DE69711230T2

DE69711230T2 - Biologisch aktive substanzen, verfahren zur herstellung und sie enthaltende zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69711230T2
Application number: DE69711230T
Authority: DE
Inventors: Gilles Gutierrez; James Norton; Mostafa Serrar; Lionel Viornery
Original assignee: INOVAT SARL TUNIS TUNIS
Current assignee: INOVAT SARL TUNIS TUNIS
Priority date: 1996-12-27
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 2002-11-14
Anticipated expiration: 2017-12-23
Also published as: FR2757863A1; US6737086B2; AP1085A; DK0948340T3; DE69711230D1; AP9901599A0; FR2757863B1; US20020102317A1; JP2001508424A; EP0948340B1; PT948340E; ES2174328T3; WO1998029128A1; EP0948340A1; AU726744B2; AU5667598A; ATE214612T1

Description

Die vorliegende Erfindung ist auf dem Gebiet der Biochemie und insbesondere auf dem Gebiet biologischer Verbindungen pflanzlichen Ursprungs angesiedelt.
Die vorliegende Erfindung betrifft neue, biologisch aktive Substanzen, die aus der Schale von Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel extrahiert werden, das Verfahren zu ihrer Gewinnung und die pharmazeutischen, kosmetischen und/oder der Ernährung dienenden Mixturen, in denen sie enthalten sind.
Die erfindungsgemäßen Mixturen sind dazu bestimmt, die Synthese der Hitzeschockproteine (oder Stress-Proteine) der Zellen von Lebewesen zu beschleunigen und zu verstärken. In der Tat sind die Bedingungen von Stress oder von Stressbelastung dergestalt, dass sie die Qualität der Proteinsynthese beeinflussen. Die Eucaryoten haben dazu geführt, solche Stoffwechselschritte zu entwickeln, die dazu bestimmt sind, ihre Struktur zu erhalten.
Die Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel gehören hauptsächlich zu den Familien der Cactaceae, der Crassulaceae und der Saxifraga, welche die einzige Gesamtheit bilden, die imstande ist, diesen Stoffwechseltyp zu entwickeln.
Diese Pflanzen sind besonders für strenge klimatische Bedingungen geeignet und besitzen einen besonderen Chlorophyll-Stoffwechsel, der es ermöglicht, einen Kohlenstoffzyklus einzubringen und der CAM (= Crassulacae Acid Metabolismus) genannt wird.
Manche Pflanzen können unter Stressbedingungen gedeihen (das ist insbesondere der Fall bei Pflanzen in den ariden Zonen von heißen oder kalten Wüsten oder in den Höhenzonen) und haben einen hinsichtlich des Einbaus von CO&sub2; besonderen Stoffwechsel, der CAM genannt wird. Die Pflanzen der Familie der Cactaceae, der Crassulaceae und der Saxifraga sind an diese Bedingungen des Hitzeschocks gut angepasst. Die Synthese der biologischen Substanzen, die das Ausschütten der Hitzeschockproteine aktivieren oder verstärken, ist besonders stark in der Frucht bei ihrer Ausbildung ausgeprägt. Das Reifen der Frucht erfolgt vorrangig in einer Zeitspanne der Rückkehr auf eine normale Temperatur. Die Frucht ist stark der Wärme ausgesetzt. Es gibt allen Grund zu der Annahme, dass sie über Mittel zum Schutz ihrer Proteinsynthesen verfügt.
Diese Schutzmaßnahme könnte sich auch in anderen lebenden Arten wiederfinden.
Unter den Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel sind besonders die Cactaceae anzuführen. Die Cactaceae bilden eine Familie derjenigen zweikeimblättrigen Pflanzen, die gewöhnlich Kakteen genannt werden und wegen ihrer seltsamen Formen und ihrer leuchtenden farbigen Blüten sehr geschätzt sind. Eine der am weitesten verbreiteten Gattungen der Familie der Cactaceae wird von den Opuntien gebildet. Die Opuntia ficus-indica oder Echter Feigenkaktus (Familie der Cactaceae) besteht aus abgeplatteten Teilen ovaler Form, den "Tennisschlägern", deren Oberfläche mit Warzenhöfen übersät ist. Jeder von ihnen enthält einen schlafenden vegetativen Punkt, der durch Sohlen, mit Stacheln besetzten Haaren oder Widerhakenstacheln (kennzeichnendes Merkmal der Gattung), durch Dornen geschützt ist. Sie bilden somit das Homologe zu den Knospen. Auf den jungen Trieben sind die Warzenhöfe durch kleine fleischige Blätter, die schnell abfallen, blattachsenständig angeordnet.
Das Wachstum und die Vermehrung der lebenden Organismen lassen eine starke Autonomie vermuten nicht nur hinsichtlich der Wiederherstellung des genetischen Materials als Garant für den Fortbestand der Art, sondern auch für die Reparatur der Bindungen ihres Körpers, um ihre Integrität zu erhalten. Diese beiden Erfordernisse erinnern an biologische Komplementärsysteme.
Es wurden bereits unterschiedliche Mechanismus entdeckt, die von den Zeilen zur Absicherung des Erhalts der genetischen Erbmasse benutzt werden. Als Beispiel kann das System des Proteins P 53 angeführt werden. Außerdem gibt es Mechanismen zur Absicherung der strukturellen Konformität der Proteine, die aus der Überschreibung der im Genom enthaltenen Informationen dargestellt wurden. Diese Mechanismen zum Schutz der Synthesen benutzen verschiedene Verfahren, darunter das der Synthese von dem, was man "Hitzeschockproteine" nennt, auch wenn sie nicht einzig und allein der Art und Weise entsprechen, die für den Hitzestress spezifisch ist.
Der Ausdruck Stress muss im weiten Sinne gefasst werden: Er enthält den Stress aus verschiedenen Ursachen ungeachtet dessen, ob es sich um eine Temperaturerhöhung (daher der Name Hitzeschockprotein), um oxidativen Stress, um UV-Bestrahlung, Viren- oder Bakterieninfektionen handelt, oder um solchen Stress, der die konsekutive Folge von verschiedenen Stimuli ist wie eines Entzugs der Ernährungsgrundlage, einer mechanischen Belastung oder eines Stoffwechselschocks. Daher werden die Hitzeschockproteine von Zellen chemisch aufgebaut, um auch auf Angriffe chemischen (Gifte usw.) physikalischen (ionisierende Strahlungen, Osmolarität, pH-Wert, ...), biologischen (Cytokone) oder mechanischen Ursprungs gut reagieren zu können.
Die Hitzeschockproteine (HSP) sind Proteine, die die Aufgabe haben, die Zelle und insbesondere ihre Proteinsynthesen vor Belastungen jeglichen Ursprungs zu schützen.
Mit dem Alter nehmen die Fähigkeiten zur Proteinsynthese beträchtlich ab, und auf Grund dieser Tatsache nimmt die Fähigkeit, auf eine Stressbelastung zu reagieren, immer mehr ab. Das hat den Tod zahlreicher Zellen, den Mangel an Schutz und eine Abnahme des Zellbestandes zur Folge, was sich insbesondere beim Fell der Säugetiere in einer Abnahme der Anzahl der für den Schutz der Lederhaut verfügbaren Keratinocyten ausdrückt. Die Zeit, die Exposition der Sonne und die Temperaturänderungen induzieren Belastungen, die für die Zellen eine Belastung darstellen. Die Haut des jungen erwachsenen Menschen ist besonders gut geeignet, auf die Stressbelastung zu reagieren, denn sie ist imstande, große Mengen an Hitzeschockproteinen zu bilden, um die Konfiguration der Proteine im Laufe der Synthese zu schützen. Mit dem Alter nehmen die Fähigkeiten zur Synthese der Hitzeschockproteine ab.
Der Sonnenschutz der Haut ist eine der Sorgen mit der höchsten Nachfrage seitens der Verbraucher und der stärksten Empfehlung seitens derer, die sie verschreiben. Die Veränderlichkeit der schützenden Ozonschicht, das Verlangen nach sommerlichen Wärme, die Möglichkeiten der Reisen in die Tropen haben die Gefahr des Auftretens von Schwierigkeiten mit der Haut, welche die Sonnenexposition und die Hitzebelastung als Ursache haben, beträchtlich erhöht. Heute besteht der Schutz von UV- und IR-Strahlung in den verschiedenen Möglichkeiten der Filterung oder der Reflexion, aber es gibt kein Erzeugnis, das auf die Haut aufgetragen werden kann, um sie vor Hitze oder übermäßiger Kälte zu schützen.
Der Körper benutzt die Hitzeschockproteine, um Schäden zu verhindern, die durch zahlreiche Arten von Belastungen induziert werden. Dazu gehören Belastungen von außen (Licht- und Wärmestrahlung, chemische oder biologische Verbindungen), aber auch aus dem Innern kommende Belastungen (Hyperthermie, Hypotonie, Veränderung der biologischen Parameter wie beispielsweise die Osmolarität, die Konzentration an bestimmten Substanzen usw.)
Die Hitzeschockproteine werden auch Stressproteine, Schockproteine oder in der angelsächsischen Ausdrucksweise "Hitzeschockprotein" genannt. In der wissenschaftlichen Terminologie werden sie mit HSP bezeichnet, während sie von manchen noch Haubenproteine und von die anderen "Glukosegesteuerte Proteine" (GRP) genannt werden.
Die Hitzeschockproteine (HSP) sind um eine sehr große Anzahl von Molekülen gruppiert. Um ihre Bezeichnung zu vereinfachen, ist man auch übereingekommen, sie spezifisch nach ihrem Molekulargewicht festzulegen, das in Kilodalton (kDa) ausgedrückt wird. Man unterscheidet daher unterschiedliche Gruppen von HSP: die HAP 110 (110 kDa), die HSP 90 (90 kDa), die HSP 70 (70 kDa), die die größte Familie der HSP ausmacht, die HSP 60 (60 kDa), die HSP 47 (47 kDa) und die HSP mit der kleinsten Größe (zwischen 16 und 40 kDa).
Die Hitzeschockproteine bilden eine große Molekülfamilie, die Einfluss auf die Erhaltung der räumlichen Konfiguration der Proteine hat. Daher zeigen bei einer Erhöhung der Temperatur die Proteine eine abgewandelte räumliche Struktur (es handelt sich um dieselbe Erscheinung wie bei der Koagulation von Albumin im sauren Milieu).
Die große Anzahl von HSP stammt aus der Tatsache, dass sie mit einer Spezifizität wirken, die vom Zelltyp, ihrer Bestimmung oder noch von der Art des Stress abhängt. Daher hat jedes Mitglied der Familie der HSP eine sehr genaue Funktion, und die Eingreifpunkte sind sehr zahlreich. Die HSP werden nicht nur in den der Übertragung folgenden Etappen, wo das Einschreiben in eine normale Funktion der Synthese und des Lebens der Proteine erfolgt, eingesetzt wie beispielsweise das Eintragen der Konfiguration und ihres Transports, sondern auch während des Ereignisses, das die Proteinsynthese verändert, indem in die Auswahl der Stoffwechselwege eingegriffen wird: Wiederherstellung, Zerstörung und Eliminierung der modifizierten Substanzen. Manche HSP haben eine Wirkung, die sich bei einer thermischen Belastung entwickelt, andere spielen ihre Rolle nur beim Vorhandensein einer chemischen Gefährdung.
Es gibt daher eine große Anzahl von Schockproteinen, von denen jedes an einen besonderen Schutzmechanismus angepasst ist.
Diese Substanzen, von ihrer Natur her Proteinsubstanzen, sind durch Gene kodiert, für die die Chromosomenlokalisierung nur für einige aufgestellt ist. Es muss angemerkt werden, dass diese Substanzen über ihre gesamte Phylogenese im Zustand einer völlig konstanten Art gehalten werden sowohl auf der Ebene der Aufeinanderfolge als auch der Funktion, was besagt, dass die Folgen der Stimulierung oder von Abänderungen der Synthese sich nicht nur bei den menschlichen Zellen, sondern zweifellos bei den Zellen aller Tierarten wiederfinden.
Auch wenn die HSP 70 auf konstitutive Weise aufgebaut werden, um den Belastungen zu widerstehen, bauen sich die Zellen im Bedarfsfall aus großen Mengen dieser Proteine auf. Es ist daher möglich, Zellen mit Proteinsubstanzen zu behandeln, um ihre Lebensfähigkeit angesichts von Stress zu verbessern. Man kann also auf die Verbesserung der Lebensfähigkeit von Zellen dadurch Einfluss nehmen, dass man diese Substanzen entweder ihrem Nahrungsmilieu zugibt oder direkt dem Innern der Zellen. Dank der Erfindungskunst auf genetischem Gebiet oder der Molekularbiologie wurde ihre Wirkung untersucht, indem man die Gene, die für die HSP eine Kodierung darstellen, vektorisiert hat.
Die Techniken der Zugabe weisen zahlreiche Nachteile für die mehrzelligen Organismen auf:
- Es ist nicht möglich, die betroffenen Zellen zielgerichtet auszusuchen;
- die Substanz kann in der extrazellularen Umgebung zerstört werden;
- es ist nicht möglich, ein Protein an zahlreiche Zellen heranzubringen.
Die Techniken der Molekularbiologie weisen auch größere Nachteile auf:
- Die große Anzahl der HSP und ihre Spezifik machen die Arbeitsgänge schwierig, zahlreich und ermüdend;
- die Verstärkung des Genom-Kodierers führt zu einem Kurzschluss der Regelungen;
- es ist heutzutage nicht möglich, die Synthese des Proteins zu steuern;
- bei der Gentransfection ist das Protein ungeachtet der Umstände stets überbewertet.
Die Erzeugung der HSP durch Einführung der Überschreibung (Synthese der ARNm aus der ADN) oder der Überführung (Synthese der Proteine durch Ribosome aus den ARNm) ist möglich, wenn man über pharmakologische Substanzen verfügt, die entweder auf der Stufe der Plasmamembran oder im Zellplasma oder gar auf der Stufe des Kerns wirken.
Die Anmelderin hat an Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel und insbesondere in der Frucht der Pflanzen der Familie der Cactaceae Substanzen gefunden, die geeignet sind, die Proteinsynthesen zu schützen. Nach Durchführung verschiedener Forschungsarbeiten hat sie auf eine sehr überraschende Art entdeckt, dass diese Substanzen von den tierischen Zellen erkannt wurden.
Die vorliegende Erfindung hat neuartige, nicht zytotoxische Substanzen mit biologischer Wirksamkeit besonders auf den Stoffwechsel der HSP, die aus den Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel wie beispielsweise den Pflanzen der Familie der Cactaceae, der Crassulaceae und der Saxifraga isoliert werden, zum Gegenstand.
Die vorliegende Erfindung betrifft insbesondere die Substanzen, die aus der Schale der Früchte dieser Pflanzen der Familie der Cactaceae und insbesondere aus der Schale der Früchte der Opuntie und insbesondere der des Echten Feigenkaktus gewonnen werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch noch ein Verfahren zur Gewinnung der biologisch wirksamen, nichttoxischen Substanzen, die aus den Pflanzen mit CAM- Stoffwechsel isoliert werden.
Das Verfahren zur Gewinnung der nichttoxischen biologisch aktiven Substanzen ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Frucht einer Pflanze mit CAM- Stoffwechsel erst einer Trocknung und dann einer Dehydratisierung unterzieht, denen eine Auslaugung mit einem polaren organischen Lösungsmittel folgt, um einen organischen Extrakt der Frucht zu erhalten, den man mit Wasser verdünnt, wonach man den verdünnten Extrakt durch Behandlung mit Hexan reinigt, die hexanhaltige organische Fraktion abtrennt und sie im Vakuum bis zur Trockne eindampft, so dass man die aktive Fraktion der Frucht der Pflanze mit CAM- Stoffwechsel erhält, nämlich diejenige, welche die besagten biologisch aktiven Substanzen enthält. Die aktive Fraktion wird noch getrocknet und gegebenenfalls mit einem biologisch verträglichen Lösungsmittel wie beispielsweise Ethanol oder mit einem je nach den gewünschten Arbeitsgängen geeigneten Lösungsmittel aufgenommen.
Man benutzt die Frucht der Pflanze mit CAM-Stoffwechsel und insbesondere die Schale der Frucht der Pflanzen der Familie der Cactaceae. Die Frucht der Pflanze mit CAM-Stoffwechsel ist eine Frucht der Pflanze der Familie der Cactaceae und insbesondere die Frucht der Opuntie und ganz speziell die Feige des Echten Feigenkaktus.
Aus der Patentschrift DE 16 17 409 geht hervor, dass die Kladoden der Opuntia indica, d. h. die blattähnlichen abgeplatteten Zweige bereits in der Therapie benutzt worden sind, insbesondere als antivirales, nicht zytotoxisches Mittel, das äußerlich verabreicht wird.
In der bisherigen Literatur liegt jedoch nichts vor, woraus man den Schluss ziehen könnte, dass die Früchte und insbesondere die Schalen der Früchte der Opuntie einen aktiven Bestandteil enthalten, der Einfluss auf die Synthese der HSP hat.
Im Schrifttum findet man auch keine Informationen über die Tatsache, dass die aus der Schale der Frucht der Opuntia indica extrahierten Substanzen geeignet sind, die Synthese der HSP in Zellkulturen oder in den Zellen von Lebewesen in vivo oder in vitro zu beschleunigen und zu verstärken.
Das Verfahren zur Gewinnung der aktiven Substanz/en ist noch durch die Tatsache gekennzeichnet, dass man die Schale der reifen oder der unreifen Frucht benutzen kann, wobei die Schale der Frucht durch Schälen, Aushöhlen oder Zerkleinern der Frucht gewonnen werden kann.
Das polare organische Lösungsmittel, welches man im Verfahren zur Gewinnung benutzt, ist vorzugsweise ein Lösungsmittel, das aus den aliphatischen Alkoholen und den aliphatischen Ketonen aussucht, die mit Wasser mischbar sind, wie beispielsweise Ethanol und/oder Aceton. Die direkte Extraktion der Pflanze durch ein wenig oder nicht polares Lösungsmittel kann auch eine Alternative darstellen, die ein Zusammenstoßen mit einem polaren Lösungsmittel einschließt.
Die erfindungsgemäßen nicht zytotoxischen, biologisch aktiven Substanzen, die aus den Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel wie beispielsweise den Pflanzen der Familie der Cactaceae, der Crassulaceae und der Saxifraga isoliert werden, und besonders diejenigen, die aus der Schale der Früchte der Opuntie und ganz speziell der Feige des Echten Feigenkaktus isoliert werden, zeigen sehr interessante pharmakologische Eigenschaften insbesondere hinsichtlich des Stoffwechsels der HSP, und finden in der Therapie, in der Kosmetik und/oder in der Lebensmittelbranche Verwendung.
Diese nicht zytotoxischen Substanzen, die aus den Pflanzen mit CAM- Stoffwechsel wie beispielsweise denen der Cactaceae, der Crassulaceae und der Saxifraga extrahiert werden, wirken auf die Zellen der Gewebe oder der Lebewesen in der Weise, dass sie die Synthese der Hitzeschockproteine (HSP) beschleunigen und/oder verstärken, wenn die Zelle einem Stress oder verschiedenen Belastungen ausgesetzt wird, welche die Synthese der Hitzeschockproteine bewirken.
Es ist wichtig darauf hinzuweisen, dass diese Substanzen nicht zytotoxisch sind; denn die Mehrzahl der zytotoxischen Substanzen induziert eine Verstärkung der Hitzeschockproteine (HSP).
Die Substanzen der vorliegenden Erfindung sind dazu bestimmt, die Zellen von Gewebe oder von Lebewesen zu behandeln, um ihre Widerstandsfähigkeit gegenüber Stress oder anderen Belastungen, welche die Synthese der Hitzeschockproteine hervorrufen, zu verbessern und/oder die Folgen von Stress oder verschiedenen Belastungen, welche die Synthese der Hitzeschockproteine induzieren und welche die Synthese der Proteine abändern, zu behandeln.
Ganz allgemein sind die erfindungsgemäßen Substanzen dazu bestimmt, jegliche Folge eines durch Stress oder eine Belastung der Zellen hervorgerufenen Symptoms zu verhüten und/oder zu behandeln.
Diese Substanzen finden in einem sehr weiten Bereich der Therapie, der Kosmetik und/oder der Lebensmittelbranche Verwendung.
Die erfindungsgemäßen Substanzen sind daher einsetzbar bei der Verhütung und/oder Behandlung der Folgen von vaskulären Ischämien; Fibrosen der Haut (Keloiden), der Lunge und der Leber; von chirurgischen Eingriffen (Sekundärwirkungen infolge der Behandlung unter Einsatz von Chemotherapie, ionisierenden Strahlungen oder Strahlentherapie usw.), des Klimakteriums; von Belastungen durch freie Radikale, von mechanischen Verletzungen, Überstrecken eines Muskels, der Haut (Schwangerschaftsstriemen); von mechanischen Reibungen (Pferde, Geschirrzeug, Schuhe, Kleidungsstücke usw.), von Wärme und Fotonenstrahlung und bei der Vermeidung von Gefahren, die mit der therapeutischen Tätigkeit, mit der Verschlimmerung von bestimmten Krankheiten (virale Hepatitis, Krebs, diverse Infektionen, degenerative Erkrankungen mit apoplektischen Erscheinungen ...), mit bestimmten beruflichen Tätigkeiten wie beispielsweise denen der Feuerwehrleute oder Personen, die Ionisierenden Strahlungen ausgesetzt sein können, sowie dem Tauchen und anderem im Zusammenhang stehen.
Zu diesem Zweck werden eine oder mehrere erfindungsgemäße Substanzen, die aus der Schale der Früchte der Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel wie beispielsweise den Pflanzen der Familie der Cactaceae, der Crassulaceae und der Saxifraga und insbesondere aus der Schale der Früchte der Opuntie und ganz speziell der Feige des Feigenkaktus isoliert werden, einzeln oder in Kombination oder im Gemisch mit einer oder mehreren aktiven Grundstoffen mit ergänzender Wirkung sowie mit einer Grundmasse oder einem inerten nichttoxischen Trägermaterial, das für den vorgesehenen Einsatz geeignet ist, zur Herstellung von pharmazeutischen, kosmetischen und/oder der Ernährung dienenden Mixturen verwendet.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch noch die Verwendung einer oder mehrerer biologisch aktiver Substanzen, um die Synthese der Hitzeschockproteine in Zellkulturen zu beschleunigen und zu verstärken.
Die erfindungsgemäßen Mixturen werden daher in Form von ummantelten oder nicht ummantelten Tabletten, Dragees, Kapseln, Säften, Pulvern zum Einnehmen oder für die äußerliche Anwendung, von Zusatzmixturen für die postoperative Vernarbung, für Brandwunden und für Verletzungen, von Zäpfchen; von Lösungen oder Suspensionen für Injektionen, die auf Ampullen abgezogen sind; von Salben, Gelen oder Pommade dargestellt.
Die ergänzenden aktiven Grundstoffe, die sich für derartige Verabreichungen und für derartige Mixturen eignen, sind beispielsweise Sonnenlichtfilter, Antiseptika, Antibiotika, Analgetika usw.
Die für derartige Verabreichungen und für derartige Mixturen geeigneten Grundmassen sind Hilfsmittel für die Herstellung (Bindemittel, Verflüssiger usw.), Geschmacksstoffe, Farbstoffe und Stabilisatoren usw.
Für den Gebrauch in der Therapie, der Kosmetik und/oder der Lebensmittelbranche wird der Gehalt an aktivem Grundstoff (nämlich an den erfindungsgemäßen biologisch aktiven Substanzen) nach dem Äquivalent an pflanzlichem Trockenmaterial abgestuft, und zwar von 10 · 10&supmin;³ mg/ml bis 400 mg/ml, insbesondere jedoch von 0,1 mg/ml bis 200 mg/ml und vorzugsweise von 0,5 mg/ml bis 100 mg/ml pro Probeneinheit.
Die tägliche Dosierung unter Berücksichtigung der Applikationsart ist gestaffelt von 0,1 mg/kg bis 200 mg/kg pro Tag je nach der Indikation von therapeutischer, von kosmetischer Seite und/oder von der Seite der Lebensmittelbranche sowie der Art der Verabreichung.
Da die Pflanze und der Trockenauszug nicht toxisch sind, wird die obere Grenze der Verabreichung lediglich durch das Aufnahmevermögen, die Löslichkeit, die biologische und pharmazeutische Verfügbarkeit oder aber noch durch die Wirkung im Zusammenhang mit mindestens einem weiteren aktiven Grundstoff, der in der Pflanze vorhanden ist, und unabhängig von der aktiven Fraktion festgelegt.
Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung. Diese Beispiele werden unter Bezug auf die beigefügten Abbildungen beschrieben.

BEISPIEL 1

Verstärkung der Synthese von HSP 90 bei Fibroblasten, die einer thermischen Behandlung ausgesetzt sind

Die Hitzeschockproteine (HSP) sind für die Erhaltung der Synthese der Proteine bei einer äußeren Belastung unerlässlich. Die Verstärkung der Synthese der HSP bietet die Möglichkeit, die Zelle beispielsweise im Augenblick einer Temperaturerhöhung besser zu schützen.
Im Rahmen der nachfolgend beschriebenen Experimente wurden Substanzen untersucht, die geeignet sind, die Synthese der HSP 90 bei einer Erhöhung der Temperatur auf 43ºC zu verstärken, ohne die Synthese dieses Moleküls bei 37ºC (Normalbedingungen) zu induzieren, um die eventuelle Erzeugung von HSP durch eine toxische Substanz zu auszuschließen.
Die weiter unten untersuchte Substanz stammt aus einem alkoholischen Auszug, der aus der Schale der Früchte der Opuntia ficus-indica oder Echter Feigenkaktus erhalten wurde. Diese Substanz wird nachfolgend mit 'OE' bezeichnet, was 'Opuntienextrakt' oder Auszug aus der Opuntie bedeutet.
Um dies durchzuführen, wurden 100 g dehydratisierten Pflanzenmaterials oder dehydratisierter Frucht oder noch 1 g dehydratisierter Fruchtschale mit dem Zehnfachen ihres Gewichts an polarem organischem Lösungsmittel behandelt. Vom erhaltenen Auszug fügt man 10 ul zu 1 ml Nährboden, der für die Kultur von Keratinozyten oder Fibroblasten geeignet ist. Nach Inkubation über Nacht bei 37 ºC hat sich die Synthese der HSP nicht verändert, aber nach einer Exposition bei einer Temperatur von 43ºC erscheinen die HSP viel früher.
Zum Beispiel erscheint HSP 90, nachgewiesen durch indirekte Immunofluoreszenz, zwischen 10 und 20 min. in einer Kultur von Fibroblasten, die in Gegenwart des Auszugs aus Cactaceae (O.E.) inkubiert wurden, während die Nährböden der Kultur, welche nicht inkubierte Zellen enthält, HSP 90 erst eine oder zwei Stunden später zeigen.
Die Werte der Tabellen und der grafischen Darstellungen 1, 2, 3 und 4 sind in willkürlichen Einheiten in Abhängigkeit von der Fluoreszenzfläche für einen für die Gesamtheit der Versuche festgelegten Schwellwert dargestellt. Es handelt sich um Relativwerte in willkürlichen Einheiten, die auf der Grundlage eines Schwellwerts für den Nachweis erstellt wurden, der für die Gesamtheit der Experimente mit einem Biocom-Gerät identisch ist, und durch Berechnungen der Fluoreszenzbereiche, die durch einen Antikörper festgestellt wurden, der mit dem Fluoreszin gekoppelt und gegen den spezifischen Antikörper des HSP gerichtet ist. Tabelle I:
Fph = Fibroblasten der menschlichen Haut
Die Tabelle I wird durch Fig. 1 veranschaulicht.
Der Opuntienauszug, der mit der Dosierung von 1% in den Nährboden der Kultur gegeben wurde, drückt keinerlei Aktivität nach der Inkubation über Nacht bei 37ºC aus, während dieselben Fibroblasten der menschlichen Haut, die bei einer Temperatur von 43ºC in Gegenwart von Opuntienauszug inkubiert wurden, zu einem viel schnelleren Auftreten von HSP 90 führten.
Also ermöglicht die Anwesenheit des Opuntienauszugs (OE) im Nährboden der Kultur eine Aktivierung des Vorgangs der Synthese der HSP 90 im Vergleich mit dem, was die unbehandelte Zelle entwickelt. Die Synthese wird nicht verstärkt, sie wird schneller aktiviert. Statt normalerweise nach 120 min aufzutreten, wird die Synthese von HSP 90 durch die Fibroblasten in Gegenwart von OE bereits 30 min nach der Erhöhung der Temperatur auf 43ºC (s. Fig. 1) ausgelöst.
Im Laufe einer thermischen Belastung ermöglicht OE eine bessere Erhaltung des Zellenmaterials dank der schnellen Auslösung des Vorgangs der Synthese der HSP.
Es ist möglich gewesen, im Laufe einer weiteren experimentellen Untersuchung zu präzisieren, dass das Auftreten der HSP 90 durch die Fibroplasten der menschlichen Haut, die aus einem Gewebestück von einem Fünfjährigen stammen und einer thermischen Belastung von 43ºC unterzogen wurden, zwischen 10 und 20 min erfolgt, während diejenigen Zellen, die vom selben Kind stammen, aber nicht mit dem Auszug aus den Cactaceae behandelt wurden, die HSP 90 erst nach 60 min erschienen ließen.
Die Datengruppen, die in den 3 Tabellen gezeigt werden, sind voneinander unabhängig und können daher nicht miteinander verglichen werden. Tabelle II - Synthese der HSP 90 durch die Fibroblasten
Die Tabelle II wird durch Fig. 2 veranschaulicht. BEISPIEL II Synthese von Hitzeschockproteinen (HSP) durch menschliche Epithelzellen Tabelle III: - Synthese der HSP 90 durch Keratinozyten
Die Tabelle III wird durch Fig. 3 veranschaulicht. Tabelle IV: Synthese der HSP 27 durch Keratinozyten
Die Tabelle IV wird durch Fig. 4 veranschaulicht.

BEISPIEL III

Untersuchung der Zellverträglichkeit des Opuntienauszuas

Der Auszug aus den Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel darf nicht zytotoxisch sein, damit nicht die Synthese der HSP auf Grund der Toxizität induziert wird. Die Untersuchungen auf Zellverträglichkeit sind an Fibroblasten und Keratinozyten durchgeführt worden. Dabei sind zwei Arten von Versuchen durchgeführt worden: die Mitochondrialaktivität und die Zellvermehrung.
Die Mitochondralaktivität wird nach dem XTT-Test bewertet.
Der XTT-Test ist ein kolorimetrischer Test auf der Grundlage der Reduktion eines löslichen Tetrazolsalzes (XTT = 2,3-bis[2-Methoxy-4-Nitro-5-Sulfophenyl]-2H- Tetrazol-r-Karboxanilid), (wenn Derivat unlöslich, MTT-Test, MTT = [3-(4,5- Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-Diphenyl-2H-Tetrazolbromid] durch die NADPH- Mitochondrialreduktase und einen Farbstoff vom Typ Formazan blau-violett.
Zum Beispiel werden herkömmlich 2 · 10&sup4; Zellen kultiviert und mit verschiedenen Konzentrationen des zu testenden Wirkstoffs behandelt. Die Ablesung erfolgt nach 24 oder 48 Stunden.
Der XTT-Test liefert einen Wert für die Mitochondrialaktivität, wobei dieser Wert als optische Dichte (DO) bei der Wellenlänge, die dem Blau des Formazan zugeordnet ist, angegeben wird.
Die Vermehrung der Zellen wird durch Auszählen mit Hilfe eines Zellzählers bestimmt. Sie wird als Anzahl der Zellen dargestellt.

A) Test mit Fibroblasten:

Die Fibroblasten stammen von einem zu verpflanzenden Gewebestück der menschlichen Haut, die einem dreijährigen Kind entnommen wurde (Zellen der dritten Passage). Tabelle V: - Untersuchung des Stoffwechsels von Fibroblasten, die in Gegenwart eines Opuntienauszugs kultiviert wurden
Der Opuntienauszug verändert den Stoffwechsel der Fibroblasten nicht. Die Werte sind bezüglich der Vergleichsprobe nicht statistisch signifikant.
Die Tabelle V wird durch Fig. 5 veranschaulicht.

Tabelle VI: - Einfluss der Auszüge aus Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel auf die Vermehrung der Fibroblasten

Einsaat 10&sup4; Zellen.

Wert in Tausend Zellen

Vergleichsprobe 255
OE 5% 281
OE 2% 215
OE 1% 260
OE 0,5% 251
OE 0,2% 225
OE 0,1% 252
OE 0,05% 257
Der Opuntienauszug verändert die Vermehrung der Fibroblasten nach zwei Tagen Inkubationszeit nicht.
Die Tabelle VI wird durch Fig. 6 veranschaulicht.

B) Test mit Keratinozyten

Die Keratinozyten stammen von Gewebestücken der menschlichen Haut, entnommen der Vorhaut von zweijährigen Kindern Tabelle VII: - Untersuchung des Mitochondrialstoffwechsels der menschlichen Keratinozyten in Gegenwart des Opuntienauszugs.
Der Opuntienauszug ist mit den Keratinozyten zellverträglich.
Man beobachtet keine statistisch signifikante Änderung der Mitochondrialaktivität der mit verschiedenen Konzentrationen zwischen 0,05% und 5% kultivierten Keratinozyten.
Die Tabelle VII wird durch Fig. 7 veranschaulicht.

Tabelle VIII: - Vermehrung der Keratinozyten in Tausend Zellen.

Wert in Tausend Zellen

Vergleichsprobe 82.300
OE 5% 114.600
OE 2% 86.300
OE 1% 102.300
OE 0,5% 82.600
OE 0,2% 82.500
OE 0,1% 82.300
OE 0,05% 81.900
Der Opuntienauszug verändert die Vermehrung der Keratinozyten nicht.
Die Tabelle VII wird durch Fig. 8 veranschaulicht.

BEISPIEL IV

Untersuchung des Einflusses von verschiedenen Dosierungen des Auszugs aus Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel auf die Lebensfähigkeit der Keratinozyten, die einer thermischen Behandlung über eine Stunde bei 48ºC unterzogen wurden.

Nach 30 Minuten Kontakt mit dem Opuntienauszug werden die Keratinozyten eine Stunde lang bei einer Temperatur von 48ºC inkubiert. Die Lebensfähigkeit der Zellen wird mit dem XTT-Test bewertet. Tabelle IX: - Mitochondrialaktivität der Keratinozyten durch Opuntienextrakt und nach einer Wärmebehandlung bei 48ºC
(*) unbehandelt
Krc: Keratinozyten
Die Tabelle IX wird durch die Fig. 9 veranschaulicht.

BEISPIEL V

Der Wärmeschutzeffekt der Auszüge aus Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel Untersuchung der Lebensfähigkeit der Zellen, die mit Opuntienauszügen aus verschiedenen Teilen der Pflanze behandelt wurden.

Die Bedingungen des XTT-Tests an Fibroblasten der menschlichen Haut sind die folgenden:
- Inkubationszeit eine Nacht bei 37ºC mit oder ohne OE (Vergleichsprobe für Hitzeschock)
- erster Hitzeschock von 20 min. mit 48ºC
- Inkubationszeit 40 min. bei 37ºC (Erzeugung der HSP)
- zweiter Hitzeschock von 20 min. mit 50ºC
- 15 min. bei 37ºC
- XTT-Test über 3 Stunden bei 37ºC. Tabelle X: Untersuchung der Widerstandsfähigkeit der Fibroblasten gegenüber Hitzeschock, wenn sie mit dem Extrakt der Fruchtschale behandelt wurden.
Die Vergleichsprobe bei 37ºC ist in einer anderen Schale kultiviert worden.
Die optischen Dichten (DO), die beim XTT-Test für die Schale der Früchte gemessen wurden, sind bezüglich aller anderen Mittelwerte der optischen Dichte statistisch signifikant bis auf den Fall der Gesamtlösung (1 + 2 + 3).
Dies zeigt, dass für bestimmte Cactaceae die Gesamtheit der Wirkung in der Schale liegt.
Die Fibroblasten haben eine höhere Widerstandsfähigkeit gegen Hitzeschocks, wenn sie mit dem Auszug aus der Schale der Frucht behandelt werden.
Die Tabelle X wird durch die Fig. 10 veranschaulicht. BEISPIEL VI Untersuchung der Lebensfähigkeit der Zellen, die mit Opuntieauszügen aus verschiedenen Teilen der Früchte behandelt wurden. Tabelle XI: - Sie veranschaulicht der Vergleich mit der Vergleichsprobe.
Die Fibroblasten haben eine höhere Widerstandsfähigkeit gegenüber Hitzeschocks, wenn sie mit einem Auszug aus der Schale der Frucht behandelt werden.
Die Tabelle XI wird durch die Fig. 11 veranschaulicht.

Claims

1. Biologisch aktive Substanzen, die nicht zytotoxisch sind, die Synthese der Hitzeschockproteine (HSP) beschleunigen und/oder verstärken und von der Schale der Furcht der Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel isoliert werden.

2. Biologisch aktive Substanzen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Frucht der Pflanzen mit CAM-Stoffwechsel eine Opuntiafrucht ist.

3. Biologisch aktive Substanzen nach einem der Ansprüche 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus der Schale der Opuntiafrüchte und spezifischer der Kaktusfeige gewonnen werden.

4. Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Substanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die reife oder nicht reife Frucht einer Pflanze mit CAM-Stoffwechsel einer Trocknung und sodann einer Dehydratisierung unterzogen wird, gefolgt von einem Ausziehen durch ein polares organisches Lösemittel, um einen organischen Fruchtextrakt zu erhalten, dieser Extrakt mit Wasser verdünnt wird, der verdünnte Extrakt durch Ausziehen mit Hexan gereinigt wird, die organische Hexan-Fraktion abgeschieden wird, die im Vakuum bis zur völligen Trockenheit eingedampft wird, und die aktive Fraktion der Frucht der Pflanze mit CAM-Stoffwechsel gewonnen wird.

5. Verfahren zur Herstellung von biologisch aktiven Substanzen nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass als polares organisches Lösemittel ein Lösemittel verwendet wird, das aus den aliphatischen Alkoholen und den aliphatischen Ketonen gewählt wird.

6. Herstellungsverfahren nach den Ansprüchen 4 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Schale der Frucht der Pflanze mit CAM- Stoffwechsel verwendet wird, die durch Schälen, Abtragen oder Zerstoßen der Frucht gewonnen wird.

7. Pharmazeutische, kosmetische und/oder Nahrungsmittel- Zusammensetzungen, die die Synthese der Hitzeschockproteine (HSP) beschleunigen und verstärken, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoff eine oder mehrere biologisch aktive Substanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, in Verbindung oder gemischt mit einem inaktiven, nicht toxischen Hilfsstoff oder Träger, der für die beabsichtigte Verwendung geeignet ist, und eventuell einen oder mehrere Wirkstoffe mit komplementärer Wirkung enthält.

8. Pharmazeutische, kosmetische und/oder Nahrungsmittel- Zusammensetzungen nach Anspruch 7, wobei der inaktive Hilfsstoff oder Träger einer von jenen ist, die für die Verabreichung auf oralem, parenteralem, topischem oder rektalem Weg geeignet sind.

9. Pharmazeutische, kosmetische und/oder Nahrungsmittel- Zusammensetzungen nach den Ansprüchen 7 und 8, wobei der Gehalt an aktivem Wirkstoff zwischen 10 · 10&supmin;³ mg/ml und 400 mg/ml pro Einnahmeeinheit gestaffelt ist.

10. Verwendung der biologisch aktiven Substanz oder Substanzen nach einem der Ansprüche 1 bis 3, um die Synthese der Hitzeschockproteine (HSP) in Zellkulturmilieus zu beschleunigen und zu verstärken.