DE69624927T2 - Zusammensetzungen und ihre anwendungen gegen die hyperakute abstossung von transplantaten und bestimmte krankheiten - Google Patents

Description

• Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Transplantation und insbesondere die Verhinderung der hyperakuten Abstoßung von Xenotransplantnten oder zumindest der Verringerung des Ausmaßes oder der Abstoßungsgeschwindigkeit.
• Die Transplantation eines Schweineorgans (beispielsweise Herz, Niere) in einem Primaten löst eine schnelle (weniger als 10 Minuten) hyperakute Abstoßung beim Empfänger aus, die das Donorgewebe zerstört.
• Der erste Schritt bei der hyperakuten Abstoßung dürfte die Bindung von vorgeformten "xenogenen natürlichen Antikörpern" (XNA) des Empfängers an die Blutgefäße des Donorgewebes sein, die wiederum das Komplementsystem des Empfängers aktiviert. Es besteht eine starke Evidenz, daß das Hauptziel dieser Antikörper Galactose-α1,3-galactose (Galα1,3Gal) ist (Sandrin et al. Proc. Natl. Acad. Sci USA 90: 11391(1993)). Dies ist ein Kohlenhydrat, das in Schweinegewebe weit verbreitet ist, aber beim Menschen fehlt (Galili et al., Proc Natl Acad Sci USA 84: 1369-1373 (1987)). Dieses Disaccharid ist eine tenninale Modifikation der Oligosaccharidketten, die durch die Zelloberflächenglycoproteine und Glycolipide exponiert werden. Es wurden mehrere Proteine aus dem Schweineendothel identifiziert, die XNA binden und daher möglicherweise Galα1,3Gal tragen. (Platt et al., Transplantation 57: 327-335 (1994)).
• Der Hauptteil der XNAs, die gegen Schweinegewebe gerichtet sind, binden bekanntermaßen Galα1,3Gal.
• Oligosaccharide, die diese Struktur enthalten (B-Trisaccharid: Galα1,3Galβ1,4GlcNAc, B-Disaccharid: Galα1,3- Gal) sind die besten Inhibitoren der cytotoxischen Effekte von Humanserum auf Schweineendothelzellen (Neethling et al., Transplantation 57: 959-963 (1994)). Andere α-galactosylierte Zucker (nicht 1,3-gebunden) hemmen auch, aber weit weniger effizient.
• Cooper und Mitarbeiter haben untersucht wie die Infusion der α-galactosylierten Zucker Arabinogalactan und Melibiose in Gibbons die Fähigkeit von Serum aus diesen Tieren beeinflußt, Schweineendothelzellen in vitro zu töten (Ye et al., Transplantation 58: 330-337 (1994)). Es wird ein gewisses Maß an Schutz erreicht, aber nicht ausreichend, um das Leben eines heterotrophen Schweineherzxenotransplantats signifikant zu verlängern. Zusätzlich können große Mengen an Kohlenhydratinfusion die Tiere krank machen (Diurese, Atemstreß).
• Die Gruppe von Cooper et al. hat auch versucht, die Antikörper-vermittelte Lyse von Schweinezellen in vitro mit B-Disaccharid-Polyacrylamid-Konjugaten (PAA) zu hemmen, die im Handel von Syntesom GmbH, Fine Biochemicals, Heimdall Str. 4, D-81739 München, Deutschland erhältlich sind (Riebin et al., Xenotransplantation 2: 98-106 (1995)). Das Disaccharid kann an das Polyacrylamid in einer Reihe an Substitutionsdichten gebunden werden, die in ihrer Fähigkeit variieren, Schweinegewebe vor dem Angriff zu schützen. Jedoch wurden keine direkten Vergleiche der Schutzfähigkeit des PAA Konjugats und des freien Disaccharids veröffentlicht.
• Die WO 93/03735 A beschreibt verschiedene Verfahren und Zusammensetzungen, die zur Verzögerung der durch Antikörper vermittelten Xenotransplantatabstoßungen brauchbar sein sollen. In einer Ausführungsform werden die Xenoantigene an feste Träger gekuppelt und sollen zur Perfusion des Bluts eines Patienten brauchbar sein, um die Xenoantikörper zu entfernen. Beispiele für geeignete feste Träger sollen Silica, synthetische Silicate, wie poröses Glas, biogene Silicate, wie Diatomäenerde, Mineralien enthaltendes Silicat, wie Kaolinit und synthetische Polymere, wie Polystyrol, Polypropylen und Polysaccharide sein.
• Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein synthetisches Konjugat eines Proteins und einer Mehrzahl an Epitopen zur Verwendung in der Medizin bereitgestellt, worin die Epitope dazu fähig sind, von xenogenen, natürlichen Antikörpern gebunden zu werden.
• Der Ausdruck "Protein" wird hierin verwendet, um Einheiten mit Peptidbindung zu umfassen, wie Peptide (beispielsweise Polylysin), Polypeptide und vollständige Proteine. Er sollte daher nicht auf eine ungewollt beschränkende Weise aufgefaßt werden. Erforderlichenfalls können die Charakteristiken (beispielsweise die Ladungscharakteristiken) eines Proteins zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung modifiziert werden. Beispielsweise reduziert die Methoxyethoxyacetylierung der ε-Aminogruppe von Lysin in Poly-L-Lysin unspezifische Wechselwirkungen zwischen ihm und dem Geweben als Ergebnis der kationischen Ladungen des Polypeptids (A. Gasho et al., Biol. Pharm. Bull. 17: 275-282 (1994)).
• Der Ausdruck "synthetisch" wird hierin verwendet, um anzuzeigen, daß das Konjugat nicht natürlich vorkommt.
• Der Ausdruck "Konjugat" zeigt an, daß das Protein und die Epitope aneinander gebunden sind.
• Der Ausdruck "xenogener natürlicher Antikörper" wird hierin verwendet, um beides zu umfassen:
• (a) Antikörper, die bereits in einem Wirt vorhanden sind und die bei einer Abstoßung von Xenotransplantaten in diesem Wirt teilnehmen können. (Diese Antikörper dürften bei der hyperakuten Abstoßung von Xenotransplantaten beteiligt sein).
• und (b) Antikörper, die neu in einem Wirt in Reaktion auf das Vorkommen eines Xenotransplantats in diesem Wirt synthetisiert werden. (Diese werden manchmal als "xenoreaktiv hervorgerufene Antikörper" bezeichnet und dürften bei der akuten Abstoßung von Xenotransplantaten beteiligt sein).
• Es wurde nun festgestellt, daß ein erfindungsgemäßes Konjugat bei der Bindung von xenogenen, natürlichen Antikörpern hoch effektiv ist und besonders bei der Bindung von IgM effektiv ist. Diese Feststellung ist bedeutend, da IgM in den frühen Phasen der Abstoßung beteiligt ist und allgemein die wichtigste Immunglobulinklasse in diesem Prozeß sein dürfte. Die Blockierung der IgM Bindung an Epitope, die an einem Xenotransplantat exprimiert werden, ist daher ein bedeutender Vorteil bei der Prävention oder Linderung der Abstoßung.
• Da eine große Anzahl an Epitopen an ein einzelnes Proteinmolekül gebunden werden können, kann die Gesamtzahl an Molekülen, die zur Präsentation einer gegebenen Anzahl an Epitopen an das Immunsystem eines Patienten erforderlich sind, signifikant im Vergleich zur Verwendung von einzelnen Epitopen reduziert werden. Das Konjugat kann zur Vermeidung von osmotischen Störungen verwendet werden oder um weniger osmotische Störungen bei einem Patienten zu verursachen, (im Vergleich zum freien Zucker), da die Osmolarität direkt mit der Konzentration an Molekülen in Lösung zusammenhängt.
• Vorzugsweise binden die Epitope an humane xenogene natürliche Antikörper, die bei der Abstoßung (beispielsweise akuten oder hyperakuten Abstoßung) von Xenotransplantaten beteiligt sind, die von Schweinen stammen.
• Jedoch können die Epitope an humane xenogene natürliche Antikörper bilden, die bei der Abstoßung von Xenotransplantaten beteiligt sind, die von anderen Tieren stammen. Bevorzugte Epitope sind daher normalerweise nicht im erwachsenen Menschen vorhanden. Bestimmte Epitope, die verwendet werden können, werden später diskutiert.
• Die vorliegende Erfindung macht ein Verfahren zur Verhinderung der Abstoßung eines Xenotransplantats oder zumindest der Verringerung des Ausmaßes oder der Abstoßungsgeschwindigkeit durch die Verabreichung des Konjugats an einen Empfänger des Xenotransplantats verfügbar. (Dies kann vor, während und/oder nach der Implantierung des Xenotransplantats ausgeführt werden. Vorzugsweise wird es vor der Implantierung ausgeführt, beispielsweise bis zu 24 Stunden vor einer Transplantationsoperation. Boosterdosierungen können dann anschließend verabreicht werden.) Das Konjugat kann an xenogene natürliche Antikörper binden, die im Empfänger vorkommen und kann daher die Bindung dieser Antikörper an Epitope verhindern, die auf dem Xenotransplantat vorkommen. Dieser Blockierungseffekt entfernt viele freien xenogenen natürlichen Antikörper aus dem Kreislauf eines Empfängers und diese Antikörper sind daher nicht für eine Aktivierung des Komplements durch die Bindung an Epitope frei, die auf dem Xenotransplantat vorhanden sind. Die Komplementaktivierung dürfte ein Hauptfaktor bei der hyperakuten Abstoßung von Xenotransplantaten sein und der Blockierungseffekt, der unter Verwendung des erfindungsgemäßen Konjugats erreicht werden kann, hat daher eine besondere Bedeutung. Wenn dieser Blockierungseffekt auch nur von kurzer Dauer ist (beispielsweise wenn er nur für einige Tage anhält) gibt es Anzeichen in der Technik, daß er immer noch wirksam sein kann, da eine Einnistung des Xenotransplantats eintreten kann. Dies wird von Rieben et al. (siehe obige Literaturstelle) beschrieben, wo eine Analogie mit dem ABO System gezogen wird. In jedem Fall ist es möglich, einen Empfänger zu überwachen und zusätzliches Konjugat der vorliegenden Erfindung bereitzustellen, falls dies erforderlich ist.
• Konjugate der vorliegenden Erfindung können als Tolerogene fungieren, das heißt Moleküle, die die Immunogenität in Reaktion auf eine anschließende Provokation mit einem Hapten verringern können. Daher kann die Verabreichung von Konjugaten der vorliegenden Erfindung vor dem Einsetzen eines Schweinexenotransplantats die Antikörperreaktion auf das Transplantat selbst durch eine Toleranz hemmen. Wenn ein Transplantat bereits eingesetzt ist, kann das Konjugat verabreicht werden, um eine Antikörperreaktion auf das Transplantat durch Hemmung zu verhindern (das heißt durch die Verringerung der Bildung eines Anti-Hapten-Antikörpers).
• (Als Hintergrundinformation kann auf die Arbeit von Dintzis (beispielsweise R. Z. Dintzis et al., J. Immunol. 131: 2196-2203 (1983) mit multivalenten Polyacrylamidkonjugaten verwiesen werden. Dies hat gezeigt, daß Konjugate, die multiple Haptengruppen präsentieren, entweder ürununogen (das heißt sie stimulieren die Anti- Hapten-Antikörperbildung) oder hemmend sein können (verringern die Bildung von And-Hapten-Antikörpern in Gegenwart von immungenen Konjugaten). Ob das Konjugat immunogen oder hemmend ist hängt von der Konjugatgröße und der Haptendichte ab. Falls die Verabreichung eines hemmenden Konjugats vor der Provokation mit einem immunogenen Konjugat die Immunogenität des letzteren verringert, wird das hemmende Molekül Tolerogen genannt. Alle diese Effekte (Immunogenität, Hemmung und Tolerogenität) dürften durch die Kompetition an den Haptenrezeptoren auf B-Zellen wirken. Tolerogene, hemmende Moleküle werden als persistierend am B- Zellrezeptor trotz der Entfernung aus dem Umfeld betrachtet.)
• Die in der vorliegenden Erfindung verwendeten Konjugate können einem Patienten durch jede geeignete Technik verabreicht werden, werden aber vorzugsweise durch Infusion (unter Verwendung eines Tropfs) verabreicht. Die Dosierungsmengen können durch den Fachmann bestimmt werden und hängen von Faktoren ab, wie dem Gewicht des Patienten, der Größe des Xenotransplantats, der Größe des im Konjugat vorhandenen Proteins, der Anzahl der im Konjugat vorhandenen Epitope, dem Abstand der Epitope usw. Ohne sich an eine Theorie zu binden kann eine typische Dosis für das im Beispiel angeführte B-Trisaccharid-HSA 0,1 mg/ml bis 5 mg/ml Endkonzentration im Serum betragen. Dieser Bereich leitet sich von der Konzentration eines Konjugats ab, die zur vollkommenen Hemmung der Lyse von Endothelzellen in vitro durch 10 ug/ml XNA IgM erforderlich ist (siehe Fig. 3, die später beschrieben wird), die etwa 0,5 mg/ml beträgt. 10 ug/ml stellen die ungefähre Konzentration von XNA IgM dar, die im Serum erwartet wird. Dosierungsbereiche für andere Konjugate der vorliegenden Erfindung können mit einem ähnlichen Testverfahren abgeschätzt werden. Dann können Tierversuche verwendet werden, um die Dosismengen genauer abzuschätzen.
• Wie oben erwähnt, kann ein Patient überwacht werden und es können erforderlichenfalls zusätzliche Dosen des Konjugats verabreicht werden. Die Überwachung kann durch die folgende Technik ausgeführt werden: Das Serum von einem Patienten wird in vitro auf die Mengen an löslichen XNA Antikörpern getestet (primär der Klassen G und M). Das Serum wird zuerst in die einzelnen Immunglobulinklassen fraktioniert. Diese werden dann in getrennte Mikrotiterplattenvertiefungen gegeben, die mit Galα1,3Galβ1,4GlcNAc-HSA beschichtet sind. Gebundener Antikörper wird mit einem Reporterenzym detektiert, das mit anti-human IgG oder anti-human-IgM Antikörper konjugiert ist.
• Die vorliegende Erfindung kann auch zur Herstellung eines Immunabsorptionmittels verwendet werden, das außerhalb des Körpers des Patienten liegt und das wirkt, um xenogene natürliche Antikörper des Patienten zu entfernen, die bei der Abstoßung von Xenotransplantaten beteiligt sind. Wünschenswerterweise wird das Immunabsorptionsmittels immobilisiert, beispielsweise ist es in einer Säule vorhanden. So können xenogene natürliche Antikörper aus dem Blut entfernt werden oder es kann zumindest ihr Titer verringert werden. Dies ist vorteilhaft, da das eigene Blut des Transplantationspatienten mittels dieser Technik behandelt und dann in den Patienten zurückgeführt werden kann. Ein weiterer Vorteil dieser Technik ist die Bereitstellung von Blutstammlösungen von Blutdonoren, die für eine spätere Verwendung verpackt und bei der Behandlung von Transplantationspatienten verwendet werden können. Ein so behandeltes Blut liegt innerhalb des Schutzumfangs der vorliegenden Erfindung.
• Die vorliegende Erfindung liefert auch ein Gerät, worin zumindest ein Konjugat der vorliegenden Erfindung in einer Kammer vorhanden ist, die mit einem Einlaß und einem Auslaß ausgestattet ist. Das Blut kann durch die Behandlung durch die Kammer über den Einlaß und den Auslaß behandelt werden.
• Vorzugsweise ist die Proteinkomponente des Konjugats ein humanes Protein. Der Ausdruck "Humanprotein" wird hierin verwendet, um Proteine zu umfassen, die natürlicherweise in Menschen vorkommen, wie auch Proteine oder Derivate hiervon, die dieselbe oder eine im wesentlichen ähnliche biologische Aktivität aufweisen. Solche Proteine können natürlich oder synthetisch hergestellt werden (beispielsweise durch chemische Synthese oder durch die Verwendung der rekombinanten DNA Technologie).
• Wünschenswerterweise ist das Protein eine Blutkomponente. Beispielsweise kann sie Serumalbumin (das in natürlicher Form oder rekombinanter Form vorliegen kann) oder ein anderes im allgemeinen inertes natives oder rekombinantes Protein sein, das im unkonjugierten Zustand nicht antigen und nicht immunogen ist und das kein Ligand für ein humanes Rezeptormolekül ist.
• Vorzugsweise ist das Protein löslich (statt membrangebunden).
• Das Protein kann mit einer Vielzahl an Epitopen assoziiert sein, um ein Konjugat zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung durch jede geeignete Technik bereitzustellen. Vorzugsweise werden die Epitope kovalent an das Protein gebunden. Dies kann mittels eines Spacermoleküls ausgeführt werden.
• Eine Reaktion, die zur Einführung eines dreiatomigen Spacers verwendet werden kann, ist eine Michael- Addition zwischen einem Acroylylatderivat eines Zuckers und eines Proteins, beispielsweise HSA (Roy et al., J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1709-1711 (1990)). Die Umsetzung besteht aus drei Hauptschritten:
• i. Aminierung eines reduzierenden Zuckers (beispielsweise B-Trisaccharid): Inkubation in gesättigten Ammoniumhydrogencarbonat für 3 Tage bei 37ºC.
• ii. Aryloylierung: Verwendung von Acryloylchlorid in Gegenwart von Na&sub2;CO&sub3; in einem Methanol-Wasser Lösemittel.
• iii. Nach ausgiebiger Lyophilisierung und Reinigung des derivatisierten Zuckers durch Gelfiltration und Umkehrphasen-HPLC wird er an HSA in 0,1 M Na&sub2;CO&sub3; pH 10,0 für 2 Tage bei 37ºC gekuppelt. Das Produkt der Reaktion ist Zucker-NH-CO-CH&sub2;-CH&sub2;-NH-HSA.
• (Dieselbe basische Reaktion kann zur Kupplung eines Zuckers an Polyacerylamid verwendet werden.)
• Alternativ dazu kann ein Zucker mit einem Allyllinker mit zwei Kohlenstoffen an ein Protein durch ein Verfahren mittels reduktiver Ozonolyse gefolgt von einer reduktiven Aminierung mit Natriumcyanoborhydrid gekuppelt werden (M. A. Bernstein und D. H. Laurance, Carbohydr. Res. 78 (1980)).
• Die Epitope umfassen erwünschterweise als minimale Struktur den kleinsten Liganden, der zur Bindung von XNAs fähig ist, die in α-Konfiguration gebundene Galactose ist. Daher sind die Epitope vorzugsweise Saccaride und erwünschterweise Oligosaccharide oder nachahmende Strukturen dieser Saccharidstrukturen.
• Die Epitope sind erwünschterweise Saccharide und sind vorzugsweise Oligosaccharide. Ähnliche Strukturen jedes der Saccharide oder Oligosaccharide sind im Schutzumfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Der Ausdruck "ähnliche Struktur" bezieht sich auf jede Struktur, die bei der Bindung an einen Antikörper im wesentlichen auf dieselbe Weise wirkt, wie ein Saccharid oder Oligosaccharid.
• Solche ähnlichen Strukturen sind in der Technik bekannt (und werden manchmal als Mimetika bezeichnet). Beispielsweise beschreiben A. R Shikhman und M. W. Cunnigham (J. Immunol. 152(9): 4375 (1994)) die Verwendung von Cytokeratinpeptiden, die als Mimetika der Zuckerepitope durch die Blockierung der anti-GlcNAc Antikörper wirken, Vaughan et al (Xenotransplantation 3: 18-23 (1996) beschreiben ein synthetisches Octapeptid (DAHWESWL), das das Epitop Galα(1,3)Gal nachahmt und Koogman et al. beschreiben ein unterschiedliches Peptid (SSLRGF), das das Epitop Galα1,3Gal ebenfalls nachahmt.
• Die Epitope können Sulfatgruppen, Silalinsäure und α-Galactose (oder Mimetika hiervon umfassen).
• Das Konjugat kann ein Neoglycoprotein sein (ein nicht glycosyliertes Protein, an das Saccharide mit einer definierten Struktur gebunden sind). Neoglycoproteine werden diskutiert von Adler et al., (J. Biol. Chem., 270: 5164-5171 (1995)) und wurden zur Sondierung von Kohlenhydrat-Protein Wechselwirkungen verwendet. Sie können durch Enzym-katalysierte Reaktionen (beispielsweise unter Verwendung von Glycosyltransferasen oder Glucosidasen) oder durch chemische Synthesetechniken hergestellt werden. Die Methodik für chemische Glycosylierung von humanem Serumalbumin (HSA) und Rinderserumalbumin (BSA) ist gut etabliert wie auch die chemische Synthese des B-Trisaccharids (Jaquinet et al., JCS Perkin T: 326-330 (1981)). Es ist eine Reihe an geeigneten auf Galα1,3Gal basierenden Neoglycoproteinen von Dextra Laboratories Ltd., Reading, England erhältlich. Diese Firma stellt HSA-konjugiertes Galα1,3Gal und HSA her, das an Galα1,3Galβ1,4GleNAc konjugiert ist. Beide können entweder als Spacermoleküle mit 3 oder 14 Atomen erhalten werden. Ähnlich stellt die Firma vier auf BASA- basierende Neoglycoproteine her (HSA und BSA beziehen sich jeweils auf humanes Serumalbumin und Rinderserumalbumin).
• Wenn es gewünscht wird, Xenotransplantate von Schweinen zu verwenden, umfassen die bevorzugten Epitope zur Herstellung des Konjugats zwei Galactosereste. Wünschenswerterweise sind die zwei Galactosereste mit einer α-1,3-Bindung verbunden. Daher ist Galα1,3Gal ein bevorzugtes Epitop zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung. Dieses Epitop kann Teil einer größeren Oligosaccharidstruktur sein. Beispielsweise kann es Teil eines Trisaccharids sein: Beispielsweise Galα1,3Galβ1,4GlcNAc. Andere Strukturen, die verwendet werden können, umfassen die folgenden:
• 1) Mehrantennige Oligosaccharide, die bis zu 4 Galα1,3Gal Enden aufweisen. Diese Oligosaccharide können leicht aus natürlichen Quellen gereinigt werden, beispielsweise Thyreoglobulin vom Rind oder Schwein.
• 2) Glycolipid, das von α-galactosylierten Oligosacchariden stammt.
• 3) Synthetische Glycosphingolipide, die die korrekte terminale Struktur aufweisen. Hierbei wird ein Neosphingoglycoprotein erzeugt.
• Das Disaccharid Galα1,3Gal kann an sich verwendet werden.
• Als Alternative zu den oben diskutierten Epitopen können andere Epitope verwendet werden. Diese umfassen: Oligosacchaccharide mit terminaler Galactose, die an einen subterminalen Rest α-gebunden ist, der nicht Galactose sein muß. Die α-Bindung muß keine 1,3-Bindung sein. Beispiele sind Melibiose: Galα1,6Glc, Raffinose: Galα1,6(Fucα1,4)Glc und Arabinogalactan.
• Wenn Xenotransplantate aus anderen Tieren als Schweinen verwendet werden, dann können die geeigneten Epitope in Bezug auf diese Tiere verwendet werden, um ein Konjugat der vorliegenden Erfindung herzustellen. In jedem Fall wird Galα1,3Gal weit verbreitet bei Nicht-Primatensäugern und amerikanischen Affen exprimiert und dürfte ein Hauptepitop bei einer Xenotransplantation von Organen aus einer großen Vielzahl an Säugern sein. Jedoch können wie im Fall des Schweines andere Epitope verwendet werden. Ferner können andere Spezies einzigartige Epitope präsentieren, die mit humanen XNAs reagieren. Wie bei Galα1,3Gal dürfte keines dieser Epitope vom erwachsenen Menschen exprimiert werden.
• Verschiedene bevorzugte Epitope, die in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die in der folgenden Liste angegebenen Kohlenhydrate. (Jedoch können natürlich andere Epitope verwendet werden (beispielsweise die in WO 93/03735 A beschriebenen Xenoantigene).)
Liste der bevorzugten epitopen Strukturen
• (i) Alle Kohlenhydrate, die mit Galα1,3Gal (wie vorher angegeben) enden, einschließlich Blutgruppe B-bezogene Oligosaccharide, das Pentasaccharid Galα1,3Galβ1,4GlcNAcβ1,3Galβ1,4Glc, Galα1,3Galβ1,3GalNAcβ1,4Galβ1,4- Glc und die Blutgruppe I-aktiven Kohlenhydrate (U. Dabrowski et al., J. Biol. Chem. 259: 7648-7651 (1984)).
• (ii) N-Glycosylneuraminsäure. Dies ist ein Monosaccharid, das in Schweinegewebe aber nicht in normalem Menschengewebe expimiert wird, es wurde aber auf humanen Tumoren beschrieben (Y. Fukui et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 160: 1149-1154 (1989)). Diesbezüglich ist N-Glycosylneuramninsäure ähnlich zu Galα1,3Gal.
• (iii) Galα1,XGal, worin X für 2, 4 oder 6 steht. Es besteht Evidenz, daß einige XNAs diese Strukturen erkennen (J. Wieslander et al., Glycoconjugate J. 7: 85-100 (1990)).
• (iv) Blutgruppe A oder A-ähnliche Substanzen. Es besteht eine Evidenz, daß diese Strukturen am Herz (D. Cooper et al., Transpl. Immunol. 1: (1993)) und an der Niere (K. Jalali-Araghi und B. A. Macher, Glycoconjugate J. 11: 266- 271 (1994)) vom Schwein exprimiert werden. Es wird in Tabelle 1 hierin eine experimentelle Evidenz gezeigt, daß Anti-A Antikörper in Primatenempfängern von Nierenxenotransplantaten ausgelöst werden:
• Die Infusion von A und B Kohlenhydraten wurde in der Vergangenheit ausgeführt, um Pathologien zu kontrollieren, die von einer Blutgruppeninkompatibilität stammen (E. L. Romano et al., Transplantation Proceedings 19: 44754478 (1987)).
• (v) T- und T-verwandte Antigene. Menschen haben signifikante Titer an Antiköpern gegen das T-Antigen. (Thomsen Freidenreich Antigen = Galβ1,3GalNAc). Trotzdem führt dies normalerweise nicht zu Problemen, da das Disaccharid - zumindest bei Lymphozytenmembranen vom Schwein und Menschen - cryptisch ist, das heißt normalerweise durch nicht-immunogene Neuraminsäure verdeckt (Newman et al., Eur. J. Biochem. 64: 373-380 (1976)). Es ist möglich, daß diese Abdeckung nicht in allen Geweben vollständig ist, die im Schweinexenotransplantat vorkommen. Darüberhinaus kann die genetische Manipulation der Xenotransplantate, beispielsweise die Ablation des terminalen Galα1,3Gal, das T-Antigen exponieren.
• Menschen tragen auch natürliche Antikörper gegen das Tn Antigen (GalNAc-O-Ser(Thr), einem normalerweise cryptischen Antigen, das durch das Versagen des Gewebes, die darüberliegende Galactose anzufügen, erzeugt werden kann (Thurnher et al. J. Clin. Invest. 91: 2103-2110 (1993)).
• Das T-Antigen ist wahrscheinlich ein allgemeiner Substituent von Mucinoligosacchariden (O-gebunden). Es sollte auf anti-T-Antikörper im Serum von Primatenempfängern von Schweineherzxenotransplantaten getestet werden.
• Die IgG und IgM Subklassen werden mit fixierten Endothelzellen in Gegenwart von hochmolekularem Schweinemagenmucin inkubiert, das zur Entfernung der α-Galactosylgruppen und Neuraminsäure (Tabelle 2) inkubiert wurde. Die Entfernung der α-Galactose durch Kaffeebohnen-α-galactosidase wird durch 1B-4 Lektinbindungsstudien bestätigt (Daten nicht gezeigt). In einem vorläufigen Experiment wurde festgestellt, daß die restliche Bindungsaktivität, vermutlich aufgrund der T-Antigenerkennung, konsistent etwa 15-20% der Antikörperbindung an fixierte Endothelzellen ausmacht und wird der IgM Klasse zugerechnet (im Gegensatz zu anti-Galα1,3Gal, die entweder von der IgG oder IgM Klasse sein können).
• (vi) Poly-N-acetyllactosamin und Lactosamin (Galβ1.XGlcNAc)n worin n = 1 oder > 1 und X für 3 oder 4 stehen kann. Obwohl diese Strukturen gemeinsame Modifikationen der humanen Oligosaccharide sind, können modifizierte Versionen mit A-B und B ähnlichen Enden für Schweine typisch sein. Diese Oligosaccharide binden nicht nur natürlich vorkommende Antikörper, sie können auch ein Ziel für Lactosamin bindende Lactine sein (LBLs, Feizi et al., Biochemistry 33: 6342-6349 (1994)), die Entzündungszellen an das Xenotransplantat anziehen könnten.
• (vii) 3-Sulfatierte Galactose (SO&sub4;-3Galβ). Dies wurde kürzlich als potentielles Xenoantigen beschrieben (Samuelsson und Cairns in Complex Carbohydrates in Drug Research, Alfred Benzon Symposium 36, 368-379, Herausgeber Bock, Clausen (1994)) da es in normalen Humangeweben als cryptisches Antigen exprimiert wird.
• (viii) Peptidepitope, die mit Galα1,3Gal um die Bindung als xenogene natürliche Antikörper konkurriert. Diese können Peptidsequenzen sein, die durch Phagendisplaytechniken oder natürlich vorkommende Sequenzen bestimmt werden. Ein Beispiel ist eine Sequenz oder mehrere Sequenzen auf dem schnellen Myosin des Katzenskelettmuskels, die einen monoklonalen anti-Galα1,3Gal Antikörper binden können (S. Kirkeby, Cell Tissue Res. 283: 85-92 (1996)).
• (ix) N-Acetyl-β-D-glucosamin (GlcNAc). Cooper hat eine anti-GlcNAc Spezifität unter humanen Antikörpern identifiziert, die von Schweineherzen eluiert wurden (D. Cooper et al., Transpl. Immunol. 1: 198 (1993)), wobei jedoch bekannt ist, daß humanes Serum einen natürlichen Antikörper gegen GlcNAc enthält (Emmrich et al., J. Exp. Med 161: 547 (1985)), der mit Keratin kreuzreagieren kann (Shikhman und Cunningham, 1994). In der letzteren Veröffentlichung wurde kommentiert, daß der anti-Kohlenhydrat-Antikörper nur BSA-Konjugate mit einem Minimum von 20 GlcNAc Resten bindet. Albumin hat einen bestimmten Vorteil gegenüber anderen potentiellen "Grundkörpern", da es groß genug ist, eine große Anzahl an Epitopen zu tragen und es ist immer noch löslich.
• In einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt die vorliegende Erfindung ein Epitop, das von einem xenogenen natürlichen Antikörper gebunden wird, wie auch einen Rest, der an die Leberhepatozyten bindet (erwünschterweise mit hoher Spezifität). Dieser Rest umfaßt vorzugsweise eine terminal β-gebundene Galactose, da diese an einen Leberprotein/Asialoglycoproteinrezeptor bindet, der auf Hepatozyten gefunden wird (siehe Virgolini et al., Nucl. Med. Commun. 12: 507-517 (1991)). Das Konjugat kann zusammen mit den xenogenen natürlichen Antikörpern, an die es gebunden ist auf schnelle Art und Weise über die Leber aus dem Kreislauf entfernt werden.
• Das erfindungsgemäße Konjugat kann in einem Kit bereitgestellt werden, der wahlweise Anleitungen zu dessen Verwendung bei der Prävention oder Linderung der Abstoßung enthält.
• Es wird normalerweise in steriler Form als pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung bereitgestellt, die zusätzliche Inhaltsstoffe umfassen kann, beispielsweise Puffer, Hilfsstoffe, usw.
• Das Konjugat kann beispielsweise in steriler Kochsalzlösung oder Kochsalzlösung-Dextrose bereitgestellt werden.
• Zur Erleichterung der Verabreichung kann es in Einheitsdosierungsform bereitgestellt werden. Es kann in einer Form vorliegen, die für die Injektion oder Infusion in einen Patienten angepaßt ist.
• Das Konjugat kann zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verwendung bei der Prävention der Abstoßung eines Xenotransplantats (beispielsweise eines diskordanten Xenotransplants) oder zumindest zur Verringerung der Geschwindigkeit oder des Ausmaßes der Abstoßung verwendet werden. Erwünschterweise wird das Arzneimittel zur Prävention der Abstoßung eines Xenotransplantats von einem humanen Empfänger verwendet.
• Es sollte erwähnt werden, daß obwohl die Konjugate der vorliegenden Erfindung oben hauptsächlich in Zusammenhang mit der Xenotransplantation diskutiert wurden, sie andere potentielle Anwendungen haben. Beispielsweise sind sie zur Behandlung von Erkrankungen brauchbar, bei den Xenoantigene (beispielsweise Galα1,3Gal) beteiligt sind. Der Ausdruck "behandeln" wird hierin verwendet, um die prophylaktische Behandlung wie auch die Behandlung von Patienten zu umfassen, die bereits eine bestimmte Erkrankung aufweisen.
• Mehrere humane Erkrankungen umfassen die Erkennung von Galα1,3Gal durch anti-Galα1,3Gal Antikörper, beispielsweise Chagas Erkrankung und Leishmaniose (Avila et al., J. Immunol. 142: 2828-2834 (1989)) und ideopathische Myelofibrose (Leoni et al., British J. Haematology 85: 313-319 (1993)). Towbin et al., J. Exp. Med. 166: 419432 (1987) berichten, daß ein natürliches Protein-gebundenes Konjugat Galα1,3Gal - Mauslaminin ein sehr guter Inhibitor des Galα1,3Gal Antikörpers ist, der in Leishmanioseseren und auch in normalen Humanseren hervorgerufen wird. Daher hat die vorliegende Erfindung eine potentielle Brauchbarkeit bei der Behandlung der Chagas Erkrankung, Leishmaniose und ideopatischen Myelofibrose.
• Die vorliegende Erfindung wird nun durch ein Beispiel unter Bezugnahme auf die Tabellen und Zeichnungen beschrieben:
• Tabelle 1- zeigt die Agglutination von humanen A+ und B+ Erythrozyten (0,3%) durch gesamte IgM Fraktionen von Prä- und Post-Tx-Seren.
• Das Serum wird von Primatenempfängern entweder von Schweineherzxenotransplantaten (W544, W141 und W135) oder von Schweinenierenxenotransplantaten (T381 und V337) gewonnen. Dies wird größenfraktioniert, um Pools zu erzeugen, die vorwiegend IgG oder IgM enthalten. Die IgM Fraktionen werden mit humanen 0- Erythrozyten voradsorbiert, um die Reaktivität gegenüber Epitopen zu eliminieren, die nicht die A- oder B-Substanzen sind. Das IgM wird dann mit humanem A 1 oder B Erythrozyten auf eine Endverdünnung von 1 : 40 in Bezug auf das ursprüngliche Serum gemischt. Die Zahlen in Klammern zeigen die Anzahl an Tagen an, die zwischen der Operation und dem Gewinnen des Serums vergangen sind. "Prä-" zeigt an, daß das Serum vor der Xenotransplantationsoperation gewonnen wurde. Nach 2 Stunden bei Raumtemperatur werden die Erythrozyten auf Agglutinationsanzeichen untersucht. Die Werte in der 2 und 3. Spalte stehen für die niedrigste IgM Verdünnnung (in Bezug auf das reine Serum), die zur Verursachung der vollständigen Agglutination der Erythrpozyten fähig ist. Als Kontrollen werden die humanen A1 und B Erythrozyten auch mit monoklonalen Antikörpern der anti-A oder anti-B Gruppe provoziert.
• Tabelle 2 - zeigt die Hemmung der Antikörperbindung an fixierte Schweineaortaendothelzellen mit der hochmolekularen Agalactosyl-, Asialo-Fraktion des Schweinemagenmucins.
• Die IgG und IgM Fraktionen aus Serumproben werden entweder mit HSA oder desialysiertem, mit α- Galactosidase behandeltem Schweinemagemnucin (hochmolekulare Fraktion) so gemischt, daß die Endverdünnung des Antikörpers in Bezug auf das Serum 1 : 12 und die Endkonzentration des Inhibitors 100 ug/ml betragen. "W544" und "W141" sind zwei Affenempfänger von hDAF-exprimierenden Schweineherzxenotransplantaten. Die Nummern stehen für die Tage nach der Transplantation. "Prä" steht für eine Probe vor der Transplantation. Nach 2 Stunden bei 4ºC wird das Gemisch in Vertiefungen gegeben, die mit fixierten Schweineaortaendothelzellen beschichtet sind. Nach einer Inkubationsperiode von 2 Stunden bei Raumtemperatur wird der gebundene Antikörper mit Peroxidasekonjugiertem anti-human IgM oder IgG detektiert. Die Tabelle 2 zeigt die prozentuale Veränderung der Bindung von Immunglobulin in Gegenwart von Mucin im Gegensatz zu HSA.
Hemmung der Bindung von XNA IgM an B-Trisaccharid-HSA durch lösliche Zucker und Glycokonjugate
• Fig. I - zeigt die Ergebnisse eines Konkurrenzbindungshemmtests mit Konjugaten, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, wie auch die Ergebnisse dieses Tests mittels freier Oligosaccharide.
• Diese Figur zeigt, daß Mol für Mol das B-Trisaccharid-HSA etwa 2 Größenordnungen besser bei der Bindung von XNA IgM ist als freies B-Trisaccharid, sogar dann, wenn die Gesamtzahl der präsentierten Epitope in Betracht gezogen wird. Eine Hypothese ist, daß die Anordnung der Epitope auf dem Protein es mehreren Armen des Immunglobulins erlaubt, gleichzeitig gebunden zu werden, wobei die Affinität des Immunglobulins erhöht wird. Darüberhinaus kann der Proteingrundkörper die freie Bewegung der Kohlenhydratepitope hemmen, was ihre Antigenität erhöht. Diese Eigenschaften werden nicht automatisch von allen Konjugaten geteilt (wie denen, die in WO 93/03735 A erwähnt sind) und dies sind alles signifikante Vorteile bei der Verwendung eines Proteingrundkörpers.
Zweistufenchromfreisetzungstest mit normalen Schweineendothelzellen (PAE 68#3), der eine anfängliche Inkubation mit seriellen Verdünnungen von affinitätsisoliertem IgM oder IgG gefolgt von 1/8 Babykaninchenkomplement umfaßt
• Fig. 2 - zeigt die Ergebnisse eines Zweistufenchromfreisetzungstests auf normale Schweineaortaendothelzellen (hierin als PAE-68#3) bezeichnet, der eine anfängliche Inkubation mit Reihenverdünnungen an Affinitäts-isoliertem IgM oder IgG gefolgt durch 1/8 Babykaninchenkomplement umfaßt.
• Die Menge an freigesetztem Chrom spiegelt das Ausmaß an Komplement-vermittelter Lyse wider, die durch die XNA Bindung ausgelöst wird.
Zweistufenchromfreisetzungstest mit normalen Schweineendothelzellen (PAE-68#4), der eine anfängliche Inkubation jeweils mit humanem Affinitäts-gereinigtem IgM (10 ug/ml) und vier verschiedenen Zuckern gefolgt von 1/8 Babykaninchenkomplement umfaßt
• Fig. 3 - zeigt die Ergebnisse eines Zweistufenchromfreisetzungstests mit normalen Schweineendothelzellen (PAE- 68#4), der eine anfängliche Inkubation mit entweder humanem, Affinitäts-gereinigtem IgM (10 ug/ml) oder IgG (80 ug/ml) in Gegenwart von drei Zuckern oder HSA-B-Trisaccharidglycokonjugat gefolgt von 1/8 Babykaninchenkomplement umfaßt.
Hemmung der Bindung von IgG oder IgM aus gepooltem Humanserum an fixierte PAEC durch die Präinkubation mit B-Trisaccharid-HSA (HSA-3)
• Fig. 4 - zeigt die Ergebnisse eines Kompetitionsbindungshemmtests, worin die gesamten IgM und IgG Fraktionen von Humanserum mit verschiedenen Konzentrationen an B-Trisaccharid-HSA vor der Inkubation mit fixierten Monoschichten aus kultivierten Schweineendothelzellen in Vertiefungen einer Mikrotiterplatte gemischt werden.
• In einem zweiten Schritt wird 1/200 mit Peroxidase konjugierter anti-human IgM und IgG Antikörper (Sigma) zugegeben. Die gebundene Peroxidase wird gemessen (vertikale Achse) und wird in einer einfachen Weise zur Menge des Serumantikörpers in Beziehung gesetzt, die an die Schweinezellen gebunden ist. Der Abfall in der Immunglobulinbindung in Gegenwart des Konjugats zeigt die Bedeutung von Galα1,3Gal bei der Bindung von vor der Transplantation vorhandem IgM und IgG an das Schweinegewebe an.
• Es wird angemerkt, daß das Meiste der Bindung von sowohl IgG als auch IgM über die Galα1,3Gal Erkennung läuft, die Wirksamkeit des Konjugats aber gegenüber IgG besser ist. Es kann der Fall sein, daß nur eine partielle Hemmung der Bindung ausreicht, um die cytotoxischen Effekte der Antikörper zu verringern.
W544: Post Tx AAg IgG
• Fig. 5 - zeigt die Veränderungen der anti-αGal Antikörper im Serum eines Primaten (W544, der ein Affe ist, der ein transgenes (humanes DAF exprimierendes) Schweinherzxenotransplantat und auch eine geringe (immunsupressive) Cyclophosphamidgabe erhalten hat) nach der Transplantation eines Schweineherzens (genetisch modifiziert, um durch eine hyperakute Abstoßung zu überwinden).
• IgM und IgG werden anfänglich durch eine Gelfiltrationschromatographie getrennt und die anti-αGal Komponente im IgG Pool wird durch ein ELISA Verfahren mittels B-Trisaccharid-HSA als Ziel gemessen. Das Histogramm zeigt eine Zunahme der anti-aGal IgG Konzentration im Serum des Empfängers kurz vor der Abstoßung des Xenotransplantats. Gezeigt ist der Titer des generalisierten anti-Schwein-Antikörpers, wie er durch einen Komplement-abhängigen Schweineerythrozytenzelllysetest gemessen wird.
Hemmung der Bindung des Post-Xenotransplantat IgG an PAEC in Gegenwart von B-Trisaccharid-HSA
• Fig. 6 - zeigt, wie wichtig die Erkennung von Galα1,3Gal bei der Bindung von post-Xenotransplantat Immunglobulin des Empfängers an Schweinezellen ist.
• Post-Xenotransplantatserum aus dem in Fig. 5 beschriebenen Empfänger wird auf fixierte Aortaendothelzellinien in Gegenwart von entweder HSA oder B-Trisaccharid-HSA (0,2 mg/ml) aufgetragen. Die B-Trisaccharid- HSA Intervention hat die größte Wirkung gegen Prä-Xenotransplantat IgG und IgG rom Serum, das direkt vor der Abstoßung gewonnen wurde. Daher ist trotz der kontinuierlichen Gegenwart von anti-αGal Antikörpern, wie dies durch ELISA gemessen wurde, die kompetitive Stärke des Konjugats in Gegenwart von Schweinezellen variabel und hängt wahrscheinlich mit den Affinitätsveränderungen im ausgelösten Antikörper zusammen. Es ist ermutigend, daß der anti-αGal IgG peak, der der Abstoßung vorausgeht, in diesem Fall relativ empfindlich gegenüber der Kompetiation mit dem Konjugat ist.
Relative Färbung von PAEC durch Affinitäts-gereinigtes IgM
• Fig. 7 - zeigt einen Vergleich der Hemmstärke von B-Trisaccharid-HSA, anderer natürlicher α-galactosylierter Glycoproteine und XNA IgM Zielxenoantigene.
• Affinitäts-gereinigtes anti-Galα1,3Gal IgM aus Humanserum wird auf fixierte Schweineaortaendothelzellen (PAEC) nach einer Vorinkubation mit entweder HSA, B-Trisaccharid-HSA, Maus-EHS-Laminin, Rinderthyreoglobulin oder Schweineblutplättchenxenoantigenen aufgetragen. Die horizontale Achse steht für die Menge an XNA IgM, das an PAEC gebunden ist, die mit Meerrettichperoxidase-konjugiertem, humanem anti-IgM Antikörper detektiert wird.
Beispiel
• XNAs werden aus 500 ml Humanserum durch Affinitätschromatographie auf Thyreoglobulin-Sepharose gereinigt. Thyreoglobulin ist ein Glycoprotein, das reich an α-Galactosekohlenhydrat ist. Die IgG und IgM Subklassen werden in einem zweiten Schritt durch Gelfiltration getrennt (dieses Verfahren fraktioniert auf der Grundlage der Größe).
• Es wird eine Auswahl von freien und konjugierten Zuckern auf die Fähigkeit getestet, die Bindung der XNA IgM an α1,3-galactosyliertem Glycoprotein zu hemmen (wird hierin als "B-Trisaccharid-HSA" bezeichnet. Dies ist ein Konstrukt, das eine Vielzahl an Galα1,3Galβ1,4GlcNAc Resten (das heißt B-Trisacchariden) an humanes Serumalbumin durch dreiatomige Spacer gebunden aufweist und von Dextra Laboratories Ltd., Reading, UK unter der Produktnummer NGP2334 erhalten werden kann) (Fig. 1). Das schlagkrägftigste Ergebnis ist, daß B- Trisaccharid-HSA hundertmal hemmender gegenüber der IgM Bindung ist, als unkonjugiertes Galα1,3Galβ1,4- GlcNAc (in den Fig. 1 und 3 als "B-Trisaccharid" bezeichnet). Diese Figuren beziehen sich auch auf "B-Disaccharid". Dies ist Galα1,3Gal. In einigen Fällen wird dies mit einem Spacerarm verwendet. Der Spacerarm ist OCH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;NH&sub2;. Die Fig. 1 bezieht sich auf B-Disaccharid-PAA. Dies ist ein Konjugat aus Polyacrylamid und einer Mehrzahl an Galα1,3Gal Epitopen und Polyacrylamid, wie dies in Rieben et al., Xenotransplantation 2: 98- 106 (1995) beschrieben ist. Jedes Disaccharidepitop ist an einen CONH Rest am Polyacrylamid durch einen Spacer der Zusammensetzung CH&sub2;CH&sub2;CH&sub2;O gebunden. Er ist von Synthesom GmbH erhältlich und wird zum Vergleich mit B-Trisaccharid-HSA verwendet. Es wird eine Form mit 10% Molsubstitution verwendet.
• Die Fähigkeit von Affinitäts-isoliertem Human-IgG und IgM zur Auslösung der Lyse von Schweineendothelzellen wird durch einen Zweistufen-&sup5;¹Chromfreisetzungstest bestimmt. Kurz gesagt werden normale Schweineendothelzellen bis zur Konfluenz in Platten mit 96 Vertiefungen angezogen, bevor sie gewaschen und mit &sup5;¹Chrom markiert werden. Überschüssige Markierung wird entfernt und die Zellen werden gegenüber zwei unterschiedlichen Konzentrationen an XNA exponiert. Ungebundene Antikörper werden entfernt und 1/8 Babykaninchenkomplement wird für 1 Stunde bei 37ºC zugegeben. Die Zellyse wird als Prozentsatz der gesamten Zählung, die mit den Endothelzellen assoziiert ist, ausgedrückt, die im Medium nach der Inkubation der Zellen mit Komplement detektiert werden könnte.
• Beide Immunglobuline, die an die Endothelzellen gebunden sind, führen durch die Fixierung und anschließende Aktivierung des Babykaninchenkomplements zur Zellyse. In Kontrollexperimenten führt der Antikörper oder das Babykaninchenkomplement alleine zu keiner spezifischen Zellyse (Fig. 2). Die IgG Fraktion läßt sich bis 12,5 ug/ml verdünnen, der Wert für IgM beträgt 0,47 ug/ml. Es besteht ein ungefähr zehnfacher Unterschied in den Werten für 50% Lyse, das heißt 32 ug/ml für IgG im Vergleich zu 3,2 ug/ml für IgM.
• Die Antikörperbindung (und somit Lyse) an die Schweineendothelzellen wird dann mit verschiedenen Zuckern gehemmt. Affinitäts-isoliertes IgM (10 ug/ml) oder IgG (80 ug/ml) wird mit Endothelzellen wie vorher in Gegenwart von verschiedenen Konzentrationen an vier verschiedenen Zuckerpräparationen inkubiert. Die Zellen werden dann gewaschen und gegenüber Babykaninchenkomplement exponiert, wie dies vorher beschrieben wurde.
• Der stärkste Inhibitor der Zellyse und daher der Antikörperbindung in Gegenwart von einem der beiden Immunglobuline ist das B-Trisaccharid-HSA Konjugat (Fig. 3). Als Inhibitor der XNA IgM Bindung ist dies in Gegenwart von IgM über zehnfach effektiver im Vergleich zu unkonjugiertem B-Trisaccharid, das wiederum besser als das B-Disaccharid (das heißt Galα1,3Gal) ist. Der Effekt ist für IgG weniger ausgeprägt, aber immer noch signifikant. Es besteht ein minimaler Unterschied für die IgG Bindung zwischen dem B-Trisaccharid und dem B- Disaccharid, jedoch sind sie in ihrer Hemmwirkung gegen IgG im Gegensatz zu IgM effektiver. Glucose hat als unspezifischer Zucker keine Hemmwirkung weder auf das IgG noch auf das IgM Bindungsereignis, sogar bei einer Konzentration von 10 mM.
• Das verwendete B-Trisaccharid-HSA Konjugat wird als sehr effizienter Inhibitor der Zerstörung der Schweinezellen verwendet, die durch die Anwendung von humanen XNA in vitro ausgelöst wird.
• Diese Verbindung kann das Überleben von Schweine-Mensch-Xenotransplantaten verlängern und da weniger Moleküle für den Schutz erforderlich sind, um einen Schutz zu gewährleisten (im Vergleich zu freien α- galactosylierten Zuckern), können osmotische Störungen im Empfänger verringert werden.
• Weitere Daten, die die vorliegende Erfindung unterstützen, werden in den Tabellen 1 und 2 und in den Fig. 4 bis 7 bereitgestellt. Diese Daten werden auf den Seiten 16 bis 21 diskutiert.
Liste der verwendeten Abkürzungen
• BSA: Rinderserumalbumin
• HSA: Humanes Serumalbumin
• Glc: Glucose
• GlcNAc: N-Acetylglucosamin
• GalNAc: N-Acetylgalactosamin
• Gal: Galactose
• XNA: Xenogene natürliche Antikörper
• IgG: Immunglobulin der G Klasse
• IgM: Immunglobulin der M Klasse
• B-Trisaccharid-HSA: Eine Vielzahl an Galα1,3Galβ1,4GlcNAc Epitopen, die mit humanem Serumalbumin konjugiert sind.
• DME: Dulbeccos Modifled Eagle's Medium Tabelle 1 Tabelle 2

Claims (21)

1. Synthetisches Konjugat eines Proteins und einer Vielzahl an Epitopen zur Verwendung in der Medizin, worin diese Epitope zur Bindung von xenogenen natürlichen Antikörpern fähig sind.

2. Konjugat zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 1, worin das Protein keine schädliche Immunreaktion hervorruft, wenn es im Menschen vorkommt.

3. Konjugat zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, worin das Protein ein Humanprotein oder ein funktionelles Äquivalent hiervon ist.

4. Konjugat nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Protein ein Protein ist, das im Blut gefunden wird.

5. Konjugat zur Verwendung in der Medizin nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin das Protein Senunalbumin ist.

6. Konjugat zur Verwendung in der Medizin nach einem der vorangehenden Ansprüche, worin die Epitope ausgewählt sind aus einem Oligosaccharid oder einem Imitat hiervon, das eine terminale Galactose in einer α- Konformation umfaßt und das wahlweise über ein Spacermolekül an das Protein gebunden ist.

7. Konjugat zur Verwendung in der Medizin nach einem der vorangehenden Ansprüche mit einer Vielzahl an Epitopen, die α-verknüpfte Galactose umfassen.

8. Konjugat zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 7 mit einer Vielzahl an Epitopen, die Galα1, 3 Gal umfassen.

9. Konjugat zur Verwendung in der Medizin nach einem der vorangehenden Ansprüche, das ferner einen Rest umfaßt, der an Leberzellen bindet.

10. Konjugat zur Verwendung in der Medizin nach Anspruch 9, worin der Rest, der an Leberzellen bindet, eine β- verknüpfte Galactose umfaßt.

11. Konjugat nach einem der Anprüche 1 bis 10 zur Verwendung bei der Verhinderung der Abstoßung eines Xenotransplantats oder zumindest zur Verringerung des Ausmaßes oder der Geschwindigkeit der Abstoßung.

12. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung bei der Behandlung einer Erkrankung, worin ein Epitop beteiligt ist, das zur Bindung eines xenogenen natürlichen Antikörpers fähig ist (beispielsweise Chagas Erkrankung, Leishmaniose oder ideopathische Myelofibrose).

13. Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Verwendung bei der Behandlung von Blut, das von einem Blutspender stammt, um die Anzahl an vorhandenen xenogenen natürlichen Antikörpern zu verringern.

14. Konjugat nach Anspruch 13, worin das Konjugat immobilisiert ist.

15. Gerät, das zur Verwendung in einem Verfahren nach Anspruch 13 oder 14 geeignet ist, das eine Immunabsorptionseinheit aufweist, welche zumindest ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, eine Kammer, in der das Konjugat zurückgehalten wird und einen Flüssigkeitseinlaß und -auslaß umfaßt.

16. Blut, das gemäß dem Verfahren nach Anspruch 13 oder Anspruch 14 behandelt wird.

17. Pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung, die ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10 umfaßt.

18. Pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung nach Anspruch 17, die zur Verwendung bei der Injektion oder Infusion angepaßt ist.

19. Kit, der ein Konjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 10, Blut nach Anspruch 16, eine pharmazeutisch annehmbare Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder 18 oder ein Gerät nach Anspruch 15 einschließlich Anleitungen zur Verwendung umfaßt

a) zur Verhinderung der Abstoßung von Xenotransplantaten oder zumindest Verringerung der Geschwindigkeit oder des Ausmaßes der Abstoßung, oder

b) zur Behandlung einer Erkrankung, worin ein Epitop beteiligt ist, das zur Bindung eines xenogenen natürlichen Antikörpers fähig ist (beispielsweise Chagas Erkrankung, Leishmaniose oder ideopathische Myelofibrose).

20. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Verhinderung der Abstoßung von Xenotransplantaten oder zumindest zur Verringerung des Ausmaßes oder der Geschwindigkeit der Abstoßung.

21. Verwendung eines Konjugats nach einem der Ansprüche 1 bis 10 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer Erkrankung, worin ein Epitop gebunden ist, das zur Bindung an xenogene natürliche Antikörper fähig ist (beispielsweise Chagas Erkrankung, Leishmaniose oder ideopathische Myelofibrose).