur Reinigung von hitzeempfindlichem Plasma, insbesondere nach einem Verfahren zur Virussterilisation ohne die Anwendung von Wärme.
So besteht ein sehr spezieller Bedarf nach der Entwicklung von Mitteln und Methoden zur Herstellung und Isolierung von hochgereinigtem Faktor IX, der anschließend zu einem potenten, rasch wirksamen therapeutischem Blutprodukt formuliert werden kann, das in vitro stabil ist, und das für Patienten, die an einem kritischen Blutungsereignis leiden, eine effektive Linderung bringt.
Die vorliegende Erfindung soll drei Aufgaben lösen, nämlich (1) eine sichere, (2) virusinaktivierte proteinhaltige Zusammensetzung, (3) ohne auftretende wesentliche Proteindenaturierung. Diese drei Aufgaben sind nicht notwendiger weise kompatibel, da beispielsweise die Sterilisation die virale Infektiosität inaktiviert, aber im wesentlichen die wertvollen Plasmaproteine denaturiert, beta-Propiolacton die virale Infektiosität inaktiviert, aber unsicher ist und Substanzen, wie Formaldehyd, Viren inaktivieren, aber auch wesentlich die wertvollen Plasmaproteine, beispielsweise Faktor IX, denaturieren.
Es ist daher zweckmäßig, ein Verfahren zum Erhalt von proteinhaltigen Zusammensetzungen bereitzustellen, das die wertvollen Proteinkomponenten darin nicht wesentlich denaturiert, und das nicht mit der Verwendung von erwiesenermaßen karzinogenen Mitteln (wie beta-Propiolacton) verbunden ist. Genauer ist es zweckmäßig, Blutprotein-enthaltende Zusammensetzungen bereitzustellen, in denen im wesentlichen alle Hepatitisviren und andere Viren, die vorhanden sind, inaktiviert sind. Eine weitere Aufgabe ist die Bereitstellung von Produkten aus Krebszellen und normalen Zellen oder aus Fermentationsverfahren von Zellen nach erfolgter Insertion einer rekombinanten DNA, die im wesentlichen von Viren einschließlich lipidhaltigen Viren, frei sind, die eine Kategorie ausmachen, die bekannte Infektionserreger des Plasmas enthält.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Es wurde nun entdeckt, daß, wenn eine proteinhaltige Zusammensetzung, wie Vollblut, Blutzellproteine, Blutplasma, ein Blutplasma-Fraktionierungspräzipitat, ein Blutplasma-Fraktionierungsüberstand, ein Cryopräzipitat, ein Cryoüberstand, oder ein Anteil oder Derivat davon oder Serum [oder ein aus normalen oder Krebszellen erzeugtes Nicht-Blutprodukt (z.B. über die rekombinante DNA-Technik)] mit Natriumthiocyanat für eine ausreichende Zeitspanne in Kontakt gebracht wird, Viren (wie das Hepatitisvirus oder das menschliche Immunschwächevirus (HIV)), die in einer pharmazeutischen Zusammensetzung vorhanden sind, in der Tat vollständig inaktiviert werden, ohne daß die Proteine darin denaturiert werden. Eine Kombination aus chemischen und physikalischen Mitteln, die auf ein Blut-Protein-Gemisch oder ein Konzentrat davon oder eine Fraktion davon angewendet wird, ergibt eine sichere virenfreie proteinhaltige Zusammensetzung ohne Denaturierung des Proteins.
Die Erfindung betrifft eine hochwirksame Kombination aus chemischen und physikalischen Mitteln, um ein Blutprodukt, das labile Blutproteine und Viren enthält, virusfrei zu machen, bevorzugt ohne begleitende Proteindenaturierung. Die Erfindung betrifft im allgemeinen eine Therapie mit Blutkomponenten und insbesondere einzigartige Mittel und Verfahren zur Reinigung von Faktor IX aus Prothrombin-Komplexkonzentraten oder anderen Quellen von Faktor IX einschließlich Kulturüberständen, die Faktor IX aus einer rekombinanten DNA-Technik enthalten.
Das Verfahren umfaßt die Stufen:
a) Vermischen eines Blutprodukts mit einer wirksamen Menge eines Natriumthiocyanats, die das Protein in dem Blutprodukt nicht denaturiert, und einem Puffer;
b) Stehenlassen des Gemisches für eine Zeit, die ausreicht, im wesentlichen alle Viren zu inaktivieren;
c) gegebenenfalls Entfernung des Natriumthiocyanats; und
d) physikalische Entfernung der inaktivierten und aktiven Viren aus den Blutprodukten.
Bevorzugt wird die chemische Verfahrensstufe an einem zuvor gereinigtem Blutprodukt durchgeführt. Beispielsweise können die Reinigung und die chemische Behandlung die folgenden Stufen umfassen:
a) Chromatographie des Blutprodukts auf einer Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern, um es zu reinigen;
b) Elution des chromatographierten Blutprodukts von der Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern mit einem Natriumthiocyanat in einem Puffer oder Elution mit einem alternativen nicht-desinfizierenden Elutionsinittel mit anschließender Zugabe von Natriumthiocyanat;
c) Stehenlassen des eluierten Gemisches für eine Zeit, die ausreicht, im wesentlichen alle Viren zu inaktivieren;
d) gegebenenfalls Abtrennen des Natriumthiocyanats von dem aktiven Blutprodukt durch Dialyse; und
e) physikalische Entfernung der inaktivierten und aktiven Viren von dem Blutprodukt.
Nach solchen Verfahren wird eine virenfreie Blutproteinenthaltende Zusammensetzung ohne Proteinedenaturierung bereitgestellt. Der hier verwendete Ausdruck Blutplasma-enthaltende Zusammensetzungen umfaßt Blutzellderivate (z.B. Hämoglobin, alpha-Interferon, T-Zell-Wachstumsfaktor, Plättchen-abgeleiteter Wachstumsfaktor, etc., Plasminogenaktivator, Blutplasma, Blutplasmafraktion, Blutplasmapräzipitat (z.B. Cryopräzipitat, Ethanolpräzipitat oder Polyethylenglykolpräzipitat), oder -überstand (z.B. Cryoüberstand, Ethanolüberstand oder Polyethlyenglykolüberstand). Blutprotein-enthaltende Zusammensetzungen sind durch die Anwesenheit eines oder mehrerer labiler Blutproteine, wie Faktor IX gekennzeichnet.
Die vorstehenden Methoden sind besonders nützlich für pharmazeutische Zusammensetzungen, die Vitamin K-abhängige Proteine einschließlich Faktor II, Faktor VII, Faktor IX, Faktor X, Prothrombin, Protein C, Protein S und dergleichen enthalten, insbesondere für eine gereinigte Faktor-IX-Lösung mit einer hohen spezifischen Aktivität. Die labilen Blutproteine können auch einen Antikörper gegen infektiöse Hepatitis oder einen Antikörper gegen das menschliche Immunschwächevirus enthalten.
Das erfindungsgemäße Verfahren übertrifft die Verfahren aus dem Stand der Technik dadurch, daß eine Kombination von hoher Ausbeute des gewünschten Proteins mit hoher Reinheit und insbesondere mit relativ niedrigerer Verunreinigung durch andere Gerinnungsfaktoren bereitgestellt wird. Die Erfindung stellt eine leicht handhabbare und ökonomische Kombination aus chemischen und physikalischen Mitteln bereit, um eine leicht zu verwendende Endformulierung zu erhalten. Die Erfindung vermeidet auch unnötige und teure Reinigungsmanipulationen und erzeugt eine leicht zu erzeugende Endformulierung, die im wesentlichen risikofrei ist.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Das erfindungsgemäße Verfahren betrifft die Inaktivierung und Entfernung von Viren in mit Viren verunreinigten Protein-enthaltenden Zusammensetzungen, insbesondere in denjenigen, die Blutproteine, wie beispielsweise den Prothrombinkomplex (Faktoren II, VII, IX und X) und ein Cryopräzipitat (Faktoren I und VIII) enthalten. Sie betrifft auch Seren, die ein oder mehrere Blutprotein(e) enthalten, Blutprotein-enthaltende Fraktionen, die mindestens ein Blutprotein, wie den Faktor II, den Faktor VII, den Faktor IX, den Faktor X, Fibrinogen und ein Immunglobulin (z.B. IgG, IgM, etc.) enthalten, und Zellysate oder in Blutzellen induzierte Proteine. Insbesondere betrifft sie die Inaktivierung und Entfernung von lipidhaltigen Viren und bevorzugt die Inaktivierung und Entfernung von Hepatitis B- und non- A-, non-B-Viren. Andere Viren, die durch das erfindungsgemäße Verfahren inaktiviert und entfernt werden, umfassen beispielsweise Cytomegalieviren, Epstein-Barr-Viren, Lactatdeyhdrogenaseviren, Viren der Herpesgruppe, Rhabdoviren, Leukoviren, Myxoviren, Alphaviren, Arboviren (Gruppe B), Paramyxoviren, Arenaviren, Coronariviren und menschliches Immunschwächevirus (HIV).
Das bevorzugte Verfahren inaktiviert und entfernt Viren von einem Blutprodukt, das labile Blutproteine und Viren enthält, ohne daß dabei eine Proteindenaturierung auftritt. Es umfaßt die Stufen:
(a) Chromatographie des Blutprodukts auf einer Affinitätsmatrix mit einem monoclonalen Antikörper;
(b) Elution des chromatographierten Blutprodukts von der Affinitätsmatrix mit einem monoclonalen Antikörper mit einer effektiven Menge an Natriumthiocyanat;
(c) Stehenlassen des eluierten Gemisches für eine Zeitspanne und bei einer speziellen Temperatur, die ausreicht, im wesentlichen alle Viren zu inaktivieren;
(d) gegebenenfalls Abtrennen des Natriumthiocyanats von dem aktiven Blutprodukt durch Dialyse; und
(e) physikalische Entfernung der inaktivierten und aktiven Viren von dem Blutprodukt.
Natriumthiocyanat ist das bevorzugte chemische Desinfektionsinittel zur erfindungsgemäßen Verwendung, und es wird in einer Menge zwischen etwa 0,5M und etwa 6M, bevorzugt zwischen etwa 0,5M und etwa 2M, und bevorzugter zwischen etwa 1,5M und 2M verwendet.
Die physikalischen Mittel zur Entfernung der inaktivierten und aktiven Viren aus dem Blutprodukt werden aus der Gruppe, bestehend aus Ultrafiltration, Ultrazentrifugation und Elektrophorese, ausgewählt. Das bevorzugte physikalische Mittel ist die Ultrafiltration.
Zusätzlich zu dem bevorzugten erfindungsgemäßen Verfahren gibt es alternative Verfahren, um ein Blutprodukt virusfrei zu machen. Das erste alternative Verfahren verwendet nur chemische Mittel, ohne daß physikalische Mittel verwendet werden. Ein solches Verfahren umfaßt das Inkontaktbringen des unreinen Blutproteins nur mit einem Natriumthiocyanat. Das zweite alternative Verfahren verwendet das physikalische Mittel zuerst, gefolgt von der Inaktivierung mit Natriumthiocyanat, und gegebenenfalls die anschließende Verwendung eines physikalischen Mittels, um sowohl inaktivierte als auch aktive Viren zu entfernen.
Ein drittes alternatives Verfahren umfaßt die Stufen:
(a) Chromatographie des Blutprodukts auf einer Affinitätsmatrix mit einem monoclonalen Antikörper, um es zu reinigen;
(b) Elution des chromatographierten Blutprodukts von der Affinitätsmatrix mit dem monoclonalen Antikörper mit Natriumthiocyanat;
(c) weiterhin Auslassen des Kontakts mit dem chemischen Desinfektionsmittel; und
(d) Abtrennen der inaktivierten und aktiven Viren durch physikalische Mittel, um das gereinigte aktive Blutprodukt zu isolieren.
Ein viertes alternatives Verfahren umfaßt die Stufen:
(a) Chromatographie des Blutprodukts auf einer Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern, um es zu reinigen;
(b) Elution mit einem nichtdesinfizierenden Elutionsmittel mit anschließender Zugabe von Natriumthiocyanat;
(c) Stehenlassen des eluierten Gemisches für eine Zeit, die ausreicht, im wesentlichen alle Viren zu inaktivieren; und
(d) gegebenenfalls physikalische Entfernung der inaktivierten und aktiven Viren von dem Blutprodukt.
Die Behandlung von Blutprotein-enthaltenden Zusammensetzungen mit Natriumthiocyanat wird bei einer Temperatur von etwa 4 bis 25ºC, bevorzugt 4ºC, durchgeführt. Der Kontakt von Natriumthiocyanat mit den Blutprotein-enthaltenden Zusammensetzungen beträgt etwa 1 bis 2,5 Stunden, bevorzugt mindestens 1 Stunde. Normalerweise wird nach der Behandlung das Natriumthiocyanat entfernt, obwohl dies nicht in allen Fällen in Abhängigkeit von der beabsichtigten Weiterverarbeitung der Blutplasmaprotein-enthaltenden Zusammensetzung notwendig ist.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der Erfindung wird das Blutprodukt durch chromatographische Trennung auf einer Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern gereinigt, dann mit Natriumthiocyanat für eine Zeitspanne behandelt, die ausreicht, das Virus abzutöten, und dann mindestens einmal unter Verwendung einer Membran mit einer Porengröße, die effektiv das Virus zurückhält, z.B. einem Ausschlußvolumen von etwa 100.000 Dalton und einem Druck, der ausreicht, eine adäquate Fließgeschwindigkeit aufrechtzuerhalten, z.B. 5 psi, ultrafiltriert.
Wenn das Blutprodukt (das hier verwendete Beispiel ist Faktor IX) chromatographisch auf einer Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern vorgereinigt wird, können spezifische Aktivitäten von 190 Einheiten/mg Protein erhalten werden. Die Natriumthiocyanatbehandlung kann zweckdienlicherweise unter Verwendung einer Natriumthiocyanatlösung, um die Zusammensetzung von der Matrix zu eluieren, und anschließendes Stehenlassen des Gemisches für eine Zeit, die ausreicht, das Virus abzutöten, durchgeführt werden.
Jede dieser Stufen, d.h. die Vorreinigung, die chemische Sterilisation und die Retentionsfiltration reduziert sehr effektiv die virale Infektiosität. Bei gemeinsamer Verwendung sollte ein virussicheres Ultrafiltrat erhalten werden. Im wesentlichen unvollständige Viren oder virale Komponenten können effektiv in Abhängigkeit von ihrem Molekulargewicht und Durchmesser entfernt werden oder nicht. Jedoch sind vermutlich solche unvollständigen oder defekten Teilchen im Wirt nicht infektiös. Die zusätzliche Reinigung von Faktor IX kann gegebenenfalls chromatographisch auf Aminohexylsepharose erzielt werden.
Von unmittelbarem, aber nicht ausschließlichem Interesse ist der Gerinnungsfaktor IX, eine pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Behandlung von Hämophilie B nützlich ist. Faktor IX, der ein Molekulargewicht von nicht weniger als 100 K Dalton besitzt, ist ein Mitglied der Familie der Vitamin K-abhängigen Gerinnungsfaktoren, die Faktor II, Faktor VII, Faktor X, Protein C, Protein S und dergleichen umfassen, deren Molekülgröße im Bereich von 60 bis 70 K Dalton liegt. Gerinnungsfaktoren, wie Faktor IX, werden aus menschlichem Plasma hergestellt und können mit einer Anzahl potentiell infektiöser und gefährlicher Viren verunreinigt sein. Die Virusteilchen von hauptsächlichem Interesse sind das Hepatitis B-Virus und HIV, die Durchmesser von 42 bzw. 100 Nanometern (nm) besitzen. Wie gezeigt wird, ist der Durchmesser dieser Virusteilchen so, daß die Ultrafiltration durch entweder eine XM300- oder XM100-Membran sie effektiv aus einem Faktor IX-Gerinnungsfaktor oder anderen pharmazeutischen Produkten entfernt. Vom gegenwärtigen Wissensstand würde dies auch eine erwartete Eigenschaft des Hepatitis-non-A- und -non-B-Virus sein.
Das erfindungsgemäße Verfahren erlaubt die Herstellung von Blutproduktderivaten, wie Faktor VIII, gamma-Globulin, Faktor IX oder des Prothrombinkomplexes (Faktoren II, VII, IX und X), Fibrinogen und jedem anderen Blutderivat mit Eigenschaften, die auf diese Beschreibung passen, von denen alle wenig oder keine verbleibenden infektiösen Hepatitis- oder andere Viren enthalten.
Durch die gleichen Manipulationssstufen wie vorstehend diskutiert, können Viren, die in Produkten von normalen oder Krebszellen vorhanden sind, inaktiviert werden, während die labile Proteinaktivität in solchen Produkten beibehalten wird. Beispielsweise kann man durch die gleiche chemische Inaktivierungsbehandlung Produkte inaktivieren, die unter Verwendung von normalen oder Krebszellen, dem Exudat von normalen oder Krebszellen, Hybridomen und durch Gensplicing erzeugten Produkten erzeugt wurden. Eine solche Behandlung beeinträchtigt nicht wesentlich das gewünschte Protein. Zellen, die zur Erzeugung des gewünschten Proteins verwendet werden, können natürlich Säugerzellen als auch Nicht- Säugerzellen sein. Die Erfindung kann in anderen spezifischen Formen ausgeführt werden, ohne vom Gehalt oder den wesentlichen Eigenschaften davon abzuweichen.

VERFAHREN ZUR ABSCHÄTZUNG DER WIRKSAMKEIT DER ERFINDUNG

Die Größe von Makromolekülen einschließlich Proteinen wird meistens durch das Gewicht des Moleküls in Masseneinheiten definiert und bezeichnet. Ein Molekül mit einem Gewicht von 1000 Dalton (1K Dalton) kann auch durch die Angabe beschrieben werden, daß ein Mol des reinen Moleküls 1000 g wiegt. (Für diese Anwendung ist es zweckdienlicher, sich auf die physikalischen Dimensionen der Proteinmoleküle an statt ihr Molekulargewicht zu beziehen.)
Proteinmoleküle sind lineare Ketten von covalent gebundenen Aminosäuren. In Lösung verknäulen sich diese Ketten und falten sich auf spezifische Arten, und bei Sichtbarmachung mit geeigneten Techniken werden sie als kompakte Kugeln, Ellipsoide, Stäbchen oder Fasern gesehen. Die Wissenschaft der Vorhersage der Form einer einzelnen Molekülart ist aufschlußreich, aber die Form kann durch bekannte physikalische Methoden bestimmt werden. Bis eine starke Abweichung durch eine präzise Messung bestimmt wird, und der Einfluß davon berücksichtigt wird, nimmt der Praktiker an, daß die Form des Moleküls eine Kugel ist. Wenn die Molekülgröße, bezogen auf das Gewicht in Dalton, durch bekannte Techniken bestimmt wird, und wenn die Kompaktheit (Dichte) der Proteinfaltung verfügbar ist, kann die Berechnung der Moleküldimensionen eines kugelförmigen Teilchens durch eine einfache Geometrie durchgeführt werden. Basierend auf zusammengetragenen Messungen ist bekannt, daß die Teilchendichten von Proteinmolekülen variieren und für jedes Protein unterschiedlich sein können. Die Varianz ist jedoch im allgemeinen nicht groß, und ein durchschnittlicher oder typischer Wert kann ohne großen Fehler verwendet werden. Dieser wird üblicherweise als das spezifische Teilvolumen ( ) ausgedrückt, das der reziproke Wert der Dichte ist. Ein typisches spezifisches Volumen für Proteine ist 0,75 cm³/g. So wiegt in dem folgenden Beispiel ein Proteinmolekül mit einem Molekulargewicht von 100.000 Dalton unter der Verwendung der Definition der Einheit Dalton 10&sup5; g pro 6,023 x 10²³ Moleküle des Proteins. Unter Verwendung des nominalen spezifischen Teilvolumens von 0,75 cm³/g beträgt das von einem einzelnen Molekül dieses Proteins eingenommene Volumen 0,1245 x 10&supmin;¹&sup8; cm³. Aus der Formel für das Volumen einer Kugel wird ein Durchmesser von 6,2 Nanometern (nm) für das Protein berechnet. Eine Ultrafiltrationsmembran mit einer Ausschlußgrenze von 100.000 Dalton sollte theoretisch Virusteilchen mit Durchmessern von größer 6,2 nm aus einer pharmazeutischen Zusammensetzung von Komponenten, deren Molekulargewicht weniger als 100.000 Dalton beträgt, entfernen.
Viele Experimentatoren, die daran arbeiten, Verfahren zur HIV-Virusreduktion zu entwickeln, verwendeten oft (als Virusinoculum) den Überstand eines Gewebskulturmediums aus gezüchteten Zellen, das bekanntlich mit dem Virus infiziert ist. Diese Medien besitzen nicht die gleiche chemische Zusammensetzung, wie das, das verarbeitet wird, um die Virusreduktion zu testen. Die meisten Medien enthalten in der Tat bis zu 10% fötales Rinderserum als Wachstumsnährsupplement. Bei direkter Verwendung zur Inokulierung des Reinigungs/Verfahrenssystems muß der Forscher folgern, daß entweder (a) jede Wirkung der zugesetzten Gewebskulturkomponenten durch die Verwendung eines kleinen Inokulums auf das Verfahrenssystemverhältnis, d.h. beispielsweise 1:10, minimiert wird, oder daß (b) die Wirkung der zugesetzten Komponenten in jedem Fall vernachlässigt werden kann. Jede dieser Schlußfolgerungen ist nicht akzeptabel, wenn die Überlegung vernünftigerweise vermieden werden kann.
Es gibt weitere technische (und die Versuchsanordnung betrefffende) Einwände gegen die Verwendung von Zellkulturmedien als direkte Quellen für infektiöses HIV. Infizierte Gewebskulturzellen erzeugen bekanntlich (im allgemeinen) Titer an infektiösen Viren (in dem Überstand des Wachstumsmediums) von 10&sup5; bis 10&sup8; TCID&sub5;&sub0; (50% infektiöse Dosis in einem Gewebskulturassay). Die meisten Berichte geben an, daß der untere Wert dieses Bereichs üblicher ist als der höhere Wert. Alle Assaysysteme, die verwendet wurden, um infektiöse Titer nachzuweisen und zu messen, besitzen einen niedrigeren Grad an Detektionsempfindlichkeit. Durch die Definition des TCID&sub5;&sub0;-Assay, der üblicherweise für Viren, die keine Plaques bilden, verwendet werden, beträgt der niedrigste positive Assay ein TCID&sub5;&sub0; pro Volumen Assayprobe. Bei der verwendeten Anwendung und in Abhängigkeit von dem Volumen des untersuchten Testmaterials könnte die Empfindlichkeit des Assays eines jeden Untersuchers von weniger als 10&sup0; bis 10² ID&sub5;&sub0; pro ml Testprobe variieren. (Andere Typen von Assaysystemen wurden für HIV beschrieben. Die meisten veröffentlichten Berichte zeigen eine geringere Empfindlichkeit. Durch Vergleich mit dem Vorstehenden ist eine Empfindlichkeitsgrenze von 10² ID&sub5;&sub0; pro ml Assayprobe für alternative Assayverfahren nicht unüblich).
Es sind dann die verfügbaren Grenzen des Nachweises der Aktivität der Mechanismen zur Virusreduktion zu berücksichtigen. Wenn das als Quelle verwendete Inokulum nicht mehr als einen Titer von 10&sup5; bis 10&sup8; enthält, und das Inokulumvolumen 1:10, bezogen auf die Zusammensetzung für das Testverfahren, beträgt, würde der anfängliche Virustiter für das Reduktionsexperiment nicht höher als 10&sup4; bis 10&sup7; betragen. In Abhängigkeit von der Sorgfalt, die bei der Auswahl eines Assaysystems verwendet wurde, könnte ein abschließender Virustiter, der als "nicht nachweisbar" gilt, 10 infektiöse Viren enthalten. Genau ausgedrückt (ohne unzulässige Betonung, daß der nichtnachweisbare Wert möglicherweise 0 ist) beträgt die Reduktion, die nachgewiesen werden kann, nicht 10² bis 10&sup5; mehr als ID&sub5;&sub0;.
Hier wurde eine andere Versuchsanordnung und Versuchsdurchführung gewählt, um nachzuweisen, daß die erfindungsgemäße Virusreduktion weit stärker ist als diejenige, die von anderen nachgewiesen wurde. Ursprünglich wurde die Auffassung vertreten (Petricciani, J.C., et al., "Case for Concluding That Heat Treated, Licensed, Antihemophilic Factor is Free From HTLV-III", Lancet II: 890-891, 1985) (Hinweis: HTLV- III = HIV-1), daß eine Sicherheitsspane für die Herstellung von Blutprodukten gegen das Konzept des Szenarios vom schlimmsten Fall gemessen werden könnte. Im schlimmsten Fall könnten Gerinnungsfaktorkonzentrate, virale Titer von 2 x 10&sup5; (etwa 5,5 log&sub1;&sub0;) enthalten, wenn keine Behandlung zur Virusreduktion verwendet wurde. Die statistische Behandlung dieser Abschätzung würde nahelegen, daß eine viel höhere Sicherheitsspanne benötigt wird, wenn der Patient 2 x 10&sup5; Dosen oder in etwa in einem Lebenszeitraum erhalten soll, da Gerinnungsfaktoren chronisch verwendete Arzneimittel sind. So sind als eine Gruppe von Beispielen die Reduktionen, die für Modellvirusstudien zitiert werden, wie in dem US. Patent Nr. 4 764 369 (Neurath, et al.), US. Patent Nr. 4 540 573 (Neurath et al.) und dem U.S. Patent Nr. 4 820 805 (Neurath et al.) beschrieben, wobei auf deren Offenbarung hiermit Bezug genommen wird (all diese Druckschriften weisen nur am Rande die gewünschte Sicherheitsspanne, die von Petricciani et al. genannt wurde, nach) unzureichend, eine höhere Sicherheitsspanne nachzuweisen, die für den chronischen Gebrauch benötigt wird. Im vorliegenenden Fall wird das HIV-Virus durch Ultrazentrifugation teilgereinigt und konzentriert, damit es im wesentlichen von den Komponenten des Gewebskulturmediums frei ist. Das Virus wird in einer Pufferzusammensetzung suspendiert, die so ausgewählt ist, daß sie mit den untersuchten Verarbeitungsflüssigkeiten kompatibel ist. Es gibt keine chemische Störung (ausgenommen das Virus), die die vorliegenden Versuche im Vergleich mit der Durchführungsart des Verfahrens verdächtig machen würde. Ein Titer des Konzentrats von 10¹&sup0; bis 10¹² ID&sub5;&sub0; pro ml wird erhalten. Dieses Verfahren läßt sich leicht auf andere Viren anwenden, beispielsweise auf diejenigen, die in dem U.S. Patent Nr. 4 764 369 (Neurath et al.), dem U.S. Patent Nr. 4 540 573 (Neurath et al.) und dem U.S. Patent Nr. 4 820 805 (Neurath et al.) beschrieben sind.
Diese sorgfältige Vorüberlegung für die Versuchsanordnung ist immer noch mit experimentellen Beschränkungen verbunden. Wenn irgendeine Stufe in einem vielstufigen Virusreduktionsverfahren so beachtlich wirksam ist, die Virustiter auf diese viel höhere Grenze zu reduzieren (selbst mit einem Assaysystem, das auf weniger als 10&sup0; empfindlich ist) kann die Gesamtwirksamkeit des vielstufigen Systems nicht in einem einzelnen Versuch untersucht werden. Idealerweise sollte für die beste wissenschaftliche Versuchsanordnung der vor der Durchführung einer einzelnen Verfahrensstufe gemessene Anfangstiter hoch genug sein, daß ein Restvirus nach der Verfahrensstufe vorhanden ist. So kann ein gut definiertes Reduktionsinkrement festgestellt werden. Wenn der Resttiter unzureichend ist, um eine Herausforderung in einer nachfolgenden Stufe darzustellen, und wieder Restviren am Ende der Stufe zu gewährleisten, kann ein definiertes Limit für diese zweite Stufe nicht festgestellt werden. Bei diesem kombinierten Verfahren liefert jede der zwei Verfahrensstufen eine Titerreduktion, die im wesentlichen dem Maximum äquivalent ist, das vernünftigerweise erzielt werden kann, selbst mit der hinzugefügten Vorsicht der Verwendung eines außergewöhnlich angereicherten Viruskonzentrats. In den erfindungsgemäßen HIV-Versuchen werden die anfänglichen Titer, die für die laboratoriumsmäßige Demonstration des Potentials zur Virusreduktion verwendet werden, auf einen vielfachen log&sub1;&sub0;-Überschuß zu dem, was durch eine zufällige Verunreinigung der Proteinszusammenseztungen während der tatsächlichen Praxis der Herstellung von therapeutischen Präparaten erwartet werden könnte, eingestellt. (C.F. Petricciani, et al.). Dies weist eine breite Sicherheitsspanne bei der Durchführung der Erfindung nach und erlaubt eine Extrasicherheitsspanne, die gemäß der statistischen Analyse des chronischen Arzneimittelgebrauchs benötigt wird.
So kann die kombinierte numerische Reduktion der zwei aufeinanderfolgenden Reduktionsstufen, wenn jede unabhängig an der Grenze der Fähigkeit, die Effektivität zu messen, ist, nicht spezifiziert werden, aber die angewendete Redundanz der Virusreduktionsmechanismen mit hoher Wirksamkeit kann vorhergesagt werden. Auf anderen Gebieten wie in der Elektronik wird das Konzept der Redundanz verwendet, um die Zunahme der Sicherheitsspannen eines störungssicheren Arbeitsschritts während des Gebrauchs zu erhöhen. Dieses Konzept wurde nun zuvor für die Gewährleistung der Sicherheit einer Virusübertragung in Plasmaproteintherapeutika erkannt.

BEISPIEL 1

Entfernung von Viren durch Ultrafiltration

Ein gereinigter Faktor IX wurde von PROTHAR chromatographisch auf einer Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern, die für Faktor IX spezifisch sind, erhalten. Das Präparat enthielt etwa 0,065 mg Protein und 8 Einheiten Faktor IX-Aktivität pro ml Lösung. Das gereinigte Präparat wurde unter Verwendung einer Amicon XM300-Membran und eines Drucks von 5 psi ultrafiltriert. Die Ultrafiltration lief sehr rasch ab (etwa 2,5 ml/min). Das Filtrat wurde anschließend erneut durch eine Amicon XM100-Membran filtriert. Die Faktor IX-Aktivität in dem abschließend erhaltenen Ultrafiltrat betrug 67%. Verluste waren nicht das Ergebnis einer Inaktivierung des Faktors IX, da die spezifische Aktivität unverändert war.

BEISPIEL 2

Teil A - Herstellung einer Virusstammlösung

Ein Virusstammkonzentrat wurde durch Infizieren von CEM- Zellen mit einer Infektionshäufigkeit von etwa 1 hergestellt. Die Kulturen wurden in 490 cm²-Corning-Schüttelgefäßen, die etwa 450 ml RPMI 1640-Medium enthielten, das ausreichend ist, da es mit 10% fötalem Rinderserum, Penicillin, Streptomycin und 0,002 mg/ml Polybren suppiementiert ist, angesetzt. Die in den Kulturen nach 4tägiger Infektion erzielte maximale Zelldichte betrug 1 x 10&sup6; Zellen/ml, und zu diesem Zeitpunkt wurden die Kulturen durch die Hälfte frisches Medium verdünnt. Das Gesamtvolumen der Kulturen betrug 1800 ml. Die Inkubation wurde drei weitere Tage fortgesetzt, als eine ausgedehnte Cytopathologie beobachtet wurde. Die Kulturen wurden durch ein 1,2 µm Celluloseacetatfilter filtriert. Das Virus wurde aus dem Filtrat durch 4stündige Zentrifugation bei 61.000 g bei 4ºC zusammengeballt. Das zusammengeballte Virus wurde dann in PBS- Lösung (phosphatgepufferte Kochsalzlösung) resuspendiert. Die Stammlösung enthielt mehr als 10 log&sub1;&sub0; ID&sub5;&sub0; pro ml.

Teil B - Inaktivierung des Virus durch Behandlung mit NaSCN

Der Faktor IX wurde aus der Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern mit 3M NaSCN eluiert und anschließend über Sephadex G10 entsalzt. Ein Milliliter der vorstehenden HIV- Stammlösung wurde mit 20 ml Faktor IX-Lösung vermischt, und 2 ml des so erhaltenen Gemisches wurden zu variierenden Mengen von 6M Natriumthiocyanat (NaSCN) und Puffer (0,01 M Tris-HCL und 0,02 M EDTA, pH 8,0), wie in Tabelle II gezeigt, gegeben, um die geeignete NaSCN-Konzentration zu erhalten. Tabelle II Probe Puffer Endkonzentration an NaSCN
Die Proben A, B, C und D wurden 1 Stunde lang bei 4ºC stehengelassen, und die Probe D wurde 1 Stunde lang bei 25ºC stehengelassen. Jede Probe wurde dann 90 Minuten lang bei 105.000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden in 1 ml PBS resuspendiert und auf HIV durch direkte Beobachtung der cytopathischen Wirkungen des Virus auf die CEM-Zellen untersucht. Das in diesem Beispiel verwendete Assayverfahren rundet inhärent die Titer auf das nächste 0,5 log-Inkrement ab. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III gezeigt. Tabelle III Probe Gesamt-Log&sub1;&sub0;-ID&sub5;&sub0; (gefunden) Log&sub1;&sub0;-Reduktion (infolge der Behandlung)
(Der anfängliche Virustiter betrug für jede Probe vor der Behandlung 9 log&sub1;&sub0;).
Die Ergebnisse zeigen, daß die Natriumthiocyanatbehandlung 8 logs HIV inaktivierte. Sie zeigen weiter, daß Konzentrationen von etwa 1,5 nicht effektiver waren, daß die Verwendung eines Puffers nicht benötigt wurde (siehe Probe C), und daß die Behandlung sowohl bei 4ºC als auch bei 25ºC effektiv war.

BEISPIEL 3

Alternatives Mittel der Verwendung eines chemischen Desinfektionsmittels

Eine Faktor IX-Konzentratlösung, die etwa 1 bis 3 Einheiten Faktor IX pro mg Protein enthielt, wurde mit dem in dem U.S. Patent Nr. 4 786 726 (Smith) beschriebenen monoclonalen Antikörper in Kontakt gebracht. Der gereinigte Faktor IX wird von dem monoclonalen Antikörper mit einem chaotropen Mittel, wie EDTA (Ethylendiamintetraessigsäure) eluiert. Es wird erwartet, daß die so erhaltene Faktor-IX-Lösung gereinigten Faktor IX mit hoher spezifischer Aktivität enthält, und daß die Ausbeute 80 bis 100% beträgt.
Die so erhaltene Faktor-IX-Lösung wird weiter mit dem HIV- Virus in Kontakt gebracht, um einen Endtiter von 8 bis 9 log&sub1;&sub0; des Virus zu erhalten. Natriumthiocyanat wird dem Faktor-IX-HIV-Gemisch zugesetzt, so daß die Endkonzentration an NaSCN etwa 1,5M beträgt, und das Faktor-IX-HIV-Gemisch wird bei einer Temperatur zwischen 4ºC und 25ºC für eine Zeitspanne für 1 bis 2,5 Stunden stehengelassen. Es wird erwartet, daß die Wirksamkeit von Faktor IX durch die Behandlung mit dem Desinfektionsinittel nicht beeinträchtigt wird, und daß der Titer der HIV-Infektiosität auf nicht nachweisbare Spiegel reduziert wird.
Die Lösung wird dann dialysiert, um das chemische Desinfektionsmittel zu entfernen, und dann durch eine Membran mit einer effektiven Porosität, die einem Molekulargewichtsausschluß von 100 KD äquivalent ist, filtriert. Es wird erwartet, daß 80 bis 100% der Faktor-IX-Aktivität wiedergewonnen werden, und daß der HIV-Titer weiter reduziert wird. Es wird auch erwartet, daß unvollständige oder veränderte virale Teilchen von der Faktor-IX-Lösung durch Filtration entfernt werden.
Die Faktor IX-Lösung wird eingeengt, wodurch eine Stärke von etwa 100 Internationalen Einheiten ml erhalten wird, und gegen einen Puffer, bestehend aus 0,066 M Natriumchlorid (NaCl), 0,01 M Histidin, 3% Mannit, pH 7,0 ± 0,2, dialysiert. Bei Durchführung ohne Zugabe des exogenen Testvirus wird diese Lösung steril filtriert (0,1 µm Filter) und lyophilisiert, um ein für die pharmazeutische Verwendung geeignetes Produkt zu erhalten.
Während spezifische Ausführungsformen der Erfindung gezeigt und beschrieben wurden, ist es offensichtlich, daß viele Modifikationen davon gemacht werden können, ohne vom Gehalt und Umfang der Erfindung abzuweichen. Folglich ist die Erfindung nicht auf die vorstehende Beschreibung beschränkt.

Claims

1) Verfahren zur Inaktivierung von Viren in einem Blutprodukt, wobei man das Blutprodukt, das labile Blutproteine und Viren enthält, mit einer wirksamen Menge an Natriumthiocyanat, die Proteine nicht denaturiert, für eine Zeitspanne und bei einer Temperatur, die ausreichen, im wesentlichen alle Viren zu inaktivieren, in Kontakt bringt.

2) Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Menge an Natriumthiocyanat zwischen 0,5 M und 6 M liegt.

3) Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Menge an Natriumthiocyanat zwischen 0,5 M und 2 M liegt.

4) Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Menge an Natriumthiocyanat zwischen 1,5 M und 2 M liegt.

5) Verfahren zur Befreiung eines Blutprodukts, das labile Blutproteine und Viren enthält, von inaktivierten und aktiven Viren, wobei man

(a) das Blutprodukt mit einer wirksamen Menge an Natriumthiocyanat, die Proteine nicht denaturiert, für eine Zeitspanne und bei einer Temperatur, die ausreichen, im wesentlichen alle Viren zu inaktivieren, in Kontakt bringt, und

(b) die inaktivierten und aktiven Viren durch physikalische Mittel von dem Blutprodukt abtrennt.

6) Verfahren nach Anspruch 5, wobei man weiterhin das Blutprodukt aus Stufe (a) dialysiert, um das Natriumthiocyanat vor Abtrennung der inaktivierten und aktiven Viren zu entfernen.

7) Verfahren zur Befreiung eines Blutprodukts, das labile Blutproteine und Viren enthält, von inaktivierten und aktiven Viren, wobei man

(a) das Blutprodukt an einer Affinitätsmatrix mit monodonalen Antikörpern chromatographiert,

(b) das chromatographierte Blutprodukt von der Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern mit einer wirksamen Menge an Natriumthiocyanat, die Proteine nicht denaturiert, eluiert, und

(c) das eluierte Gemisch für eine Zeitspanne und bei einer Temperatur, die ausreichen, im wesentlichen alle Viren zu inaktivieren, stehen läßt.

8) Verfahren nach Anspruch 7, wobei man weiterhin (d) die inaktivierten und aktiven Viren durch physikalische Mittel von dem Blutprodukt abtrennt.

9) Verfahren nach Anspruch 7, wobei man weiterhin das Blutprodukt aus Stufe (c) dialysiert, um das Natriumthiocyanat vor Abtrennung der inaktivierten und aktiven Viren zu entfernen.

10) Verfahren zur Befreiung eines Blutprodukts, das labile Blutproteine und Viren enthält, von inaktivierten und aktiven Viren, wobei man

(a) das Blutprodukt an einer Affinitätsmatrix mit monodonalen Antikörpern chromatographiert, um es zu reinigen,

(b) das chromatographierte Blutprodukt von der Affinitätsmatrix mit monoclonalen Antikörpern mit einem nichtdesinfizierenden Elutionsinittel eluiert,

(c) eine wirksame Menge an Natriumthiocyanat, die Proteine nicht denaturiert, zusetzt, und

(d) das eluierte Gemisch für eine Zeitspanne und bei einer Temperatur, die ausreichen, im wesentlichen alle Viren zu inaktivieren, stehen läßt.

11) Verfahren nach Anspruch 10, wobei man weiterhin

(e) die inaktivierten oder aktiven Viren durch physikalische Mittel von dem Blutprodukt abtrennt.