-
Selbst nach dem Verfahren zur Auswahl des Plasmas eingeführt
worden sind, das als Ausgangsmaterial verwendet wird, ist die
therapeutische Verwendung von Human-Plasmaderivaten nie frei von der Gefahr
einer Übertragung von Viren,. In vielen Fällen wird das
Vorhandensein einer viralen Verunreinigung indirekt durch serologische Marker
(Alanin-Aminotransferase) und durch das Vorhandensein bestimmter
Antikörper (Human-Immunschwächevirus, HIV Typen 1 und 2,
Hepatitis-C-Virus, HCV) bestimmt. Somit ist ein Inkubationszeitraum
notwendig, bevor nachweisbare Mengen dieser indirekten Indikatoren
auftreten. Während dieses Zeitraums nach der Infektion (dem
Zeitfenster) kommt es zu einer übermäßigen Proliferation des Virus. In
Abhängigkeit von der Art des Virus kann diese Virämiephase bis zu 3 bis
6 Monate nach der Infektion andauern.
-
Dank der Empfindlichkeit der existierenden Analyseverfahren können
kontaminierte Einheiten in den ersten Wochen nach der Infektion
(Oberflächenantigen für das Hepatitis-B-Virus: HBsAg) oder innerhalb
weniger Wochen (2 oder 3) oder Monate (1 oder 2) für HIV und HCV
nachgewiesen werden.
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Human-Blutplasmaderivate werden von einer großen Anzahl von
Plasmaspendern, gewöhnlich aus weit mehr als 1000 einzelnen Einheiten,
hergestellt, so daß es eine hohe statistische Wahrscheinlichkeit gibt,
das eine Einheit mit einer hohen Virusbelastung (und einer analytisch
negativen Beladung mit Antikörpern) im "Zeitfenster" enthalten ist
und den gesamten ersten Plasmapool verunreinigt (siehe Alegre Amor,
A.: La transmisión de enfermedades virales por productos sanguineos.
Congreso Hematologia de Granada, Nov. 1994: 175-178).
-
Gegenwärtig wird die direkte Bestimmung eines Virus-Genoms nach
dem Verfahren der Amplifizierung und des Nachweises der
spezifischen DNA, z. B. die Polymerase-Kettenreaktion (PCR), für das
vollständige Endprodukt oder den ersten Pool des zugrundeliegenden
Plasmas angewendet, so daß eine hohe Mindestmenge der
Verunreinigung notwendig ist, um diese nachzuweisen.
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Folglich kann ein negativer PCR-Wert nicht als völliges Fehlen von
Viren interpretiert werden, in der gleichen Weise entspricht ein
positiver Wert nicht notwendigerweise einer Virusinfektiösität.
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Somit gibt es noch gute Gründe für spezifische Schritte, um Viren
während der Prozesse zur Erzeugung und Reinigung von Blutderivaten
zu inaktivieren oder abzuschwächen.
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Bis vor kurzem gab es extensive Veröffentlichungen bezüglich der
Übertragung von infektiösen Mitteln durch Blutderivate, und die
Forschung konzentriert sich weiterhin auf die Überwachung der
Herstellungsverfahren, um zu prüfen, daß Plasmaprodukte virenfrei sind.
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Da ist (aufgrund der Möglichkeit unbekannter Viren) eine absolute
Virenfreiheit nicht erreichbar und angesichts möglicher Fehler oder
Abweichungen von den guten Produktionsstandards (GPC) bei der
Herstellung von Blutderivaten geht der heutige Trend, insbesondere bei
einem spezifischen Schritt der Inaktivierung von Viren oder als
Ergebnis einer Querverunreinigung, dahin, einen zweifach spezifischen
Inaktivierungsschritt in die Produktionsprozesse aufzunehmen, wodurch
die Gefahr der Übertragung von Viren enorm verringert wird (EEC
Guide (CPMP): III/8115/89).
-
In ähnlicher Weise zielen gegenwärtige Empfehlungen der
Gesundheitsbehörden in Hinblick auf die Virenfreiheit darauf, im allgemeinen
für jede Virenart, entweder mit oder ohne externe Lipidhülle, einen
zweiten Inaktivierungsschritt aufzunehmen. In Hinblick auf die
bekannten, im Plasma übertragenen Viren sind die gegenwärtig als die
gefährlichsten erkannten die Human-Immunschwäche- und
Hepatitisviren (insbesondere B und C), die nach bekannten Verfahren inaktiviert
werden können.
-
Spenden können auch mit dem Herpesvirus (HSV und HHV) oder dem
Cytomegalievirus (CMV), dem Epstein-Barr-Virus (EBV) oder dem
Human-Immunoleucopathievirus (HTLV-I/II) verunreinigt sein,
obwohl die Wahrscheinlichkeit, daß diese in das Plasma gelangen,
angesichts der starken Bindung an die Zellen (Leucocyten), die bereits
abgetrennt wurden, nicht vorstellbar ist.
-
Andere Viren, wie der Hepatitis-A- und der Human-Parvovirus (PVH
B19) können im Plasma vorhanden sein - hauptsächlich die
letztgenannte Substanz - da das Auftreten in der Spenderpopulation relativ
hoch ist. Die beiden letztgenannten Viren sind jene, die vom Plasma
übertragen werden, die den größten Widerstand gegenüber einer
Inaktivierung durch physikalische und chemische Mittel zeigen, obwohl sie
als weniger gefährlich als andere angesehen werden, immer
vorausgesetzt, daß die Infektion bei gesunden Patienten auftritt. Der Human-
Parvovirus ist bei Individuen mit herabgesetzter Immunität oder bei
der Behandlung schwangerer Frauen (Gefahr für den Fötus)
möglicherweise gefährlich (siehe Mosquet, N. et al.: Atteinte hematologique
sévere lors d'une infektion à parvovirus B19: Des injections
d'antithrombine III sont-elles à origine de la contamination? Therapie
1994; 49: 459-76).
-
In jedem Fall sollte ein zweiter Inaktivierungsschritt durch andere
bekannte Inaktivierungsverfahren ergänzt werden, die die meisten
resistenten Viren töten können, die nicht mit einer Lipidhülle versehen
sind. Diese Verfahren müssen in Hinblick auf einige dieser Viren oder
Modelle davon überwacht werden.
-
Gegenwärtig basieren die Verfahren zum Eliminieren von Viren, die
auf diesem Fachgebiet beschrieben sind, auf einem physikalischen und
chemischen Mechanismus, der die Verunreinigung durch Inaktivierung
und/oder Fraktionierung verringert. Die meisten heutigen gut
eingeführten Verfahren können in folgender Reihenfolge klassifiziert
werden:
-
- chemische Behandlung mit Lösungsmittel (Tri-n-butylphosphat
und Alkylphosphat-Derivate oder TNBP) und einem Detergens
(Tween-80 oder Polysorbat, Triton X-100 oder nichtionische
oberflächenaktive Derivate), Symbol S/D (siehe Horowitz, B. et al.:
Inactivation of viruses in labile blood derivatives: I. Disruption of
lipid-enveloped viruses by Tri-(n-butyl)phosphate detergent
combinations. Transfusion 1985; 25: 516-522).
-
- Pasteurisieren in einer Flüssigkeit, 10 Stunden bei 60ºC im
Zwischen- oder Endschritt in Gegenwart von Stabilisatoren (siehe
Uemura, Y. et al.: Inactivation and elimination of viruses during
the fractionation of an intravenous immunoglobulin preparation.
Vox. Sang. 1989; 56: 155-61).
-
- Behandlung mit trockener Wärme (trockene HT) im
Zwischenschritt oder in der abschließenden fertigen Ampulle (gewöhnlich)
bei Temperaturen ≥ 80ºC unter längerer Einwirkung (siehe
Knevelman, A. et al.: Effect of Monosaccharides during Severe Dry
Heat Treatment of Coagulation Factor VIII Concentrates. Vox.
Sang. 1994; 66: 96-103).
-
- Nanofiltration oder Filtration der Viren durch Membranen mit
einheitlichen Poren, die kleiner als die Viren sind (siehe Burnouf-
Radosevich, M. et al., Nanofiltration, a New Specific Virus
Elimination Method Applied to High-Purity Factor IX and Factor XI
Concentrates. Vox. Sang. 1994; 67: 132-138).
-
- Die nachstehenden weiteren Verfahren werden seltener oder nicht
mehr angewendet: Behandlung unter trockener Wärme mit
organischen Lösungsmitteln, Inaktivieren mit β-Propiolacton-UV (BPL-
UV), Methylenblau-UV (siehe Wagner, 5. J. et al.: Mammalian
genotoxicity assessment of methylene blue in plasma:
implications for virus inactivation. Transfusion 1995; 35 (5): 407-413),
Behandlung bei einem mäßig sauren pH-Wert (nur auf
Gammaglobulin anwendbar) (siehe Kempf C. et al.: Virus inactivation
during production of intravenous immunoglobulin. Transfusion
1991; 31 (5): 423-27).
-
Im allgemeinen sind diese Verfahren bei der Abschwächung oder
Abtrennung von Viren effizient, obwohl nicht alle das Virus wirksam
eliminieren und keines davon die völlige Abwesenheit oder eine
signifikante Abschwächung aller Virenarten sichern kann. Folglich hat
jedes Verfahren Vorteile und Nachteile.
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Ein Schritt zum Eliminieren von Viren sollte idealerweise
verschiedene Forderungen erfüllen, von denen einige von den gegenwärtig am
häufigsten angewendeten Inaktivierungsverfahren nicht erfüllt werden.
Diese Forderungen sind folgende:
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1. Wenn eine Anzahl von Inaktivierungsverfahren bei dem gleichen
Reinigungsverfahren angewendet wird, sollte diese über
unterschiedliche Mechanismen wirken. Zum Beispiel bilden
physikalische Verfahren (Inaktivieren oder Fraktionieren) gute
Kombinationen mit chemischen Verfahren (Inaktivieren).
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2. Die Verfahren sollten gegen jede Virenart aktiv sein.
Inaktivierungsverfahren haben eine begrenzte oder keine Wirkung auf
Viren mit einer besseren physikalischen und chemischen
Beständigkeit, wie Viren ohne eine Lipidhülle (die Behandlung mit S/D ist
bei diesen Viren ineffektiv oder hat bei BPL-UV oder Methylenblau-UV
und einer Behandlung mit trockener Wärme bei
Temperaturen unter 80ºC einen geringeren Effekt). Das Pasteurisieren
ist im Prinzip ein wirksames Verfahren, um irgendeine Virenart
zu inaktivieren, seine Wirkung geht jedoch aufgrund des
Schutzmechanismus der Viren verloren, wenn die Konzentration der
Stabilisatoren oder des Proteins sehr hoch ist, so daß eine
Verminderung im Falle der meisten wärmebeständigen Viren in Medien
nicht signifikant ist, die hohe Konzentrationen von Stabilisatoren
und/oder Proteinen enthalten.
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Die Filtration der Viren durch eine Membran verringert jede
Virenart unabhängig von ihrer physikalischen und chemischen
Beständigkeit, hängt jedoch von der Größe der Viren im Verhältnis
zu den Poren der Membran ab. Folglich können die kleinsten
Viren nicht vollständig eliminiert werden, und unvorteilhafterweise
sind die meisten davon ohne eine Lipidhülle (Human-Parvovirus,
Hepatitis-A- und Poliovirus).
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3. Das Verfahren darf keine biologische Inaktivierung oder
Denaturierung der Proteine hervorrufen, oder dieser Effekt muß
sehr gering sein und darf in keinem Fall zu Materialien mit einer
Antigenreaktion führen. Einige chemische
Inaktivierungsverfahren führen zu einer chemischen Änderung in den Proteinen (BPL-
UV), und in ähnlicher Weise führt die Wärmebehandlung, trocken
oder flüssig (Pasteurisieren), fast immer unvermeidlich zu einer
gewissen Denaturierung der Proteine, entweder des betreffenden
Moleküls oder der begleitenden kontaminierenden Proteine.
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4. Möglicher Einschluß im letzten Schritt. Die chemische
Inaktivierung ist im letzten Schritt schwierig, das beruht auf der
notwendigen Abtrennung der verwendeten chemischen Reagenzien (S/D,
BPL, Thiocyanat), abgesehen vom Inaktivierungsverfahren mit
Methylenblau (es sollte auch daran erinnert werden, daß Nebenprodukte
dieser Reaktion nicht völlig unschädlich sind). Einige
Pasteurisierungsverfahren werden aufgrund der anschließend
notwendigen Eliminierung des denaturierten Materials und/oder der
verwendeten Stabilisatoren auch in einem Zwischenschritt
durchgeführt. Die Behandlung mit trockener Wärme wird häufig in der
letzten Phase oder bei der fertigen Ampulle angewendet.
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Die Nanofiltration ist im allgemeinen in der abschließenden
fertigen Mengenlösung in der Weise eingeschlossen, daß bei
bestimmten Anwendungszwecken eine anschließende Manipulation
nicht notwendig ist.
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5. Es darf aufgrund des Inaktivierungsschrittes (chemische
Reagenzien) keinerlei toxische Rückstände geben. Die meisten
chemischen Behandlungen erfordern anschließend Schritte, um diese
Reagenzien wirksam zu beseitigen. Die maximalen zulässigen
Grenzwerte sollten in Abhängigkeit von der Toxizität der
chemischen Verunreinigung und der Häufigkeit der Verabreichung des
Präparats festgelegt werden (wie in den bereits genannten Fällen
mit S/D, BPL und Thiocyanat). Inaktivierungsverfahren (durch
Erwärmen) oder Fraktionieren (Nanofiltration) sind natürlich
ohne diese Nachteile.
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6. Das Verfahren sollte im industriellen Umfang möglich sein, und
die Prozesse sollten vollständig reproduzierbar sein und einer
Überwachung der bekannten Parameter unterzogen werden
können, die sich leicht einstellen lassen. Die chemische Inaktivierung
erfolgt zusätzlich zur Temperatur und Dauer des Einflusses durch
Konzentrieren der Produkte (Proteine, Salze, Stabilisatoren und
chemische Reagenzien). Gelegentlich können jedoch einige nicht
kontrollierte Parameter den Verbrauch dieser Inaktivierungsmittel
erleichtern (wenn eine chemische Reaktion erfolgt), oder die
Ausgangslösung für die Inaktivierung kann sich unter nicht reproduzierbaren
Bedingungen befinden (Vorhandensein von Partikeln
und Sedimenten usw.). Die Inaktivierung durch Behandlung mit
trockener Wärme (fertige Ampulle) hängt vom Restfeuchtegehalt
der Ampullen ab, der von Charge zu Charge leicht schwanken
kann, so daß dieser Parameter nicht angemessen überwacht
werden kann.
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7. Einfache Verfahren werden bevorzugt, die keine ergänzenden
Reinigungsschritte erfordern. Wie bereits im vorstehenden Punkt
5 erwähnt, erfordert die chemische Inaktivierung nachfolgende
Schritte, um toxische Reagenzien zu beseitigen. Außerdem
beeinflußt sie jene Pasteurisierungsverfahren, die zum Schutz des
Proteins eine starke Stabilisierung erfordern (Pasteurisieren von FIX,
FVIII, ATIII, α1-PI, IM oder IV Gammaglobulinen usw.).
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8. Die Inaktivierungsverfahren müssen sich in industriellem Umfang
und in Hinblick auf die verwendeten Materialien und Reagenzien
bei akzeptablen Kosten durchführen lassen. Die Nanofiltration
stellt einen Fall dar, bei dem die Ausrüstung nach einmaliger
Verwendung weggeworfen wird, und die Produktivität in Gramm
Protein pro Stunde und pro Flächeneinheit ist gering, und somit
ist die industrielle Anwendung auf niedrige Produktionsraten von
Proteinen begrenzt.
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Schließlich ist die Inaktivierung von Viren ohne eine Lipidhülle
weiterhin Gegenstand zahlreicher Untersuchungen mit dem Ziel, die
Wirksamkeit neuer Verfahren beim Abtöten von Viren und die Sicherheit
der Inaktivierung in Hinblick auf eine mögliche Änderung des
behandelten Proteins darzustellen (siehe Highsmith, F. A. et al.: Inactivation
of lipid-enveloped model viruses in normal human plasma by
crosslinked starch-iodine. Transfusion 1994; 34: 322-327).
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Wie bereits festgestellt, sind der Human-Parvovirus (PVH B19) und
der Hepatitis-A-Virus die hauptsächlichen Viren ohne eine Lipidhülle,
die im Human-Plasma oder in Blutderivaten übertragen werden.
Folglich sollte sich die Entwicklung eines zweiten Inaktivierungsschrittes
hauptsächlich auf die Verringerung dieser Viren richten.
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Die Übertragung des Human-Parvovirus und von Hepatitis A wurde bei
hämophilen Patienten durch die Verabreichung von AHF, das
ausschließlich mit S/D inaktiviert worden war, nachgewiesen. Es gibt
auch Beschreibungen einer Infektion mit dem Human-Parvovirus durch
Infusion von AHF, das durch Pasteurisieren inaktiviert wurde. Es
wurde auch nachgewiesen, daß das Pasteurisieren von Proteinen in
stabilisierten Medien bei hohen Konzentrationen Viren ebenfalls
schützt, und die Verringerung der Infektiösität ist bei den Viren PVH
B19 und HAV nicht signifikant.
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Es gibt kürzlich veröffentlichte Beschreibungen einiger
Komplikationsfälle beim Fötus nach der Verabreichung von Präparaten mit
Antithrombin III an Schwangere (siehe Mosquet, N. et al.: Atteinte
hematologique severe lors d'une infection à parvovirus B19: Des injections
d'antithrombine III sont-elles à origine de la contamination? Therapie
1994; 49: 459-76). Diese Fälle beruhen auf der Verunreinigung mit
dem Human-Parvovirus, der angesichts des Verhältnisses zwischen
Risiko und Vorteil und einer möglichen alternativen Behandlung selbst
einen Grund für eine Kontraindikationsbehandlung darstellt.
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Die hauptsächliche Aufgabe der Erfindung besteht in einer effizienten
Inaktivierung von Viren mit oder ohne eine Lipidhülle in einem
Medium, das Proteine aus biologischen Fluiden enthält, durch
virustötende Behandlung bei einem extrem alkalischen pH-Wert unter
Bedingungen, bei denen die Proteine durch den vom stabilisierenden Mittel
bereitgestellten Schutz nicht denaturiert werden.
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Die hier angegebene Einführung erhärtet andererseits die Anwendung
bestimmter Inaktivierungsverfahren, wie den doppelten
Inaktivierungsschritt, um das Risiko einer Virenübertragung zu
vermindern. Diese Einführung zeigt auch die Anforderungen an ein
ideales Inaktivierungsverfahren, sie zeigt, daß dies weiterhin eine
Aufgabe in diesem Fachgebiet darstellt und Gegenstand der Forschung
ist. Diese Einführung beschreibt auch einen Fall einer spezifischen
Kontraindikation bei der Verabreichung von Blutderivaten
(Antithrombin III), wenn die Schritt der Verminderung von Viren ohne
Lipidhülle nicht eingeschlossen sind.
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Der gegenwärtige Stand der Technik erreicht die grundsätzlichen
Aufgaben der Erfindung in Hinblick auf eine wirksame, kostengünstige
Eliminierung von Viren ohne Lipidhülle, hauptsächlich im Falle von
Produkten, die aufgrund des erwarteten Vorhandenseins von
resistenten Viren (Human-Parvovirus) im Endprodukt kontraindizierend sind
(Antithrombin III) nicht (siehe Mosquet, N. et al.: Atteinte
hematologique severe lors d'une infection à parvovirus B19: Des injections
d'antithrombine III sont-elles à origine de 1a contamination? Therapie
1994; 49: 459-76).
-
In ähnlicher Weise gibt es bisher keine Beschreibung oder
Dokumentation eines Inaktivierungsverfahrens bei extremem (alkalischem) pH-
Wert, das direkt für Proteine für die therapeutische Verwendung
gedacht ist. Es ist nur die potentielle Fähigkeit von Laugen bekannt,
einige Viren zu töten, so daß dieses Verfahren als
Desinfektionsverfahren in Chromatographiekolonnen, Ultrafiltern und einer anderen
wiederverwendbaren Ausrüstung benutzt wurde, um eine
Querkontamination zwischen den Chargen zu verhindern, das Verfahren wurde
jedoch noch nie für die Virusinaktivierung von Plasmaproteinen
benutzt, die bei einer Therapie intravenös eingesetzt werden.
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Die Möglichkeit der Inaktivierung bei einem extrem alkalischen pH-
Wert beruht auf der Stabilität des Proteins und der Schutzwirkung, die
durch das in dieser Erfindung beschriebene Verfahren erreicht wird.
Dieses Verfahren basiert im allgemeinen auf dem
Wirkungsmechanismus auf Proteine und ist völlig neu und hat wie bereits erklärt
Indikationen, die gegenwärtig durch keines der beschriebenen Verfahren
abgedeckt werden.
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Die einzigen vorhergehenden Veröffentlichungen betreffen die
Anwendungen der Virusinaktivierung bei Gammaglobulin bei einem
mäßig sauren pH-Wert (pH = 4), und unterscheiden sich deshalb von
dieser Erfindung, mit dem Inkubieren bei einer Temperatur von 37ºC und
der synergistischen Wirkung proteolytischer Enzyme (Pepsin), was zu
einer wirksamen Verringerung einiger Viren führt (siehe Kempf C. et
al.: Virus inactivation during production of intravenous
immunoglobulin. Transfusion 1991; 31 (5): 423-27).
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In Infektiösität instabiler Viren wird unter anderen Bedingungen bei
einem mäßig saurem pH-Wert (pH = 4,25) und im Endprodukt
(Gammaglobulin und Maltose) während einer 20-tägigen Inkubation bei
21ºC wirksam verringert, es gibt jedoch keine wirksame Verringerung
der Viren ohne eine Lipidhülle.
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Die Hauptaufgabe der Erfindung (Inaktivieren von Viren ohne eine
Lipidhülle) wurde jedoch bis jetzt noch nicht befriedigend gelöst, und
das Verfahren zur Lösung dieser Aufgabe (Inaktivieren bei einem
extrem alkalischen pH-Wert in Gegenwart eines Stabilisators), das bis
jetzt noch nicht für diesen Zweck eingeführt wurde, verleiht dieser
Erfindung insgesamt etwas absolut Neues.
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Die Erfindung basiert auf der Fähigkeit, Viren (mit oder ohne
Lipidhülle) bei extremen pH-Bedingungen des Mediums zu inaktivieren.
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Ergebnisse zur Inaktivierung von Viren in einem mäßig sauren
Medium und in Gegenwart säurestabiler Proteine (Gammaglobulin)
durch den Zusatz von Mineralsäure (Chlorwasserstoffsäure bzw.
Salzsäure) oder schwacher Säuren (Zitronensäure, Essigsäure usw.)
wurden bereits veröffentlicht. Wie beschrieben, wird im Falle stärker
empfindlicher Viren, hauptsächlich jener mit einer Lipidhülle (Human-
Herpesvirus und Leukämievirus X-I bei Mäusen) eine deutliche
Inaktivierung erreicht. Um eine signifikante Verringerung von Viren
bei pH = 4 zu erreichen, muß die Protein-Lösung oberhalb der
Umgebungstemperatur (37ºC) inkubiert werden, womit folglich die
Modellviren mit einer Lipidhülle völlig inaktiviert werden, abgesehen
vom Virus für vesikuläre Stomatitis (VSV) der weiterhin infektiös
bleibt.
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Die Inaktivierung in der Kälte (4ºC) ist für die meisten Viren nicht
effektiv, so daß eine Inkubation bei 37ºC mit dem sauren pH-Wert
synergistisch wirkt (siehe Kempf C. et al.: Virus inactivation during
production of intravenous immunoglobulin. Transfusion 1991; 31 (5):
423-27).
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Es gab auch bereits Beschreibungen über die Inaktivierung von Viren
in der fertigen Ampulle mit Gammaglobulin bei pH = 4,25 (mit dessen
Maltose-Arzneimittelträger) innerhalb von 20 Tagen bei 21ºC, diese
zeigen, daß Viren mit geringerer physikalischer und chemischer
Beständigkeit völlig inaktiviert werden, die stärkr resistenteren Viren
ohne Lipidhülle jedoch nicht (Virus-40 vom Affen, Reovirus-3).
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Die Resistenz bestimmter Viren, wie Poliovirus oder Hepatitis A,
gegenüber einem sauren Medium ist ebenfalls bekannt und beschrieben
worden (siehe Roberts, Peter L. et al.: Removal and Inactivation of
Enveloped and Non-enveloped Viruses during the Purification of a
High-Purity FIX by Metal Chelate Affinity Chromatography. Vox.
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Sang. 1994; 67 (1): 69-71). In diesen Fällen beträgt die Verringerung
der Infektiösität praktisch null.
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In Hinblick auf die Inaktivierung in einem basischen Medium gibt es
im Stand der Technik eine Beschreibung der virustötenden
Wirksamkeit einer Desinfektion der Ausrüstung (Säulen, Ultrafilter usw.) mit
alkalischen Lösungen, wodurch eine Querkontamination zwischen den
behandelten Chargen verhindert wird (siehe Grun, Janet B. et al.: Viral
Removal/Inactivation by Purification of Biopharmaceuticals. Bio-
Pharm 1992; 5 (9): 22-30), obwohl das Verfahren noch nie für die
spezifische Virusinaktivierung von Proteinen für die therapeutische
Verwendung unter extremen pH-Bedingungen angewendet worden ist.
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Die Forschung dieser Erfinder hat die virustötende Wirkung von
alkalischen Hydroxiden bei einem extremen pH-Wert ohne die
Anwesenheit von Proteinen oder anderen Stabilisatoren oder
Arzneimittelträgern gezeigt. Die bei Viren mit oder ohne eine Lipidhülle erhaltenen
Ergebnis zeigen eine hohe virustötende Wirksamkeit gegenüber beiden
Virusarten. Folglich können sowohl der Polio-A-Virus (ein Modell für
Hepatitis A) als auch der Parvovirus vom Hund (ein Modell für dessen
homologe Human-Verbindung) inaktiviert werden.
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Das erfindungsgemäße Verfahren bei einem extrem alkalischen pH-
Wert basiert auch auf einem anderen Wirkungsmechanismus als die
Inaktivierung durch Pasteurisieren, so daß diese Verfahren
möglicherweise hinzugefügt werden und einander ergänzen können.
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Die Möglichkeit der Inaktivierung von Viren in Gegenwart von
Proteinen bei einem extremen pH-Wert hängt weitgehend von der Stabilität
der Proteine im Medium ab. Einige Proteine haben eine größere
strukturelle Stabilität in einer basischen pH-Zone, so daß das
erfindungsgemäße Verfahren hauptsächlich auf diesen Typ von mäßig
stabilen Proteinen, wie Inhibitoren von Serin-Protease und verwandte Enzyme,
gerichtet ist, aus denen wir Antithrombin (ATIII), α1 des
Protease-Inhibitors (α1-Antitrypsin) und Human-Albumin herausgreifen
(dessen Struktur in gewisser Weise den Molekülen der Serin-Protease-
Inhibitoren ähnelt).
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Für die Inaktivierung bei einem extrem alkalischen pH-Wert müssen
die Proteine stabilisiert werden, damit eine Denaturierung vermieden
wird.
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Verschiedene Verbindungen zum Stabilisieren von Proteinen wurden
allgemein beschrieben, wobei das übliche Ziel darin bestand, die
Molekülintegrität während der Schritte der Inaktivierung durch
Pasteurisieren oder während der Wärmebehandlung zu erhalten und die
biologische Aktivität im abschließenden Endprodukt, entweder in einer
flüssigen oder einer gefriergetrockneten Formulierung, beizubehalten.
Die große Anzahl der verwendeten Verbindungen gehört in die
folgenden Hauptgruppen:
-
- Zucker, Alkoholzucker und Polyole (Saccharose, Maltose,
Manitol, Sorbitol, Dextrine, Polyethylenglycol usw.)
-
- Aminosäuren (Lysin, Glycin, Histidin, Arginin usw.)
-
- Proteine (Albumin) und
-
- organische Säuren oder deren Salze (Caprylat, Citrat, EDTA usw.)
Als Arzneimittelträger wurden auch anorganische Salze in
physiologischen Konzentrationen verwendet, wobei das einzige Ziel darin
bestand, eine angemessene Isotonie und Löslichkeit zu erreichen
(hauptsächlich im Falle der gefriergetrockneten Formulierung), wobei die
Hauptsubstanzen Natriumchlorid, Natriumphosphat usw. sind.
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Der spezifische Fall der Stabilisierung von Proteinen bei einem
extremen pH-Wert für den Zweck der Virusinaktivierung wurde vor der
vorliegenden Erfindung noch nicht berührt. Es wird deshalb
angenommen, daß die bereits beschriebenen allgemeinen Verfahren anwendbar
sind.
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Diese Verfahren schützen die zu inaktivierenden Proteine jedoch nicht
ausreichend.
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Als Ergebnis der Untersuchungen dieser Erfinder wurde es möglich,
Proteine zu stabilisieren, ohne daß externe Mittel eingeführt werden,
die möglicherweise toxisch sind oder sich schwer eliminieren lassen,
wobei das Ziel darin besteht, die Inaktivierung bei einem alkalischen
pH-Wert zu erreichen.
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Die Theorie der Stabilisierung von Proteinen durch die Behandlung bei
einem extremen pH-Wert beruht auf der hypothetischen hydrophoben
Wechselwirkung der Proteine und der Änderung der Molekülgröße
(Falten) durch die reversible Wirkung von hohen Konzentrationen von
Salzen (wie Natriumchlorid) in der Lösung. Diese Kontraktion der
Moleküle durch die Abstoßung von Ladungen (Lösungsmittel) trägt
zum Erhalt der biologisch aktiven Regionen bei, die dadurch ergeben,
daß ein größerer Einfluß auf die stärker wasserabweisenden Zonen
ausgeübt wird.
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Die stabilisierenden Mittel können irgendeine Art von anorganischen
Salzen, insbesondere polyionische, sein, die das Medium mit einer
ausreichenden Ionenladung versehen können (z. B. Ammoniumsulfat,
Natriumchlorid usw.).
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Andererseits ist die Möglichkeit der gleichzeitigen Stabilisierung von
Viren geringer, wenn die Ionenstärke zunimmt, da die äußere Hülle
von starren Protein- oder Lipoproteinstrukturen gebildet wird und
deshalb nur eine geringe Möglichkeit hat, sich durch Kontraktion und
Hydrophobie selbst zu schützen.
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Die Erfindung beschreibt ein Verfahren zum Inaktivieren von Viren in
Protein-Lösungen mit einem im allgemeinen extremen basischen pH-
Wert, die für die anschließende therapeutische Verwendung stabil sind
und humanen oder tierischen Ursprungs sind oder durch
DNA-Rekombinationsverfahren erhalten werden.
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Die Inaktivierungsbehandlung wird im allgemeinen in der letzten
Phase des Herstellungsverfahrens angewendet, so daß eine mögliche
Gefahr einer restlichen Verunreinigung der vorangegangenen Schritte
vermieden wird. Es ist auch bevorzugt, Fraktionen mit ausreichender
Reinheit zu verwenden, um eine unnötige Fällung oder Abtrennung
nach der Behandlung zu vermeiden.
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Die folgenden nichtbegrenzenden Anwendungsbeispiele der Erfindung
betreffen Proteine, wie Antithrombin (ATIII),
α1-Proteinase-Inhibitoren (α1-PI) oder Serumalbumin.
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Die zugrundeliegende, löslich gemachte Protein-Lösung -fraktion kann
durch Cohn-, Cohn-Oncley- oder Kistler-Nischmann-Fraktionierung
mit Ethanol in der Kälte, oder mit Polyethylenglycol, Octansäure,
Ionenaustausch oder Affinitätschromatographie oder irgendein anderes
Verfahren erhalten werden, das ausreichend reine Fraktionen für die
Inaktivierungsbehandlung bei einem extremen alkalischen pH-Wert
ergibt.
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Der erste Schritt besteht im Löslichmachen des Proteins und
vorzugsweise in der Verminderung von Arzneimittelträgern und Salzen, falls
diese in signifikanten Mengen vorhanden sind. Es ist auch notwendig,
in der Protein-Lösung vorhandene, mögliche Denaturierungsmittel
(z. B. Ethanol) zu eliminieren oder deutlich zu verringern. Das wird
durch ein Gelfiltrationsverfahren mittels Molekülausschlußharzen
(kommerzielle Produkte: Sephadex, Sepharose, Sephacryl, Ultragel,
Sephacel usw.) oder vorzugsweise durch ein Diafiltrationsverfahren
mit Wasser durch Ultrafiltrationsmembranen mit einer molekularen
Porengröße für 1 bis 50 kD (Pellicon-Modell, von Millipore) erreicht,
wobei dies von der Größe des Proteins abhängt. Ein anderes Verfahren
ist eine herkömmliche Dialyse mit Nitrocellulose, Cellophan- oder
Cuprophan-Membranen (Produkt: I DEL M-11), bis die dialysierte
Lösung vorzugsweise einen Osmolalitätswert von weniger als 300
mOsm/kg hat, obwohl dieser Wert nicht einschränkend ist, wenn der
Wert der Ionenstärke der Protein-Lösung von der erforderlichen
zugesetzten Stabilisatormenge abgezogen wird.
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Für die Injektion wird die Lösung dann geeignet mit Wasser auf eine
Proteinkonzentration von 25 bis 0,001% (wobei dies von der
Löslichkeit des betreffenden Proteins abhängt), vorzugsweise von 5 bis 0,1%,
wobei dies vom zu inaktivierenden Protein abhängt, verdünnt.
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Die Lösung wird auf eine Temperatur zwischen 0 und 45ºC,
vorzugsweise zwischen 2 und 4ºC eingestellt, wobei dies vom Protein
abhängt.
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Die Menge des neutralen oder nicht-neutralen ionischen Salzes von
0,005 Mole bis zur Sättigung (ein Chlorid oder Sulfat von
Alkalimetallen oder das Ammoniumion oder alkalische Salze von Carbonsäuren
usw.) wird der Lösung zusammen mit vorzugsweise 1 bis 4 Mol/kg der
tatsächlichen Lösung des Natriumchlorids, allein oder in Mischung mit
anderen Salzen, die der Lösung eine ausreichende Ionenstärke
verleihen können, zugesetzt. Die Arzneimittelträger oder Stabilisatoren, die
einen Teil der abschließenden Produktzusammensetzung bilden,
können falls erforderlich gleichzeitig mit den anderen bestimmten
Substanzen zugegeben werden, wobei immer vorausgesetzt wird, daß sie
gegenüber dem extremen pH-Wert während der Behandlung resistent
sind.
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Wenn die Protein-Lösung stabilisiert ist, wird unter Rühren eine
Alkalimetallhydroxidlösung (vorzugsweise 0,001 m bis zur Sättigung)
oder eine andere alkalische Lösung zugesetzt, die mit dem Protein
kompatibel ist, und das Medium bietet die ausreichende Konzentration
der Hydroxylionen und kann die Lösung auf einen pH-Wert zwischen
10,0 und 14,0, vorzugsweise zwischen pH = 12 und 13 bringen. Die
Temperatur der Lösung wird zwischen 0 und 45ºC vorzugsweise
zwischen 2 und 4ºC gehalten.
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Der pH-Wert kann mit irgendeinem kommerziellen pH-Meßgerät
eingestellt werden (von Crison, Hanna hergestellt), vorher sollte jedoch
eine exakte Einstellung mit einem Borat-Puffer bei pH = 10,00
erfolgen.
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Entsprechend der Behandlung bei einem extremen pH-Wert und einer
kurzen Einwirkung ist die Einwirkungszeit während der Behandlung
möglichst gering, kürzer als oder gleich 100 Stunden und länger als
die Inkubation über 1 Sekunde, vorzugsweise zwischen 1 und 60
Minuten.
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Nach der exakten Inkubationszeit wird die Lösung sofort auf pH < 10
gebracht, indem vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure zugesetzt oder
vorzugsweise eine andere starke oder schwache Mineralsäure oder
organische Säure zugesetzt wird oder irgendein anderes System benutzt
wird, das den pH-Wert fast bis zur Neutralität oder auf den
gewünschten Wert verringern kann.
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Die Protein-Lösung kann dann dialysiert und für die fertige
Formulierung eingestellt werden, wobei vorzugsweise sterilisierte
Wegwerfkartuschen für die Dialyse verwendet werden (1 DEC M-11 oder eine
äquivalente) oder indem Ultrafiltrationsmembranen, vorzugsweise 1
bis 50 kD (Pellicon-Modell, von Millipore) verwendet werden, wobei
eine ausreichende Dialyselösung mit einer für die gewünschte fertige
Formulierung geeigneten Zusammensetzung verwendet wird, um die
Ionenstärke der Lösung geeignet zu verringern.
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Die eingestellte Mengenlösung kann durch Filtration mit einer 0,22
um Membran sterilisiert und anschließend für die Darreichung in
flüssiger Form in Ampullen verteilt oder falls geeignet gefriergetrocknet
werden.
Beispiele dieser Erfindung
Beispiel 1
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Die Wirksamkeit der Alkalibehandlung für die Inaktivierung von Viren
wurde getestet, indem 1 ml eines Viruskonzentrats bei einer
Temperatur von 4ºC in 19 ml einer 0,1 n Natriumhydroxidlösung geimpft
wurde, was zu einem pH-Wert zwischen 12,5 und 13 führte.
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Zu den in der Tabelle 1 angegebenen Zeitpunkten wurden nach dem
Neutralisieren mit einer Säure Proben für die Züchtung von Zellen
entnommen.
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Die geprüften Viren waren der Herpesvirus vom Rind oder BHV
(Virus mit einer Lipidhülle) und das Parvovirus vom Hund oder CPV und
der Human-Poliovirus Typ 2 (beide Viren ohne Lipidhülle). Die
Zählungen erfolgten durch den zytopathischen Effekt bei der Züchtung der
Zellen (TCID&sub5;&sub0;).
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
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Die alkalische Inaktivierungsbehandlung führt bei den drei geprüften
Viren zu einer deutlichen Verringerung der Viren (≥ log) und kann
deshalb als spezifischer Inaktivierungsschritt angesehen werden.
Beispiel 2
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Die Virusüberwachung des Inaktivierungsschrittes erfolgte nach dem
erfindungsgemäßen Verfahren. Das wurde durchgeführt, indem zwei
unterschiedliche Viren, und zwar der Herpesvirus vom Rind und der
Parvovirus vom Hund, geprüft wurden.
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Das zu inaktivierende Protein war endgereinigtes Antithrombin III
(Charge Nr. 5139) mit einer spezifischen Aktivität von mehr als 7
IE/mg Protein und einer Proteinkonzentration von 0,8%. 45,1 g der
Lösung von Antithrombin III wurden für jeden zu prüfenden Virus
entnommen, und 8,7 g Natriumchlorid-Stabilisator, 0,81 g
Trinatriumcitratdihydrad bzw. 1,06 g Manitol wurden in der angegebenen
Reihenfolge als Arzneimittelträger zugesetzt. Nach jeder Zugabe wurde
das gemischte Produkt löslich gemacht. Dann wurde die Lösung in einem
Wasser/Eis-Bad auf 1,0 ± 0,5ºC abgekühlt, wobei weiterhin 4,5 g
der Impfung von jedem Virus zugesetzt wurden, und nach dem
Mischen eine Probe mit 10 g entnommen wurde. Es wurden 1,75 ml 2 n
Natriumhydroxid zugesetzt, so daß der pH-Wert der Lösung 12,50 ±
0,05 betrug. Nach einer einstündigen Behandlung unter diesen
Bedingungen wurde jeder Assay neutralisiert. Das erfolgte durch Einführen
von 1,55 ml 2 n Chlorwasserstoffsäure und Prüfen, daß der pH-Wert
zwischen 6, 7 und 6,9 lag.
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Die abschließenden Proben jedes Assays wurden in den
entsprechenden Wachstumszellen gezüchtet, um die Verringerung der Infektiösität
mengenmäßig zu erfassen, die durch dieses Verfahren erreicht wurde.
Die Zählung erfolgte mit einem zytopathogenizitäts-Assay TCID&sub5;&sub0;.
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Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 2 aufgeführt.
Tabelle 2
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Die bei der Verminderung der Viren erhaltenen Werte sind für die
beiden untersuchten Viren signifikant (≥ log). Im spezifischen Fall des
Parvovirus vom Hund ist der Verminderungswert praktisch der gleiche
wie ohne Protein und Stabilisatoren (Beispiel 1), wobei die restliche
Infektiösität unter der Meßgrenze liegt (8,0 · 10² Einheiten).
Beispiel 3
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Um das durch die Behandlung bei einem extremen pH-Wert
inaktivierte Produkt zu kennzeichnen, wurde das erfindungsgemäße
Verfahren durchgeführt, bis ein fertiges, gefriergetrocknetes Produkt erhalten
wurde (Antithrombin III).
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Das Ausgangskonzentrat von Antithrombin III mit 85,3 g, das durch
doppelte Affinitätschromatographie (Charge 0,5/l)gereinigt worden
war, mit einer optischen Dichte (A&sub2;&sub8;&sub0; nm) von 4,20 und einer
Aktivität von 43,1 IE/ml wurde mit Natriumchlorid stabilisiert, wobei 3
Mol/l der tatsächlichen Lösung zugesetzt wurden.
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Dann wurde die Lösung mit geeigneten Arzneimittelträgern mit einem
Anteil von 20 g Trinatriumcitratdihydrat bzw. Manitol pro Liter der
Ausgangslösung eingestellt. Danach wurde die Lösung in einem
Wasser/Eis-Bad abgekühlt und während des gesamten Prozesses bei 3 ±
1ºC gehalten. Danach wurde 2 n Natriumhydroxid zugesetzt, bis der
pH-Wert 12,50 ± 0,02 betrug (pH-Meßgerät Crison, mit Borat-Puffer
bei pH = 10,00 geeicht). Dem einstündigen Inkubieren folgte das
Neutralisieren mit 2 n Chlorwasserstoffsäure, bis der pH-Wert nahezu
neutral war.
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Die inaktivierte Viruslösung wurde in einer aseptischen
Ultrafiltrationskartusche mit einem Molekülquerschnitt von 10 kD bis zu einem
konstanten Volumen diafiltriert (Modell TFF PrepScale, 2,5 sq. ft.,
von Millipore), wobei insgesamt 5 Volumina der Dialyse-Pufferlösung
verwendet wurden, die Natriumchlorid, Natriumcitrat und Manitol
enthielt. Die entstandene Lösung wurde auf die entsprechende Stärke
eingestellt und durch eine 0,22 um Membran steril filtriert und in
Ampullen verteilt, die dann gefriergetrocknet wurden.
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Das fertige Endprodukt wurde gekennzeichnet, um irgendwelche
möglichen Molekülveränderungen zu zeigen.
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Der während der Alkalibehandlung vom Stabilisator (Natriumchlorid)
gelieferte Schutz wurde deutlich gemacht, indem die
Wiederherstellung der Aktivität und die spezifische Aktivität während des
Inaktivierungsschritts bestimmt wurden. Die erhaltenen Werte sind in der
folgenden Tabelle 3 gezeigt.
Tabelle 3
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Das Endprodukt wurde auf der Basis von Tests gekennzeichnet, die
dessen Funktionalität bestätigen:
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Heparin-Affinität (Heparin-Harz Sepharose 6FF) Ausgeschlossen (keine Affinität) = 3%
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Eluiert = 90%
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Immunoelektrophorese
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mit Heparin gekreuzt langsame Formen (geringe Affinität = 4,2%
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Molekulargewichtsverteilung HPLC Aggregation (Polymere) = 3,6%
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Elektrophorese
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(Celluloseacetat/Amidschwarz Bande α&sub2; = 99,6%
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spezif. Aktivität IE/m gesamtes Protein = 7,9
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(*) Molekulargewichte: SDS-PAGE = 58,500 (einzelne Bande)
Bedingungen der Verringerung = 68,500 (einzelne Bande) (2-ME)
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(*) Elektrofocus (isoelektrischer Punkt) = 4,98 grundsätzliche Bande
4,90 zweite Bande
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(*) Die Ergebnisse waren für das gereinigte ATIII in der fertigen
Ampulle die gleichen - mit oder ohne erfindungsgemäße
Inaktivierungsbehandlung
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Die nachstehende Tabelle 4 zeigt einen Vergleich der Stabilität der
Lösung von Antithrombin III aus den gefriergetrockneten Ampullen,
das mit Wasser wiederhergestellt worden war, innerhalb der gleichen
Produktionscharge mit und ohne Inaktivierung.
Tabelle 4 Vergleichende Stabilität des ATIII in Lösung bei 25ºC
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Als abschließende allgemeine Zusammenfassung zeigten all diese
Assays keine strukturelle oder funktionelle Änderung des
Proteinmoleküls.
Beispiel 4
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Die Schutzwirkung von Natriumchlorid und anderen Verbindungen
wurde durch eine Inaktivierungsbehandlung bei unterschiedlichen
Konzentrationen des Stabilisators in Gegenwart von Antithrombin III
dargestellt, indem die Wiederherstellung der biologischen Aktivität
bestimmt wurde (chromogene Substratmethode).
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Fraktionen mit 5,00 g wurden einer Lösung des gereinigten
Antithrombins III aus einer einzigen Produktionscharge (Nr. 305690)
entnommen, und zunehmende Mengen der folgenden Stabilisatoren -
Natriumchlorid, Natriumcitrat und Manitol - wurden wie in Tabelle 5
angegeben zugesetzt. Die stabilisierte Lösung wurde in einem Wasser/Eis-
Bad auf 2 bis 4ºC abgekühlt, danach erfolgte die Zugabe von 2 n
Natriumhydroxid, bis der pH-Wert 12,50 ± 0,05 betrug. Unter diesen
Bedingungen wurden die Proben 1 Stunde inkubiert und danach mit 2 n
Chlorwasserstoffsäure auf pH = 7,0 ± 0,2 neutralisiert. Die
Wiederherstellung der Aktivität von Antithrombin III in diesen Proben wurde vor
und nach der Inaktivierungsbehandlung bestimmt.
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Die Ergebnisse der Wiederherstellung sind in der folgenden Tabelle 5
gezeigt.
Tabelle 5
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Die Ergebnisse zeigen die Schutzwirkung von Natriumchlorid oder
Gemischen davon mit kleineren Mengen anderer Salze, wie
Natriumcitrat, die dem Protein eine ausreichende Stabilität verleihen können.
Die optimale stabilisierende Zusammensetzung ist die, die die
Aktivität von ATIII erhält und eine minimale Schutzwirkung auf die Viren
ausübt. Das wird erreicht, wenn die geringstmögliche Konzentration
der Stabilisatoren verwendet wird, die den Virus nicht schützen (Natriumchlorid).
Die optimale Zusammensetzung entspricht der, die durch
den Zusatz von 175,5 g Natriumchlorid pro Liter der tatsächlichen
Lösung (oder 3 Mole Salz) oder noch besser durch die Zugabe zu den
bisherigen 20,0 g Trinatriumcitratdihydrad (0,067 Mol/l der
tatsächlichen Lösung) erhalten wird.
Beispiel 5
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Dieses Beispiel zeigt die Möglichkeit, das gleiche Verfahren
anzuwenden, um andere Proteine in der Gruppe zu inaktivieren, die
Inhibitoren von Serin-Protease-Enzymen, wie α1 Anti-Trypsin (oder α1
PI) umfaßt.
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Dafür wurde die Schutzwirkung von Natriumchlorid in Hinblick auf
den Protease-Inhibitor (α1 PI) getestet, indem die Wiederherstellung
seiner Aktivität gegen Elastase bei unterschiedlichen
Stabilisatorkonzentrationen überwacht wurde.
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Die gereinigte Ausgangslösung von α1 PI (spezifische Aktivität 1,05
IE/ml: A&sub2;&sub8;&sub0; nm) hatte eine Aktivität gegen Elastase von 8,8 IE/ml.
Fraktionen dieser Lösung mit 20,0 ml wurden entnommen und
stabilisiert, indem der Lösung zunehmende Mengen Natriumchlorid zugesetzt
wurden. Nach dem Auflösen wurde die Substanz in einem Wasser/Eis-
Bad auf eine Temperatur zwischen 2 und 4ºC abgekühlt, und die Viren
wurden inaktiviert, indem 2 n Natriumhydroxid zugesetzt wurde, bis
der pH-Wert 12,50 ± 0,05 betrug. Nachdem unter diesen Bedingungen
1 Stunde inkubiert worden war, wurden die Proben durch direkte
Zugabe von 2 n Chlorwasserstoffsäure neutralisiert. Es wurden Proben
der inaktivierten Fraktionen entnommen, und es wurden deren
Aktivität gegen Elastase, deren spezifische Aktivität und deren
Wiederherstellung bestimmt.
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Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle 6 aufgeführt.
Tabelle 6
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Bei Konzentrationen von 2 und 4 Mol/l hat Natriumchlorid eine
merkliche Schutzwirkung (Werte > 100% Wiederherstellung und
spezifische Aktivität > 1,5 IE/ml: A&sub2;&sub8;&sub0;).
Beispiel 6
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Es wurden andere Proteine untersucht, deren Molekülstruktur den
Inhibitoren der Serin-Protease-Enzyme ähnlich ist. Albumin stellt ein
nichtbegrenzendes Beispiel dieser Proteingruppe dar.
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Das Verfahren bestand aus einer alkalischen Inaktivierungsbehandlung
des gereinigten stabilisierten Human-Albumins für eine intravenöse
Injektion. Zwei Lösungen mit 2 bzw. 5% Proteinen wurden aus der
gleichen, bei 5% eingestellten Albuminlösung (Caprylat und
Tryptophanat) hergestellt, indem mit einer physiologischen Salzlösung (0,9
%) verdünnt wurde. Die 2%ige Lösung wurde in zwei Fraktionen
aufgeteilt, einer davon wurden 3 Mole/l Natriumchlorid zugesetzt. Alle
Lösungen wurden dann in einem Wasser/Eis-Bad auf eine Temperatur
von 2 bis 4ºC abgekühlt. Durch den Zusatz von 2 n Natriumhydroxid
wurden die Lösungen auf pH = 12,50 ± 0,05 gebracht, sie wurden 1
Stunde unter diesen Bedingungen inkubiert und danach mit 2 n
Chlorwasserstoffsäure auf pH = 7,0 ± 0,2 neutralisiert.
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Danach wurde die Probe mit der höchsten Salzkonzentration in einer
Cuprofan-Kartusche (Produkt 1 DEL M-11) mit der Lösung der
Stabilisatoren (Caprylat und Tryptophanat) mit der gleichen Konzentration,
die die Albuminlösung enthielt, dialysiert, wobei die Ionenstärke
ausreichend auf einen physiologischen Wert verringert wurde. Nach der
Einstellung der Ionenstärke wurden die Lösungen durch Ultrafiltration
(TFF PrepScale, von Millipore) mit einer 10 kD Membran auf 5%
Protein konzentriert. In jedem Assay wurden erneute Einstellungen der
Konzentrationen der Stabilisatoren, des Proteins (5%), der Isotonie
(0,15 m Natriumchlorid) und des pH-Wertes von 7,0 ± 0,2 der Proben
vorgenommen. Der letzte Schritt war eine Filtration durch eine sterile
0,22 um Membran (PVDF, von Millipore) in 50 ml Ampullen, die dann
10 Stunden bei 60 ± 0,5ºC pasteurisiert wurden.
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Proben der Lösung und einer Kontrolle (ohne
Inaktivierungsbehandlung) wurden bei jeder Protein- und Salzkonzentration der Assays
entnommen. Die Molekülzusammensetzung (Molekülverteilung HPLC)
und die Stabilität des Endproduktes wurden ausgewertet.
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Die Ergebnisse sind in Tabelle 7 aufgeführt.
Tabelle 7
Beispiel 7
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Es wurden der Bereich der pH-Werte, bei denen eine
Virusinaktivierung möglich war, und die Einflußzeit bestimmt.
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Eine Ausgangslösung von gereinigtem Antithrombin III (spezifische
Aktivität > 6 IE/mg Protein) wurde bei unterschiedlichen pH-Werten,
Temperaturen und Einflußzeiten inaktiviert, indem den Lösungen 2 n
Natriumhydroxid zugesetzt wurde, nachdem sie mit Natriumchlorid
und -citrat stabilisiert worden waren. Dann wurden die Lösungen
neutralisiert, und es wurden Proben entnommen, um deren ATIII-Aktivität
zu überwachen. Die Wiederherstellung der Aktivität wurde nach jeder
Behandlung berechnet.
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Die exakten Bedingungen des Verfahrens und die Ergebnisse sind in
der folgenden Tabelle 8 aufgeführt.
Tabelle 8