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DE69637383T2 - Cytotoxinkonjugate umfassend dipeptide - Google Patents

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DE69637383T2
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pro
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Toshiyuki Yamato-shi SUZAWA
Motoo Machida-shi Yamasaki
Satoru Hofu-shi Nagamura
Hiromitsu Kawasaki-shi SAITO
So Sunto-gun OHTA
Nobuo Sagamihara-shi Hanai
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Original Assignee
Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd
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Description

  • Bereich der Technik
  • Cytotoxinkonjugate, in welchen ein Cytotoxin über einen Spacer an einen Rest, abgeleitet von einer Verbindung, welche eine Affinität zu einer Zielzelle aufweist, zum Beispiel einen Rest, der von einem Antikörper oder Antikörperfragment abgeleitet ist, welche für einen Krebs spezifisch sind, gebunden ist, werden beschrieben. Das erhaltene Cytotoxinkonjugat inhibiert das Wachstum einer Zielzelle selektiv und wirksam und ist als ein Wirkstoff eines Antitumormittels nützlich.
  • Stand der Technik
  • Anthracyclin-Antikrebsverbindungen, welche bisher bekannt sind, schließen Daunomycin ( US Patent Nr. 3,590,028 ) und Adriamycin ( US Patent Nr. 3,590,028 ), welche häufig klinische Verwendung als Antikrebsmittel finden, ein. Jedoch wurden Nebenwirkungen von diesen Verbindungen berichtet; zum Beispiel ist bekannt, dass Adriamycin Nebenwirkungen wie Kardialtoxizität und Knochenmarkschwächung [Cancer Chemotherapy and Pharmacology, 4, 5–10 (1980)] aufweist. Die Linderung von solchen Nebenwirkungen ist ein großes Problem, welches zu lösen ist, und umfangreiche Forschung wurde bisher dazu durchgeführt. Speziell in den letzten Jahren wurde Forschung an Arzneistoffbereitstellungssystemen betrieben, was auf eine Linderung der Toxizität, Aufrechterhaltung der Konzentration im Blut und Verbesserung der Affinität für eine Krebszelle abzielte. Zum Beispiel wurde die Modifizierung mit einem Copolymer von Divinylether-Maleinsäureanhydrid (veröffentlichte nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 67490/85 ) und die Modifizierung mit Dextran [Cancer Treatment Reports, 66, 107 (1982)] berichtet.
  • Ferner wurden Antikörperkonjugate (Cytotoxinkonjugate) mit einer Spezifität zu einer Krebszelle untersucht. Einige Beispiele von solchen Konjugaten sind nachstehend gezeigt [Bioconjugate Chem., 1, 13 (1990)].
  • Figure 00020001
  • US 5,219,564 beschreibt Copolymere eines Poly(alkenoxids)s und einer Aminosäure oder Peptidsequenz mit multiplen anhängenden funktionellen Gruppen in regelmäßigen vorbestimmten Intervallen, welche für Arzneistoffanbindungs- oder Vernetzungsreaktionen verwendet werden können.
  • WO 92/20371 beschreibt ein Konjugat von bioaktiven Verbindungen, umfassend einen synthetischen hydrophilen Polymerspacer wie PEG.
  • WO 92/16221 beschreibt ein Konjugat von bioaktiven Verbindungen, umfassend einen nicht-peptidischen polymeren Spacer wie PEG.
  • Es gibt einige andere Berichte, welche Antikörperkonjugate betreffen [veröffentliche nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 67433/85 ; veröffentliche nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 35575/88 ; veröffentliche nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 150282/88 ; veröffentliche nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 246336/88 ; Biochem. J., 173, 723 (1978); Cancer Res., 50, 6600 (1990); Science, 261, 212 (1993); Bioconjugate Chem., 4, 275 (1993); Bioconjugate Chem., 4, 251 (1993); Bioconjugate Chem., 5, 88 (1994); Bioconjugate Chem., 5, 31 (1994); und Bioconjugate Chem., 5, 246 (1994)].
  • Es gibt auch bekannte Beispiele, in welchen Polyethylenglykol mit niedrigem Molekulargewicht als ein Spacer verwendet wird [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88, 9287 (1991); WO 92/01470 ; und Bioconjugate Chem., 4, 455 (1993)], und Beispiele der Modifizierung eines Antikörpers mit Polyethylenglykol ( WO 93/08838 und WO 86/04145 ). Ferner wurde die Verwendung eines Spacers, der ein Peptid enthält, berichtet [ US Patent Nr. 4,671,958 ; WO 91/18012 ; und Bioconjugate Chem., 4, 10 (1993)].
  • Offenbarung der Erfindung
  • Die Erfinder führten intensive Untersuchungen bei der Suche eines ausgezeichneten Cytotoxinkonjugats, welches selektiv Tumorzellen abtötet, durch. Als ein Ergebnis haben die Erfinder gefunden, dass ein Konjugat mit einem Spacer, der spezifisch gespalten wird, wenn es in eine spezielle Zelle eingebracht wird, durch chemisches Binden eines Cytotoxins an eine Verbindung, welche eine spezielle Affinität zu einer Krebszelle aufweist, über einen neuen Spacer, umfassend Polyethylenglykol und Dipeptid, erhalten werden kann. So wurde die vorliegende Erfindung vervollständigt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ein Cytotoxinkonjugat, bei welchem ein Rest, abgeleitet von einer Verbindung mit einer Affinität zu einer Zielzelle, über einen Spacer, umfassend Polyalkylenglykol und Dipeptid, an ein Cytotoxin gebunden ist.
  • Typische Beispiele der erfindungsgemäßen Konjugate der vorliegenden Erfindung sind Cytotoxinkonjugate, dargestellt durch die allgemeine Formel (A): Z-(X1-CH2(OCH2CH2)nOCH2CO-R1-R2-W-Y1)m (A)wobei Z einen Rest, abgeleitet von einer Verbindung mit einer Affinität zu einer Zielzelle, darstellt; Y1 ein Cytotoxin darstellt; R1 und R2, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils einen Aminosäurerest darstellen; Alk Alkylen darstellt; n eine ganze Zahl von 1–1000 darstellt; und m eine ganze Zahl von 1–100 darstellt. Obwohl X0, W0 und W1 nicht speziell definiert sind, sind Beispiele ihrer Darstellungen wie folgt: X0 stellt -COAlk1-, -SAlk1-, -COOAlk1-, -CONHAlk1-, -COAlk1CO-,
    Figure 00040001
  • W0 stellt CO, -Alk1CO- oder -Alk1S- dar; und W1 stellt eine Einfachbindung, S, -OAlk1CO-, -NHAlk1CO-, -NHAlk1NH-,
    Figure 00040002
  • In den vorstehenden Formeln stellen Alk1 und Alk2, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils ein geradkettiges oder verzweigtes Alkylen mit 1–8 Kohlenstoffatomen dar, wie Methylen, Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen, Isobutylen, Pentylen, Hexylen, Heptylen und Octylen.
  • Insbesondere sich bevorzugte Cytotoxinkonjugate Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) Z-(x1-CH2(OCH2CH2)nOCH2CO-R1-R2W-Y1)m (I) wobei X1 CO, S oder
    Figure 00050001
  • W eine Einfachbindung oder
    Figure 00050002
    darstellt und Z, Y1, R1, R2, n und m die gleichen Bedeutungen wie vorstehend definiert haben. Die Verbindungen gemäß der allgemeinen Formel (I) werden hier nachstehend als Verbindungen (I) bezeichnet und das gleiche gilt für die Verbindungen mit anderen Formelnummern.
  • In den Definitionen der vorstehend beschriebenen Reste bedeutet die Alkyleneinheit des Alkylens und des Polyalkylenglykols ein geradkettiges oder verzweigtes Alkylen mit 1-8 Kohlenstoffatomen wie Methylen, Ethylen, Propylen, Isopropylen, Butylen, Isobutylen, Pentylen, Hexylen, Heptylen und Octylen. Beispiele der Verbindungen, welche eine Affinität zu einer Zielzelle aufweisen, sind Verbindungen mit einer Struktur, welche zum Binden an X1 in der Lage ist, wie COOH, NH, SH und OH, z. B. Rezeptorliganden wie epidermale Wachstumsfaktoren (EGF) und Transferrin mit einer Affinität zu einer Zielzelle, Adhäsionsmoleküle, welche durch die Arginin-Glycin-Asparaginsäure-Sequenz dargestellt werden, und Proteine und Peptide wie Antikörper und Antikörperfragmente. Bevorzugte Beispiele sind Antikörper und Antikörperfragmente. Die Antikörper schließen polyklonale Antikörper und monoklonale Antikörper, welche gemäß bekannten Verfahren hergestellt werden und zu Immunglobulin (Ig)-Klassen, wie IgG, IgA, IgM und IgE, und Immunglobulinunterklassen, zum Beispiel IgG1, IgG2, IgG3 und IgG4 im Falle von IgG, gehören, ein. Bevorzugte Beispiele sind KM-641-Antikörper, welcher ein Antikörper gegen Gangliosid GD3 ist, der in einer Krebszelle stark exprimiert wird (veröffentlichte nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 176791/93 ), KM-231 (AMC-462)-Antikörper, welcher ein Antikörper gegen Sialyl-Lewis-a ist (veröffentlichte nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 021562/88 ), und NL-1-Antikörper, der ein Antikörper gegen allgemeines humanes akutes lymphatisches Leukämiezellantigen (CALLA) ist [Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79, 4386–4390 (1982)]. Beispiele der Antikörperfragmente sind F(ab')2, welches durch Behandeln der vorstehend erwähnten Antikörper mit einem proteolytischen Enzym wie Pepsin erhalten wird, Fab', welches durch Reduzieren von F(ab')2 mit Mercaptan erhalten wird, und Fab, welches durch Abbau der Antikörper mit einem proteolytischen Enzym wie Papain, Trypsin, Chymotrypsin und Plasmin erhalten wird. F(ab')2, Fab' und Fab sind bekannt, genauso wie Verfahren zur Herstellung von ihnen [Immunochemistry, Yuichi Yamamura et al., S. 461, Asakura Shoten (1973)]. Beispiele der Cytotoxine sind Cytotoxine mit einer Struktur, welche zum Kondensieren mit einem Carboxylrest der terminalen Aminosäure R2 in der Lage ist oder zum Anbinden an eine Doppelbindung von Maleinimid in der Lage ist, wie NH, SH und OH, z. B. Anthracyclinverbindungen wie Adriamycin ( US Patent Nr. 3,590,028 ) und Daunorubicin ( US Patent Nr. 3,616,242 ), Duocarmycinderivate wie DC-88A-Derivate (veröffentlichte nicht geprüfte Japanische Patentanmeldung Nr. 288879/90 ) und die in den Referenzbeispielen beschriebenen Verbindungen, Mitomycin A, Mitomycin C und Proteincytotoxine wie Ricin A, Diphtherietoxin und Pseudomonas Exotoxin. Beispiele der Aminosäurereste sind ein Alaninrest, ein Leucinrest, ein Glycinrest, ein Prolinrest und ein Valinrest.
  • Die hier verwendeten Abkürzungen haben die folgenden Bedeutungen, wenn nicht Anderweitiges angegeben ist.
  • Die Abkürzungen für Aminosäuren und ihre Schutzgruppen folgen den Empfehlungen der IUPAC-IUB Joint Commission an Biochemical Nomenclature [Biochemistry, 11, 1726 (1972)].
    • Ala:
    L-Alanin
    Val:
    L-Valin
    Pro:
    L-Prolin
    Gly:
    Glycin
    DMF:
    N,N-Dimethylformamid
    DMSO:
    Dimethylsulfoxid
    THF:
    Tetrahydrofuran
    TFA:
    Trifluoressigsäure
    NMM:
    N-Methylmorpholin
    Bzl:
    Benzyl
    tBu:
    tert-Butyl
    Z:
    Benzyloxycarbonyl
    Pic:
    Picolyl
    HONSu:
    N-Hydroxysuccinimid
    ONSu:
    Succinimidoxy
    DCC:
    N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid
    DCU:
    N,N'-Dicyclohexylharnstoff
    ADM:
    Adriamycin
    DNR:
    Daunorubicin
    HOBt:
    N-Hydroxybenzotriazol
    PyBOP:
    Benzotriazol-1-yloxytripyrrolidinphosphoniumhexafluorophosphat
    EDC:
    1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid
    DMAP:
    4-(N,N-Dimethylamino)pyridin
    PEG:
    COCH2(OCH2CH2)nOCH2CO
    HPLC:
    Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
    NMR:
    Magnetische Kernresonanz
  • Die Verfahren zur Herstellung der Verbindungen (I) und Polyethylenglykolderivate gemäß der allgemeinen Formel (II) X2-CH2(OCH2CH2)nOCH2CO-R1-R2-Y2 (II)(wobei X2 Carboxyl, Mercapto oder
    Figure 00080001
  • Y2 Hydroxyl oder
    Figure 00080002
    darstellt; und R1, R2 und n die gleichen Bedeutungen wie vorstehend definiert haben) werden nachstehend beschrieben.
  • Verfahren 1: Verfahren zur Herstellung von Verbindung (Ia), d. h. Verbindung (I), wobei Z ein Rest mit N, S oder O ist, X1 CO ist und W eine Einfachbindung ist Verbindung (Ia) kann gemäß den folgenden Reaktionsschritten hergestellt werden.
  • Figure 00090001
  • (In den Formeln stellen A1 und A2, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Carbonsäureschutzgruppe dar; A3 und A4, welche gleich oder verschieden sein können, stellen jeweils eine Carbonsäureaktivierungsgruppe dar; Hal stellt Halogen dar; Z1 stellt einen Rest mit N, S oder O in der Definition von Z dar; und Y1, R1, R2 und n haben die gleichen Bedeutungen wie vorstehend definiert.)
  • Beispiele der Carbonsäureschutzgruppe sind Carbonsäureschutzgruppen, welche in herkömmlicher Peptidsynthese verwendet werden (Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya et al., Maruzen) wie tBu, Bzl und Pic. Ein Beispiel der Carbonsäureaktivierungsgruppe ist ONSu. Das Halogen bedeutet ein Chloratom, ein Bromatom oder ein Iodatom.
  • (Schritt 1)
  • Verbindung (V) kann durch Umsetzung von Polyethylenglykoldicarbonsäure (III) mit Verbindung (IV) in einer Menge von 0,1 bis 1 Äquivalent, bevorzugt 0,5 Äquivalent, in einem Lösungsmittel wie DMF in der Gegenwart einer Base wie Kaliumcarbonat bei –50 bis 30°C für 1 bis 24 Stunden erhalten werden. Diester und nicht umgesetzte Dicarbonsäure, welche in dem erhaltenen Produkt enthalten sind, können durch Verteilungssäulenchromatographie, Säulenchromatographie unter Verwendung von Adsorptionsharzen, Umkehrphasen-Kieselgel, Aluminiumoxid, Diatomeenerde oder Ionenaustauschharzen, bevorzugt Kieselgel-Säulenchromatographie oder Dünnschichtchromatographie, entfernt werden.
  • (Schritt 2)
  • Verbindung (VII) kann durch Kondensieren von Verbindung (V) mit Verbindung (VI), erhalten gemäß einem herkömmlichen Flüssigphasen-Peptidsyntheseverfahren (Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya et al., Maruzen), in einem Lösungsmittel in der Gegenwart einer Base in einer Menge von 1 bis 2 Äquivalenten, unter Verwendung eines Kondensationsmittels in einer Menge von 1 bis 10 Äquivalenten, bevorzugt 1 bis 2 Äquivalenten, erhalten werden. Beispiele der Base sind Triethylamin und NMM, Beispiele des Kondensationsmittels sind herkömmliche Aminosäure-Kondensationsreagenzien wie DCC und EDC, und Beispiele des Lösungsmittels sind Methylenchlorid, Chloroform und DMF. Die Umsetzung wird durch Rühren bei 0 bis 30°C für 1 bis 24 Stunden durchgeführt.
  • Es ist bevorzugt, dass A2, welches als die Carbonsäureschutzgruppe der Verbindung (VI) verwendet wird, ein Rest ist, der selektiv, getrennt von A1 von Verbindung (V), entfernt werden kann.
  • Verbindung (VII) kann auch durch Kondensieren von Verbindung (V) mit HONSu, HOBt oder dergleichen in einer Menge von 1 bis 10 Äquivalenten, bevorzugt 1 bis 2 Äquivalenten, in einem Lösungsmittel in der Gegenwart einer äquivalenten Menge einer Base, unter Verwendung eines Kondensationsmittels in einer Menge von 1 bis 5 Äquivalenten, bevorzugt 1 bis 2 Äquivalenten, wobei ein aktiver Ester erhalten wird, und dann Unterwerfen des erhaltenen Esters einer Umsetzung mit Verbindung (VI) bei 0 bis 30°C für 1 bis 24 Stunden erhalten werden. Als die Base, das Kondensationsmittel und das Lösungsmittel können jene, welche vorstehend beschrieben wurden, verwendet werden.
  • (Schritt 3)
  • Verbindung (VIII) kann durch selektive Entfernung der Schutzgruppe A2 von Verbindung (VII) gemäß einem Verfahren zur Entfernung einer Schutzgruppe, welches in herkömmlicher Peptidsynthese verwendet wird (Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya et al., Maruzen), erhalten werden.
  • (Schritt 4)
  • Verbindung (X) kann durch Kondensieren von Verbindung (VIII) mit einer äquivalenten Menge eines Cytotoxins in einem Lösungsmittel in der Gegenwart einer Base in einer Menge von 1 bis 2 Äquivalenten, unter Verwendung eines Kondensationsmittels in einer Menge von 1 bis 10 Äquivalenten, bevorzugt 1 bis 2 Äquivalenten, erhalten werden. Beispiele der Base sind Triethylamin und NMM, Beispiele des Kondensationsmittels sind herkömmliche Aminosäure-Kondensationsreagenzien wie DCC und EDC, und Beispiele des Lösungsmittels sind Methylenchlorid, Chloroform und DMF. Die Umsetzung wird unter Rühren bei –30 bis 30°C für 1 bis 24 Stunden durchgeführt.
  • Verbindung (X) kann auch durch Kondensieren von Verbindung (VIII) mit HONSu, HOBt oder dergleichen in einer Menge von 1 bis 10 Äquivalenten, bevorzugt 1 bis 2 Äquivalenten, in einem Lösungsmittel in der Gegenwart einer äquivalenten Menge einer Base, unter Verwendung eines Kondensationsmittels in einer Menge von 1 bis 5 Äquivalenten, bevorzugt 1 bis 2 Äquivalenten, wobei ein aktiver Ester (IX) erhalten wird, und dann Unterwerfen des erhaltenen Esters einer Umsetzung mit einem Cytotoxin bei –30 bis 30°C für 1 bis 24 Stunden erhalten werden. Als die Base, das Kondensationsmittel und das Lösungsmittel können jene, welche vorstehend beschrieben wurden, verwendet werden.
  • (Schritt 5)
  • Verbindung (XI) kann durch Entfernen der Schutzgruppe A1 von Verbindung (X) gemäß einem Verfahren zur Entfernung einer Schutzgruppe, welches in herkömmlicher Peptidsynthese verwendet wird (Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya et al., Maruzen) erhalten werden. In dem Falle zum Beispiel, wobei Bzl als A1 verwendet wird und tBu als A2, welche in den Schritten 3 beziehungsweise 5 entfernt werden müssen, wird Entfernung der Schutzgruppe gemäß herkömmlichen Verfahren zur selektiven Entfernung von Aminosäureschutzgruppen wie Hydrierung in der Gegenwart eines Palladium/Kohlenstoff-Katalysators für A1 und Trifluoressigsäure-Behandlung für A2, wobei A1 und A2 in jedem Schritt selektiv entfernt werden können, durchgeführt. Es ist möglich, die vorstehende Kombination von A1 und A2 umgekehrt zu verwenden und die Reihenfolge der Entfernung der Schutzgruppen umzukehren.
  • Verbindung (XI) kann auch durch Entfernen der Schutzgruppe A1 von Verbindung (IX), welche in Schritt 4 erhalten wurde, gemäß dem Verfahren von Schritt 5 und dann Unterwerfen der erhaltenen Verbindung einer Umsetzung mit einem Cytotoxin gemäß dem Verfahren von Schritt 2 erhalten werden.
  • (Schritt 6)
  • Verbindung (Ia) kann von Verbindung (XI) und einer Verbindung, welche eine Affinität zu einer Zielzelle aufweist und NH, SH oder OH im Molekül aufweist, gemäß dem Verfahren von Schritt 2 erhalten werden. Die Verbindungen mit einer Affinität zu einer Zielzelle, wie Proteine und Peptide, unterliegen in einem organischen Lösungsmittel Denaturierung und Inaktivierung, und es ist bevorzugt, die vorstehende Umsetzung unter milden Bedingungen, z. B. in einer wässrigen Lösung, durchzuführen. In diesem Fall wird die Umsetzung durch Lösen einer Verbindung mit einer Affinität zu einer Zielzelle in einem Puffer wie einem Phosphatpuffer oder einem Boratpuffer (pH-Wert 6–8) und Geben von Verbindung (XI) in einer Menge von 1 bis 500 Äquivalenten, bevorzugt 1 bis 50 Äquivalenten, und eines Kondensationsmittels wie EDC zu der Lösung, gefolgt von Rühren bei 0 bis 30°C für 1 bis 48 Stunden durchgeführt. Alternativ kann die Umsetzung durch Erhalten eines aktiven Esters (XII) gemäß dem Verfahren von Schritt 2 und Geben des erhaltenen aktiven Esters in einer Menge von 1 bis 500 Äquivalenten, bevorzugt 1 bis 50 Äquivalenten, zu einer Lösung einer Verbindung mit einer Affinität zu einer Zielzelle in einem Puffer (pH-Wert 6–8), in der Gegenwart von 0 bis 10%, bevorzugt 0 bis 5% DMSO oder DMF, gefolgt von Rühren bei 0 bis 30°C für 1 bis 48 Stunden durchgeführt werden.
  • Verfahren 2: Verfahren zur Herstellung von Verbindung (Ib), d. h. Verbindung (I), wobei Z ein Rest mit N, S oder O ist, X1 CO ist und W
    Figure 00130001
  • Verbindung (Ib) kann gemäß den folgenden Reaktionsschritten hergestellt werden.
  • Figure 00130002
  • (In den Formeln haben A1, Y1, Z1, R1, R2 und n die gleichen Bedeutungen wie vorstehend definiert).
  • (Schritt 7)
  • Verbindung (XIII) kann aus Verbindung (VIII) und Aminoethylmaleimid gemäß dem Verfahren von Schritt 2 erhalten werden.
  • (Schritt 8)
  • Verbindung (XIV) kann durch Unterwerfen von Verbindung (XIII) einer Umsetzung mit einem Cytotoxin erhalten werden. Die Umsetzung wird durch Lösen eines Cytotoxins in einem Puffer wie einem Phosphatpuffer und einem Boratpuffer (pH-Wert 6–8) und Geben von Verbindung (XIII) in einer Menge von 1 bis 50 Äquivalenten zu der Lösung, gefolgt von Rühren bei 0 bis 30°C für 1 bis 48 Stunden durchgeführt.
  • (Schritt 9)
  • Verbindung (Ib) kann aus Verbindung (XIV) gemäß den Verfahren der Schritte 5 und 6 erhalten werden.
  • Verfahren 3: Verfahren zur Herstellung von Verbindung (Ic), d. h. Verbindung (I), wobei Z ein Rest mit CO ist, X1 S ist und W eine Einfachbindung ist.
  • Verbindung (Ic) kann gemäß den folgenden Reaktionsschritten hergestellt werden.
  • Figure 00150001
  • (In den Formeln stellt A4 eine Thiolschutzgruppe dar; Z2 stellt einen Rest mit CO in der Definition von Z dar; und A1, Y1, R1, R2 und n haben die gleichen Bedeutungen wie vorstehend definiert).
  • Beispiele der Thiolschutzgruppe sind Benzyl, Picolyl und Nitrobenzyl.
  • Die Ausgangsverbindung (XV) kann gemäß dem Verfahren für die Synthese von Polyethylenglykolderivaten, beschrieben in Poly(Ethylene Glycol)Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (J. M. Harns, Aut., Plenum, NY. 1992) erhalten werden.
  • (Schritt 10)
  • Verbindung (XVI) kann erhalten werden durch Schützen der Thiolgruppe von Verbindung (XV) gemäß einem Verfahren zur Einbringung einer Schutzgruppe, welches in herkömmlicher Peptidsynthese verwendet wird (Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya et al., Maruzen).
  • (Schritt 11)
  • Verbindung (XVII) kann aus Verbindung (XVI) gemäß dem Verfahren von Schritt 3 erhalten werden.
  • (Schritt 12)
  • Verbindung (XVIII) kann aus Verbindung (XVII) gemäß den Verfahren der Schritte 2 und 3 erhalten werden.
  • (Schritt 13)
  • Verbindung (XIX) kann aus Verbindung (XVIII) gemäß dem Verfahren von Schritt 4 erhalten werden.
  • (Schritt 14)
  • Verbindung (XX) kann durch Entfernen der Schutzgruppe von Verbindung (XIX) gemäß einem Verfahren zur Entfernung einer Schutzgruppe, welches in herkömmlicher Peptidsynthese verwendet wird (Fundamentals and Experiments of Peptide Synthesis, Nobuo Izumiya et al., Maruzen) erhalten werden.
  • (Schritt 15)
  • Verbindung (Ic) kann durch Binden von Verbindung (XX) an eine Verbindung mit einer Affinität zu einer Zielzelle und mit COOH in dem Molekül durch ein Verfahren wie die Aktivierung einer Thiolgruppe, welches in J. Applied Biochem., 6, 56–63 (1984) beschrieben wird, erhalten werden.
  • Verfahren 4: Verfahren zur Herstellung von Verbindung (Id), d. h. Verbindung (I), wobei Z ein Rest mit N, S oder O ist, X1
    Figure 00170001
    ist und W eine Einfachbindung ist, und Verbindung (IId), d. h. Verbindung (II), wobei X2
    Figure 00170002
    ist und Y2 Hydroxyl ist
  • Verbindung (Id) und Verbindung (IId) können gemäß den folgenden Reaktionsschritten hergestellt werden.
  • Figure 00180001
  • (In den Formeln haben A1, Y1, Z1, R1, R2 und n die gleichen Bedeutungen wie vorstehend definiert.)
  • Die Ausgangsverbindung (XXI) kann gemäß dem Verfahren zur Synthese von Polyethylenglykolderivaten, welches in Poly(Ethylene Glycol)Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications (J. M. Harris, Aut., Plenum, NY. 1992) beschrieben wird, erhalten werden.
  • (Schritt 16)
  • Verbindung (XXII) kann aus Verbindung (XXI) gemäß dem Verfahren von Schritt 3 erhalten werden.
  • (Schritt 17)
  • Verbindung (IId) kann aus Verbindung (XXII) gemäß den Verfahren der Schritte 2 und 3 erhalten werden.
  • (Schritt 18)
  • Verbindung (XXIII) kann aus Verbindung (IId) gemäß dem Verfahren von Schritt 4 erhalten werden.
  • (Schritt 19)
  • Verbindung (Id) kann aus Verbindung (XXIII) und einer Verbindung mit einer Affinität zu einer Zielzelle und mit NH, SH oder OH im Molekül gemäß dem Verfahren von Schritt 8 erhalten werden.
  • Verfahren 5: Verfahren zur Herstellung von Verbindung (IIa), d. h. Verbindung (II), wobei X2 Carboxyl ist und Y2 Hydroxyl ist
  • (Schritt 20)
  • Verbindung (IIa) kann aus Verbindung (VIII) gemäß dem Verfahren von Schritt 3 erhalten werden.
  • Verfahren 6: Verfahren zur Herstellung von Verbindung (IIb), d. h. Verbindung (11), wobei X2 Carboxyl ist und Y2
    Figure 00200001
  • (Schritt 21)
  • Verbindung (IIb) kann aus Verbindung (XIII) gemäß dem Verfahren von Schritt 3 erhalten werden.
  • Verfahren 7: Verfahren zur Herstellung von Verbindung (IIc), d. h. Verbindung (1I), wobei X2 Mercapto ist und Y2 Hydroxyl ist
  • (Schritt 22)
  • Verbindung (IIc) kann aus Verbindung (XVIII) gemäß dem Verfahren von Schritt 14 erhalten werden.
  • Die Verbindungen (I) und (II) mit den gewünschten Resten an den gewünschten Positionen können durch geeignetes Kombinieren der vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten werden.
  • Die Zwischenprodukte und gewünschten Verbindungen in den vorstehend beschriebenen Verfahren können isoliert und durch Reinigungsverfahren wie Filtration, Extraktion, Waschen, Trocknen, Konzentration, Umkristallisation, verschiedene Arten von Säulenchromatographie, z. B. Kieselgel-Chromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Umkehrphasen-Chromatographie und Gelfiltrationschromatographie, und Dialyse unter Verwendung einer herkömmlichen semipermeablen Membran gereinigt werden. Die Zwischenprodukte können der anschließenden Umsetzung ohne eine spezielle Reinigungsbehandlung unterworfen werden.
  • Beispiele von Cytotoxinkonjugaten (I), welche durch die vorstehend beschriebenen Verfahren erhalten werden, sind in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    Verbindungsnr. Struktur
    Ia-1 NL-1-(PEG-Ala-Val-ADM)m
    Ia-2 NL-1-(PEG-Ala-Pro-ADM)m
    Ia-3 NL-1-(PEG-Gly-Pro-ADM)m
    Ia-4 KM-231-(PEG-Ala-Val-DNR)m
    Ia-5 KM-231-(PEG-Ala-Pro-DNR)m
    Ia-6 KM-231-(PEG-Gly-Pro-DNR)m
    Ia-7 NL-1-[PEG-Ala-Val-Verbindung (20)*]m
    Ia-8 NL-1-[PEG-Ala-Pro-Verbindung (20)*]m
    Ia-9 NL-1-[PEG-Gly-Pro-Verbindung (20)*]m
    Ia-10 KM-231-[PEG-Ala-Val-Verbindung (12)**]m
    Ia-11 KM-641-[PEG-Ala-Val-Verbindung (12)**]m
    • *: synthetisiert in Referenzbeispiel 17
    • **: synthetisiert in Referenzbeispiel 15
  • Die pharmakologischen Aktivitäten der Cytotoxinkonjugate werden nachstehend durch Testbeispiele gezeigt.
  • Testbeispiel 1
  • Die inhibitorische Wirkung der Cytotoxinkonjugate auf das Zellwachstum wurde untersucht. Zervikal-HeLaS3-Krebszellen (CALLA–) ohne Expression des CALLA-Antigens und Burkitt-Lymphom-Daudi-Zellen (CALLA+) mit einer Expression des CALLA-Antigens wurden als Zielzelllinien verwendet. Jede der Zielzellsuspensionen wurde in Vertiefungen einer flachen Platte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 50 μl (1 × 103 Zellen/Vertiefung) gegeben und in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 2 Stunden kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden verschiedene Verdünnungen eines Cytotoxinkonjugats oder eines monoklonalen Antikörpers jeweils in einer Menge von 50 μl zugegeben, gefolgt von weiterem Kultivieren in dem CO2-Inkubator bei 37°C für 68 Stunden. Dann wurden 20 μl 3H-Thymidin (463 kBq/ml) zu jeder Vertiefung gegeben und nach 4 Stunden wurden die Zellen geerntet, wobei die Radioaktivität des 3H-Thymidins, welches in die Zellen aufgenommen worden war, unter Verwendung von Matrix 96 (Packard Japan) bestimmt wurde. Die Zellwachstumsinhibierungsaktivität wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet.
  • Figure 00220001
  • Als ein Ergebnis wiesen Verbindung (Ia-3) und Verbindung (Ia-1) eine geringe inhibierende Wirkung auf das Wachstum von HeLaS3-Zellen bei hohen Konzentrationen auf, wogegen sie eine beträchtliche inhibierende Wirkung auf das Wachstum von Daudi-Zellen sogar bei sehr niedrigen Konzentrationen aufwiesen. Als Verbindung (Ia-9) oder Verbindung (Ia-7) zugegeben wurden, wurde eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum von HeLaS3-Zellen kaum beobachtet, während eine stärker spezifische inhibierende Wirkung auf das Wachstum von Daudi-Zellen beobachtet wurde. Eine Zugabe des monoklonalen Antikörpers (NL-1) alleine hatte eine geringe Wirkung auf das Zellwachstum (siehe 1).
  • Testbeispiel 2
  • Die inhibierende Wirkung von Verbindung (Ia-6) auf das Zellwachstum wurde in der gleichen Weise wie in Testbeispiel 1 untersucht. Zervikal-HeLaS3-Krebszellen (sLea–) ohne Expression von sLea-Antigen und Dickdarm-SW1116-Krebszellen (sLea +) mit einer Expression von sLea-Antigen wurden als Zielzelllinien verwendet. Als ein Ergebnis wurde eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum von SW1116-Zellen, aber nicht auf das Wachstum von HeLaS3-Zellen beobachtet. Als ein monoklonaler Antikörper (KM-231) alleine zugegeben wurde, wurde keine Zellwachstum-inhibierende Wirkung auf diese beiden Stämme beobachtet. Die Antigen-spezifische Zellwachstums-inhibierende Wirkung des Konjugats wurde so bestätigt (siehe Tabelle 2). Tabelle 2
    Verbindung (12,5 μg/ml) Wachstums-inhibierende Wirkung (%)
    HeLaS3 SW1116
    Verbindung (Ia-6) KM-231 1,6 26,8
    0,0 0,0
  • Durch das Vorstehende wurden die Antigen-spezifische Zellwachstums-inhibierende Wirkung der verschiedenen Arten der Konjugate und die Verwendbarkeit der Spacer bestätigt.
  • Testbeispiel 3
  • Die inhibierende Wirkung von Verbindung (Ia-10) auf das Zellwachstum wurde untersucht.
  • Zervikal-HeLaS3-Krebszellen (sLea–) ohne Expression des sLea-Antigens und Dickdarm-SW1116-Krebszellen (sLea +) mit einer Expression des sLea-Antigens wurden als Zielzelllinien verwendet. Jede der Zielzellsuspensionen wurde in Vertiefungen einer flachen Platte mit 96 Vertiefungen in einer Menge von 50 μl (1 × 103 Zellen/Vertiefung) gegeben und in einem CO2-Inkubator bei 37°C für 2 Stunden kultiviert. Nach dem Kultivieren wurden verschiedene Verdünnungen des Arzneistoff-monoklonaler Antikörper-Konjugats oder eines monoklonalen Antikörpers jeweils in einer Menge von 50 μl zugegeben, gefolgt von weiterem Kultivieren in dem CO2-Inkubator bei 37°C für 2 Stunden. Dann wurden die Zellen in der Platte zentrifugiert und unmittelbar nach der Entfernung des Überstandes wurden 100 μl eines Mediums zugegeben, gefolgt von weiterem Kultivieren für 64 Stunden. Zu jeder Vertiefung wurden 20 μl3H-Thymidin (463 kBq/ml) gegeben und nach 4 Stunden wurden die Zellen geerntet, wobei die Radioaktivität des 3H-Thymidins, welches in die Zellen aufgenommen worden war, unter Verwendung von Matrix 96 (Packard Japan) bestimmt wurde. Die Zellwachstumsinhibierungsaktivität wurde gemäß der folgenden Gleichung berechnet.
  • Figure 00230001
  • Als ein Ergebnis wies Verbindung (Ia-10) eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum von SW1116-Zellen, aber keine Wirkung auf das Wachstum von HeLaS3-Zellen auf. Als der monoklonale Antikörper (KM-231) alleine zugegeben wurde, wurde eine inhibierende Wirkung auf das Wachstum von SA1116-Zellen nur schwach beobachtet. Die Antigenspezifische Zellwachstums-inhibierende Wirkung des Konjugats und die Verwendbarkeit des Spacers wurden so auch in diesem Testsystem bestätigt (siehe Tabelle 3). Tabelle 3
    Verbindung (75 μg/ml) Wachstums-inhibierende Wirkung (%)
    HeLaS3 SW1116
    Verbindung (Ia-10) KM-231 0,0 20,8
    0,0 5,3
  • Testbeispiel 4
  • Humane SK-Ly-18-Myelomzellen wurden in RPMI-1640-Medium, welches 10% fötales Kälberserum enthielt, in einer Konzentration von 2 × 108 Zellen/ml suspendiert und die Suspension wurde mit Matrigel (eingetragenes Warenzeichen; Becton Dickinson Labware, USA) in einem Verhältnis von 1:1 (v/v) gemischt. Das Gemisch (0,1 ml, 1 × 107 Zellen/Maus) wurde subkutan in BALB/C-nu/nu-Mäuse (Clea Japan, Inc.) transplantiert. Am 7. Tag nach der Tumortransplantation wurden ein Arzneistoff-monoklonaler Antikörper-Konjugat (Menge entsprechend zu 7,5 mg/kg ADM) oder ADM (7,5 mg/kg) intravenös an die Mäuse, welche in Gruppen aufgeteilt worden waren, welche jeweils aus 5 bestanden, verabreicht. Einer Kontrollgruppe wurde physiologische Salzlösung in der gleichen Weise gegeben. Die Hauptachse und die Nebenachse des Tumors wurden in Intervallen gemessen und das Tumorvolumen wurde als ein Näherungswert eines Ellipsoids gemäß der folgenden Gleichung berechnet. Tumorvolumen(mm3) = (a × b2)/2
    • a:
    Hauptachse (mm)
    b:
    Nebenachse (mm)
  • Die therapeutische Wirkung auf den transplantierten Tumor wurde bezogen auf V/V0, das Verhältnis des Tumorvolumens am Tag der Bewertung (V) zu dem am Tag der Arzneistoffverabreichung (V0), bewertet.
  • Als ein Ergebnis wurde ein signifikantes Tumorwachstum in der Kontrollgruppe beobachtet und eine beträchtliche Tumorwachstums-inhibierende Wirkung wurde in den Gruppen, an welche Verbindung (Ia-1) oder Verbindung (Ia-3) verabreicht worden waren, beobachtet. Auf der anderen Seite wurde keine Wachstums-inhibierende Wirkung in der Testgruppe, an welche die gleiche Menge an ADM alleine verabreicht worden war, im Vergleich mit der Kontrollgruppe beobachtet. Die Verwendbarkeit der Arzneistoff-monoklonaler Antikörper-Konjugate wurde so gezeigt (siehe 2).
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1 zeigt die Zellwachstums-inhibierende Wirkung von Cytotoxinkonjugaten und einem monoklonalen Antikörper.
    • (a) Das Ergebnis, welches unter Verwendung von Verbindung (Ia-3) erhalten wurde
    • (b) Das Ergebnis, welches unter Verwendung von Verbindung (Ia-1) erhalten wurde
    • (c) Das Ergebnis, welches unter Verwendung von Verbindung (Ia-9) erhalten wurde
    • (d) Das Ergebnis, welches unter Verwendung von Verbindung (Ia-7) erhalten wurde
    • (e) Das Ergebnis, welches unter Verwendung von NL-1 erhalten wurde
    o
    Das Ergebnis, welches unter Verwendung von Daudi-Zellen erhalten wurde
    Figure 00250001
    Das Ergebnis, welches unter Verwendung von HeLaS3-Zellen erhalten wurde
  • 2 zeigt die therapeutische Wirkung von Cytotoxinkonjugaten und einem Arzneistoff auf einen transplantierten Tumor.
    • Figure 00250002
    Kontrollgruppe
    ☐
    Das Ergebnis, welches unter Verwendung von Verbindung (Ia-1) erhalten wurde
    Δ
    Das Ergebnis, welches unter Verwendung von Verbindung (Ia-3) erhalten wurde
    o
    Das Ergebnis, welches unter Verwendung von ADM erhalten wurde
  • Beste Weise zur Durchführung der Erfindung
  • Bestimmte erfindungsgemäße Ausführungsformen werden in den folgenden Beispielen und Referenzbeispielen veranschaulicht.
  • Beispiel 1 Cytotoxinkonjugat (Ia-1): NL-1-(PEG-Ala-Val-ADM)m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 275 μg (0,21 μMol) Verbindung (XI-1), welche in Referenzbeispiel 6 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (1,1 μMol) in Methylenchlorid (13,0 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (1,1 μMol) in Methylenchlorid (22,0 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend dazu unter Eiskühlung gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 70 μl DMSO gelöst und 1400 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 480 μl einer wässrigen Lösung von NL-1-Antikörper (3,3 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC [Säule: Superose 12 (Pharmacia Fine Chemicals, Inc.), Entwickler: Phosphatpuffer, Fließrate: 0,5 ml/min, Nachweis: bei der Extinktion von 280 nm] gereinigt. Die gewünschte Fraktion, welche eluiert wurde, wurde unter Verwendung einer Ultrafiltrationsmembran mit kleiner Größe (Millipore Corp., Cut off-Molekulargewicht: 5000) konzentriert, wobei 771 μg NL-1-(PEG-Ala-Val-ADM)m (Proteingehalt: 0,67 mg/ml) (Ausbeute: 49%) erhalten wurden.
  • In dem erhaltenen Konjugat war die Anzahl an Molekülen von gebundenem Adriamycin 2,2 pro Antikörpermolekül, wie aus der Extinktion bei 280 nm (Absorption des Proteins = Gesamtabsorption bei 280 nm – Absorption von Adriamycin bei 280 nm) und der bei 495 nm (Absorption von Adriamycin, ε = 1,21 × 104 M–1 cm–1, ε 280 = ε 495) berechnet. Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Antikörpers ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers gemäß dem nachstehend beschriebenen fluoreszenten Antikörperverfahren ist.
  • <Messung einer Affinität eines Antikörpers durch das Fluoreszenz-Antikörperverfahren>
  • Zu Daudi-Zellen (1 × 106) wurde das vorstehend beschriebene Konjugat (10 μg/ml) gegeben und das Gemisch wurde einer Umsetzung für 30 Minuten unter Eiskühlung unterworfen. Die Zellen wurden zentrifugiert und mit einem Phosphatpuffer dreimal gewaschen, gefolgt von der Entfernung des nicht umgesetzten Konjugats. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 20 ml FITC(Fluoreszeinisothiocyanat)-markierter anti-Maus-IgG-Antikörper (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., 30-fache Verdünnung) gegeben und das resultierende Gemisch wurde einer Umsetzung für 30 Minuten unter Eiskühlung unterworfen. Nachdem die Zentrifugation und das Waschen mit einem Phosphatpuffer dreimal wiederholt worden waren, wurde eine Messung unter Verwendung eines Durchflusszytometers (EPICS Elite, Coulter) durchgeführt. Als eine Kontrolle wurde ein Reaktionsgemisch von Zellen und dem FITC-markierten anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet.
  • Beispiel 2 Cytotoxinkonjugat (Ia-2): NL-1-(PEG-Ala-Pro-ADM)m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 289 μg (0,22 μMol) Verbindung (XI-2), welche in Referenzbeispiel 7 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (1,1 μMol) in Methylenchlorid (13,0 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (1,1 μMol) in Methylenchlorid (23,1 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 95 μl DMSO gelöst und 1900 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 510 μl einer wässrigen Lösung von NL-1-Antikörper (3,3 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 1060 μg NL-1-(PEG-Ala-Pro-ADM)m (Proteingehalt: 0,88 mg/ml) (Ausbeute: 63%) erhalten wurden.
  • In dem erhaltenen Konjugat war die Anzahl an Molekülen von gebundenem Adriamycin 1,8 pro Antikörpermolekül, wie aus den Extinktionen bei 280 nm und 495 nm in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 berechnet. Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Beispiel 3 Cytotoxinkonjugat (Ia-3): NL-1-(PEG-Gly-Pro-ADM)m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 259 μg (0,20 μMol) Verbindung (XI-3), welche in Referenzbeispiel 8 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (1,0 μMol) in Methylenchlorid (11,7 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (1,0 μMol) in Methylenchlorid (21,0 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 76 μl DMSO gelöst und 1460 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 460 μl einer wässrigen Lösung von NL-1-Antikörper (3,3 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 912 μg NL-1-(PEG-Gly-Pro-ADM)m (Proteingehalt: 0,76 mg/ml) (Ausbeute: 60%) erhalten wurden.
  • In dem erhaltenen Konjugat war die Anzahl an Molekülen von gebundenem Adriamycin 1,5 pro Antikörpermolekül, wie aus den Extinktionen bei 280 nm und 495 nm in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 berechnet. Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Beispiel 4 Cytotoxinkonjugat (Ia-4): KM-231-(PEG-Ala-Val-DNR)m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 96 μg (0,08 μMol) Verbindung (XI-4), welche in Referenzbeispiel 9 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (0,38 μMol) in Methylenchlorid (4,3 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (0,37 μMol) in Methylenchlorid (7,7 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 27 μl DMSO gelöst und 114 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 563 μl einer wässrigen Lösung von KM-231-Antikörper (1,0 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 510 μg KM-231-(PEG-Ala-Val-DNR)m (Proteingehalt: 0,85 mg/ml) (Ausbeute: 91%) erhalten wurden.
  • In dem erhaltenen Konjugat war die Anzahl an Molekülen von gebundenem Daunorubicin 3,1 pro Antikörpermolekül, wie aus der Extinktion bei 280 nm und der bei 495 nm (ε = 1,15 × 104 M–1 cm–1) in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 berechnet. Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Beispiel 5 Cytotoxinkonjugat (Ia-5): KM-231-(PEG-Ala-Pro-DNR)m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 348 μg (0,27 μMol) Verbindung (XI-5), welche in Referenzbeispiel 10 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (1,4 μMol) in Methylenchlorid (15,7 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (1,4 μMol) in Methylenchlorid (28,2 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 100 μl DMSO gelöst und 410 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 2,05 ml einer wässrigen Lösung von KM-231-Antikörper (1,0 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 2,0 mg KM-231-(PEG-Ala-Pro-DNR)m (Proteingehalt: 1,36 mg/ml) (Ausbeute: 100%) erhalten wurden.
  • In dem erhaltenen Konjugat war die Anzahl an Molekülen von gebundenem Daunorubicin 1,9 pro Antikörpermolekül, wie aus den Extinktionen bei 280 nm und 495 nm in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 berechnet. Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war, wobei SW1116-Zellen als die Zellen zur Bewertung verwendet wurden.
  • Beispiel 6 Cytotoxinkonjugat (Ia-6): KM-231-(PEG-Gly-Pro-DNR)m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 154 μg (0,12 μMol) Verbindung (XI-6), welche in Referenzbeispiel 11 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (0,61 μMol) in Methylenchlorid (7,0 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (0,61 μMol) in Methylenchlorid (12,6 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 40 μl DMSO gelöst und 185 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 825 μl einer wässrigen Lösung von KM-231-Antikörper (1,0 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 660 μg KM-231-(PEG-Gly-Pro-DNR)m (Proteingehalt: 1,1 mg/ml) (Ausbeute: 80%) erhalten wurden.
  • In dem erhaltenen Konjugat war die Anzahl an Molekülen von gebundenem Daunorubicin 1,5 pro Antikörpermolekül, wie aus den Extinktionen bei 280 nm und 495 nm in der gleichen Weise wie in Beispiel 4 berechnet. Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 5 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Beispiel 7 Cytotoxinkonjugat (Ia-7): NL-1-[PEG-Ala-Val-Verbindung (20)]m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 100 μg (0,08 μMol) Verbindung (XI-7), welche in Referenzbeispiel 12 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (0,41 μMol) in Methylenchlorid (4,7 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (0,41 μMol) in Methylenchlorid (8,4 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1,5 Stunden wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 30 μl DMSO gelöst und 527 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 203 μl einer wässrigen Lösung von NL-1-Antikörper (3,0 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 648 μg NL-1-[PEG-Ala-Val-Verbindung (20)]m (Proteingehalt: 1,1 mg/ml) (Ausbeute: 100%) erhalten wurden.
  • Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Die Anzahl an Molekülen von Verbindung (20), welche pro Antikörpermolekül gebunden waren, wurde durch Unterwerfen des Konjugats einer Enzymbehandlung (Thermolysin) und quantitatives Bestimmen der freigesetzten H-Val-Verbindung (20) durch HPLC gemäß dem in Referenzbeispiel 27 beschriebenen Verfahren berechnet. Es wurde gefunden, dass in dem erhaltenen Konjugat die Anzahl an Molekülen von Verbindung (20) 0,38 pro Antikörpermolekül war.
  • Beispiel 8 Cytotoxinkonjugat (Ia-8): NL-1-[PEG-Ala-Pro-Verbindung (20)]m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 211 μg (0,17 μMol) Verbindung (XI-8), welche in Referenzbeispiel 13 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (0,85 μMol) in Methylenchlorid (9,8 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (0,85 μMol) in Methylenchlorid (17,5 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 60 μl DMSO gelöst und 1115 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 425 μl einer wässrigen Lösung von NL-1-Antikörper (3,0 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 1,2 mg NL-1-[PEG-Ala-Pro-Verbindung (20)]m (Proteingehalt: 1,76 mg/ml) (Ausbeute: 97%) erhalten wurden.
  • Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Die Anzahl an Molekülen von Verbindung (20), welche pro Antikörpermolekül gebunden waren, wurde durch Unterwerfen des Konjugats einer Enzymbehandlung (Prolinendopeptidase) und quantitativ Bestimmen der freigesetzten Verbindung (20) durch HPLC gemäß dem in Referenzbeispiel 27 beschriebenen Verfahren berechnet. Es wurde gefunden, dass in dem erhaltenen Konjugat die Anzahl an Molekülen von Verbindung (20) 0,45 pro Antikörpermolekül war.
  • Beispiel 9 Cytotoxinkonjugat (Ia-9): NL-1-[PEG-Gly-Pro-Verbindung (20)]m
  • In 500 μl Methylenchlorid wurden 135 μg (0,11 μMol) Verbindung (XI-9), welche in Referenzbeispiel 14 erhalten worden war, gelöst und 10 μl einer Lösung von HONSu (0,55 μMol) in Methylenchlorid (6,3 mg/ml) und 10 μl einer Lösung von DCC (0,55 μMol) in Methylenchlorid (11,3 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben. Nach Rühren unter Eiskühlung für 1 Stunde und dann bei Raumtemperatur für 1 Stunde wurde das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 40 μl DMSO gelöst und 735 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 275 μl einer wässrigen Lösung von NL-1-Antikörper (3,0 mg/ml) gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,45 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 774 μg NL-1-[PEG-Gly-Pro-Verbindung (20)]m (Proteingehalt: 1,2 mg/ml) (Ausbeute: 94%) erhalten wurden.
  • Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 1 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Die Anzahl an Molekülen von Verbindung (20), welche pro Antikörpermolekül gebunden waren, wurde durch Unterwerfen des Konjugats einer Enzymbehandlung (Prolinendopeptidase) und quantitativ Bestimmen der freigesetzten Verbindung (20) durch HPLC gemäß dem in Referenzbeispiel 27 beschriebenen Verfahren berechnet. Es wurde gefunden, dass in dem erhaltenen Konjugat die Anzahl an Molekülen von Verbindung (20) 0,49 pro Antikörpermolekül war.
  • Beispiel 10 Cytotoxinkonjugat (Ia-10): KM-231-[PEG-Ala-Val-Verbindung (12)]m
  • In 0,4 ml Methanol wurden 0,45 mg (0,33 μMol) Verbindung (X-1), welche in Referenzbeispiel 16 erhalten worden war, gelöst und 1 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurde in einer Stickstoffatmosphäre dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei –15°C für 5 Stunden. Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtration, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck bei einer Temperatur von unter 0°C entfernt, wobei 0,14 mg (0,11 μMol) HO-PEG-Ala-Val-Verbindung (12) erhalten wurden. Die erhaltene Verbindung (0,14 mg) wurde in 250 μl einer Lösung von HONSu in Methylenchlorid (0,076 mg/ml) unter Eiskühlung gelöst und 250 μl einer Lösung von DCC in Methylenchlorid (0,14 mg/ml) wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 2,5 Stunden unter Eiskühlung. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck bei einer Temperatur von unter 0°C entfernt. Der Rückstand wurde in 36 μl DMSO gelöst und 204 μl eines eisgekühlten Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 0,56 ml einer wässrigen Lösung von KM-231-Antikörper (0,99 mg/ml) unter Eiskühlung gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,22 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 250 μg KM-231-[PEG-Ala-Val-Verbindung (12)]m (Proteingehalt: 0,5 mg/ml) (Ausbeute: 5,1%) erhalten wurden.
  • Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Beispiel 11 Cytotoxinkonjugat (Ia-11): KM-641-[PEG-Ala-Val-Verbindung (12)]m
  • In 0,3 ml Methanol wurden 2,5 mg (1,8 μMol) Verbindung (X-1), welche in Referenzbeispiel 16 erhalten worden war, gelöst und 1 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurde in einer Stickstoffatmosphäre dazu gegeben, gefolgt von starker Rühren in einem Wasserstoffstrom bei –18°C für 4 Stunden. Nach der Entfernung des Katalysators durch Filtration, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck bei einer Temperatur von unter 0°C entfernt, wobei 0,05 mg (0,04 μMol) HO-PEG-Ala-Val-Verbindung (12) erhalten wurden. Die erhaltene Verbindung (0,05 mg) wurde in 250 μl einer Lösung von HONSu in Methylenchlorid (0,028 mg/ml) unter Eiskühlung gelöst und 250 μl einer Lösung von DCC in Methylenchlorid (0,05 mg/ml) wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 4,5 Stunden unter Eiskühlung. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck bei einer Temperatur von unter 0°C entfernt. Der Rückstand wurde in 15 μl DMSO gelöst und 80 μl eines gekühlten Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 205 μl einer wässrigen Lösung von KM-641-Antikörper (1,47 mg/ml) unter Eiskühlung gegeben, gefolgt von schonendem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,22 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrations-HPLC gereinigt und in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 konzentriert, wobei 200 μg KM-641-[PEG-Ala-Val-Verbindung (12)]m (Proteingehalt: 70 μg/ml) (Ausbeute: 66%) erhalten wurden.
  • Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem in Beispiel 4 beschriebenen Fluoreszenz-Antikörperverfahren ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • Referenzbeispiel 1 Verbindung (VIII-1): BzlO-PEG-Ala-Val-OH
  • (a) Verbindung (V-1): BzlO-PEG-OH
  • In 100 ml DMF wurden 10 g (16,7 mMol) Polyethylenglykoldicarbonsäure [HO-PEG-OH, mittleres Molekulargewicht: 600 (Fluka Fine Chemicals Co.)] gelöst und 2,75 g wasserfreies Kaliumcarbonat wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur. Zu der resultierenden Lösung wurde tropfenweise eine Lösung, welche durch Lösen von 2 ml (8,4 mMol) Benzylbromid in 100 ml DMF hergestellt worden war, über 30 Minuten gegeben, gefolgt von weiterem Rühren für 24 Stunden. Zu der resultierenden Lösung wurden 100 ml Wasser gegeben und das Gemisch wurde auf einen pH-Wert von 1–2 mit 1 N HCl eingestellt. Nachdem eine Extraktion sechsmal mit 100 ml-Portionen von Ethylacetat durchgeführt worden war, wurde die Ethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 200 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 200 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie identifiziert wurden. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge an Chloroform gelöst, gefolgt von Filtration. Das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 0,9 g (1,3 mMol) der gewünschten Verbindung, BzlO-PEG-OH, (Ausbeute: 7,8%) erhalten wurden.
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 3:1
    Rf-Wert: 0,5
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 7,36 (5H, m, C6H5), 5,19 (2H, s, CH2), 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2)
  • (b) Verbindung (VI-1): H-Ala-Val-OtBu
  • In 160 ml THF wurden 1,6 g (7,6 mMol) H-Val-OtBu-Hydrochlorid gelöst und 1,0 ml (9,2 mMol) NMM wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur. Zu der resultierenden Lösung wurden 2,5 g (7,6 mMol) Z-Ala-ONSu gegeben, gefolgt von weiterem Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden aufeinanderfolgend jeweils 50 ml Chloroform und ein Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) zugegeben. Die Chloroformschicht wurde extrahiert und über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei ein öliger Rückstand erhalten wurde. Der erhaltene Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 200 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 200 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Chloroform:Methanol = 10:1, Rf-Wert: 0,9] identifiziert wurden, wobei 3,0 g Z-Ala-Val-OtBu als eine ölige Substanz erhalten wurden. Die erhaltene Verbindung (3,0 g) wurde in 60 ml THF und 60 ml Methanol gelöst und 320 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 7 Stunden. Der Katalysator wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 1,7 g (7,1 mMol) der gewünschten Verbindung, H-Ala-Val-OtBu, (Ausbeute: 93%) erhalten wurden.
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 10:1
    Rf-Wert: 0,4
    Massenspektrum (SIMS): 245 (M+H)
  • (c) Verbindung (VIII-1): BzlO-PEG-Ala-Val-OH
  • In 6,0 ml Methylenchlorid wurden 400 mg (0,58 mMol) BzlO-PEG-OH, welches in vorstehendem (a) erhalten wurde, gelöst und 119 mg (0,58 mMol) DCC wurden dazu unter Eiskühlung gegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten. Zu der resultierenden Lösung wurden 6,0 ml einer Lösung von 118 mg (0,48 mMol) H-Ala-Val-OtBu, welches in vorstehendem (b) erhalten wurde, in Methylenchlorid gegeben, gefolgt von weiterem Rühren unter Eiskühlung für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden 5,0 ml Ethylacetat zugegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für eine Stunde. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 50 ml Kieselgel und als der Entwickler jeweils 100 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel- Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Chloroform:Methanol = 10:1, Rf-Wert: 0,7] identifiziert wurden, wobei 0,19 g BzlO-PEG-Ala-Val-OtBu erhalten wurden. In 4,6 ml Methylenchlorid wurden 0,19 g der erhaltenen Verbindung gelöst und 4,6 ml TFA wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 20 ml Kieselgel und als der Entwickler jeweils 50 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie identifiziert wurden, wobei 0,14 g (0,16 mMol) der gewünschten Verbindung, BzlO-PEG-Ala-Val-OH, erhalten wurden (Ausbeute: 28%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 10:1
    Rf-Wert: 0,2
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 7,36 (5H, m, C6H5), 5,19 (2H, s, CH2), 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,23 [1H, s, CH(Ala)], 2,23 [1H, brq, J = 6,0 Hz, CH(Val)], 1,26 [1H, s, CH(Val)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], 0,89 [6H, brd, J = 2,5 Hz, CH3(Val)]
  • Referenzbeispiel 2 Verbindung (VIII-2): BzlO-PEG-Ala-Pro-OH
  • (a) Verbindung (VI-2): H-Ala-Pro-OtBu
  • In 65,7 ml THF wurden 657 mg (3,8 mMol) H-Pro-OtBu gelöst und 1,23 g (3,8 mMol) Z-Ala-ONSu wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden aufeinanderfolgend jeweils 50 ml Chloroform und ein Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) zugegeben. Die Chloroformschicht wurde extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei ein öliger Rückstand erhalten wurde. Der erhaltene Rückstand wurde unter Verwendung von 200 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 100 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1) gereinigt. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Chloroform:Methanol = 10:1, Rf-Wert: 0,8] identifiziert wurden, wobei 1,47 g Z-Ala-Pro-OtBu als eine ölige Substanz erhalten wurden. Die erhaltene Verbindung (1,47 g) wurde in 30 ml THF und 30 ml Methanol gelöst und 250 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 8 Stunden. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 200 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 100 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie identifiziert wurden, wobei 0,67 g (2,8 mMol) der gewünschten Verbindung, H-Ala-Pro-OtBu, erhalten wurden (Ausbeute: 74%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 10:1
    Rf-Wert: 0,2
    Massenspektrum (SIMS): 243 (M+H)
  • (b) Verbindung (VIII-2): BzlO-PEG-Ala-Pro-OH
  • In 6,0 ml Methylenchlorid wurden 400 mg (0,58 mMol) BzlO-PEG-OH, welches in Referenzbeispiel 1 (a) erhalten worden war, gelöst und 119 mg (0,58 mMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten. Zu der resultierenden Lösung wurden 6,0 ml einer Lösung von 116 mg (0,48 mMol) H-Ala-Pro-OtBu, welches in vorstehendem (a) erhalten worden war, in Methylenchlorid gegeben, gefolgt von weiterem Rühren unter Eiskühlung für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden 5,0 ml Ethylacetat zugegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für eine Stunde. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 0,21 g eines Rückstandes, der BzlO-PEG-Ala-Pro-OtBu enthielt, erhalten wurden. Der erhaltene Rückstand wurde in 5,1 ml Methylenchlorid gelöst und 5,1 ml TFA wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 20 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 50 ml von Chloroform-Methanol-Genschen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1, 3:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie identifiziert wurden, wobei 164 mg (0,19 mMol) der gewünschten Verbindung, BzlO-PEG-Ala-Pro-OH, erhalten wurden (Ausbeute: 33%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 5:1
    Rf-Wert: 0,2
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 7,36 (5H, m, C6H5), 5,19 (2H, s, CH2), 4,40 [2H, br, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,80 [1H, q, J = 6,0 Hz, CH(Ala)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,59 [2H, br, CH2(Pro)], 2,36 [1H, br, CH(Pro)], 2,02 [2H, br, CH2(Pro)], 1,29 [3H, brd, J = 3,5 Hz, CH3(Ala)]
  • Referenzbeispiel 3 Verbindung (VIII-3): BzlO-PEG-Gly-Pro-OH
  • (a) Verbindung (VI-3): H-Gly-Pro-OtBu
  • In 100 ml THF wurde 1,0 g (5,8 mMol) H-Pro-OtBu gelöst und 1,8 g (5,8 mMol) Z-Gly-ONSu wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden aufeinanderfolgend jeweils 50 ml Chloroform und ein Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) zugegeben. Die Chloroformschicht wurde extrahiert und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei ein öliger Rückstand erhalten wurde. Der erhaltene Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 200 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 150 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Chloroform:Methanol = 10:1, Rf-Wert: 0,9] identifiziert wurden, wobei 1,93 g Z-Gly-Pro-OtBu als eine ölige Substanz erhalten wurden. Die erhaltene Verbindung (1,93 g) wurde in 20 ml THF und 40 ml Methanol gelöst und 440 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einer Wasserstoffatmosphäre bei Raumtemperatur für 15 Stunden. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 1,13 g (4,9 mMol) der gewünschten Verbindung, H-Gly-Pro-OtBu, erhalten wurden (Ausbeute: 86%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 10:1
    Rf-Wert: 0,2
    Massenspektrum (SIMS): 211 (M+H)
  • (b) Verbindung (VIII-3): BzlO-PEG-Gly-Pro-OH
  • In 6,0 ml Methylenchlorid wurden 400 mg (0,58 mMol) BzlO-PEG-OH, welches in Referenzbeispiel 1 (a) erhalten worden war, gelöst und 119 mg DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten. Zu der resultierenden Lösung wurden 6,0 ml einer Lösung von 110 mg (0,48 mMol) H-Gly-Pro-OtBu, welches in vorstehendem (a) erhalten worden war, in Methylenchlorid gegeben, gefolgt von weiterem Rühren unter Eiskühlung für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden 5,0 ml Ethylacetat zugegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für eine Stunde. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 50 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 100 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Chloroform:Methanol = 10:1, Rf-Wert: 0,7] identifiziert wurden, wobei 0,21 g BzlO-PEG-Gly-Pro-OtBu erhalten wurden. In 5,1 ml Methylenchlorid wurden 0,21 g der erhaltenen Verbindung gelöst und 5,1 ml TFA wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 20 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 50 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1, 5:1, 3:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie identifiziert wurden, wobei 164 mg (0,2 mMol) der gewünschten Verbindung, BzlO-PEG-Gly-Pro-OH, erhalten wurden (Ausbeute: 33%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 10:1
    Rf-Wert: 0,2
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 7,36 (5H, m, C6H5), 5,19 (2H, s, CH2), 4,40 [2H, br, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,82 [2H, s, CH2(Gly)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,59 [2H, br, CH2(Pro)], 2,21 [1H, s, CH(Pro)], 2,02 [2H, br, CH2(Pro)]
  • Referenzbeispiel 4 Verbindung (VIII-4): PicO-PEG-Gly-Pro-OH
  • (a) Verbindung (V-2): PicO-PEG-OH
  • In 50 ml DMF wurden 10 g (16,7 mMol) HO-PEG-OH gelöst und 1,37 g (8,4 mMol) Picolylchlorid-Hydrochlorid und 3,4 ml (25,1 mMol) Triethylamin wurden aufeinanderfolgend dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 90 bis 100°C für 2 Stunden. Dann wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt, wobei ein Gemisch von Polyethylenglykoldicarbonsäure (nicht umgesetzt), Monopicolylester und Dipicolylester erhalten wurde. In 100 ml Chloroform wurden 1,97 g dieses Reaktionsgemisches gelöst und 100 ml Wasser wurden dazu gegeben, gefolgt von der Zugabe von 1 N Natriumhydroxid, um die Wasserschicht auf einen pH-Wert von 9,5 einzustellen. Nachdem die Wasserschicht extrahiert worden war und mit 1 N HCl auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt worden war, wurde eine Extraktion mit 100 ml-Portionen von Chloroform 6- bis 7-mal durchgeführt. Während den wiederholten Extraktionen wurde der pH-Wert der Wasserschicht mit 1 N HCl bei 6,5 gehalten. Nachdem die Chloroformschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden war, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt, wobei 1,0 g (1,5 mMol) der gewünschten Verbindung, PicO-PEG-OH, (Ausbeute: 8,9%) erhalten wurden.
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 3:1
    Rf-Wert: 0,5
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 5,21 (2H, s, CH2), 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 7,28 [2H, d, J = 3,5 Hz, H-3, H-5(Pic)], 8,65 [2H, d, J = 3,5 Hz, H-2, H-6(Pic)]
  • (b) Verbindung (VIII-4): PicO-PEG-Gly-Pro-OH
  • In 8 ml Methylenchlorid wurden 500 mg (0,73 mMol) PicO-PEG-OH, welches in vorstehendem (a) erhalten worden war, gelöst und 151 mg (0,73 mMol) DCC wurde unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten. Zu der resultierenden Lösung wurden 8 ml einer Lösung von 139 mg (0,61 mMol) H-Gly-Pro-OtBu, welches in Referenzbeispiel 3 (a) erhalten worden war, in Methylenchlorid gegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für 3 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden 5 ml Ethylacetat zugegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für eine Stunde. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 50 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 50 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 20:1, 10:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Chloroform:Methanol = 10:1, Rf-Wert: 0,5] identifiziert wurden, wobei 374 mg PicO-PEG-Gly-Pro-OtBu erhalten wurden. In 9,0 ml Methylenchlorid wurden 374 mg der erhaltenen Verbindung gelöst und 9,0 ml TFA wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 20 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 50 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie identifiziert wurden, wobei 131 mg (0,16 mMol) der gewünschten Verbindung, PicO-PEG-Gly-Pro-OH, erhalten wurden (Ausbeute: 26%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 5:1
    Rf-Wert: 0,1
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 5,21 (2H, s, CH2), 4,40 [2H, br, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,82 [2H, s, CH2(Gly)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,59 [2H, br, CH2(Pro)], 2,21 [1H, s, CH(Pro)], 2,02 [2H, br, CH2(Pro)], 7,28 [2H, d, J = 3,5 Hz, H-3, H-5(Pic)], 8,65 [2H, d, J = 3,5 Hz, H-2, H-6(Pic)]
  • Referenzbeispiel 5 Verbindung (VIII-5): PicO-PEG-Ala-Val-OH
  • In 7 ml Methylenchlorid wurden 459 mg (0,67 mMol) PicO-PEG-OH, welches in Referenzbeispiel 4 (a) erhalten worden war, gelöst und 138 mg (0,80 mMol) DCC wurde unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 20 Minuten. Zu der resultierenden Lösung wurden 7 ml einer Lösung von 134 mg (0,55 mMol) H-Ala-Val-OtBu, welches in Referenzbeispiel 1 (b) erhalten worden war, in Methylenchlorid gegeben, gefolgt von weiterem Rühren unter Eiskühlung für 3 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurden 5 ml Ethylacetat zugegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für eine Stunde. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 50 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 50 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 20:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Chloroform:Methanol = 10:1, Rf-Wert: 0,4] identifiziert wurden, wobei 328 mg PicO-PEG-Ala-Val-OtBu erhalten wurden. In 8,0 ml Methylenchlorid wurden 328 mg der erhaltenen Verbindung gelöst und 8,0 ml TFA wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels unter verringertem Druck wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 20 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 50 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 10:1, 5:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie identifiziert wurden, wobei 131 mg (0,15 mMol) der gewünschten Verbindung, PicO-PEG-Gly-Pro-OH, erhalten wurden (Ausbeute: 27%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 5:1
    Rf-Wert: 0,1
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 5,21 (2H, s, CH2), 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,23 [1H, s, CH(Ala)], 2,23 [1H, brq, J = 6,0 Hz, CH(Val)], 7,28 [2H, d, J = 3,5 Hz, H-3, H-5(Pic)], 1,26 [1H, s, CH(Val)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], 8,65 [2H, d, J = 3,5 Hz), H-2, H-6(Pic)], 0,89 [6H, q, J = 2,5 Hz, CH3(Val)]
  • Referenzbeispiel 6 Verbindung (XI-1): HO-PEG-Ala-Val-ADM
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 11,4 mg (13,3 μMol) Verbindung (VIII-1), welche in Referenzbeispiel 1 erhalten worden war, gelöst und 3,4 mg (29,5 μMol) HONSu und 6,2 mg (30,1 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde unter Eiskühlung eine Lösung, welche durch Lösen von 0,25 mg (0,46 μMol) Adriamycin-Hydrochlorid in 383 μl einer Lösung von Triethylamin in trockenem DMF (8,5 μg/ml) hergestellt worden war, gegeben. Nachdem man das resultierende Gemisch unter Eiskühlung für 30 Minuten stehengelassen hatte, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 3,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Das Nebenprodukt, BzlO-PEG-Ala-Val-ADM, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1) entfernt. Dann wurde das gewünschte HO-PEG-Ala-Val-ADM mit 20 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 179 μg (0,20 μMol) HO-PEG-Ala-Val-ADM erhalten wurden (Ausbeute von Adriamycin: 44%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Ala-Val-Einheit 4,19 (4H, s, OCH2), 3,48 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,22 [1H, brs, CH(Ala)], 2,23 [1H, brq, J = 6,0 Hz, CH(Val)], 1,25 [1H, s, CH(Val)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], 0,89 [6H, brm, CH3(Val)], Adriamycin-Einheit 7,99 (2H, d, J = 6,0 Hz, H-1, H-2), 7,73 (1H, brm, H-3), 5,43 (1H, brm, H-1'), 5,42 (1H, d, J = 3,7 Hz, H-14b), 5,35 (1H, d, J = 3,7 Hz, H-1'), 5,14 (1H, brs, H-7), 4,34 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-5'), 4,10 (3H, s, 4-OCH3), 3,22 (1H, d, J = 10 Hz, H-10b), 3,10 (1H, d, J = 18 Hz, H-10a), 2,50 (1H, brd, J = 14 Hz, H-8b), 2,23 (1H, d, J = 14 Hz, H-8a), 2,06 (1H, brm, H-2'b), 1,89 (1H, brm, H-2'a), 1,28 (3H, d, J = 6,5 Hz, 5'-CH3)
    Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Methanol, λmax): 232, 274, 495, 534, 575 nm
    Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3580, 3400, 3000, 2924, 2870, 1786, 1717, 1660, 1605, 1520, 1450, 1295, 1105 cm–1
  • Referenzbeispiel 7 Verbindung (XI-2): HO-PEG-Ala-Pro-ADM
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 9,5 mg (11,1 μMol) Verbindung (VIII-2), welche in Referenzbeispiel 2 erhalten worden war, gelöst und 3,4 mg (29,5 μMol) HONSu und 6,2 mg (30,1 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde unter Eiskühlung eine Lösung, welche durch Lösen von 0,25 mg (0,46 μMol) Adriamycin-Hydrochlorid in 383 μl einer Lösung von Triethylamin in trockenem DMF (8,5 μg/ml) hergestellt worden war, gegeben. Nachdem man das resultierende Gemisch unter Eiskühlung für 30 Minuten stehengelassen hatte, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 3,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Das Nebenprodukt, BzlO-PEG-Ala-Pro-ADM, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1) entfernt. Dann wurde das gewünschte HO-PEG-Ala-Pro-ADM mit 20 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 182 μg (0,21 μMol) HO-PEG-Ala-Pro-ADM erhalten wurden (Ausbeute von Adriamycin: 46%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Ala-Pro-Einheit 4,52 [2H, brm, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,75 [1H, q, J = 6,0 Hz, CH(Ala)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,55 [2H, br, CH2(Pro)], 2,34 [1H, br, CH(Pro)], 2,04 [2H, brm, CH2(Pro)], 1,15 [3H, br, CH3(Ala)], Adriamycin-Einheit 8,06 (2H, d, J = 6,0 Hz, H-1, H-2), 7,80 (1H, brm, H-3), 5,54 (1H, brm, H-1'), 5,51 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-14b), 5,29 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-14a), 5,19 (1H, brs, H-7), 4,31 (1H, t, J = 6,5 Hz, H-5'), 4,13 (3H, s, 4-OCH3), 3,41 (1H, d, J = 18 Hz, H-10b), 3,07 (1H, d, J = 18 Hz, H-10a), 2,59 (1H, brd, J = 14 Hz, H-8b), 2,27 (1H, d, J = 14 Hz, H-8a), 2,14 (1H, br, H-2'b), 1,82 (1H, br, H-2'a), 1,26 (3H, d, J = 6,5 Hz, 5'-CH3)
    Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Methanol, λmax): 233, 252, 290, 470, 495, 534, 578 nm
    Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3580, 3400, 3005, 2930, 2870, 1780, 1718, 1658, 1580, 1450, 1282, 1110 cm–1
  • Referenzbeispiel 8 Verbindung (XI-3): HO-PEG-Gly-Pro-ADM
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 10,8 mg (12,5 μMol) Verbindung (VIII-3), welche in Referenzbeispiel 3 erhalten worden war, gelöst und 3,4 mg (29,5 μMol) HONSu und 6,2 mg (30,1 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde unter Eiskühlung eine Lösung, welche durch Lösen von 0,175 mg (0,3 μMol) Adriamycin-Hydrochlorid in 250 μl einer Lösung von Triethylamin in trockenem DMF (8,5 μg/ml) hergestellt worden war, gegeben. Nachdem man das resultierende Gemisch unter Eiskühlung für 30 Minuten stehengelassen hatte, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 5,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Das Nebenprodukt, BzlO-PEG-Gly-Pro-ADM, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (5:1, 3:1, 2:1) entfernt. Dann wurde das gewünschte HO-PEG-Gly-Pro-ADM mit 20 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 240 μg (0,19 μMol) HO-PEG-Gly-Pro-ADM erhalten wurden (Ausbeute von Adriamycin: 62%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Gly-Pro-Einheit 4,22 [2H, brm, CH2(Pro)], 4,17 (4H, m, OCH2), 4,08 [2H, s, CH2(Gly)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,52 [2H, br, CH2(Pro)], 2,22 [1H, br, CH(Pro)], 1,95 [2H, brm, CH2(Pro)], Adriamycin-Einheit 8,05 (2H, m, H-1, H-2), 7,77 (1H, m, H-3), 5,50 (1H, d, J = 3,7 Hz, H-1'), 5,34 (1H, d, J = 3,5 Hz, H-14b), 5,30 (1H, d, J = 3,8 Hz, H-1'), 5,19 (1H, brs, H-7), 4,31 (1H, q, J = 6,8 Hz, H-5'), 4,10 (3H, s, 4-OCH3), 3,30 (1H, d, J = 18 Hz, H-10b), 3,03 (1H, d, J = 18 Hz, H-10a), 2,48 (1H, brd, J = 14 Hz, H-8b), 2,20 (1H, d, J = 14 Hz, H-8a), 2,04 (1H, brm, H-2'b), 1,83 (1H, m, H-2'a), 1,14 (3H, brd, J = 7 Hz, 5'-CH3)
    Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Methanol, λmax): 233, 250, 290, 470, 495, 530, 576 nm
    Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3590, 3400, 3000, 2940, 2860, 1720, 1650, 1450, 1115 cm–1
  • Referenzbeispiel 9 Verbindung (XI-4): HO-PEG-Ala-Val-DNR
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 11,4 mg (13,3 μMol) Verbindung (VIII-1), welche in Referenzbeispiel 1 erhalten worden war, gelöst und 3,6 mg (31,3 μMol) HONSu und 6,4 mg (31,0 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde unter Eiskühlung eine Lösung, welche durch Lösen von 0,90 mg (1,7 μMol) Daunorubicin-Hydrochlorid in 500 μl einer Lösung von Triethylamin in trockenem DMF (0,48 μg/ml) hergestellt worden war, gegeben. Nachdem man das resultierende Gemisch unter Eiskühlung für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für eine Stunde stehengelassen hatte, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 3,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Das Nebenprodukt, BzlO-PEG-Ala-Val-DNR, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1) entfernt. Dann wurde das gewünschte HO-PEG-Ala-Val-DNR mit 20 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 38 μg (0,03 μMol) HO-PEG-Ala-Val-DNR erhalten wurden (Ausbeute von Daunorubicin: 1,8%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Ala-Val-Einheit 4,19 (4H, s, OCH2), 3,49 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,20 [1H, brs, CH(Ala)], 2,29 [1H, brq, J = 5,7 Hz, CH(Val)], 1,29 [1H, s, CH(Val)], 1,24 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], 0,95 [6H, brm, CH3(Val)], Daunorubicin-Einheit 7,82 (2H, m, H-1, H-2), 7,72 (1H, m, H-3), 5,34 (1H, d, J = 3,7 Hz, H-1'), 5,27 (1H, brs, H-7), 4,31 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-5'), 4,19 (3H, s, 4-OCH3), 3,29 (1H, d, J = 18 Hz, H-10b), 3,12 (1H, d, J = 18 Hz, H-10a), 2,80 (3H, s, H-14), 2,34 (1H, brd, J = 14 Hz, H-8b), 2,22 (1H, d, J = 14 Hz, H-8a), 1,91 (1H, brm, H-2'b), 1,83 (1H, brm, H-2'a), 1,29 (3H, d, J = 6,5 Hz, 5'-CH3)
    Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Methanol, λmax): 232, 274, 495, 534, 575 nm
    Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3580, 3400, 3000, 2924, 2870, 1786, 1717, 1660, 1605, 1520, 1450, 1295, 1105 cm–1
  • Referenzbeispiel 10 Verbindung (XI-5): HO-PEG-Ala-Pro-DNR
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 9,7 mg (11,3 μMol) Verbindung (VIII-2), welche in Referenzbeispiel 2 erhalten worden war, gelöst und 3,1 mg (26,9 μMol) HONSu und 5,5 mg (26,7 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurden unter Eiskühlung 165 μl (0,5 μMol) einer Lösung, welche durch Lösen von 0,9 mg Daunorubicin-Hydrochlorid in 500 μl einer Lösung von Triethylamin in trockenem DMF (0,48 μg/ml) hergestellt worden war, gegeben. Nachdem man das resultierende Gemisch unter Eiskühlung für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für eine Stunde stehengelassen hatte, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 5,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Das Nebenprodukt, BzlO-PEG-Ala-Pro-DNR, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1) entfernt. Dann wurde das gewünschte HO-PEG-Ala-Pro-DNR mit 20 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 150 μg (0,1 μMol) HO-PEG-Ala-Pro-DNR erhalten wurden (Ausbeute von Daunorubicin: 20%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Ala-Pro-Einheit 4,52 [2H, br, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,75 [1H, q, J = 6,0 Hz, CH(Ala)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,42 [2H, br, CH2(Pro)], 2,37 [1H, br, CH(Pro)], 2,08 [2H, brm, CH2(Pro)], 1,29 [3H, br, CH3(Ala)], Daunorubicin-Einheit 8,03 (2H, m, H-1, H-2), 7,72 (1H, m, H-3), 5,52 (1H, brd, J = 3,7 Hz, H-1'), 5,36 (1H, brm, H-1'), 5,29 (1H, brs, H-7), 4,34 (1H, q, J = 6,5 Hz, H-5'), 4,09 (3H, s, 4-OCH3), 3,23 (1H, d, J = 18 Hz, H-10b), 3,01 (1H, d, J = 18 Hz, H-10a), 2,80 (3H, s, H-14), 2,42 (1H, brd, J = 14 Hz, H-8b), 2,23 (1H, d, J = 14 Hz, H-8a), 2,06 (1H, brm, H-2'b), 1,87 (1H, brm, H-2'a), 1,29 (3H, d, J = 6,5 Hz, 5'-CH3)
    Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Methanol, λmax): 232, 251, 290, 469, 495, 532, 580 nm
    Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3690, 3580, 3400, 3015, 2936, 2878, 1782, 1714, 1650, 1600, 1525, 1457, 1432, 1350, 1285, 1240, 1108 cm–1
  • Referenzbeispiel 11 Verbindung (XI-6): HO-PEG-Gly-Pro-DNR
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 11,0 mg (12,8 μMol) Verbindung (VIII-3), welche in Referenzbeispiel 3 erhalten worden war, gelöst und 3,5 mg (30,4 μMol) HONSu und 6,3 mg (30,5 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurden unter Eiskühlung 156 μl (0,5 μMol) einer Lösung, welche durch Lösen von 0,9 mg Daunorubicin-Hydrochlorid in 500 μl einer Lösung von Triethylamin in trockenem DMF (0,48 μg/ml) hergestellt worden war, gegeben. Nachdem man das resultierende Gemisch unter Eiskühlung für 30 Minuten und dann bei Raumtemperatur für eine Stunde stehengelassen hatte, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 5,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Das Nebenprodukt, BzlO-PEG-Gly-Pro-DNR, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (10:1, 7:1, 5:1, 3:1, 2:1) entfernt. Dann wurde das gewünschte HO-PEG-Gly-Pro-DNR mit 20 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 180 μg (0,1 μMol) HO-PEG-Gly-Pro-DNR erhalten wurden (Ausbeute von Daunorubicin: 26%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Gly-Pro-Einheit 4,51 [2H, brm, CH2(Pro)], 4,17 (4H, m, OCH2O), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,56 [2H, s, CH2(Gly)], 3,50 [2H, m, CH2(Pro)], 2,21 [1H, s, CH(Pro)], 2,02 [2H, brm, CH2(Pro)], Daunorubicin-Einheit 8,04 (2H, m, H-1, H-2), 7,79 (1H, m, H-3), 5,34 (1H, d, J = 3,7 Hz, H-1'), 5,27 (1H, brs, H-7), 4,52 (1H, q, J = 6,7 Hz, H-5'), 4,12 (3H, s, 4-OCH3), 3,22 (1H, d, J = 18 Hz, H-10b), 2,99 (1H, d, J = 18 Hz, H-10a), 2,90 (3H, s, H-14), 2,35 (1H, brd, J = 14 Hz, H-8b), 2,22 (1H, d, J = 14 Hz, H-8a), 2,02 (1H, brm, H-2'b), 1,18 (3H, d, J = 6,6 Hz, 5'-CH3) Ultraviolett-Absorptionsspektrum (in Methanol, λmax): 235, 252, 289, 470, 495, 534, 578 nm Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3580, 3000, 2930, 2880, 1790, 1719, 1658, 1610, 1450, 1404, 1350, 1290, 1110 cm–1
  • Referenzbeispiel 12 Verbindung (XI-7): HO-PEG-Ala-Val-Verbindung (20)
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 11,5 mg (13,4 μMol) Verbindung (VIII-1), welche in Referenzbeispiel 1 erhalten worden war, gelöst und 3,6 mg (31,3 μMol) HONSu und 6,4 mg (31,0 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2,5 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge an Chloroform gelöst und einer Reinigung unter Verwendung von 3,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Die Benzylesterform, BzlO-PEG-Ala-Val-ONSu, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (20:1, 10:1) entfernt. Dann wurde eine Lösung, welche durch Lösen von 0,05 mg (0,10 μMol) Verbindung (20), die in Referenzbeispiel 17 erhalten worden war, in 200 μl trockenem DMF hergestellt wurde, in die Säule eingebracht. Nachdem ferner 150 μl trockenes DMF auf die Säule gegeben worden waren, wurde das Gemisch einer Umsetzung bei Raumtemperatur für 30 Minuten unterworfen. Nach dem Waschen der Säule unter Verwendung von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (10:1, 5:1, 2:1) als der Entwickler wurde das gewünschte HO-PEG-Ala-Val-Verbindung (20) mit 10 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 112 μg (0,09 μMol) HO-PEG-Ala-Val-Verbindung (20) erhalten wurden [Ausbeute von Verbindung (20): 88%].
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Ala-Val-Einheit 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,23 [1H, s, CH(Ala)], 2,23 (1H, brq, J = 6,0 Hz, CH(Val)], 1,26 [1H, s, CH(Val)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], 0,89 [6H, q, J = 2,5 Hz, CH3(Val)], Verbindung (20)-Einheit 10,57 (1H, brs), 7,68 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,12 (1H, dd, J = 8,3, 2,0 Hz), 6,99 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,80 (1H, d, J = 8,1 Hz), 4,40 (1H, m), 4,27 (2H, m), 4,16 (1H, brd, J = 11,2 Hz), 3,90 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,67 (1H, m), 3,12 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,63 (3H, s), 2,38 (1H, dd, J = 7,5, 3,4 Hz), 1,52 (2H, m), 1,37 (1H, t, J = 4,2 Hz)
    Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3690, 3592, 3400, 3000, 2900, 1712, 1650, 1600, 1450, 1300, 1110 cm–1
  • Referenzbeispiel 13 Verbindung (XI-8): HO-PEG-Ala-Pro-Verbindung (20)
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 9,8 mg (11,4 μMol) Verbindung (VIII-2), welche in Referenzbeispiel 2 erhalten worden war, gelöst und 3,2 mg (27,8 μMol) HONSu und 5,6 mg (27,1 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge an Chloroform gelöst und einer Reinigung unter Verwendung von 3,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Die Benzylesterform, BzlO-PEG-Ala-Pro-ONSu, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (20:1, 10:1) entfernt. Dann wurde eine Lösung, welche durch Lösen von 0,05 mg (0,10 μMol) Verbindung (20), die in Referenzbeispiel 17 erhalten worden war, in 200 μl trockenem DMF hergestellt wurde, in die Säule eingebracht. Nachdem ferner 100 μl trockenes DMF auf die Säule gegeben worden waren, wurde das Gemisch einer Umsetzung bei Raumtemperatur für 30 Minuten unterworfen. Nach dem Waschen der Säule unter Verwendung von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (10:1, 2:1) als der Entwickler wurde das gewünschte HO-PEG-Ala-Pro-Verbindung (20) mit 10 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 233 μg (0,10 μMol) HO-PEG-Ala-Pro-Verbindung (20) erhalten wurden [Ausbeute von Verbindung (20): 100%].
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Ala-Pro-Einheit 4,52 [2H, brm, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,42 (2H, br, CH2(Pro)], 3,23 [1H, s, CH(Ala)], 2,37 [1H, br, CH(Pro)], 2,08 [2H, brm, CH2(Pro)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], Verbindung (20)-Einheit 10,23 (1H, brs), 7,68 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,10 (1H, dd, J = 8,3, 2,0 Hz), 6,89 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,80 (1H, d, J = 8,1 Hz), 4,40 (1H, m), 4,29 (2H, m), 4,20 (1H, brd, J = 11,2 Hz), 3,89 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,67 (1H, m), 3,12 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,63 (3H, s), 2,33 (1H, dd, J = 7,5, 3,4 Hz), 1,52 (2H, m), 1,35 (1H, t, J = 4,2 Hz) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3690, 3592, 3400, 3000, 2900, 1712, 1650, 1600, 1450, 1300, 1110 cm–1
  • Referenzbeispiel 14 Verbindung (XI-9): HO-PEG-Gly-Pro-Verbindung (20)
  • In 0,5 ml Methylenchlorid wurden 11,2 mg (13,0 μMol) Verbindung (VIII-3), welche in Referenzbeispiel 3 erhalten worden war, gelöst und 3,6 mg (31,3 μMol) HONSu und 6,4 mg (31,0 μMol) DCC wurden unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei 0°C für 2 Stunden. Das unlösliche Material (DCU) wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 300 μl Methanol in einem Stickstoffstrom gelöst und 2–3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Nach dem Entfernen des Katalysators durch Filtration wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge an Chloroform gelöst und einer Reinigung unter Verwendung von 3,0 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) unterworfen. Die Benzylesterform, BzlO-PEG-Gly-Pro-ONSu, wurde durch Elution unter Verwendung als der Entwickler von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (20:1, 10:1) entfernt. Dann wurde eine Lösung, welche durch Lösen von 0,05 mg (0,10 μMol) Verbindung (20), die in Referenzbeispiel 17 erhalten worden war, in 200 μl trockenem DMF hergestellt wurde, in die Säule eingebracht. Nachdem ferner 150 μl trockenes DMF auf die Säule gegeben worden waren, wurde das Gemisch einer Umsetzung bei Raumtemperatur für 30 Minuten unterworfen. Nach dem Waschen der Säule unter Verwendung von jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (10:1, 2:1) als der Entwickler wurde das gewünschte HO-PEG-Gly-Pro-Verbindung (20) mit 10 ml eines Gemisches von Chloroform:Methanol:Wasser (13:6:1) eluiert. Das Lösungsmittel wurde von der gewünschten Fraktion unter verringertem Druck entfernt, wobei 135 μg (0,10 μMol) HO-PEG-Gly-Pro-Verbindung (20) erhalten wurden [Ausbeute von Verbindung (20): 100%].
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol:Wasser = 13:6:1
    Rf-Wert: 0,6
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Gly-Pro-Einheit 4,22 [2H, brm, CH2(Pro)], 4,17 (4H, m, OCH2), 4,08 [2H, s, CH2(Gly)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,52 [2H, br, CH2(Pro)], 2,22 [1H, br, CH(Pro)], 1,95 [2H, brm, CH2(Pro)], Verbindung (20)-Einheit 9,97 (1H, brs), 7,54 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,22 (1H, dd, J = 8,3, 2,0 Hz), 6,99 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,88 (1H, d, J = 8,1 Hz), 4,40 (1H, m), 4,27 (2H, m), 4,16 (1H, brd, J = 11,2 Hz), 3,90 (3H, s), 3,82 (3H, s), 3,70 (1H, m), 3,12 (2H, t, J = 7,1 Hz), 2,63 (3H, s), 2,54 (1H, dd, J = 7,5, 3,4 Hz), 1,62 (2H, m), 1,35 (1H, t, J = 4,2 Hz) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3690, 3592, 3400, 3000, 2900, 1712, 1650, 1600, 1450, 1300, 1110 cm–1
  • Referenzbeispiel 15 Verbindung (12)
  • Verbindung (12) wurde gemäß den folgenden Reaktionsschritten synthetisiert.
  • Figure 00560001
  • Figure 00570001
  • In 30 ml DMF wurden 3,0 g (16 mMol) 4-Hydroxy-3,5-dimethoxybenzaldehyd [Verbindung (1)] gelöst und 3,4 g wasserfreies Kaliumcarbonat wurden dazu gegeben. Zu der resultierenden Lösung wurden tropfenweise 3,0 ml (25 mMol) Benzylbromid gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach der Zugabe von 300 ml 0,1 N HCl wurde das resultierende Gemisch zweimal mit 200 ml-Portionen von Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 300 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler ein Hexan:Ethylacetat-Gemisch (3:1) unterworfen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei 4,7 g (17 mMol) Verbindung (2) erhalten wurden (Ausbeute: 100%).
  • In 70 ml Methanol wurden 11,8 g (103 mMol) Methylazidoacetat in einem Argonstrom gelöst und 20,9 ml (103 mMol) 28% Natriummethoxid wurden tropfenweise bei –50°C über 75 Minuten dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 30 Minuten. Zu der resultierenden Lösung wurden 40 ml einer Lösung von 4,7 g Verbindung (2) in einem Methanol-Toluol-Gemisch (1:1) über 25 Minuten gegeben und man ließ die Temperatur des Gemisches von –50°C auf etwa –10°C mit Rühren für 24 Stunden steigen. Dann wurden geeignete Mengen an Wasser und Diethylether dazu gegeben, um die Etherschicht zu extrahieren. Die Etherschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei 2,8 g (7,5 mMol) Verbindung (3) erhalten wurden (Ausbeute: 45%).
  • In 750 ml Xylol wurden 2,8 g Verbindung (3) gelöst und die Lösung wurde bei 140 bis 150°C für 2 Stunden erwärmt. Nachdem die Lösung auf Raumtemperatur abgekühlt worden war, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 150 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch (4:1) unterworfen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei 2,4 g (7,0 mMol) Verbindung (4) erhalten wurden (Ausbeute: 93%).
  • In 116 ml eines Tetrahydrofuran-Methanol-Gemisches (1:1) wurden 2,4 g Verbindung (4) gelöst und 471 mg Platindioxid wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom für 24 Stunden. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 200 mg Platindioxid gegeben, gefolgt von weiterem Rühren in einem Wasserstoffstrom für 7 Stunden. Der Katalysator wurde durch Filtration unter Verwendung von Celite entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung einer Säule von Kieselgel (120 ml) und als der Entwickler ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch (3:1) unterworfen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei 1,6 g (6,4 mMol) Verbindung (5) erhalten wurden (Ausbeute: 91%).
  • In 5 ml DMF wurden 100 mg (0,4 mMol) Verbindung (5) gelöst und 275 mg (2 mMol) wasserfreies Kaliumcarbonat wurden dazu gegeben. Zu der resultierenden Lösung wurden tropfenweise 173 μl (2 mMol) 1,2-Dibromethan gegeben, gefolgt von Rühren in einem Stickstoffstrom bei Raumtemperatur für 19 Stunden. Nach der Zugabe eines Phosphatpuffers (pH-Wert 7) wurde das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über waserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 20 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler ein Hexan-Ethylacetat-Gemisch (2:1) unterworfen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei 94 mg (0,26 mMol) Verbindung (6) erhalten wurden (Ausbeute: 65%).
  • In 9,5 ml DMF wurden 94 mg (0,26 mMol) Verbindung (6) gelöst und 85 mg (1,3 mMol) Natriumazid wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 25 Stunden. Zu der resultierenden Lösung wurden geeignete Mengen von Ethylacetat und einem Phosphatpuffer (pH-Wert 7) gegeben, um die Ethylacetatschicht zu extrahieren. Nachdem die Ethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden war, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt, wobei 79 mg von Verbindung (7) erhalten wurden (Ausbeute: 95%).
  • In einem Gemisch von THF (8 ml) und Wasser (10 ml) wurden 79 mg Verbindung (7) gelöst und 2,5 ml 1 N wässrige Lösung von Natriumhydroxid wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 3,5 Stunden. Das Reaktionsgemisch wurde durch Zugabe von 1 N HCl sauer gemacht und unter Verwendung von Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei 75 mg Verbindung (8) erhalten wurden (Ausbeute: 98%).
  • In 7 ml Methylenchlorid wurden 75 mg Verbindung (8) unter Eiskühlung gelöst und 103 mg (0,5 mMol) DCC wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für eine Stunde. Zu der resultierenden Lösung wurden 70 mg (0,5 mMol) p-Nitrophenol und 61 mg (0,5 mMol) Dimethylaminopyridin gegeben, gefolgt von Rühren bei einer Temperatur von 0°C bis Raumtemperatur für 80 Minuten. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt und 0,5 N HCl wurde zu dem Filtrat gegeben, gefolgt von Extraktion mit Chloroform. Die Chloroformschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat und einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde das Produkt in Ethanol umkristallisiert, wobei 72 mg Verbindung (9) erhalten wurden (Ausbeute: 69%).
  • In einem Argonstrom wurden 37 mg (0,9 mMol) 50% Natriumhydroxid in 1,5 ml DMF gelöst und eine Lösung, welche durch Lösen von 185 mg (0,7 mMol) Verbindung (10), die gemäß dem in der veröffentlichten nicht geprüften Japanischen Patentanmeldung Nr. 178858/93 beschriebenen Verfahren erhalten worden war, in 2,9 ml DMF hergestellt wurde, wurde bei –20°C dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 3 Stunden. Zu der resultierenden Lösung wurde eine Lösung, welche durch Lösen von 368 mg (0,9 mMol) Verbindung (9) in 6 ml DMF hergestellt worden war, gegeben und die Temperatur des Gemisches ließ man von –20°C auf Raumtemperatur mit Rühren für 24 Stunden ansteigen. Zu dem resultierenden Gemisch wurden geeignete Mengen an Ethylacetat und eines Phosphatpuffers (pH-Wert 7,0) gegeben, um die Ethylacetatschicht zu extrahieren. Die Ethylacetatschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 80 ml Kieselgel und als der Entwickler ein Chloroform-Methanol-Gemisch (100:1) unterworfen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei 278 mg (0,5 mMol) Verbindung (11) erhalten wurden (Ausbeute: 71%).
  • Die Strukturen der Verbindungen (2) bis (9) und Verbindung (11) wurden durch 1H-NMR- und Massenspektrometrieanalyse bestätigt.
  • In einem Stickstoffstrom wurden 20 mg (36,6 μMol) Verbindung (11) in 1,1 ml eines Gemisches von Essigsäure (0,2 ml) und Tetrahydrofuran (9,8 ml) gelöst und 7,3 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden bei 10°C bis 15°C dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei 10°C bis 15°C für 3 Stunden und 20 Minuten. Nachdem das Gemisch auf eine Temperatur von unter –20°C abgekühlt worden war und der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck unter Kühlen entfernt, wobei 9 mg (17,3 μMol) Verbindung (12) erhalten wurden (Ausbeute: 47%).
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 11,58 (1H, brs, 1-NH), 9,40 (1H, brs, 1'-NH), 7,12 (1H, s, H-7), 6,95 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-3'), 6,81 (1H, s, H-4'), 4,45 (2H, m, H-5), 4,08 (3H, s, 7'-OCH3), 3,92 (2H, t, J = 5,2 Hz, OCH2), 3,90 (3H, s, 5'-OCH3), 3,82 (3H, s, 3-COOCH3), 3,67 (1H, m, H-4a), 3,20 (2H, q, J = 6,4 Hz, CH2), 2,63 (3H, s, 2-CH3), 2,38 (1H, dd, J = 7,5, 3,4 Hz, H-4), 1,37 (1H, t, J = 4,2 Hz, H-4)
    Massenspektrum (SIMS): 521 (M+H)
  • Referenzbeispiel 16 Verbindung (X-1): BzlO-PEG-Ala-Val-Verbindung (12)
  • In 2,4 ml Methylenchlorid wurden 13 mg (15,2 μMol) Verbindung (VIII-1), welche in Referenzbeispiel 1 erhalten worden war, gelöst und 2,0 mg HONSu und 4,3 mg DCC wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 2 Stunden. Das unlösliche Material wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Dann wurde der Rückstand in 2 ml Pyridin gelöst, gefolgt von der Zugabe einer Lösung, welche durch Lösen von 7,8 mg (15,0 μMol) Verbindung (12), die in Beispiel 24 erhalten worden war, in 1,5 ml Pyridin unter Eiskühlung hergestellt wurde. Das resultierende Gemisch wurde unter Eiskühlung für eine Stunde und dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden gerührt. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 5 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler von jeweils 5 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:1, 80:1, 60:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 0,5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei 2,8 mg (0,2 μMol) BzlO-PEG-Ala-Val-Verbindung (12) erhalten wurden (Ausbeute: 1,4%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 10:1
    Rf-Wert: 0,5
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): BzlO-PEG-Ala-Val-Einheit 7,36 (5H, m, C6H5), 5,19 (2H, s, CH2), 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,23 [1H, s, CH(Ala)], 2,23 [1H, brq, J = 6,0 Hz, CH(Val)], 1,26 [1H, s, CH(Val)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], 0,89 [6H, q, J = 2,5 Hz, CH3(Val)], Verbindung (12)-Einheit 11,58 (1H, brs, 1-NH), 9,40 (1H, brs, 1'-NH), 7,12 (1H, s, H-7), 6,95 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-3'), 6,81 (1H, s, H-4'), 4,45 (2H, m, H-5), 4,08 (3H, s, 7'-OCH3), 3,90 (3H, s, 5'-OCH3), 3,88 (2H, t, J = 5,2 Hz, OCH2), 3,82 (3H, s, 3-COOCH3), 3,67 (1H, m, H-4a), 3,20 (2H, q, J = 6,4 Hz, CH2), 2,63 (3H, s, 2-CH3), 2,38 (1H, dd, J = 7,5, 3,4 Hz, H-4), 1,37 (1H, t, J = 4,2 Hz, H-4)
    Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3595, 3450, 3010, 2900, 1750, 1665, 1608, 1515, 1460, 1310, 1110 cm–1
  • Referenzbeispiel 17 Verbindung (20)
  • Verbindung (20) wurde gemäß den folgenden Reaktionsschritten synthetisiert.
  • Figure 00630001
  • In einem Gemisch von Methanol (30 ml) und Benzol (105 ml) wurden 1,51 g (7,78 mMol) 3'-Hydroxy-4'-methoxyzimtsäure [Verbindung (13)] gelöst und 11 ml (9,6 mMol) einer 10%igen Lösung von Trimethylsilyldiazomethan in Hexan wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Zu der resultierenden Lösung wurden 2,0 ml einer 10%igen Lösung von Trimethylsilyldiazomethan in Hexan gegeben, gefolgt von Rühren für eine Stunde. Nach der Zugabe einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat wurde das Reaktionsgemisch mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei 1,55 g des Methylesters von 3'-Hydroxy-4'-methoxyzimtsäure [Verbindung (14)] erhalten wurden (Ausbeute: 95,6%).
  • In 60 ml DMF wurden 1,55 g (7,44 mMol) Verbindung (14) gelöst und 5,14 g (37,2 mMol) Kaliumcarbonat und 3,78 ml (37,2 mMol) 1,3-Dibrompropan wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 14 Stunden. Zu der resultierenden Lösung wurden Wasser und Ethylacetat gegeben, um die Ethylacetatschicht zu extrahieren. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser und einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde der Rückstand einer Reinigung durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung eines Hexan-Ethylacetat-Gemisches (4:1) als der Entwickler unterworfen, wobei 1,90 g des Methylesters von 3'-(3-Brompropyloxy)-4'-methoxyzimtsäure [Verbindung (15)] erhalten wurden (Ausbeute: 77,6%).
  • In 120 ml DMF wurden 1,90 g (5,77 mMol) Verbindung (15) gelöst und 1,88 g (28,9 mMol) Natriumazid wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 17 Stunden. Zu der resultierenden Lösung wurde eine gesättigte wässrige Lösung von Natriumhydrogencarbonat gegeben, gefolgt von Extraktion mit Ethylacetat. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser und einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei 1,81 g des rohen Methylesters von 3'-(3-Azidopropyloxy)-4'-methoxyzimtsäure [Verbindung (16)] erhalten wurden.
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 7,62 (1H, d, J = 15,8 Hz), 7,12 (1H, d, J = 7,9 Hz), 7,08 (1H, s), 6,86 (1H, d, J = 7,9 Hz), 6,29 (1H, d, J = 15,8 Hz), 4,12 (2H, t, J = 6,2 Hz), 3,89 (3H, s), 3,79 (3H, s), 3,55 (2H, t, J = 6,6 Hz), 2,10 (2H, m)
  • In einem Gemisch von THF (60 ml) und Wasser (2 ml) wurden 1,81 g rohe Verbindung (16) gelöst und 11,5 ml 1 N wässrige Lösung von Natriumhydroxid wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 19 Stunden. Nachdem das Reaktionsgemisch durch Zugabe von 2 N HCl auf einen pH-Wert von 4 eingestellt worden war, wurden Wasser und Ethylacetat dazu gegeben, um die Ethylacetatschicht zu extrahieren. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser und einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei 1,64 g rohe 3'-(3-Azidopropyloxy)-4'-methoxyzimtsäure [Verbindung (17)] erhalten wurden.
  • In 150 ml Methylenchlorid wurden 5,77 mMol Verbindung (17) gelöst und 1,36 g (9,8 mMol) 4-Nitrophenol, 2,73 ml (19,6 mMol) Triethylamin und 2,51 g (9,8 mMol) 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 5 Stunden. Zu der resultierenden Lösung wurden ferner 722 mg (5,2 mMol) 4-Nitrophenol, 1,45 ml (10,4 mMol) Triethylamin und 1,33 g (5,2 mMol) 2-Chlor-1-methylpyridiniumiodid gegeben, gefolgt von Rühren für 17 Stunden. Nach der Zugabe einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat wurde das Reaktionsgemisch mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung durch Kieselgel-Chromatographie unter Verwendung als der Entwickler von Hexan-Ethylacetat-Gemischen (4:1–2:1) unterworfen, wobei 2,15 g des 4-Nitrophenylesters von 3'-(3-Azidopropyloxy)-4'-methoxyzimtsäure [Verbindung (18)] erhalten wurden. Die erhaltene Verbindung wurde in Ethanol umkristallisiert, wobei 2,01 g Verbindung (18) erhalten wurden (Ausbeute: 87%).
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 8,30 (1H, d, J = 9,2 Hz), 8,17 (2H, d, J = 9,2 Hz), 7,84 (1H, d, J = 15,8 Hz), 7,37 (1H, d, J = 9,0 Hz), 7,16 (1H, s), 6,90 (2H, d, J = 9,2 Hz), 6,47 (1H, d, J = 15,8 Hz), 4,15 (1H, t, J = 6,2 Hz), 3,92 (3H, s), 3,57 (2H, t, J = 6,5 Hz), 2,12 (2H, m)
  • Zu 12 mg (0,3 mMol) 60%igem Natriumhydrid wurden 0,6 ml DMF gegeben und dann 1,5 ml einer Lösung von 60 mg (0,23 mMol) Verbindung (10) in DMF, gefolgt von Rühren in einer Argonatmosphäre bei 0°C für 2 Stunden. Nachdem das resultierende Gemisch auf –20°C abgekühlt worden war, wurden 1,5 ml einer Lösung von 124 mg (0,31 mMol) Verbindung (18) in DMF dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei –20 bis 0°C für 2 Stunden. Zu dem resultierenden Gemisch wurde 0,2 M Phosphatpuffer (pH-Wert 7) gegeben und dann wurde das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 30 ml Kieselgel und als der Entwickler ein Chloroform-Methanol-Gemisch (50:1) unterworfen, wobei 77 mg Verbindung (19) erhalten wurden (Ausbeute: 65%).
    1H-NMR-Spektrum (270 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 9,81 (1H, br), 7,68 (1H, d, J = 15,5 Hz), 7,11 (1H, dd, J = 8,3, 2,0 Hz), 7,01 (1H, d, J = 2,0 Hz), 6,81 (1H, d, J = 8,2 Hz), 6,66 (1H, d, J = 15,5 Hz), 6,56 (1H, br), 4,15 (1H, d, J = 11,2 Hz), 4,07 (2H, t, J = 3,6 Hz), 4,06 (1H, m), 3,84 (3H, s), 3,76 (3H, s), 3,50 (2H, t, J = 6,6 Hz), 3,46 (1H, m), 2,52 (3H, s), 2,31 (1H, dd, J = 7,3, 3,3 Hz), 2,05 (2H, m), 1,25 (1H, dd, J = 5,3, 3,4 Hz)
    Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr): 2098, 1697, 1622, 1608, 1516, 1392, 1263, 1217 cm–1
    Massenspektrum (SIMS): 518 (M+H)
  • In 1,5 ml THF wurden 15 mg (0,029 mMol) Verbindung (19) gelöst und 23 mg (0,088 mMol) Triphenylphosphin wurden dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten. Zu der resultierenden Lösung wurden 1,5 ml Wasser gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 24 Stunden. Nach der Zugabe einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumhydrogencarbonat wurde das Reaktionsgemisch mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 30 ml Kieselgel und als der Entwickler ein Chloroform-Methanol-Triethylamin-Gemisch (200:10:1) unterworfen, wobei 4 mg Verbindung (20) erhalten wurden (Ausbeute: 28%).
    1H-NMR-Spektrum (270 MHz, in DMSO-d6)δ(ppm): 7,75 (1H, d, J = 15,2 Hz), 7,54 (1H, brs), 7,49 (1H, br, J = 8,6 Hz), 7,18 (1H, d, J = 8,6 Hz), 7,09 (1H, d, J = 15,2 Hz), 7,03 (1H, br), 4,15 (1H, brd, J = 11,2 Hz), 4,39 (1H, m), 4,27 (2H, t, J = 3,6 Hz), 3,96 (3H, s), 3,87 (3H, s), 3,61 (1H, m), 3,12 (2H, t, J = 7,2 Hz), 2,61 (3H, s), 2,23 (1H, m), 2,16 (2H, m), 1,46 (1H, m)
    Infrarot-Absorptionsspektrum (KBr): 1647, 1610, 1512, 1458, 1394, 1385, 1294, 1219 cm–1
    Massenspektrum (SIMS): 492 (M+H)
  • Referenzbeispiel 18 Verbindung (X-2): BzlO-PEG-Ala-Pro-Verbindung (12)
  • In 3,5 ml Methylenchlorid wurden 21 mg (24,5 μMol) Verbindung (VIII-2), welche in Referenzbeispiel 2 erhalten worden war, gelöst und 3,4 mg HONSu und 6,3 mg DCC wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren für 2 Stunden. Nachdem das unlösliche Material durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde in 3,4 ml Pyridin gelöst, gefolgt von einer Zugabe einer Lösung von 9,9 mg (19 μMol) Verbindung (12), welche in Referenzbeispiel 15 erhalten worden war, in 2,0 ml Pyridin unter Eiskühlung. Das resultierende Gemisch wurde unter Eiskühlung für eine Stunde gerührt und dann bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde der Rückstand einer Reinigung unter Verwendung von 10 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 10 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:1, 80:1, 60:1, 40:1, 20:1, 10:1, 5:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 1,0 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei 10,0 mg (7,3 μMol) BzlO-PEG-Ala-Pro-Verbindung (12) erhalten wurden (Ausbeute: 39%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 10:1
    Rf-Wert: 0,5
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): BzlO-PEG-Ala-Pro-Einheit 7,36 (5H, m, C6H5), 5,19 (2H, s, CH2), 4,50 [2H, brm, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,42 [2H, br, CH2(Pro)], 3,23 [1H, s, CH(Ala)], 2,37 [1H, br, CH(Pro)], 2,08 [2H, brm, CH2(Pro)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], Verbindung (12)-Einheit 11,58 (1H, brs, 1-NH), 9,40 (1H, brs, 1'-NH), 7,12 (1H, s, H-7), 6,95 (1H, d, J = 2,3 Hz, H-3'), 6,81 (1H, s, H-4'), 4,45 (2H, m, H-5), 4,08 (3H, s, 7'-OCH3), 3,92 (2H, t, J = 5,2 Hz, OCH2), 3,90 (3H, s, 5'-OCH3), 3,82 (3H, s, 3-COOCH3), 3,67 (1H, m, H-4a), 3,20 (2H, q, J = 6,4 Hz, CH2), 2,63 (3H, s, 2-CH3), 2,38 (1H, dd, J = 7,5, 3,4 Hz, H-4), 1,37 (1H, t, J = 4,2 Hz, H-4) Infrarot-Absorptionsspektrum (in Chloroform): 3595, 3450, 3010, 2900, 1750, 1665, 1608, 1515, 1460, 1310, 1110 cm–1
  • Referenzbeispiel 19 Verbindung (25)
  • Verbindung (25) wurde gemäß den folgenden Reaktionsschritten synthetisiert.
  • Figure 00690001
  • In 75 ml Methylenchlorid wurden 3,1 g (15 mMol) 2-Bromethylamin-Hydrobromid gelöst und die Lösung wurde auf –40 bis –50°C abgekühlt. Nachdem 2,6 ml (18 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid tropfenweise dazu gegeben worden waren, ließ man die Temperatur des Gemisches über 24 Stunden auf Raumtemperatur ansteigen. Dann wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt und 50 ml Ethylacetat und 50 ml 1 N HCl wurden zu dem Rückstand gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 6 Stunden. Die Ethylacetatschicht wurde mit 50 ml einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, wobei 2,0 g Verbindung (21) erhalten wurden (Ausbeute: 53%).
  • In 10 ml DMF wurden 495 mg (2,0 mMol) Verbindung (5) gelöst und 545 mg wasserfreies Kaliumcarbonat und 1020 mg (4,0 mMol) Verbindung (21) wurden aufeinanderfolgend dazu gegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für 24 Stunden. Zu der resultierenden Lösung wurden aufeinanderfolgend 100 ml eines Phosphatpuffers (20 mMol, pH-Wert 7,0) und 100 ml Ethylacetat gegeben, um die Ethylacetatschicht zu extrahieren. Die Ethylacetatschicht wurde mit einer gesättigten wässrigen Lösung von Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 100 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 200 ml von Hexan-Ethylacetat-Gemischen (5:1, 4:1, 3:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 10 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Hexan:Ethylacetat = 2:1, Rf-Wert: 0,2] identifiziert wurden, wobei 713 mg (1,7 mMol) Verbindung (22) erhalten wurden (Ausbeute: 83%).
  • Zu 66 mg (0,15 mMol) Verbindung (22) wurden 1,5 ml THF und 1,5 ml Methanol gegeben und 6,6 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom für 18 Stunden. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 6,6 mg des Katalysators gegeben, gefolgt von weiterem Rühren für 5 Stunden. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 36 mg (0,12 mMol) Verbindung (23) (Segment B) erhalten wurden (Ausbeute: 82%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    Chloroform:Methanol = 5:1
    Rf-Wert: 0,3
  • In 1,5 ml Methylenchlorid wurden 109 mg (0,13 mMol) Verbindung (VIII-1), welche in Referenzbeispiel 1 erhalten worden war, gelöst und 21 mg HONSu und 38 mg DCC wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren unter Eiskühlung für 3 Stunden. Nachdem das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Zu dem Rückstand wurde 1 ml Methylenchlorid gegeben und 1 ml einer Lösung von 34 mg (0,12 mMol) Verbindung (23) in Methylenchlorid wurde unter Eiskühlung dazu gegeben. Man ließ die Temperatur des Gemisches mit Rühren für 24 Stunden auf Raumtemperatur ansteigen. Nachdem das unlösliche Material (DCU) durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 192 mg eines Rückstandes erhalten wurden. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 20 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler jeweils 20 ml von Chloroform-Methanol-Gemischen (100:0, 100:1, 50:1, 30:1, 20:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie [Kieselgel 60 (Merck & Co., Inc.), Chloroform:Methanol = 10:1, Rf-Wert: 0,4] identifiziert wurden, wobei 89 mg (0,08 mMol) Verbindung (24) erhalten wurden (Ausbeute: 68%). Die Strukturen der Verbindungen (21) bis (23) wurden durch 1H-NMR- und Massenspektrometrieanalyse bestätigt und die Struktur von Verbindung (24) wurde durch 1H-NMR bestätigt.
  • In einem Gemisch von 2 ml THF und 2 ml Methanol wurden 89 mg (79 μMol) Verbindung (24) gelöst und 18 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom für 15 Stunden. Nach der Zugabe von 9 mg des Katalysators wurde das Gemisch in einem Wasserstoffstrom für 9 Stunden gerührt. Dann wurden wieder 9 mg des Katalysators zugegeben, gefolgt von Rühren in einem Wasserstoffstrom für 15 Stunden. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde einer Reinigung unter Verwendung von 10 ml Kieselgel (Wako Gel C-200) und als der Entwickler Chloroform-Methanol-Gemische (100:0, 50:1, 30:1) unterworfen. Das Eluat wurde in 5 ml-Fraktionen genommen. Das Lösungsmittel wurde von den gewünschten Fraktionen unter verringertem Druck entfernt, wobei die gewünschten Fraktionen durch Kieselgel-Dünnschichtchromatographie identifiziert wurden, wobei 52 mg Verbindung (25) erhalten wurden (Ausbeute: 63%).
    Kieselgel-Dünnschichtchromatographie: Kieselgel 60
    (Merck & Co., Inc.)
    Chloroform:Methanol = 5:1
    Rf-Wert: 0,4
    1H-NMR-Spektrum (500 MHz, in CDCl3)δ(ppm): PEG-Ala-Val-Einheit 4,13 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,23 [1H, s, CH(Ala)], 2,22 [1H, brq, J = 6,0 Hz, CH(Val)], 1,26 [1H, s, CH(Val)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], 0,89 [6H, q, J = 2,5 Hz, CH3(Val)], Segment B-Einheit 9,40 (1H, brs, 1-NH), 6,95 (1H, d, J = 2,2 Hz, H-3), 6,82 (1H, s, H-4), 4,08 (3H, s, 7-OCH3), 3,92 (2H, d, J = 5,2 Hz, OCH2), 3,90 (3H, s, 5-OCH3), 3,85 (3H, s, 2-COOCH3), 3,20 (2H, q, J = 6,4 Hz, CH2)
  • Referenzbeispiel 20 KM-641-(PEG-Ala-Val-Segment B)m
  • In 0,8 ml Methylenchlorid wurden 7,8 mg (7,5 μMol) Verbindung (25), welche in Referenzbeispiel 19 erhalten worden war, gelöst und 1,0 ml einer Lösung von HONSu in Methylenchlorid (1 mg/ml) und 0,9 ml einer Lösung von DCC in Methylenchlorid (2 mg/ml) wurden aufeinanderfolgend unter Eiskühlung dazu gegeben, gefolgt von Rühren bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Nachdem das Lösungsmittel unter verringertem Druck entfernt worden war, wurde 1 ml DMSO zu dem Rückstand gegeben. Das resultierende Gemisch wurde unter Eiskühlung zu einer Lösung gegeben, welche durch Geben von 11,5 ml eines Phosphatpuffers zu 8 ml einer wässrigen Lösung von KM-641-Antikörper (1,47 mg/ml) hergestellt worden war, gefolgt von mildem Rühren bei 4°C für 24 Stunden. Nachdem das unlösliche Material mit einem Filter (0,22 μm) entfernt worden war, wurde die Antikörperfraktion durch Gelfiltrationschromatographie [Säule: 200 ml Sephacryl S 200 (Pharmacia Co., Ltd.), Entwickler: ein Phosphatpuffer, Fließrate: 0,5 ml/Minute, 11,5 ml-Fraktionen] gereinigt. Die 8. und 9. Fraktionen wurden gesammelt, wobei eine Lösung erhalten wurde, die 0,34 mg/ml KM-641-(PEG-Ala-Val-Segment B)m enthielt.
  • Die Anzahl der Moleküle von Segment B, welche pro Antikörpermolekül gebunden waren, wurde durch Unterwerfen des Konjugats einer Enzymbehandlung (Thermolysin) und quantitativen Bestimmung des freigesetzten H-Val-Segment B durch HPLC gemäß dem in Referenzbeispiel 22 beschriebenen Verfahren berechnet. Es wurde gefunden, dass in dem erhaltenen Konjugat die Anzahl der Moleküle von Segment B 1,9 pro Antikörpermolekül war.
  • Es wurde bestätigt, dass die Affinität des Konjugats gemäß dem folgenden Enzym-gekoppelten Immunadsorptionstest ungefähr gleich zu der eines nicht gebundenen Antikörpers war.
  • <Messung einer Affinität eines Antikörpers durch ELISA (Enzym-gekoppelter Immunadsorptionstest)>
  • Gangliosid GD3 (2 nMol) wurde in 2 ml Ethanol, welches 5 ng Phosphatidylcholin (Sigma Chemical Co.) und 2,5 ng Cholesterol enthielt, gelöst und die Lösung wurde in Vertiefungen einer Platte mit 96 Vertiefungen für ELISA (Linbro Co., Ltd.) in einer Menge von 20 μl/Vertiefung gegeben. Nach dem Trocknen der Vertiefungen wurde zum Blockieren ein Phosphatpuffer, der 1% Rinderserumalbumin enthielt, in die Vertiefungen gegeben. Das vorstehend beschriebene Konjugat (10 μg/ml, 50 μl) wurde in jede Vertiefung gegeben und man ließ die Platte bei Raumtemperatur für 2 Stunden (oder bei 4°C für 24 Stunden) stehen. Dann wurde Peroxidase-markierter Kaninchen-anti-Maus-Ig-Antikörper (Dako) als der zweite Antikörper in die Vertiefungen gegeben und man ließ die Platte bei Raumtemperatur für 1 bis 2 Stunden stehen, gefolgt von Waschen. ABTS (Sigma Chemical Co.)-Lösung wurde zugegeben und nachdem sich die Farbe entwickelt hatte, wurde Spektrofotometrie der Extinktion bei 414 nm unter Verwendung von NJ-2001 (Japan Intermed Co., Ltd.) durchgeführt.
  • Referenzbeispiel 21 Enzym-spezifische Spaltung eines Spacers – Versuch unter Verwendung eines Spacers, der an Segment B gebunden ist (Seitenkettenmodell)
  • Dieses Referenzbeispiel zeigt, dass die Peptidbindung eines Spacers, der an ein Antitumormittel gebunden ist, in einer Zelle durch ein spezifisches Enzym gespalten wird und dass die Spaltung des Spacers in einem Serum nicht stattfindet, wobei Verbindung (25), welche in Referenzbeispiel 19 erhalten worden war, verwendet wurde. Die Freisetzung von Segment B durch die Verwendung von Thermolysin als das Spaltungsenzym wurde in der folgenden Weise bestätigt.
  • Zu 0,1 ml einer Lösung von Verbindung (25) in einem Phosphatpuffer (0,2 mg/ml) wurden 0,1 ml einer Enzymlösung (0,1 mg/ml) (Menge an Enzym: 94 pU) gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Die Menge an H-Val-Segment B, welche von Verbindung (25) freigesetzt wurde, wurde durch Analysieren des Überstandes durch Umkehrphasen-HPLC überprüft (Spaltungswirksamkeit: 100%).
  • Umkehrphasen-HPLC-Bedingungen;
    Gerät: UVIDEC-100IV Spektrofotometriedetektor, TRIROTAR SR (Japan Spectroscopic Co., Ltd.)
    Säule: UNISIL PACK 5C18-150A (GL Sciences)
    Eluent: 50 mM Acetatpuffer (pH-Wert 4,5) [10–70% Acetonitril-Gradient (35 Minuten)]
    Fließrate: 0,7 ml/Minute
    Detektionswellenlänge: 300 nm
    Elutionszeit: 39,0 Minuten
    Massenspektrum (SIMS): 393,2 (M+H)
    Aminosäureanalyse: Val 1,0 (1,0)
  • Es wurde wie folgt bestätigt, dass der Spacer in einem Serum nicht gespalten wurde.
  • Zu 0,1 ml einer Lösung von Verbindung (25) in einem Phosphatpuffer (0,2 mg/ml) wurden 0,1 ml eines humanen Serums gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 2 Tage stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie im vorstehenden Versuch analysiert, außer dass 50 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 5,9) als der Eluent verwendet wurde. Als ein Ergebnis wurde der Peak, der sich von Segment B ableitet, nicht bestätigt.
  • Referenzbeispiel 22 Enzym-spezifische Spaltung eines Spacers – Versuch unter Verwendung eines Konjugats von einem Antikörper und Segment B über einen Spacer (Seitenkettenmodell)
  • Dieses Referenzbeispiel zeigt, dass die Peptidbindung eines Konjugats von einem Antikörper und einem Antitumormittel durch einen Spacer in einer Zelle durch ein spezifisches Enzym gespalten wird, aber in einem Serum stabil ist, wobei das Konjugat von einem Antikörper und Segment B durch einen Spacer, welches in Referenzbeispiel 20 erhalten worden war, verwendet wurde. Die spezifische Spaltung des Spacers wurde wie folgt unter Verwendung von Thermolysin als das intrazelluläre Spaltungsenzym und Plasmin als das proteolytische Hauptenzym im Blut bestätigt.
  • Zu 250 μl KM-641-(PEG-Ala-Val-Segment B)m, (0,33 mg/ml) wurden 2,5 μl Thermolysin (0,1 mg/ml) (Menge an Enzym: 2,4 pU) [oder 2,5 μl einer 1:200-Verdünnung von Plasmin (Menge an Enzym: 250 μU)] und 5,7 μl eines Phosphatpuffers gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in Referenzbeispiel 21 analysiert.
  • Der Peak von H-Val-Segment B, welcher ähnlich zu dem in Referenzbeispiel 21 war, wurde 42,0 Minuten nach dem Elutionsstart für das Konjugat, welches mit Thermolysin behandelt worden war, bestätigt, aber der Peak wurde nicht für das Konjugat, welches mit Plasmin behandelt worden war, bestätigt. Plasmin ist eines der proteolytischen Hauptenzyme im Blut, wobei diese Ergebnisse zeigen, dass das Konjugat im Blut stabil ist, aber dass, wenn es in eine Zelle eingebracht wird, seine Antitumormitteleinheit spezifisch durch ein spezifisches Enzym gespalten wird, wobei eine Antitumoraktivität bereitgestellt wird.
  • Referenzbeispiel 23 Enzym-spezifische Spaltung eines Spacers – Versuch unter Verwendung eines Spacers, der an Verbindung (12) gebunden ist
  • (1) Spaltung von Verbindung (X-1) [BzlO-PEG-Ala-Val-Verbindung (12)] mit Thermolysin
  • In 10 μl DMSO wurden 20 μg (15 nMol) Verbindung (X-1), welche in Referenzbeispiel 16 erhalten worden war, gelöst und 90 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 100 μl einer Thermolysin-Lösung (2 mg/ml) (Menge an Enzym: 1,9 μU) gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 5 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, wobei die Freisetzung von H-Val-Verbindung (12) aus Verbindung (X-1) (Elutionszeit: 35,1 Minuten) bestätigt wurde (Spaltungswirksamkeit: 78%).
  • Umkehrphasen-HPLC-Bedingungen;
    Gerät: Das selbe wie in Referenzbeispiel 21
    Eluent: Eine Lösung, welche 25% Puffer (pH-Wert 4,8) enthielt, hergestellt aus einer 0,2 M wässrigen Lösung von Dinatriumhydrogenphosphat und einer 0,1 M wässrigen Lösung von Zitronensäure [10–70% Acetonitril-Gradient (35 Minuten)]
    Fließrate: 0,7 ml/Minute
    Detektionswellenlänge: 330 nm
    Elutionszeit: 31,6 Minuten
    Massenspektrum (SIMS): 620 (M+H)
    Aminosäureanalyse: Val 1,0 (1,0)
  • (2) Spaltung von Verbindung (X-2) [BzlO-PEG-Ala-Pro-Verbindung (12)] mit Prolinendopeptidase
  • Zu 54 μg (40 nMol) Verbindung (X-2), welche in Referenzbeispiel 18 erhalten worden war, wurden 20 μl DMSO und 370 μl eines Phosphatpuffers gegeben. Nachdem 10 μl einer Prolinendopeptidase-Lösung (0,1 mg/ml) zugegeben worden waren, ließ man das Gemisch bei 37°C für 2,5 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, wobei die Freisetzung von Verbindung (12) aus Verbindung (X-2) bestätigt wurde (Spaltungswirksamkeit: 100%).
  • Umkehrphasen-HPLC-Bedingungen;
    Gerät: Das selbe wie in Referenzbeispiel 21
    Eluent: 50 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 5,9) (10–70% Acetonitril-Gradient)
    Fließrate: 0,7 ml/Minute
    Detektionswellenlänge: 330 nm
    Elutionszeit: 30,6 Minuten [stimmte mit der für Verbindung (12) überein]
    Massenspektrum (SIMS): 521 (M+H)
  • Referenzbeispiel 24 Enzym-spezifische Spaltung eines Spacers – Versuch unter Verwendung eines Konjugats von einem Antikörper und Verbindung (12) über einen Spacer
  • Zu 740 μl Verbindung (Ia-11) {KM-641-[PEG-Ala-Val-Verbindung (12)]m}, welche in Beispiel 11 erhalten worden war, (0,07 mg/ml) wurden 5,1 μl einer Thermolysin-Lösung (0,1 mg/ml) (Menge an Enzym: 26 μU) gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 8 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in Referenzbeispiel 23 (1) analysiert, wobei die Freisetzung von H-Val-Verbindung (12) aus Verbindung (Ia-11) bestätigt wurde.
    Elutionszeit: 31,6 Minuten
    Massenspektrum (SIMS): 620 (M+H)
  • Referenzbeispiel 25 Enzym-spezifische Spaltung eines Spacers – Versuch unter Verwendung eines Spacers, der an Adriamycin gebunden ist
  • (1) Spaltung von Verbindung (XI-3) (HO-PEG-Gly-Pro-ADM) mit Prolinendopeptidase
  • In 20 μl DMSO wurden 14,3 μg (11 nMol) Verbindung (XI-3), welche in Referenzbeispiel 8 erhalten worden war, gelöst und 210 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 80 μl Prolinendopeptidase (1,0 mg/ml) (Menge an Enzym: 2,8 U) gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, wobei die Freisetzung von ADM aus Verbindung (XI-3) (Elutionszeit: 23,3 Minuten) bestätigt wurde (Spaltungswirksamkeit: 50%).
  • Umkehrphasen-HPLC-Bedingungen;
    Eluent: 50 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 5,9) [10–70% Acetonitril-Gradient (35 Minuten)]
    Fließrate: 0,7 ml/Minute
    Detektionswellenlänge: 233 nm
    Elutionszeit: 24,0 Minuten (stimmte mit der für ADM überein)
    Massenspektrum (SIMS): 544,2 (M+H) (stimmte mit dem für ADM überein)
  • (2) Spaltung von Verbindung (XI-1) (HO-PEG-Ala-Val-ADM) mit Thermolysin
  • In 10 μl DMSO wurden 0,09 mg (10,2 nMol) Verbindung (XI-1), welche in Beispiel 6 erhalten worden war, gelöst und 210 μl eines Phosphatpuffers wurden dazu gegeben. Zu dem resultierenden Gemisch wurden 80 μl Thermolysin (1,0 mg/ml) (Menge an Enzym: 750 pU) gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in (1) analysiert, wobei die Freisetzung von H-Val-ADM aus Verbindung (XI-1) (Elutionszeit: 23,8 Minuten) bestätigt wurde (Spaltungswirksamkeit: 100%).
    Elutionszeit: 25,2 Minuten
    Massenspektrum (SIMS): 643 (M+H)
  • Referenzbeispiel 26 Enzym-spezifische Spaltung eines Spacers – Versuch unter Verwendung eines Konjugats von einem Antikörper und Adriamycin über einen Spacer
  • (1) Spaltung von Verbindung (Ia-3) [NL-1-(PEG-Gly-Pro-ADM)m] mit Prolinendopeptidase
  • Zu 35 μl von Verbindung (Ia-3), welche in Beispiel 3 erhalten worden war, (0,19 mg/ml) wurden 70 μl Prolinendopeptidase (1,0 mg/ml) (Menge an Enzym: 2,4 U) und 95 μl eines Phosphatpuffers gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in Referenzbeispiel 25 analysiert, wobei die Freisetzung von ADM aus Verbindung (Ia-3) bestätigt wurde (Spaltungswirksamkeit: 10%).
    Elutionszeit: 23,7 Minuten (stimmte mit der für ADM überein)
  • (2) Spaltung von Verbindung (Ia-1) [NL-1(PEG-Ala-Val-ADM)m] mit Thermolysin
  • Zu 50 μl von Verbindung (Ia-1), welche in Beispiel 1 erhalten worden war, (0,42 mg/ml) wurden 50 μl Thermolysin (2,0 mg/ml) (Menge an Enzym: 0,9 μU) und 100 μl eines Phosphatpuffers gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in Referenzbeispiel 25 analysiert, wobei die Freisetzung von H-Val-ADM aus Verbindung (Ia-1) bestätigt wurde (Spaltungswirksamkeit: 100%).
    Elutionszeit: 28,1 Minuten
  • (3) Spaltung von Verbindung (Ia-2) [NL-1-(PEG-Ala-Pro-ADM)m] mit Prolinendopeptidase
  • Zu 40 μl von Verbindung (Ia-2), welche in Beispiel 2 erhalten worden war, (0,27 mg/ml) wurden 110 μl Prolinendopeptidase (1,0 mg/ml) (Menge an Enzym: 3,9 U) und 50 μl eines Phosphatpuffers gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in Referenzbeispiel 25 analysiert, wobei die Freisetzung von ADM aus Verbindung (Ia-2) bestätigt wurde (Spaltungswirksamkeit: 10%).
    Elutionszeit: 23,9 Minuten (stimmte mit der für ADM überein)
  • Referenzbeispiel 27 Enzym-spezifische Spaltung eines Spacers – Versuch unter Verwendung eines Konjugats von einem Antikörper und Verbindung (20) über einen Spacer
  • (1) Spaltung von Verbindung (Ia-9) {NL-1-[PEG-Gly-Pro-Verbindung (20)]m} mit Prolinendopeptidase
  • Zu 17 μl von Verbindung (Ia-9), welche in Beispiel 9 erhalten worden war, (1,2 mg/ml) wurden 80 μl Prolinendopeptidase (1,0 mg/ml) (Menge an Enzym: 2,8 U) und 53 μl eines Phosphatpuffers gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC analysiert, wobei die Freisetzung von Verbindung (20) aus Verbindung (Ia-9) bestätigt wurde.
  • Umkehrphasen-HPLC-Bedingungen;
    Das selbe Gerät und die selbe Säule wie in Referenzbeispiel 21 wurden verwendet.
    Eluent: 50 mM Phosphatpuffer (pH-Wert 7,0) [10–70% Acetonitril-Gradient (35 Minuten)]
    Fließrate: 0,7 ml/Minute
    Detektionswellenlänge: 330 nm
    Elutionszeit: 26,0 Minuten [stimmte mit der für Verbindung (20) überein]
  • (2) Spaltung von Verbindung (Ia-7) [NL-1-[PEG-Ala-Val-Verbindung (20)]m} mit Thermolysin
  • Zu 18 μl von Verbindung (Ia-7), welche in Beispiel 7 erhalten worden war, (1,1 mg/ml) wurden 60 μl Thermolysin (3,0 mg/ml) (Menge an Enzym: 1,7 μU) und 72 μl eines Phosphatpuffers gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in (1) analysiert, wobei die Freisetzung von H-Val-Verbindung (20) aus Verbindung (Ia-7) bestätigt wurde.
    Elutionszeit: 17,7 Minuten
  • (3) Spaltung von Verbindung (Ia-8) {NL-1-[PEG-Ala-Pro-Verbindung (20)]m) mit Prolinendopeptidase
  • Zu 11 μl von Verbindung (Ia-8), welche in Beispiel 8 erhalten worden war, (1,8 mg/ml) wurden 80 μl Prolinendopeptidase (1,0 mg/ml) (Menge an Enzym: 2,8 U) und 59 μl eines Phosphatpuffers gegeben und man ließ das Gemisch bei 37°C für 24 Stunden stehen. Der resultierende Überstand wurde durch Umkehrphasen-HPLC unter den gleichen Bedingungen wie in (1) analysiert, wobei die Freisetzung von Verbindung (20) aus Verbindung (Ia-8) bestätigt wurde.
    Elutionszeit: 25,9 Minuten [stimmte mit der für Verbindung (20) überein]
  • Referenzbeispiel 28 Verbindung (IIa-1): HO-PEG-Ala-Val-OH
  • In 5,0 ml Methanol wurden 100 mg (117 μMol) Verbindung (VIII-1), welche in Referenzbeispiel 1 erhalten worden war, in einem Stickstoffstrom gelöst und 20 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 76 mg (99 μMol) HO-PEG-Ala-Val-OH erhalten wurden (Ausbeute: 85%).
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 4,12 (4H, s, OCH2), 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,23 [1H, s, CH(Ala)], 2,23 [1H, brq, J = 6,0 Hz, CH(Val)], 1,26 [1H, s, CH(Val)], 1,17 [3H, d, J = 2,8 Hz, CH3(Ala)], 0,89 (6H, brd, J = 2,5 Hz, CH3(Val)]
  • Referenzbeispiel 29 Verbindung (IIa-2): HO-PEG-Ala-Pro-OH
  • In 5,0 ml Methanol wurden 100 mg (117 μMol) Verbindung (VIII-2), welche in Referenzbeispiel 2 erhalten worden war, in einem Stickstoffstrom gelöst und 20 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 3 Stunden. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 70 mg (91 μMol) HO-PEG-Ala-Pro-OH erhalten wurden (Ausbeute: 78%).
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 4,40 [2H, br, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,80 [1H, q, J = 6,0 Hz, CH(Ala)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,59 [2H, br, CH2(Pro)], 2,36 [1H, br, CH(Pro)], 2,02 [2H, br, CH2(Pro)], 1,29 [3H, brd, J = 3,5 Hz, CH3(Ala)]
  • Referenzbeispiel 30 Verbindung (IIa-3): HO-PEG-Gly-Pro-OH
  • In 5,0 ml Methanol wurden 100 mg (116 μMol) Verbindung (VIII-3), welche in Referenzbeispiel 3 erhalten worden war, in einem Stickstoffstrom gelöst und 20 mg 10% Palladium-Kohlenstoff-Katalysator wurden dazu gegeben, gefolgt von starkem Rühren in einem Wasserstoffstrom bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Nachdem der Katalysator durch Filtration entfernt worden war, wurde das Lösungsmittel von dem Filtrat unter verringertem Druck entfernt, wobei 76 mg (98 μMol) HO-PEG-Gly-Pro-OH erhalten wurden (Ausbeute: 85%).
    1H-NMR-Spektrum (100 MHz, in CDCl3)δ(ppm): 4,40 [2H, br, CH2(Pro)], 4,12 (4H, s, OCH2), 3,82 [2H, s, CH2(Gly)], 3,64 (4nH, brs, OCH2CH2), 3,59 [2H, br, CH2(Pro)], 2,21 [1H, s, CH(Pro)], 2,02 [2H, br, CH2(Pro)]
  • Industrielle Verwendbarkeit
  • Ein Cytotoxinkonjugat, welches als Wirkstoff eines Antitumormittels nützlich ist, und eine in vitro-Diagnosetechnik unter Verwendung des Konjugats werden beschrieben. Das Konjugat umfasst ein Cytotoxin und eine Verbindung mit einer Affinität zu einer Zielzelle, zum Beispiel einen Antikörper oder ein Antikörperfragment, welches spezifisch für einen Krebs ist, wobei das Cytotoxin und die Verbindung über einen Spacer gebunden sind.

Claims (9)

  1. Cytotoxinkonjugat, bei welchem ein Rest, abgeleitet von einer Verbindung mit Affinität zu einer Zielzelle, durch einen Spacer umfassend Polyalkylenglykol und Dipeptid an ein Cytotoxin gebunden ist.
  2. Cytotoxinkonjugat gemäß Formel (I) Z-(X1-CH2(OCH2CH2)nOCH2CO-R1R2-W-Y1)m (I)wobei Z ein Rest, abgeleitet von einer Verbindung mit Affinität zu einer Zielzelle, darstellt; X1 CO, S oder
    Figure 00830001
    darstellt; W eine Einfachbindung oder
    Figure 00830002
    darstellt; Y1 ein Cytotoxin darstellt; R1 und R2, welche gleich oder verschieden sein können, jeweils einen Aminosäurerest darstellen; n eine ganze Zahl von 1–1000 darstellt; und m eine ganze Zahl von 1–100 darstellt.
  3. Cytotoxinkonjugat gemäß Anspruch 2, wobei Z CO, N, S oder O aufweist, und Y1 N, S oder O aufweist, mit der Maßgabe, dass falls X1 S ist, Z durch CO an X1 gebunden ist, und falls X1 eine andere Gruppe als S ist, Z durch N, S oder O an X1 gebunden ist und Y1 durch N, S oder O an W oder R2 gebunden ist.
  4. Cytotoxinkonjugat gemäß Anspruch 2 oder 3, wobei Z ein Rest abgeleitet von einem Protein oder Peptid ist.
  5. Cytotoxinkonjugat gemäß Anspruch 4, wobei das Protein ein Antikörper oder ein Antikörperfragment ist.
  6. Cytotoxinkonjugat gemäß einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei R1 einen Alaninrest, einen Leucinrest oder einen Glycinrest darstellt; und R2 einen Prolinrest, einen Valinrest oder einen Leucinrest darstellt.
  7. Cytotoxinkonjugat gemäß einem der Ansprüche 2 bis 6, wobei Y1 ein von Adriamycin, Daunorubicin, einem Duocarmycinderivat, Mitomycin A, Mitomycin C, Ricin A, Diphtherietoxin, oder Pseudomonas Exotoxin abgeleiteter Rest ist.
  8. Cytotoxinkonjugat gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Verwendung bei der Behandlung von Krebs.
  9. Verwendung des Cytotoxinkonjugats gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 bei der Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung von Krebs.
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