DE69625581T2

DE69625581T2 - Cyanidfreies Reagenz und Verfahren zur Bestimmung von Hämoglobin und Leukozytendifferenzierung

Info

Publication number: DE69625581T2
Application number: DE1996625581
Authority: DE
Inventors: Mirta I. Riesgo; Carole J. Young
Original assignee: Coulter International Corp
Current assignee: Beckman Coulter Inc
Priority date: 1996-03-07
Filing date: 1996-03-07
Publication date: 2003-09-25
Anticipated expiration: 2016-03-08
Also published as: DE69625581D1; EP0794435A1; EP0794435B1

Description

TECHNISCHES GEBIET

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Reagenz und ein Verfahren, die zur Bestimmung des Gesamthämoglobins in Blut brauchbar sind, wobei das Reagenz frei von Cyanid- und Eisen-(+III)-cyanidionen ist. Zusätzlich ermöglichen das Reagenz und das Verfahren das Zählen der gesamten weißen Blutzellen und das Bestimmen von mindestens zwei Leukozytenpopulationen in einer einzigen Vollblutprobe mit Hilfe einer geeigneten elektronischen Apparatur.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Messungen von Leukozyten und Hämoglobin in Blutproben sind für die klinische Diagnose von Krankheiten, wie zum Beispiel Leukämie und Anämie, extrem wichtig. Zum Zwecke des Verständnisses und der Erläuterung der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Begriffe definiert.
1. Hämoglobin - ist in roten Blutzellen enthalten, dient als der Sauerstoffträger im Blut. Es ist ein Chromoprotein, das aus vier Hämgruppen besteht: zwei alpha und zwei beta Globinketten.
2. Hämgruppe - Die Fähigkeit, Sauerstoff zu binden hängt von dem Vorhandensein der Hämgruppe ab. Ebenfalls gibt sie Hämoglobin dessen charakteristische Farbe. Das Häm besteht aus einem organischen Teil, der als Protophorphyrin bezeichnet wird, und einem Eisenatom. Das Eisenatom im Häm bindet an die vier Stickstoffatome im Zentrum des Protophorphyrinrings. Das Eisenatom kann in der Eisen (+II) oder der Eisen (+III) Oxidationsstufe vorliegen.
3. Hämiglobin (Symbol Hi) - Hämoglobin, bei dem die Eisenatome zum Eisen(+III) Zustand oxidiert worden sind. Alternative Begriffe sind Methämoglobin und Eisen(+III)-Hämoglobin.
4. Hämiglobincyanid - Hämoglobin, worin die Eisenatome zum Eisen(+III) Zustand oxidiert und mit Cyanidionen komplexiert worden sind. Alternative Begriffe sind Cyanmethämoglobin, Cyaneisen(+III)-Hämoglobin und Methämoglobincyanid.
5. Hämoglobinarten - All diejenigen Hämoglobinderivate, die normalerweise im Blutkreislauf vorhanden sind. Diese umfassen Deoxyhämoglobin (Hb), Oxyhämoglobin (HbO&sub2;), Hämoglobin S, Hämoglobin A&sub2;, Carboxyhämoglobin (HbCO), Hämiglobin (Hi).
6. NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards) Referenzverfahren zur Bestimmung von Hämoglobins in Blut (H15-A-Band 4 Nr. 3). Ein Standardverfahren, das tfür das gesamte klinische Laborpersonal und Hersteller von Geräten, Reagenzien und Materialien zur Messung der Hämoglobinkonzentration mit Hilfe des Hämiglobincyanidverfahrens vorgesehen ist.
7. Hämoglobinmessung - Die gesamte Hämoglobinkonzentration kann durch bestimmte physikalische Eigenschaften des Bluts, wie zum Beispiel dem spezifischen Gewicht und spezifischen Lichtbrechungsvermögen, der chemischen Zusammensetzung des Hämoglobinmoleküls, der Fähigkeit des Hämoglobins sich mit Sauerstoff, Kohlenmonoxid, Schwefel usw. zu verbinden, und den spektralen Charakteristika der Hämoglobinderivate bestimmt werden.
8. Hämoglobinstabilisator - Chemische Verbindung, die zur Erhaltung von stabilen physiko-chemischen Merkmalen des Hämoglobinderivats oder des Chromogens (chemische Struktur, optische Dichte, usw.), das während der Hämoglobin-Meßdauer gebildet wird, verwendet wird.
Automatische Blutanalysatoren werden im allgemeinen zum Zählen und zum Differenzieren der Leukozyten in Blutproben verwendet. Das Zählen von Leukozyten mit einem automatischen Blutanalysator beginnt mit dem Verdünnen einer Vollblutprobe mit einem isotonischen Verdünnungsmittel und der Lyse der Erythrozyten in der Probe, indem ein Mittels zur Lyse von Erythrozyten zugegeben wird, das zu der Probe mit Leukozyten führt. Dann geht die Probe durch einen kleinen Kanal oder enge Öffnung in der Detektoreinheit des Analysators hindurch. Die Anzahl der Leukozyten wird gezählt und differenziert, indem die Signale, die als Reaktion auf den Durchgang einzelner Leukozyten erzeugt wurden, erfasst werden. Weitere Beschreibungen der isotonischen Verdünnungsmittel sind in den U.S. Patenten 3,962,125; 4,346,018 und 4,521,518 enthalten. Weitere Beschreibungen der Mittel zur Lyse von Erythrozyten sind in den U.S. Patenten 3,874,852; 4,528,274; 3,874,852; 4,346,018 und 4,485,175 enthalten.
Beispielsweise lehrt das U.S. Patent 4,346,018 ein isotonisches Vielzweck- Blutverdünnungsmittel und ein Verfahren zur Verwendung dieses Verdünnungsmittels mit einem Lysereagenzsystem für die differentielle Zweivolumenbestimmung von Leukozyten. Das U.S. Patent 4,485,175 lehrt ein Verfahren und ein Reagenzsystem zur differentiellen Dreivolumenbestimmung von Lymphozyten, mononuklearen und Granulozyten Populationen von Leukozyten, unter Verwendung quartärer Ammoniumsalze als Lysemittel und dem COULTER COUNTER® Modell S-Plus (eingetragene Marke der Coulter Corporation, Miami, Florida) automatischen Blutzähler. Das U.S. Patent 4,485,175 lehrt ebenfalls, dass zur Bildung eines geeigneten Chromogens zur Hämoglobinbestimmung ebenfalls ein Alkalimetallcyanid, wie zum Beispiel Kaliumcyanid zur Verfügung gestellt werden kann.
Die Messung der Hämoglobinkonzentration wurde mittels eines Cyanmethämoglobinverfahrens durchgeführt. Bei diesem Verfahren wird ein Mittel zur Lyse der Erythrozyten, das einen nichtionischen grenzflächenaktiven Stoff enthält, zu der Blutprobe gegeben, um deren Trübung, die durch die Zellmembranen der Erythrozyten verursacht wurde, zu verringern. Das freigesetzte Hämoglobin wird durch die Wirkung eines Oxidationsmittels, wie zum Beispiel Kalium-eisen(+III)cyanat unter Bildung von Methämoglobin oxidiert. Anschließend binden die Cyanidionen an Methämoglobin unter Bildung von Cyanmethämoglobin (HiCN), das eine stabile Hämoglobinmessprobe bildet. Die Extinktion der Cyanmethämoglobinprobe wird bei einer vorher festgelegten Wellenlänge gemessen. Dieses Verfahren ist weltweit als das Standardverfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration akzeptiert.
Obwohl die durch das Cyanmethämoglobinverfahren gebildete Verbindung, sobald sie gebildet wurde, eine extrem stabile Substanz ist, braucht die Oxidation von Hämoglobin unter Verwendung eines Oxidationsmittels etwas mehr als 10 Minuten, um die Oxidation unter Verwendung von Drabkins Reagenz zu vervollständigen. Weiterhin braucht die Lyse roter Zellen, das Eluieren des Hämoglobins und Auflösung der roten Zellen und Plättchenmembranen länger, als für die automatische Messung erforderlich ist.
Zur Erfüllung der Zeitanforderungen einer automatischen Blutanalysatorapparatur verwenden Verfahren nach dem Stand der Technik Reagenzien zur Lyse von Erythrozyten, die Cyanidionen enthalten, die ein stabiles Hämochromogen bilden und ein Absorptionsspektrum, ähnlich dem des Cyanmethämoglobins, aufweisen. Das Reagenz zur Lyse von Erythrozyten verringert ebenfalls die Zeit, die für die Zelllyse, die Hämoglobinelution und Zellmembranauflösung notwendig ist. Weiterhin muß die Abfallflüssigkeit auf eine geeignete Weise entgiftet und beseitigt werden, beispielsweise unter Verwendung von Natriumhypochlorit, was ein sehr mühsames Verfahren erforderlich macht.
Aus diesem Grund wird ebenfalls ein anderes Verfahren, bekannt als ein Oxyhämoglobinverfahren, angewandt. Bei dem Oxyhämoglobinverfahren werden Erythrozyten mit nichtionischen grenzflächenaktiven Stoffen, die zur Lyse der Erythrozyten und zum Freisetzen des Hämoglobins verwendet werden, hämolysiert. Das Hämoglobin wird freigesetzt und als Oxyhämoglobin (HbO&sub2;) gemessen. Die Extinktion des Oxyhämoglobins wird bei einer vorher festgelegten Wellenlänge gemessen. Da bei dem Oxyhämoglobinverfahren keine Cyanide verwendet werden, gibt es keine Gefahr bei der Handhabung der Reagenzien und keine Notwendigkeit, ein beschwerliches Verfahren zum Beseitigender Abfallflüssigkeit durchzuführen.
Das herkömmliche Oxyhämoglobinverfahren hat jedoch den Nachteil, dass das Lysereagenz nicht nur Erythrozyten lysiert, sondern ebenfalls die Größe der Leukozyten auf eine sehr geringe Größe verkleinert. Dies ist bei Extinktionsmessungen vorteilhaft, da es die Streuung des Lichts durch Leukozyten minimiert, andererseits wird es jedoch ziemlich schwierig, mehr als zwei Subpopulationen oder Leukozyten mit dem Lysereagenz zu messen.
Zur Vermeidung dieses Problems fertigen automatische Blutanalysatoren, die das Oxyhämoglobinverfahren verwenden, getrennte Proben für Hämoglobin und Leukozyten an, indem eine Probe durch zwei Nachweisabschnitte hindurchgeht, einen zur Hämoglobinmessung und der andere zur Leukozytenmessung. Dieses Verfahren leidet jedoch an den Nachteilen, dass eine teure und komplizierte Ausrüstung erforderlich ist, weil nicht nur zwei getrennte Nachweisabschnitte erforderlich sind, sondern ebenfalls zwei Flüssigkeitsleitungen zur Anfertigung der Proben für die Messungen erforderlich sind.
Außerdem kann mit dem Oxyhämoglobinverfahren eine Blutprobe mit einem hohen Methämoglobingehalt nicht genau gemessen werden, da Methämoglobin sich nicht ohne weiteres zu Oxyhämoglobin umwandelt. Der Methämoglobingehalt ist besonders bei der Verwendung eines Kontrollblutes wichtig. Das Kontrollblut wird zum Kontrollieren der analytischen Genauigkeit des automatischen Blutanalysators verwendet. Das Kontrollblut wird normalerweise in gekühltem Zustand gelagert und kann über eine ausgedehnte Zeitspanne eine stabile Hämoglobinkonzentration aufweisen. Jedoch wird während einer Lagerung bei einer höheren Temperatur als der Raumtemperatur das Hämoglobin im Blut allmählich zu Methämoglobin umgewandelt. Daher ist es bei einer nach dem Oxyhämoglobinverfahren durchgeführten Messung des Kontrollbluts, das wärmer als bei 22ºC gelagert worden war, unmöglich, den Hämoglobinanteil, der in Methämoglobin umgewandelt worden war, zu messen, so dass der gemessene Hämoglobinwert über mehrere Tage hinweg allmählich niedriger wird, als der Anfangswert.
Eine Herangehensweise an dieses Problem war die Verwendung eines Reagenz zur Hämoglobinmessung, das Dodecylnatriumsulfate oder gleiche Mengen an Natriumlaurylsulfat (SLS), einen anionischen grenzflächenaktiven Stoff und Triton X- 100, einen nichtionischen grenzflächenaktiven Stoff in einem neutralen Puffer (pH- Wert 7,2) umfasst. Dies wurde von Oshiro et al. in Clinical Biochemistry, Band 15, 83 (1982) gelehrt. Bei diesem Verfahren wurden Erythrozyten durch die Einwirkung von SLS und Triton x-100 hämolysiert und das eluierte Hämoglobin zu SLS-Hämoglobin umgesetzt. Folglich kann die Hämoglobinkonzentration im Blut gemessen werden, ohne dass sie durch Methämoglobin beeinflusst wird und es gibt keine Notwendigkeit, ein spezielles Verfahren zur Beseitigung der Abfallflüssigkeit zu haben, weil kein Cyanid vorhanden ist. Mit diesem Verfahren ist es jedoch nicht möglich, eine Leukozytendifferenz und eine Hämoglobinkonzentration der gleichen behandelten Blutprobe zu messen. Bei einer SLS-Konzentration, die erforderlich wäre, das eluierte Hämoglobin zu SLS-Hämoglobin umzusetzen, werden die weißen Blutzellen lysiert, was die simultane Messung mit der Hämoglobinbestimmung verhindert.
Andere Wege zur Lösung dieser Probleme werden in den U.S. Patenten 5,250,437 und 5,242,832 gelehrt. Diese Veröffentlichungen lehren, dass zum Messen der Hämoglobinkonzentration geeignete erythrocytolytische Mittel verwendet werden, um die Erythrozyten hauptsächlich durch die Wirkung von quartären Ammoniumsalzen, die das Hämoglobin in Erythrozyten eluieren, selektiv zu hämolysieren. Das elutierte Hämoglobin ist beinahe sofort denaturiert, das heißt, in seiner sterischen Struktur modifiziert, und das Hämeisen im Hämoglobin wird durch den in dem Reagenz gelösten Sauerstoff von zweiwertigem Eisen zu dreiwertigem Eisen unter Bildung von Methämoglobin oxidiert. In dem U.S. Patent 5,250,437 werden geeignete Mengen kationischer, nichtionischer und amphoterer grenzflächenaktiver Stoffe den erythrocytolytischen Mitteln zum Einstellen des Grades der Hämoglobindenaturierung zugegeben, um stabiles Hämoglobin zu ergeben. Obwohl der Mechanismus der Methämoglobinstabilisierung nicht aufgeklärt wurde, wurde angenommen, dass die Wirkung vieler grenzflächenaktiver Stoffe mit unterschiedlichen molekularen Strukturen auf Hämoglobin möglicherweise dazu führt, dass der Denaturierungsgrad fixiert wird oder zu einem vorher festgelegten Grad zu einer Veränderung der sterischen Struktur bei Methämoglobin führt. Das U.S. Patent 5,242,832 verbessert das Reagenz des U.S. Patents 5,250,437 durch die Zugabe eines Hämoglobinstabilisators. Obwohl der Wirkungsmechanismus des Hämoglobinstabilisators nicht aufgeklärt ist, wurde angenommen, dass freie Elektronenpaare der Stickstoffatome in der Molekularstruktur des Hämoglobinstabilisators oder die Sauerstoffatome der phenolischen Hydroxygruppen mit dem Hämeisen in Methämoglobin komplexieren können, was zu einer Stabilisierung des Methämoglobins führt.
Noch andere Lösungswege umfassen das U.S. Patent 4,853,338, das die Verwendung eines anionischen grenzflächenaktiven Stoffes lehrt, der einen pH-Wert von mindestens 11,3 aufweist, um das gesamte Hämoglobin zu bestimmen. Der ionische grenzflächenaktive Stoff kann als eine Base dienen oder es kann alternativ dazu in der Zusammensetzung eine von dem grenzflächenaktiven Stoff unabhängige starke Base enthalten sein, um den für die alkalische Hämatinreaktion erforderlichen pH-Wert zu liefern. Grenzflächenaktive Stoffe, die geeignet sind, den erforderlichen pH-Wert zu liefern, umfassen langkettige Trimethylammoniumhydroxide. Grenzflächenaktive Stoffe, die in Kombination mit einer unabhängigen Komponente geeignet sind, den erforderlichen pH-Wert zu liefern, umfassen zwitterionische grenzflächenaktive Stoffe und kationische quartäre Ammoniumhalogenide. Die Literaturstelle lehrt weiterhin, dass anionische grenzflächenaktive Stoffe, wie zum Beispiel die Alkalimetallsalze von Alkylsulfaten verwendet werden können. Wegen des pH-Werts des alkalischen Hämatins ist dieses Verfahren jedoch nicht wünschenswert.
Andere Lösungswege umfassen auch das U.S. Patent Nr. 4,656,139 und Nr. 4,617,275, die ein Oxyhämoglobinverfahren lehren, wobei eine Umwandlung des Hämoglobins in Methämoglobin vermieden wird. Zur Vermeidung der Umwandlung von Hämoglobin in Methämoglobin wird zusätzlich zu einer Borsäurepufferlösung (2- Pyridylthio-1-oxid)natrium als Konservierungsmittel verwendet. Zusätzlich wird EDTA-2K als Komplexbildner in dem Reagenzsystem verwendet. Das Reagenzsystem weist einen pH-Wert von 6 bis 8 auf und einen osmotischen Druck von 240 bis 310 mOsm/kg.
Noch weitere andere Lösungswege umfassen das U.S. Patent 3,874,852, das die Leukozyten- und Hämoglobinbestimmung in Blut mit einem Reagenz lehrt, das eine von Eisen(+III)cyanidionen freie wässrige Lösung umfaßt, die ein quartäres Ammoniumion und Cyanidion in Mengen enthält, die ausreichen, um Erythrocyten und Plättchenzellen zu stromatolysieren und Hämoglobin in ein Chromogen für die Bestimmung umzuwandeln.
Einen anderen Lösungsweg umfaßt das U.S. Patent 4,185,964, das auf Lysereagenzien zur Verwendung in Blutanalysatoren gerichtet ist, die schnell Leukozyten zerstören. Das Reagenz reagiert oder komplexiert mit dem Hämoglobin unter Bildung eines Chromogens mit ausreichender Stabilität, um die spektralphotometrische Bestimmung von Hämoglobin zu ermöglichen.
Einen anderen Lösungsweg umfaßt auch das U.S. Patent 4,800,167, das auf ein Reagenzsystem zur Bestimmung des Hämoglobingehalts in Vollblut gerichtet ist, das eine wässrige Lösung von Polyvinylpyrrolidon mit einem Molekulargewicht von ungefähr 10000 bis ungefähr 360000 bei einem pH-Wert, der größer ist als ungefähr 8,0 umfaßt, um das in dem Vollblut vorhandene Hämoglobin unter Bildung eines stabilen Produkts, das bei einer Wellenlänge von näherungsweise 575 Nanometern gemessen wurde, zu denaturieren.
Die WO-A-96/02841 beschreibt Verfahren und cyanidfreie Reagenzien zur Bestimmung von Hämoglobin und Leukozyten in Vollblut. Die Reagenzien umfassen wässrige Lösungen mit mindestens einem quartären Ammoniumsalz und Hydroxylaminsalze.
Trotz der vorstehend erörterten Lehren des Standes der Technik besteht ein Bedarf daran, andere Reagenzien, die zum Messen von Hämoglobin nützlich sind, mit einem oder mehreren der folgenden Merkmale zu entwickeln: es sollte ungiftig sein, es sollte ein stabiles Chromogen bei der Verwendung mit einem isotonischen Verdünnungsmittel erzeugen, das nicht nachteilig die Hämoglobinstabilität beeinflusst, und mit den anderen Blutbestimmungsparametern, wie zum Beispiel Leukozytenzahl und Leukozytendifferenzierung verträglich sein.

ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Reagenzzusammensetzung, die keine Cyanid- oder Eisen(+III)cyanidionen enthält, und ein Verfahren zum Messen der Hämoglobinkonzentration in einer Blutprobe. Die Reagenzzusammensetzung umfaßt mindestens ein Lysemittel, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem quartären Ammoniumsalz, einem Pyridiniumsalz und Kombinationen davon, in einer Menge, die wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin freizusetzen, und ein Antioxidans in einer Menge, die wirksam ist, das freigesetzte Hämoglobin in ein Hämochromogen überzuführen. Im allgemeinen wird die Reagenzzusammensetzung einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7,5 aufweisen, wenn das Lysereagenz und das Antioxidans miteinander kombiniert werden. Die Reagenzzusammensetzung wird über einen pH-Wert Bereich von 5 bis 11,5, vorzugsweise von 9 bis 11 und besonders bevorzugt von 9,5 bis 10,5 wirksam sein, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin freizusetzen. Ein Mittel zum Einstellen des pH-Werts kann zu der Reagenzzusammensetzung zugegeben werden, um einen pH-Wert in dem Bereich von 5 bis 11,5 zur Verfügung zu stellen.
Die Erfindung betrifft ebenfalls ein Verfahren zur Messung der Hämoglobinkonzentration, das die Schritte des Umsetzens einer Blutprobe mit einer Reagenzzusammensetzung, die keine Cyanid- oder Eisen(+III)cyanidionen enthält, wobei die Reagenzzusammensetzung umfasst: (i) mindestens ein Lysemittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem quartären Ammoniumsalz, einem Pydiniumsalz und Kombinationen davon, in einer Menge, die wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin freizusetzen, und (ii) ein Antioxidans in einer Menge, die wirksam ist, das freigesetzte Hämoglobin in ein Hämochromogen unter Bildung eines Reaktionsproduktes zu überführen; und des Messens der Extinktion des Reaktionsproduktes zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration in der Blutprobe umfasst. Im allgemeinen wird die Reagenzzusammensetzung einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7,5 aufweisen, wenn das Lysereagenz und das Antioxidans kombiniert werden. Die Reagenzzusammensetzung wird über einen pH-Wert-Bereich von 5 bis 11,5 vorzugsweise von 9 bis 11 wirksam sein, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin freizusetzen.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine Reagenzzusammensetzung und ein Verfahren, das die Bestimmung der Hämoglobinkonzentration und Differenzierung von Leukozyten aus derselben Blutprobe ermöglicht und ein Reaktionsprodukt der Reagenzzusammensetzung. Die Reagenzzusammensetzung ist in Anspruch 2 definiert. Im allgemeinen wird die Reagenzzusammensetzung einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7,5 aufweisen, wenn das Lysereagenz und das Antioxidans miteinander kombiniert werden. Die Reagenzzusammensetzung wird über einen pH- Wert-Bereich von 5 bis 11,5, vorzugsweise von 9 bis 11 und besonders bevorzugt von 9,5 bis 10,5 wirksam sein, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin freizusetzen. Ein Mittel zum Einstellen des pH-Werts kann zu der Reagenzzusammensetzung zugegeben werden, um einen pH-Wert in dem Bereich von 5 bis 11,5 zur Verfügung zu stellen.
Ein Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration und zur Differenzierung von mindestens zwei Leukozytensubpopulationen in einer Blutprobe ist in Anspruch 1 definiert.

KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN

Fig. 1 zeigt eine Korrelation zwischen den Messungen der Hämoglobinkonzentration in verschiedenen Proben mit normalem Vollblut unter Verwendung eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts, hergestellt von Coulter Corporation, Miami, Florida. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt LYSE S® III diff Lysereagenz (eingetragenes Warenzeichen der Coulter Corporation, Miami, Florida), das von der Coulter Corporation hergestellt wird, aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet.
Fig. 2 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Hämoglobinkonzentration in verschiedenen Proben mit abnormalem Vollblut unter Verwendung eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet.
Fig. 3 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Leukozyten (WBC) in einer Probe mit normalem Vollblut unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y- Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet.
Fig. 4 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Leukozytenzahl (WBC) in einer Probe mit abnormalem Vollblut unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y- Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet.
Fig. 5 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Lymphozytensubpopulation der Leukozyten in einer Probe mit normalem Vollblut, unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet.
Fig. 6 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der mononuklearen Subpopulation von Leukozyten in einer Probe mit normalem Vollblut, unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet.
Fig. 7 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der granulozyten Subpopulation von Leukozyten in einer Probe mit normalem Vollblut, unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet.

GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Reagenzzusammensetzung und ein Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration in Blut zur Verfügung, wobei die Reagenzzusammensetzung frei von Cyanid- oder Eisen(+III)cyanidionen ist. Vorzugsweise ermöglichen die Reagenzzusammensetzung und das Verfahren die Hämoglobinmessung und das Differenzieren von mindestens zwei Leukozytenpopulationen unter Verwendung einer Blutprobe und eines Reaktionsproduktes der Reagenzzusammensetzung.
Die Reagenzzusammensetzung umfaßt ein Reagenz zur Lyse von Erythrozyten und ein Antioxidans und ist frei von giftigen Substanzen, wie zum Beispiel Cyanidionen. Probenflüssigkeiten, mit denen solche Bestimmungen durchgeführt werden umfassen Vollblut und hergestellte Blutkalibratoren und Blutkontrollen, die zur Kalibrierung und zur Bestätigung des richtigen Funktionierens der Hämatologieanalysatoren verwendet werden. Die Kalibratoren und Kontrollen können menschlichen oder tierischen Ursprungs sein.
Das Lysereagenz enthält mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem quartären Ammoniumsalz, einem Pyridiniumsalz und Kombinationen davon. Das quartäre Ammoniumsalz hat die Formel:
wobei R&sub1; eine C&sub8; bis C&sub2;&sub0; Alkyl, Alkenyl oder Alkenylgruppe ist; R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; eine C&sub1; bis C&sub8; Alkyl, Alkenyl oder Akenylgruppe ist; und X&supmin; ist ein Salz bildendes Radikal, wie zum Beispiel Cl, Br, I, PO&sub4; und CH&sub3;SO&sub4; ist. Vorzugsweise stellt R&sub1; eine Alkylgruppe mit mindestens 12 Kohlenstoffatomen dar und R&sub2;, R&sub3; und R&sub4; stellen kurze Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen dar. Das Pyridiniumsalz hat die Formel:
wobei n eine ganze Zahl von 7 bis 19 ist und wobei X&supmin; eine anionische Gruppe ist.
Das bevorzugte Lysereagenz verwendet eine Kombination aus mindestens zwei verschiedenen quartären Ammoniumverbindungen. Insbesondere besteht das bevorzugte Lysereagenz aus einer Mischung von mindestens einer quartären Ammoniumverbindung, wobei R&sub1; eine Alkylgruppe mit 12 Kohlenstoffatomen darstellt und mindestens einem quartären Ammoniumsalz, wobei R&sub1; eine Alkylgruppe mit 14 bis 16 Kohlenstoffatomen darstellt, oder einer Mischung davon. Besonders bevorzugt umfaßt das Lysemittel Dodecyltrimethylammoniumchlorid mit Tetradecyltrimethylammoniumbromid. Andere quartäre Ammoniumsalze, die wirksame Ergebnisse ergeben, umfassen Hexadecyltrimethylammoniumbromid oder Hexadecyldimethylethylammoniumbromid in Kombination mit Dodecyltrimethylammoniumchlorid.
Die Reagenzzusammensetzung enthält das Lysereagenz in einer Menge, die wirksam ist, das Hämoglobin ausreichend aus den Erythrozyten freizusetzen. Vorzugsweise enthält die Reagenzzusammensetzung ein Lysereagenz im Bereich von 5 bis 80 Gramm pro Liter. Besonders bevorzugt beträgt der Bereich 15 bis 35 Gramm pro Liter.
Das Hämoglobin wird aus dem Erythrozyten durch das Lysemittel freigesetzt und das freigesetzte Hämoglobin wird mit dem Antioxidans umgesetzt. Das Antioxidans wird verwendet, um das freigesetzte Hämoglobin in ein Hämochromogen überzuführen. Die verwendete Antioxidansmenge liegt in einer Menge vor, die wirksam ist, das freigesetzte Hämoglobin in ein Hämochromogen überzuführen. Wird eine unzureichende Antioxidansmenge verwendet, dann ist die Hämoglobinüberführung in Hämochromogen nicht ausreichend, um genaue Hämoglobinkonzentrationswerte zu bestimmenverglichen mit der Verwendung des handelsüblichen Produkts, LYSE S III diff Lysereagenz in einem COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Gerät. Vorzugsweise liegt das Antioxidans im Bereich von 0,1 Gramm pro Liter bis 10 Gramm pro Liter, besonders bevorzugt im Bereich von 1 bis 3 Gramm/Liter vor. Diese Bereiche können variieren, weil das Verhältnis von Antioxidansmenge zu einem Blutprobenvolumen von der Menge des Verdünnungsmittels abhängig ist, das zu der Blutprobe gegeben wurde, und der Menge des Lysereagenz, das zur der Blutprobe gegeben wurde.
Das Antioxidans zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung ist ausgewählt aus Ascorbinsäure, Phosphorsäure, Natriumsulfit, Natriummetabisulfit, Natriumbisulfit, Natriumthiosulfat und anderen alkalischen Metallsalzen oder Schwefel- Sauerstoffsäuren mit reduzierenden Eigenschaften, wobei die Oxidationszahl des Schwefels einen Bereich von +2 bis +4 aufweist, einschließlich Kombinationen davon. Vorzugsweise umfaßt das Antioxidans Natriumsulfit, Natriummetabisulfit, Natriumbisulfit und Kombinationen davon. Besonders bevorzugt umfaßt das Antioxidans Natriumsulfit.
Wenn das Lysereagenz und das Antioxidans kombiniert werden, wird die Reagenzzusammensetzung im allgemeinen einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7,5 aufweisen. Der pH-Wert der Reagenzzusammensetzung kann von ungefähr 5 bis 11,5, vorzugsweise von 9 bis 11 und besonders bevorzugt von 9,5 bis 10,5 reichen. Um für die Reagenzzusammensetzung einen pH-Wert in dem pH-Wertebereich zu erhalten, sollte ein Mittel zum Einstellen des pH-Wertes zugefügt werden.
Beispiele für Mittel zum Einstellen des pH-Wertes, die geeignet sind, den erforderlichen pH-Wert einzustellen, umfassen starke Säuren, wie zum Beispiele Salzsäure und starke Basen, wie zum Beispiel Alkalimetallhydroxide. Beispiele brauchbarer Alkalimetallhydroxide umfassen Natriumhydroxid und Kaliumhydroxid. Ein weniger bevorzugtes Beispiel umfasst Tetraalkylammoniumhydroxid, wobei die Alkylgruppe 1 bis 4 Kohlenstoffatome enthalten kann, wie zum Beispiel Tetrabutylammoniumhydroxid.
Es wurde bestimmt, dass bei einem pH-Wert von unter 5 signifikante Probleme beim Erhalten genauer Hämoglobinkonzentrationswerte auftreten, im Vergleich zur Verwendung des handelsüblichen Produkts LYSE S III diff Lysereagenz. Beim einem pH-Wert von unter 9 ist die Stabilität der Reagenzzusammensetzung verringert.
Die Reagenzzusammensetzung sollte derartige weitere Merkmale aufweisen, um sie für ihre beabsichtigte Verwendung verträglich zu machen. Solche Merkmale umfassen das Vorhandensein einer Osmolalität von ungefähr 220 bis 370 Milliosmol und eine Leitfähigkeit von ungefähr 3 bis 11 Siemens.
Es wurde gefunden, dass bei der Verwendung einer wässrigen Lysereagenzlösung und eines Antioxidans, die miteinander gemischt und während mehreren Tagen bei 70ºC gelagert worden sind, die gemessene Hämoglobinkonzentration von derjenigen verschieden ist, die unter Verwendung einer frischen Mischung aus einer wässrigen Lysereagenzlösung und eines Antioxidans erhalten wurde. Die Messungen der Hämoglobinkonzentration unter Verwendung einer frischen Mischung aus einer wässrigen Lysereagenzlösung und eines Antioxidans lieferte Hämoglobinkonzentrationen, die mit denjenigen, die unter Verwendung des LYSE S III diff Lysereagenz erhalten wurden, vergleichbar sind. Besonders wenn eine Mischung des Lysemittels und des Antioxidans bei erhöhter Temperatur gelagert wurde, liegen die gemessenen Hämoglobinkonzentrationswerte signifikant unterhalb der Hämoglobinkonnzetrationen, die als Vergleich unter Verwendung des LYSE S III diff Lysereagenz erhalten wurden. Zur Lösung dieses Problems können die Reagenzien unmittelbar vor der Hämoglobinmessung gemischt werden.
Vorzugsweise wird der Reagenzzusammensetzung ein Antioxidansstabilisator zugegeben, um eine Reagenzstabilität zu liefern. Der Antioxidansstabilisator wird in einer Menge zugegeben, die wirksam ist, um für die Stabilität der Reagenszusammensetzung zu sorgen. Die Stabilität der Reagenzzusammensetzung umfasst, dass das Reagenz in der Lage ist, nach langer Lagerung genaue Hämoglobinkonzentrationsmessungen zu liefern. Besonders bei Lagerung der Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung während mindestens sechs Wochen und bei erhöhter Temperatur waren die Hämoglobinkonzentrationsmessungen mit denjenigen vergleichbar, die erhalten wurden, wenn das LYSE S III diff Lysereagenz denselben Lagerungsbedingungen unterworfen wurde.
Geeignete Antioxidansstabilisatoren sind Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)- Derivate, Zitronensäure, Weinsäure, Gluconsäure, Saccharinsäure und Kombinationen davon. Die Antioxidansstabilisatoren sind ausgewählt aus Dinatrium EDTA, Ethylenglycol-bis-(3-aminoethylether)-N,N'-tetraessigsäure (EGTA), Gluconsäure, N-(2-acetoamido)-iminodiessigsäure (ADA) und Kombinationen davon. Der am meisten bevorzugte Stabilisator ist EDTA. Die Reagenzzusammensetzungen enthalten vorzugsweise Antioxidansstabilisatoren im Bereich von 0,1 bis 10 Gramm pro Liter und besonders bevorzugt von 1 bis 5 Gramm pro Liter und am meisten bevorzugt von 2 bis 4 Gramm pro Liter.
Um die Wirksamkeit des Antioxidansstabilisators zu zeigen, wurde ein Vergleich zwischen den Reagenzzusammensetzungen durchgeführt. Reagenz 1 war das Reagenz aus Beispiel 1 ohne die Zugabe der Dinatrium-EDTA. Reagenz 2 war das Reagenz aus Beispiel 1. Die Reagenzzusammensetzungen wurden während sieben (7) Tagen bei 70ºC gelagert. Die folgende Tabelle 1 zeigt, dass die Reagenzzusammensetzung, die einen Antioxidansstabilisator enthält, Hämoglobinbestimmungen liefert, die mit dem herkömmlichen LYSE S III diff Lysereagenz vergleichbar sind. TABELLE 1 HÄMOGLOBINKONZENTRATIONEN REAGENZZUSAMMENSETZUNG
Das Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration erfordert den Nachweis des Chromogens, das sich aus der Reaktion einer Blutprobe mit der Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung ergibt. Das Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration umfaßt die Schritte des Umsetzens einer Blutprobe mit einer Reagenzzusammensetzung, die keine Cyanidionen enthält, wobei die Reagenzzusammensetzung mindestens ein Lysemittel umfasst, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem quartären Ammoniumsalz, einem Pyridiniumsalz und Kombinationen davon, in einer Menge, die wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin freizusetzen; ein Antioxidans in einer Menge, die wirksam ist, das freigesetzte Hämoglobin in ein Hämochromogen überzuführen, und eine alkalische Lösung, um einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 11,5, zur Bildung eines Reaktionsprodukts bereitzustellen; und des Messens der Extinktion des Reaktionsprodukts, um die Hämoglobinkonzentration in der Blutprobe zu bestimmen.
Das Chromogen-Reaktionsprodukt weist ein reproduzierbares Absorptionsspektrum auf, das im Bereich von 500 bis 600 Nanometern gemessen wurde.
Fig. 1 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Hämoglobinkonzentration in 36 verschiedenen Proben mit normalem Vollblut unter Verwendung eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz, aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S 4 bezeichnet ist, verwendet. Die Anzahl der untersuchten Blutproben betrug 36. Normale Blutproben sind definiert als Blutproben von Personen mit keinen bekannten Krankheiten.
Der Korrelationskoeffizient, r = 0,9940 und die Regressionsgerade, y = 1,0115x - 0,1671, weisen auf eine zulässige Korrelation und Messwertabweichung hin.
Fig. 2 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Hämoglobinkonzentration in 82 verschiedenen Proben mit abnormalem Vollblut unter Verwendung eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz, aufgetragen und auf der y- Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S 4 bezeichnet ist, verwendet. Abnormale Blutproben wurden von Personen erhalten, die eine oder mehrere Krankheiten hatten, wie zum Beispiel Anämien, Leukämien abnormale Blutzellenzahlen.
Der Korrelationskoeffizient, r = 0,9994 und die Regressionsgerade, y = 1,0249x - 0,256, weisen auf eine zulässige Korrelation und Messwertabweichung hin.

Beispiel 1

Das Reagenz mit der folgenden Zusammensetzung wurde durch Mischen der Bestandteile bei einer Temperatur, die höher als die Raumtemperatur ist, hergestellt.
Menge (Gramm/Liter)
Dodecyltrimethylammoniumchlorid 28
Tetradecyltrimethylammoniumbromid 4
Natriumsulfit 2
Dinatrium-EDTA 2,5
Pluronic 25R8 Prill 1
pH-Wert eingestellt auf 10,0
Außerdem bietet die Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung den weiteren Vorteil, dass die Bestimmung der Hämoglobinkonzentration und die Differenzierung von Leukozyten von derselben Blutprobe ermöglicht wird und ein Reaktionsprodukt der Reagenzzusammensetzung vorliegt. Es werden bevorzugt mindestens zwei Subpopulationen von Leukozyten mit der Hämoglobinmessung differenziert. Diese zwei Subpopulationen umfassen Lymphozyten und Granulozyten. Besonders bevorzugt werden mindestens drei Leukozytenpopulationen differenziert. Diese drei Populationen umfassen Lymphozyten, mononukleare Zellen und Granulozyten.
Bei der Bestimmung von sowohl der Hämoglobinkonzentration, als auch der Leukozytendifferenzierung wird weiterhin die Konzentration des Lysereagenz so eingestellt, dass sie in einer Größe vorliegt, die wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren, ohne die Leukozyten nachteilig zu beeinflussen, so dass eine Messung der Hämoglobinkonzentration und die Leukozytendifferenzierung ausgehend von demselben Reaktionsprodukt durchgeführt werden kann. Bei der Verwendung einer quartären Ammoniumverbindung liegt die wirksame Menge des Lysereagenz in dem Bereich von 5 bis 80 Gramm pro Liter. Besonders bevorzugt ist der Bereich bei 15 bis 35 Gramm pro Liter.
Das Lysereagenz lysiert die Erythrozyten, ohne nachteilig die Leukozyten zu beeinflussen. Es bleibt jedoch eine bestimmte Menge an zellulärem Abfall von den stromatolysierten Erythrozyten zusammen mit den Lykozyten in der lysierten Blutprobe übrig. Der zelluläre Abfall kann ein Hintergrundrauschen erzeugen oder es können Zellklumpen in die Differenzierung der Leukozyten schwemmen. Es kann wahlweise ein grenzflächenaktives Mittel in der Reagenzzusammensetzung in einer Menge enthalten sein, die wirksam ist, die Störungen durch Auflösen der aus Partikeln bestehenden Substanz, Proteinrückstände, zu beheben. Die Konzentration des grenzflächenaktiven Mittels reicht von 0,1 bis 2,5 Gramm pro Liter und vorzugsweise von 0,5 bis 1,5 Gramm pro Liter. Geeignete nichtionische grenzflächenaktive Mittel umfassen Pluronic F, Pluronic L, Pluronic P, Pluronic R (Pluronic grenzflächenaktive Mittel werden von der BASF Corporation, Parsippany, New Jersey hergestellt) und polyoxyethylierte Alkylphenole. Vorzugsweise ist das grenzflächenaktive Mittel Pluronic 25R8 Prill und Pluronic F127 und besonders bevorzugt ist es Pluronic 25R8 Prill.
Bei der Bestimmung von sowohl der Hämoglobinkonzentration, als auch der Leukozytendifferenzierung liegt die Konzentration des Antioxidans in einer Menge vor, die wirksam ist, das freigesetzte Hämoglobin in ein Hämochromogen zu überführen. Wird ein Übermaß an Antioxidans verwendet, sind die zurückgewonnenen Leukozytenwerte niedrig.
Vorzugsweise liegt das Antioxidans in dem Berich von 0,1 Gramm pro Liter bis 10 Gramm pro Liter, besonders bevorzugt von 1 bis 3 Gramm/Liter vor. Diese Bereiche sind veränderlich, weil das Verhältnis der Antioxidansmenge zu einem Blutprobenvolumen von der Menge des Verdünnungsmittels, das zu der Blutprobe gegeben wurde, und von der Menge des Lysereagenz, das zu der Blutprobe gegeben wurde, abhängig ist.
Wenn das Lysereagenz und das Antioxidans kombiniert werden, wird bei der Bestimmung von sowohl der Hämoglobinkonzentration, als auch der Leukozytendifferenzierung die Reagenzzusammensetzung einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7,5 aufweisen. Die Reagenzzusammensetzung kann von ungefähr 5 bis 11,5, vorzugsweise von 9 bis 11 und besonders bevorzugt von 9,5 bis 10,5 reichen. Um für die Reagenzzusammensetzung einen pH-Wert mit einem Wert in dem pH-Wertbereich zu erhalten, sollte ein Mittel zum Einstellen des pH-Werts zugegeben werden. Oberhalb eines pH-Werts von 11,5 treten bei dem Erhalten der Hämoglobinkonzentrationen, die Werten entsprechen, die unter Verwendung des handelsüblichen Produkts, LYSE S III diff Lysereagenz erhalten wurden, signifikante Probleme auf.
Bei der Bestimmung von sowohl der Hämoglobinkonzentration als auch der Leukozytendifferenzierung wird die Konzentration des Antioxidansstabilisators so angepasst, dass sie eine Größenordnung aufweist, die wirksam ist, die Reagenzzusammensetzung zu stabilisieren. Speziell wenn die Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung während mindestens sechs Wochen und bei erhöhter Lagerungstemperatur gelagert wird, waren die Leukozytendifferenzierung und die Hämoglobinkonzentrationsmessungen mit denjenigen vergleichbar, die erhalten wurden, wenn das LYSE S III diff Lysereagenz denselben Lagerungsbedingungen unterworfen wurde. Für sowohl die Hämoglobinkonzentrationsbestimmung als auch die Leukozytendifferenzierung werden dieselben Antioxidansstabilisatoren verwendet. Die Reagenzzusammensetzungen enthalten Antioxidansstabilisatoren vorzugsweise im Bereich von 0,1 bis 10 Gramm pro Liter und bevorzugter von 1 bis 5 Gramm pro Liter und besonders bevorzugt von 2 bis 4 Gramm pro Liter.
In dem Verfahren zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration und Differenzierung von mindestens zwei Subpopulationen in einer Blutprobe betrifft die Erfindung auch die Verbesserung der Extinktionsmessung des chromogenen Reaktionsprodukts, das aus der Reaktion einer Blutprobe mit einer Reagenzzusammensetzung dieser Erfindung folgt, und der Differenzierung von mindestens zwei verschiedenen Leukozytensubpopulationen aus dem Reaktionsprodukt.
Speziell umfaßt das Verfahren dieser Erfindung das Umsetzen einer Blutprobe mit einer Reagenzzusammensetzung, die keine Cyanidionen enthält, wobei die Reagenzzusammensetzung mindestens ein Lysemittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem quartären Ammoniumsalz, einem Pyridiniumsalz und Kombinationen davon, in einer Menge, die wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin freizusetzen, und ein Antioxidans in einer Menge umfasst, die wirksam ist, das freigesetzte Hämoglobin zur Bildung eines Reaktionsproduktes in ein Hämochromogen überzuführen, und das Messen der Extinktion des Reaktionsprodukts zur Bestimmung der Hämoglobinkonzentration in der Blutprobe; und das Differenzieren von mindestens zwei Subpopulationen von Leukozyten aus dem Reaktionsprodukt.
Im allgemeinen wird die Reagenzzusammensetzung im vorliegenden Verfahren einen pH-Wert von ungefähr 6 bis 7,5 aufweisen, wenn das Lysereagenz und das Antioxidans kombiniert werden. Der pH-Wert der Reagenzzusammensetzung kann von ungefähr 5 bis 11,5, vorzugsweise von 9 bis 11 und besonders bevorzugt von 9,5 bis 10,5 reichen. Um für die Reagenzzusammensetzung einen pH-Wert mit einem Wert in dem pH-Wertebereich zu erhalten, sollte ein Mittel zum Einstellen des pH-Wertes zugegeben werden.
Der Fachmann wird erkennen, dass die Differenzierung der Leukozyten durch die in dem Gebiet bekannten Verfahren ausgeführt wird. Die Lehren des U.S. Patents 3,874,852 von Hamill; 4,485,175 von Ledis et al und 4,528,274 von Carter et al. veranschaulichen diese Lehren beispielhaft.

Beispiel 2

Eine Vollblutprobe wird mit einer vorher festgelegten Konzentration eines isotonisch ausgeglichenen Verdünnungsmittel verdünnt, wobei das Verdünnungsmittel auf einen vorher festgelegten pH-Wert und Osmolalität eingestellt worden war. Das daraus entstandene verdünnte Blut wird mit der Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung derart gemischt, dass es eine volumetrische Modifikation der einzelnen Blutzellen von mindestens einer der Leukozytenpopulationen über einen Zeitraum zur Folge hat, um dadurch die Differenzierung von mindestens zwei Leukozytensubpopulationen zu ermöglichen. Zusätzlich wird die Leukozytenzahl bestimmt.
Fig. 3 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der weißen Blutzeilen (WBC) in 204 verschiedenen Proben mit normalem Vollblut unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV Diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet. Normale Blutproben werden definiert als Blutproben von Personen, die keine bekannten Krankheiten besitzen. Der Korrelationskoeffizient, r = 0,9989 und die Regressionsgerade y = 0,9899x + 0,0074 weisen auf eine zulässige Korrelation und Messwertabweichung hin.
Fig. 4 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Leukozytenzahl (WBC) in 82 verschiedenen Proben mit abnormalem Vollblut unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S4 bezeichnet ist, verwendet. Der Korrelationskoeffizient, r = 0,9996 und die Regressionsgerade y = 0,9962x - 0,0251 weisen auf eine hohe Korrelation und eine sehr kleine Messwertabweichung hin.
Ein zusätzlicher Vorteil der Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung besteht darin, dass sie als Reagenz zur Bestimmung der Leukozytenzahl in einer Blutprobe unter Verwendung herkömmlicher Bestimmungsverfahren brauchbar ist. Bei der Verwendung für die Bestimmung der Leukozytenzahl ist die Reagenzformulierung der Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung die gleiche, wie die Reagenzzusammensetzung für die Hämoglobinkonzentrationsbestimmungen und die Leukozytendifferenzierung. Dies liefert den zusätzlichen Vorteil, dass die Hämoglobinkonzentrationsbestimmung, die Leukozytendifferenzierung und die Bestimmung der Leukozytenzahl unter Verwendung derselben Reagenzzusammensetzung und aus demselben Reaktionsprodukt, das aus der Reaktion der Blutprobe und der Reagenzzusammensetzung der vorliegenden Erfindung resultiert, ermöglicht wird.
Fig. 5 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Lymphozytensubpopulation von Leukozyten in 224 verschiedenen Vollblutproben unter Verwendung des Verfahrens von Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S 4 bezeichnet ist, verwendet. Der Korrelationskoeffizient, r = 0,9885 und die Regressionsgerade y = 0,9761x - 0,729 weisen auf eine zulässige Korrelation und Messwertabweichung hin.
Fig. 6 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der mononuklearen Subpopulation von Leukozyten in 36 verschiedenen Proben mit normalem Vollblut unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S 4 bezeichnet ist, verwendet. Der Korrelationskoeffizient, r = 0,8528 und die Regressionsgerade y = 0,9147x + 1,3805 weisen auf eine zulässige Korrelation und Messwertabweichung hin.
Fig. 7 zeigt eine Korrelation zwischen der Messung der Granulozytensubpopulation von Leukozyten in 223 verschiedenen Proben mit normalem Vollblut unter Verwendung des Verfahrens aus Beispiel 2 und eines COULTER COUNTER Modell S-Plus IV diff Geräts. Auf der x-Achse wird das handelsübliche Produkt, LYSE S III diff Lysereagenz aufgetragen und auf der y-Achse wird das Reagenz aus Beispiel 1, das in der Figur als LYSE S 4 bezeichnet ist, verwendet. Der Korrelationskoeffizient, r = 0,9851 und die Regressionsgerade y = 0,976x + 2,0711 weisen auf eine zulässige Korrelation und Messwertabweichung hin.

Claims

1. Reagenzzusammensetzung, welche keine Cyanidionen enthält, zum Messen der Hämoglobinkonzentration in einer Blutprobe, umfassend:

a. ein Lysereagenz, umfassend mindestens ein Mitglied, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem quartären Ammoniumsalz, einem Pyridiniumsalz und Kombinationen davon, in einer Menge, welche wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin zu eluieren; und

b. ein Antioxidans in einer Menge, welche wirksam ist, das freigesetzte Hämoglobin in ein Hämochromogen zu überführen, wobei das Antioxidans aus der Gruppe, bestehend aus phosphoriger Säure, Natriumsulfit, Natriummetabisulfit, Natriumbisulfit, Natriumthiosulfat und anderen Alkalimetallsalzen von Sauerstoffsäuren des Schwefels mit reduzierenden Eigenschaften, wobei die Oxidationszahl des Schwefels von +2 bis +4 ist, einschließlich Kombinationen davon, ausgewählt ist, und wobei die Reagenzzusammensetzung einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 11,5 aufweist.

2. Reagenzzusammensetzung nach Anspruch 1 zum Messen der Hämoglobinkonzentration und Differenzieren von Leukozytensubpopulationen in einer Blutprobe, wobei das Lysereagenz in einer Menge vorliegt, die wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin zu eluieren und die Leukozyten bezogen auf das Volumen so zu beeinflussen, daß mindestens zwei Subpopulationen von Leukozyten bestimmt werden können.

3. Reagenzzusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Lysereagenz zwei verschiedene quartäre Ammoniumsalze umfaßt.

4. Reagenzzusammensetzung nach einem vorherigen Anspruch, welche weiter ein Mittel zum pH-Wert-Einstellen, ausgewählt aus starken Säuren und starken Basen, umfaßt, um einen pH-Wert bereitzustellen, welcher von 5 bis 11,5 reicht.

5. Reagenzzusammensetzung nach einem vorherigen Anspruch, welche weiter einen Antioxidansstabilisator in einer Menge umfaßt, welche wirksam ist, die Reagenzzusammensetzung mit Stabilität zu versehen, und wobei der Stabilisator aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Derivaten, Zitronensäure, Weinsäure, Gluconsäure, Saccharinsäure und Kombinationen davon besteht.

6. Verfahren zum Bestimmen der Hämoglobinkonzentration, umfassend die Schritte:

a. das Umsetzen einer Blutprobe mit einer Reagenzzusammensetzung, welche keine Cyanidionen enthält, wobei die Reagenzzusammensetzung umfaßt:

(1) mindestens ein Lysereagenz, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem quartären Ammoniumsalz, einem Pyridiniumsalz und Kombinationen davon, in einer Menge, die wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin zu eluieren und

(2) ein Antioxdans in einer Menge, welche wirksam ist, das freigesetzte Hämoglobin in ein Hämochromogen zu überführen, um ein Reaktionsprodukt zu bilden, wobei das Antioxidans aus der Gruppe, bestehend aus phosphoriger Säure, Natriumsulfit, Natriummetabisulfit, Natriumbisulfit, Natriumthiosulfat und anderen Alkalimetallsalzen von Sauerstoffsäuren des Schwefels mit reduzierenden Eigenschaften, wobei die Oxidationsstufe des Schwefels von +2 bis +4 ist, einschließlich Kombinationen davon, ausgewählt ist, und wobei die Reagenzzusammensetzungen einen pH-Wert im Bereich von 5 bis 11,5 aufweist, und

b. das Messen der Extinktion des Reaktionsproduktes, um die Hämoglobinkonzentration in der Blutprobe zu bestimmen.

7. Verfahren nach Anspruch 6 zum Bestimmen der Hämoglobinkonzentration und Differenzieren von Leukozytensubpopulationen in einer Blutprobe, wobei in Schritt (a) die Reagenzzusammensetzung ein Lysereagenz in einer Menge umfaßt, die wirksam ist, die Erythrozyten ausreichend zu lysieren und das Hämoglobin zu eluieren und die Leukozyten bezogen auf das Volumen zu beeinflussen, so daß mindestens zwei Leukozytensubpopulationen bestimmt werden können; und das Verfahren weiter

c. das Differenzieren von mindestens zwei Leukozytensubpopulationen, welche in dem Reaktionsprodukt enthalten sind, umfaßt.

8. Verfahren nach Anspruch 6 oder 7, wobei das Lysereagens zwei unterschiedliche quartäre Ammoniumsalze umfaßt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei die Reagenzzusammensetzung weiter ein Mittel zum pH-Wert-Einstellen, ausgewählt aus starken Säuren und starken Basen, umfaßt, um einen pH-Wert bereitzustellen, welcher von 5 bis 11,5 reicht.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 6 bis 9, wobei die Reagenzzusammensetzung weiter einen Antioxidansstabilisator in einer Menge umfaßt, die wirksam ist, die Reagenzzusammensetzung mit Stabilität zu versehen, und wobei der Stabilisator aus der Gruppe ausgewählt ist, welche aus Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)-Derivaten, Zitronensäure, Weinsäure, Gluconsäure, Saccharinsäure und Kombinationen davon besteht.

11. Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Messen der Extinktion des Reaktionsgemisches zwischen 500 und 600 nm ist.

12. Verfahren nach Anspruch 11, wobei mindestens drei Leukozytensubpopulationen, welche in dem Reaktionsprodukt enthalten sind, differenziert werden.