DE60105037T2

DE60105037T2 - Verfahren zur kupplung in lösung zwischen einem peptid und einer lipophilen verbindung, und verwendungen davon

Info

Publication number: DE60105037T2
Application number: DE60105037T
Authority: DE
Inventors: Dominique Bonnet; Line Bourel; Oleg Melnyk; Helène GRAS-MASSE
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur de Lille; Institut Pasteur
Priority date: 2000-09-08
Filing date: 2001-09-07
Publication date: 2005-06-02
Anticipated expiration: 2021-09-08
Also published as: WO2002020558A2; EP1315739B1; JP2004510709A; FR2813794A1; US20040092015A1; DE60105037D1; WO2002020558A3; CA2421791A1; FR2813794B1; JP5072164B2; AU8783201A; EP1315739A2; ATE273993T1; CA2421791C; AU2001287832B2; US7390875B2; AU2001287832C1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Kupplung in Lösung zwischen wenigstens einer Peptidverbindung und wenigstens einem lipophilen Vektor, der eine Aldehydfunktion aufweist, auf lipophile Vektoren, die in diesem Verfahren verwendet werden können, auf so erhaltene Lipopeptide und auf Anwendungen dieses Verfahrens, insbesondere zum Erhalt von Medikamenten.
Das Problem des Eintritts von verschiedenen Substanzen, die mit pharmakologischen Eigenschaften ausgestattet sind, in die lebenden Zellen hat eine große Bedeutung auf dem therapeutischen Gebiet. Für die synthetischen Peptide und die Oligonucleotide ist es schwierig, die Zellmembran zu durchdringen. Eine interessante Vorgehensweise zum Verbessern ihrer Fähigkeit, in die Zelle einzudringen, ist, sie mit einem lipophilen Teil zu modifizieren. So wurde gezeigt, dass ein durch eine einfache aliphatische Kette modifiziertes Peptid durch passiven Transfer über die Membran in das Innere der Zelle vordringen und mit seinem intrazytoplasmatischen Ziel wechselwirken kann. Die Lipopeptide stellen folglich interessante Moleküle zum Einschleusen bzw. Vektorisieren einer funktionellen Einheit in das Innere einer Zelle dar.
Die Synthese von Lipopeptiden kann z. B. durch Kuppeln einer Fettsäure an ein Peptid in fester Phase durchgeführt werden, wie es insbesondere von K. THIAM et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, 253, 639–647 und in Journal of Medicinal Chemistry, 1999, 42, 3732–3736, sowie von C. KLINGUER et al. in Vaccine, 2000, 18, 259–267 beschrieben ist. Am Ende der Synthese müssen die Schritte der Spaltung der Peptid/fester Träger-Bindung und der Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten des Peptids durch eine starke Säure durchgeführt werden. Diese Behandlung beschränkt die Wahl des lipophilen Teils erheblich; sie verbietet insbesondere die Verwendung von ungesättigten Fettsäuren. Außerdem ist die Reinigung der Lipopeptide durch Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatographie, die nach der Spaltung der Peptid/Träger-Bindung erforderlich ist, schwierig und führt zu geringen Ausbeuten im Hinblick auf die zahlreichen Verunreinigungen, die am Ende der Synthese vorhanden sind.
Es wurde auch vorgeschlagen, in Lösung ein Protein an eine Palmitoyl-Coenzym A-Gruppe zu kuppeln, wobei letztere an der Thiolgruppe eines Cysteins eingeführt wird. Eine solche Kupplung führt zur Bildung einer Thioesterbindung, welche den Nachteil aufweist, dass sie wenig stabil ist. Andererseits ist diese Strategie auf die Modifizierung von bestimmten Proteinen durch das Palmitoyl-Coenzym A beschränkt und kann nicht auf die Synthese von Lipopeptiden verallgemeinert werden.
Die aktuellen Strategien für die Synthese von Lipopeptiden bestehen auch darin, chemische Ligationsreaktionen einzusetzen. Die chemische Ligation ermöglicht es, in Lösung und unter äußerst milden Bedingungen zwei zuvor gereinigte und von allen Schutzgruppen befreite Peptidstrukturen zu verbinden.
Es wurde daher vorgeschlagen, in einem wässrigen Puffer eine Fettsäure durch eine Disulfidbindung mit einem Peptid zu verbinden. Die Disulfidbindung weist jedoch zahlreiche Probleme auf; eine solche Bindung ist in der Tat wenig stabil und kann in Gegenwart von Thiolen abgebaut werden, daher ist es notwendig, die Verunreinigung der zur Löslichmachung der Produkte verwendeten Lösungsmittel durch Thiole zu vermeiden, und es ist nicht möglich, ein Cystein in die zu vektorisierende Peptidsequenz einzuführen. Die Verwendung der Thiolchemie macht es außerdem erforderlich, unter Inertatmosphäre zu arbeiten, um eine Oxidation der Thiole zu vermeiden.
W. ZENG et al. (J. Pept. Sc., 1996, 2, 66–72) haben auch vorgeschlagen, in Lösung ein von allen Schutzgruppen befreites und zuvor gereinigtes Peptid an eine an ein Peptid gebundene polyfunktionelle Peptidstruktur zu binden, und zwar auf dem Umweg über eine Oximbindung. Der lipophile Teil wird an einer Peptidsequenz in fester Phase eingeführt, wobei ein solches Verfahren die vorstehend erwähnten Nachteile aufweist, nämlich die Beschränkung im Hinblick auf die Wahl des lipophilen Teils und die Schwierigkeiten, die mit der Reinigung der Lipidstruktur verbunden sind.
Auf ähnliche Weise haben O. MELNYK et al. (J. Peptide Res., 1998, 52, 180–184) die Ligation, in Lösung und durch eine Hydrazonbindung, zwischen einem Peptid, das eine lipophile Kette und eine Aldehydfunktion aufweist, und einem anderen Peptid, das an der Seitenkette von Lysin durch eine Hydrazinogruppe modifiziert ist, beschrieben. Die Hydrazonbindung erfolgt in Lösung, aber die lipophile Verbindung mit peptidartiger Beschaffenheit wird in fester Phase synthetisiert und die Beschränkungen sind die gleichen, die vorstehend erwähnt wurden.
Außerdem haben C. KLINGUER et al. (Tetrahedron Letters, 1996, 37, 40, 7259–7262) die Ligation, in einem Wasser/Acetonitril-Gemisch, zwischen Cyclohexancarboxaldehyd und einem Peptid, das eine Hydrazinfunktion aufweist, beschrieben. Das von diesen Autoren beschriebene Verfahren gestattet jedoch nicht, stabile und folglich für die Einschleusung bzw. Vektorisierung von Wirkstoffen brauchbare Verbindungen zu erhalten: in der Tat ist die zwischen dem Hydrazin und dem Aldehyd gebildete Hydrazonbindung in einem breiten pH-Bereich instabil.
Schließlich haben D. BONNET et al. (Tetrahedron Letters, 2000, 41, 45–48) die Ligation, in Lösung und durch eine Hydrazidbindung, von mit einem α-Hydrazinoessigsäurerest funktionalisierten Peptiden mit aktivierten Fettsäureestern beschrieben. Dieses Verfahren, das auch in der französischen Patentanmeldung Nr. 99 10626 beschrieben ist, gestattet die Einführung von komplexen Fettsäuren an Peptiden. Es ist jedoch am Ende der Synthese eine Reinigung durch HPLC erforderlich, um das Lipopeptid von Salzen, Aktivierungsreagenzien und Verunreinigungen (insbesondere dem polyacylierten Peptid) abzutrennen, die sich in dem Reaktionsmedium befinden. Diese Reinigung wird durch die Eigenschaften der Kupplung in Lösung vereinfacht, ist aber dennoch aus den vorstehend genannten Gründen notwendig. Dieses Kupplungsverfahren eignet sich folglich nicht für die Synthese eines Gemisches von Lipopeptiden, wie solchen, die in bestimmten Impfstoffen verwendet werden (H. GAHERY-SEGARD et al., Journal of Virology, 2000, 74, Nr. 4, 1694–1703; C. KLINGUER et al., Vaccine, ebenda).
In Anbetracht der vorstehend erwähnten Nachteile des Standes der Technik haben sich die Erfinder die Aufgabe gestellt, eine neue Strategie zur Synthese von Lipopeptiden und allgemeiner von durch verschiedene Verbindungen mit lipidartiger Beschaffenheit modifizierten Peptiden durch chemische Ligation in Lösung bereitzustellen.
Diese neue Synthesestrategie muss insbesondere die folgenden Kriterien erfüllen:

– die Kupplung der Verbindung mit lipidartiger Beschaffenheit an das Peptid erfolgt in Lösung,
– die Kupplung erfolgt ausgehend von einem Peptid, von dem alle Schutzgruppen entfernt sind, wobei die Reaktion chemoselektiv ist,
– die Reaktionsbedingungen der Kupplung gestatten die Verwendung von Fettsäurederivaten, einschließlich komplexer einfach und mehrfach ungesättigter Fettsäurederivate, und von handelsüblichen Cholesterolderivaten,
– die im Lauf der Kupplung gebildete Bindung ist in einem breiten pH-Bereich sehr stabil,
– die Kupplung ermöglicht den Erhalt von Gemischen von Lipopeptiden, die ohne einen vorherigen Reinigungsschritt direkt verwendet werden können.

Die Erfinder haben sich auch die Aufgabe gestellt, Lipopeptide bereitzustellen, die durch chemische Ligation erhalten werden können, in welchen die Lipid/Peptid-Bindung sehr stabil ist und die Nachteile der Disulfidbindungen des Standes der Technik nicht aufweist.
Diese Aufgaben werden gelöst durch die Schaffung einer Hydrazonbindung zwischen einem Peptid und einem lipophilen Vektor von nicht-peptidartiger Beschaffenheit, bei einer konvergenten Synthese in Lösung.
Der Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Kupplung, in Lösung, zwischen wenigstens einer Peptidverbindung und wenigstens einem lipophilen Vektor, der eine Aldehydfunktion aufweist, wobei die Kupplung einen Schritt der Ausbildung einer Hydrazonbindung bzw. eines Hydrazonbindegliedes zwischen der Peptidverbindung und dem lipophilen Vektor umfasst, wobei das Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, dass der lipophile Vektor von nicht-peptidartiger Beschaffenheit ist und durch die allgemeine Formel (I) wiedergegeben wird: [(R¹)(R²)_i]D-CHO (I) in welcher:

– i 0 oder 1 bedeutet,
– wenn i 0 ist, D eine Bindung bedeutet,
– wenn i 1 ist, D einen gesättigten, ungesättigten oder aromatischen, mono- oder polycyclischen Heterocyclus bedeutet, und
– R¹ und R², welche gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Gruppe der Formel L-f-E-f' bedeuten, wobei L einen Lipidrest bedeutet, E einen Spacerarm bzw. Abstandshalter bedeutet, und f und f' Funktionen bedeuten, die L mit E bzw. E mit D verbinden.

Auf besonders vorteilhafte Weise gestattet das erfindungsgemäße Verfahren, das in Lösung durchgeführt wird, einen Schritt der Spaltung der so erhaltenen modifizierten Peptidverbindung von dem Träger zu vermeiden, wobei eine solche Spaltung die Wahl des an die Peptidverbindung gekuppelten lipophilen Teils erheblich beschränkt, wie vorstehend erwähnt wurde.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst letzteres die folgenden Schritte:

a) Herstellung wenigstens einer Peptidverbindung, von der alle Schutzgruppen entfernt sind und die entweder an ihrem N-terminalen Ende oder am Ende der Seitenkette eines gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhandenen Lysins oder Ornithins 1 bis 4 von Hydrazin abgeleitete Gruppen der Formel -CO-CHR'-NR-NH₂ aufweist, wobei R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine gesättigte oder ungesättigte, lineare, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe bedeuten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome sowie gegebenenfalls 1 bis 3 Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, umfasst und durch 1 bis 6 Gruppen, ausgewählt aus Hydroxy-, Alkoxy-, Aryloxy-, Amino-, Ami noalkyl-, Aminoaryl-, Thio-, Thioalkyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Guanidino- und Carboxamidogruppen, substituiert sein kann;
b) Reaktion, in Lösung, der im Schritt a) erhaltenen Peptidverbindung(en) mit wenigstens einem lipophilen Vektor von nicht-peptidartiger Beschaffenheit der Formel (I), wie sie vorstehend definiert ist, welcher eine Aldehydfunktion aufweist.

Eine von Hydrazin abgeleitete Gruppe, wie sie vorstehend definiert ist, kann entweder am N-terminalen Ende des Peptids oder am Ende der Seitenkette eines gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhandenen Lysins oder Ornithins durch jedes dem Fachmann bekannte Mittel eingeführt werden.
Die von Hydrazin abgeleiteten Gruppen, welche die Peptidverbindung aufweist, die in Schritt a) des erfindungsgemäßen Verfahrens erwähnt sind, sind vorzugsweise α-Hydrazinoessigsäuregruppen, d. h. -CO-CH₂-NH-NH₂-Gruppen. Solche Gruppen können z. B. mit Hilfe von N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure oder N,N'-Di(Boc)hydrazinoessigsäure an der Peptidverbindung eingeführt werden, wie es in der internationalen Anmeldung PCT/FR00/02336, sowie im Artikel von D. BONNET et al., der in Tetrahedron Letters, 2000, 41, 45–48 erschienen ist, beschrieben ist. Die Reaktion erfolgt in fester Phase, wobei das funktionalisierte Peptid anschließend von dem festen Träger abgetrennt und gemäß Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, von Schutzgruppen befreit wird.
Auf besonders vorteilhafte Weise gestattet die Kupplungsreaktion zwischen dem lipophilen Vektor der Formel (I) und der von allen Schutzgruppen befreiten Peptidverbindung, die wie vorstehend beschrieben funktionalisiert ist, jeglichen Schritt einer Entfernung der Schutzgruppen von den Seitenketten der Peptidverbindung mit einer starken Säure nach der Kupplungsreaktion zu vermeiden, was es möglich macht, als lipophilen Vektor empfindliche Fettsäurederivate zu verwenden. Das erfindungsgemäße Verfahren macht es somit möglich, eine modifizierte, d. h. an einen lipophilen Vektor gekuppelte Peptidverbindung direkt zu erhalten.
Die im Lauf des erfindungsgemäßen Verfahrens (Schritt b) durchgeführte Kupplungsreaktion erfolgt unter sehr milden Betriebsbedingungen und erfordert nicht, unter inerten Bedingungen zu arbeiten, wie es bei bestimmten Verfahren des Standes der Technik der Fall ist, insbesondere bei solchen, die darin bestehen, ein Peptid durch eine Disulfidbindung an eine Fettsäure zu kuppeln. Die Kupplung ist wirksam, schnell und erfolgt unter stöchiometrischen Bedingungen. Es gibt keine oder wenig Nebenprodukte und nicht verbrauchte Vorstufen, was es gestattet, Lipopeptide zu erhalten, die direkt verwendet werden können, ohne gereinigt werden zu müssen. Dies ist besonders vorteilhaft insofern, als die Lipopeptide Moleküle sind, die durch Hochleistungsflüssigchromatografie oder durch andere Verfahren (in Anbetracht der Probleme der Löslichkeit, der Aggregation ...) schwierig zu reinigen sind. In dem erfindungsgemäßen Verfahren werden die Peptidvorstufen leicht gereinigt, bevor sie an lipophile Vektoren gekuppelt werden. Somit müssen die erhaltenen Lipopeptide nicht gereinigt werden.
Darüber hinaus ist die im Lauf des Schrittes b) des erfindungsgemäßen Verfahrens gebildete Hydrazonbindung zwischen der Aldehydfunktion des lipophilen Vektors der Formel (I) und der von Hydrazin abgeleiteten Gruppe der Formel -CO-CHR'-NR-NH₂, welche die Peptidverbindung aufweist, besonders stabil, in jedem Fall viel stabiler als eine Hydrazonfunktion, die zwischen einem Aldehyd und einer Hydrazingruppe (-NH-NH₂) gebildet wird, eine Art von Hydrazonbindung, die insbesondere von C. KLINGUER et al. (Tetrahedron Letters, 1996, 37, 40, 7259–7262) beschrieben ist. In der Tat modifiziert die Anwesenheit der Carbonylfunktion in den von Hydrazin abgeleiteten Gruppen, welche die im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendeten Peptidverbindungen aufweisen, die Reaktivität der Hydrazinfunktion und stabilisiert die gebildete Hydrazonbindung.
Die im Schritt b) des erfindungsgemäßen Verfahrens bewirkte Reaktion wird vorteilhafterweise in einem Gemisch aus Wasser (zur Solubilisierung der Peptidverbindung) und wenigstens einem mit Wasser mischbaren lipophilen Lösungsmittel (zur Solubilisierung des lipophilen Vektors), vorzugsweise tert-Butanol, durchgeführt.
Die in dem erfindungsgemäßen Verfahren eingesetzte Peptidverbindung kann aus der Gruppe ausgewählt werden, die aus den Peptiden und den Peptidderivaten, wie etwa den Glycopeptiden, den Pseudopeptiden und den dendrimeren Glycomimetika mit peptidartiger Beschaffenheit, besteht.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter "Peptid" jede Verkettung von mehreren Aminosäuren, gleich welcher Beschaffenheit und Anzahl; der Begriff "Peptid" bezeichnet folglich sowohl Oligopeptide (Dipeptide oder Tripeptide) als auch Polypeptide oder Proteine. Unter "Glycopeptiden" versteht man Peptide, die durch kovalente Bindung mit Kohlenhydraten verbunden sind, ganz gleich, ob es sich um Monosaccharide (wie etwa neutrale Einfachzucker) oder um Polysaccharide handelt. Unter "Pseudopeptiden" versteht man Peptide, bei denen eine oder mehrere Peptidbindungen (-CO-NH-) durch Nichtpeptidbindungen (wie etwa die Bindungen -CO-NH-NH-, -CH₂-NH- oder -CO-NH-O-) ersetzt worden sind. Unter "dendrimeren Glycomimetika mit peptidartiger Beschaffenheit" versteht man Glycomimetika, deren Struktur auf Aminosäuren oder ihren Derivaten beruht und in einer stark verzweigten Form vom baumartigen Typ vorliegt.
Die Peptide und Peptidderivate, die in dem erfindungsgemäßen Kupplungsverfahren verwendet werden können, können vorteilhafterweise eine pharmakologische Aktivität und einen therapeutischen Nutzen aufweisen: es kann sich z. B. um Neuropeptide, Peptidhormone oder Substanzen handeln, welche die Aktivität von Zytokinrezeptoren modulieren können. Die Kupplung dieser Peptide oder Peptidderivate an einen lipophilen Vektor in Übereinstimmung mit dem erfindungsgemäßen Verfahren verleiht ihnen die Fähigkeit, durch Transfer über die Zellmembran in die Zellen einzudringen, und zwar ganz gleich, um welche Zellen es sich dabei handelt.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die verwendete Peptidverbindung ein dendrimeres Glycomimetikum mit peptidartiger Beschaffenheit, welches durch die nachstehende allgemeine Formel (II) wiedergegeben wird: (B²M)_m(XN)_nA (II)in welcher:

– B² durch eine oder mehrere nachstehende allgemeine Formeln (a) oder (b) wiedergegeben wird:
wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten und wobei W eine Bindung oder eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffkette bedeutet, die 1 bis 18 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls 1 bis 12 Atome, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, umfasst, wobei die Kohlenstoffkette gegebenenfalls durch 1 bis 16 Halogenatome substituiert ist,
– X den Rest eines Oligopeptids X' bedeutet, das 1 bis 6 Aminosäuren umfasst,
– A den Rest einer Verbindung A' bedeutet, welche mindestens trifunktionell ist,
– m eine ganze Zahl zwischen 1 und 32 ist,
– n eine ganze Zahl zwischen 0 und 32 ist; und
– M und N jeweils eine Bindungsgruppe zwischen B² und A, wenn n = 0, oder B² und X, wenn n von 0 verschieden ist, bzw. zwischen X und A, wenn n von 0 verschieden ist, bedeuten und unabhängig voneinander eine Funktion umfassen, die ausgewählt wird aus den Funktionen Oxim, Hydrazon, Amid, Ester, Thioester, Hydrazid, Hydroxamat, Ether, Thioether, Amin, Carbonat, Carbamat, Thiocarbonat, Thiocarbamat, Harnstoff, Thioharnstoff und Thiazolidin.

Die Verbindung der Formel (II) ist in der internationalen Anmeldung PCT/FR00/02194 beschrieben.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter "Schutz"-gruppe, eine Schutzgruppe einer Hydroxylfunktion oder eines Diols (wobei in diesem Fall zwei Gruppen, ausgewählt aus R₁, R₂, R₃ und R₄, kovalent miteinander verbunden sein können, um zusammen einen Ring zu bilden), wie sie in dem Werk Protective Groups in Organic Synthesis, T. W. GREENE und P. G. M. WUTS, zweite Auflage 1991, J. WILEY and Sons, definiert ist. Als Beispiele und auf nicht beschränkende Weise kann man die Gruppen Trimethylsilyl, Triethylsilyl, Triisopropylsilyl, Tertiärbutyldimethylsilyl, Tertiärbutyldiphenylsilyl, Trimethylsilylethylether, tert-Butoxymethyl, Methoxymethyl, Benzyloxymethyl, 2-Methoxyethoxymethyl, Methylthiomethyl, Acetyl oder 2',3'-Dimethoxybutan-2',3'-diyl zitieren.
Als Beispiele und auf nicht-beschränkende Weise sind in den allgemeinen Formeln (a) und (b):

– zweckdienliche Halogenatome Brom, Chlor und Fluor; und
– zweckdienliche Kohlenstoffketten sind Alkylgruppen (Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Tertiärbutyl, Pentyl, ...), Alkenylgruppen (Vinyl, Allyl, Butenyl, Pentenyl, ...), Alkinylgruppen (Ethinyl, Propinyl, Butinyl, Pentinyl, ...), Cycloalkylgruppen (Cyclopentyl, Cyclohexyl, ...), Heterocyclen (Piperazin, ...), Arylgruppen (Phenyl, Cresyl, ...), Heteroarylgruppen (Pyridin, Pyrimidin, Pyrazin, ...), Polyethylenglycolgruppen oder auch Polyamine.

Die Formeln (a) und (b) bedeuten Reste von Chinasäure und Shikimisäure und bestimmten ihrer Derivate, die durch Schützen der Hydroxyle in den Stellungen 1, 3, 4 und/oder 5 des Rings erhalten werden.
Die Verbindungen, die durch die allgemeinen Formeln (a) und (b) wiedergegeben werden, stellen, wenn sie wenigstens zwei freie vizinale Hydroxylfunktionen aufweisen, eine Nachahmung von D-Mannose dar: diese Verbindungen und folglich die Verbindung der allgemeinen Formel (II), welche sie aufweist, können von dem Mannoserezeptor erkannt werden und an letzteren oder an jeden Rezeptor der Familie der C-Lectine binden, welcher mit dem Mannoserezeptor verwandt ist.
Die Verbindung A' ist vorteilhafterweise durch eine Verkettung gebildet, die mehrere Reste einer mindestens trifunktionellen Verbindung umfasst, welche durch kovalente Bindungen aneinander gebunden sind, und ist im Stande, an den freien funktionellen Gruppen dieser Reste (d. h. den funktionellen Gruppen, die nicht an einer kovalenten Bindung beteiligt sind), mehrere Verankerungsstellen für die Verbindungen) der allgemeinen Formel (a) und/oder (b) oder, falls X vorhanden ist, die Verbindung X' anzubieten.
Die Verbindung A' umfasst vorzugsweise 2 bis 32 und noch mehr bevorzugt 4 bis 16 Reste einer trifunktionellen Verbindung.
Vorzugsweise umfasst die Verbindung A' eine Verkettung von Aminosäuren, gleich oder verschieden, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Hydroxylysin, Serin, Threonin, Cystein, Ornithin, Asparaginsäure und Glutaminsäure. Diese Aminosäure kann sowohl zur L-Reihe als auch zur D-Reihe gehören und die Verbindung A' kann sogar gleichzeitig Reste der L-Reihe und Reste der D-Reihe umfassen. Eine Verbindung A' auf der Basis von Lysin ist insofern bevorzugt, als gezeigt wurde, dass die Makromoleküle auf der Basis von Lysin keine wesentliche Immunogenität aufweisen (TAM, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1988, 85, 540).
Es ist jedoch möglich, als Verbindung A' Verkettungen von anderen trifunktionellen Verbindungen als den vorstehend genannten Aminosäuren zu verwenden, soweit sie eine zufriedenstellende Biokompatibilität aufweisen. Als Beispiele und auf nichtbeschränkende Weise kann man 3,3'-Iminobis(propylamin), 2,2'-Iminobis(ethylamin), Gallussäure, Tris(2-carboxyethyl)nitromethan (M. BRETTEICH et al., Synlett, 1998, 1396), Tris(hydroxymethyl)aminomethan (P. R. ASHTON et al., J. Org. Chem., 1998, 63 3429) und (Dihydroxy)propylamin nennen.
Der Index n, welcher die Anzahl der Reste X wiedergibt, die in der Verbindung der allgemeinen Formel (II) vorhanden sind, kann sein:

– entweder gleich 0, wobei in diesem Fall der oder die Reste B² direkt an den Rest A gebunden sind,
– oder zwischen 1 und 32, wobei in diesem Fall, wenn n 1 ist, der oder die Reste B² über einen einzigen Rest X als Zwischenstück mit dem Rest A verbunden sind, wogegen, wenn n von 1 verschieden ist, jeder Rest X als Verbindungselement zwischen einem oder mehreren Resten B² und dem Rest A dienen kann.

Was die Bindungsgruppen M und N anbelangt, werden sie unabhängig voneinander aus den Bindungsgruppen gewählt, die eine Funktion umfassen, die ausgewählt ist aus den Funktionen Oxim, Hydrazon, Amid, Ester, Thioester, Hydrazid, Hydroxamat, Ether, Thioether, Amin, Carbonat, Carbamat, Thiocarbonat, Thiocarbamat, Harnstoff, Thioharnstoff und Thiazolidin. Als Beispiele und auf nicht-beschränkende Weise:

– kann eine Oximbindung durch Reaktion einer O-Alkylamingruppe mit einer Carbonylgruppe gebildet werden,
– eine Hydrazonbindung kann durch Reaktion einer Hydrazingruppe mit einer Carbonylgruppe gebildet werden,
– eine Amidbindung (bzw. Esterbindung) kann durch Reaktion einer Amingruppe (bzw. Alkoholgruppe) mit einer aktivierten Säure- oder Anhydrid- oder Säurehalogenidgruppe gebildet werden,
– eine Thioesterbindung kann durch Reaktion einer Thiolgruppe mit einer aktivierten Säure- oder Anhydrid- oder Säurehalogenidgruppe gebildet werden,
– eine Hydrazidbindung kann durch Reaktion einer Hydrazingruppe mit einer aktivierten Säure-, Anhydrid- oder Säurehalogenidgruppe gebildet werden,
– eine Etherbindung kann durch Reaktion einer Alkoholgruppe mit einer Alkylhalogenidgruppe gebildet werden,
– eine Thioetherbindung kann durch Reaktion eines Thiols mit einer Alkylhalogenidgruppe gebildet werden,
– eine Aminbindung kann durch Reaktion zwischen einer Amingruppe und einem Alkylhalogenid gebildet werden,
– eine Carbonatbindung kann durch Reaktion einer Chlorformiatgruppe mit einer Alkoholgruppe gebildet werden,
– eine Carbamatbindung kann durch Reaktion einer Chlorformiatgruppe mit einer Amingruppe gebildet werden,
– eine Thiocarbonatgruppe kann durch Reaktion einer Chlorthioformiatgruppe mit einer Alkoholgruppe gebildet werden,
– eine Thiocarbamatbindung kann durch Reaktion einer Chlorthioformiatgruppe mit einer Amingruppe gebildet werden,
– eine Harnstoffbindung kann durch Reaktion einer Isocyanatgruppe mit einer Amingruppe gebildet werden,
– eine Thioharnstoffbindung kann durch Reaktion einer Isothiocyanatgruppe mit einer Amingruppe gebildet werden,
– eine Thiazolidinbindung kann durch Reaktion einer β-Aminothiolgruppe mit einer Carbonylgruppe gebildet werden, während
– eine Hydroxamatbindung durch Reaktion zwischen einer aktivierten Säuregruppe und einer Hydroxylamingruppe gebildet werden kann.

Man versteht folglich, dass in der allgemeinen Formel (II) B², A und X Reste von Verbindungen, die von Natur aus funktionelle Gruppen enthalten, die durch Reaktion miteinander zum Erhalt von Bindungsgruppen M und N, wie sie vorstehend definiert sind, führen können, oder von Verbindungen, die so modifiziert sind, dass sie solche funktionellen Gruppen aufweisen, bedeuten.
Die Verbindung der allgemeinen Formel (II) ist vorteilhafterweise so, dass m eine ganze Zahl zwischen 4 und 16 ist, n eine ganze Zahl zwischen 2 und 8 ist, X den Rest eines Oligopeptids bedeutet, das 2 bis 4 Aminosäurereste umfasst, während A den Rest einer Verkettung bedeutet, die 2 bis 8 Lysinreste umfasst und in Form eines Dendrimers vorliegt.
Die Verbindungen der allgemeinen Formeln (a) und/oder (b) werden vorteilhafterweise so ausgewählt, dass die Gruppen -OR₂ und -OR₃ in trans-Beziehung stehen, so dass sie die beiden Hydroxyle nachahmen, die der Ring von D-Mannose aufweist, welche an der Bindung zwischen dieser Verbindung und ihrem Rezeptor beteiligt zu sein scheinen.
Die Verbindung der Formel (b) ist vorteilhafterweise so beschaffen, dass R₁, R₂ und R₃ Wasserstoffatome bedeuten. Wenn sich darüber hinaus die Gruppen -OR₁ und -OR₂ in cis-Beziehung zueinander befinden und die Gruppen -OR₂ und -OR₃ in trans-Beziehung zueinander befinden, wobei die Konfiguration 3R, 4S und 5R ist, besteht die resultierende Verbindung aus einem (–)-Shikimisäurerest (oder 3,4,5-Trihydroxy-1-cyclohexen-1-carbonsäurerest).
Was die Verbindung der Formel (a) anbelangt, ist sie vorteilhafterweise so, dass R₁, R₂, R₃ und R₄ Wasserstoffatome bedeuten. Wenn sich darüber hinaus die Gruppen -OR₂ und -OR₃ in trans-Beziehung zueinander befinden, während sich die Gruppen -OR₁ und -OR₄ jeweils in cis-Beziehung zur Gruppe -oR₂ befinden, wobei die Konfiguration 1s_n, 3R, 4s_n und 5R ist, besteht die resultierende Verbindung aus einem (–)-Chinasäurerest (oder 1,3,4,5-Tetrahydroxy-cyclohexan-carbonsäurerest).
So ist die Verbindung der allgemeinen Formel (II) vorzugsweise so, dass B² einen Rest von einer oder mehreren Verbindungen, ausgewählt aus (–)-Shikimisäure und (–)-Chinasäure, gegebenenfalls in geschützter Form, bedeutet. Die (–)-Shikimisäure und (–)-Chinasäure sind im Handel erhältlich, z. B. von den Firmen ALDRICH oder ACROS.
Das erfindungsgemäße Kupplungsverfahren kann mehrere verschiedene Peptidverbindungen und/oder mehrere verschiedene lipophile Vektoren einsetzen, was es somit ermöglicht, Gemische von durch lipophile Vektoren funktionalisierten Peptidverbindungen zu synthetisieren.
Solche Gemische werden auf einmal am Ende des Schritts b) des erfindungsgemäßen Verfahrens erhalten: die Verwendung von mehreren verschiedenen Peptidverbindungen und/oder mehreren verschiedenen lipophilen Vektoren in Schritt b) führt direkt zu einem Gemisch von durch lipophile Vektoren funktionalisierten Peptidverbindungen, einem Gemisch, welches ohne vorherigen Reinigungsschritt oder Entsalzungsschritt durch direkte Lyophilisierung des Reaktionsmediums oder Fällung der erhaltenen Verbindungen durch Verdünnung mit Wasser direkt verwendet werden kann.
Gemäß einer vorteilhaften Ausführungsform des erfindungsgemäßen Kupplungsverfahrens kann letzteres in Schritt b) wenigstens einen lipophilen Vektor, der eine Aldehydfunktion aufweist, wenigstens eine Peptidverbindung, ausgewählt aus den Peptiden, den Glycopeptiden und den Pseudopeptiden, sowie wenigstens ein dendrimeres Glycomimetikum der allgemeinen Formel (II), wie sie vorstehend definiert ist, einsetzen.
Die Verwendung von wenigstens einer Verbindung der Formel (II) im Lauf des Schritts b) des erfindungsgemäßen Kupplungsverfahrens führt vorteilhafterweise zum Erhalt eines Gemisches, das wenigstens eine Peptidverbindung, ausgewählt aus den Peptiden, den Glycopeptiden und den Pseudopeptiden, und wenigstens ein dendrimeres Glycomimetikum der Formel (II) umfasst, wobei jedes an einen oder mehrere lipophile Vektoren gebunden ist. Aufgrund des Vorhandenseins der lipophilen Ketten organisiert sich das Gemisch in Form von Mischmizellen. Das Vorhandensein der Verbindung der Formel (II) in diesen Mizellen gestattet es, die Peptidverbindungen selektiv in Zellen einzuschleusen, die Mannoserezeptoren oder Rezeptoren der Familie der C-Lectine besitzen, die mit dem Mannoserezeptor verwandt sind.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein lipophiler Vektor, der in dem vorstehend definierten Kupplungsverfahren verwendet werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass er durch die allgemeine Formel (I) wiedergegeben wird: [(R¹)(R²)_i]D-CHO (I)wie sie vorstehend definiert ist.
Ein solcher lipophiler Vektor ist vorteilhafterweise so beschaffen, dass i 1 ist und D den Hetercyclus 1-Aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]octan bedeutet.
Die Gruppe L (in der Formel L-f-E-f definiert in Bezug auf R¹ und R²) bedeutet z. B. ein Sterol, ein Sterolderivat (wie etwa ein Cholesterolderivat) oder eine gesättigte oder ungesättigte, lineare oder verzweigte Kohlenstoffkette, die zwischen 4 und 30 Kohlenstoffatome umfasst. Eine solche Kohlenstoffkette stellt den lipophilen Teil einer Fettsäure, wie etwa Palmitinsäure (wenn L der Formel CH₃-(CH₂)₁₄- entspricht) oder Ölsäure (wenn L der Formel CH₃-(CH₂)₇-CH-CH=(CH₂)₇- entspricht), dar.
Übrigens bedeutet E vorteilhafterweise eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffkette bzw. kohlenstoffhaltige Kette, die 1 bis 18 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls 1 bis 16 Heteroatome (z. B. Stickstoff oder Sauerstoff) und/oder 1 bis 7 Gruppen, ausgewählt aus Carbonylgruppen, Heterocyclen, Heteroarylen, Carbocyclen und Arylen, umfasst. E kann gegebenenfalls mit 1 bis 8 Hydroxyl- oder Aminogruppen und/oder 1 bis 16 Halogenatomen (wie etwa Chlor oder Fluor) substituiert sein.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung versteht man unter:

– "Carbocyclus" (auch als "Cycloalkyl" bezeichnet) einen mono- oder polycyclischen kohlenstoffhaltigen Ring, der zwischen 3 und 8 Kohlenstoffatome umfasst, wie etwa Cyclopentyl oder Cyclohexyl;
– "Aryl" einen mono- oder polycyclischen aromatischen kohlenstoffhaltigen Ring, der zwischen 5 und 14 Kohlenstoffatome umfasst, wie etwa Phenyl, Naphthyl oder Cresyl;
– "Heterocyclus" einen Carbocyclus, der ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel umfasst, wie etwa Piperazin;
– "Heteroaryl" ein Aryl, das ein oder mehrere Heteroatome, ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff und Schwefel umfasst, wie etwa Pyridin, Pyrimidin oder Pyrazin.

Was f und f' anbelangt, bedeuten diese Funktionen z. B. eine -CO-NH- oder -CO-O- bzw. -NH-CO- oder -O-CO- -Bindung.
Beispiele für bevorzugte lipophile Vektoren gemäß der Erfindung sind durch die nachstehenden Formeln (III) und (IV) wiedergegeben:
in welchen L wie vorstehend definiert ist und z. B. bedeutet:

– in den Formeln III und IV eine Kohlenstoffkette der Formel CH₃-(CH₂)₁₄- (d. h. der lipophile Teil von Palmitinsäure), oder eine Kohlenstoffkette der Formel CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇- (d. h., der lipophile Teil von Ölsäure).
– In der Formel III eine Kohlenstoffkette der Formel CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇(d. h. der lipophile Teil von Ölsäure), oder ein Sterolderivat.

Die erfindungsgemäßen lipophilen Vektoren sind besonders dafür eingerichtet, so wie sie sind und ohne dass eine vorhergehende Aktivierung erforderlich wäre, in dem vorstehend definierten Kupplungsverfahren eingesetzt zu werden.
Ein Gegenstand der Erfindung ist auch ein Lipopeptid, das durch das vorstehend definierte Kupplungsverfahren erhalten werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen aus wenigstens einer Peptidverbindung besteht, die über eine Hydrazonbindung bzw. ein Hydrazonbindeglied an wenigstens einen lipophilen Vektor von nichtpeptidartiger Beschaffenheit der Formel (I), wie sie vorstehend definiert ist, gebunden ist. Die Peptidverbindung ist vorteilhafterweise so, wie sie vorstehend in Bezug auf das erfindungsgemäße Kupplungsverfahren definiert ist.
Wie bereits vorstehend erwähnt wurde, besitzt ein solches Lipopeptid die Fähigkeit, durch passiven Transfer über die Zellmembran auf nicht-selektive Weise in die Zellen einzudringen.
Gegenstand der Erfindung ist auch ein Gemisch aus mehreren verschiedenen Lipopeptiden, wie sie vorstehend definiert sind. Ein solches Gemisch kann durch das erfindungsgemäße Kupplungsverfahren, wie es vorstehend beschrieben ist, erhalten werden.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung eines Lipopeptids, wie es vorstehend definiert ist, für die gezielte Ansteuerung von Zellen.
Gegenstand der Erfindung ist auch die Verwendung des vorstehend definierten Kupplungsverfahrens zur Herstellung eines Medikaments, welches wenigstens einen Wirkstoff mit peptidartiger Beschaffenheit, der durch wenigstens eine lipophile Verbindung vektorisiert ist, umfasst, das zur gezielten Ansteuerung von Zellen brauchbar ist.
In einem solchen Medikament ist der Wirkstoff mit peptidartiger Beschaffenheit (z. B. ein Hormon oder ein Neuropeptid), der durch eine lipophile Verbindung vektorisiert ist, in der Lage, die lipophilen physiologischen Barrieren, wie etwa die Zellmembranen, zu durchdringen und zwar auf nicht-selektive Weise (d. h., ganz gleich von welchen Zellen). Die physikalischen Eigenschaften des Wirkstoffs sind modifiziert, da letzterer aufgrund der Anwesenheit der lipophilen Ketten in Form von Mizellen oder Aggregaten vorliegt, welche es insbesondere im Fall von Mischmizellen möglich machen, Peptide von verschiedenartiger Beschaffenheit in einer gleichen Umgebung anzuordnen. Wenn diese Mizellen oder Aggregate auch eine Verbindung der Formel (II) umfassen, die über eine Hydrazonbindung bzw. ein Hydrazonbindeglied an wenigstens einen lipophilen Vektor gebunden ist, macht es das resultierende Medikament möglich, die Rezeptoren der Familie der C-Lectine, die mit dem Mannoserezeptor verwandt sind, gezielt anzusteuern.
Außer den vorstehenden Anordnungen bzw. Bestimmungen umfasst die Erfindung auch noch andere Anordnungen bzw. Bestimmungen, die aus der folgenden Beschreibung hervorgehen, welche sich auf Ausführungsbeispiele des Verfahrens, das Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist, und von Synthesen von Lipopeptiden gemäß der vorliegenden Erfindung sowie auf die beigefügten Abbildungen bezieht, in welchen:
die 1 die Synthese von lipophilen Vektoren der Formeln (IIIa) und (IIIb) und (IIIc) gemäß der Erfindung veranschaulicht;
die 2 einen anderen Syntheseweg des lipophilen Vektors der Formel (IIIa) sowie die Synthese des lipophilen Vektoren der Formel (IVa) gemäß der Erfindung veranschaulicht;
die 3 die Synthese des lipophilen Vektors der Formel (IVb) gemäß der Erfindung veranschaulicht;
die 4 die Kupplung eines Gemisches von Peptiden mit der Bezeichnung SIV1–7 und TT mit einem lipophilen Vektor der Formel (IIIa) durch das erfindungsgemäße Verfahren veranschaulicht;
die 5 die Kupplung des Peptids mit der Bezeichnung Mu-IFNγ mit zwei lipophilen Vektoren der Formel (IIIa) durch das erfindungsgemäße Verfahren veranschaulicht;
die 6 die Kupplung des Peptids mit der Bezeichnung OVA mit einem lipophilen Vektor der Formel (IVa) durch das erfindungsgemäße Verfahren veranschaulicht.
Es versteht sich jedoch, dass diese Beispiele ausschließlich zur Veranschaulichung des Gegenstands der Erfindung angegeben werden und folglich in keiner Weise eine Beschränkung darstellen.
In den folgenden Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: Äq.: Äquivalente; Boc: tert-Butyloxycarbonyl; Fmoc: 9-Fluorenylmethoxycarbonyl; Mtt: 4-Methyltrityl; DMF: Dimethylformamid; TFA: Trifluoressigsäure; CH₂Cl₂: Dichlormethan; MeOH: Methanol; EtOH: Ethanol; THF: Tetrahydrofuran; AcOH: Essigsäure; AcOEt: Ethylacetat; H₂O: Wasser; AcO^–NH₄ ⁺: Ammoniumacetat; CDCl₃: deuteriertes Chloroform; EDT: Ethandithiol; TIS: Triisopropylsilan; DMSO-d₆: Dimethylsulfoxid-d₆ (vollständig deuteriert); NaIO₄: Natriumperiodat; NaCl: Natriumchlorid ; Na₂SO₄: Natriumsulfat; MgSO₄: Magnesiumsulfat; KH₂PO₄: Kaliumdihydrogenphosphat; PAL: "Peptid-Amid-Linker"; BOP: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris(dimethylamino)phosphoniumhexafluorophosphat; HOBt: N-Hydroxybenzotriazol; HBTU: N-[(1H-Benzotriazol-1-yl)(dimethylamino)methylen]-N-methylmethanaminium-hexafluorophosphat-N-Oxid; DIEA: Diisopropylethylamin; TEAP: Triethylaminphosphat; HPLC: Hochleistungsflüssigchromatografie; RP-HPLC: Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigchromatografie; ES-MS: Elektrospray-Massenspektrometrie; TOF-PDMS: Plasmadesorptions-Massenspektrometrie; LC-MS: Massenspektrometrie, gekoppelt mit einer Analyse durch Flüssigchromatografie; ¹H-NMR: Protonen-Kernspin-Resonanz; ¹³C-NMR: Kohlenstoff-Kernspin-Resonanz; PyBOP: Benzotriazol-1-yl-oxy-tris-pyrrolidino-phosphoniumhexafluorophosphat.
Beispiel 1: Synthese von Peptiden, die durch α-Hydrazinoessigsäuregruppen funktionalisiert sind

Die folgenden Peptide, die durch α-Hydrazinoessigsäuregruppen entweder an ihrem N-terminalen Ende oder am Ende der Seitenkette eines in der Peptidsequenz vorhandenen Lysins (K) funktionalisiert sind, wurden hergestellt:

SIV1:	H-SVRPKVPLRAMTYKLAIDMSHFIKEKK(COCH₂NHNH₂)-NH₂
SIV2:	H-EKGGLEGIYYSARRHRILDMYLEK(COCH₂NHNH₂)-NH₂
SIV3:	H-DWQDYTSGPGIRYPKTFGWLWKLVK(COCH₂NHNH₂)-NH₂
SIV4:	H-SKWDDPWGEVLAWKFDPTLAYTYEAK(COCH₂NHNH₂)-NH₂
SIV5:	H-YTYEAYARYPEELEASQACQRKRLEEGK(COCH₂NHNH₂)-NH₂

SIV6:	H-KFGAEVVPGFQALSEGCTPYDINQMLNCVGDK(COCH₂NHNH₂)-NH₂
SIV7:	H-QIQWMYRQQNPIPVGNIYRRWIQLGLQKCVRMYNPTN-K(COCH₂NHNH₂)-NH₂
TT:	Ac-QYIKANSKFIGITELKK K(COCH₂NHNH₂)-NH₂
Mu-IFNγ:	H₂NNHCH₂CO-K(COCH₂NHNH₂)-AKFEVNNPQVQRQAFNELIR-VVHQLLPESSLRKRKRSR-NH₂
Mu-IFNγ a:	H-K(COCH₂NHNH₂)IRVVHQLLPESSLRKRKRSR-NH₂
Mu-IFNγ b:	H-K(COCH₂NHNH₂)SLRSERRHQKVRPIRVLSKL-NH₂
Mu-IFNγ c:	H-K(COCH₂NHNH₂)-AKFEVNNPQVQRQAFNELIRVVHQLLPESSLRKRKRSR-NH₂
Mu-IFNγ d:	H-K(COCH₂NHNH₂)-PSRENQNAVKIQKLSVVLRREQKHRVERLAFRNQSLPF-NH₂
OVA:	Ac-K(COCH₂NHNH₂)-ISQAVHAAHAEINEAGR-NH₂
G18R:	H-K(COCH₂NHNH₂)GAVVGGLGGYMLGSAMSR-NH₂

Die Synthese dieser Hydrazinopeptide erfolgt in fester Phase gemäß den nachstehend beschriebenen Arbeitsvorschriften.
1) Herstellung des Harzes Fmoc-Lys(Boc₂NN(Boc)CH₂CO)-PAL-PEG-PS
Das Ausgangsharz ist das Harz Fmoc-PAL-PEG-PS mit einer Beladung von 0,16 mmol/g (Perseptive Biosystems, 25 g). Es wird mit 20 % Piperidin in DMF behandelt, um die Schutzgruppen von der Aminfunktion zu entfernen, anschließend mit Ethanol, mit N-Methyl-pyrrolidon und mit DMF gewaschen. Die Aminosäure Fmoc-Lys(Mtt)-OH (Senn Chemicals), die in einem Verhältnis von 4 Äquivalenten, bezogen auf die an dem festen Träger vorhandenen Aminfunktionen, verwendet wird, wird durch das Gemisch HBTU/HOBt/DIEA (4 Äq./4 Äq./8 Äq.) in DMF 1 Minute lang aktiviert. Die aktivierte Säure wird anschließend zu dem Harz zugegeben. Nach 1 Stunde Rühren wird das Harz mit DMF, anschließend mit CH₂Cl₂ gewaschen und bei 4°C in CH₂Cl₂ aufbewahrt.
Die Entfernung der Schutzgruppe Mtt erfolgt durch eine Reihe von Waschungen mit 1 TFA in CH₂Cl₂. Auf diese Entfernung der Schutzgruppen folgt eine RP-HPLC an einer TSKgel Super-ODS-Säule (Tosohaas). Die Entfernung der Schutzgruppen ist nach 13 bis 16 Waschungen beendet. Das Harz wird durch zwei Waschungen mit 5 % Diisopropylethylamin in CH₂Cl₂ neutralisiert und anschließend mit CH₂Cl₂ gewaschen.
Die Kupplung der N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure, die so durchgeführt wird, wie dies in der internationalen Anmeldung PCT/FR00/02336 beschrieben ist, erfolgt unter Verwendung von 1,2 Äq. N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure, bezogen auf reaktive Aminfunktionen, die an dem festen Träger vorhanden sind. Die N,N'-Tri(Boc)hydrazino-essigsäure wird mit Hilfe eines BOP/DIEA-Gemisches (M. GAIRI et al., Tetrahedron Letters, 1990, 50, 7363) oder HBTU/HOBt/DIEA-Gemisches in DMF (N,N'-Tri(Boc)-hydrazinoessigsäure/BOP/DIEA: 1/1/3 oder N,N'-Tri(Boc)hydrazino-essigsäure /HBTU/HOBt/DIEA: 1/1/1/3) aktiviert, anschließend auf einmal zu dem festen Träger in Suspension in DMF zugegeben. Nach 30 Minuten wird der Träger mit DMF und mit CH₂Cl₂ gewaschen.
Das so hergestellte Harz Fmoc-Lys(Boc₂NN(Boc)CH₂CO)-PAL-PEG-PS wird direkt für die Peptidsynthesen auf einem Träger verwendet.
2) Synthese der Peptide SIV1 bis SIV7 und TT.
Synthesevorschrift
Die Hydrazinopeptide SIV1–7 und TT werden in fester Phase an dem Harz Fmoc-Lys(Boc₂NN(Boc)CH₂CO)-PAL-PEG-PS synthetisiert, wobei die Fmoc/tert-Butyl-Chemie, wie sie z. B. in "Fmoc solid phase peptide synthesis, a practical approach" (W. C. CHAN & P. D. WHITE, Herausgeber, Oxford University Press, Oxford 2000) oder von G. B. FIELDS et al. in Int. J. Pept. Protein, 1990, 35, 161 beschrieben ist, mit einer HBTU/HOBt-Aktivierung (M. SCHNÖLZER et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 40, 180) verwendet wird. Die Synthese wird mit einem automatischen Synthesegerät Pioneer (Perseptive Biosystems) durchgeführt. Die Synthesereagenzien sind die Folgenden:

– Entfernung der Schutzgruppen von den Aminfunktionen: 20 % Piperidin in DMF,
– Aktivator der Aminosäuren: HBTU/HOBt (die beiden Reagenzien werden in einer Konzentration von 0,5 M in DMF verwendet),
– Lösung von 1 M DIEA in DMF,
– "Capping"-Lösung (d. h. Lösung zum Blockieren der reaktiven Funktionen, die nicht reagiert haben): 3 % Essigsäureanhydrid und 0,3 % DIEA in DMF.

Die Hydrazinopeptide SIV1 und SIV2 wurden in einem Maßstab von 0,1 mmol synthetisiert, wobei 10 Äquivalente Aminosäuren verwendet wurden. Was die Peptide SIV3 bis SIV7 und TT anbelangt, wurden sie in einem Maßstab von 0,25 mmol synthetisiert, wobei 4 Äquivalente Aminosäuren verwendet wurden. Die Synthesen erfolgten durch doppelte Kupplung mit "Capping" nach der folgenden Abfolge von Schritten: Entfernung der Schutzgruppen von der Aminofunktion, Aktivierung der Aminosäure und Kupplung (zweimal), anschließend "Capping" mit der Essigsäureanhydridlösung.
– Abtrennen und Entfernen der Schutzgruppen der Hydrazinopeptide SIV1–7 und TT.
Die Hydrazinopeptide werden von dem festen Träger abgetrennt und gleichzeitig werden ihre Schutzgruppen entfernt durch die Wirkung von TFA in Gegenwart von Carbokationenfängern. Das verwendete Gemisch ist das Folgende:

– Für die Peptide SIV1 und SIV2: 95 % TFA, 2,5 % TIS, 2,5 % H₂O,
– Für das Peptid SIV4: 95 % TFA, 2,5 % EDT, 2,5 % H₂O,
– für die Peptide SIV3, SIV5, SIV6, SIV7 und TT: TFA/EDT/Tfhioanisol/H₂O/Phenol (10 ml/0,25 ml/0,5 ml/0,5 ml/0,75 g).

Die Dauer der Reaktion der Abtrennung der Hydrazinopeptide von dem festen Träger schwankt zwischen 1 h 30 und 2 h 30 unter Rühren. Die Peptide werden anschließend in kaltem Ethylether ausgefällt und zentrifugiert.
Reinigung der Hydrazinopeptide SIV1–7 und TT.
Die Hydrazinopeptide werden durch RP-HPLC an einer präparativen Säule (15 mm Durchmesser und 500 mm Länge) mit einer stationären Phase C3 (Zorbax) an einem Shimadzu 6A HPLC-Gerät gereinigt, das mit einem Kipp&Zonen-Flachbettplotter und einem Gilson-Fraktionssammler ausgestattet ist. Die Elutionslösungsmittel (Lösungsmittel A und B) sind die Folgenden:

– Lösungsmittel A: entionisiertes Wasser, umfassend 0,05 % TFA,
– Lösungsmittel B: 40 % Isopropanol in entionisiertem Wasser, umfassend 0,05 TFA (für die Peptide SIV4 und SIV5) oder 40 % n-Propanol in entionisiertem Wasser, umfassend 0,05 % TFA (für die anderen Peptide).

Die rohen Hydrazinopeptide werden in einem Wasser/Essigsäure-Gemisch in einer Menge von 10 bis 20 mg/ml in Lösung gebracht für injizierte Mengen im Bereich von 40 bis 80 mg, je nach dem Peptid. Die Gradienten der Reinigung variieren in Abhängigkeit von den injizierten Hydrazinopeptiden:

SIV1: von 15 bis 40 % Puffer B in 25 Minuten (4 ml/min, 50°C),
SIV2: von 15 bis 30 % Puffer B in 30 Minuten (3 ml/min, 50°C),
SIV3: von 20 bis 40 % Puffer B in 20 Minuten (3 ml/min, 50°C),
SIV4: von 20 bis 50 % Puffer B in 30 Minuten (3 ml/min, 50°C),
SIV5: von 15 bis 30 % Puffer B in 15 Minuten (3 ml/min, 50°C),
SIV6: von 30 bis 60 % Puffer B in 25 Minuten (3 ml/min, 50°C),
SIV7: von 30 bis 40 % Puffer B in 30 Minuten (3 ml/min, 50°C),
TT: von 0 bis 25 % Puffer B in 25 Minuten (3 ml/min, 50°C).

Der UV-Nachweis erfolgt bei 225 nm, außer im Fall von SIV7, bei dem der Nachweis bei 280 nm erfolgt. Die gesammelten Fraktionen werden durch RP-HPLC (Gerät Shimadzu 10A) an einer Säule C3 (Zorbax, 4,6 mm Durchmesser und 160 mm Länge) mit einem linearen Gradienten von 0 bis 100 % Puffer B in 30 Minuten analysiert (Nachweis bei 215 nm, Durchfluss: 1 ml/min, 50°C). Die Fraktionen, welche die Hydrazinopeptide enthalten, werden vereinigt und lyophilisiert.
Die Tabelle 1 gibt für die Hydrazinopeptide SIV1 bis SIV7 und TT die Massen der nach der Synthese erhaltenen rohen Peptide, die Massen der nach der Reinigung durch RP-HPLC erhaltenen gereinigten Peptide sowie den Prozentsatz der Reinheit dieser gereinigten Peptide an.
Tabelle 1
Analyse der Hydrazinopeptide SIV1–7 und TT.
Um ihre Identität zu bestätigen, werden die gereinigten Hydrazinopeptide durch ES-MS mit Hilfe eines Micromass Quatro-Spektrometers analysiert. Die berechneten ("ber.") und gefundenen ("gef.") Molekulargewichte sind wie folgt: SIV1 ber. 3258,9, gef. 3257,5; SIV2 ber. 2969,35, gef. 2968; SIV3 ber. 3113,5, gef. 3111,5; SIV4 ber. 3188,5, gef. 3187; SIV5 ber. 3453,7, gef. 3452,5 ; SIV6 ber. 3502,9, gef. 3501,5; SIV7 ber. 4806,5, gef. 4804,5; TT ber. 2222,57, gef. 2220,5.
Die Hydrazinopeptide werden auch durch Kapillarelektrophorese (Applied Biosystems 270A-HT) analysiert. Die Betriebsbedingungen sind wie folgt:

– SIV4, SIV5 und SIV6: 50 mM Boratpuffer, 30 kV, 10 Minuten, 200 nm, 45°C, Injektion während 1,5 Sekunden,
– für die anderen Hydrazinopeptide: 20 mM Citronensäurepuffer, pH 2,1, 30 kV, 10 Minuten, 200 nm, 45°C, Injektion während 1,5 Sekunden.

Die Hydrazinopeptide werden außerdem einer Analyse der Zusammensetzung der Aminosäuren nach vollständiger Säurehydrolyse mit 6N Chlorwasserstoffsäure während 24 Stunden und bei 110°C unterzogen. Außer einer dritten Bestätigung ihrer Identität ermöglicht diese Analyse, den Prozentsatz des Peptids in dem Lyophilisat abzuschätzen. Die Ergebnisse dieser Analyse sind wie folgt: SIV1: 91,9 %; SIV2: 78,2 %; SIV3: 97,9 %; SIV4: 100 %; SIV5: 92,7 %; SIV6: 74,9 %; SIV7: 95,1 %; TT: 100 %.
3) Synthese der Peptide Mu-IFNγ, Mu-IFNγ a, Mu-IFNγ b, Mu-IFNγ c und Mu-IFNγ d.
Die in den Peptiden Mu-IFNγ und Mu-IFNγ c einerseits und Mu-IFNγ a andererseits vorhandenen Sequenzen entsprechen 38 bzw. 20 angrenzenden Aminosäuren des C-terminalen Endes von Interferon-γ (IFN-γ) der Maus, wie es insbesondere in der internationalen PCT-Anmeldung, die unter der Nr. WO 99/40113 veröffentlicht ist, und von K. THIAM et al. in Biochemical and Biophysical Research Communications, 1998, 253, 639–647 und in Journal of Medicinal Chemistry, 1999, 42, 3732–3736 beschrieben ist. Was die in den Peptiden Mu-IFNγ b und Mu-IFNγ d vorhandenen Sequenzen anbelangt, handelt es sich um "Scramble"-Sequenzen der in den Peptiden Mu-IFNγ a bzw. Mu-IFNγ c vorhandenen Sequenzen, d. h. um Sequenzen, in denen die Reihenfolge der Aminosäuren so angeordnet worden ist, dass jede Sequenzverwandtschaft mit dem ursprünglichen Peptid vermieden wird. Ein solches Peptid dient als Kontrolle in den biologischen Tests, die nachstehend beschrieben werden.
Synthese des Hydrazinopeptids Mu-IFNγ.
Das Hydrazinopeptid Mu-IFNγ wird mit Hilfe von 0,25 mmol eines Rink-Amid-Harzes MBHA PS mit einer Beladung von 0,74 mmol/g (Applied Biosystems, Foster City, USA) nach der Fmoc/tert-Butyl-Strategie (wie es vorstehend für die Synthese der Hydrazino peptide SIV1 bis SIV7 und TT beschrieben ist) und einer klassischen Aktivierung an einem Peptidsynthesegerät Applied Biosystems 430A hergestellt. Am Ende der Synthese wird ein Teil des Peptidylharzes (31,25 μmol) an dem N-terminalen Ende mit einer Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH-Gruppe modifiziert. Nach dem Verdrängen der Fmoc-Gruppen durch eine Lösung von 20 % Piperidin in DMF wird N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure (36,48 mg, 1,2 Äq. pro Aminogruppe) manuell eingeführt, wobei eine BOP-Aktivierung in situ verwendet wird, wie es vorstehend unter 1) beschrieben ist.
Das Abtrennen und die Entfernung der Schutzgruppen des Hydrazinopeptids Mu-IFNγ erfolgt in Gegenwart eines TFA/H₂O/Phenol/EDT/Thioanisol-Gemisches (1 g trockenes Harz/10,0 ml TFA/0,5 ml Wasser/0,75 g Phenol/0,25 ml EDT/0,5 ml Thioanisol). Nach der Fällung in einem Ether/Heptan-Gemisch (1/1 bezogen auf das Volumen) und einer Zentrifugation wird das Peptid in einem Wasser/Essigsäure-Gemisch (80/20 bezogen auf das Volumen) aufgenommen, eingefroren und lyophilisiert.
Das Hydrazinopeptid Mu-IFNγ wird durch RP-HPLC an einer präparativen Säule (15 mm Durchmesser und 300 mm Länge) mit einer stationären Phase C3 (Zorbax) gereinigt, wie es für die Reinigung der Hydrazinopeptide SV1 bis SV7 und TT beschrieben ist. Der Elutionsdurchfluss beträgt 3 ml/Minute, wobei ein Gradient von 25 bis 90 % Lösungsmittel B (40 % Isopropanol in entionisiertem Wasser, umfassend 0,05 % TFA) in dem Lösungsmittel A (entionisiertes Wasser, umfassend 0,05 % TFA) verwendet wird. Nach der Lyophilisierung wird das Hydrazinopeptid Mu-IFNγ (16,1 mg, Ausbeute 8,5 %) bei –20°C aufbewahrt. Seine ES-MS-Analyse ist wie folgt: [M+H]⁺ berechnet 4846,6; gefunden 4845,5.
Synthese der Hydrazinopeptide Mu-IFNγ a und Mu-IFNγ b.
Man geht so vor, wie es vorstehend im Hinblick auf die Synthese des Hydrazinopeptids Mu-IFNγ beschrieben ist. Nach den Schritten der Abtrennung und der Entfernung der Schutzgruppen werden die Peptide in Ethylether gefällt, zentrifugiert, in einem Wasser/Essigsäure-Gemisch (90/10 bezogen auf das Volumen) aufgenommen, eingefroren und lyophilisiert. Man erhält 430 mg bzw. 594,4 mg der Peptide Mu-IFNγ a und Mu-IFNγ b in roher Form. Die Reinigung der Peptide erfolgt wie vorstehend für das Peptid Mu-IFNγ beschrieben, wobei ein Gradient von 0 to 50 % Lösungsmittel B in 50 Minuten verwen det wird. So erhält man 61,4 mg bzw. 104,2 mg der gereinigten Peptide Mu-IFNγ a und Mu-IFNγ b. Mu-IFNγ a: TOF-PDMS [M+H]⁺ berechnet 2659,22; gefunden 2660,9. Mu-IFNγ b : ES-MS [M+H]⁺ berechnet 2658,22; gefunden 2657,0.
Synthese der Hydrazinopeptide Mu-IFNγ c und Mu-IFNγ d.
Die Hydrazinopeptide Mu-IFNγ c und Mu-IFNγ d werden mit Hilfe von 0,1 mmol eines Harzes Fmoc-PAL-PEG-PS (Perseptive Bioystems) nach der Fmoc/tert-Butyl-Strategie (wie vorstehend für die Synthese der Hydrazinopeptide SIV1 bis SIV7 und TT beschrieben) und einer klassischen Aktivierung an einem Peptidsynthesegerät Pioneer (Perseptive Biosystems) hergestellt. Die Synthesen erfolgen durch einfache Kupplung und mit einem 10-fachen Überschuss an Aminosäure, bezogen auf die theoretische Beladung des Peptidylharzes. Am Ende der Synthese werden die Peptidylharze an dem N-terminalen Ende durch einen Boc-L-Lys(Fmoc)-OH -Rest modifiziert. Nach der Verdrängung der Fmoc-Gruppe durch eine Lösung von 20 % Piperidin in DMF wird N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure (390 mg, 10 Äquivalente) ebenfalls automatisch eingeführt. Die Schritte der Abtrennung und der Entfernung der Schutzgruppen erfolgen so, wie es vorstehend für die Herstellung von Mu-IFNγ beschrieben ist. Die Reinigung der Peptide Mu-IFNγ c und Mu-IFNγ d erfolgt so, wie es vorstehend für das Peptid Mu-IFNγ beschrieben ist, wobei ein Gradient von 25 bis 100 % Puffer B in 75 Minuten bzw. von 20 bis 100 % Puffer B in 80 Minuten verwendet wird.
So werden 158 mg (26 %) des Peptids Mu-IFNγ c nach der Lyophilisierung erhalten. ES-MS berechnet 4772,6; gefunden 4771,5: m/z 1193,5 [M+4H]⁴⁺, 955,1 [M+5H]⁵⁺,796,0 [M+6H]⁶⁺, 682,2 [M+7H]⁷⁺.
So werden 120 mg (20 %) des Peptids Mu-IFNγ d nach der Lyophilisierung erhalten. ES-MS berechnet 4772,6; gefunden 4771,0; m/z 1193,7, [M+4H]⁴⁺, 955,3 [M+5H]⁵⁺, 796,2 [M+6H]⁶⁺, 682,5 [M+7H]⁷⁺.
4) Synthese des Peptids OVA.
Das Hydrazinopeptid OVA wird in fester Phase mit Hilfe von 0,10 mmol eines Harzes Fmoc-PAL-PEG-PS mit einer Beladung von 0,16 mmol/g (Perseptive Biosystems) unter Verwendung der Fmoc/tert-Butyl-Chemie und einer HBTU/HOBt-Aktivierung, wie es vorstehend für die Synthese der Hydrazinopeptide SIV1 bis SIV7 und TT beschrieben ist, an einem Peptidsynthesegerät Pioneer synthetisiert. Am Ende der Synthese wird die α-NH₂-Funktion von Lysin 20 Minuten in Gegenwart von 20 % Piperidin in DMF behandelt, anschließend 10 Minuten acetyliert, wobei eine Lösung von 10 % Essigsäureanhydrid in CH₂Cl₂ verwendet wird. Die Schutzgruppe Mtt der ε-NH₂-Funktion von Lysin wird mit Hilfe einer Lösung von 1 % TFA in CH₂Cl₂ verdrängt. Es sind 13 Zyklen erforderlich, die jeweils eine Behandlung mit 20 ml dieser Lösung umfassen. Schließlich wird das Harz zweimal während 2 Minuten mit 20 ml CH₂Cl₂ gewaschen.
N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure (47 mg, 0,12 mmol) wird anschließend an die ε-NH₂-Funktion von Lysin gekuppelt, wobei eine Aktivierung mit HBTU/HOBt/DIEA (1,12 mmol/0,12 mmol/0,24 mmol) während 60 Minuten verwendet wird, wie es vorstehend in Bezug auf die Synthese der Hydrazinopeptide SIV1 bis SIV7 und TT beschrieben ist. Nachdem das Peptidylharz gewaschen und getrocknet worden ist, wird es in Gegenwart von 95 %TFA/2,5 % H₂O/2,5 % TIS (wie vorstehend für die Abtrennung und die Entfernung der Schutzgruppen der Hydrazinopeptide SIV1 und SIV2 beschrieben) 2 Stunden lang bei Umgebungstemperatur behandelt. Das Hydrazinopeptid wird schließlich gefällt, in einem Wasser/Essigsäure-Gemisch gelöst, eingefroren und anschließend lyophilisiert.
Das so in roher Form erhaltene Hydrazinopeptid OVA wird an einer C3-Zorbax-Säule gereinigt. Der Elutionsdurchfluss beträgt 4 ml/Minute, wobei ein linearer Gradient von 0 bis 20 %, in 20 Minuten, eines Gemisches aus entionisiertem Wasser/Isopropanol (2/3), umfassend 0,05 % TFA, in einem Gemisch aus entionisiertem Wasser/0,05 % TFA verwendet wird. Nach der Lyophilisierung werden 74 mg (Ausbeute 30 %) Hydrazinopeptid OVA erhalten. Die Analyse des Peptids OVA durch ES-MS ist wie folgt: [M+H]⁺ berechnet 2016,1; gefunden 2015,0.
5) Synthese des Peptids G18R.
Die Synthese erfolgt mit Hilfe eines automatischen Synthesegeräts Pioneer (Perseptive Biosystems) mit 0,2 mmol des Harzes Fmoc-PAL-PEG-PS, gemäß der vorstehend in Bezug auf die Synthese der Peptide SIV1–7 und TT beschriebenen Arbeitsvorschrift. Die Schritte der Abtrennung und der Entfernung der Schutzgruppen erfolgen mit Hilfe eines Gemisches aus TFA/TIS/H₂O/EDT (94 %/1 %/2,5 %/2,5 %, bezogen auf das Volumen). Nach der Fällung in Ethylether erhält man 360 mg rohes Peptid. Dieses Peptid wird an einer C3-Zorbax-Säule gereinigt, mit einem Elutionsdurchfluss von 4 ml/Minute, wobei ein linearer Gradient von 0 bis 30 %, in 30 Minuten, eines Gemisches aus entionisiertem Wasser/Isopropanol (40 Volumen-%), umfassend 0,05 % TFA, in einem Gemisch aus entionisiertem Wasser/0,05 % TFA verwendet wird. Nach der Lyophilisierung werden 117 mg Hydrazinopeptid G18R erhalten. Seine Analyse durch TOF-PDMS ist wie folgt: [M+H]⁺ berechnet 1883,2; gefunden 1881,1.
Beispiel 2: Synthese des Tetrachinoyl-Lysin-Baums, der eine Hydrazinogruppe aufweist, in Übereinstimmung mit der allgemeinen Formel (II) [(Chi)₄AKHdz]
Der Baum (Chi)₄AKHdz wird in einem Maßstab von 0,125 mmol ausgehend von einem Rink-Amid-Harz Nleu AM-PS mit einer Beladung von 0,75 mmol/g nach der Fmoc/tert-Butyl-Strategie (wie vorstehend für die Synthese der Hydrazinopeptide Mu-IFNγ beschrieben) hergestellt. Die Synthese wird manuell durchgeführt, wobei ein 4-facher Überschuss an Aminosäure, bezogen auf reaktive Amingruppen, die an dem festen Träger vorhanden sind, und eine Aktivierung mit HBTU/HOBt/DIEA 4/4/8 Äquivalente (M. SCHNÖLZER et al., Int. J. Pept. Protein Res., 1992, 40, 180) eingesetzt wird, wobei DMF als Lösungsmittel verwendet wird. Das Fmoc-β-Ala-OH wird zunächst an das Harz gekuppelt, gefolgt von dem ersten Lysinrest in Form der Verbindung Fmoc-L-Lys(Mtt)-OH. Die 4-Methyltritylgruppe (Mtt) wird durch Behandlung mit einer Lösung von 1 % Trifluoressigsäure in Dichlormethan entfernt, wie es in L. BOUREL et al., J. Peptide Sci., 2000, 6, 264 beschrieben ist. Die N,N'-Tri(Boc)hydrazinoessigsäure wird anschließend nach einer Voraktivierung mit einem Gemisch aus HBTU/HOBt/DIEA 1,2/1,2/2,4 in DMF an die Aminfunktion der Seitenkette gekuppelt (wobei ein Überschuss von 1,2 Äquivalenten pro reaktiver Aminfunktion verwendet wird).
Die Herstellung des Baumes wird fortgesetzt durch Kuppeln von einem und danach zwei Lysinen in Form ihrer Fmoc-L-Lys(Fmoc)-OH Derivate. Auf die zwei Kupplungsschritte folgt jeweils ein "Capping"-Schritt (d. h. die Blockierung von gegebenenfalls vorhandenen Aminfunktionen, die nicht reagiert haben), durch Behandlung des Peptidylharzes mit einem Gemisch aus Ac₂O/DIEA/CH₂Cl₂ (10/5/85) während 5 Minuten. Nach der Entfernung der Fmoc-Gruppen durch Behandlung mit einer Lösung von 20 % Piperidin in DMF während 20 Minuten wird das Peptidylharz mit (1s_n,3R,4s_n,5R)-1,3,4,5-Tetra-acetoxycyclohexan-1-carbonsäure umgesetzt (2 Äquivalente, bezogen auf die reaktiven Aminfunktionen), die in situ durch ein Gemisch von PyBOP/DIEA (2 bzw. 4 Äquivalente, bezogen auf die reaktiven Aminfunktionen) in DMF aktiviert ist. Die Kupplung wird erneut vollzogen, wobei die gleichen Reagenzien in einem Verhältnis von 1/1/2 Äquivalenten, bezogen auf die ursprünglichen reaktiven Aminfunktionen verwendet werden. Das Harz wird anschließend mit Dichlormethan (3 x 2 Minuten) und danach mit Ethylether (2 x 1 Minute) gewaschen und anschließend getrocknet.
Das Peptidylharz wird anschließend mit einem Gemisch aus TFA/TIS/H₂O (95/2,5/2,5) (6 ml) während 1 Stunde 30 Minuten bei Umgebungstemperatur behandelt. Das Rohprodukt der Spaltung wird nach einer Filtration in einem gekühlten Gemisch aus Ethylether/Heptan (1:1) (60 ml) gefällt. Nach einer Zentrifugation wird das Rohprodukt in einem Gemisch aus AcOH/H₂O gelöst, eingefroren und anschließend lyophilisiert.
Der Rückstand wird in einer wässrigen Lösung von 25 % Essigsäure aufgenommen, anschließend durch semipräparative RP-HPLC an einem Shimadzu LC-4A-System gereinigt, wobei eine Hypersil Hyperprep C-18-Säule (300Å, 8 μm, 10 × 260 mm) mit einem Durchfluss von 3 ml · min^–1 bei 50°C und einem Nachweis bei 215 nm: Lösungsmittelsystem A: 0,05 % TFA in entionisiertem Wasser; Lösungsmittelsystem B: 0,05 % TFA in 40 % Isopropanol in entionisiertem Wasser (Gradient: von 0 bis 30 % Puffer B in 30 Minuten, anschließend von 30 bis 40 % Puffer B in 20 Minuten und von 40 bis 50 in 50 Minuten) verwendet wird. Die Fraktionen, die den Tetrachinoyl-Baum enthalten, werden vereinigt, eingefroren und anschließend lyophilisiert. Ein Teil des Rückstands (54 mg) wird 1 Stunde bei Umgebungstemperatur in einem Gemisch aus 10 % Hydrazin in Wasser (4 ml) aufgenommen, um die Entfernung der Schutzgruppen von den Alkoholfunktionen der Chinoylreste zu ermöglichen. Das Reaktionsmedium wird anschließend unter den vorstehend beschriebenen Bedingungen direkt gereinigt (Gradient: von 0 bis 20 % Puffer B in 40 Minuten), um 15 mg (40 %) des Tetrachinoyl-Baumes in Form eines Pulvers nach der Lyophilisierung zu ergeben. ES-MS: m/z [M+H]⁺ berechnet 1369,7; gefunden 1369,8; [M+Na]⁺ berechnet 1391,8; gefunden 1391,7.
(Chi)₄AKHdz
Beispiel 3: Synthese von Peptiden, die durch eine von Hydrazin abgeleitete Gruppe der Formel -CO-CHR'-NH-NH₂ funktionalisiert sind, wobei R' H ist
Die Peptide H₂N-KVGFFKR-NN₂ (R' = 4-Aminobutyl) und H₂N-VKYAL-NH₂ (R' = Isopropyl) werden in fester Phase an einem Rink-Amid-Harz AM-PS 1 % DVD (0,70 mmol/g, 100–200 mesh, Senn Chemicals AG) unter Verwendung der Fmoc/tert-Butyl-Chemie, wie in Beispiel 1, § 2, beschrieben, im Maßstab von 0,25 mmol synthetisiert. Die Synthesen erfolgen an einem automatischen Synthesegerät Applied Biosystems 431A, durch einfache Kupplung.
Nachdem die Peptidsequenzen fertiggestellt sind, werden die N^α-Aminfunktionen von Lysin und von Valin von den Schutzgruppen befreit, wobei eine Lösung von 20 % Pipe ridin in NMP verwendet wird. Die Peptidylharze werden anschließend mittels einer elektrophilen N-Aminierungsreaktion in fester Phase in Hydrazinderivate umgewandelt, wobei N-Boc-3-(4-Cyanophenyl)oxaziridin (BCPO) verwendet wird, wie es in der Literatur beschrieben ist (D. BONNET et al., J. Peptide Res., 1999, 54, 270 und O. MELNYK et al., J. Peptide Res., 1998, 52, 180).
Kurz gesagt, werden die Peptidylharze mit 60 mg (0,244 mmol) BCPO in Lösung in CH₂Cl₂ (6 ml) 3 Stunden lang umgesetzt. Nach einer Waschung mit CH₂Cl₂ und anschließend DMF werden die Harze mit 50 mg (0,25 mmol) N-Benzylhydrazin in Form seines Chlorhydrats in Lösung in DMF/AcOH/H₂O (8,5/1/0,5) (5 ml) (3 × 10 Minuten) behandelt. Nach dem Waschen mit DMF und anschließend CH₂Cl₂ werden die Peptidylharze durch eine Lösung von 5 % DIEA in CH₂Cl₂ (2 × 2 Minuten) neutralisiert und schließlich mit CH₂Cl₂ gewaschen. Diese Reihenfolge von Arbeitsschritten wird 10mal wiederholt.
Die Hydrazinopeptide werden durch eine Behandlung mit 10 ml eines Gemisches aus TFA/H₂O/Thioanisol/TIS (94/2,5/2,5/1) während 1h 30 von den Schutzgruppen befreit und von dem Harz gespalten. Das Harz wird über ein Sinterformteil filtriert und die Peptide werden in 100 ml eines gekühlten Gemisches aus Ethylether/Pentan (1/1) gefällt. Die Rückstände werden zentrifugiert, lyophilisiert, um 149 bzw. 133 mg Rohprodukt zu ergeben, anschließend durch semipräparative RP-HPLC an einem Shimadzu LC-4A-System gereinigt, wobei eine Hypersil Hyperprep C-18-Säule (300Å, 8 μm, 10 × 260 mm) mit einem Durchfluss von 3 ml · min^–1 bei 50°C und einem Nachweis bei 215 nm verwendet wird: Lösungsmittelsystem A: 0,05 % TFA in entionisiertem Wasser; Lösungsmittelsystem B: 0,05 % TFA in 40 % Isopropanol in entionisiertem Wasser.
123 mg (36 %) der Verbindung H₂N-KVGFFKR-NH₂ werden nach der Reinigung (Gradient: von 0 bis 70 % Puffer B in 70 Minuten), gefolgt von der Lyophilisierung, erhalten. TOF-PDMS: m/z [M+H]⁺ berechnet 895,9; gefunden 895,5.
27,8 mg (13,3 %) der Verbindung H₂N-VKYAL-NH₂ werden nach der Reinigung (Gradient: von 0 bis 40 % Puffer B in 200 Minuten), gefolgt von der Lyophilisierung, erhalten. TOF-PDMS: m/z [M+H]⁺ berechnet 607,8; gefunden 607,5.
Beispiel 4: Synthese der erfindungsgemäßen lipophilen Vektoren (IIIa), (IIIb), (IIIc) und (IVa).
Die lipophilen Vektoren (IIIa) und (IIIb), die nachstehend wiedergegeben sind, entsprechen der allgemeinen Formel (III) gemäß der Erfindung, in welcher L eine Kohlenstoffkette der Formel CH₃-(CH₂)₁₄- bzw. der Formel CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇- bedeutet.
Der nachstehend wiedergegebene lipophile Vektor (IVa) entspricht der allgemeinen Formel (IV) gemäß der Erfindung, in welcher L eine Kohlenstoffkette der Formel CH₃-(CH₂)₁₄- bedeutet.
1) Synthese des lipophilen Vektors (IIIa) (Figur 1).
Synthese der Verbindung 2
In einem 500 ml-Kolben werden 10 g (66,6 mmol) Weinsäure 1 in 200 ml absolutem Ethanol gelöst, in Gegenwart von 1 Massen-% Amberlyst 15-Harz. Der Kolben ist mit einem Soxhlet-Aufsatz versehen, der aktiviertes Molekularsieb 4A enthält. Das Ethanol wird 48 Stunden lang refluxiert. Das Reaktionsmedium wird anschließend über Sinterglas Nr. 4 filtriert, um das Harz zu entfernen. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck konzentriert und führt zu einem hellgelben Öl. Der Rückstand 2 wird eine Nacht über P₂O₅ getrocknet und ohne weitere Reinigung verwendet (m =13,46 g, Ausbeute = 98,0 %).
Die Analyse der Verbindung 2, die nachstehend angegeben ist, durch Dünnschichtchromatografie ergibt einen Retentionsfaktor Rf = 0,76 in dem Lösungsmittel CH₂Cl₂/MeOH/H₂O/AcOH (90/10/0,1/0,05).
¹H-NMR (CDCl₃): 1,33 (t, 6H, H_5,5', J_5–4 = 7,2 Hz), 3,28 (s, 2H, H_1,1'), 4,33 (q, 4H, H_4,4', J_4–5 = 7,1 Hz), 4,54 (s, 2H, H_2,2'). ¹³C-NMR: 14,14 (C_5,5'), 62,48 (C_4,4'), 72,08 (C_2,2'), 171,62 (C_3,3').
Synthese der Verbindung 3
13,46 mg (65,26 mmol) der Verbindung 2 werden in 155 ml absolutem Ethanol gelöst und tropfenweise zu 56 ml (665,26 mmol) 1,3-Diaminopropan zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird anschließend 3 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Der Überschuss von 1,3-Diaminopropan wird anschließend durch Abdampfen unter vermindertem Druck und azeotrope Destillation in Gegenwart von Ethanol (3 × 200 ml) entfernt. Das erhaltene gelbe Öl wird eine Nacht lang über P₂O₅ getrocknet, anschließend in einem Gemisch aus Ethanol/Toluol (1/1) aufgenommen und unter vermindertem Druck (3 × 200 ml) konzentriert. So wird eine gelbe Verbindung in Form einer Paste erhalten. Die Verbindung wird in 50 ml eines Gemisches aus Ethylether/Ethanol (5/1) gefällt, anschließend filtriert und der weißliche Niederschlag wird 1 h 30 bei 0°C in Gegenwart von Ethylether gerührt. Er wird anschließend über ein Sinterformteil filtriert und zweimal mit der Mindestmenge an Ethylether in der Kälte gewaschen. Der zurückbleibende Feststoff 3 wird eine Nacht lang über P₂O₅ getrocknet (m = 13,92 g, Ausbeute = 81,3%).
Die Analyse der Verbindung 3, die nachstehend angegeben ist, ist wie folgt: Rf = 0,34 in THF/AcOH/H₂O/AcO^–NH₄ ⁺ (35/20/10/1 Massen-%).¹H-NMR (DMSO-d₆): 1,48 (q, 4H, H_{6 und 6'}, J_{6–5,6,7 und
6'–5',6',7'} = 6,65 Hz), 2,51 (m, 4H, H_7–7'), 3,14 und 3,16 (t, 4H, H_{5 und 5'}, J_{5–6
und 5'–6'} = 6,3 Hz), 4,19 (s, 2H, H_2,2'), 7,75 (t, 2H, H_4,4', J_4,4' = 5,97 Hz). ¹³C-NMR: 33,51 (C_6,6'), 36,98 (C_7,7'), 40,06 (C_5,5'), 73,43 (C_2,2'), 172,87 (C_5,5').
Synthese der Verbindung (IIIa)
996,9 mg (3,8 mmol) der Verbindung 3 werden in 15 ml Wasser gelöst. Der pH der Lösung, der 8,5 beträgt, wird mit Hilfe von 1,46 g Citronensäure auf 3,25 gebracht. Anschließend werden 1,06 g (4,9 mmol) festes NaIO₄ auf viermal während 5 Minuten zu dem Reaktionsmedium zugegeben, das mit Hilfe eines Wasserbades auf Umgebungstemperatur gehalten wird. Nach 10 Minuten Rühren werden 570 mg Weinsäure (3,8 mmol) zugegeben, um den Überschuss an NaIO₄ zu neutralisieren, der nicht reagiert hat. Nach 10 Minuten Rühren bei Umgebungstemperatur wird der pH mit 24 ml N-Methylmorpholin auf 8,6 eingestellt. Das Reaktionsmedium wird mit 70 ml 2-Methylpropan-2-ol und 20 ml Wasser verdünnt. Dann werden 2,16 g (1,6 Äq.) Succinimidylpalmitoat zu der Lösung zugegeben, welche eine Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt wird. Anschließend wird der pH mit 7,11 g Citronensäure auf 3,5 eingestellt. Das Medium wird mit 40 ml einer gesättigten NaCl-Lösung verdünnt und mit 140 ml Dichlormethan, anschließend 100 ml Chloroform extrahiert. Die organische Phase wird mit zweimal 100 ml einer gesättigten KH₂PO₄-Lösung, zweimal 100 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, anschließend über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Die zurückbleibende feste Verbindung wird an Siliciumdioxid gereinigt, wobei als Elutionsmittel ein Gemisch aus CH₂Cl₂/AcOEt/EtOH (70/22/5) verwendet wird. So werden 951,4 mg des lipophilen Vektors (IIIa), d. h. eine Ausbeute von 42,3 % erhalten.
Die Analyse der Verbindung (IIIa), die nachstehend in Form des Hydrats wiedergegeben ist, ist wie folgt :¹H-NMR (DMSO-d₆): 0,87 (t, 3H, H₁, J_1,2 = 5,31 Hz), 1,25 (m, 24H, H₂), 1,83 (m, 4H, H₃, H₈), 2,39 (m, 2H, H₄), 3,57 (m, 4H, H₇, H₉), 4,41 (s, 2H, H_14,15), 5,50 (m, 1H, H₁₂).¹³C-NMR: 14,31 (C₁), 22,96 (C₂), 26,35 (C₈), 29,99 (C₃), 36,79 (C₄), 37,14 (C₇), 92,18 (C₁₂), 173,42 (C₅), 175,22 (C₁₁). ES-MS:[M+H]⁺ berechnet 387,5; gefunden 387,2
2) Synthese des lipophilen Vektors (IIIb) (Figur 1).
Zunächst wird aktivierte Ölsäure in Form des N-Hydroxysuccinimidesters hergestellt, ausgehend von 859 mg (3,0 mmol) Ölsäure, 353 mg (3,0 mmol) N-Hydroxysuccinimid und 370 μl (2,3 mmol) Diisopropylcarbodiimid, welche in 30 ml eines Gemisches aus THF/CH₂Cl₂ (1/1) gelöst werden. Nach einer Nacht bei 4°C wird das Medium unter vermindertem Druck konzentriert und ohne weitere Reinigung für die Fortsetzung der Synthese verwendet.
Anschließend geht man auf die gleiche Weise wie zum Erhalt des lipophilen Vektors (IIIa) vor, wie es vorstehend beschrieben ist: 500 mg (1,9 mmol) der Verbindung 3, die wie vorstehend angegeben hergestellt wurde, werden in 10 ml Wasser gelöst. Der pH der Lösung, der 8,5 beträgt, wird mit 667 mg Citronensäure auf 3,5 eingestellt. 530 mg (2,4 mmol) festes NaIO₄ werden anschließend auf viermal während 5 Minuten zugegeben, wobei das Medium mittels eines Wasserbades auf Umgebungstemperatur gehalten wird. Nach 10 Minuten Rühren werden 286 mg Weinsäure (1,9 mmol) zugegeben, um den Überschuss an NaIO₄ zu neutralisieren. Nach 10 Minuten Rühren wird der pH mit 12 ml N-Methylmorpholin auf 8,6 eingestellt. Das Medium wird mit 35 ml 2-Methyl-propan-2-ol und 20 ml Wasser verdünnt. Aktivierte Ölsäure in Form des N-Hydroxysuccinimidesters wird in 50 ml 2-Methyl-propan-2-ol gelöst und zu der Lösung zugegeben. Nach einer Nacht Rühren wird der pH des Mediums mit 15 g Citronensäure auf 3,5 eingestellt und mit 20 ml einer gesättigten NaCl-Lösung verdünnt. Das Gemisch wird mit 70 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Phase wird zweimal mit 50 ml gesättiger KH₂PO₄-Lösung, anschließend zweimal mit 50 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Der zurückbleibende Feststoff wird an Siliciumdioxid gereinigt, wobei als Elutionsmittel ein Gemisch aus CH₂Cl₂/AcOEt/EtOH (70/22/5) verwendet wird. So werden 336,3 mg des lipophilen Vektors (IIIb), d. h. eine Ausbeute von 27 %, erhalten.
3) Synthese des lipophilen Vektors (IIIc) (Figur 1).
Die Synthese erfolgt ausgehend von N-Cholesterylcarbonyloxysuccinimid, wie es für die Herstellung des lipophilen Vektors (IIIa) vorstehend beschrieben ist. 50,3 mg (0,1905 mmol) der Verbindung 3, die wie vorstehend angegeben hergestellt wurde, werden in 2 ml Wasser gelöst. Der pH der Lösung, der 11,05 beträgt, wird mit 126 mg Citronensäure auf 3,08 eingestellt. 53,6 mg (0,248 mmol) festes NaIO₄ werden auf viermal über 5 Minuten zugegeben, wobei das Medium mittels eines kalten Wasserbades auf Umgebungstemperatur gehalten wird. Nach 10 Minuten Rühren werden 24 mg Weinsäure (0,19 mmol) zugegeben, um den Überschuss an NaIO₄ zu neutralisieren. Nach 10 Minuten Rühren wird der pH anschließend mit 2,4 ml N-Methylmorpholin auf 8,51 eingestellt. Das Medium wird mit 10 ml 2-Methyl-propan-2-ol verdünnt. 161,1 mg (0,305 mmol) N-Cholesterylcarbonyloxysuccinimid wird in fester Form zu der Lösung zugegeben. Nach 1 h Rühren bei Umgebungstemperatur, anschließend 2 h bei 60°C werden 10 ml CH₂Cl₂ zugegeben, um das N-Cholesterylcarbonyloxy-succinimid vollständig aufzulösen. Nach 1 Stunde Rühren bei Umgebungstemperatur wird der pH der wässrigen Phase mit 1,8 g Citronensäure auf 3,8 eingestellt. Das Gemisch wird mit 15 ml CH₂Cl₂ extrahiert. Die organische Phase wird zweimal mit 30 ml gesättigter KH₂PO₄-Lösung und anschließend mit 30 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen (mit Zugabe von 15 ml Ethylether, um die Phasentrennung zu ermöglichen). Die organische Phase wird anschließend über Na₂SO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Der zurückbleibende Feststoff wird an Silicagel gereinigt, wobei als Elutionsmittel ein Gemisch aus CHCl₃/AcOH (95/5) verwendet wird, um 53,4 mg des lipophilen Vektors (IIIc), d. h. eine Ausbeute von 32,2 % zu erhalten.
4) Synthese des lipophilen Vektors (IVa) (Figur 2)
1 g (3,8 mmol) der Verbindung 3 deren Synthese vorstehend beschrieben wurde, wird in 10 ml Wasser gelöst. Der pH wird mit Citronensäure (1,8 g) auf 3,25 eingestellt. 1,06 g (4,95 mmol) NaIO₄ werden anschließend auf viermal zu dem Reaktionsmedium zugegeben, das mittels eines Wasserbades auf Umgebungstemperatur gehalten wird. So bald die Zugabe beendet ist, wird das Gemisch 10 Minuten lang gerührt. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatografie unter Verwendung des Elutionsmittels THF/AcOH/H₂O/AcO^–NH₄ ⁺ (35/20/10/1 Massen-%) verfolgt.
Der Überschuss an NaIO₄ wird durch Zugabe von 3 Äq. Weinsäure verbraucht. Nach 5 Minuten Rühren bei Umgebungstemperatur wird der pH des Reaktionsmediums durch Zugabe von 7 g Tris(hydroxymethyl)aminomethan auf 8,55 eingestellt. Es werden 70 ml tert-Butanol sowie 1,21 g (3,4 mmol) festes Succinimidylpalmitoat zugegeben. Das Gemisch wird während einer Nacht kräftig gerührt, mit 50 ml Wasser, das mit KH₂PO₄ gesättigt ist, verdünnt, anschließend zweimal mit einem Gemisch aus CH₂Cl₂/tert-Butanol (100 ml/50 ml) extrahiert. Die organische Phase wird zweimal mit einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen und anschließend über MgSO₄ getrocknet und unter vermindertem Druck konzentriert. Der zurückbleibende gelbe pastenartige Feststoff wird in Ethanol gelöst und die Lösung wird unter vermindertem Druck konzentriert. Der Arbeitsschritt wird zweimal durchgeführt, um das zurückbleibende tert-Butanol zu entfernen. Man erhält die Verbindung 4, die dem lipophilen Vektor (IVa) in reduzierter Form entspricht, in Form eines weißen Feststoffes in Mischung mit dem lipophilen Vektor (IIIa).
Die Reinigung von 301,4 mg dieses Feststoffs durch Chromatografie an Siliciumdioxid mit einem Gemisch aus CH₂Cl₂/AcOEt/EtOH (70/20/10) ermöglicht es, 157,7 mg (Ausbeute = 52,2 %) der Verbindung 4 und 37,6 mg (Ausbeute = 13,2 %) des lipophilen Vektors (IIIa) zu erhalten.
Die Analyse der Verbindung 4, die nachstehend angegeben ist, ist wie folgt:¹H-NMR (Pyridin-d₅): 0,86 (t, 6H, H_1,1', J = 6,30 Hz), 1,25 (m, 48H, H_2,2'), 1,83 (m, 8H, H_3,3',8,8'), 2,37 (t, 2H, H₄, J = 7,20 Hz), 2,40 (t, 2H, H_4', J = 7,20 Hz), 3,60 (m, 8H, C_7,7',9,9'), 3,99 (s, 2H, H₁₅), 4,07 (s, 2H, H₁₃), 4,08 (d, 1 H, H_13', J_13'–13" = 8,70 Hz), 4,48 (d, 1H, H_13", J_13"–13" = 8,70 Hz), 5,40 (s, 1H, H₁₂), 5,50 (s, 1H, H_12'), 6,80 (t, 1H, H₁₆, J = 5,10 Hz), 8,50 und 8,55 (t, 2H, H_6,6', J_{6–7
oder 6'–7'} = 5,72 Hz), 8,89 und 9,07 (t, 2H, H_10,10', J_{10–9 oder
10'–9'} = 6,16 Hz).¹³C-NMR: 15,60 (C_1,1'), 24,25 (C_2,2'), 27,58 (C_3,3'), 31,15 (C_8,8'), 37,54 (C_4,4'), 38,02 (C_7,7',9,9'), 65,29 (C₁₅), 74,00 (C₁₃), 75,5 (C_13'), 76,18 (C_13"), 93,70 und 94,90 (C₁₂ oder C_12'), 171,45 (C_5,5'), 175,29 (C_11,11'). ES-MS: [M+H]⁺ berechnet 823,2; gefunden 822,7.
Die Verbindung 4 wird anschließend oxidiert, um den lipophilen Vektor (IVa) zu erhalten: 40 mg (48,6 μmol) der Verbindung 4 werden in 750 μl CH₂Cl₂ gelöst und zu 61,8 mg (145,8 μmol) Dess-Martin-Periodinan (d. h. die Verbindung 1,1,1-Triacetoxy-1,1-dihydro-1,2-benziodexol-3(1H)-on, wie sie in J. Org. Chem., 1983, 48, 4156 und in J. Am. Chem. Soc., 1991, 113, 7277 beschrieben ist), gelöst in 1,5 ml CH₂Cl₂, zugegeben. Das Gemisch wird 18 h bei Umgebungstemperatur gerührt. Das Reaktionsmedium wird anschließend mit 10 ml CH₂Cl₂, 10 ml Ethylether und 10 ml einer gesättigten NaHCO₃-Lösung verdünnt. 46,1 mg Na₂S₂O₄ werden anschließend zu der Lösung zugegeben. Nach 5 Minuten Rühren werden 5 ml Ethylether und 5 ml CH₂CL₂ zugegeben und die beiden Phasen werden getrennt. Die organische Phase wird zweimal mit 15 ml einer gesättigten NaHCO₃-Lösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Das zurückbleibende gelbe Öl wird durch Chromatografie an Siliciumdioxid gereinigt, wobei ein Gemisch aus CH₂Cl₂/AcOEt/EtOH/Et₃N (70/20/15/0,5 %) verwendet wird. So werden 23 mg (57,7 %) des lipophilen Vektors (IVa) erhalten.
Die Analyse des lipophilen Vektors (IVa), die nachstehend angegeben ist, ist wie folgt:
¹H-NMR (Pyridin-d₅): 0,87 (t, 6H, H_1,1', J = 6,30 Hz), 1,26 (m, 48H, H_2,2'), 1,83 (m, 8H, H_3,3',8,8'), 2,39 (m, 4H, H_4,4'), 3,60 (m, 8H, C_7,7',9,9'), 4,21 (m, 4H, H_13,13'), 5,60 (m, 2H, H_12,12'), 8,46 (m, 2H, H_6,6'), 9,02 (m, 2H, H_10,10'). ¹³C-NMR: 14,30 (C_1,1'), 22,95 (C_2,2'), 26,32 (C_3,3'), 29,86 (C_8,8'), 36,75 (C_4,4'), 36,75 (C_7,7',9,9'), 73,5 (C_13,13'), 93,5 (C_12,12'), 166,9 (C_5,5'), 170,7 (C_11,11'). ES-MS: [M+H]⁺ berechnet 821,2; gefunden 820,6.
Beispiel 5: Andere Synthesevorschrift des lipophilen Vektors (IIIa) (Figur 2)
Als Variante der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsvorschriften kann der erfindungsgemäße lipophile Vektor (IIIa) ausgehend von dem lipophilen Vektor (IVa) in reduzierter Form (d. h. der Verbindung 4) gemäß der folgenden Arbeitsvorschrift synthetisiert werden.
245,0 mg des Gemisches des lipophilen Vektors (IIIa) mit der Verbindung 4, welches in Beispiel 2 vor der Reinigung erhalten wurde, werden in einem Gemisch aus tert-Butanol/ H₂O/10 % TFA in Wasser (15 ml/10 ml/1 ml) gelöst. Das Gemisch wird eine Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt, anschließend mit einer gesättigten NaCl-Lösung (15 ml) verdünnt. Das Reaktionsmedium wird anschließend zweimal mit einem Gemisch aus CH₂Cl₂/tert-Butanol (20 ml/20 ml) extrahiert. Die organische Phase wird zweimal mit 15 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der so erhaltene weiße Feststoff (IIIa) wird durch Chromatografie an Siliciumdioxid unter den in Beispiel 2 mit Bezug auf den Erhalt des lipophilen Vektors der Formel (IIIa) beschriebenen Bedingungen gereinigt. Man erhält 136,2 mg der Verbindung (IIIa), d. h. eine Ausbeute von 56,2 %.
Beispiel 6: Andere Synthesevorschrift des lipophilen Vektors (IVa) (Figur 2)
Als Variante der in Beispiel 2 beschriebenen Arbeitsvorschrift ist es möglich, die Verbindung 4, d. h. den lipophilen Vektor (IVa) in reduzierter Form, ausgehend von dem lipophilen Vektor (IIIa) gemäß der folgenden Arbeitsvorschrift zu erhalten:
eine Lösung von 242,3 mg/ml Tris(hydroxymethyl)-aminomethan in Wasser wird hergestellt und anschließend mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf pH 8,5 eingestellt. Diese Lösung wird anschließend mit NaCl gesättigt und danach filtriert. 20,25 mg (55,0 μmol) des lipophilen Vektors (IIIa), gelöst in 600 μl 2-Methyl-propan-2-ol werden zu 600 μl der vorstehend hergestellten Lösung zugegeben. Das Reaktionsmedium wird bei Umgebungstemperatur 4 Stunden lang gerührt, mit 2 ml Wasser verdünnt und das Produkt wird mit 2 ml einer Lösung von CH₂Cl₂/2-Methyl-propan-2-ol (1/1) extrahiert. Die organische Phase wird zweimal mit 1 ml einer gesättigten KH₂PO₄-Lösung gewaschen, danach über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. 20,14 mg (54,7 μmol) des lipophilen Vektors (IIIa), gelöst in 2 ml 2-Methyl-propan-2-ol werden zu dem vorstehend erhaltenen festen Rückstand zugegeben. Nach 13 h Rühren bei 30°C wird das Reaktionsmedium mit 4 ml CH₂Cl₂ verdünnt. Die organische Phase wird mit 2 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, über Na₂SO4 getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der feste Rückstand wird an einer Siliciumdioxidsäule gereinigt, wobei als Elutionsmittel das Gemisch CH₂Cl₂/AcOEt/EtOH (70/22/12) verwendet wird, um 23,1 mg der Verbindung 4, d. h. eine Ausbeute von 51 zu erhalten. Letztere wird anschließend oxidiert, wie es im Beispiel 2 beschrieben ist, um den lipophilen Vektor (IVa) zu erhalten.
Beispiel 7: Synthese des lipophilen Vektors (IVb) (Figur 3)
sAls Variante der Synthesevorschrift des lipophilen Vektors (IVa) ist es möglich, die Verbindung 6, d. h. den lipophilen Vektor (IVb) in reduzierter Form, aus den lipophilen Vektoren (IIIa) und (IIIb) gemäß der folgenden Arbeitsvorschrift zu erhalten: eine Lösung von 242,3 mg/ml (2 mol/l) Tris(hydroxymethyl)-aminomethan in Wasser wird hergestellt, anschließend mit konzentrierter Chlorwasserstoffsäure auf pH 8,5 eingestellt. Diese Lösung wird anschließend mit NaCl gesättigt und danach filtriert. 99,9 mg (270 mmol) des lipophilen Vektors (IIIa), gelöst in 3 ml 2-Methyl-propan-2-ol werden zu 3 ml der vorstehend hergestellten Lösung zugegeben. Das Reaktionsmedium wird bei Umgebungstemperatur 6 Stunden lang gerührt, mit 5 ml Wasser verdünnt und das Produkt wird mit 5 ml einer Lösung aus CH₂Cl₂/2-Methyl-propan-2-ol (1/1) extrahiert. Die organische Phase wird zweimal mit 2 ml einer gesättigten KH₂PO₄-Lösung gewaschen, danach über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter verringertem Druck konzentriert, wobei das palmitoylierte Oxazolidin 5 in Form eines festen Rückstandes erhalten wird.
99,2 mg (270 mmol) des lipophilen Vektors (IIIb), gelöst in 10 ml 2-Methyl-propan-2-ol werden anschließend zu dem Zwischenprodukt 5 zugegeben, das vorstehend erhalten wurde. Nach 20 Stunden Rühren bei 30°C wird das Reaktionsmedium mit 20 ml CH₂Cl₂ verdünnt. Die organische Phase wird mit 10 ml einer gesättigten NaCl-Lösung gewaschen, über Na₂SO₄ getrocknet, filtriert und unter vermindertem Druck konzentriert. Der feste Rückstand wird an Silicagel gereinigt, wobei das Gemisch CH₂Cl₂/AcOEt/EtOH (70/22/12) verwendet wird, um 133 mg der Verbindung 6, d. h. eine Ausbeute von 53 zu erhalten.
Charakterisierung des Oxazolidins 5:¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃): δ (ppm): 0,75 (t, 3 H, J_1–2 = 6,7 Hz, H1), 1,25 (m, 24 H, H2), 1,80 (m, 4H, H3 und H8), 2,33 (t, 2H, J_3–4= 7,49 Hz, H4), 3,53 (m, 4 H, H7 und H9), 4,04 (s, 2H, H13), 4,20 (s, 4H, H15 und H15'), 4,23 (s, 1H, H17), 5,41 (s, 1 H, H12), 8,39 (t, 1 H, J_6–7 = 5,7 Hz, H6), 8,99 (t, 1 H, J_10–9 = 5,9 Hz, H10); ¹³C(300 MHz, CDCl₃): δ (ppm): 14,8 (C1), 26,8 (C3), 30,9 (C8), 23,4, 30,3 und 37,6 (C2), 37,2 (C4,7,9), 63,9 und 70,8 (C15 und C15'), 64,4 (C13), 68,8 (C14), 90,9 (C12), 171,4 (C5), 174,1 (C11); MALDI-TOF-MS: [M+H+] berechnet 471,7; gefunden 471,2.
Charakterisierung des Bisoxazolidins 6: ¹H-NMR: δ (ppm) 0,84 (m, 6 H, H1 und H1'); 1,23 (m, 42 H, H2 und H2'); 1,78 (m, 8 H, H3, H3', H8 und H8'); 2,05 (m, 4 H, H17 und H17'); 2,34 (m, 4 H, H4 und H4'); 3,50 (m, 8 H, H7, H7', H9 und H9'); 3,95 (s, 2 H, H15); 4,03 (s, 2 H, H13); 4,05 (d, 1H, H13', J_13'–13" = 8,9 Hz); 4,45 (d, 1 H, H_13",J_13"–13'= 8,8 Hz); 5,36 (m, 2 H, H18 und H18'); 5,37 und 5,45 (s, 2H, H12 und H12'); 8,35 und 8,45 (t, 2H, J_6–7 = 5,7 und J_6–7' = 5,9 Hz H6 und H6'); 8,78 und 9,0 (t, 2 H, J_10–9 = 6,1 und J_10'–9' = 6,0 Hz, H10 und H10');¹³C-NMR: δ (ppm) 14,4 (C1 und C1'); 23,1, 29,8 und 32,3 (C2 und C2'); 29,8 (C3 und C3'); 26,4 (C8 und C8'); 27,6 (C17 und C17'); 36,8 (C4 und C4'); 36,4 und 36,7 (C7, C7', C9 und C9'); 64,1 (C15 und C15'); 72,6 (C13); 74,3 und 75,0 (C13' und C13"); 92,6 und 93,8 (C12 und C12'); 130,3 (C18 und C18'); 166,9, 170,3, 173,8 und 174,1 (C5, C5', C10, C10'). MALDI-TOF-MS: [M+H+]: berechnet 849,3; gefunden 848,6.
Letzteres wird anschließend oxidiert, wie in Beispiel 2 beschrieben ist, um den lipophilen Vektor (IVb) zu erhalten: MALDI-TOF-MS: [M+H⁺] berechnet 847,2; gefunden 846,6.
Beispiel 8 Kupplungen in Lösung zwischen einem oder mehreren Peptiden und einem lipophilen Vektor von nicht-peptidartiger Beschaffenheit, der eine Aldehydfunktion aufweist
1) Kupplung des Gemisches der Peptide SIV1–7 und TT mit dem lipophilen Vektor (IIIa) (Figur 4).
Das Gemisch der Hydrazinopeptide SIV1–7 und TT, die gemäß Beispiel 1 hergestellt wurden, wird ausgehend von ungefähr 2 mg von jedem Lyophilisat hergestellt. Es wird eine Lösung des lipophilen Vektors (IIIa), der gemäß Beispiel 2 oder Beispiel 3 hergestellt wurde, in einer Menge von 1,1 Äquivalenten, bezogen auf die gesamten Hydrazinoessigsäurefunktionen, welche die Peptide aufweisen, (unter Berücksichtigung der Gegenionen und des Peptidgehalts von jedem Lyophilisat) in tert-Butanol hergestellt. Die Kupplungsreaktion (chemische Ligation) findet in einem Gemisch aus tert-Butanol/ Wasser (95/5, bezogen auf das Volumen) statt, wobei die Endkonzentration an Peptid in der Größenordnung von 1,3 mmol/l liegt. Zunächst wird entionisiertes Wasser zu dem Gemisch der Hydrazinopeptide zugegeben, um sie zu befeuchten, und die Lösung des lipophilen Vektors (IIIa) in dem tert-Butanol wird anschließend zugegeben.
Die Ligationsreaktion führt zum Erhalt eines Gemisches von Lipopeptiden 7, wobei der Begriff "Sequenz" (4) die Peptidsequenz der Peptide SIV1–7 oder TT bezeichnet. Auf diese Reaktion folgt eine RP-HPLC wie folgt. 20 μl des Reaktionsmediums werden entnommen, zu denen 80 μl eines Gemisches aus Essigsäure/Wasser (20/80) zugege ben werden. 50 μl dieses Volumens werden in eine analytische C3-Säule (Zorbax, 4,6 mm Durchmesser, 300 mm Länge) injiziert mit einem Gradienten von Lösungsmittel B (so wie in Beispiel 1 mit Bezug auf die Reinigung der Peptide SIV1–7 und TT beschrieben) von 0 bis 100 % in 30 Minuten (1 ml/min, 215 nm, 50°C). Diese Methode ermöglicht es, die Umwandlung der Hydrazinopeptide in ligierte Peptide an dem gleichen Chromatogramm zu verfolgen, wobei die Hydrazinopeptide und die chemisch an den lipophilen Vektor gebundenen Peptide ("ligierte" Peptide) nicht die gleichen Elutionszeiten aufweisen. Das Verhältnis der Summe der Integrationen der Peaks der Hydrazinopeptide und der ligierten Peptide ermöglicht es, die Umwandlungsrate der Reaktion abzuschätzen.
Nach ungefähr 20 Stunden Kupplungsreaktion werden die Fraktionen des Reaktionsmediums lyophilisiert und dann wird eine LC-MS-Analyse der Lipopeptide in dem Gemisch durchgeführt. Zu diesem Zweck wird das Hewlett-Packard HPLC-System durch eine Kapillare mit einem Micromass Quatro-Massenspektrometer verbunden. Die Bedingungen der HPLC sind die gleichen wie die für die Verfolgung der Kupplungsreaktion eingesetzten, wobei der eingesetzte Durchfluss jedoch 0,2 ml/min an einer C3-Säule (Zorbax, 2,1 mm Durchmesser, 200 mm Länge) beträgt. Das Gemisch der Hydrazinopeptide allein (wässrige Lösung mit 1 mg/ml) wird in einer Menge von 20 μl mit einem Gradienten von 0 bis 100 % Lösungsmittel B während 30 Minuten injiziert. Die Reihenfolge des Austritts der Hydrazinopeptide, ihre Retentionszeit (rt, in Minuten) und ihre beobachteten Molekulargewichte sind wie folgt: TT (17,1; 2222); SIV5 (17,5 ; 3452) SIV2 (18,3; 2968); SIV1 (19,4; 3258); SIV6 (20,9; 3501,5); SIV7 (21,0; 4804); SIV4 (21,2; 3186); SIV3 (21,6; 3112).
Die Kupplungsreaktion wird nach ungefähr 20 Stunden angehalten und das lyophilisierte Reaktionsmedium wird in Wasser in einer Menge von 1 mg/ml wieder in Lösung gebracht. Diese Lösung wird unter den gleichen Bedingungen wie vorstehend für das Gemisch der Peptide beschrieben injiziert, mit der Ausnahme, dass ein höher auflösender Gradient im Bereich von 0 bis 50 % Lösungsmittel B während 10 Minuten, anschließend von 50 bis 100 % während 30 Minuten, gefolgt von einigen Minuten bei 100 % verwendet wird. In diesem Stadium ist es noch immer möglich, in der HPLC und in der LC-MS die Anwesenheit der Hydrazinopeptide SIV1–7 und TT nachzuweisen. Sie sind jedoch zum Teil durch das Hintergrundrauschen und die Verunreinigungen, die sich im Lauf des ersten Teils des Gradienten an Lösungsmittel B ansammeln, maskiert. Fünf größere Peaks werden in der HPLC beobachtet, und parallel dazu sechs TIC-Peaks (Total Ion Count, Gesamtionenzählung) in der LC-MS. Diese Peaks entsprechen den Hydrazinopeptiden SIV1–7 und TT, die an den lipophilen Vektor (IIIa) gekuppelt sind, von denen einige gemeinsam eluieren. Es ist jedoch möglich, ihre Reihenfolge des Austritts und ihre beobachteten Massen zu bestimmen, wie in der Tabelle II angegeben ist.
Tabelle II
2) Kupplung des Peptids Mu-IFNγ mit zwei lipophilen Vektoren (IIIa) (Figur 5).
708,2 μg (1,92 μmol) des lipophilen Vektors (IIIa), der gemäß Beispiel 2 oder Beispiel 3 hergestellt wurde, gelöst in 640 μl tert-Butanol, werden zu 5,04 mg (d. h. ungefähr 1 μmol) des Peptids Mu-IFNγ zugegeben, das gemäß Beispiel 1 hergestellt und vorher in 35 μl Wasser in Suspension gebracht wurde. Nach 5 h Rühren bei Umgebungstemperatur wird das Reaktionsmedium eingefroren und lyophilisiert. Die Analyse des resultierenden Lipopeptids 8 durch ES-MS ist wie folgt: [M+H⁺] berechnet 5547,7, gefunden 5547,5.
3) Kupplung der Peptide Mu-IFNγ a und Mu-IFNγ b mit dem lipophilen Vektor (IIIa).
1,067 mg des lipophilen Vektors (IIIa), gelöst in 1,88 ml tert-Butanol, werden zu 10 mg des Peptids (d. h. entweder des Peptids Mu-IFNγ a oder des Peptids Mu-IFNγ b) in 105 μl Wasser zugegeben. Nach 4 h bei Umgebungstemperatur wird die Lösung mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt und lyophilisiert. Man erhält 9,2 mg Lipopeptid, ausgehend von Mu-IFNγ a (Lipopeptid mit der Bezeichnung "L-Mu-IFNγ a") und 9,3 mg Lipopeptid, ausgehend von Mu-IFNγ b (Lipopeptid mit der Bezeichnung "L-Mu-IFNγ b"). Ihre Analyse durch ES-MS ist wie folgt: L-Mu-IFNγ a: [M+H]⁺ berechnet 3008,7; gefunden 3007,5. L-Mu-IFNγ b: [M+H]⁺ berechnet 3008,7; gefunden 3007,0.
4) Kupplung der Peptide Mu-IFNγ c, Mu-IFNγ d, Mu-IFNγ a und Mu-IFNγ b mit dem lipophilen Vektor (IIIc)
5,8 mg des lipophilen Vektors (IIIc) werden in 6,302 ml 2-Methyl-propan-2-ol gelöst.
Zu 5 mg (1,32 μmol) Peptid (d. h. entweder Peptid Mu-IFNγ a oder Peptid Mu-IFNγ b), gelöst in 50 μl Wasser, werden 965 μl (1,58 μmol) der vorstehend hergestellten Lösung, die den lipophilen Vektor (IIIc) enthält, zugegeben. Nach 5 Stunden Reaktion bei Umgebungstemperatur wird die Lösung durch das gleiche Volumen Wasser verdünnt und lyophilisiert. Man erhält 6,3 mg Lipopeptid, ausgehend von Mu-IFNγ a (Lipopeptid bezeichnet als Cho-Mu-IFNγ a) und 6,4 mg Lipopeptid, ausgehend von Mu-IFNγ b (Lipopeptid bezeichnet als Cho-Mu-IFNγ b). Ihre Analyse durch MALDI-TOF-MS ist wie folgt:

Cho-Mu-IFNγ a: m/z(M+H)⁺ berechnet 3184,0: gefunden 3183,2.
Cho-Mu-IFNγ b: m/z(M+H)⁺ berechnet 3184,0; gefunden 3184,3.

Auf die gleiche Weise werden zu 8 mg (1,30 μmol) Peptid (d. h. entweder Peptid Mu-IFNγ c oder Peptid Mu-IFNγ d), gelöst in 50 μl Wasser, 952 μl der Lösung, die den lipophilen Vektor (IIIc) enthält, zugegeben. Nach 5 h Reaktion bei Umgebungstemperatur wird die Lösung mit dem gleichen Volumen Wasser verdünnt und lyophilisiert. Man erhält 8,6 mg Lipopeptid, ausgehend von Mu-IFNγ c [Lipopeptid bezeichnet als Cho-Mu-IFNγ c oder 9 7)] und 8,4 mg Lipopeptid, ausgehend von Mu-IFNγ d (Lipopeptid bezeichnet als Cho-Mu-IFNγ d). Ihre Analyse durch MALDI-TOF-MS ist wie folgt:

Cho-Mu-IFNγ c: m/z(M+H)⁺ berechnet 5298,4; gefunden 5298,0.
Cho-Mu-IFNγ d: m/z(M+H)⁺ berechnet 5298,4; gefunden 5299,7.

5) Kupplung des Peptids G18R mit dem lipophilen Vektor (IIIb).
15 mg (6,75 μmol) Peptid werden mit 254 μl Wasser getränkt, anschließend werden 3,73 mg des lipophilen Vektors (IIIa) in Lösung in 4,82 ml tert-Butanol zugegeben. Nach 48 h bei Umgebungstemperatur wird die Lösung lyophilisiert. Man erhält 17 mg des Lipopeptids 6 dessen Analyse durch TOF-PDMS wie folgt ist : [M+H]⁺ berechnet 2259,8, gefunden 2259,4.
6) Kupplung des Peptids OVA mit dem lipophilen Vektor (IVa) (Figur 6).
1 mg (0,40 μmol) des Peptids OVA, hergestellt gemäß Beispiel 1, wird in 75 μl eines 25 mM Phosphat/Citrat-Puffers mit pH 6,2 gelöst. Dieser Puffer wird mit Hilfe von 160,5 μl einer 0,2 M Na₂HPO₄-Lösung und 89,5 μl 0,1 M Citronensäure erhalten, wobei das Gemisch mit Wasser auf 1 ml aufgefüllt wird. 663 μg (0,81 μmol) des lipophilen Vektors (IVa), der gemäß Beispiel 2 oder gemäß Beispiel 6 hergestellt wurde, werden in 75 μl tert-Butanol gelöst. Die zwei Lösungen werden anschließend vermischt und während 5 h auf 50°C erwärmt. Das Fortschreiten der Reaktion wird durch HPLC an einer C3-Zorbax-Säule unter Verwendung eines linearen Gradienten von 0 bis 100 % Lösungsmittel B, bestehend aus einem Gemisch aus 80 % Acetonitril/20 % TEAP, 25 mM, pH 7,1 während 30 Minuten, danach 10 Minuten bei 100 % Lösungsmittel B (Durchfluss von 1 ml/min, Nachweis bei 215 nm) verfolgt. Nach 5 h wird das Lipopeptid 10 durch Zugabe von 500 μl Wasser gefällt, zentrifugiert und in 500 μl Isopropanol aufgenommen. Das rohe Lipopeptid wurde durch ES-MS analysiert: [M+H]⁺ berechnet 2818,4; gefunden 2818,6.
7) Kupplung des Glycomimetikums [(Chi)₄AKHdz] mit dem lipophilen Vektor (IIIa).
9,4 mg (6,4 mmol) der Verbindung (Chi)₄AKHdz werden in 244 ml Wasser gelöst und anschließend zu 2,44 mg des lipophilen Vektors (IIIa) in Lösung in 5,07 ml 2-Methylpropan-2-ol zugegeben. Das Reaktionsmedium wird 5 Stunden lang bei 30°C gerührt und anschließend mit Wasser verdünnt, eingefroren und lyophilisiert, um das Derivat ChiAK-Pam in Form eines weißen Rückstands quantitativ zu ergeben.
MALDI-TOF: m/z (M+Na)⁺ berechnet 1742,0; gefunden 1742,9; (M+K)⁺ berechnet 1758,1; gefunden 1757,9 (Chi)₄AK-Pam.
8) Kupplung des Gemisches der Peptide SIV1–7, TT und (Chi)₄AKHdz mit dem lipophilen Vektor (IIIa).
Die befolgte Arbeitsvorschrift entspricht derjenigen, die in Beispiel 8, 1) beschrieben ist.
52,5 mg eines Gemisches aus gleichen Massen von jedem der Peptide SIV1–7 (entsprechend einem Durchschnittswert von 12,1 mmol von jedem der Peptide, unter Berücksichtigung der Gegenionen und des Peptidgehalts von jedem Lyophilisat) werden in 0,464 ml Wasser gelöst. Parallel dazu werden 12,94 mg (8,72 mmol) der Verbindung (Chi)₄AKHdz in 0,335 ml Wasser gelöst. Zu den beiden Lösungen, die vorher vereinigt wurden, werden 9,63 mg (24,9 mmol, 1,2 Äquivalente) des lipophilen Vektors (IIIa) in Lösung in 15,198 ml 2-Methyl-propan-2-ol zugegeben. Die Endkonzentration von jedem der Peptide beträgt folglich ungefähr 1,3 mmol · I^–1 in einem Gemisch aus 2-Methylpropan-2-ol/H₂O (95/5). Das Reaktionsmedium wird sofort klar. Letzteres wird unter Stickstoff bei 30°C gerührt. Die Verfolgung des Fortschreitens der Reaktion durch RP-HPLC [durchgeführt wie unter 1) beschrieben] zeigt uns, dass die Ligationen nach nur 5 Minuten nahezu vollständig sind. Nach 5 h wird das Reaktionsmedium mit Wasser verdünnt, eingefroren und anschließend lyophilisiert. Eine mikropräparative RP-HPLC wird an einer Probe des rohen Reaktionsprodukts durchgeführt, um die Identifizierung von jedem der Lipopeptide durch Massenspektrometrieanalyse zu ermöglichen.
a: in Form eines Natrium-Adduktes
9) Kupplung zwischen den Verbindungen H₂N-KVGFFKR-NH₂ und H₂N-VKYAL-NH₂ und dem lipophilen Vektor (IIIa).
1,73 mg (4,5 mmol) und 0,68 mg (1,8 mmol) des lipophilen Vektors (IIIa) werden in 3,60 bzw. 1,41 ml 2-Methyl-propan-2-ol gelöst, danach zu 5,8 mg (4,3 mmol) der Verbindung H₂N-KVGFFKR-NH₂, gelöst in 190 ml H₂O, bzw. zu 1,4 mg (1,7 mmol) der Verbindung H₂N-VKYAL-NH₂, gelöst in 77 ml H₂O, zugegeben. Die Reaktionsmedien werden 5 Stunden lang bei 30°C gerührt, danach mit Wasser verdünnt, eingefroren und lyophilisiert, um die Verbindungen 11 bzw. 12 zu ergeben.
4,5 mg (66 mg) der Verbindung 13 werden nach einer semipräparativen RP-HPLC-Reinigung an einem Shimadzu LC-4A-System unter Verwendung einer C3-Zorbax-Säule mit einem Durchfluss von 3 ml · min^–1 bei 60°C und einem Nachweis bei 215 nm: Lösungsmittelsystem A: 0,05 % TFA in entionisiertem Wasser; Lösungsmittelsystem B: 0,05 % TFA in 60 % Isopropanol in entionisiertem Wasser (Gradient: von 20 bis 40 Puffer B in 10 Minuten, danach isokratisch 10 Minuten, danach von 40 % bis 100 % in 10 Minuten und isokratisch während 20 Minuten), gefolgt von einer Lyophilisierung er halten. MALDI-TOF-MS: m/z [M+H]⁺ berechnet 1245,7; gefunden 1245,8; [M+Na]+ berechnet 1267,7; gefunden 1267,8.
Charakterisierung der Verbindung 11: MALDI-TOF-MS: m/z [M+H]⁺ berechnet 957,3; gefunden 957,8; [M+Na]⁺ berechnet 979,3; gefunden 979,7.
Beispiel 9 Analyse und Quantifizierung der Expression von Molekülen der Klasse II des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf der Oberfläche von Zellen, induziert durch Inkubation dieser Zellen mit den erfindungsgemäßen Lipopeptiden
1) Verwendete Lipopeptide
Die erfindungsgemäßen Lipopeptide, welche in diesen Versuchen verwendet werden, sind die Lipopeptide L-Mu-IFNγ a und L-Mu-IFNγ b, deren Synthese in Abschnitt 3 des vorstehenden Beispiels 5 beschrieben ist. Wie in Abschnitt 3 des vorstehenden Beispiels 1 angegeben ist, entspricht das Peptid Mu-IFNγ a 20 angrenzenden Aminosäuren des C-terminalen Endes von Interferon-γ (IFN-γ) der Maus. Das Peptid Mu-IFNγ b ist eine "Scramble"-Sequenz der in dem Peptid Mu-IFNγ a vorhandenen Sequenz, d. h. eine Sequenz, in welcher die Aminosäuren (ihre Reihenfolge in der Sequenz) vermischt worden sind.
Das Lipopeptid L-mIFNγ 95–132 ist in dem Artikel von K. THIAM et al., erschienen in J. Med. Chem., 1999, 42, 3732–3736 beschrieben. Es ist das Ergebnis der Kupplung eines Palmitoylrests, der sich an einem Lysin befindet, am N-terminalen Ende der Sequenz 95–132, entsprechend 38 angrenzenden Aminosäuren des C-terminalen Endes von Interferon-γ der Maus. Die Kupplung des lipophilen Teils an der Peptidsequenz ist in dem vorstehend genannten Artikel von K. THIAM et al. beschrieben: sie ist das Ergebnis der Einführung der Verbindung Fmoc-Lys(Palmitoyl)-OH in fester Phase. Das so erhaltene Lipopeptid wird anschließend von Schutzgruppen befreit und von dem festen Träger abgetrennt.
Das Lipopeptid SL-mIFNγ 95–132 ist ebenfalls in dem vorstehend genannten Artikel von K. THIAM et al. beschrieben: es handelt sich um eine "Scramble"-Version des Lipopeptids L-mIFNγ 95–132.
Das Lipopeptid L-mIFNγ 113–132 ist ebenfalls in dem vorstehend genannten Artikel von K. THIAM et al. beschrieben: dieses Lipopeptid umfasst die gleiche Peptidsequenz wie das erfindungsgemäße Lipopeptid L-Mu-IFNγ a, aber der Palmitoylrest ist nicht auf die gleiche Weise wie bei dem Lipopeptid L-Mu-IFNγ a eingeführt und die Bindung zwischen der Peptidsequenz und dem lipophilen Teil ist nicht die gleiche in den beiden Lipopeptiden (Amidbindung zwischen Palmitinsäure und der Aminfunktion der Seitenkette eines Lysins im Fall von L-mIFNγ 113–132, wobei das Lipopeptid in fester Phase synthetisiert wurde, während es sich im Fall von L-Mu-IFNγ a um eine Hydrazonbindung und eine Kupplung in Lösung handelt).
2) Arbeitsvorschrift zur Quantifizierung der Expression von Molekülen der Klasse II des Haugthistokompatibilitätskomplexes (MHC) auf der Oberfläche von Zellen
Die Zellen COLO 205 (menschliche Zelllinie, die von einem Kolonkarzinom herrührt) stammen aus der Zellbank ATCC (American Type Culture Collection). Sie werden in RPMI 1640-Medium (Gibco BRL, Courbevoie, Frankreich) mit 10 % fötalem Kälberserum (FKS) und 5 mM Natriumpyruvat kultiviert und bei 37°C in Gegenwart von 5 % CO₂ inkubiert. Die Zellen werden 24 Stunden lang mit verschiedenen Konzentrationen (35, 42 oder 50 μM) von Lipopeptiden stimuliert. Die Zellen werden anschließend 1 Stunde lang mit 10 μl Maus-Antikörpern anti-HLA-DR der Klasse II in 10 % FKS/PBS markiert, anschließend dreimal mit FKS/PBS gewaschen, wobei entweder ein an FITC gekuppelter Antikörper (Klon TAL, 1B5, Cymbus Biotechnology Ltd., Hants, Großbritannien) (die Ergebnisse sind in Tabelle III a angegeben) oder der Antikörper L243 herangezogen wird, der durch einen zweiten Antikörper sichtbar gemacht wird, der an ALEXA 488 gekuppelt ist (Molecular Probe, Niederlande) (die Ergebnisse sind in Tabelle III b angegeben).
Die Oberflächenexpression der Moleküle der Klasse II des MHC wird durch Durchflusszytometrie an einem Coulter EPICS II-Zytometer mit 10000 Zählereignissen pro Probe analysiert. Die Intensität der beobachteten Fluoreszenz ist direkt proportional zur Menge der Moleküle der Klasse II des MHC, die auf der Oberfläche der Zellen vorhanden sind. Der Mittelwert der beobachteten Fluoreszenz für die nicht-behandelten Zellen und für die behandelten Zellen (Spalte "Mittelwert" in der Tabelle III) ermöglicht es, ein Verhältnis zwischen dem Mittelwert der Fluoreszenz der behandelten Zellen und dem Mittelwert der Fluoreszenz der nicht-behandelten Zellen zu berechnen (Spalte "Verhältnis" in der Tabelle III). Die Kontrolle besteht darin, die Zellen in Abwesenheit von Lipopeptiden zu inkubieren.
3) Ergebnisse.
Die bei zwei unabhängigen Versuchsreihen erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen III a und III b angegeben.
Tabelle III a
Tabelle III b
In der Tabelle III a zeigt ein Vergleich zwischen den Ergebnissen, die für L-Mu-IFNγ a und für L-mIFNγ 113–132 (Lipopeptide der gleichen Größe, umfassend die gleiche Peptidsequenz, aber durch die Beschaffenheit der Bindung zwischen dem lipophilen Teil und der Peptidsequenz voneinander verschieden) bei 42 μM und bei 50 μM erhalten werden, dass die Expression der Moleküle der Klasse II des MHC auf der Oberfläche der Zellen größer ist, wenn die Zellen mit dem erfindungsgemäßen Lipopeptid inkubiert worden sind.
In der Tabelle 111 b zeigt ein Vergleich zwischen den Ergebnissen, die mit dem Produkt L-Mu-IFNγ a, das ebenfalls in Tabelle III a beschrieben ist, und den Derivaten Cho-Mu-IFNγ a–d, die einen von Cholesterol abgeleiteten lipophilen Teil umfassen, erhalten werden, dass die Expression der Moleküle der Klasse II auf der Oberfläche von Zellen noch stärker ist, wenn die Zellen mit den Cholesterolderivaten inkubiert worden sind, als wenn sie mit Palmitinsäurederivaten inkubiert worden sind.
Der Durchgang der erfindungsgemäßen Lipopeptide durch die Membran ist folglich wirksamer, im Hinblick auf die Beschaffenheit der Bindung zwischen dem lipophilen Teil und der Peptidsequenz (Hydrazonbindung bzw. Hydrazonbindeglied).
Diese Ergebnisse zeigen, dass die erfindungsgemäßen Lipopeptide im Stande sind, durch die Membran von Zellen hindurch zu gehen, und zwar auf wirksamere Weise als die Lipopeptide des Standes der Technik. Die erfindungsgemäßen Lipopeptide sind folglich für die Einschleusung bzw. Vektorisierung von Wirkstoffen in die Zellen geeignet.

Claims

Verfahren zur Kupplung in Lösung zwischen wenigstens einer Peptidverbindung und wenigstens einem lipophilen Vektor, der eine Aldehydfunktion aufweist, wobei die Kupplung einen Schritt der Ausbildung einer Hydrazonbindung bzw. eines Hydrazonbindegliedes zwischen der Peptidverbindung und dem lipophilen Vektor umfasst, dadurch gekennzeichnet, dass der lipophile Vektor von nicht-peptidartiger Beschaffenheit ist und durch die allgemeine Formel (I) wiedergegeben wird: [R¹)(R²)_i]D – CHO (I)in welcher: – i 0 oder 1 bedeutet, – wenn i 0 ist, D eine Bindung bedeutet, – wenn i 1 ist, D einen gesättigten, ungesättigten oder aromatischen, mono- oder polycyclischen Heterocyclus bedeutet, und – R¹ und R², welche gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Gruppe der Formel L-f-E-f bedeuten, wobei L einen Lipidrest bedeutet, E einen Spacerarm bzw. Abstandshalter bedeutet, und f und f Funktionen bedeuten, die L mit E bzw. E mit D verbinden.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es die folgenden Schritte umfasst: a) Herstellung wenigstens einer Peptidverbindung, von der alle Schutzgruppen entfernt sind und die entweder an ihrem N-terminalen Ende oder am Ende der Seitenkette eines gegebenenfalls an einem beliebigen Ort der Peptidsequenz vorhandenen Lysins oder Ornithins 1 bis 4 von Hydrazin abgeleitete Gruppen der Formel -CO-CHR'-NR-NH₂ aufweist, wobei R und R' unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine gesättigte oder ungesättigte, lineare, verzweigte oder cyclische Alkylgruppe bedeuten, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome sowie gegebenenfalls 1 bis 3 Heteroatome, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, umfasst, und durch 1 bis 6 Gruppen, ausgewählt aus Hydroxy-, Alkoxy-, Aryloxy-, Amino-, Aminoalkyl-, Aminoaryl-, Thio-, Thioalkyl-, Carbonyl-, Carboxyl-, Guanidino- und Carboxamidogruppen, substituiert sein kann; b) Reaktion in Lösung der im Schritt a) erhaltenen Peptidverbindung(en) mit wenigstens einem lipophilen Vektor von nicht-peptidartiger Beschaffenheit der Formel (I), wie sie in Anspruch 1 definiert ist, welcher eine Aldehydfunktion aufweist.
Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass die im Schritt b) bewirkte Reaktion in einem Gemisch aus Wasser und wenigstens einem mit Wasser mischbaren lipophilen Lösungsmittel durchgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass das mit Wasser mischbare lipophile Lösungsmittel tert-Butanol ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass die von Hydrazin abgeleiteten Gruppen α-Hydrazinoessigsäuregruppen sind.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidverbindung ausgewählt wird aus der Gruppe bestehend aus den Peptiden und den Peptidderivaten.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptidderivate ausgewählt sind aus den Glycopeptiden, den Pseudopeptiden und den dendrimeren Glykomimetika mit peptidartiger Beschaffenheit.
Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass die dendrimeren Glykomimetika mit peptidartiger Beschaffenheit durch die nachstehende allgemeine Formel (II) wiedergegeben werden: (B²M)_m(XN)_nA (II)in welcher: – B² durch eine oder mehrere nachstehende allgemeine Formeln (a) oder (b) wiedergegeben wird:
wobei R₁, R₂, R₃ und R₄ unabhängig voneinander ein Wasserstoffatom oder eine Schutzgruppe bedeuten und wobei W eine Bindung oder eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffkette umfasst, die 1 bis 18 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls 1 bis 12 Atome, ausgewählt aus Sauerstoff, Schwefel und Stickstoff, umfasst, wobei die Kohlenstoffkette gegebenenfalls durch 1 bis 16 Halogenatome substituiert ist, – X den Rest eines Oligopeptids X' bedeutet, umfassend 1 bis 6 Aminosäuren, – A den Rest einer Verbindung A' bedeutet, welche mindestens trifunktionell ist, – m eine ganze Zahl zwischen 1 und 32 ist, – n eine ganze Zahl zwischen 0 und 32 ist, und – M und N jeweils eine Bindungsgruppe zwischen B² und A, wenn n = 0, oder B² und X, wenn n von 0 verschieden ist, bzw. zwischen X und A, wenn n von 0 verschieden ist, bedeuten und unabhängig voneinander eine Funktion umfassen, die ausgewählt wird aus den Funktionen Oxim, Hydrazon, Amid, Ester, Thioester, Hydrazid, Hydroxamat, Ether, Thioether, Amin, Carbonat, Carbamat, Thiocarbonat, Thiocarbamat, Harnstoff, Thioharnstoff und Thiazolidin.
Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung A' eine Verkettung von gleichen oder verschiedenen Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Lysin, Hydroxylysin, Serin, Threonin, Cystein, Ornithin, Asparaginsäure und Glutaminsäure, umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8 oder Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel (II) so ist, dass m eine ganze Zahl zwischen 4 und 16 ist, n eine ganze Zahl zwischen 2 und 8 ist, X den Rest eines Oligopeptids bedeutet, das 2 bis 4 Aminosäurereste umfasst, während A den Rest einer Verkettung bedeutet, die 2 bis 8 Lysinreste umfasst und in Form eines Dendrimers vorliegt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 8 bis 10, dadurch gekennzeichnet, dass die Verbindung der allgemeinen Formel (II) so ist, dass 8² einen Rest von einer oder mehreren Verbindungen, ausgewählt aus (–)-Shikimisäure und (–)-Chinasäure, bedeutet.
Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es mehrere verschiedene Peptidverbindungen und/oder mehrere verschiedene lipophile Vektoren einsetzt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass es in dem Schritt b) wenigstens einen lipophilen Vektor, der eine Aldehydfunktion auf weist, wenigstens eine Peptidverbindung, ausgewählt aus den Peptiden, den Glycopeptiden und den Pseudopeptiden, sowie wenigstens ein dendrimeres Glykomimetikum der allgemeinen Formel (II), wie sie in einem der Ansprüche 8 bis 11 definiert ist, einsetzt.
Lipophiler Vektor, der in dem Verfahren nach einem der vorangehenden Ansprüche verwendet werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass er durch die allgemeine Formel (I) wiedergegeben wird: [R¹)(R²)_i]D – CHO (I)wie sie in Anspruch 1 definiert ist.
Lipophiler Vektor nach Anspruch 14, dadurch gekennzeichnet, dass i 1 ist und dass D den Heterocyclus 1-Aza-3,7-dioxabicyclo[3.3.0]-octan bedeutet.
Lipophiler Vektor nach Anspruch 14 oder Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, dass L ein Sterol, ein Sterolderivat oder eine gesättigte oder ungesättigte, lineare oder verzweigte Kohlenstoffkette, die zwischen 4 und 30 Kohlenstoffatome umfasst, bedeutet.
Lipophiler Vektor nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass das Sterolderivat ein Derivat von Cholesterol ist und dass die Kohlenstoffkette durch die Formel CH₃-(CH₂)₁₄- oder CH₃-(CH₂)₇-CH=CH-(CH₂)₇- wiedergegeben wird.
Lipophiler Vektor nach einem der Ansprüche 14 bis 17, dadurch gekennzeichnet, dass E eine lineare, verzweigte oder cyclische, gesättigte oder ungesättigte Kohlenstoffkette bedeutet, die 1 bis 18 Kohlenstoffatome und gegebenenfalls 1 bis 16 Heteroatome und/oder 1 bis 7 Gruppen, ausgewählt aus den Carbonylgruppen, den Heterocyclen, den Heteroarylen, den Carbocyclen und den Arylen, umfasst.
Lipophiler Vektor nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass E durch 1 bis 8 Hydroxyl- oder Aminogruppen und/oder 1 bis 16 Halogenatome substituiert ist.
Lipophiler Vektor nach einem der Ansprüche 14 bis 19, dadurch gekennzeichnet, dass feine -CO-NH- oder -CO-O- -Bindung bedeutet und feine -NH-CO- oder -O-CO- -Bindung bedeutet.
Lipophiler Vektor nach einem der Ansprüche 14 bis 20, dadurch gekennzeichnet, dass er durch die Formel (III) oder die Formel (IV) wiedergegeben wird:
in welchen L wie in einem der Ansprüche 1, 16 oder 17 definiert ist.
Lipophiler Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass L eine Kohlenstoffkette der Formel CH₃-(CH₂)₁₄- in den Formeln (III) und (IV) bedeutet.
Lipophiler Vektor nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, dass L eine Kohlenstoffkette der Formel CH₃-(CH₂)₁₄-CH=CH-(CH₂)₇- in der Formel (III) bedeutet.
Lipopeptid, das durch das Verfahren zur Kupplung, wie es in einem der Ansprüche 1 bis 13 definiert ist, erhalten werden kann, dadurch gekennzeichnet, dass es im Wesentlichen aus wenigstens einer Peptidverbindung besteht, die über eine Hydrazonbindung bzw. ein Hydrazonbindeglied an wenigstens einen lipophilen Vektor mit nicht-peptidartiger Beschaffenheit der Formel (I), wie er in einem der Ansprüche 14 bis 23 definiert ist, gebunden ist.
Gemisch aus mehreren verschiedenen Lipopeptiden, wie sie in Anspruch 24 definiert sind.
Verwendung eines Lipopeptids nach Anspruch 24 zur gezielten Ansteuerung von Zellen.
Verwendung des Verfahrens nach einem der Ansprüche 1 bis 13 zur Herstellung eines Medikaments, welches wenigstens einen Wirkstoff mit peptidartiger Beschaffenheit, der durch wenigstens eine lipophile Verbindung vektorisiert ist, umfasst, das zur gezielten Ansteuerung von Zellen brauchbar ist.