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DE69635452T2 - Hohe expressionsrate des grün-fluoreszierenden proteins - Google Patents

Hohe expressionsrate des grün-fluoreszierenden proteins Download PDF

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DE69635452T2
DE69635452T2 DE69635452T DE69635452T DE69635452T2 DE 69635452 T2 DE69635452 T2 DE 69635452T2 DE 69635452 T DE69635452 T DE 69635452T DE 69635452 T DE69635452 T DE 69635452T DE 69635452 T2 DE69635452 T2 DE 69635452T2
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DE
Germany
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codons
preferred
gene
preferred codons
less preferred
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DE69635452T
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Brian Seed
Jürgen Haas
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General Hospital Corp
Original Assignee
General Hospital Corp
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Publication date
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Description

  • Gebiet der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Gen, das für das grün-fluoreszierende Protein der Qualle Aequorea Victoria codiert, und Verfahren zum Exprimieren desselben in hohen Leveln in eukaryotischen Zellen.
  • Hintergrund der Erfindung
  • Eine Expression von eukaryotischen Genprodukten in Prokaryonten ist manchmal durch das Vorliegen von Codons, die selten in E. coli verwendet werden, beschränkt. Eine Expression solcher Gene kann durch systemische Substitution der endogenen Codons durch Codons, die in hoch exprimierten prokaryotischen Genen überrepräsentiert sind (Robinson et al., 1984), verstärkt werden. Es wird allgemein angenommen, dass seltene Gene ein Stoppen des Ribosoms verursachen, was zu einem Versagen bei der Vervollständigung der nascenten Polypeptidkette und der Nicht-Kopplung von Transkription und Translation führt. Das mRNA-3'-Ende des verzögerten Ribosoms wird cellulären Ribonucleasen ausgesetzt, die die Stabilität des Transkripts verringern.
  • Zusammenfassung der Erfindung
  • Die Erfindung betrifft ein Gen, das für das grün-fluoreszierende Protein der Qualle Aequorea Victoria codiert, worin wenigstens 50% der nicht bevorzugten und weniger bevorzugten Codons im natürlichen Gen durch ein bevorzugtes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert, ersetzt wurde/wurden, wobei die bevorzugten Codons aus der Gruppe bestehend aus gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac und gtg ausgewählt sind, die weniger bevorzugten Codons aus der Gruppe bestehend aus ggg, att, ctc, tcc und gtc ausgewählt sind, wobei die nicht bevorzugten Codon alle anderen Codons als die bevorzugten Codons und die weniger bevorzugten Codons sind, wobei das Gen im Vergleich zu dem natürlichen Gen in einem in vitro-Säugerzellkultursystem unter identischen Bedingungen eine verstärkte Expression des grün-fluoreszierenden Proteins in einer Säugerwirtszelle erlaubt.
  • Bevorzugte Codons sind: Ala (gcc); Arg (cgc); Asn (aac); Asp (gac); Cys (tgc); Gln (cag); Gly (ggc); His (cac); Ile (atc); Leu (ctg); Lys (aag); Pro (ccc); Phe (ttc); Ser (agc); Thr (acc); Tyr (tac); und Val (gtg). Weniger bevorzugte Codons sind: Gly (ggg); Ile (att); Leu (ctc); Ser (tcc); Val (gtc). Alle Codons, die nicht mit der Beschreibung der bevorzugten Codons oder weniger bevorzugten Codons übereinstimmen, sind nicht-bevorzugte Codons. Im Allgemeinen wird der Präferenzgrad eines besonderen Codons durch die Prävalenz des Codons in hoch exprimierten humanen Genen angegeben, wie es in Tabelle 1 unter der Überschrift "Hoch" angeführt ist. Beispielsweise stellt "atc" 77% der Ile-Codons in hoch exprimierten Säugergenen dar und ist das bevorzugte Ile-Codon; "att" stellt 18% der Ile-Codons in hoch exprimierten Säugergenen dar und ist das weniger bevorzugter Ile-Codon. Die Sequenz "ata" stellt nur 5% der Ile-Codons in hoch exprimierten humanen Genen dar und ist ein nicht-bevorzugtes Codons. Ersetzen eines Codons durch ein anderes Codon, das in hoch exprimierten humanen Genen stärker verbreitet ist, wird im Allgemeinen die Expression des Gens in Säugerzellen verstärkten. Dementsprechend umfasst die Erfindung Ersetzen einer weniger bevorzugten Codons durch ein bevorzugtes Codon wie auch Ersetzen eines nicht-bevorzugten Codons durch ein bevorzugtes oder weniger bevorzugtes Codon.
  • Die Erfindung bezieht sich außerdem auf ein Verfahren zur Herstellung eines solchen Gens, umfassend:
    • (a) Identifizieren nicht-bevorzugter und weniger bevorzugter Codons in dem natürlichen Gen, das für das grün-fluoreszierende Protein der Qualle Aequorea Victoria codiert, und
    • (b) Ersetzen von wenigstens 50% der nicht-bevorzugten und weniger bevorzugten Codons durch ein bevorzugtes Codon, das für dieselbe Aminosäure wie das ersetzte Codon codiert, wobei die bevorzugten Codons aus der Gruppe, bestehend aus gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac und gtg ausgewählt sind, die weniger bevorzugten Codons aus der Gruppe, bestehend aus ggg, att, ctc, tcc und gtc, ausgewählt sind, die nicht-bevorzugten Codons alle anderen Codons als die bevorzugten und die weniger bevorzugten Codons sind.
  • Mit "Protein, das normalerweise in einer Säugerzelle exprimiert wird" ist ein Protein gemeint, das unter natürlichen Bedingungen in einem Säuger exprimiert wird. Der Ausdruck umfasst Gene im Säugergenom, z.B. Faktor VIII, Faktor IX, Interleukine und andere Proteine. Der Ausdruck umfasst auch Gene, die in einer Säugerzelle unter Krankheitsbedingungen exprimiert werden, z.B. Onkogene, wie auch Gene, die durch ein Virus codiert werden (einschließlich eines Retrovirus), die in Säugerzellen nach Infektion exprimiert werden. Mit "Protein, das normalerweise in einer eukaryotischen Zelle exprimiert wird", ist ein Protein gemeint, das unter natürlichen Bedingungen in einem Eukaryonten exprimiert wird. Der Ausdruck umfasst auch Gene, die unter Krankheitsbedingungen in einer Säugerzelle exprimiert werden.
  • In bevorzugten Ausführungsformen ist das Gen fähig, das Säugerprotein oder das eukaryotische Protein in einer Konzentration zu exprimieren, die wenigstens 110%, 150%, 200%, 500%, 1.000%, 5.000% oder 10.000% derjenigen ist, die durch das natürliche Gen in einem in vitro-Säugerzellkultursystem unter identischen Bedingungen exprimiert wird (d.h. derselbe Zelltyp, dieselben Kulturbedingungen, derselbe Expressionsvektor).
  • Geeignete Zellkultursysteme zur Messung der Expression des Gens und des entsprechenden natürlichen Gens werden unten beschrieben. Andere geeignete Expressionssysteme, die Säugerzellen verwenden, sind dem Fachmann gut bekannt und werden z.B. in den unten genannten Referenzstandardwerken der Molekularbiologie beschrieben. Vektoren, die zum Exprimieren der synthetischen und natürlichen Gene geeignet sind, werden unten und in den unten beschriebenen Standardreferenzbüchern beschrieben. Mit "Expression" ist Proteinexpression gemeint. Expression kann unter Verwendung eines für das interessierende Protein spezifischen Antikörpers gemessen werden. Solche Antikörper und solche Messtechniken sind dem Fachmann gut bekannt. Mit "natürliches Gen" ist die Gensequenz (einschließlich natürlich auftretender Allelvarianten) gemeint, die natürlicherweise für das Protein codiert.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen sind wenigstens 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% oder 90% der Codons im natürlichen Gen nicht-bevorzugte Codons.
  • Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Herstellung eines Gens bereit, das für ein Protein codiert, welches normalerweise durch eine Säugerzelle oder eine andere eukaryotische Zelle exprimiert wird. Das Verfahren umfasst Identifizieren nicht-bevorzugter und weniger bevorzugter Codons im natürlichen Gen, das für das Protein codiert, und Ersetzen eines oder mehrerer der nicht-bevorzugten und weniger bevorzugten Codons mit einem bevorzugten Codons, das für dieselbe Aminosäure wie das ersetzte Codon codiert.
  • Unter bestimmten Umständen (z.B. um die Einführung einer Restriktionsstelle zu ermöglichen) kann es wünschenswert sein, ein nicht-bevorzugtes Codon durch ein weniger bevorzugtes Codon anstatt durch ein bevorzugtes Codon zu ersetzen.
  • Es ist nicht erforderlich, alle weniger bevorzugten oder nicht bevorzugten Codons durch bevorzugte Codons zu ersetzen. Eine verstärkte Expression kann selbst durch einen teilweisen Ersatz erreicht werden. Unter bestimmten Umständen kann es wünschenswert sein, nicht-bevorzugte Codons nur teilweise durch bevorzugte oder weniger bevorzugte Codons zu ersetzen, um einen Zwischenlevel der Expression zu erreichen.
  • In anderen bevorzugten Ausführungsformen stellt die Erfindung Vektoren (einschließlich Expressionsvektoren) bereit, die ein oder mehrere der synthetische Gene umfassen.
  • Mit "Vektor" ist ein DNA-Molekül gemeint, das z.B. von einem Plasmid, Bakteriophagen oder Säuger- oder Insekten-Virus abgeleitet ist, in das DNA-Fragmente insertiert oder kloniert sein können. Ein Vektor wird eine oder mehrere einmal vorkommende Restriktionsstellen enthalten und kann zur autonomen Replikation in einem definierten Wirts- oder Vehikelorganismus fähig sein, so dass die klonierte Sequenz reproduzierbar ist. Demnach ist mit "Expressionsvektor" ein beliebiges autonomes Element gemeint, das fähig ist, die Synthese eines Proteins zu steuern. Solche DNA-Expressionsvektoren umfassen Säugerplasmide und Viren.
  • Die Erfindung stellt auch Genfragmente bereit, die für einen gewünschten Teils des Proteins codieren. Solche synthetischen Genfragmente sind den synthetischen Genen der Erfindung ähnlich, außer dass sie nur für einen Teil des Proteins codieren. Solche Genfragmente codieren vorzugsweise wenigstens 50, 100, 150 oder 500 benachbarte Aminosäuren des Proteins.
  • Beim Konstruieren der Gene der Erfindung kann es wünschenswert sein, CpG-Sequenzen zu vermeiden, da diese Sequenzen ein Gen zur stummen bzw. Gen-"Silencing" verursachen können.
  • Die Gene der Erfindung können in die Zellen eines lebenden Organismus eingeführt werden. Beispielsweise können Vektoren (virale oder nicht-virale) verwendet werden, um ein Gen zur Gentherapie in Zellen eines lebenden Organismus einzuführen.
  • Umgekehrt kann es wünschenswert sein, bevorzugte Codons in einem natürlich auftretenden Gen durch weniger bevorzugte Codons als Mittel zur Senkung der Expression zu ersetzen.
  • Standard-Literaturwerke, die die allgemeinen Prinzipien der DNA-Rekombinationstechniken beschreiben, umfassen:
    J. D. Watson et al., Molecular Biology of the Gene, Band I und II, the Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc., Herausgeber, Menlo Park, CA (1987); J. E. Darnell et al., Molecular Cell Biology, Scientific American Books, Inc., Herausgeber, New York, N. Y. (1986); R. W. Old et al., Principles of Gene Manipulation: An Introduction to Genetic Engineering, 2. Ausgabe, University of California Press, Herausgeber, Berkeley, CA (1981); T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratorv Manual, 2. Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory, Herausgeber, Cold Spring Harbor, NY (1989); und Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Wiley Press, New York, NY (1992).
  • Detaillierte Beschreibung
  • Beschreibung der Zeichnungen
  • WO 86/07595 offenbart einen im Wesentlichen reinen basischen fibroplasten Wachstumsfaktor (bFGF), ein Polypeptid mit 146 Aminosäureresten. Die Aminosäurerestsequenz von bFGF wird offenbart ebenso wie eine DNA-Kette, die für das Polypeptid codiert. Durch geeignetes Insertieren einer synthetisierten DNA-Kette in einen Klonierungsvektor und unter Verwendung des Klonierungsvektors zum Transformieren von Zellen kann synthetischer bFGF aus transformierten Zelllinien, sowohl prokaryotischen als auch eukaryotischen, erhalten werden.
  • In US-Patent Nr. 5,270,171 wird beschrieben, dass ein Krebserkennungsfaktor (SCM-Faktor), der bei der Durchführung des Tests auf Strukturierung der cytoplasmatischen Matrix (SCM) einsetzbar ist, isoliert wurde, zur wesentlichen Homogenität gereinigt und charakterisiert wurde.
  • WO 95/07463 offenbart eine Zelle, die ein DNA-Molekül umfasst, das ein regulatorisches Element aus einem anderen Gen als einem Gen, das für ein grün-fluoreszierendes Protein codiert, funktionell an eine DNA-Sequenz, die für das grün-fluoreszierende Protein codiert, verknüpft enthält. Diese Erfindung stellt auch lebende Organismen bereit, die die oben beschriebene Zelle umfassen. Diese Erfindung stellt auch ein Verfahren zum Selektieren von Zellen bereit, die ein Protein von Interesse codieren, wobei das Verfahren umfasst:
    a) Einführen eines DNAI-Moleküls in die Zellen, das eine DNA-Sequenz hat, die für das Protein von Interesse codiert, und ein DNAII-Molekül, das eine DNA-Sequenz hat, die für ein grün-fluoreszierendes Protein codiert; b) Kultivieren der eingeführten Zellen unter Bedingungen, die eine Expression des grün-fluoreszierenden Proteins und des Proteins von Interesse erlauben, und c) Selektieren der kultivierten Zellen, die grün-fluoreszierendes Protein exprimieren, dadurch Selektieren von Zellen, die das Protein von Interesse exprimieren. Schließlich stellt die vorliegende Erfindung verschiedene Verwendungen von grün-fluoreszierendem Protein bereit.
  • Coulombe und Skup (Gene 46, 89–95, 1986) haben ein rekombinantes Interferon-(IFN)-Gen konstruiert, dessen codierende Region ein chemisch-synthetisiertes humanes (HU)IFN-α1-Gen ist, das für dasselbe Protein wie sein natürliches Gegenstück codiert, obgleich es wichtige Modifikationen besitzt. Diese Modifikationen wurden eingeführt um (1) die Codonverwendung zu verändern, (2) die Integrität von wiederholten und komplementären Oligodesoxynucleotiden in der codierenden Region zu zerstören, (3) ein Intron einzuführen, (4) andere Sequenzen für die IFN-spezifischen-3'- und -5'-flankierenden Sequenzen einzusetzen und (5) die Leadersequenz (die für das Signalpeptid codiert) zu entfernen. Coulombe und Skup berichten außerdem über die Transfektion und Isolierung von murinen Zellen, die Insertionen mit niedriger Kopienzahl des rekombinanten Gens enthalten. Diese Linien halten einen hohen konstanten Level an biologisch aktivem HuIFN-α im Cytoplasma aufrecht, das aus mRNAs von Mr produziert wird, das für korrekt prozessierte Transkripte erwartet wird. Diese Resultate zeigen direkt, dass die Leadersequenz für eine Sekretion von IFN-Proteinen essentiell ist. Sie sprechen sich auch gegen eine wesentliche Rolle der besonderen Merkmale der transkribierten Sequenz des natürlichen HuIFN-α1-Gens bei der Regulierung seiner Expression aus.
  • Haseloff und Amos (Trends in Genetics, Band 11, Nr. 8, 1. August 1995, S. 328–329) berichten über die Verwendung von GFP in Pflanzen.
  • In WO 96/27675 wird eine DNA-Sequenz offenbart, die für grün-fluoreszierendes Protein (GFP) codiert, wobei die Sequenz bezüglich der Wildtypsequenz so modifiziert ist, dass sie eine effizientere Expression eines funktionellen GFP-Polypeptids in einer Pflanzenzelle zulässt. Offenbart wird auch ein modifiziertes GFP-Polypeptid, das eine Aminosäuresubstitution bezüglich der Wildtypproteinsequenz umfasst, welches nützliche Charakteristika aufweist, wenn es in vielen verschiedenen Wirtszelltypen exprimiert wird.
  • WO 96/09378 liefert ein synthetisches Gen, das für ein Protein codiert, welches normalerweise in Säugerzellen exprimiert wird, worin wenigstens ein nicht-bevorzugtes oder weniger bevorzugtes Codon im natürlichen Gen, das für das Säugerprotein codiert, durch ein bevorzugtes Codon ersetzt wurde, welches für dieselbe Aminosäure codiert.
  • 1, Abbildung A ist eine Fotografie von COS-Zellen, die nur mit einem Vektor transfiziert sind und keine GFP-Fluoreszenz zeigen. 1, Abbildung B ist eine Fotografie von COS-Zellen, die mit einem CDM7-Expressionsplasmid, das für native GFP codiert, das so verändert ist, dass es eine Consensus-Translationsinitiationssequenz enthält, transfiziert sind. 1, Abbildung C ist eine Fotografie von COS-Zellen, die mit einem Expressionsplasmid transfiziert sind, das dieselben flankierenden Sequenzen und den Initiationsconsensus wie in 1, Abbildung B, hat, aber eine Codon-optimierte Gensequenz trägt. 1, Abbildung D ist eine Fotografie von COS-Zellen, die mit einem Expressionsplasmid wie in 1, Abbildung C, transfiziert sind, das aber als Rest 65 ein Thr anstelle von Ser trägt.
  • 2 zeigt eine DNA-Sequenz, die für GFP der Qualle Aequorea Victoria codiert.
  • Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
  • Polymerasekettenreaktion
  • Kurz ausgedrückt, überlappende 15- bis 25-mer-Oligonucleotide, die an beiden Enden aneinander lagern, wurden verwendet, um die langen Oligonucleotide durch Polymerasekettenreaktion (PCR) zu amplifizieren. Typische PCR-Bedingungen waren: 35 Zyklen, 55°C-Annealing-Temperatur, 0,2 s Extensionszeit. PCR-Produkte wurden gelgereinigt, mit Phenol extrahiert und in einer anschließenden PCR verwendet, um längere Fragmente zu erzeugen, die aus zwei benachbarten kleinen Fragmenten bestehen. Diese längeren Fragmente wurden in ein von CDM7-abgeleitetes Plasmid, das eine Leadersequenz des CD5-Oberflächenmoleküls, gefolgt von einem Nhel/Pst1/Mlu1/EcoR1/BamH1-Polylinker enthält, kloniert.
  • Die folgenden Lösungen wurden in diesen Reaktionen verwendet:
    10 × PCR-Puffer (500 mM KCl, 100 mM Tris-HCl, pH 7,5, 8 mM MgCl2, jeweils 2 mM dNTP). Der Endpuffer wurde mit 10% DMSO ergänzt, um die Genauigkeit der Taq-Polymerase zu erhöhen.
  • DNA-Herstellung in kleinem Maßstab
  • Transformierte Bakterien wurden in 3 ml-LB-Kulturen für mehr als 6 Stunden oder über Nacht wachsen gelassen. Etwa 1,5 ml jeder Kultur wurden in 1,5 ml-Mikrozentrifugenröhrchen gegossen, für 20 Sekunden zentrifugiert, um die Zellen zu pelletisieren, dann wurde in 200 μl Lösung I resuspendiert. Anschließend wurden 400 μl Lösung II und 300 μl Lösung III zugesetzt. Die Mikrozentrifugenröhrchen wurden verkappt, gemischt und für > 30 s zentrifugiert. Die Überstände wurden in frische Röhrchen überführt und mit Phenol extrahiert. DNA wurde durch Füllen der Röhrchen mit Isopropanol, Mischen und Zentrifugieren in einer Mikrozentrifuge für > 2 min präzipitiert. Die Pellets wurden in 70% Ethanol gespült und in 50 μl dH2O, das 10 μl RNAse A enthielt, resuspendiert. Die folgenden Medien und Lösungen wurden in diesen Verfahren verwendet: LB-Medium (1,0% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Trypton); Lösung I (10 mM EDTA, pH 8,0); Lösung II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS); Lösung III (2,5 M KOAc, 2,5 M Eisessig); Phenol (pH auf 6,0 eingestellt, überschichtet mit TE); TE (10 mM Tris-HCl, pH 7,5, 1 mM EDTA, pH 8,0).
  • DNA-Herstellung in grobem Maßstab
  • Ein-Liter-Kulturen von transformierten Bakterien wurden 24 bis 36 Stunden (MC1061p3, transformiert mit pCDM-Derivaten) oder 12 bis 16 Stunden (MC1061, transformiert mit pUC-Derivaten) bei 37°C entweder in M9-bakteriellem Medium (pCDM-Derivate) oder LB (pUC-Derivate) wachsen gelassen. Bakterien wurden in 1-Liter-Flaschen unter Verwendung einer Beckman J6-Zentrifuge mit 4200 U/min für 20 min nach unten zentrifugiert. Das Pellet wurde in 40 ml Lösung I resuspendiert. Anschließend wurden 80 ml Lösung II und 40 ml Lösung III zugesetzt und die Flaschen wurden halbkräftig geschüttelt, bis sich Klumpen mit einer Größe von 2 bis 3 mm entwickelten. Die Flasche wurde mit 4.200 U/min 5 min zentrifugiert, und der Überstand wurde durch Gaze in eine 250 ml-Flasche gegossen. Isopropanol wurde zu dem oberen Teil gegeben, und die Flasche wurde mit 4200 U/min für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde in 4,1 ml Lösung I resuspendiert und zu 4,5 g Cäsiumchlorid, 0,3 ml 10 mg/ml Ethidiumbromid und 0,1 ml 1% Triton X100-Lösung gegeben. Die Röhrchen wurden in einer Beckman J2-Hochgeschwindigkeitszentrifuge mit 10.000 U/min 5 min zentrifugiert. Der Überstand wurde in Beckman Quick Seal-Ultrazentrifugenröhrchen überführt, die dann dicht verschlossen wurden, und es wurde in einer Beckman-Ultrazentrifuge unter Verwendung eines NVT90-Festwinkelrotors mit 80.000 U/min für > 2,5 h zentrifugiert. Die Bande wurde durch sichtbares Licht unter Verwendung einer 1 ml-Spritze und einer Nadel Nr. 2 extrahiert. Es wurde ein gleiches Volumen an dH2O zu dem extrahierten Material gegeben. DNA wurde einmal mit n-Butanol, das mit 1 M Natriumchlorid gesättigt war, extrahiert, worauf Zusatz eines gleichen Volumens an 10 M Ammoniumacetat/1 mM EDTA folgte. Das Material wurde in ein 13 ml Schnappröhrchen gegossen, welches dann bis oben mit absolutem Ethanol gefüllt wurde, es wurde gemischt und in einer Beckman J2-Zentrifuge mit 10.000 U/min für 10 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gespült und in 0,5 bis 1 ml H2O resuspendiert. Die DNA-Konzentration wurde bestimmt, indem die optische Dichte bei 260 nm in einer Verdünnung von 1:200 (1 OD260 = 50 μg/ml) gemessen wurde.
  • Die folgenden Medien und Puffer wurden in diesen Verfahren eingesetzt: M9-bakterielles Medium (10 g M9-Salze, 10 g Casaminosäuren (hydrolysiert), 10 ml M9-Zusätze, 7,5 μg/ml Tetracyclin (500 μl einer 15 mg/ml-Stammlösung), 12,5 μg/ml Ampicillin (125 μl einer 10 mg/ml-Stammlösung); M9-Zusätze (10 mM CaCl2, 100 mM MgSO4, 200 μg/ml Thiamin, 70 Glycerin); LB-Medium (1,0% NaCl, 0,5% Hefeextrakt, 1,0% Trypton); Lösung I (10 mM EDTA, pH 8,0); Lösung II (0,2 M NaOH, 1,0% SDS), Lösung III (2,5 M KOAc, 2,5 M HOAc).
  • Sequenzierung
  • Gene wurden durch das Sanger-Didesoxynucleotid-Verfahren sequenziert. Kurz ausgedrückt, 20 bis 50 μg doppelsträngige Plasmid-DNA wurden in 0,5 M NaOH für 5 min denaturiert. Anschließend wurde die DNA mit 1/10 Volumen Natriumacetat (pH 5,2) und 2 Volumina Ethanol präzipitiert und 5 min zentrifugiert. Das Pellet wurde mit 70% Ethanol gewaschen und in einer Konzentration von 1 μg/ml resuspendiert. Die Annealing-Reaktion wurde mit 4 μg Matrizen-DNA und 40 ng Primer in 1 × Annealing-Puffer in einem Endvolumen von 10 μl durchgeführt. Die Reaktion wurde auf 65°C erwärmt und langsam auf 37°C abgekühlt. In ein getrenntes Röhrchen wurden 1 μl 0,1 M DTT, 2 μl Markierungsmischung, 0,75 μl dH2O, 1 μl [35S] dATP (10 μCi) und 0,25 μl SequenaseTM (12 E/μl) für jede Reaktion gegeben. 5 μl dieses Gemisches wurden zu jedem Röhrchen mit annealter Primer-Matrize gegeben, und es wurde für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Für jede Markierungsreaktion wurden 2,5 μl jedes der vier Terminationsgemische auf eine Terasaki-Platte gegeben und bei 37°C vorerwärmt. Am Ende des Inkubationszeitraums wurden 3,5 μl Markierungsreaktion zu jedem der vier Terminationsgemische gegeben. Nach 5 min wurden 4 μl Stop-Lösung zu jeder Reaktion gegeben und die Terasaki-Platte wurde für 10 min in einem Ofen bei 80°C inkubiert. Die Sequenzierungsreaktionen wurden an 5% Denaturierungspolyacrylamidgel laufen gelassen. Eine Acrylamidlösung wurde hergestellt, indem 200 ml 10 × TBE-Puffer und 957 ml dH2O zu 100 Acrylamid:Bisacrylamid (29:1) gegeben wurden. 5% Polyacrylamid-46% Harnstoff und 1 × TBE-Gel wurden hergestellt, indem 38 ml Acrylamidlösung und 28 g Harnstoff kombiniert wurden. Die Polymerisation wurde durch Zusatz von 400 μl 10% Ammoniumperoxodisulfat und 60 μl TEMED initiiert. Gele wurden unter Verwendung von silanisierten Glasplatten und Haifischzahnkämmen gegossen und in 1 × TBE-Puffer bei 60 bis 100 W für 2 bis 4 h (in Abhängigkeit von der abzulesenden Region) laufen gelassen. Die Gele wurden auf Whatman-Blottingpapier transferiert, bei 80°C für etwa 1 h getrocknet und bei Raumtemperatur auf Röntgenfilm belichtet. Die typische Belichtungszeit war 12 h. Die folgenden Lösungen wurden in diesen Verfahren verwendet: 5 × Annealing-Puffer (200 mM Tris-HCl, pH 7,5, 100 mM MgCl2, 250 mM NaCl); Markierungsgemisch (jeweils 7,5 μM dCTP, dGTP und dTTP); Terminationsgemische (jeweils 80 μM dNTP, 50 mM NaCl, 8 μM ddNTP (jeweils)); Stop-Lösung (95% Formamid, 20 mM EDTA, 0,05% Bromphenol blau, 0,05% Xylencyanol); 5 × TBE (0,9 M Tris-Borat, 20 mM EDTA); Polyacrylamidlösung (96,7 g Polyacrylamid, 3,3 g Bisacrylamid, 200 ml 1 × TBE, 957 ml dH2O.
  • RNA-Isolierung
  • Cytoplasmische RNA wurde aus Calciumphosphat-transfektierten 293T-Zellen 36 Stunden nach Transfektion und aus mit Vaccinia infizierten Hela-Zellen 16 h nach Infektion im Wesentlichen wie von Gilman beschrieben (Gilman Preparation of cytoplasmic RNA from tissue culture cells. In Current Protocols in Molecular Biology, Ausubel et al., Herausg., Wiley & Sons, New York, 1992). Kurz ausgedrückt, Zellen wurden in 400 μl Lysepuffer lysiert, die Kerne wurden herauszentrifugiert und SDS und Proteinase K wurden zu 0,2% bzw. 0,2 mg/ml zugesetzt. Die cytoplasmischen Extrakte wurden bei 37°C für 20 min inkubiert, 2 × mit Phenol/Chloroform extrahiert und präzipitiert. Die RNA wurde in 100 μl Puffer I gelöst und bei 37°C für 20 min inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 25 μl Stop-Puffer beendet und erneut präzipitiert.
  • In diesem Verfahren wurden die folgenden Lösungen verwendet:
    Lysepuffer (TRUSTEE, enthaltend 50 mM Tris, pH 8,0, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 0,5% NP40); Puffer I (TRUSTEE-Puffer mit 10 mM MgCl2, 1 mM DTT, 0,5 E/μl Placenta-RNAse-Inhibitor, 0,1 E/μl RNAse-freie DNAse I); Stop-Puffer (50 mM EDTA 1,5 M NaOAc 1,0% SDS).
  • Slot-Blot-Analyse
  • Zur Slot-Blot-Analyse wurden 10 μg cytoplasmischer RNA in 50 μl dH2O, dem 150 μl 10 × SSC/18% Formaldehyd zugesetzt worden waren, gelöst. Die solubilisierte RNA wurde dann 15 min bei 65°C inkubiert und mit einer Slot-Blot-Apparatur aufgetüpfelt. Radiomarkierte Sonden mit 1,5 kb gp120IIIb- und syngp120mn-Fragmenten wurden zur Hybridisierung verwendet. Jedes der zwei Fragmente wurde statistisch in einer 50 μl-Reaktion mit 10 μl 5 × Oligo-markierendem Puffer, 8 μl 2,5 mg/ml BSA, 4 μl α[32P]-dCTP (20 μCi/μl; 6000 Ci/mmol) und 5 E Klenow-Fragment markiert. Nach 1 bis 3 Stunden Inkubation bei 37°C wurden 100 μl TRUSTEE zugesetzt und nicht-eingebaute α[32P]-dCTP wurde unter Verwendung einer G50-Spinsäule eliminiert. Die Aktivität wurde in einem Beckman-beta-Zählgerät gemessen und gleiche spezifische Aktivitäten wurden zur Hybridisierung verwendet. Membranen wurden für 2 Stunden vorhybridisiert und hybridisierten für 12 bis 24 Stunden bei 42°C mit 0,5 × 106 cpm-Sonde pro ml Hybridisierungsflüssigkeit. Die Membran wurde zweimal mit Waschpuffer I bei Raumtemperatur (5 min), für 1 Stunde in Waschpuffer II bei 65°C gewaschen und dann auf Röntgenfilm belichtet. Ähnliche Resultate wurden unter Verwendung eines 1,1 kb Not1/Sfi1-Fragments von pCDM7, das die 3-untranslatierte Region enthielt, erhalten. Kontrollhybridisierungen wurden parallel mit einer statistisch markierten humanen beta-Actinsonde durchgeführt. Die RNA-Expression wurde quantitativ bestimmt, indem die hybridisierten Nitrocellulosemembranen mit einem Magnetic Dynamics Phosphorimager gescannt wurden.
  • In diesem Verfahren wurden die folgenden Lösungen verwendet:
    5 × Oligo-Markierungspuffer (250 mM Tris-HCl, pH 8,0, 25 mM MgCl2, 5 mM β-Mercaptoethanol, 2 mM dATP, 2 mM dGTP, mM dTTP, 1 M Hepes, pH 6,6, 1, mg/ml Hexanucleotide [dNTP]6); Hybridisierungslösung (M Natriumphosphat, 250 mM NaCl, 7% SDS, 1 mM EDTA, 5% Dextransulfat, 50% Formamid, 100 μg/ml denaturiertes Lachssperma-DNA); Waschpuffer I (2 × SCC, 0,1% SDS); Waschpuffer II (0,5 × SSC, 0,1% SDS), 20 × SSC (3 M NaCl, 0,3 M Na3-citrat, pH auf 7,0 eingestellt).
  • Zellkultur
  • Die Affennieren-Karzinomzelllinien CV1 und Cos7, die humane Nierenkarzinomzelllinie 293T und die humane Cervix-Karzinomzelllinie Hela wurden von The American Tissue Typing Collection erhalten und wurden in supplementiertem IMDM gehalten. Sie wurden auf 10 cm-Gewebekulturplatten gehalten und typischerweise alle 3 bis 4 Tage 1:5 bis 1:20 aufgespalten. In diesem Verfahren wurde das folgende Medium verwendet:
    Ergänztes IMDM (90% Iscove's modifiziertes Dulbecco-Medium, 10% Kälberserum, Eisen-ergänzt, Hitze inaktiviert 30 min, 56°C, 0,3 mg/ml L-Glutamin, 25 μg/ml Gentamycin, 0,5 mM β-Mercaptoethanol (pH eingestellt mit 5 M NaOH, 0,5 ml)).
  • Transfektion
  • Eine Calciumphosphat-Transfektion von 293T-Zellen wurde durch langsames Zugeben und unter Verwirbeln von 10 μm Plasmid-DNA in 250 μl 0,25 M CaCl2 zu demselben Volumen an 2 × HEBS-Puffer unter Verwirbeln durchgeführt. Nach Inkubation für 10 bis 30 min bei Raumtemperatur wurde das DNA-Präzipitat in eine kleine Schale mit 50 bis 70%ig konfluenten Zellen gegeben.
  • Die folgenden Lösungen wurde in diesem Verfahren verwendet:
    2 × HEBS-Puffer (280 mM NaCl, 10 mM KCl, 1,5 mL steril filtriert); 0,25 mM CaCl2 (autoklaviert).
  • Grün-fluoreszierendes Protein
  • Die Wirksamkeit des Codonersatzes legt nahe, dass ein Ersetzen nicht-bevorzugter Codons durch weniger bevorzugte Codons über bevorzugte Codons (und Ersetzen weniger bevorzugter Codons durch bevorzugte Codons) die Expression von anderen Proteinen, z.B. anderen eukaryotischen Proteinen, in Säugerzellen erhöhen wird.
  • Das grün-fluoreszierende Protein (GFP) der Qualle Aequorea Victoria (Ward, Photochem. Photobiol., 4:1, 1979; Prasher et al., Gene 111:229, 1992; Cody et al., Biochem. 32:1212, 1993) hat seit kurzem wegen seiner möglichen Verwendung als Marker oder Reporter zur Transfektion und Abstammungsstudien Aufmerksamkeit an sich gezogen (Chalfie et al., Science 263:802, 1994).
  • Die Untersuchung einer Codonverwendungstafel, die aus der nativen codierenden Sequenz von GFP konstruiert wurde, zeigte, dass die GFP-Codons entweder A oder U in der dritten Position begünstigten.
  • Die Ausrichtung in diesem Fall begünstigt A weniger als die Ausrichtung für gp120, ist aber wesentlich. Es wurde ein Gen geschaffen, indem die natürliche GFP-Sequenz wiederentwickelt wurde. Außerdem wurde die Translationsinitiationssequenz von GFP durch Sequenzen ersetzt, die dem translationalen Initiationsconsensus entsprechen. Die Expression des resultierenden Proteins stand im Gegensatz zu der der Wildtyp-Sequenz, die entsprechend gentechnisch verändert war, so dass sie einen optimierten translationalen Initiationsconsensus trug (1, Abbildung B und 1, Abbildung C). Außerdem wurde der Effekt des Einschlusses der Mutation Ser 65 → Thr, von dem berichtet wurde, dass er die Anregungseffizienz von GFP bei 490 nm verbessert und daher für die Fluoreszenzmikroskopie bevorzugt wird (Heim et al., Nature 373:663, 1995), untersucht (1, Abbildung D). Eine gentechnische Codonveränderung verlieh eine signifikante Erhöhung bei der Expressionseffizienz (begleitend war ein Prozentgehalt an Zellen offensichtlich auf Transfektion positiv) und die Kombination der Ser 65 → Thr-Mutation und der Codonoptimierung führte zu einem DNA-Segment, das für ein stark sichtbares Säugermarkerprotein codiert (1, Abbildung D).
  • Die oben beschriebene, synthetisches grün-fluoreszierendes Protein codierende Sequenz wurde aus sechs Fragmenten mit jeweils 120 by zusammengebaut, wobei eine Strategie zum Zusammenbau verwendet wurde, die auf der Fähigkeit der Restriktionsenzyme BsaI und BbsI beruhte, außerhalb ihrer Erkennungssequenz zu spalten. Es wurden lange Oligonucleotide synthetisiert, die Teile der codierenden Sequenz für GFP in flankierenden Sequenzen, die für EcoRI und BsaI codieren, an einem Ende und BamHI und BbsI am anderen Ende codieren, enthielt. Demnach hat jedes Oligonucleotid die Konfiguration EcoRI/BsaI/GFP-Fragment/BbsI/BamHI. Die Restriktionsstellen, die durch die BsaI- und BbsI-Stellen erzeugt worden waren, waren so konzipiert, dass sie zu kompatiblen Enden führten, die verwendet werden könnten, um benachbarte GFP-Fragmente zu verbinden. Jedes der kompatiblen Enden war so entwickelt, dass es einmal vorkommend und nicht-selbstkomplementär war. Die rohen synthetischen DNA-Segmente wurden durch PCR amplifiziert, zwischen EcoRI und BamHI in pUC9 insertiert und sequenziert. Anschließend wurde die intakte codierende Sequenz in der Sechs-Fragment-Ligation zusammengebaut, wobei Insertfragmente verwendet wurden, die durch BsaI und BbsI hergestellt worden waren. Zwei von sechs Plasmiden, die aus der Ligation resultierten, trugen ein Insert korrekter Größe und eines enthielt die gewünschte Volllängensequenz. Eine Mutation von Ser65 zu Thr wurde durch Mutagenese auf Standard-PCR-Basis erreicht, wobei ein Primer verwendet wurde, der eine einmal vorkommende BssSI-Stelle in synthetischem GFP überlappte.
  • Codon-Optimierung als Strategie zur verbesserten Expression in Säugerzellen
  • Die Gene der Erfindung sind auch zur Gentherapie einsetzbar.
  • GFP-Gene können in einer beliebigen Anwendung eingesetzt werden, in der natives GFP-Gen oder ein anderes Reportergen verwendet werden kann. Ein GFP-Gen, das bevorzugtere Codons als native GFP-Gen verwendet, kann die Basis eines in hohem Maße empfindlichen Reportersystems sein. Ein solches System kann z.B. verwendet werden, um den Einfluss von besonderen Promotorelementen oder trans-wirkenden Faktoren auf die Genexpression zu analysieren. Somit kann das GFP-Gen in derselben Art wie andere Reporter, z.B. β-Galactosidase, eingesetzt werden.

Claims (6)

  1. Gen, das für das grün-fluoreszierende Protein der Qualle Aequorea Victoria codiert, worin wenigstens 50% der nicht-bevorzugten und weniger bevorzugten Codons im natürlichen Gen durch ein bevorzugtes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert, ersetzt wurden, wobei die bevorzugten Codons aus der Gruppe, bestehend aus gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac und gtg, ausgewählt sind und die weniger bevorzugten Codons aus der Gruppe, bestehend aus ggg, att, ctc, tcc und gtc, ausgewählt sind, wobei die nicht-bevorzugten Codons alle anderen Codons als die bevorzugten Codons und die weniger bevorzugten Codons sind, wobei das Gen im Vergleich zu dem natürlichen Gen in einem in vitro-Säugerzellkultur-System unter identischen Bedingungen eine verstärkte Expression des grün-fluoreszierenden Proteins in einer Säugerwirtszelle erlaubt.
  2. Gen nach Anspruch 1, wobei wenigstens 90% der nicht-bevorzugten Codons und weniger bevorzugten Codons, die in dem natürlichen Gen vorhanden sind, durch bevorzugte Codons ersetzt wurden.
  3. Gen nach Anspruch 1, das die Sequenz von SEQ ID NO: 40 hat.
  4. Verfahren zur Herstellung eines Gens nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend: (a) Identifizieren nicht-bevorzugter und weniger bevorzugter Codons in dem natürlichen Gen, das für das grün-fluoreszierende Protein der Qualle Aequorea Victoria codiert, und (b) Ersetzen von wenigstens 50% der nicht-bevorzugten und weniger bevorzugten Codons durch ein bevorzugtes Codon, das für dieselbe Aminosäure wie das ersetzte Codon codiert, wobei die bevorzugten Codons aus der Gruppe, bestehend aus gcc, cgc, aac, gac, tgc, cag, ggc, cac, atc, ctg, aag, ccc, ttc, agc, acc, tac und gtg, ausgewählt sind, die weniger bevorzugten Codons aus der Gruppe, bestehend aus ggg, att, ctc, tcc und gtc, ausgewählt sind, die nicht-bevorzugten Codons aller anderen Codons als die bevorzugten und die weniger bevorzugten Codons sind.
  5. Expressionsplasmid, das das Gen nach einem der Ansprüche 1 bis 3 umfasst.
  6. Säugerzelle, die mit dem Expressionsplasmid von Anspruch 5 transfiziert ist.
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