DE69432513T2

DE69432513T2 - Gangliosid-klh-konjugatimastoffe mit qs-21

Info

Publication number: DE69432513T2
Application number: DE69432513T
Authority: DE
Inventors: Friedhelm Helling; Philip O. Livingston
Original assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Current assignee: Memorial Sloan Kettering Cancer Center
Priority date: 1993-01-22
Filing date: 1994-01-21
Publication date: 2003-12-24
Anticipated expiration: 2014-01-22
Also published as: DE69435025D1; AU685776B2; FI953529L; DE69432513D1; NO318920B1; NO952914D0; HUT72193A; EP0680338B1; US6967022B1; EP1360963A2; FI117668B; NZ261744A; EP0680338A4; DK0680338T3; HU9502201D0; AU6092494A; US6936253B1; US20060153859A1; CA2154488A1; US6916476B1

Description

Hintergrund der Erfindung

Ganglioside sind Sialinsäure enthaltende Glycosphingolipide, die aus einem komplexen Kohlenhydratrest bestehen, der an einen hydrophoben Ceramidteil gekoppelt ist. Die in die äußere Hülle der Zellmembran eingebettete Kohlenhydratkette ist gegenüber der extrazellulären Matrix exponiert. Es wurden qualitative und quantitative Veränderungen der Gangliosid-Zusammensetzung während der Zeildifferenzierung und -teilung beobachtet. Diese scheinen den Zustand der bösartigen Transformation von Krebsarten neuroektodermalen Ursprungs widerzuspiegeln (Hakomori 1985). Bösartige Melanomzellen exprimieren eine Vielzahl von komplexen Gangliosiden zusätzlich zu GM3, dem Haupt- Gangliosid normaler Melanocyten (Carubia et al.. 1984). Ein veränderter Gangliosid- Stoffwechsel in Melanomen verursacht die zusätzliche Expression von GD3, GD2, GM2, 9- O-Acetyl-GD3 und GT3 (Hamilton et al., 1993; Tsuchida et al., 1987). Die Behandlung von Patienten mit monoclonalen Anti-GD3-Antikörpern führte zur Entzündung an der Tumorstelle und gelegentlich wurde eine teilweise Rückbilduag der Metastasenbildung beobachtet, was vermuten läßt, dass Ganglioside geeignete Ziele für einen Immunangriff darstellen (Houghton et al., 1985). Die Erzeugung menschlicher MAKs (monoclonaler Antikörper), die mit GD3 aus Melanompatienten reagieren (Yamaguchi et al., 1987) unterstützt die Vorstellung, dass Ganglioside ebenfalls potentielle Immunogene sind.
Bei Studien, die darauf abzielten, eine humorale Antwort gegen Ganglioside in Melanompatienten durch aktive Immunisierung zu induzieren, schienen GM2/BCG- Impfstoffe am wirksamsten (Livingston et al., 1987; Livingston et al., 1989). In einer zufallsverteilten Studie mit 122 Melanompatienten, die nach Operation frei von Krankheit waren, wurde gezeigt, dass von 64 Patienten, die alleine mit BCG, und von 58 Patienten, die mit GM2/BCG behandelt worden waren, die Mehrzahl der Patienten (86%), die den GM2- Impfstoff erhalten hatten, Antikörper herstellten. Die Patienten, die Anti-GM2-Antikörper herstellten, besaßen eine signifikant längere krankheitsfreie Zeit und eine höhere Gesamtüberlebensrate als die Patienten ohne Antikörper. Wenn man die beiden Zweige des Versuchs miteinander vergleicht, besaßen Patienten, die den GM2/BCG-Impstoff erhalten hatten, verglichen mit der BCG-Konlrollgruppe eine 17%-ige Verbesserung des krankheitsfreien Zeitraums und eine 9%-ige Verbesserung der Überlebensrate, obwohl keines der Ergebnisse statistisch signifikant war (Livingston et ab, 1993a). Unglücklicherweise war die Immunantwort nur von kurzer Dauer und bestand größtenteils aus IgM mit einem mittleren Titer. Dies legt nahe, dass GM2 als ein von T-Zellen unabhängiges Antigen erkannt wurde, weil es ein Kohlenhydrat-Antigen darstellt (Livingston et al., 1989) und auch, weil Ganglioside Autoantigene darstellen, die auf einigen normalen Geweben exprimiert werden (Hamilton et al., 1993). Ähnliche Ansätze mit GD2 und 9-O-Acetyl-GD3-Impfstoffen bei Patienten führten gelegentlich zur niedrigen Titern, und es konnte keine Antikörperantwortreaktion gegen GD3 nachgewiesen werden (Livingston, 1991). Des Weiteren wurde die Konjugation eines Gangliosid-Antigens mit KLH vorher beschrieben (Ritter et al., Seminars in Cancer Biology, Bd. 2, (1991): 401409).
Neue potente Adjuvanzien waren in der Lage, die Immunantworten gegen Ganglioside in einigen Fällen zu erhöhen, aber insbesondere für Autoantigene wie z. B. für mit Tumoren verbundene Ganglioside mußte ein anderer Ansatz verwendet werden. Auf Grundlage der klassischen Experimente von Landsteiner (Landsteiner und Chase, 1942) mit Hapten-Träger- Konjugaten wurde die kovalente Anheftung von schwach immunogenen Antigenen an immunogene Trägerproteine erfolgreich verwendet, um die Immunantwort zu steigern. Zum Beispiel konnte die Antwortfähigkeit auf andere Kohlenhydrate als Ganglioside durch die Konjugation an geeignete Trägerproteine bewerkstelligt werden. Die Kopplung von bakteriellen Kapselpolysacchariden an immunogene Proteine zeigte eine signifikante Steigerung der Immunantwort und des Impfschutzes (Eskola et al., 1990). Wie vor Kurzem beschrieben rief die Immunisierung von Eierstock-Krebspatienten mit synthetischem Thompson-Friedenreich-Tumorantigen, das an Keyhole-Limpet-Hämocyanin gekoppelt war, die humorale IgM- und IgG-Antwortreaktion hervor (MacLean et al., 1992). Das wichtige Ergebnis, das diesen Studien gemeinsam ist, war das Umschaltung der Isotypen (isotype switch) von einer IgM-Antwortreaktion mit kurzer Dauer zu einer lang andauernden IgG- Antwortreaktion mit hoher Affinität, was anzeigt, dass die Aktivierung von T-Zellen abhängiger (Antigen-Präsentations)-Wege gegen Kohlenhydrate wahrscheinlich stattfindet. Dieser Ansatz wird nun auf das Melanom-Tumorantigen GD3 angewendet, um ein Verfahren zu entwickeln, Gangliosid-Proteinkonjugat-Impfstoffe zu synthetisieren und die Immunogenität verschiedener GD3-Proteinkonjugate in Mäusen zu untersuchen.

Zusammenfassung der Erfindung

Diese Erfindung stellt einen Impfstoff zur Stimulierung oder zur Verstärkung der Herstellung eines Antikörpers, der ein Gangliosid erkennt, in einem Individuum, dem der Impfstoff verabreicht wird, bereit. Der Impfstoff umfaßt eine Menge eines Gangliosids oder eines Oligosaccharidteils davon, das an ein immunogenes Protein konjugiert ist, das zur Stimulierung oder zu Verstärkung der Antikörperproduktion in dem Individuum wirksam ist, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel.
Diese Erfindung stellt auch die Verwendung eines Gangliosids oder eines Oligosaccharidteils davon, die an ein immunogenes Protein konjugiert sind, bereit, die die Stimulierung oder die Verstärkung der Antikörperproduktion in dem Individuum bewirken, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und eines pharmazeutisch verträglichen Trägers zur Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung oder zur Verstärkung der Produktion eines Antikörpers, der ein Gangliosid erkennt. Das Gangliosid oder der Oligosaccharidteil davon umfaßt einen unveränderten Oligosaccharidteil und einen veränderten Ceramidteil.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 Die Synthese von GD3-Proteinkonjugaten nach Spaltung durch Ozon und reduktiver Aminierung. Die Teilabbildung stellt eine HPTLC von GD3 vor (A) und nach (B) der Spaltung dar.
Fig. 2A und 2B Zeitverlauf der GD3-KLH-Antiseren IgM- (a) und IgG- (b) Antikörper. Jedes Symbol der Figur steht für eine Maus.
Fig. 3A und 3B linmun-Dünnschicht-Chromatographie von drei Maus-Antiseren nach Impfung mit GD3-KLH. Die Reaktionsfähigkeit von IgG- (a) und IgM- (b) Antikörpern wurde mit A, menschlichen Gehim-Gangliosiden; B, Neuroblastom- Gangliosiden; C, Melanom-Gangliosiden und D, dem GD3-Antigen untersucht.
Fig. 4 Immunblot von vier verschiedenen Mäusen, um die Spezifität der Immunantwort aufzuzeigen. Die reinen Ganglioside wurden als Tupfen aufgetragen (dot-blotted) und mit den Seren aus Mäusen inkubiert.
Fig. 5 Repräsentative FACS-Analyse der Reaktionsfähigkeit des Maus-Serums vor (Peak bei 3) und nach (Peak bei 50) der Immunisierung mit GD3-KLH und QS-21 untersucht an der Melanom-Zelllinie SK-MEL-28.
Fig. 6A und 6B Zeitverlauf der IgM- (a) und IgG- (b) Antikörper der GM2-KLH-Antiseren. Jedes Symbol der Figur stellt einen Patienten dar.
Fig. 7 Nachweis des GM2-Antikörpers in Seren aus Patienten, die mit dem GM2- Konjugat-Impfstoff plus Adjuvanz geimpft worden waren, über Dot-B Lot- Immunfärbung. Die Gangliosid-Standards wurden auf Nitrocellulose-Streifen aufgetragen (angezeigt auf der vertikalen Achse), und es wurde ihnen erlaubt mit den Präimmun- und den Peak-Titer-Immunseren aus individuellen Patienten und mit Peroxidase markiertem Anti-Mensch-IgM- oder IgG- Antikörper aus Ziegen zu reagieren. Die Streifen werden nach einer Skala von 0 bis 3+ benotet. Der MAK 696 wurde als positive Kontrolle für GM2 verwendet.
Fig. 8A- 1 und 8A-2 Spezifität der Peak-Titer-Seren aus Patienten, die mit GM2-KLH + QS-21- Impfstoff immunisiert worden waren, die Bestimmung erfolgte über Immun- Dünnschicht-Chromatographie wie vorher beschrieben (3, Referenz der Dritten Reihe der Experimente). GM2 (A) und Gangliosidextrakt aus Melanomgewebe (B) wurden auf TLC-Platten aufgetragen, mit Seren aus individuellen Patienten inkubiert und mit Peroxidase markiertem Anti-Mensch-IgM- oder IgG- Antikörper aus Ziegen gefärbt. Der MAK 696 wurde als positive Kontrolle für GM2 verwendet und die Resorcin-Färbung für Ganglioside.
Fig. 8B Hemmung der IgG-Reaktionsfähigkeit von Patientenserum gegen GM2 und GD2. GM2 (A) und Gangliosidextrakt aus Melanomgewebe (B) wurden auf HPTLC-Platten aufgetragen, mit dem Serum des Patienten Nr. 2 inkubiert und mit Peroxidase markiertem Anti-Mensch-IgG-Antikörper aus Ziegen gefärbt. 3 ml Patientenserum in einer Verdünnung von 1 : 50 wurden vor der Immunfärbung entweder mit 150 ug GM2 oder mit 150 ug GD2 vorinkubiert.
Fig. 9A und 9B IgM- und IgG-Antikörperantwortreaktionen bei Melanompatienten nach der Immunisierung mit GM2-KLH plus QS-21-Impfstoffen. Die aufeinander folgenden Ergebnisse für sechs Patienten, die die 100 ug QS-21-Dosis erhalten hatten, werden in Fig. 9a gezeigt und für sechs Patienten, die die 200 ug- Dosis erhalten hatten, in Fig. 9b. Man bemerke, dass ein Patient jeder Gruppe nur vier Impfungen erhielt und aufgrund des Fortschreitens der Krankheit aus der Studie herausgenommen wurde. Die Pfeile zeigen die Zeitpunkte der Cyclophosphamid- (Cy) und der GM2-KLH plus QS-21-Impfstoff-Injektionen an.
Fig. 10A und 10B Nachweis des GM2-Antikörpers durch Dot-Blot-Immunfärbung mit Seren aus zehn Patienten, die mit GM2-KLH geimpft worden waren. Die Gangliosid- Standards wurden auf Nitrocellulose-Streifen aufgetragen (wie auf der linken Seite angezeigt) und zuerst mit den Seren und dann, nach dem Waschen, mit Peroxidase markiertem Anti-Mensch-IgM- oder IgG-Antikörper aus Ziegen inkubiert. Es werden die Ergebnisse mit Seren aus zwei Patienten aus jeder der fünf Gruppen gezeigt, die unterschiedliche QS-21-Dosen erhalten hatten (wie oben angezeigt wird). Für jeden Patienten werden die Prä- (a) und die Immunseren (b) gezeigt. Die monoclonalen Antikörper 696 und 3F8 aus Mäusen sind IgM- (beziehungsweise) IgG-Antikörper gegen GM2 und GD2. Der IgM-Antikörper gegen GM1 wurde in Seren aus den meisten Patienten vor und nach der Impfung nachgewiesen. Der IgM- und der IgG-Antikörper gegen GM2 wurde vor der Impfung in keinem dieser Patienten nachgewiesen. Nach der Impfung wurden IgM- und IgG-Antikörper gegen GM2 in den Seren aller Patienten nachgewiesen. Die Reaktionen wurden mit 0, 1+, 2+ oder 3+ benotet. Eine Beispiel für die Benotung einer Reaktion dieses Testansatzes ist: Patient 1 (100 ug QS-21) IgM (vor/nach Impfung): KLH 1+/2+, GM3 0/0, GM2 0/3+, GM1 1+/1+, GD3 0/0, GD2 0/1+, GDIb 0/0.
Fig. 11 A und 11B IgM-Antikörperantwortreaktionen bei Melanompatienten nach der Immunisierung mit dem GM2/BCG-Impfstoff. Die aufeinanderfolgenden Ergebnisse von fünf Patienten, die während der anfänglichen vier Monate des Protokolls (Gruppe A) und von fünf Patienten, die während der anschließenden vier Monate des Protokolls (Gruppe B) behandelt worden waren, werden gezeigt. Die Pfeile zeigen die Zeitpunkte der Cyclophosphamid- (Cy) und der GM2-KLH plus QS-21-Impfstoff-Injektionen an.
Fig. 12 Nachweis des GM2-Antikörpers durch Dot-Blot-Immunfärbung in Seren aus zehn mit GM2/BCG geimpften Melanompatienten. Die Gangliosid-Standards wurden auf Nitrocellulose-Streifen aufgetragen (wie auf der linken Seite angezeigt) und zuerst mit den Seren und dann, nach dem Waschen, mit Peroxidase markiertem Anti-Mensch-IgM-Antikörper aus Ziegen inkubiert. GM2-MEL zeigt gereinigtes GM2 an, das aus Melanom-Biopsieproben extrahiert wurde, alle anderen Ganglioside einschließlich GM2 stammen aus Rinderhirn. Die Patientennummern (6 bis 58) sind angegeben, und es werden die Prä- (a) und die Immunseren (b) für jeden Patienten gezeigt. 696 und 3G6 sind monoclonale IgM-Antikörper aus Mäusen gegen GM2 beziehungsweise GD2. Der GM2-Antikörper wurde in den Immunseren dieser 10 Patienten nachgewiesen. Der GM1-Antikörper wurde in den Prä- und in den Immunseren des Patienten 53 und in dem Immunserum des Patienten 57 beobachtet. Die Reaktionen wurden mit 0, 1+, 2+ oder 3+ benotet. Beispiele für Benotungen der Reaktionen sind wie folgt: Patient 8: GM2 3+, GM2-MEL 2+; Patient 54: GM2 3+, GM2-MEL 1+ und Patient 57: GM2 3+, GM2-MEL 3+. Die geringere Reaktionsfähigkeit gegen G2-MEL verglichen zu GM2, die mit den Immunseren und dem monoclonalen Antikörper 696 aus Mäusen beobachtet wurde, spiegelt die niedrigere Menge an GM2-MEL-Gangliosid wider, die auf die Streifen aufgetragen wurde.
Fig. 13 Kaplan-Meier-Darstellungen des krankheitsfreien Zeitraums und der Gesamt- Überlebensrate von Patienten mit GM2-Antikörperproduktion nach der Impfung. Die Patienten wurden als positiv eingeordnet, wenn die Reaktionsfähigkeit von GM2a) bei der Dot-Blot-Analyse 2+ oder 3+ mit einem ELISA-Titer ≥ 1/20 betrug oder b) bei der Dot-Blot-Analyse 1+ mit einem ELISA-Titer ≥ 1/80 betrug.
Fig. 14 Kaplan-Meier-Darstellungen des krankheitsfreien Zeitraums und der Gesamt- Überlebensrate von 59 Patienten, die zufällig ausgewählt worden waren, um BCG zur erhalten, und von 57 Patienten, die zufällig ausgewählt worden waren, um GM2/BCG zu erhalten, unter Ausschluß von sechs Patienten, die den GM2-Antikörper vor der Immunisierung herstellten (fünf im BCG-Zweig und einer im GM2/BCG-Zweig).
Fig. 15 Kaplan-Meier-Darstellungen des krankheitsfreien Zeitraums und der Gesamt- Überlebensrate von 64 Patienten, die zufällig ausgewählt worden waren, um BCG zu erhalten, und von 58 Patienten, die zufällig ausgewählt worden waren, um GM2/BCG zu erhalten.
Fig. 16 Kaplan-Meier-Darstellungen von krankheitsfreien Überlebensraten von 59 Patienten ohne GM2-Antikörper, die zufällig ausgewählt worden waren, um BCG zu erhalten (Δ oder ) verglichen mit 57 Patienten ohne GM2- Antikörper, die zufällig ausgewählt worden waren, um GM2/BCG zu erhalten ( oder ). Die Patienten wurden in zwei Gruppen angeordnet, Patienten mit einem einzigen positiven Lymphknoten (Δ oder ) und Patienten mit zwei oder mehreren positiven Lymphknoten ( oder ).

Genaue Beschreibung der Erfindung

In diesem Antrag wird durchgängig auf zahlreiche Referenzen in Klammern Bezug genommen. Die vollständigen Literaturzitate dieser Referenzen befinden sich am Ende dieser Anmeldung vor den Ansprüchen.
Die Erfindung stellt einen Impfstoff zur Stimulierung oder zur Verstärkung in einem Individuum, dem der Impfstoff verabreicht wird, zur Produktion eines Antikörpers bereit, der ein Gangliosid erkennt. Der Impfstoff umfaßt eine Menge eines Gangliosids oder eines Oligosaccharidteils davon, das mit einem immunogenen Träger konjugiert ist, die wirksam Antikörperproduktion in dem Individuum stimulieren oder verstärken, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel.
Das Gangliosidderivat der Erfindung umfaßt einen unveränderten Oligosaccharidteil und einen veränderten Ceramidteil.
Der Oligosaccharidteil eines Gangliosids kann durch Spaltung eines Gangliosids gewonnen werden, oder er kann direkt synthetisiert werden. Wie hierin verwendet ist ein immunogenes Protein ein Protein, dass, wenn es mit dem Gangliosid oder dem Oligosaccharidteil davon konjugiert ist, die Antikörperproduktion in dem Individuum stimuliert oder verstärkt.
In einer Ausführungsform der Erfindung ist das Individuum ein Mensch.
Diese Erfindung stellt auch den vorstehend beschriebenen Impfstoff bereit in dem das Gangliosid oder der Oligosaccharidteil davon mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin oder einem Derivat von Keyhole-Limpet-Hämocyanin konjugiert ist.
Keyhole-Limpet-Hämocyanin ist ein wohlbekanntes Protein. Ein Derivat von Keyhole-Limpet-Hämocyanin kann durch die direkte Verknüpfung von mindestens einem immunologischen Adjuvanz wie z. B. Monophospholipid A oder nicht-ionischen Block- Copolymeren oder Cytokinen mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin erzeugt werden. Cytokine sind dem Fachmann wohlbekannt. Ein Beispiel für ein Cytokin ist Interleukin-2. Im Fachgebiet gibt es andere bekannte Interleukine, die mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin verknüpft werden können und so ein Derivat von Keyhole-Limpet-Hämocyanin bilden.
In einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Impfstoffs ist das Adjuvanz QS-21.
Es gibt andere bekannte Adjuvanzien, die auf diese Erfindung anwendbar sind. Möglicherweise gibt es Klassen von QS-21 oder zu QS-21 ähnliche Chemikalien, die in ähnlicher Weise in Übereinstimmung mit dieser Erfindung verwendet werden können.
Diese Erfindung stellt weiterhin den vorstehend beschriebenen Impfstoff bereit, wobei das Gangliosid ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus GM2, GM3, GD2, GD3, GD3- Lacton, O-Acetyl-GD3 und GT3.
In einer der bevorzugten Ausführungsformen dieser Erfindung ist das Gangliosid GM2. In einer anderen Ausführungsform ist das Gangliosid GD3. In einer anderen Ausführungsform ist das Gangliosid GD2.
Es können unterschiedlich wirksame Mengen des konjugierten Gangliosids oder des Oligosaccharidteils davon gemäß dieser Erfindung angewendet werden. Eine Person mit dem allgemeinen Fachwissen kann einfache Titrationsexperimente durchführen, um zu bestimmen, wie hoch die wirksame Menge ist die für eine wirksame Immunisierung erforderlich ist. Ein Beispiel für ein solches Titrationsexperiment besteht darin, unterschiedliche Mengen des konjugierten Gangliosids oder des konjugierten Oligosaccharidteils davon, dem Individuum zu injizieren und dann die Immunantwort zu untersuchen.
In einer Ausführungsform ist die wirksame Menge des konjugierten Gangliosids oder des konjugierten Oligosaccharidteils davon eine Menge zwischen 1 ug und 200 ug.
In einer anderen Ausführungsform ist die wirksame Menge des konjugierten Gangliosids oder des konjugierten Oligosaccharidteils davon eine Menge zwischen 50 ug und 90 ug. In einer Ausführungsform beträgt die wirksame Menge des konjugierten Gangliosids oder des konjugierten Oligosaccharidteils davon 70 ug.
In einer anderen Ausführungsform liegt die wirksame Menge des konjugierten Gangliosids oder des konjugierten Oligosaccharidteils davon zwischen 1 ug und 10 ug. In einer spezifischeren Ausführungsform liegt die wirksame Menge des konjugierten Gangliosids oder des konjugierten Oligosaccharidteils davon zwischen 7 ug und 10 ug. In einer Ausführungsform beträgt die wirksame Menge des konjugierten Gangliosids oder des konjugierten Oligosaccharidteils davon 7 ug.
Des Weiteren kann die wirksame Menge des Adjuvanz ebenfalls auf ähnliche Weise bestimmt werden, d. h. durch die Verabreichung unterschiedlicher Mengen des Adjuvanz mit den Konjugaten und der Untersuchung der immunantwort, um zu bestimmen, welche Menge wirksam ist. Wenn QS-21 als Adjuvanz verwendet wird, kann die wirksame Menge an QS-21 ebenfalls auf ähnliche Weise bestimmt werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die wirksame Menge an QS-21 eine Menge zwischen 10 ug und 200 ug. In einer Ausführungsform beträgt die wirksame Menge an QS-21 100 ug. In einer anderen Ausführungsform beträgt die wirksame Menge an QS-21200 ug.
Die Erfindung stellt weiterhin einen Impfstoff zur Stimulierung oder zur Verstärkung in einem Individuum, dem der Impfstoff verabreicht wird, zur Produktion eines Antikörpers, der ein Gangliosid erkennt, bereit. Dieser umfaßt eine Menge eines Gangliosids oder eines Oligosaccharidteils davon, die mit einem immunogenen Träger konjugiert sind, die wirksam die Antikörperproduktion in dem Individuum stimulieren oder verstärken, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel, wobei das Individuum unter Krebs leidet und der in dem Individuum nach Verabreichung des Impfstoffs hergestellte Antikörper den Krebs wirksam behandelt.
Die Erfindung stellt auch einen Impfstoff zur Stimulierung oder zur Verstärkung in einem Individuum, dem der Impfstoff verabreicht wird, zur Produktion eines Antikörpers, der ein Gangliosid erkennt, bereit umfassend eine Menge eines Gangliosids oder eines Oligosaccharidteils davon, die mit einem immunogenen Träger konjugiert sind, die wirksam die Antikörperproduktion in dem Individuum stimulieren oder verstärken, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel, wobei das Individuum anfällig für Krebs ist und der in dem Individuum nach Verabreichung des Impfstoffs hergestellte Antikörper den Krebs wirksam verhindert.
Diese Erfindung stellt weiterhin einen Impfstoff für Krebsarten bereit, wobei die Zellen des Krebses Ganglioside auf ihrer Oberfläche tragen.
Diese Erfindung stellt ebenfalls einen Impfstoff für Krebsarten bereit, wobei die Ganglioside sich im Stroma des Krebses befinden.
Diese Erfindung stellt einen Impfstoff ihr Krebsarten bereit die epithelialen, mesodermalen oder neuroektodermalen Ursprungs sind. Beispiele ihr epitheliale Krebsarten sind Brustkrebs und die Gebärmutterschleimhaut betreffende Krebsarten der Gebärmutter. Ein Beispiel für einen Krebs mesodermalen Ursprungs ist ein Sarkom. Ein Beispiel für einen Krebs neuroektodermalen Ursprungs ist ein Melanom.
Diese Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung von Gangliosiden oder Oligosaccharidteilen davon bereit, die an ein immunogenes Protein konjugiert sind, die wirksam die Antikörperproduktion in einem Individuum stimulieren oder verstärken, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für die Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung oder zur Verstärkung der Produktion eines Antikörpers, der ein Gangliosid erkennt, in einem Individuum, dem der Impfstoff verabreicht wird.
In einer Ausführungsform des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist das Gangliosid GM2.
Diese Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung von Gangliosiden oder Oligosaccharidteilen davon bereit, die an ein immunogenes Protein konjugiert sind, die wirksam die Antikörperproduktion in einem Individuum stimulieren oder verstärken, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für die Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung oder zur Verstärkung der Produktion eines Antikörpers, der ein Gangliosid erkennt, in einem Individuum, dem der Impfstoff verabreicht wird, wobei das Individuum unter Krebs leidet.
Diese Erfindung stellt ebenfalls die Verwendung von Gangliosiden oder Oligosaccharidteilen davon bereit, die an ein immunogenes Protein konjugiert sind, die wirksam die Antikörperproduktion in einem Individuum stimulieren oder verstärken, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für die Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung oder zur Verstärkung der Produktion eines Antikörpers, der ein Gangliosid erkennt, in einem Individuum, dem der Impfstoff verabreicht wird, wobei das Individuum für Krebs empfänglich ist.
Diese Erfindung stellt ebenfalls die vorstehend beschriebene Verwendung bereit, wobei das Gangliosid oder der Oligosaccharidteil davon mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin oder einem Derivat von Keyhole-Limpet-Hämocyanin konjugiert ist. Diese Erfindung stellt weiterhin die vorstehend beschriebene Verwendung bereit, wobei das Adjuvanz QS-21 ist.
Diese Erfindung stellt weiterhin die vorstehend beschriebe Verwendung zur Herstellung eines Impfstoffs zur Behandlung oder zur Verhinderung von Krebs bereit, wobei die Zellen des Krebses Ganglioside auf ihrer Oberfläche tragen.
Diese Erfindung stellt weiterhin die vorstehend beschriebe Verwendung zur Herstellung eines Impfstoffs zur Behandlung oder zur Verhinderung von Krebs bereit, wobei sich die Ganglioside im Stroma des Krebses befinden.
Diese Erfindung stellt weiterhin die vorstehend beschriebe Verwendung zur Herstellung eines Impfstoffs zur Behandlung oder zur Verhinderung von Krebsarten bereit, die epithelialen, mesodermalen oder neuroektodermalen Ursprungs sind. Ein solcher Krebs neuroektodermalen Ursprungs ist ein Melanom.
Zum Zwecke dieser Erfindung bedeutet "pharmazeutisch verträgliche Vehikel" irgendeines der pharmazeutischen Standard-Vehikel. Beispiel für geeignete Vehikel sind im Fachgebiet wohlbekannt und können irgendein pharmazeutisches Standard-Vehikel wie z. B. eine phosphatgepufferte Kochsalzlösung, phosphatgepufferte Kochsalzlösungen, die Polysob- 80 enthalten, Wasser, Emulsionen wie z. B. eine ÖL/Wasser-Emulsion und verschiedene Arten an Befeuchtungsmitteln umfassen, sind aber nicht auf diese beschränkt.
Der Impfstoff dieser Erfindung kann intradermal, subcutan und intramuskulär verabreicht werden. Es können auch andere Verfahren verwendet werden, die dem Fachmann wohlbekannt sind.
In einer bevorzugten Ausführungsform stellt diese Erfindung die Verwendung von Gangliosiden oder Oligosaccharidteilen davon bereit, die an ein immunogenes Protein konjugiert sind, die wirksam die Antikörperproduktion in einem Individuum stimulieren oder verstärken, sowie eine wirksame Menge eines Adjuvanz und ein pharmazeutisch verträgliches Vehikel für die Herstellung eines Impfstoffs zur Stimulierung oder zur Verstärkung der Produktion eines Antikörpers, der ein Gangliosid erkennt, in einem Individuum, dem der Impfstoff verabreicht wird, wobei die Verabreichung, die Verabreichung an zwei oder mehr Stellen umfaßt. "Verabreichung der wirksamen Dosis an zwei oder mehr Stellen" bedeutet, dass die wirksame Menge in zwei oder mehr Portionen aufgeteilt wird, und dass jede Portion an einer unterschiedlichen Stelle des Individuums verabreicht werden soll. In einer spezifischen Ausführungsform der vorstehend beschriebenen Verwendungen des Impfstoffs wird der Impfstoff an drei Stellen verabreicht.
Diese Erfindung wird durch die folgenden experimentellen Einzelheiten besser verstanden werden. Ein Fachmann wird jedoch rasch erkennen, dass die spezifischen Verfahren und die diskutierten Ergebnisse die Erfindung, wie sie vollständiger in den darauffolgenden Ansprüchen beschrieben ist, nur veranschaulichen.

Experimentelle Einzelheiten

Erste Reihe der Experimente

EXPERIMENTELLE EINZELHEITEN

Die erhöhte Immunogenität von GD3-Konjugat-Impfstoffen: Vergleich verschiedener Trägerproteine und Auswahl von GD3-KLH zur weiteren Untersuchung.
Mit Tumoren verbundene Ganglioside sind dafür bekannt, dass sie geeignete Ziele für den Immunangriff gegen Krebs darstellen, aber sie sind schwach immunogen. Die aktive Immunisierung führt zu IgM-Antwortreaktionen mit niedrigem Titer und von kurzer Dauer. Die kovalente Anheftung von schwach immunogenen Antigenen an immunogene Trägerproteine ist ein potentes Verfahren zur Steigerung der humoralen Antwortreaktion. GD3, eine dominantes Gangliosid auf bösartigen Melanomen, wurde durch zwei Verfahren an Trägerproteine angeheftet. Es wurde durch die Glucose des GD3-Oligosaccharids gebunden, aber dies führte zum Verlust der Antigenität und zur Induktion von Antikörpern, die nicht mit GD3 oder GD3-exprimierenden Melanomzellen reagierten. Beim zweiten Verfahren wurde GD3 durch Ozon-Spaltung der Doppelbindung des Ceramidgerüstes modifiziert, es wurde eine Aldehydgruppe eingeführt, und diese Gruppe wurde durch reduktive Aminierung an die Aminolysylgruppen von Proteinen gekoppelt. Unter Verwendung dieses Verfahrens wurden Konjugate mit synthetischen multiplen antigenen Peptiden (MAP) konstruiert, die Wiederholungssequenzen eines Malaria T-Zellen-Epitops, des äußeren Membranproteins (OMP) von Neisseria meningitidis, kationisiertem Rinderserumalbumin (cBSA), Keyhole- Limpet-Hämocyanin (KLH) und Polylysin enthüllen. Die Antigenität der Konjugate wurde durch ihre Reaktionsfähigkeit mit verschiedenen Antikörpern bestätigt, und die Immunogenität wurde in Mäusen untersucht. Die Antikörperspiegel in den Immunseren wurden durch ELISA und durch Dot-Blot-Immunfärbungen mit gereinigten Gangliosiden untersucht. Die Spezifität der Reaktionsfähigkeit der Seren wurde weiterhin durch Immun- Dürmschicht-Chromatographie unter Verwendung von Tumorgewebeextrakten untersucht. Die GD3-Konjugat-Impfstoffe führten zu signifikant verbesserten Antikörper- Antwortreaktionen, insbesondere mit den GD3-KLH-Konjugaten. Es wurden IgM- und IgG- Antwortreaktionen mit hohen Titern gegen GD3 induziert. Dieses Verfahren ist auf andere Ganglioside anwendbar und könnte zur Konstruktion von Gangliosid-Impfstoffen gegen eine Vielzahl von menschlichen Krebsarten geeignet sein, die reich an Gangliosiden sind.

Material und Methoden

Glycolipide. Aus Rinderhirn extrahiertes GM3, GM2 und GD1b wurden durch das Fidia-Forschungslabor (Abano Terme, Italien) zur Verfügung gestellt. GD2 wurde aus GD1b durch Behandlung mit β-Galactosidase hergestellt (Cahan et al., 1982). GD3 (mel) wurde aus menschlichem Melanomgewebe isoliert (Ritter et al., 1991), GD3 (bbm) (zur Herstellung des Impfstoffs verwendet) und GT3 wurden aus Rinder-Buttermilch isoliert und freundlicherweise von Dr. R. K. Yu (Medical College of Virginia, Richmond, VA) (Ritter et al., 1990a) zur Verfügung gestellt. Disialyllactose (das GD3-Oligosaccharid) wurde wie vorher beschrieben (Nicolai et al., 1978) aus Rinder-Kolostrum (Vormilch) isoliert.
Chemikalien. HPTLC-Silicagel-Platten wurden von E. Merck (Darmstadt, BRD) bezogen; Sep-Pak-C18-Kartuschen kamen von Walters Associates (Mildford, MA); 4-Chloro- 1-naphtol, Dinatrium-p-Nitrophenylpolyphosphat, Natriumcyanoborhydrid von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO); Cyclophosphamid (Cytoxan) von Mead Johnson (Syracuse, NY); QS-21, das einen Saponin Quil A-Bestandteil enthielt, von Cambridge Biotech (Worcester, MA).
Proteine. Poly-L-lysin-hydrobromid (MG (vis) 3800) wurde von Sigma bezogen; Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) von Calbiochem (LaJolla, CA); cBSA-lnject- Supercarrier-Immunemodulator von Pierce (Rockfort, IL); die äußeren Membranproteine (OMP) von Neisseria meningitidis wurden freundlicherweise von Dr. M. S. Blake (Rockefeller University, New York, NY) zur Verfügung gestellt. Das Multiple-Antigene- Peptid (MAP) YAL-IV 294-I, das 4 Wiederholungssequenzen eines Malaria-T-Zellen-Epitops enthielt, war ein Geschenk von Dr. J. P. Tam (Rockefeller University, New York, NY).
Monoclonale Antikörner. Anti-Maus-Immunglobuline aus Kaninchen, die mit Meerrettich-Peroxidase für die ITLC konjugiert worden waren, und Anti-Maus-IgM und -IgG aus Kaninchen, die mit Alkalischer Phosphatase für den ELISA konjugiert worden waren, wurden von Zymed (San Francisco, CA) erhalten; der Anti-GD3-MAK R24 wurde hergestellt (Houghton et al., 1985).
Serologische Testansätze. Enzymgekoppelte Immunadsorbens Testansätze (ELISA) wurden wie vorher beschrieben durchgeführt (Livingston et al., 1989). Um die unspezifische "Klebrigkeit" ("stickiness") zu kontrollieren, wurden die Immunseren auch auf Platten untersucht, die identisch weiter behandelt wurden, denen aber kein Gangliosid zugegeben wurde. Der abgelesene Wert wurde von dem Wert abgezogen, der bei Anwesenheit des Gangliosids erhalten wurde. Der Titer wurde als die größte Verdünnung definiert, die eine korrigierte Extinktion von 0,1 oder höher ergab. Die Immunfärbung von Gangliosiden mit monoclonalen Antikörpern oder mit Maus-Seren wurde nach der Trennung über hochauflösende Dünnschicht-Chromatographie (HPTLC)-Silicagel-Glasplatten wie vorher beschrieben (Hamilton et al., 1993) durchgeführt. Die Platten wurden mit dem Lösemittel 1: Chloroform/Methanol/Wasser (0,25% CaCl&sub2;) 50 : 40 : 10 oder in dem Lösemittel 2: Ethanol/n- Butanol/Pyridin/Wasser/Essigsäure 100 : 10 : 10 : 30 : 3 (Vol./Vol.) entwickelt und wurden ebenfalls mit dem Resorcin/HCl-Reagenz sichtbar gemacht.
Immunisierung. Sechs Wochen alte, weibliche BALB/c x C57BL76-FI-Mäuse (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME) wurden 3 Tage vor der ersten Immunisierung i.p.- Injektionen an Cyclophosphamid (15 mg/kg) verabreicht, und sie wurden den Behandlungsgruppen zufällig zugeteilt. Gruppen von 4 oder 5 Mäusen wurden s.c.- Injektionen einer Gabe von drei Impfstoffen verabreicht, die 2 Wochen auseinander lagen, sofern nicht anders angegeben. Jeder Impfstoff enthielt 20 ug GD3 oder 15 ug Disialyllactose plus 1 ug QS-21 in einem Gesamtvolumen von 0,1 ml PBS/Maus. Die Mäuse wurden vor und 2 Wochen nach der Impfung aus dem hinter dem Auge liegenden Sinus entblutet, sofern nicht anders angegeben.
Herstellung des GD3-Koniugats. GD3 (2 mg) wurde durch Behandlung mit Ultraschall in 2 ml Methanol gelöst und auf -78ºC in einem Ethanol/Trockeneis-Bad abgekühlt. Ozon wurde in einem Ozon-Generator (Del Industries, San Luis Obispo, CA) erzeugt und 30 Minuten unter kräftigem Rühren durch die Probe geleitet (Criegee, 1957; Wiegandt und Baschang, 1965). Der Überschuß an Ozon wurde 10 Minuten lang durch Stickstoff verdrängt. Es wurden 100 ul S(CH&sub3;)&sub2; zugegeben (Pappas et aL, 1966), die Probe wurde 30 min bei -78ºC belassen und dann 90 min bei Zimmertemperatur unter kräftigem Rühren. Die Probe wurde unter einem Strom von Stickstoff getrocknet und durch HPTLC überprüft. Das langkettige Aldehyd wurde durch Zugabe von 2 ml n Hexan zu der trockenen Probe abgetrennt, darauf erfolgte 5 min eine Behandlung mit Ultraschall und eine 15- minütige Zentrifugation bei 2.000 · g. Das n-Hexan wurde vorsichtig abgezogen und verworfen, und die Probe wurde unter einem Strom von Stickstoff getrocknet. Das gespaltene GD3 und das native GD3 wurden durch HPLC (Waters, System 501, Milford, MA) unter Verwendung einer C18-Umkehrphasen-Säule (10 · 250 mm, Ramm Instruments, Ridgefield, NJ) getrennt. Die Ganglioside wurden mit Methanol eluiert, bei 214 nm überprüft, und die Fraktionen wurden ebenfalls durch HPTLC untersucht. Fraktionen, die gespaltenes GD3 enthielten, wurden vereinigt und bei 37ºC mit einen Rotavapor (Bucht Schweiz) eingedampft. Das gespaltene GD3, der Proteinträger in PBS und 2 mg Natriumcyanoborhydrid wurden unter sanftem Schütteln 48 h bei 37ºC inkubiert. Nach 16 h wurde 1 weiteres mg NaCNBH&sub3; zugegeben. Das Voranschreiten der Kopplung wurde über HPTLC überprüft. Im Lösemittel 1 und im Lösemittel 2 wanderten die GD3-Proteinkonjugate nicht und erschienen als eine Resorcin-positive Bande am Ursprung. Das Gemisch wurde 48 h lang durch einen Dialyseschlauch mit 1.000 MWCO (Durchlässigkeit bis 1.000 Da) mit drei Austauschen von jeweils 4 l PBS bei 4ºC dialysiert und wurde dann durch ein Extractigel- Detergenz-entfernendes Gel (Pierce) zur abschließenden Reinigung des nicht konjugierten GD3 laufen gelasssen. Die Proben wurden lyophilisiert, und ihr Protein- und Gangliosidgehalt wurde mit den Biorad-Proteintest und durch Bestimmung der Neuraminsäure gemäß Svennerholm (1957) bestimmt.
Disialyllactose wurde wie vorher beschrieben (Nicolai et al., 1978) aus Rinder- Kolostrum isoliert. Das Kohlenhydrat wurde an das Protein durch reduktive Aminierung (Gray, 1974) angeheftet. 10 mg Disialyllactose wurden 14 Tage mit 2 mg der Proteine in 2 ml PBS bei 37ºC inkubiert. Zu Beginn wurden 2 mg Natriumcyanoborhydrid zugegeben, und 1 mg wurde zusätzlich alle 3 Tage zugegeben. Die Kopplung wurde durch HPTLC in Lösemittel 2 überprüft. Die Disialyllactose-Konjugate wurden durch Dialyse über Dialysemembranen mit 1.000 MWCO gereinigt, darauf erfolgt eine Lyophilisation. Der Protein- und der Gangliosidgehalt wurde wie vorstehend beschrieben bestimmt. Die Disialyllactose wurde auch gemäß eines Verfahrens, das durch Roy und Laferriere (1990) beschrieben wurde, mit Proteinen konjugiert. Während dieses Verfahrens bildeten sich zuerst N-acroloylierte Glycopyranosylamin-Derivate des Oligosaccharids, darauf erfolgte die Konjugation durch Michael-Addition an Aminogruppen des Proteins. Die Reinigung und die Bestimmung des Protein- und des Gangliosidgehalts wurde wie vorstehend beschrieben durchgeführt.
Bestimmung der IgEl-Unterklasse. Die Bestimmung der IgG-Unterklasse wurde unter Verwendung von für die Unterklassen spezifischen sekundären MAKs über ELISA durchgeführt. Die sekundären MAKs wurden in der niedrigsten Verdünnung verwendet, die keine Reaktionsfähigkeit mit den Präseren oder den negativen Kontrollseren aufwies. An Anti-Maus-(Antikörper) aus Ziegen gekoppelte alkalische Phosphatase wurde als dritter Antikörper in einer Verdünnung von 1 : 200 verwendet.
FACS-Analyse von Maus-Antiseren. Eine Suspension von einzelnen Zellen der Melanom-Zelllinie SK-MEL-28 wurde nach Behandlung mit 0,1% EDTA in PBS erhalten, darauf erfolgte eine Passage durch eine 26 1/2 Loch-Nadel. Die Zellen (3 · 10&sup5;) wurden 30 Minuten mit 40 ul des 1 : 20 verdünnten Immun- oder Präimmunserums auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit 3%-igem fötalem Kälberserum in PBS gewaschen. Dreissig ul verdünntes (1 : 50) mit Fluorescein-Isothiocyanat markiertes Anti-Maus-IgG aus Ziegen (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, AL) wurden als sekundärer Antikörper zugegeben, darauf erfolgte eine 30-minütige Inkubation auf Eis. Die Zellen wurden dreimal wie vorstehend gewaschen und in 500 ul 3%-igem fötalem Kälberserum in PBS resuspendiert und durch Durchfluß-Cytometrie (FACScan, Becton Dickinson, San Jose, CA) untersucht.

ERGEBNISSE

Herstellung und Charakterisierung der GD3-Impfstoffe

GD3 aus Rinder-Buttermilch wurde unter Verwendung von Ozon an der C4-C5- Doppelbindung im Ceramidteil selektiv gespalten. In Methanol scheinen Methoxyperoxide Zwischenprodukte darzustellen, die leicht durch Dimethylsulfit reduziert werden. Das Ergebnis dieser Spaltung war ein GD3-Derivat mit einer funktionellen Aldehydgruppe an der Stelle der früheren Doppelbindung im Ceramidteil und die Eliminierung eines langkettigen Aldehyds (Fig. 1). Erfolgreich gespaltenes GD3 wanderte unter nativem GD3, und aufgrund gleichzeitig gespaltener ungesättigter Fettsäuren erschien es als eine Doppelbande bei der HPTLC (vergleiche mit der HPTLC, Teilabbildung in Fig. 1). Die densitometrische Auswertung der HPTLC offenbarte eine Spaltung von > 70% des GD3, das aus Rinder- Buttermilch isoliert worden war. Die anfänglichen Experimente mit verlängerten Ozon- Behandlungszeiten veränderten das Verhältnis nicht, was anzeigt, dass bis zu 30% des GD3 aus dieser Quelle aus Sphinganin- oder Phytosphingvsin-Analoga besteht. Die Spaltung von GD3 bei -78ºC mit einer Reaktionszeit von bis zu 1 h, in Abhängigkeit von der verwendeten Menge an GD3, erwies sich als optimal. Das gespaltene GD3 hatte in sauren und neutralen Phosphatpuffern nur bis zu 72 h Bestand, aber mit steigender Menge eines Nebenprodukts. Aufgrund der B-Eliminierungsreaktionen fand die Freisetzung des Oligosaccharidteils von GD3 über die Zeit in steigendem Maße statt, so wie früher beschrieben wurde, dass es leicht bei einem basischen pH-Wert stattfindet (Wiegandt und Baschang, 1965). Der aus GD3 freigesetzte Kohlenhydratteil wanderte im Lösemittel 1 nicht, wanderte aber im Lösemittel 2, das zur Trennung der Oligosaccharide verwendet wurde (nicht gezeigt), an der gleichen Stelle wie die aus Rinder-Kolostrum isolierte Disialyllactose. Die verminderte Hydrophobizität des gespaltenen GD3, verglichen zu nativem GD3, erlaubte seine Abtrennung durch HPLC mit C18-Umkehrphasen-Säulen. Unter Verwendung einer isokratischen Elution mit Methanol, führte gespaltenes GD3 mit Proteinen zur Bildung von Schiffschen Basen zwischen dem modifizierten Gangliosid und den s-Aminolysylgruppen. Diese wurden unter Verwendung von Cyanoborhydrid reduziert, um stabile sekundäre Amino-Bindungen zwischen dem Gangliosid und dem Protein zu bilden (Borch et al., 1971). Das Reduktionsmittel war selektiv, und Aldehydgruppen wurden in Phosphatpuffern bei pH-Werten von 6,5-7,5 nicht reduziert. Die Reaktion wurde durch HPTLC überprüft, und es wurden veränderte relative Verhältnisse zwischen gespaltenem GD3 und einer Resorcin-positiven Bande beobachtet, die am Ursprung erschien. Diese Bande zeigt die Bildung der Neo-Glycokonjugate an. Die Reaktion war normalerweise nach 48 h Inkubation bei 37ºC abgeschlossen. Disialyllaetose war leicht durch Dialyse zu entfernen und überschüssiges gespaltenes GD3 durch Passage über eine Detergens entfernende Säule. Der Grad der Kopplung wurde durch die Bestimmung der Sialinsäure und des Protein bestimmt. Das Gewichtsverhältnis von GD3 zu Protein in den Konjugaten hing von der Zugänglichkeit der Lysin-Gruppen in den verschiedenen Proteinen ab und ist in Tabelle 1 angegeben. Die durchschnittliche Ausbeute des an Proteine gekoppelten GD3 betrug 30%.
Der Kohlenhydratteil von GD3, die Disialyllactose, wurde an Proteine unter Verwendung von zwei unterschiedlichen Verfahren gekoppelt. Die Konjugation von Disialyllactose wurde durch reduktive Aminierung durchgeführt und führte zur offenen Ringform der an die Proteine konjugierten Glucose (Gray et al., 1978). Dieses Verfahren erforderte eine lange Inkubationzeit der Oligosaccharide mit den Proteinen, und die Ausbeuten waren geringer als 20%. Das zweite Verfahren zur Konjugation des Oligosaccharids (Roy und Laferriere, 1990) führte zu einem geschossenen, endständigen, an Proteine gekoppelten Glucosering. Tabelle 1 Reziproke ELSIA-Titer gegen GD3
aKLH: Keyhole-Limpet-Hämocyanin, cBSA: kationisiertes Rinderserumalbumin, OMP: äußere Membranproteine aus Meningococcus, MAP: Multiples antigenes Peptid, Polylysin: Poly-L-Lysin
bn.d.: nicht getestet
coffener Ring
dgeschlossener Ring

Serologische Antwortreaktionen gegen GD3 nach der Impfung mit GD3-Protein-Konjugat- Impfstoffen

Die Präimmunseren zeigten keine Reaktionsfähigkeit von IgM oder IgG mit GD3. Die Immunisierung mit 20 ug GD3 alleine oder vermischt mit 10 ug des Adjuvans QS-21 GD3- induzierte keine Antikörper (Tabelle 1). Einige Gruppen der Mäuse, die mit 20 ug mit an Proteine konjugiertem GD3 plus 10 ug QS-21 immunisiert worden waren zeigten erhöhte Immunantworten gegen GD3. Das GD3-Poly-L-Lysin-Konjugat, das eine hohe Dichte an GD3-Epitopen darstellt, induzierte eine IgM-Antwortreaktion mit mittlerem Titer (Bereich 1/20-1/320) und keine IgG-Antwortreaktion. Die mit GD3 konjugierten äußeren Membranproteine von Neisseria meningitidis (GD3-OMP) induzierten ebenfalls einen mittleren IgM-Titer (Bereich 1/20 - 1/320) und einen niedrigen IgG-Titer (Bereich 1/20 - 1/80). Nur eine Maus zeigte nach der Immunisierung mit GD3-OMP eine IgM- Antwortreaktion mit einem hohem Titer von 1/1280 und einen hohen IgG-Titer von 1/2560. GD3, das mit kationisiertem BSA (GD3-eßSA) konjugiert worden war, zeigte bei dem ELISA einen niedrigen IgM-Titer (Bereich 1/20 - 1/80) und einen hohen IgG-Titer (Bereich 1/20-1/2560). Das synthetische MAP-Peptid, das ein Malaria-T-Zellen-Epitop enthält, stellt 8 freie Aminogruppen an seinem aminoterminalen Ende bereit von denen 4 mit GD3 konjugiert werden konnten. GD3-MAP induzierte niedrige IgM-Titer (Bereich 1/20-1/160), und nur eine Maus produzierte eine IgG-Antwortreaktion mit einem niedrigen Titer von 1/40. GD3, das an KLH konjugiert worden war (GD3-KLH), induzierte, verglichen mit anderen Konjugaten, die größte Antwortreaktion mit dem höchsten IgM-Titer (Bereich 1/20-1/2560) sowie die IgG-Antwortreaktion mit dem höchsten Titer (Bereich 1/40-1/10240). Die Immunisierung mit den beiden Arten der Disialyllactose-Protein-Konjugate induzierte nur IgM mit niedrigem Titer, das mit dem GD3-Gangliosid kreuz reagierte (Bereich 1/20 - 1/160) und keine signifikante IgG-Antwortreaktion.

Die Spezifität der mit GD3 reagierenden Seren, untersucht durch Immun-Dünnschicht- Chromatographie

Immun-Dünnschicht-Chromatographie (ITLC) erlaubt die Untersuchung von GD3- Antiseren mit Gangliosid-Extrakten aus menschlichem Gewebe und (wurde durchgeführt), um die Spezifität gegen die aus Tumoren stammenden Ganglioside zu bestimmen. Beispiele für ITLCs mit menschlichen Gewebeextrakten und IgM- und IgG-Seren mit hohen Titern, die durch Immunisierung mit dem GD3-KLH-Konjugat induziert wurden, werden in den Fig. 3a und 3b gezeigt. Die Seren wurden bei einer Verdünnung won 1/150 gegen die Gangliosid Extrakte aus menschlichem Hirn, Neuroblastomen, Melanomen, sowie gegen das aus Rinder- Buttermilch isolierte Immunogen GD3 (bbm) hin untersucht. Die Reaktionsfähigkeit bei der ITLC wurde mit der mit Resorcin gefärbten HPTLC verglichen, die die Gesamt-Gangliosid- Zusammensetzung aufzeigt, die in diesen Geweben gefunden wurde. Das normale Hirngewebe enthält überwiegend GM1, GD1a, GD1b und GT1b, während der Extrakt aus Neuroblastomen zusätzlich die Haupt-Ganglioside GD2 und GM2 enthält, und der Melanom- Extrakt enthält hauptsächlich GM3 und GD3. Die IgG-Antiseren zeigten in allen drei untersuchten Geweben nur eine spezifische Reaktionsfähigkeit mit GD3 (Fig. 3a) ebenso wie der Kontroll-MAK R24. Andererseits zeigten die IgM-Antiseren (Fig. 3b) im Hirnextrakt eine leichte Kreuzreaktivität mit strukturell verwandten Gangliosiden und Sulfatid. Die Immunantworten, die durch Impfung mit anderen GD3-Konjugaten induziert worden waren, zeigten die gleiche spezifische Reaktivität, waren aber schwächer, und es mußten höher konzentrierte Antiseren verwendet werden (nicht gezeigt). Die Antiseren mit hohem Titer, die durch ELISA in Mäusen identifiziert wurden, die mit GD3-cBSA immunisiert worden waren, zeigten bei der ITLC einen hohen Hintergrund. Bei diesen Seren wurde eine Vielzahl von Blockierungs-Reagenzien erfolglos eingesetzt. Es konnte keine spezifische Reaktivität mit GD3 im Gewebsextrakt nachgewiesen werden.

Spezifität der mit GD3 reaktiven/reagierenden Seren durch Dot-Blot-Immunfärbungen

Die Spezifität aller IgM- und IgG-Antiseren mit hohem Titer (> 1/160 bei ELISA) wurde mit den gereinigten Gangliosiden GM3, GD2, GD I b, GD3 und GT3, die aus Rinder- Hirn oder -Buttermilch isoliert worden waren, und mit GD3, das aus menschlichem Melanomgewebe isoliert worden war, untersucht. Diese strukturell verwandten Ganglioside wurden auf Nitrocellulose-Streifen in ähnlichen Mengen aufgetragen und mit den Immunseren reagieren gelassen. Ein Beispiel für ein Dot-Blot-Immunfärbungs-Experiment mit Seren, die vor und nach der Immunisierung aus Mäusen, (die) mit GD3-KLH und GD3- OMP (geimpft worden waren), gewonnen wurden, wird in Fig. 4 gezeigt. Die Präseren zeigten keinerlei Reaktivität mit diesen Gangliosiden. Die Seren, die nach der Immunisierung mit GD3-KLH erhalten wurden, zeigten eine spezifische IgM- und IgG-Reaktivität mit GD3 aus Rinder-Buttermilch (dem Immunogen) sowie mit GD3, das aus menschlichem Melanomgewebe isoliert worden war. In einigen Fällen wurde eine Kreuzreaktivität mit GT3 beobachtet, eine Reaktion, die auch mit der positiven Kontrolle MAK R24 beobachtet worden war (Houghton et al., 1985). Die Seren mit hohem Titer aus Mäusen, die mit GD3-cBSA immunisiert worden waren, zeigten nur eine Hintergrund-Reaktivität, aber es wurde keine spezifische Reaktivität gegen irgendein Gangliosid nachgewiesen (nicht gezeigt). Die Dot- Blot-Reaktivität, die durch andere GD3-Konjugate induziert worden war, war für GD3 spezifisch (nicht gezeigt). Die Ergebnisse zeigen an, dass in Mäusen mit GD3-Protein- Konjugaten, spezifische IgM- und IgG-Antwortreaktionen induziert werden können, und dass die stärkste Reaktivität durch GD3-KLH-Konjugate induziert wurde. Das Konjugationsverfahren scheint die wichtigen Epitope auf der GD3-Oligosaccharidkette zu erhalten, und die GD3-Konjugate induzierten keine Kreuzreaktivität mit strukturell verwandten Gangliosiden.

Die Reaktivität der Zelloberfläche mit Immunseren, bestimmt durch FACS-Analyse

Die Seren aus Mäusen wurden auf (ihre Fähigkeit zur) Bindung an Zellen der Melanom-Zelllinie SK-MEL-28 hin untersucht, eine Zelllinie, die dafür bekannt ist, dass sie auf der Zelloberfläche CrD3 exprimiert. Ein repräsentatives Beispiel für eine FACS-Analyse unter Verwendung eines mit Fluorescein-Isothiocyanat markierten sekundären Anti-Maus- Antikörpers aus Ziegen wird in Fig. 5 gezeigt. Es wurden Seren vor und nach der Immunisierung mit GD3-KLH und QS-21 untersucht. Das Präimmunserum färbte 8% der Zielzellen, das Immunserum 92%.

DISKUSSION

Hier wird ein Ansatz zur Konstruktion von Gangliosid-Konjugat-Impfstoffen beschrieben, um 1) eine Kopplungsreaktion mit Proteinen zu etablieren, die auf unterschiedliche Tumor-Ganglioside anwendbar ist, 2) die Immunogenität von GD3 als dem Haupt-Gangliosid, das mit Melanomen verbunden ist, zu steigern und 3) das wirkungsvollste Trägerprotein zu definieren. Die Konjugation des Gangliosids muß ohne Veränderung des die Immunität dominierenden Kohlenhydratrests durchgeführt werden. Es wurde gezeigt, dass die Modifikation von GD3 in seinem Kohlenhydratteil, wie zum Beispiel die Umwandlung von Carboxylgruppen zu Aminogruppen, die Immunogenität der synthetischen Antigene erhöht, aber es gab keine signifikante kreuzreaktive Antikörperantwortreaktion mit nativem GD3 (Ritter et al., 1990b). Folglich hatte dieser Ansatz die Kopplung von GD3 über seinen Ceramidteil ohne eine Veränderung des Kohlenhydratteils zum Ziel. Das Ceramid, ein Kennzeichen aller Ganglioside, wurde mit Ozon an der C4-Position der Sphingosinbase gespalten, und es wurde eine funktionelle Aldehydgruppe eingeführt. Die Kopplung an Proteine wurde durch reduktive Aminierung verwirklicht, um eine stabile Aminbindung zwischen dem Gangliosid und den &epsi;-Aminolysyl-Gruppen der Proteine zu bilden. Die Spaltung der Ganglioside durch Ozonolyse und die anschließende Konjugation wurde bisher noch nicht beschrieben, und es wurde angenommen, dass das Aldehyd-Zwischenprodukt der Ganglioside instabil ist. Es wurde eine Zerlegung berichtet, wenn, durch den Angriff von Hydroxyl-Ionen unter alkalischen Bedingungen initiiert, eine Verlagerung der Doppelbindung stattfindet und die β-Eliminierung die Freisetzung des Oligosaccharidteil verursacht (Kanfer und Hakomori, 1983, Wiegandt und Baschang, 1965). Es wurde herausgefunden, dass die Aldehyd-Funktion bei neutralem pH-Wert ausreichend stabil ist, so dass Schiffsche Basen mit Aminogruppen von Proteinen leicht gebildet werden und die β-Eliminierung nur in geringem Ausmaß stattfindet. Eine Gesannausbeute von 30% war vergleichsweise so effizient wie für die Umwandlung von Gangliosiden in Lysoderivate beschrieben wurde (Neuenhofer et ab, 1985). Das Aldehyd-Derivat von GD3 reagierte bei der Immun-Dünnschicht- Chromatographie (ITLC) nicht mehr mit dem MAK R24. Ein ähnliches Phänomen wurde in Zusammenhang mit der Reaktivität von MAK M2590 mit GM3 beschrieben, und die Reaktivität war von der Länge der Acylkette abhängig (Itonori et al., 1989). Andererseits zeigten die GD3-Konjugate Reaktivität mit dem MAK R24 bei der ITLC und der Western- Blot-Analyse, was anzeigt, dass die die Immunität dominierenden Epitope in den neuen GD3- Glycokonjugaten wieder hergestellt wurden.
Nachdem das Konjugationsverfahren zur Erzeugung von Gangliosid-Impfstoffen etabliert war, mußten geeignete Trägerproteine ausgewählt werden. Lowell et al. (1988) beschrieb ein elegantes Impfstoffsystem, das Antikörperantwortreaktionen mit hohem Titer induzierte, durch Komplexbildung von bakteriellen Kohlenhydrat- und Peptidantigenen über einen hydrophoben Fuß/Anker in die äußeren Membranproteine (OMP) von Neisseria meningitidis und eine Wirksamkeit ohne zusätzliches Adjuvans (Donnelly, 1991). Dieses System war, aufgrund ihrer amphipathischen Natur, direkt auf Ganglioside anwendbar. In vorangegangenen Experimenten adsorbierten die Anmelder Ganglioside durch hydrophobe Wechselwirkung an diese Proteine und waren in der Lage, IgM-Antwortreaktionen mit hohem Titer zu induzieren (Livingston et al., 1993b). Es wurde eine kovalente Anheftung verwendet, aber das GD3-OMP-Konjugat induzierte nur gelegentlich IgG-Antwortreaktionen, und die IgM-Antwortreaktion übertrafnicht die Ergebnisse der vorangegangenen Versuche ohne die Konjugation von GD3. Kationisiertes BSA, von dem berichtet wurde, dass es einen potenten Immunmodulator für Proteinantigene darstellt (Apple et al., 1988), war in der Lage, die spezifische Immunantwort auf schwach immunogene Proteine nach der Konjugation zu erhöhen. GD3-eßSA-Konjugate induzierten nur eine mittlere IgM-Antwortreaktion, aber bei dem ELISA wurden IgG-Antwortenreaktionen untersucht (gefunden). Eine weitere Untersuchung dieser Antiseren mit hohem Titer über ITLC oder durch Dot-Blot- Immunfärbungen zeigte an, dass die Antwortreaktion nicht für GD3 spezifisch war. Ein anderer ansprechender Ansatz zur Konstruktion von Impfstoffen wurde durch J. Tam et al. (Tam, 1988; Tam und Lu, 1989) als multiples antigenes Peptidsystem (MAP) beschrieben. Basierend auf einem oligomeren verzweigten Kern aus Lysin, bestehen MAPs aus vier oder acht verzweigten Peptidarmen, die B- und T-Zellen-Epitope enthalten. Die Immunantwort gegen Peptide wurde drastisch erhöht, wenn diese Konstrukte im Vergleich zu den Peptiden mit den B- oder T-Zellen-Epitopen alleine verwendet wurden. Wenn GD3 an das aminoterminale Ende einer MAP-Struktur angeheftet wurde, die eine Malaria-T-Zellen- Epitop enthielt, wurden nur mittlere IgM- und keine IgG-Antwortreaktionen gegen GD3 nachgewiesen. Obwohl dieser Ansatz für synthetische Peptide sehr wirkungsvoll ist, scheint er für Gangliosid-Impfstoffe von geringer Nützlichkeit zu sein. Es wurde berichtet, dass Anti- Gangliosid-Antikörper zwischen aus Tumor stanimendem GM3 und GM3 auf normalem Gewebe wegen ihrer unterschiedlichen Zelloberflächendichte unterscheiden können (Nores et al., 1987). Man nahm an, dass die Konjugation von GD3 an Polylysin eine hohe Dichte an GD3-Epitopen darstellt, die auf einem einzigen Molekül kombiniert waren. Die Antwortreaktion auf GD3-Polylysin war mittelmäßig, es war nur eine IgM-Anwortreaktion mit mittlerem Titer und keine IgG-Antwortreaktion nachweisbar. Letztlich waren die Mäuse, die mit an Keyhole-Limpet-Hämocyanin konjugiertem GD3, GD3-KLH, immunisiert worden waren, in der Lage, die IgM- und IgG-Antwortreaktionen mit den höchsten Titern zu erzeugen und dies signifikant höher als diejenigen, die mit den vorherigen Impfstoffen erzeugt worden waren.
Als diese Seren durch Immunfärbungstests untersucht wurden, wurde herausgefunden, dass sie für GD3 in menschlichen Gewebeextrakten hoch spezifisch waren. Experimente des Zeitverlaufs der IgM-Immunantwortreaktion zeigten eine ähnliche Charakteristik, wie sie in den vorangegangenen Versuchen beobachtet worden war (Fig. 2). Der maximale Peak-IgM- Titer wurde nach der dritten Impfung erhalten, wenn in zweiwöchigen Intervallen verabreicht wurde. Die Antwortreaktion nahm rasch ab, und eine kontinuierliche Impfung induziert keine signifikante Verstärkung (Booster-Wirkung) der Antikörperantwort. Dies ist der erste Bericht, der die Induktion der IgG-Antwort mit hohem Titer unter Verwendung von Gangliosid-Impfstoffen aufzeigt. Diese Antwortreaktion dauerte signifikant länger als die IgM-Antwortreaktion und wurde durch kontinuierliche Impfung verstärkt, war aber nicht vergleichbar mit der exponentiellen Potenzierung der Antwortreaktion, die oft bei Proteinantigenen beobachtet wird. Die Unterklasse wurde hauptsächlich als IgG1 bestimmt, und es ist nicht klar, ob von T-Zellen abhängige Wege mit den Gangliosid-Konjugat- Impfstoffen aktiviert wurden. Obwohl die Bedeutung der Hilfe von T-Zellen bei der Reifung der B-Zellen nicht angezweifelt wird, ist die Regulation der Antikörper-Klasse strittig, und verschiedene Berichte haben gezeigt, dass das Umschalten der Isotypen (isotype switch) mit der Aktivität der T-Helferzellen möglich ist (Teale und Abraham, 1987). Es wurde gefunden, dass Konjugate, die ausschließlich den Oligosaccharidteil von GD3 enthielten, nicht mit dem MAK R24 reagierten und nicht in der Lage waren, eine signifikante Immunantwort gegen das GD3-Gangliosid zu induzieren. Die Modifikation der Glucose am reduzierenden Ende der Oligosaccharidkette während der Konjugation oder der fehlende Teil des Ceramids könnten die korrekte Präsentation des Epitops und die Erkennung durch das Immunsystem beeinflussen. Beide zur Konjugation verwendeten Verfahren waren weniger wirksam, und die Ausbeuten waren gering. Die Induktion einer spezifischen Immunantwort gegen mit Tumoren verbundene Ganglioside mit weniger wirksamen Impfstoffen in Patienten, induzierte bereits Immunantworten und war mit einer besseren Prognose verbunden. Gangliosid-Konjugat- Impfstoffe zeigten ihre Fähigkeit, lang andauernde und spezifische IgG-Antwortenreaktionen zu induzieren bei Mäusen, was vermuten läßt, dass sich insbesondere das GD3-KLH- Konjugat bald als nützlicher Tumor-Impfstoff bei Melanompatienten herausstellen wird.

Zweite Reihe der Experimente

Ein Phase I-Versuch mit dem immunologischen Adjuvans QS-21 bei Melanompatienten, die mit dem kovalent an KLH angehefteten Gangliosid GM2 geimpft worden waren.
Ziel: Bestimmung der optimalen sicheren Dosis des immunologischen Adjuvans QS-21 zur Induktion von Antikörpern gegen GM2.

HINTERGRUND

Patienten mit Melanomen des AJCC-Stadiums III besitzen eine Rückfallrate bei zwei Jahren und eine Sterblichkeitsrate nach drei Jahren von 60-70% (Hilal et al., 1981; Eilber et al., 1976). Patienten mit einem Stadium IV-Melanom, die nach Operation frei von Krankheit sind, haben eine noch verhängnisvollere Prognose. Es ist keine Behandlung bekannt, die diese Raten verändert. Die Standardbehandlung eines Stadium IV-Melanoms nach der Operation besteht aus enger Beobachtung.
Es wurde gezeigt, dass einige Patienten mit Melanomen, in ihren Seren Antikörper aufweisen, die mit eng begrenzten Melanocyten-Differenzierungs-Antigenen reagieren. In einigen Fällen wurde beobachtet dass die Anwesenheit dieser Antikörper mit einem unerwartet günstigen Verlauf verbunden war (Livingston et al., 1987). Da nur einige Patienten diese Antikörper in ihrem Serum besitzen, wurden Versuche unternommen, die Antikörperbildung durch Immunisierung der Patienten mit Melanom-Impfstoffen, die die betreffenden Antigene enthalten, zu induzieren. Die Impfstoffe, die aus ganzen Zellen hergestellt worden waren, stellten sich in dieser Hinsicht als nicht wirksam heraus (Livingston et al. 1982). Jetzt werden gereinigte Antigene, anstelle der ganzen Melanomzellen zur Antikörperherstellung vorgeschlagen. In kürzlich fertiggestellten Versuchen wurden Patienten mit BCG-GM2 geimpft, und es wurde eine kurzzeitige IgM-Antikörperproduktion bei 33 von 44 Patienten beobachtet (Livingston et al., 1989; Livingston, 1989), aber IgG-Antikörper- Antwortreaktionen wurden selten beobachtet.
Leistungsfähige Adjuvanzien oder andere Ansätze zur Steigerung der Immunogenität von Gangliosiden wie z. B. GM2, und insbesondere zur Induktion einer IgG-Antwortreaktion, werden laufend gesucht. Es wurde gefunden, dass bei der Induktion einer IgG- Antwortreaktion gegen Ganglioside in Mäusen, die kovalente Anheftung an Keyhole-Limpet- Hämocyanin am erfolgreichsten war. Die Grundlage dafür ist das Konzept der aufgespaltenen Toleranz. Untersuchungen der immunologischen Toleranz und von Wegen sie zu überwinden haben gezeigt, dass in einer Vielzahl experimenteller Systeme die Nichtantwortfähigkeit von T-Zellen rascher induziert und leichter aufrechterhalten wird, als die Nichtantwortführgkeit von B-Zellen (Romball et al., 1984; Weight, 1977). Die Spiegel des zirkulierenden Antigens, das zur Aufrechterhaltung der T-Zellen-Toleranz geeignet ist, genügen häufig nicht, die Toleranz der B-Zellen aufrecht zu erhalten. Folglich können, wenn die Hilfe von T-Zellen zur Verfügung gestellt wird (wie durch leistungsfähige nicht relevante Antigene wie z. B. KLH, die kovalent an das gewünschte Immunogen angeheftet sind), Antikörper gegen tolerierte, von T-Zellen abhängige, Antigene induziert werden. Dieser Ansatz wurde erfolgreich verwendet, um IgG-Antikörper gegen eine Vielzahl von Kohlenhydratantigenen in Versuchstieren zu induzieren (Kundu et ah, 1980; Gray, 1978; (lang und Rittenberg, 1981; Longenecker et al., 1987) und kürzlich gegen das H. influenza-Polysaccharid-Antigen in Kleinkindern.
Das Molekulargewicht von KLH ist sehr variabel, beträgt aber annähernd 2 · 10&sup6; Dalton. Es wurde durch verschiedene Forscher (Berd et al., 1982) mit einer Dosis von 1 mg Patienten intradermal injiziert, um die Hypersensitivität des verzögerten Typs (DTH) zu induzieren. Pyrogen-freies KLH wurde durch Biomira Inc. (Edmonton, Kanada) hergestellt und mit einer hohen Epitopdichte (1000/1) kovalent an GM2 gekoppelt. In Mäusen wurden IgG-Antwortreaktionen mit hohem Titer gegen GM2 unter Verwendung dieser Präparate, die mit immunologischen Adjuvanzien gemischt worden waren, induziert.
Von den in vorklinischen Studien untersuchten immunologischen Adjuvanzien mit KLH-Konjugat-Impfstoffen wie z. B. dem T-Antigen-KLH, war QS-21 am wirkungsvollsten. Es wurden IgG-Antikörper-Titer über 1/4000 und eine potente DTH bei den meisten Mäusen beobachtet. T-KLH alleine führt zu einem mittleren Titer von 1/160 ohne eine DTH. QS-21 ist ein Kohlenhydrat, das aus der Rinde des südamerikanischen Baums Quillaja saponaria Molina extrahiert wird. Die Monosaccharid-Zusammensetzung, das Molekulargewicht, die Adjuvanzwirkung und die Toxizität einer Reihe dieser Saponine wurde beschrieben (Kensil et al., 1991). QS-21 wurde aufgrund seiner Adjuvanzwirkung und dem Fehlen der Toxizität ausgewählt. Es hat sich als nicht giftig und hoch wirksam bei der Steigerung der Immunogenität eines FeLV-Untereinheiten-Impfstoffs bei Katzen (Marciani et al.) und eines rekombinanten HIV-1-Impfstoffs bei Rhesusaffen herausgestellt.
Da darüber hinaus gezeigt wurde, dass einige Patienten mit Melanomen Suppressor- Zellen besitzen, die die Immunisierung behindern, und da diese Zellen durch eine niedrige Dosis Cyclophosphamid gehemmt werden können (Livingston et al., 1987b), wird jeder Patient vor der ersten Impfung eine niedrige Dosis Cyclophosphamid erhalten. Es wurde herausgefunden, dass dieser kombinierte Ansatz die Immunogenität von Glycolipiden und anderen Antigenen in Versuchstieren und in Melanompatienten verbessert (Livingston et al. 1987a; Livingston et al., 1989).

Studie einer Population

Es kommen Patienten mit einen hoch risikoreichen bösartigen Tumor der AJCC- Stadien III oder IV zwei bis acht Wochen nach der operativen Entfernung in Frage, deren Objektträger aus der Pathologie durch das Department of Pathology des Memorial Hospitals beschrieben wurden, und die klinisch frei von Krankheit sind. Sie müssen einen Aktivitätsindex von > 80 (Karnofsky) und eine erwartete Überlebenszeit (abgesehen von ihrem Melanom) von mindestens 5 Jahren besitzen. Schwangere Frauen, Patienten mit Allergien gegen Meeresfrüchte und Patienten mit Creatin- oder Bilirubin-Werten von > 2,0 werden ausgeschlossen. Die Patienten können eine vorangegangene Bestrahlung, eine Chemotherapie oder eine Immuntherapie erhalten haben (die 8 Wochen vor der Impfung abgeschlossen wurde).

Bewertung der Behandlung

An den Patienten muß eine umfangreiche physische Untersuchung am Memorial Hospital und eine Brust-Röntgenaufnahme, CBC-, Serum-Creatinin- und Leber-Funktions- Tests innerhalb von 3 Wochen (vor) der Behandlung vorgenommen worden sein. Patienten mit unnormalen LFT- oder Brust-Röntgenaufnahme-Ergebnissen werden angenommen, wenn weitere Untersuchungen (d. h. CTT, Tomogramme, usw.) kein Melanom zeigen.

Impfstoff-Herstellung

CHEMIE UND HERSTELLUNG

ARZNEIMITTEL-STOFF

NAME UND QUELLE
Korrekter Name:
GM2-KLH synthetisches mit Tumor assoziiertes Glycokonjugat (S-TAG)
- zur Verwendung bei der aktiven spezifischen Immuntherapie GM2-HSA synthetisches mit Tumor assoziiertes Glycokonjugat (S-TAG)
- zur Verwendung bei Hautuntersuchungen von Patienten, die eine aktive spezifische Immuntherapie mit GM2-KLH durchlaufen.
Chemischer Name:
11³NeuAc-GgOse&sub3;Cer-Keykole-Limpet-Hämocyanin (KLH)
Laborbezeichnungen:
GM2-KLH Charge # 5
GM2-I-ISA Charge # 1
Hersteller: Biomira Inc. Research Centre One, Edmonton Research and Development Park, 9411-0 Avenue Edmonton, Alberta T6N 1E5 Kanada. MATERIALIEN, DIE ZUR HERSTELLUNG DES GM2-HAPTENS VERWENDET WURDEN MATERIALIEN, DIE ZUM KONJUGATIONSVERFAHREN VERWENDET WURDEN

ENTWICKLUNGSCHEMIE

Daten für GM2 und das GM2-Aldehyd:
Die Strukturen des GM2 und des GM2-Aldehyds wurden von Biomira Inc. durch ¹H- NMR-Spektroskopie, Dünnschicht-Chromatographie (TLC), FAB-MS und FT-IR charakterisiert.

STRUKTURDATEN

¹H(DMSO-d&sub6; : D&sub2;) 6 : 9,48 (d, 1 H, J = 2,0 Hz), 4,79 (d, 1H, J = 8,5 Hz, III-1), 4,26 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, II-1), 4,19 (d, 1 H, J = 8,0 Hz, I-1), 2,54 (dd, 1 H, A-3e), 1,88 (s, 3 H, Ac), 1,78 (s, 3 H, Ac), 0,85 (t, 3 H, J = 6,6 Hz, CH&sub3;).
FT-IR (KBr Cast, CM&supmin;¹): 3439, 3420, 2952, 2923, 2851, 1634, 1070 (möglicherweise das Gem Diol).
TLC Rf = 0,5 (5 : 4 : 1) CHC&sub1;&sub3;-CH&sub3;OH-0,2% wässriges CaCl&sub2;)

Daten für KLH, GM2-KLH, HSA und GM2-HSA:

Das Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) ist ein großes komplexes Protein, das aus einer Anzahl von Untereinheiten mit kleinerem Molekulargewicht zusammengesetzt ist. KLH wird aus der Keyhole-Limpet-Molluske (Megathura crenulata) extrahiert und gereinigt. KLH, HSA und die Konjugate wurden von Biomira Inc. durch Sepharose CL-4B-Gelfiltrations- Chromatographie, isoelektrische Fokussierung (IEF) und das kolorimetrische Resorcin- Salzsäure-Verfahren (1) bestimmt.
1. L. Svennerholm, Biochimica et Biophysica Acta, 24 (1957), 604-611.
2. Bei der Verwendung des Sepharose CL-4B-Gelfiltrations-Verfahrens eluierte das gesamte KLU-Proteinmolekül im Ausschlußvolumen der Säule, was anzeigt, dass das Molekulargewicht von KLH > 2 · 10&sup6; beträgt. Dieser Wert stimmt mit den (Molekulargewichts)bereichen überein, die in der Literatur für dieses Protein angegeben sind. FLUSSDIAGRAMM DER GM2-KLH-HERSTELLUNG

VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON GM2-KLH-KONJUGATEN

Die Herstellung des halbsynthetischen GM2-KLH-Glycokonjugats zur ASI und des halbsynthetischen GM2-HSA-Glycokonjugats für Hauttests wird in 5 Schritten durchgeführt:
2. Reinigung des Keyhole-Limpet-Hämocyanins (KLH)
3. Synthese des GM2-Aldehyds (Verbindung # 2).
4. Konjugation des GM2-Haptens mit KLH.
5. Diafiltration des Konjugats.

Schritt 1: Reinigung von GM2 (Verbindung # 1):

Name: GM2-Gangliosid
Abgekürzter Name: II³NeuAc-GgOse3Cer
Eine Probe des GM2-Gangliosid-Startmaterials (aus Rind), das durch FIDIA geliefert wurde, wird zur Untersuchung auf Viren versendet (8CFR-Vorschrift). Vor der Verwendung werden alle Glasgeräte mit destilliertem Aceton gewaschen, darauf erfolgt eine Waschung mit destilliertem Ethanol und dann eine Hitzetrocknung (130ºC) über 18 Stunden. Eine Säule (Michel-Miller S 795-10) aus Silicagel (30,5 g, Kieselgel 60 H, Art. 7736, E. Merck) wird bei 75 psi (SSI-Modell 300 Lo-Pumpe) unter Verwendung von 65 : 35 Chloroform: Methanol als Lösemittel gepackt. Das GM2 (200 mg) wird als konzentrierte 65 : 35 Chloroform-Methanol- Lösung aufgetragen, und die Elution wird mit diesem Lösemittel durchgeführt, gefolgt von 65 : 35 : 4 Chloroform-Methanol-Wasser. Die Fraktionen werden durch TLC (Rf 0,6, 5 : 4 : 1 Chloroform-Methanol-0,2% wässriges CaCl&sub2;) untersucht. Die GM2 enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und eingedampft, um einen cremig weißen, amorphen Festkörper zu erhalten.
Die Untersuchungen dieses Materials (Verbindung 1) bei laufendem Vorgang umfaßt ¹H-NMR und Dünnschicht-Chromatographie (TLC), um die Identität und die Reinheit dieses Gangliosids zu bestätigen. Die Ergebnisse der Untersuchungen bei laufendem Vorgang müssen die Spezifikationen erfüllen, die unter Entwicklungschemie aufgelistet sind. Wenn dieses Material als unsauber befunden wurde, wird der vorangegangene Reinigungsschritt wiederholt.

Schritt 2: Herstellung des sterilen, Pyrogen-freien Keyhole-Limpet-Hämocyanins (KLH)

Herstellung von KLH:

Das vollständige Verfahren wird in einer biologischen Sicherheitskabine der Klasse 100 durchgeführt. Das von Calbiochem gelieferte Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) wird in 100 mL steriler Pyrogen-freier, phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBSP, pH 7,5) gelöst. Diese Lösung wird 18 Stunden bei 2-6ºC inkubiert, um dem KLH zu ermöglichen sich in Lösung zu begeben. Dann wird die Lösung 30 Minuten bei 200 UpM zentrifugiert. Der Überstand wird gesammelt und eine Probe davon wird über eine Sepharose CL-4B-Gel- Säule laufen gelassen, um das Molekulargewichtsprofil des unbehandelten KLHs zu bestimmen.
Vor der Dialyse des KLHs wird die Amicon-Ultrafiltrations-Rührzelle zuerst durch viermaliges Abspülen mit sterilem Wasser zur Injektion (WZI) und dann durch Befüllung mit 95%-igem Ethanol und 2 h Rühren steril gemacht. Die Einheit wird erneut mit WZI abgespült und dann autoklaviert.
Der KLH enthaltende Überstand wird in die sterile, Pyrogen-freie 400 mL-Amicon- Diafiltrationseinheit mit einem YM 30-Filter (schneidet Molekulargewicht unter 30.000 ab) gegossen. Das Gesamtvolumen des KLHs wird dann mit sterilen, Pyrogen-freien oder wenig Pyrogen enthaltenden Puffern nacheinander auf 350 mL erhöht:
1.1 vollständiger Austausch von PBS, pH 7,5 (steril, Pyrogen-frei)
2.3 vollständige Austausche von TRIS-HCl, EDTA, pH 7,65 (steril, niedriger Pyrogengehalt)
3.2 vollständige Austausche von TRIS-HCl, EDTA, pH 7,75 mit 0,5% Desoxycholsäure
(DOC) (steril, niedriger Pyrogengehalt)
4.4 vollständige Austausche von TRIS-HCl, EDTA, pH 7,75 (steril, niedriger Pyrogengehalt)
5.3 vollständige Austausche von PBS, pH 7,5 (steril, Pyrogen-frei)
Jeder Pufferaustausch besteht aus dem Absenken des Volumens in der Amicon-Einheit auf 50 mL oder weniger und der Zugabe von Puffer, um das Volumen wieder auf 350 mL zu erhöhen.
(Das sterile, Pyrogen-freie PBS wird unter Verwendung von Chemikalien hergestellt, die 4, 5 Stunden bei 180-185ºC gebacken worden waren. Die Chemikalien werden sterilem Wasser zur Injektion (WZI) zugegeben und in einem sterilen, Pyrogen-freien Behälter gemischt. Die Chemikalien oder die anderen Puffer können nicht gebacken werden, um sie frei von Pyrogen zu machen, da sie bei solchen extremen Temperaturen schmelzen, daher werden diese Puffer in sterilem WZI in sterilen, Pyrogen-freien Behältern hergestellt und durch einen 0,22 um-Filter sterilfiltriert. Die pH-Werte des PBS und der TRIS-HCl-Puffer werden auf die erforderlichen pH-Werte unter Verwendung von sterilem, Pyrogen-freiem 2 N Natriumhydroxid eingestellt).
Das DOC in dem TRIS, EDTA, pH 7,75-Puffer dient dazu, die Pyrogene in ihre Untereinheiten mit niedrigerem Molekulargewicht zu zerlegen, die durch den Filter passieren, während das KLH-Protein in der Amicon-Einheit zurück gehalten wird (8,9).
Die KLH-Lösung wird aus der Amicon-Einheit aseptisch herausgenommen und erneut 30 Minuten bei 2.000 UpM zentrifugiert. Die Lösung wird dann in einen sterilen, Pyrogenfreien Meßzylinder übertragen, und das endgültige Volumen wird mit sterilem, Pyrogenfreiem PBS, pH 7,5 auf 75 mL eingestellt.
Dann wird der Überstand durch einen 0,22 um-Filter mit niedriger Proteinbindekapazität filtriert. Eine Probe des KLH wird durch eine Sepharose CL-4B-Säule laufen gelassen, um zu bestimmen, ob die Behandlung des KLH mit den Puffern (insbesondere dem DOC) das Molekulargewichtsprofil des KLH im Vergleich zu den Ergebnissen bei der anfänglichen Säulenchromatographie des unbehandelten KLH beeinflußt hat. Das Profil sollte sich nicht signifikant verändert haben. Ein Aliquot des KLH wird entnommen, und es wird ein BioRad-Proteintest unter Verwendung von KLH für die Standardkurve durchgeführt. Das endgültige Volumen der KLH-Lösung wird aseptisch mit sterilem, Pyrogen-freiem PBS, pH 7,5 eingestellt, um eine abschließende Proteinkonzentration von 10 mg/ml bereit zu stellen.
Ein LAL-Test wird durchgeführt, um die Konzentration der Pyrogene zu bestimmen, die in dem gereinigten KLH vorliegen. Der Gehalt an Pyrogen muß für das KLH, das bei dem Konjugationsverfahren verwendet wird, weniger als 10 EU/mg betragen.
Die isoelektrische Fokussierung (IEF) wird durchgeführt, um die Reinheit und die Identität des KLH zu kontrollieren. Frühere Chargen KLH werden parallel mitlaufen gelassen, um als Standard zu dienen.
Die KLH-Lösung wird in 10 mL-Aliquoten in sterile, Pyrogen-freie 30 mL- Serumfläschchen aufgeteilt und mit sterilen, Pyrogen-freien Butyl-Stopfen verschlossen. Das KLH wird dann bis zur Konjugation mit dem Hapten bei -20 ± 5ºC eingefroren.

Schritt 3: Synthese des GM2-Aldehyds (von Gem Diol, Verbindung # 2):

Alle Glasgeräte werden mit destilliertem Methanol abgespült und vor der Verwendung 18 Stunden hitzegetrocknet (130ºC). Eine Lösung des gereinigten GM2-Gangliosids (Verbindung #1) (40 mg) in destilliertem Methanol (10 mL) wird bei -15ºC gerührt (Trockeneis-Methanol), und Ozon-Gas (Orec 03V10-0-Ozonator) wird 7 Minuten durch die Lösung geleitet. Dann wird ein Strom Argon durch die Lösung geleitet, während die Reaktion durch TLC (5 : 4 : 1 Chloroform-Methanol-0,2% wässriges (CaCl&sub2;) kontrolliert wird. Dann werden die Lösemittel unter vermindertem Druck entfernt, und das so erhaltene Material wird in destilliertem Methanol gelöst. Dieser Lösung wird Methylsulfid (200 ml) zugegeben, und das Reaktionsgemisch wird eine Stunde bei Zimmertemperatur gerührt. Dann werden die Lösemittel entfernt, und der Rest wird mit Ethylether fein verrieben (4 · 25 mL). Der so erhaltene weiße Festkörper (Verbindung #2) wird 15 Minuten im Vakuum getrocknet, um jegliches verbliebene Lösemittel zu entfernen, und wird dann in dem anschließenden Konjugationsschritt direkt verwendet.
Aufgrund der instabilen Natur des entstehenden Aldehyds (β-Eliminierung) wird die Verbindung #2 routinemäßig nur durch TLC identifiziert. Die TLC eines typischen Durchlaufs zeigt im Allgemeinen die Anwesenheit einer kleinen Menge an Sphingosin oder eines Phytosphingosinanalogs (gleicher Rf-Wert wie Verbindung #1) und eine kleine Menge eines reduzierenden Zuckers (Rf-Wert 0,32) an.

Schritt 4: Konjugation des GM2-Haptens mit KLH (oder HSA):

Alle Manipulationen werden in einem biologischen Sicherheitskabinett der Klasse 100 durchgeführt.
Zwei Röhrchen, von denen jedes 10 mL des gefrorenen, sterilen, Pyrogen-freien KLHs (10 mg/mL) enthält, werden kurz vor der Verwendung bei Zimmertemperatur aufgetaut.
Das KLH-Protein (16 mL) wird aseptisch abgemessen und zu einer Flasche gegeben, die das lyophilisierte GM2-Hapten und einen Magnet-Rührstab enthält. Die Lösung wird 3 Minuten bei Zimmertemperatur sanft geschüttelt bis das Hapten vollständig in Lösung gegangen ist.
Das Natriumcyanborhydrid (NaßH3CN) (40 mg) wird zu der Hapten/KLH-Lösung zugegeben, dann wird die Flasche mit einem Stopfen, der mit einer sterilen Filternadel ausgestattet ist, versiegelt. Die Lösung wird sanft geschüttelt und dann über Nacht bei Zimmertemperatur inkubiert. Die Lösung wird anschließend weitere 4 Tage bei 40ºC inkubiert.

Schritt 5: Diaflitration der Glycokonjugate (GM2-KLH):

Die Inhalte des Hapten/KLH-Reaktionsgefäßes werden aseptisch in die stehle, Pyrogen-freie Aminon-Ultrafiltrations-Einheit mit einem YM-30-Filter überführt. Es wird gefilterter Stickstoff verwendet, um einen Arbeitsdruck von 16 psi in der Amicon-Einheit bereit zu stellen. Das Konjugat wird dann gegen die folgenden sterilen, Pyrogen-freien oder einen geringen Gehalt an Pyrogen enthaltenden Puffer der Reihe nach diafiltriert:
1.2 vollständige Austausche von PBS, pH 7,5 (steril, Pyrogen-frei)
2.2 vollständige Austausche von TRIS-HCl, EDTA, pH 7,75 (steril, niedriger Pyrogengehalt)
3.2 vollständige Austausche von TRIS-HCl, EDTA, pH 7,75 mit 0,5% Desoxycholsäure (DGC) (steht niedriger Pyrogengehalt)
4.4 vollständige Austausche von TRIS-HCl, EDTA, pH 7,75 (steril, niedriger Pyrogengehalt)
5.3 vollständige Austausche von PBS, pH 7,5 (steril, Pyrogen-frei).
Das Glycokonjugat wird dann aseptisch aus der Filtrationseinheit entnommen und 30 Minuten bei 2.000 UpM zentrifugiert. Dann wird der Überstand über einem 0,22 um-Filter mit niedriger Proteinbindekapazität filtriert.
Eine Probe des Glycokonjugats wird entnommen, und es werden bei laufendem Vorgang die folgenden Qualitätsuntersuchungen durchgeführt:
1. Sepharose-Gelflitration
2. Isoelektrische Fokussierung (IEF)
3. BioRad-Proteintest
Auf Grundlage der Ergebnisse des Proteintests, wird das endgültige Volumen des Glycokonjugats mit sterilem, Pyrogen-freiem (PBS), piEl-Wert 7,5 eingestellt, um eine Proteinkonzentration von 1 mg/ml zu erhalten.
Dann wird innerhalb des biologischen Sicherheitskabinetts der Klasse 100 das endgültige Glycokonjugat mit einem Überschußvolumen von 0,1 ml in 0,5 ml-Aliquoten in sterile, Pyrogen-freie, durchsichtige Borsilikat-Serumröhrchen mit roten Gummistopfen verteilt und bei -20ºC eingefroren. Während des Einfüllvorgangs wird die Luft im Einfüllbereich durch das Öffnen/Aussetzen von zwei Blut-Agarplatten gegenüber der Luft nahe des Arbeitsbereichs innerhalb der Schutzhülle für eine Mindestzeit von 30 Minuten überwacht. Diese Platten werden dann in einen 37ºC-Inkubator überführt und 1-2 Tage inkubiert. Dann werden die Platten auf Bakterien- oder Pilzkolonien hin untersucht.
Die Röhrchen werden mit einer Kennzeichnung, die den Produktnamen, die Chargennummer und die Anzahl der Röhrchen angibt, in eine Schachtel gestellt. Dann wird die Schachtel versiegelt, und eine Kennzeichnung mit der gleichen Information wird außen an die versiegelte Schachtel angebracht. Dann wird die Schachtel für 1-2 Tage zur Quarantäne in den Kühlschrank gestellt, bis sie gekennzeichnet werden kann. Nachdem die abschließenden Qualitäts-Kontrolluntersuchungen durchgeführt wurden, sind Kennzeichnungen erforderlich. Das Produkt wird durch das herstellende Personal gekennzeichnet, dann wird die Kennzeichnung durch die Qualitäts-Kontrollabteilung oder die Regulierungsbehörde bestätigt. Die endgültigen Produktunterlagen werden dann durch den Manager der Regulierungsbehörde und durch den Vizepräsidenten und den COO der Immunotherapeutika- Abteilung abgezeichnet. Dann wird das Produkt freigegeben und in einem Gefrierschrank für "Freigegebene Produkte" bei -20ºC aufbewahrt.
Jede Charge von GM2-KLH und von GM2-HSA durchläuft die folgenden abschließenden Qualitäts-Kontrolluntersuchungen:
1. Enzym-Immunotestansatz (EIA)
2. LAL-Pyrogentest
3. BioRad-Proteintest
4. Resorcin-HCl-Kohlenhydrattest
5. Pyrogentest an Kaninchen
6. Allgemeine Sicherheitsuntersuchung
7. Sterilitätest
8. Überprüfung auf Verunreinigung durch Cyanid
GM2-KLH wird durch Biomira Inc. (Edmonton, Alberta) hergestellt und unter einer IND der U.S. Food and Drug Association verwendet. Das molare GM2/KLH-Verhältnis beträgt 800/1 (tatsächlich = 200-1.400) und das Konjugat wird in einer Konzentration von 0,57 mg Konjugat pro 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) geliefert. Dies entspricht etwa 70 ug GM2-Gangliosid und 500 ug KLH pro 0,5 ml PBS. Am Tag der Impfung der anfänglichen 5 Immunisierungen, werden 0,5 ml in eine separate Spritze gefüllt und zur Verabreichung in die Klinik gebracht. Dies entspricht einer GM2-Dosis von 70 ug, eine Dosis, die in vorangegangenen Untersuchungen mit GM2 und unterschiedlichen Adjuvanzien als wirksam befunden wurde. Die abschließende (sechste) Immunisierung enthält die Hälfte dieser Dosis: 35 ug GM2 und 250 ug KLH.
QS-21 wird von Cambridge Bioscience Inc. (Woreester, MA) aus der Rinde des Quillaja saponaria Molina-Baumes durch Silica- und Umkehrphasen-Chromatographie wie vorher beschrieben (16) extrahiert. Das gereinigte GM2-KLH-Konjugat und QS-21 werden auf Sterilität durch Standard-Kulturverfahren in dem bakteriologischen Labor, auf Pyrogengehalt in Kaninchen und auf Sicherheit in Kaninchen und Mäusen hin untersucht. Die (Stoffe) werden in Aliquote verteilt und bei -15 bis -25ºC aufbewahrt. Am Tage der Impfung werden 570 ug GM2-KLH (oder 285 ug bei der sechsten Impfung) mit QS-21 gemischt, in eine separate Spritze gegeben, gekennzeichnet und in die Klinik gebracht.
Es werden vier Dosen an QS-21 verwendet, 10, 50, 100 und 200 ug, von denen jede auf ein Gesamtvolumen von 0,25 ml mit PBS verdünnt ist. Die erste Gruppe von 3 Patienten wird 6 Impfstoffe (Impfungen) erhalten, die 10 ug QS-21 enthalten, die nächsten 3 Patienten (erhalten) 50 ug QS-21, die nächsten 3 Patienten (erhalten) 100 ug QS-21 und die letzten 3 Patienten (erhalten) 200 ug QS-21. Kein Patient bekommt die nächste Dosis, bis alle 3 Patienten, die die vorangegangene Dosis erhalten haben, mindestens zwei Impfungen erhalten haben. Wenn bei der 200 ug-Dosis keine Toxizität beobachtet wird, und wenn die immunologische Reaktivität auf das GM2-Antigen und KLH über den Bereich von 50-200 ug noch kein Plateau erreicht hat, können 3 weitere Patienten mit einer Dosis von 400 ug behandelt werden. Nachdem eine sichere und maximal immunogene Dosis identifiziert worden ist, werden 6 weitere Patienten mit dieser Dosis immunisiert, um die Antikörperantwort besser definieren zu können.
Die IND für die Verwendung von GM2-KLH plus QS-21 ist im Besitz von MSKCC.

Behandlung

Drei bis fünf Tage vor der ersten Immunisierung werden 200 mg/M2 Cyclophosphamid i. v. verabreicht. Dies ist die Dosis und das Protokoll, das die Anmelder in froheren Versuchen erfolgreich verwendet haben. Dann werden vier Immunisierungen subcutan in zweiwöchigen Intervallen verabreicht, beginnend 2-30 Wochen nach der operativen Entfernung aller bekannten Krankheiten. Zwei weitere Impfungen werden in zweimonatigen Intervallen verabreicht.

Bewertung

Serologische Antwortreaktion: Der primäre Endpunkt dieses Versuches ist eine serologische Antwortreaktion. Peripheres Blut (30 ml) wird kurz vor jeder Impfung sowie 2 Wochen und 5 Wochen nach der vierten, fünften und sechsten Impfung entnommen. Danach kann das Blut in 3-monatigen Intervallen entnommen werden, so lange, wie nachweisbare Antikörper gegen GM2 bestehen bleiben. Die Seren aller Patienten, die 2 Wochen nach der vierten, fünften und sechsten Impfung erhalten werden, werden durch ELISA auf Antikörper gegen GM2 und verwandte Ganglioside hin untersucht. Die Patienten mit Titern von 1/80 oder höher, von denen durch ELISA und Immun-Dünnschicht-Chromatographie mit einer Vielzahl von Glycolipiden gezeigt wird, dass sie spezifisch reagieren, werden als Patienten mit einer serologischen Antwortreaktion betrachtet, und es können weitere Seren von Patienten mit einer serologischen Antwortreaktion untersucht werden, um die Antikörperantwortreaktion auf die Impfung besser zu definieren. Es können weitere 60 ml peripheres Blut 2 Wochen nach der vierten Impfung zur Untersuchung der Immunantwort gegen GM2 auf clonaler Ebene erhalten werden, wenn die Anmelder einen Hinweis auf eine Anti-GM2-IgG-Antikörperinduktion mit hohem Titer beobachten. Zu diesem Zweck werden die Überstände der mit EBV transformierten Lymphoblasten und der darauf hin erzeugten Hybridome verwendet werden.
Die verzögerte Hypersensitivitäts-Antwortreaktion: Hautuntersuchungen auf die verzögerte Hypersensitivität gegen KLH, GM2 und GM2, das an menschliches Serumalbumin angeheftet ist werden zum Zeitpunkt der fünften Immunisierung durchgeführt. Reaktionen mit mehr als 5 mm Gewebsverhärtung nach 48 Stunden werden als positiv angesehen, und, wenn sie gegen GM2 gerichtet sind, werden sie durch Hautuntersuchungen mit einer Vielzahl von Gangliosiden weiter untersucht.
Klinischer Verlauf: Die Patienten werden im Memorial Hospital zum Zeitpunkt ihrer vierten und sechsten Impfung bewertet, und es wird eine Brust-Röntgenaufhahme und eine Durchmusterung (screening profile) zum Zeitpunkt der sechsten Impfung durchgeführt. Weitere anschließende Folgeuntersuchungen werden durch ihre Onkologen durchgeführt werden.

Kriterien für den Abbruch der Behandlung

Das regionale Wiederauftreten, das routinemäßig durch örtliche Therapie (Operation oder Injektion in die Läsion) behandelt wird, ist kein Grund für den Abbruch der Behandlung, wenn der Patient frei von Krankheit bleibt. Die Behandlung wird nicht weitergeführt, wenn der Patient eine wiederkehrende Krankheit entwickelt, die eine systemische Behandlung oder eine Strahlentherapie erfordert.

Statistische Betrachtungen

Dies ist eine Phase I-Studie, die sich primär mit einer Bewertung der Toxizität und der IgG-Antwort gegen GM2 und KLH nach der Impfung beschäftigt. Es werden drei Patienten mit 4 stufenweise steigenden Dosen jeder QS-21-Dosis geimpft. Wenn die IgG- Antwortreaktion mit jeder stufenweisen Erhöhung weiter zunimmt, wird die höchste Dosis ausgewählt, die nicht mehr als eine systemische Toxizität der Stufe I oder eine örtliche Toxizität der Stufe 2 hervorruft, und wenn keine Toxizität beobachtet wird, wird eine fünfte Dosis untersucht. Aufgrund der Untersuchungen an Mäusen, wird erwartet, dass die IgG- Antwortreaktion nach der zweiten oder dritten Dosis ein Maximum oder ein Plateau erreicht.
Nachdem ein sicherer und immunogen wirkender Dosisbereich identifiziert wurde, werden 3- 6 weitere Patienten mit der Dosis, die als am stärksten immunogen erscheint, und der nächst höheren und der nächst niedrigeren Dosis immunisiert, um Vertrauen in das Ausmaß der Toxizität und der Immunogenität bei diesen Dosen zu gewinnen.

Risiken

GM2-KLH: Bei über 100 Patienten, die mit Impfstoffen behandelt worden waren, die 200 ug GM2 enthielten, wurde keine Toxizität beobachtet, die GM2 zugeschrieben werden kann, KLH wurde mit einer Dosis von 1 mg ohne Toxizität verwendet, um über 50 Patienten zu immunisieren und den Immunstatus zu untersuchen (15). 18 Patienten wurden mit Impfstoffen immunisiert, die GM2-KLH enthielten. Ein Patient hatte Schmerzen und Empfindlichkeit an den Impfstellen, die 48 Stunden andauerten und die GM2-KLH zugeschrieben werden können, vermutlich handelte es sich um eine Hypersensitivität- Antwortreaktion vom verzögerten Typ auf KLH. Es war keine Abschwächung der Dosis erforderlich. Die einzige erwartete Nebenwirkung von GM2-KLH ist eine Entzündung an den Impfstellen, die einige Tage andauert. Wenn Fieber über 38ºC oder eine ernstliche örtliche Toxizität auftritt, die die normale Aktivität einschränkt, kann die Dosis von GM2-KLH in Zukunft um den Faktor 3 vermindert werden.
Saponine wurde am Menschen noch nicht verwendet. Es ist bekannt, dass sie hämolytisch wirken, aber die QS-21-Fraktion wurde ausgewählt, weil sie keine eindeutige Toxizität bei so hohen Dosen wie bis zu 125 ug pro Maus, Katze oder Rhesusaffe zeigte. Auf M2- oder kg-Basis ist dies die tausendfache maximale Dosis, die hier vorgeschlagen wird.
Autoimmun- oder Hypersensitivitätsreaktionen auf Bestandteile des Impfstoffs oder gegen Hauttest-Antigene sind eine theoretische, aber vage Möglichkeit.
Kriterien für die Toxizität: die Toxizität wird gemäß den üblichen Toxizitätskriterien eingeteilt, die von dem National Cancer Institute (NCI) entwickelt wurden. Diese Kriterien befinden sich in den Akten bei dem IRB.

Signifikanz der Untersuchung

Die Verbesserung der Immunantwort gegen Krebs kann durch zwei grundlegende Ansätze versucht werden - unspezifische Immunpotenzierung, die den größten Teil der früheren und der gegenwärtigen Bemühungen der Krebs-Immuntherapie darstellt, und spezifische Immunisierung, die noch nicht wirklich auf die Behandlung von Krebs hin ausgewertet wurde, die aber viel zur Kontrolle von Infektionskrankheiten mit beigetragen hat. Es ist die Kenntnis mikrobieller Antigene, die die Entwicklung einer erfolgreichen spezifischen Immunisierung gegen Infektionen erlaubt hat. Dem entgegen hat die fehlende Kenntnis über menschliche Krebsantigene die Erkundung der spezifischen Immunisierung in Zusammenhang mit Krebs verhindert, da sie unter Verwendung von Impfstoffen mit auf definierte Krebsarten beschränkter Antigenität und zur Demonstration ihrer Immunogenität in Krebspatienten erforscht werden sollte. Die vor Kurzem erfolgten Fortschritte bei der Definition von Melanom-Zelloberflächenantigenen erlaubt nun die Erforschung der spezifischen Immunisierung.

ERGEBNISSE

GM2-KLH wurde in Phase I-Versuchen als Antigen mit QS-21 verwendet. Melanompatienten der AJCC-Stadien III und IV, die nach operativer Entfernung krankheitsfrei von allen bekannten Krankheiten waren, wurden mit 500 ug GM2-KLH (GM2/KLH-Verhältnis 200-1.400/1, GM2-Dosis 70 ug) plus 10, 50, 100 oder 200 ug QS-21 in Gruppen zu je 3 Patienten immunisiert. Alle Patienten haben nun die gesamten 6 Immunisierungen erhalten. Mit den 10 oder 50 ug QS-21-Dosen war keine Toxizität verbunden. Die 100 ug-Dosis wurde ebenso gut toleriert, aber jeder der mit dieser Dosis behandelten 3 Patienten wies mindestens 1 der 6 Impfungen auf, die zu einer fühlbaren Schwellung und zu einer Empfindlichkeit über 24-48 Stunden führte, und bei 2 dieser Patienten traten diese Beschwerden nach 2 der 6 Immunisierungen auf.
Es wurden keine systemischen Nebenwirkungen nachgewiesen. Die 3 Patienten, die mit 200 ug pro Impfstoff (Impfung) behandelt worden waren, litten unter Empfindlichkeit und Schmerz an den Injektionsstellen, die 2-10 Tage andauerten, sowie niedrigem Fieber und Grippeähnlichen Symptomen einschließlich schwachen Kopfschmerzen und diffusen Schmerzen, die nach den meisten Impfungen 8-24 Stunden andauerten. Die serologischen Antwortreaktionen gegen GM2 und KLH dieser 12 Patienten sind unten in der Tabelle 2 zusammengefaßt. Obwohl die Toxizität der 200 ug-Dosis nicht wirklich die maximal tolerierte Dosis darstellte, wies sie eine signifikante Toxizität auf, und es gab keinen Hinweis darauf, dass sie mit einer erhöhten Adjuvanzwirkung im Vergleich zu der 100 ug-Dosis verbunden war. Derzeit sind 9 weitere Patienten immunisiert, je 3 mit der 50-, 100- oder der 200 ug-Dosis, um diese Toxizitäts- und Immunogenitätsergebnisse zu bestätigen. Die IgM- und IgG-Titer der 6 Patienten, die GM2-KLH plus 100 oder 200 ug QS-21 erhalten hatten, werden in Fig. 6 gezeigt. Es scheint so, dass GM2-KLH plus QS-21 (100 ug) ein außerordentlich immunogen wirkender Impfstoff ist, der GM2/BCG oder GM2-KLH plus DETOX oder BCG im Hinblick sowohl auf den Titer als auch auf die Verweildauer der IgM- und IgG-Antikörper weit überlegen ist.
Nachdem gezeigt wurde, dass die GM2-KLH und die GD3-KLH plus QS-21- Impfstoffe deutlich stärker immunogen als die vorherigen Gangliosid/BCG-Impfstoffe sind, wird die Immunogenität von GD2, GD3 und GD3-Lacton in diesen neuen Konjugat- Impfstoffen in der Klinik untersucht werden. Die Grundlage für die Auswahl dieser Ganglioside als Immunogene bei Melanomen ist eine quantitative Analyse von zwanzig Melanom-Biopsien bei der die Immun-Dünnschicht-Chromatographie verwendet wurde, um die Spiegel dieser Ganglioside auf Melanomen und auf verschiedenen normalen Geweben zu quantifizieren.
Es werden sechs bis zwölf Melanompatienten mit jedem dieser Gangliosid-Konjugate geimpft werden, die hergestellt und kovalent an KLH angeheftet worden sind. Konjugate, von denen gezeigt wird, dass sie bei diesen Pilotstudien immunogen sind, werden dann vereinigt werden und bei einer weiteren Gruppe von 12 Patienten als Vorspiel für einen größeren, in vielen Zentren stattfindenden Versuch untersucht werden, der darauf abzielt, die Auswirkung eines entsprechenden, immunogenen, vielwertigen Melanom-Gangliosid-Impfstoffs auf die Rückfalls- und Überlebensrate zu bestimmen. Tabelle 2 MAXIMALE ANTIKÖRPERTITER GEGEN DAS GANGLIOSID GM2 NACH DER IMMUNISIERUNG MIT GM2-RLH PLUS VERSCHIEDENEN IMMUNOLOGISCHEN ADJUVANZIEN

Dritte Reihe der Experimente

Die Zelloberflächen-Ganglioside GM2, GD2 und GD3 werden in bösartigen Melanomen oft überexprimiert. Die Anmelder haben vor Kurzem gezeigt, dass die Immunisierung von Melanompatienten mit GM2 und BCG eine IgM- Antikörperantwortreaktion bei den meisten Patienten induzierte, und dass Patienten mit einem hohen Titer an GM2-Antikörpem eine erhöhte Überlebensrate aufwiesen. Wie üblicherweise mit KohIenhydrat-Antigenen (die T-unabhängig sind) beobachtet wird, war die IgM- Antwortreaktion kurzlebig, und eine IgG-Antwortreaktion wurde selten beobachtet. Um die Immunogenität zu steigern, konjugierten die Anmelder GM2 kovalent an Keyhole-Limpet- Hämocyanin (KLH). Der GM2-KLH-Impfstoff wurde Melanompatientea mit einem der drei Adjuvanzien - BCG, DETOX oder QS-21 verabreicht. Der am stärksten wirksame Impfstoff war GM2-KLH mit QS-21. Er induzierte einen viel höheren Titer und eine länger andauernde GM2-IgM-Antikörperantwortreaktion und eine gleichmäßige IgG-Antwortreaktion (Isotypen IgOl und IgG3). Er induzierte ebenfalls die KLH-Antwortreaktion mit dem höchsten Titer. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Konjugat-GM2-KLH plus QS-21-Impfstoff eine signifikante Hilfe der T-Zellen hervorrief. Da es keine ernsthafte Toxizität gab, ist dieser Impfstoff-Ansatz zu Verbesserung der Immunogenität anderer Ganglioside wie z. B. von GD2 und GD3 und zu Bestimmung der Wirkungen von Gangliosid-Antikörpern auf den Verlauf des Melanoms attraktiv. Darüber hinaus läßt der Befund, dass QS-21 die Immunogenität von GM2-KLH signifikant steigerte, vermuten, dass es das Gleiche bei den anderen Konjugat- Impfstoffen tut, von denen derzeit viele ohne Adjuvanz verwendet werden.

Einleitung

Eine der Veränderungen, die beim Vorgang der bösartigen Transformation stattfinden, ist ein verändertes Muster der Gangliosid-Expression auf der Zelloberfläche bei bestimmten Krebsarten, einschließlich bösartigen Melanomen (1). In normalen Melanomzellen ist GM3 das vorherrschende Gangliosid. Andere Ganglioside, umfassend GD3, GM2, GD1a und GT1b bilden weniger als 10% der Gesamtmenge (2). In bösartigen Melanomen führt die Aktivierung von glycosylierenden Enzymen zur erhöhten Expression von GD3, GD2, GM2 und 9-O-Acetyl-GD3 (3, 4). Diese überexprimierten Ganglioside sind attraktive Ziele für die Immuntherapie, einschließlich der aktiven Immunisierung mit Gangliosid-Impfstoffen. In einer Reihe von Untersuchungen, die GM2-Impfstoffe bei Patienten mit bösartigen Melanomen umfaßten, haben die Anmelder gezeigt, dass die Impfung (nach einer niedrigen Dosis Cyclophosphamid und mit BCG als Adjuvanz) IgM-Antikörper gegen GM2 bei den meisten Patienten induzierte (5), und dass der krankheitsfreie Zeitraum und die Überlebensrate bei den Patienten verlängert war, die GM2-Antikörper mit hohem Titer herstellten (6, 7). Die induzierte Antikörperantwortreaktion gegen GM2 besaß jedoch die Merkmale einer T-unabhängigen Antwortreaktion (vorwiegend IgM, kurze Dauer, inkonsistente IgG-Antwortreaktion, Fehlen einer Booster-Wirkung), und die anderen Melanom-Ganglioside GD3 und GD2 sind nicht immunogen, wenn sie auf die gleiche Weise verabreicht werden (8). Da die relevanten Epitope Kohlenhydrate darstellen, haben die Anmelder, um die Immunogenität zu steigern, Ansätze erkundet, die durch die erfolgreiche Entwicklung von Kohlenhydrat-Impfstoffen für bakterielle Infektionen nahe gelegt wurden. Bei Mäusen haben die Anmelder gezeigt, dass die Immunogenität von GD3 durch die kovalente Bindung an Keyhole-Limpet-Ilämocyanin deutlich gesteigert wird, und dass Mäuse, die mit dem GD3-KLH-Konjugat und dem Adjuvanz QS-21 immunisiert worden waren, eine IgM-Antwortreaktion mit hohem Titer zeigen, der eine starke, lang andauernde IgG-Antwortreaktion folgte (9). Die Anmelder haben nun damit begonnen, die Gangliosid- Konjugat-Impfstoffe in der Klinik zu testen, und die Anmelder berichten hier über die anfänglichen Ergebnisse der Immunisierung von Patienten mit bösartigen Melanomen mit einem GM2-KLH-Konjugat-Impfstoff.

Material und Methoden

Patienten

Die Patienten mit bösartigen Melanomen des Stadiums III wurden als geeignet betrachtet, wenn alle Metastasen bildenden Krankheiten innerhalb der letzten 4 Monate zurückgewiesen wurden. Keiner der Patienten hatte vorher eine Chemotherapie oder eine Strahlentherapie erhalten.

Impfstoffherstellung und Verabreichung

GM2-KLH-Impfstoff: Das GM2-KLH-Konjugat wurde durch Biomira Inc. (Edmonton, Alberta) wie vorher für den GD3-KLH-Konjugat-Impfstoff beschrieben hergestellt (9). Kurzgefaßt umfaßte das Konjugationsverfahren die Ozonspaltung der Ceramid-Doppelbindung von GM2, die Einführung einer Aldehydgruppe und die Konjugation mit den Aminolysylgruppen des KLH über reduktive Aminierung. Das molare Verhältnis von GM2/KLH betrug etwa 800/1, und der Impfstoff wurde in einer Konzentration von 0,57 mg Konjugat in 0,5 ml normaler Kochsalzlösung bereit gestellt. Diese Menge stellte eine Patientendosis dar und enthielt 70 ug GM2 und 500 ug KLH. Gruppen von je sechs Patienten erhielten jede das GM2-KLH-Konjugat ohne Adjuvanz, GM2-KLH mit DETOX, GM2-KLH mit BCG und GM2-KLH mit QS-21.
Es wurden vier Impfungen intradermal in die Extremitäten mit intakter Lymphdrainage in zweiwöchigen Intervallen verabreicht, darauf erfolgen zwei weitere Impfungen in achtwöchigen Intervallen. Cyclophosphamid (Cytoxan, Mead Johnson and Co., Evansville, IN) zu 200 mg/m² wurde intravenös allen Patienten 4 bis 6 Tage vor der ersten Impfung verabreicht.
Immunologische Adjuvanzien: DETOX wurde hergestellt und geliefert von Ribi Immunochem Research Inc. (Hamilton, MT) und war als eine lyophilisierte Öltröpfchenemulsion formuliert. Es besteht aus Zellwandskeletten (CWS) aus dem Bazillus Calmette-Guorin und Monophosphorylipid A (MPLA) aus Sahnonella minnesota R595. Am Tage der Impfung wurden 0,25 ml DETOX (250 ug CWS und 25 ug MPLA) mit dem GM2- KLH-Präparat gemischt. Der Impfstoff (Endvolumen 0,75 ml) wurde 2-3 Minuten geschüttelt ("gevortext") und den Patienten innerhalb von 15 Minuten verabreicht. BCG wurde von Bionetics Research Inc. (Rockville, MD) bezogen. Am Tage der Impfung wurden 10&sup7; lebende Einheiten BCG in 0,1 ml normaler Kochsalzlösung dem GM2-KLH-Impfstoff in je einer separaten Spritze zugegeben (Endvolumen 0,6 ml). Die Bestandteile wurde gemischt und den Patienten innerhalb von 15 Minuten verabreicht. QS-21-Adjuvanz (ein homogenes Saponin, das aus der Rinde von Quilllaja saponaria Molia gereinigt worden war) (10, 11) wurde freundlicherweise von Cambridge Biotech Inc. (Worcester, MA) zu Verfügung gestellt. 100 ug oder 200 ug QS-21 wurden mit 0,25 ml normaler Kochsalzlösung verdünnt und mit GM2- KLH vermischt. Der Impfstoff (Endvolumen 0,75 ml) wurde 2-3 Minuten geschüttelt ("gevortext") und innerhalb von 15 min verabreicht.

Ganglioside

GM2 und GD 1b aus Rinderhirn waren ein Geschenk des Fidia Reseach Laboratory (Abano Terme, Italien). GM3, GM1 und GDIa aus Rinderhirn wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. Asialo-GM2 wurde durch 1 h Behandlung von GM2 mit 0,1 M Trifluoressigsäure bei 100ºC, gefolgt von der Trennung über eine Sep-Pak-C18- Umkehrphasen-Säule (Waters, Milford, MA) hergestellt. GD2 wurde aus GD1b durch Behandlung mit β-Galactosidase hergestellt (12). Aus Rinder-Buttermilch isoliertes GD3 wurde freundlicherweise von Dr. R. K. Yu (Medical College of Virginia, Richmond, VA) zur Verfügung gestellt.

Reagenzien und monoclonale Antikörner

Hochauflösende Dünnschicht-Chromatographie-(HPTLC)-Silicagel-Platten wurden von E. Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen. 4-Chloro-1-naphthol und p- Nitrophenylphosphat-Dinatrium wurden von Sigma bezogen. Mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Anti-Mensch-IgM aus Ziegen (Kierkegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD) und gereinigtes Anti-Mensch-IgG aus Mäusen (Southern Biotech, Birmingham, AL) gefolgt von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Anti-Maus-IgG aus Ziegen (Southern Biotech) wurden für enzymgekoppelte Immunadsorbenz-Testansätze (ELISA) verwendet. Mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Anti-Mensch-IgM oder -IgG aus Ziegen, die von TAGO (Burlingame, CA) gekauft worden waren, wurden zur Dot-Blot-Immuntlirbung und zur Immun-Dünnschicht-Chromatographie (ITLC) verwendet. Anti-Maus-Immunglobulin aus Kaninchen, das für die ITLC mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert worden war, und Anti- Maus-IgM und -IgG aus Kaninchen, die für den ELISA mit alkalischer Phosphatase konjugiert worden waren, wurden mit monoclonalen Kontroll-Antikörpern aus Mäusen verwendet und wurden von Zymed (San Francisco, CA) bezogen. Der Anti-GM2-MAK 696 wurde von Kyowa Hakko Kogyo (Tokyo, Japan) bezogen und der Anti-GD3-MAK R24 wurde hergestellt (13).

Serologische Testansätze

Der ELISA wurde wie vorher beschrieben durchgeführt (6). Um die unspezifische "Klebrigkeit" ("stickiness") zu kontrollieren, wurden die Immunseren auch auf Platten untersucht, die identisch weiter behandelt wurden, denen aber kein Gangliosid zugegeben worden war, und der abgelesene Wert wurde von dem Wert abgezogen, der bei Anwesenheit des Gangliosids erhalten wurde. Der Titer wurde als die höchste Verdünnung definiert, die eine korrigierte Extinktion von 0,1 oder mehr ergab. Die Immunfärbung von Gangliosiden mit monoclonalen Antikörpern oder mit menschlichen Seren wurde nach dem Auftragen auf Nitrocellulose-Streifen (14) oder nach der Trennung auf HPTLC-Silicagel-Glasplatten wie vorher beschrieben (3) durchgeführt. Die Platten wurden in Chloroform/Methanol/Wasser (0,25% CaCl&sub2;) 50 : 40 : 10 (Gew./Gew.) entwickelt, und die Ganglioside wurden durch Färbung mit Resorcin/HCl-Reagenz oder mit monoclonalen Antikörpern sichtbar gemacht.

Bestimmung der IgG-Unterklasse

Die Bestimmung der IgG-Unterklasse wurde durch ELISA unter Verwendung von Unterklassen spezifischen sekundären Anti-Mensch-IgEl-, IgG2-, IgG2- und IgG4-MAKs aus Mäusen durchgeführt. Es wurden sekundäre MAKs verschiedener Lieferanten (Tabelle 4) verwendet. Als dritter Antikörper wurde mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Anti-Maus- IgG aus Ziegen (Southern Biotech, Birmingham, AL) in einer Verdünnung von 1 : 200 verwendet.

Komplement-vermittelte Cytotoxizitäts-Testansätze

Komplement-vermittelte Cytotoxizitäts-Testansätze wurden durch einen 4-stündigen slCr-Freisetzungs-Testansatz durchgeführt. Die Zellen der GM2-positiven Melanom-Zelllinie SK-MEL-173 dienten als Zielzellen. 2 · 10&sup6; Zellen wurden 1 h mit 100 uCi Na&sub2;&sup5;¹CrO&sub4; (New England Nuclear, Boston, MA) in 10% FCS-RPMI bei 37ºC in einem CO&sub2;-Inkubator markiert. Die Zellen wurden zweimal gewaschen, und 104 Zellen/Vertiefung wurden in 96 Vertiefungen enthaltenden Rundboden-Platten (Corning, New York, NY) markiert und 1 h mit 1 : 5 verdünntem Prä- oder Immunserum oder mit Medium alleine bei 37ºC in einem CO&sub2;- Inkubator inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und 4 h bei 37ºC mit menschlichem Komplement (Sigma) in einer Verdünnung von 1 : 4 inkubiert. Die Platten wurden 5 min bei 500 · g zentrifugiert, und ein Aliquot von 125 ul des Überstandes jeder Vertiefung wurde zur Bestimmung des freigesetzten &sup5;¹Cr geerntet. Alle Testansätze wurden dreifach durchgeführt und umfaßten Kontroll-Vertiefungen zur maximalen Freisetzung in 1% NP-40 (Sigma) und zur spontanen Freisetzung bei Abwesenheit von Komplement.
Der Prozentsatz der spezifischen Lyse wurde wie folgt berechnet:
%-Cytotoxizität = Freisetzung im Experiment - Spontane Freisetzung · 100/ Maximale Freisetzung - Spontane Freisetzung

ERGEBNISSE

Impfstoff-Verabreichung und Nebenwirkungen

Vierundzwanzig Patienten wurden mit dem GM2-KLH-Impfstoff immunisiert. Gruppen von je sechs Patienten erhielten jeweils GM2-KLH ohne immunologisches Adjuvanz oder mit DETOX, BCG oder QS-21. Es wurde keine örtliche oder systemische Toxizität nach der Verabreichung von GM2-KLH alleine nachgewiesen. Impfstoffe, die DETOX enthielten, führten bei vier von sechs Patienten zur Knotenbildung an den Impfstellen, die 2-10 Wochen anhielt. Bei vier Patienten waren diese mit 3-10 cm großen Hautrötungen und Verhärtung verbunden, aber nur mit minimaler Empfindlichkeit. Bei einem Patienten war sie mit einer 25 cm großen Hautrötung und Verhärtung nach einer Immunisierung verbunden, und bei einem zweiten Patienten mit niedrigem Fieber und Unbehagen über 72 Stunden nach der ersten Immunisierung. Bei diesem Patienten wurde die DETOX-Dosis auf 50 ug CWS und S ug MPLA bei den folgenden Immunisierungen herabgesetzt. BCG rief zu einem gewissen Zeitpunkt örtliche Entzündungen und Verkrustungen bei allen Patienten hervor, die nach 2-12 Wochen abheilten. Wenn dies auftrat, wurde die BCG-Dosis von 1 · 10&sup7; lebenden Einheiten auf eine Enddosis von 3 · 10&sup6; Einheiten bei vier Patienten und auf 1 · 10&sup6; Einheiten bei einen Patienten vermindert. Der sechste Patient war Tuberkulose ausgesetzt gewesen und besaß einen positiven PPD-Test. Bei ihm wurde daher mit einer Dosis von 1 · 10&sup6; Einheiten begonnen, die schließlich auf 1 · 10&sup5; Einheiten vermindert wurde. QS-21 induzierte milde örtliche Hautrötungen und Empfindlichkeit, die bei der 100 ug-Dosis bei allen Patienten 24-48 Stunden andauerten. Die 200 ug-Dosis QS-21 war mit örtlicher Empfindlichkeit und Entzündungen verbunden, die nach allen Immunisierungen 2-10 Tage andauerten, sowie mit milden Grippeähnlichen Symptomen einschließlich niedrigem Fieber (< 38,5ºC), Kopfschmerz und Muskelschmerz, die nach 3 der 18 Imniunisierungen 8-24 Stunden andauerten. Es wurden keine neurologischen Abnormalitäten oder andere Nebenwirkungen beobachtet.

Die Antikörperantwort gegen GM2-KLH-Konju atdmpfstoffe

Vor der Impfung wurden keine IgG-Antikörper gegen GM2 gefunden, und IgM- Antikörper wurden nur bei drei Patienten mit Titern von 1 : 80 in zweien Fällen und 1 : 320 in einem Fall nachgewiesen. Die übrigen 21 Patienten wiesen keine GM2-Reaktivität vor der Impfung auf. Die ELISA- und die Dot-Blot-Immunfärbungs-Ergebnisse mit den Seren, die vor und nach der Immunisierung erhalten wurden, sind in der Tabelle 3 zusammengefaßt. Die IgM-Anti körpertiter nach der Immunisierung mit GM2-KLH oder mit GM2-KLH und BCG oder mit GM2-KLH und DETOX waren ganz ähnlich (mittlerer Titer 1 : 80-1 : 160). Im Gegensatz dazu, wiesen 5 von 6 Patienten, die mit GM2-KLH und QS-21 immunisiert worden waren, IgM-Antikörpertiter von 1 : 1280 oder mehr auf, was signifikant höher ist, als die Titer in den anderen Gruppen oder bei Patienten, die vorher mit nicht konjugierten GM2- und BCG-Impfstoffen immunisiert worden waren (6). Darüber hinaus induzierte die Immunisierung mit GM2-KLH und QS-21 zum erstem Mal eine gleichmäßige IgG- Antwortreaktion bei allen Patienten; nur 2 der anderen 18 Patienten, die den GM2-KLH- Impfstoff erhalten hatten, stellten vergleichbare IgG-Titer her.
Die aufeinanderfolgenden IgM- und IgG-Antikörpertiter gegen GM2 in Patienten, die GM2-KLH und QS-21 erhalten hatten, werden in Fig. 6 gezeigt. Die maximalen IgM-Titer wurden nach der dritten oder der vierten Impfung beobachtet und blieben bei den meisten Patienten über mindestens 20 Wochen hoch. Booster-Immunisierungen in Woche 14 und 22 steigerten die IgM-Titer nicht weiter. IgG-Titer von 1 : 160 oder höher wurden zwei Wochen nach der vierten Impfung bei fünf von sechs Patienten beobachtet. Die Titer fielen auf 1 : 40 oder weniger ab, erhöhten sich aber nach einer Booster-Impfung wieder schnell auf die vorherigen Spiegel (Mittelwert 1 : 160) und verblieben auf diesem Spiegel über mehr als 11 Wochen. Die zweite Booster-Impfung hatte in den meisten Fällen keine deutliche Wirkung auf die Antikörpertiter. Somit zeigte die Antwortreaktion auf die Booster-Impfung nur eines der beiden Merkmale der klassischen sekundären Immunantwort. Die Antwort fand rascher statt, aber die Antikörpertiter stiegen nicht höher als nach den anfänglichen Immunisierungen.
In den Seren vor der Behandlung wurden keine KLH-Antikörper nachgewiesen. Nach der Impfung wiesen alle Patienten eine Reaktivität mit KLH auf, wie in Tabelle 3 gezeigt wird. Die höchsten Titer an IgG-Antikörpern wurden nach der Verabreichung mit QS-21 beobachtet und waren signifikant höher als in anderen Gruppen einschließlich der nächstbesten Patientengruppe, die mit GM2-KLH und BCG geimpft worden war (p < 0,005). In der QS-21-Gruppe bestand keine Korrelation zwischen der Stärke der GM2-Antwort und der KLH-Antwortreaktion.

Spezifitätsanalyse der GM2-Antikörper

Die Spezifität der Gangliosid-Antikörper, die in den Patientenseren vor und nach der Immunisierung nachgewiesen wurden, wurde durch Dot-Blot-Immunfärbung unter Verwendung der Gangliosid-Standards GM3, Asialo-GM2, GM2, GM1, GD2, GD3, GD1a und GD1b bestimmt (Fig. 7). Die Präimmun IgM- und IgG-Antikörper der meisten Patienten zeigten eine schwache Reaktionsfähigkeit mit Asialo-GM2, und einige Patienten besaßen auch IgM-Antikörper gegen GM1 und GD1b. Die Reaktivität mit diesen Gangliosiden wurde durch die Immunisierung nicht verändert. Die einzigen durch den Impfstoff induzierten Veränderungen, waren eine starke Reaktivität mit GM2 und eine schwache Reaktivität mit GD2. Die Dot-Blot-Immunfärbungen wurden mit 0, 1+, 2+ oder 3+ bewertet. Eine Reaktivität der IgM-Antikörper von 3+ gegen GM2 wurde in den Seren von fünf von sechs Patienten, die mit GM2-KLH und QS-21, in einem von sechs Patienten, die mit GM2-KLH und BCG und in zwei von sechs Patienten, die mit GM2-KLH ohne Adjuvanz oder mit GM2-KLH und DETOX immunisiert worden waren, beobachtet und bei keinem der Patienten der anderen Behandlungsgruppen.
Die Immunseren der Patienten, die mit GM2-KLH und QS-21 immunisiert worden waren, wurden ebenfalls durch Immun-Dünnschicht-Chromatographie (Fig. 8A) auf ihre Reaktionsfähigkeit mit GM2 und anderen Gangliosiden eines Melanom-Gewebeextraktes hin untersucht. Die meisten Patientenseren wiesen eine starke IgG- und IgM-Reaktivität mit GM2 auf, das aus Rinderhirn oder aus Melanomen isoliert worden war. Eine Reaktivität wurde ebenfalls mit einer langsamer wandernden Bande im Melanomextrakt beobachtet, wobei es sich vermutlich um GD2 handelt, wenn man die Rf-Werte mit einem gereinigten GD2- Standard vergleicht (nicht gezeigt).
Um die GD2-Kreuzreaktivität der IgG-Antikörper zu bestätigen, wurde das Präimmunserum des Patienten Nr. 2 vor der Durchführung der Immunfärbung entweder mit GM2 oder mit GD2 vorinkubiert (Fig. 8B). Die Reaktivität mit GM2 und mit GD2 im Melanom-Gangliosidextrakt wurde durch die Vorinkubation mit GM2 vollständig verhindert. Dem entgegen führte die Vorinkubation der gleichen Serums mit GD2 nur zur Hemmung der GD2-Reaktivität und veränderte die Reaktivität mit GM2 nicht. Dieses Ergebnis legt die Anwesenheit von zwei Populationen an Antikörpern nahe, von denen eine mit GM2 alleine reagiert und die andere eine Reaktivität mit GM2 und GD2 aufweist.

Bestimmung der Unterklasse der IgG-Antikörper

Die IgG-Seren mit hohen Titern der sechs Patienten, die mit GM2-KLH und QS-21 immunisiert worden waren, wurden durch ELISA unter Verwendung einer Reihe von sekundären Antikörpern untersucht, die für die IgG-Unterklassen spezifisch waren. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 zusammengefaßt. In allen sechs Seren gehörten die IgG- Antikörper zur Igül- und IgG3-Unterklasse.

Komplement-vermittelte Cytotoxizität

Die Effektor-Funktion der Anti-GM2-Antikörper (1 : 5 verdünnt) in Seren der Patienten, die mit GM2-KLH und QS-21 geimpft worden waren, wurde durch Komplementvermittelte Cytotoxizitäts-Testansätze untersucht. Wie in Tabelle 5 gezeigt wird, lysierten die Immunseren aller sechs Patienten die GM2-positiven SK-MEL-173-Melanomzellen bei Anwesenheit von menschlichem Komplement. Die Präimmunseren wiesen keine Cytotoxizität bei der Zugabe von Komplement auf, und die Immunseren waren (verhielten sich) mit GM2-negativen Melanomzellen oder wenn Komplement nicht zugegeben wurde, nicht cytotoxisch. Natürlich handelt es sich nur um vorläufige Ergebnisse, und eine genauere Untersuchung der an die Zelloberfläche bindenden und cytotoxischen Effektor-Funktion der durch den Impfstoff induzierten Antikörper und ihrer Unterklassen ist in Arbeit.

Diskussion

In einer Reihe von Untersuchungen an Patienten mit bösartigen Melanomen bestand das Ziel darin, Impfstoffe zu konstruieren, die zur Induktion der Herstellung von Antikörpern gegen drei Ganglioside wirksam sind, die in Melanomen oft überexprimiert werden - GM2, GD2 und GD3. Der anfängliche Ansatz bestand darin, Patienten mit nicht konjugierten Gangliosiden zu impfen, die an BCG adsorbiert waren. Auf diese Weise waren wir in der Lage, die Antikörperproduktion gegen GM2 zu induzieren (5, 6), aber nicht gegen GD2 oder GD3. Die GM2-Antikörper, die durch GM2-BCG-Impfstoffe induziert wurden, gehörten meistens zur IgM-Klasse, die Antikörperantwortreaktion war von kurzer Dauer und Booster- Injektionen führten wieder zu einer kurzen Phase der IgM-Antikörperproduktion, ähnlich wie bei der Erstantwort - alles Merkmale einer von T-Zellen unabhängigen Immunantwort, die aus Untersuchungen mit anderen Kohlenhydrat-Antigenen wohlbekannt sind. Selbst dann, war die durch den Impfstoff induzierte Herstellung von GM2-Antikörpern bei Patienten mit einem Stadium III-Melanom nach der Operation mit einer erhöhten Überlebensrate verbunden (6, 7). Diese Beobachtung legte nahe, dass Melanom-Ganglioside geeignete Kandidaten zur Konstruktion von Impfstoffen darstellen, und dass Melanom-Gangliosid-Impfstoffe mit gesteigerter Immunogenität zur besseren klinischen Ergebnissen führen würden. Da die relevanten Epitope der Melanom-Ganglioside Kohlenhydrate sind, ist es hilfreich Untersuchungen zu berücksichtigen, die darauf abzielten, die Immunogenität anderer Kohlenhydrat-Impfstoffe zu steigern, insbesondere von Impfstoffen gegen bestimmte bakterielle Infektionen.
Der Hauptunterschied der Immunantwort auf Kohlenhydrat-Antigene im Gegensatz zu Protein-Antigenen besteht darin, dass sie nicht vom Thymus abhängig ist. Die Vorstellung, dass Kohlenhydrat-Antigene vom Thymus unabhängig (TI) sind, basiert auf der Beobachtung, dass neugeborene Mäuse, denen die Thymusdrüse entfernt wurde, sowie Mäuse mit Thymus, unbeeinträchtigte humorale Immunantwortreaktionen gegen bakterielle Polysaccharide zeigen (15). B-Zellen, die auf TI-Antigene reagieren, zeigen einige charakteristische Merkmale. Sie erscheinen später in der Entwicklung des Individuums (Ontogenie), sind langlebig und erfordern keine T-Zellen zur Aktivierung, zumindest nicht in vivo. Obwohl T-Zellen für B- Zellen zur Aktivierung erforderlich sind, um auf TI-Antigene in vitro zu reagieren, ist die Natur der Wirkung der T-Zellen noch nicht gut verstanden und deutlich unterschieden zu der auf den MHC beschränkten Hilfe der T-Zellen bei der T-abhängigen Antikörperantwortreaktion auf Protein-Antigene. Während T-Zellen für die in vivo- Antikörperantwortreaktion auf TI-Antigene nicht unverzichtbar sind, sind die Antikörperspiegel höher, wenn T-Zellen anwesend sind, was eine allgemeine Unterstützung der Aktivität von T-Zellen, wiederum durch unbekannte Mechanismen, nahe legt (16).
Um die Immunogenität von Kohlenhydrat-Antigenen zu erhöhen, wurde eine große Anzahl von Ansätzen in Versuchen erkundet. Diese umfassen die chemische Modifizierung (17), die Verabreichung mit Adjuvanzien, die nicht-kovalente Komplexierung mit Proteinen, die kovalente Anheftung an immunogene Trägerproteine (18) und der Ersatz des Kohlenhydrat-Epitops durch ein Protein-Replikat, (d. h.) entweder durch Peptide, die de novo synthetisiert wurden (sogenannte Mimotope, 19) oder durch anti-idiotypische Antikörper (20). Die meisten dieser Ansätze führten zu einer gesteigerten Hilfe der T-Zellen bei der für Kohlenhydrate spezifischen Antikörperantwortreaktion. Obwohl jedes der Experimente anfänglich vielversprechende Ergebnisse zeigte, ist die kovalente Anheftung von Kohlenhydrat-Antigenen an immunogene, T-abhängige Trägerproteine, die zuerst für Haptene (21) und dann für Disaccharide (22) vorgeschlagen wurde, das Konzept, das am intensivsten verfolgt wurde, und führte zu Impfstoffen, von denen in einigen Fällen gezeigt wurde, dass sie bei kürzlich vorgenommenen klinischen Versuchen hoch wirksam sind.
Ausgezeichnete Beispiele sind H. influenzae Typ B (HiB)-Polysaccharid-Protein- Konjugat-Impfstoffe. Die vier Impfstoffe, die in der letzten Dekade entwickelt wurden, unterscheiden sich in den Kohlenhydrat-Bestandteilen, den Trägerproteinen und den Verbindungsstücken zwischen dem Kohlenhydrat und dem Protein (23-27). In vergleichenden Untersuchungen in Kindern, induzierten Konjugat-Impfstoffe eine viel stärkere Antikörperantwortreaktion als der nicht konjugierte Hib-PhosphoribosylfRibitolphosphat- Polysaccharid (PRP)-Impfstoff (28). Von besonderem Interesse sind Beobachtungen, dass junge Kinder, die zuerst mit HbOC (Oligosaccharid - nicht-toxisches Diphtherie-Toxin) oder mit PRP-OMPC (äußerer Membranproteinkomplex aus Neisseria meningitidis Typ B) immunisiert worden waren, und später dem nicht konjugierten PRP-Impfstoff ausgesetzt wurden, eine sich rückerinnernde (anamnestische) IgG-Antwortreaktion zeigten, sogar dann, wenn sie in einem Alter ausgesetzt (geimpft) worden waren, bei dem sie nicht auf die primäre Immunisierung mit dem nicht konjugierten Impfstoff antworteten (29, 30). Wie die T-Zellen am Geschehen beteiligt sind, und wie sie mit den auf Hib-PRP reagierenden B-Zellen wechselwirken, ist immer noch unklar. Die Tatsache, dass eine erhöhte Immunogenität und eine T-Abhängigkeit eine kovalente Bindung zwischen dem PRP und dem Protein erfordern, legt nahe, dass die räumliche Nähe zwischen Protein und PRP nicht zerstört werden darf, zumindest nicht in der frühen Phase bei der Verarbeitung/Präsentation des Antigens. Da die Isotyp-Klassen und die biologischen Wirkungen der Antikörper, die durch Hib-PRP und Hib- PRP-Konjugate induziert wurden, die gleichen sind, scheint es so, dass die B-Zellen, die auf das durch das Konjugat induzierte Signal der T-Zellen reagieren, qualitativ mit denjenigen identisch sind, die durch Hib-PRP alleine mitbeteiligt werden.
Aus der umfangreichen Erfahrung, die sich bei der Entwicklung von Kohlenhydrat- Impfstoffen für bakterielle Infektionen angehäuft hat, haben die Anmelder in den vergangenen Jahren in Versuchen ähnliche Ansätze erkundet, um die Immunogenität von Melanom-Gangliosiden zu steigern. Die chemische Modifikation von GD3, die zur Bildung eines Amids, Lactons oder eines Gangliosidols oder zur O-Acetylierung führt, lieferte Derivate, die bei der Induktion der Antikörperproduktion in Patienten mit Melanomen hoch wirksam waren. Die Antikörper, die durch diese GD3-Derivate induziert wurden, kreuzreagierten jedoch nicht mit GD3 (31, 32). Durch die Immunisierung von Mäusen mit dem monoclonalen Antikörper R24, der GD3 erkennt, wurde der anti-idiotypische Antikörper BEC-2 entwickelt, der GD3 nachbildet. Kaninchen, die mit BEC-2 immunisiert worden waren, stellten Anti-GD3-Antikörper her (33), und anfängliche Untersuchungen der Immunogenität von BEC-2 bei menschlichen Patienten sind in Arbeit.
Die Konjugat-Impfstoffe betreffend, beschäftigten sich anfängliche Untersuchungen mit GD3 bei Mäusen mit drei Themen - Entwicklung des Konjugationsverfahrens, Auswahl des Trägerproteins und Auswahl des Adjuvanz (7). Das optimale Konjugationsverfahren umfaßt die Ozonspaltung der Doppelbindung von GD3 im Ceramid-Gerüst, die Einführung einer Aldehydgruppe und die Kopplung an Protein-Aminolysylgruppen durch reduktive Aminierung. Von fünf untersuchten Trägern - Poly-L-Lysin, Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH), kationisiertes Rinderserumalbumin, äußerer Membrankomplex (OMC) von Neisseria meningitidis und multiple antigene Peptidkonstrukte, die vier Wiederholungssequenzen eines Malaria-T-Zellen-Epitops an einem verzweigten Kern aus Polylysin trugen -, stellte sich KLH als das wirksamste heraus. Nicht-kovalente GD3/KLH-Komplexe waren nicht immunogen. Das beste Adjuvanz war QS-21, eine homogene Saponinfraktion, die aus der Rinde von Quillaja saponaria Molina gereinigt worden war. Die Merkmale der Antikörperantwortreaktion auf eine Immunisierung mit dem GD3-KLH-Konjugat und QS-21 umfaßten a) einen hohen anfänglichen IgM-Antikörpertiter, b) einen schnellen sekundären Anstieg der IgM-Antikörpertiter nach Booster-Immunisierungen" c) Aufrechterhaltung der IgM-Antikörpertiter nach der Booster-Immunisierung über bis zu zehn Wochen und d) stetige Produktion von IgG-Antikärpern mit hohen Titern parallel zur IgM-Antikörperproduktion mit Ausnahme einer anfänglichen Verzögerung von zwei Wochen. Diese Befunde wurden nun in menschlichen Melanom-Patienten durch Immunisierung mit einem anderen Gangliosid- Konjugat-Impfstoff, GM2-KLH, unter Verwendung des gleichen Konjugationsverfahrens reproduziert. Wie bei den Untersuchungen an Mäusen, stellte sich QS-21 als signifikant stärker wirksames Adjuvanz als DETOX oder BCG heraus, mit einer annehmbareren Toxizität.
Die GM2-Antikörperantwortreaktion wies viele Merkmale einer von T-Zellen abhängigen Antwortreaktion auf. Sie war lang andauernd, und es wurden Antikörper der IgOl- und IgG3-Unterklasse (die gewöhnlich mit einer von T-Zellen abhängigen Immunantwort verbunden sind) induziert. Wie bei den Hib-PRP-Impfstoffen beobachtet wurde, waren diese Isotypen die Gleichen, wie diejenigen, die gelegentlich mit niedrigen Titern mit den nicht konjugierten GM2/BCG-Impfstoffen erzeugt worden waren. Das Fehlen einer deutlichen Boosterwirkung bei den anhaltenden IgM- und IgG-Antwortenreaktionen mit hohen Titern nach Impfungen, die drei und fünf Monate nach der anfänglichen Serie durchgeführt wurden, könnte durch die Tatsache erklärt werden, dass die Patienten zu Beginn in zweiwöchigen Intervallen immunisiert worden waren. Bei dem klassischen Experiment, das die sekundäre Antwortreaktion auf Proteinantigene zeigt, wird die zweite Injektion des Antigens vier Wochen nach der Ersten verabreicht. Die Antikörperspiegel nach der ersten Immunisierung sind ein bis zwei Wochen nach der Injektion höher, und dann fallen sie auf sehr niedrige Spiegel ab, bevor die Boosterinjektion nach vier Wochen verabreicht wird. Bei dem Immunisierungsprotokoll, das die Anmelder wählten, klang die anfängliche Antikörperantwort nicht ab, sondern erhöhte sich schrittweise als Antwortreaktion auf die ersten vier Impfungen, die in zweiwöchigen Intervallen stattfanden, und nahm damit die sekundäre Antwort vorweg, die in einer stärker ausgeprägten Weise bei dem klassischen Experiment beobachtet wurde. Anders als die Antikörperantwortreaktion wie auf die meisten Proteinantigene, war die IgM-Antwortreaktion lang andauernd, und die IgM-Antikörper blieben sogar nach wiederholten Booster-Immunisierungen auf einem höheren Titer als die IgG-Antikörper, wie es für Kohlenhydrat-Antigene charakteristisch ist. Daher zeigt die Immunantwort gegen Ganglioside, die eine vergleichsweise kurze Oligosaccharidkette enthalten, die mit einem Lipid-Gerüst verbunden ist, und die Autoantigene darstellen, viele Gemeinsamkeiten mit der Immunantwort gegen Hib-PRP und andere bakterielle Kohlenhydrate.
Die Entwicklung des GM2-Konjugat-Impfstoffs wird es ermöglichen, zu bestimmen, ob bei Patienten, die mit nicht-konjugiertem GM2 immunisiert wurden, höhere Spiegel an IgM- und IgG-Antikörpern, die über längere Zeiträume aufrecht erhalten werden, zur Verzögerung des Wiederauftretens von Melanomen wirksamer sind, als die niedrigeren Spiegel der vorwiegend IgM-Antikörpcr, die kürzere Zeiträume anwesend sind. Darüber hinaus können die Anmelder nun untersuchen, ob die Konjugation mit immunogenen Trägerproteinen auch Immunogenität gegen GD3 und GD2 verleihen kann, also den Haupt- Gangliosiden, die in Melanompatienten keine Antikörperantwortreaktion induzierten, wenn sie als nicht konjugierte Impfstoffe verabreicht wurden. Wenn dies durchgeführt werden kann, wäre die Konstruktion und die Untersuchung eines polyvalenten Melanom-Gangliosid- Impfstoffs der nächste erstrebenswerte Schritt. Tabelle 3 Serologische-Antwortreaktionen von Patienten, die GM2-KLH- Konjugat-Impfstoffe mit oder ohne Adjuvanzien erhalten hatten, im Vergleich zu dem Impfstoff, der an BCG anhaftendes GM2 enthielt (GM2/BCG)
a historische Daten (6) Tabelle 3 (Fortsetzung)
a historische Daten (6) Tabelle 4: Charakterisierung von gegen GM2 induzierten IgG-AK, die gegen GM2 mit dem GM2-KLH plus QS-21-Impfstoff induziert wurden, durch Unterklassen-spezifische MAK
a SBA, Southern Biotechnology Associates (Birinxngham, AL); BS, The Binding Site Ltd.; ZLI, Zymed Laboratories Inc. (San Francisco, CA) Tabelle 5 Durch Komplement induzierte Lyse der Melanom-Zelllinie SK-MEL- 178, die durch GM2-Antikörper in Seren aus Patienten vermittelt wurde, die mit GM2-KLH plus QS-21 immunisiert worden waren
a Die Zielzellen wurden mit &sup5;¹Cr markiert und mit 1 : 5 verdünnten Antiseren behandelt

Vierte Reihe der Experimente

In einem Phase I-Versuch wurden steigende Dosen der Saponin-Fraktion QS-21 als immunologisches Adjuvanz mit einer konstanten Dosis des kovalent an Keyhole-Limpet- Hämocyanin (KLH) angehefteten Melanom-Gangliosids GM2 verabreicht. Achtundzwanzig Patienten mit Melanomen der AJCC-Stadien III oder IV, die nach Operation frei von Krankheit waren, wurden mit sechs Impfungen behandelt, die subcutan über einen Zeitraum von 5 Monaten verabreicht wurden. Die örtlichen und die systemischen Reaktionen standen mit der QS-21-Dosis in Beziehung. Dosen von 100 ug oder weniger induzierten milde örtliche Empfindlichkeit und Entzündungen an den Impfstellen, die 2-4 Tage andauerten, und gelegentlich kurzes niedriges Fieber und Unbehagen, aber keine signifikante Behinderung. Die 200 ug-Dosis induzierte niedriges Fieber und Unbehagen nach 30% der Impfungen, und bei allen Patienten wurden örtliche Reaktionen von bis zu 20 em Durchmesser beobachtet, was zu einer eingeschränkten Verwendung der Extremität, in die injiziert wurde, für 5-10 Tage führte. Die Titer der IgM- und IgG-Antikörper gegen GM2 und der IgG-Antikörper gegen KLH waren bei den 100 und den 200 ug-QS-21-Dosen am höchsten. Es wurden keine Antikörper gegen QS-21 nachgewiesen. Dieser Versuch weist die 100 ug-Dosis von QS-21 als die am Besten tolerierte Dosis zur Induktion von Antikörpern gegen GM2 und KLH bei Melanompatienten aus.

EINLEITUNG

Die Anmelder und andere haben Melanompatienten mit einer Reihe von Impfstoffen aus Gesamt-Melanomzellen geimpft, die nach der Expression einer Vielzahl von Glycoprotein- und Gangliosid-Antigenen hin ausgewählt worden waren (1, 2). Das Antigen, das am häufigsten durch Antikörper in Immunseren erkannt wurde, war das Gangliosid GM2. Das GM2-Gangliosid ist ein Differenzierungsantigen, das auf der Zelloberfläche menschlicher bösartiger Melanome überexprimiert wird. Es wurde herausgefunden, dass GM2 alleine nicht immunogen ist, und daher wurden GM2-Impfstoffe untersucht, die eine Vielzahl an immunologischen Adjuvanzien enthielten (3, 4). Die Immunisierung mit gereinigtem GM2-Gangliosid, das an Bacillus Calmette-Guerin (BCG) adsorbiert worden war, induzierte bei den meisten Melanompatienten die Herstellung von IgM-Antikörpern gegen GM2, und die Patienten, die Antikörper herstellten, wiesen einen längeren krankheitsfreien Zeitraum und eine höhere Überlebensrate, wenn sie mit Patienten verglichen wurden, die keine Antikörper herstellten (4, 5). In einer Zufallsstudie mit 122 Melanompatienten, die nach Operation frei von Krankheit waren, stellte die Mehrzahl der Patienten (86%), die den GM2/BCG-Impfstoff erhalten hatten, Antikörper her (6). Patienten, die Anti-GM2-Antikörper herstellten, besaßen eine signifikant längeren krankheitsfreien Zeitraum und eine höhere Gesamt-Überlebensrate als Patienten ohne Antikörper. Wenn man die beiden Zweige des Versuchs vergleicht, besaßen die Patienten, die den GM2/BCG- Impfstoff erhalten hatten, eine 18%-ige Verbesserung des krankheitsfreien Zeitraums und eine 11%-ige Verbesserung der Überlebensrate, wenn sie mit der BCG-Kontrollgruppe verglichen wurden, obwohl keine der Veränderungen statistisch signifikant war. Die Immunantwort war von kurzer Dauer, bestand vorwiegend aus IgM und hatte einen mittleren Titer. Ähnliche Ansätze mit den anderen Melanom-Gangliosid-GD2-, GD3- und 9-O-Acetyl- GD2/BCG-Impfstoffen, führten nur gelegentlich zu Antikörperantwortreaktionen mit niedrigen Titern (7). Die Bedarf an einem wirksameren Impfstoff war offensichtlich.
Die klassischen Experimente von Landsteiner mit Hapten-Träger-Konjugaten wurden erfolgreich auf die Impfungen gegen eine Vielzahl von Antigenen einschließlich bakteriellen Kapsel-Polysacchariden bei Kleinkindern angewendet (8). Auf diesem Hintergrund basierend, wurden einige verschiedene Kohlenhydrat-Tumorantigene mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) konjugiert, und es wurde von ihnen gezeigt, dass sie höhere Titer an IgM- und IgG- Antwortreaktionen hervorriefen, als vorher mit nicht konjugierten Impfstoffen beobachtet worden war (9-11). Die Anmelder untersuchten in Mäusen die Immunogenität von GD3, das mit einer Vielzahl von Trägermolekülen gekoppelt war, und identifizierten KLH als den optimalen Träger (12). Ein GM2-KLH-Konjugat-Impfstoff wurde alleine oder vermischt mit dem immunologischen Adjuvanzien BCG und DETOX bei Melanompatienten untersucht, aber die Immunantwort unterschied sich nicht signifikant von derjenigen, die durch GM2- BCCr-Impfstoffe induziert worden war, es wurden nur mittlere IgM-Antikörper-Titer induziert (13). Ein potenteres immunologisches Adjuvanz war erforderlich.
QS-21 ist eine Saponinfraktion, die fast bis zur Homogenität aus der Rinde von Quillaja saponaria Molina gereinigt worden ist, und die aufgrund einer starken Adjuvanzwirkung und niedriger Toxizität ausgewählt wurde (14, 15). Saponine wurden in einer Vielzahj von Einrichtungen als immunologische Adjuvanzien verwendet (zusammengefaßt in 15). QS-21 wurde verwendet, um die Antikörperantwortreaktion gegen ein Polysaccharid aus E. coli (16), sowie die Antikörper- und die T-Zellen-Antwortreaktionen gegen ein III V-1-Hüllprotein (17), Ovalbumin (18) und dem Katzen-Leukämie-Virus (19) zu verbessern. Durch Immunisierung mit Protein/QS-21-Gemischen wurden cytotoxische T- Zellen gegen HIV-infizierte Zellen und gegen mit Ovalbumin transfizierte Zellen induziert (17, 18). Die Anmelder untersuchten eine Vielzahl an neuen immunologischen Adjuvanzien mit verschiedenen Kohlenhydrat-Antigen-KLH-Konjugat-Impfstoffen, und es wurde gefunden, dass die immunologischen Adjuvanzien QS-21 und SAFm die IgM- und IgG- Antikörpertiter am wirksamsten verbesserten (9). Die Experimente konzentrierten sich auf QS-21, da es am geringsten toxisch war und zum Austesten mit Konjugat-Impfstoffen verfügbar war. GD3-Gangliosid-KLH plus QS-21-Impfstoffe induzierten bei Mäusen gleichmäßige IgM- und IgG-Antikörperantwortreaktionen mit hohen Titern (12) und lieferten die Grundlage für die Untersuchung dieses Ansatzes bei Melanompatienten.
Hierin werden die Ergebnisse eines Phase I-Versuchs unter Verwendung einer konstanten Dosis GM2-KLH plus zunehmenden Dosen an QS-21 beschrieben. Da gereinigtes QS-21 oder teilweise gereinigte Saponine wie z. B. Quil A vorher noch nicht am Menschen verwendet worden waren, bestand das Ziel darin, die maximal tolerierte Dosis, die mit wiederholten Verabreichungen an ambulante Patienten ("outpatients") vereinbar war, und die optimale Dosis zu Verbesserung der Antikörperantwortreaktion auf GM2 zu bestimmen.

Material und Methoden

Ganglioside

GM2 und GD 1b aus Rinderhirn waren ein Geschenk des Fidia Reseach Laboratory (Abano Terme, Italien). GM3, GM1 und GDla aus Rinderhim wurden von Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO) bezogen. GD2 wurde aus GDIb durch Behandlung mit β-Galactosidase hergestellt (20). GD3 wurde aus Rinder-Buttermilch isoliert und freundlicherweise von Dr. R. K. Yu (Medical College of Virginia, Richmond, VA) zur Verfügung gestellt.

Reagenzien und monoclonale Antikörper

HPTLC-Silicagel-Platten wurden von E. Merck (Darmstadt, Deutschland) bezogen; 4- Chloro-1-naphthol und p-Nitrophenylphosphat-Dinatrium kamen von Sigma. Mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Anti-Mensch-IgM aus Ziegen (Kierkegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD) und gereinigtes Anti-Mensch-IgG aus Mäusen (Southern Biotech, Birmingham, AL) gefolgt von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Anti-Maus-IgG aus Ziegen (Southern Biotech) wurden für den ELISA verwendet. Mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Anti-Mensch-IgM oder -IgG aus Ziegen, die von TAGO (Burlingame, CA) gekauft worden waren, wurden zur Dot-Blot-Immunfbrbung und zur Immun-Dünnschicht- Chromatographie (ITLC) verwendet. Anti-Maus-Immunglobuline aus Kaninchen, die für die ITLC mit Meerrettich-Peroxidase konjugiert worden waren, und Anti-Maus-IgM und -IgG aus Kaninchen, die für den ELISA mit alkalischer Phosphatase konjugiert worden waren, wurden mit monoclonalen Kontroll-Antikörpern aus Mäusen verwendet und wurden von Zymed (San Francisco, CA) bezogen. Der Anti-GM2-MAK 696 wurde von Kyowa Hakko Kogyo (Tokyo, Japan) bezogen, und der Anti-GD3-MAK R24 wurde hergestellt (21).

Patienten

Patienten mit einer Krankheit des AJCC-Stadiums III oder IV wurden als geeignet angesehen, wenn alle Hinweise auf Metastasen bildende Krankheiten innerhalb der letzten 8 Monate verworfen worden waren. Keiner der Patienten hatte vorher eine Chemotherapie oder eine Strahlentherapie erhalten. Die Patienten wurden auf Toxizität zum Zeitpunkt jeder Impfung bewertet. Darüber hinaus wurden die Patienten angewiesen, die örtlichen Reaktionen zu beobachten und ihre Temperatur zu messen. Diese Ergebnisse wurden telefonisch angefordert und dann bei dem nächsten Klinikbesuch zusammengefaßt. Vier Patienten (je einer der 4 Dosierungsmengen) erhielten aufgrund des Voranschreitens der Krankheit, das eine andere Behandlung nötig machte, nur 4 Imniunisierungen.

Impfstoffherstellung und Verabreichung

Das GM2-KLH-Konjugat wurde durch Biomira Inc. (Edmonton, Alberta) hergestellt. Das molare Verhältnis von GM2/KLH betrug etwa 800/1 und wurde in einer Konzentration von 0,57 mg Konjugat pro 0,5 ml normaler Kochsalzlösung bereit gestellt. Diese Menge stellte eine Patientendosis dar und enthielt 70 ug GM2, 500 ug KLH und 0,5 ml normale Kochsalzlösung. QS-21-Adjuvanz, das einen Saponinbestandteil enthielt, der aus der Rinde von Quillaja saponaria Molia gereinigt worden war, wurde von Cambridge Biotech Corp. (Woreester, MA) zu Verfügung gestellt. Die Reinheit von QS-21 wurde durch analytische Umkehrphasen-HPLC als 98% bestimmt. Zehn, 50, 100 oder 244 ug QS-21 wurden mit 0,25 ml normaler Kochsalzlösung verdünnt und mit GM2-KLH vermischt. Der Impfstoff (Endvolumen 0,75 ml) wurde 2-3 Minuten gemischt ("gevortext") und innerhalb von 15 min verabreicht. Es wurden vier Imrnunisierungen subcutan in zweiwöchigen Intervallen, gefolgt von zwei oder mehr (Immunisierungen) in achtwöchigen Intervallen verabreicht. Zu Beginn wurden 12 Patienten behandelt, jeweils drei mit einer der 4 QS-21-Dosen. Anschließend wurde ein weiterer Patient mit der 10 ug-Dosis behandelt, und 3 weitere Patienten wurden mit den 3 nächst höheren Dosen behandelt. Allen Patienten wurden 3 bis 6 Tage vor der ersten Impfung 200 mg/M2 Cyclophosphamid (Cytoxan, Mead Johnson and Co., Evansville, IN) i. v. verabreicht.

Serologische Untersuchungen und Tests der Hypersensitiviät des verzögerten Typs (DTH)

Die enzymgekoppelten Immunadsorbenz-Testansätze (ELISA) wurde wie vorher für die Ganglioside beschrieben durchgeführt (5). Für die ELISA-Testansätze mit QS-21 wurde QS-21:Ethyendiamin (hergestellt durch Verknüpfung von Ethylendiamin mit der Carboxygruppe der Glucuronsäure von QS-21) auf mit Glutaraldehyd behandelte lmmulon 4- Platten (Dynatech Labs, Chantilly, VA) aufgetragen. Um die unspezifische "Klebrigkeit" ("stickiness") zu kontrollieren, wurden die Immunseren auch auf Platten untersucht, die identisch weiter behandelt wurden, denen aber kein Gangliosid-KLH oder QS-21 zugegeben wurde, und der abgelesene Wert wurde von dem Wert abgezogen, der bei Anwesenheit des Antigens erhalten wurde. Der Titer wurde als die höchste Verdünnung definiert, die eine korrigierte Extinktion von 0,1 oder mehr ergab. Die Immunfärbung von Gangliosiden mit monoclonalen Antikörpern oder mit menschlichen Seren wurde nach dem Auftragen auf Nitrocellulose-Streifen wie vorher beschrieben durchgeführt (22). An den Patienten wurden Hautuntersuchungen mit GM2, GM2-HSA und KLH zum Zeitpunkt der fünften Impfung vorgenommen. Jeweils 25 Mikrogramm jeder Komponente wurden in 0,05 ml PBS verdünnt und intradermal verabreicht. Die Ergebnisse wurden wie vorher beschrieben interpretiert (5).

ERGEBNISSE

Toxizität

Die Anzahl der verabreichten Impfungen, die GM2-KLH alleine oder mit verschiedenen Dosen an QS-21 enthielten, und die örtlichen und systemischen Reaktionen, die mit diesen Impfungen verbunden waren, werden in Tabelle 6 gezeigt. Während GM2- KLH alleine oder mit 10 ug QS-21 zu gelegentlichen milden örtlichen Hautrötungen und Verhärtungen führten, führten die gesteigerten Dosen an QS-21 zu einer erhöhten Häufigkeit und Schwere der örtlichen Reaktionen. Bei den 10 und 50 ug-Dosen war dies mit leichter Empfindlichkeit und mit 2-4 cm großen Hautrötungen und Verhärtungen verbunden, die 24- 48 Stunden andauerten (es wurde keine die Stufe 1 überschreitende Toxizität nachgewiesen). Bei den höheren Dosen wurden diese Reaktionen vorherrschender, wobei die meisten Reaktionen sich bis zu 8-10 cm und einige (bei der 200 ug-Dosis) bis zu 20 cm im Durchmesser ausdehnten. Diese Reaktionen währten im Allgemeinen 2-4 Tage und in einem Fall bis zu 7 Tage bei der 100 ug-Dosis, und im Allgemeinen währten sie 7 Tage und in einem Fall bei der 200 ug-Dosis bis zu 10 Tagen. In keinem Fall waren stärkere Schmerzmittel als Tylenol erforderlich, und die Patienten mit den 10, 50 und 100 ug-Dosen verfolgten ihre normalen Aktivitäten weiter. Der Gebrauch der geimpften Extremität war 5-8 Tage nach der Verabreichung der meisten der Impfstoffe, die 200 ug Q5-21 enthielten, eingeschränkt, aber alle Hinweise auf örtliche Reaktionen waren verschwunden, wenn die Patienten nach zwei Wochen wieder untersucht wurden. Es waren keine Bildung von Geschwüren und Abfluß von Wundflüssigkeit oder subcutane Knoten (wie man sie bei den meisten anderen Adjuvanzien beobachtet) nachweisbar. Obwohl gelegentliche kurze, müde, niedrige Fieber oder Muskelschmerzen nach den Impfungen, die die niedrigeren 3 Dosen QS- 21 enthielten, beobachtet wurden, war ein Drittel der Impfungen, die die 200 ug-Dosis QS-21 enthielten, mit diesen Symptomen verbunden. Im Allgemeinen waren nach der zweiten Immunisierung systemische Symptome am auffallendsten. Alle Patienten der 200 ug-QS-21- Gruppe wurden aufgrund Besorgnis über die gesteigerten örtlichen und systemischen Reaktionen, bei ihrer dritten oder vierten Immunisierung auf 100 ug oder auf 50 ug QS-21 herabgesetzt (die Nebenwirkungen bei diesen Immunisierungen mit verminderten Dosen sind unter 100 ug und 50 ug in der Tabelle 6 angeführt). Diese Dosen wurden gut toleriert, und daher wurde bei allen 5 Patienten (ein Patient wies ein Voranschreiten der Krankheit auf und wurde nach 4 Immunisierungen herausgenommen) bei der fünften Immunisierung wieder auf 200 ug erhöht. Zwei der fünf Patienten hatten bei der fünften Immunisierung Fieber und Grippeähnliche Symptome, einer dieser Patienten besaß auch eine 20 cm große örtliche Hautrötung und Verhärtung. Die QS-21-Dosis dieses Patienten wurde bei der sechsten Impfung auf 100 ug gesenkt; es entwickelten sich keine systemischen Symptome und die örtliche Reaktion war mild (3-4 cm Hautrötung und Verhärtung). Keiner der vier verbleibenden sechsten Immunisierung mit 200 ug QS-21 war mit systemischen Symptomen verbunden. Obwohl insgesamt die systemischen Symptome relativ mild waren, war die örtliche Hautrötung, die Verhärtung und die Empfindlichkeit so auffallend, dass sich die Anmelder entschlossen, mit den höheren QS-21-Dosen nicht weiter zu arbeiten.

Die Antikörperantwortreaktion gegen GM2 nach den Impfungen (vergleiche Tabelle 7)

Die Immunisierung mit GM2-KLH alleine führte zur Antikörpertitern, die ganz ähnlich zu denen waren, die bei vorangegangenen Untersuchungen mit Impfstoffen, die GM2 enthielten, das an die Oberfläche von BCG angeheftet war, beobachtet worden waren. Fünf von 6 Patienten stellten IgM-Antikörper her, nur 1 Patient produzierte IgG-Antikörper (mit niedrigem Titer). Die IgM-Antikörpertiter steigerten sich bei erhöhten Dosen an QS-21. Der reziproke mittlere IgM-Antikörpertiter nach der Immunisierung mit GM2-KLH alleine betrug 80, bei 10 oder 50 ug QS-21 betrug er 480 beziehungsweise 240, und bei 100 oder 200 ug QS-21 betrug er 1280. Die IgG-Antikörpertiter steigerten sich mit den erhöhten Dosen fortschreitend ebenso, von 0 bei Patienten, die GM2-KLH alleine erhalten hatten, bis auf 10, 20, 200 und 640 bei Patienten, die 10 beziehungsweise 50, 100 und 200 ug QS-21 erhalten hatten. Die vorherrschenden IgM- und die nachweisbaren IgG-Antikörper (durch ELISA und Dot-Blot-Immunfärbungen bestimmt) wurden bei jedem Patienten beobachtet, der GM2-KLH plus QS-21 erhalten hatte. Die aufeinanderfolgenden IgM- und IgG-Antikörpertiter der Gruppen von je sechs Patienten, die die I00 und die 200 ug QS-21-Dosis erhalten hatten, werden in Fig. 9 gezeigt. Insgesamt ist die Antikörperantwort in den beiden Gruppen relativ ähnlich, obwohl die ELISA-IgG-Titer bei der 200 ug-Dosis leicht höher waren. Die Dot-Blot- Immunfärbungen gegen GM2 bestätigten die Spezifität für GM2 und die Ähnlichkeit der Reaktionen bei der 100 und der 200 ug-Dosis (vergleiche Tabelle 7 und Fig. 10). Die mittlere IgM-Dot-Blot-Reaktion gegen GM2 erhöhte sich von 2+ bei Patienten, die GM2- KLH alleine erhalten hatten, auf zwischen 2+ und 3+ bei Patienten, die 10 oder 50 ug QS-21 erhalten hatten, bis auf 3+ bei Patienten, die 100 oder 200 ug QS-21 erhalten hatten. Die IgG- Reaktionen erhöhten sich von 0 bei Patienten, die kein QS-21 erhalten hatten, auf 2+ bei Patienten, dis 10 oder 50 ug QS-21 erhalten hatten, bis auf 3+ bei Patienten, die 100 oder 200 ug QS- 21 erhalten haften.

Spezititäts-Untersuchung der GM2-Antikörperantwort

Die Dot-Blot-Immunfärbungen mit Seren, die vor und nach den Immunisierungen erhalten wurden, werden Jur 2 repräsentative Patienten für jede der 5 Behandlungsgruppen in Fig. 10 gezeigt. Vor der Immunisierung wurde die IgM-Reaktivität gegen GM1 in den Seren vieler Patienten nachgewiesen, wie die Anmelder vorher beschrieben haben, aber es wurde keine Reaktivität gegen GM2 oder andere Ganglioside nachgewiesen. Nach der Immunisierung war die GM1-Reaktivität nicht betroffen, aber IgM- und IgG-Antikörpertiter gegen GM2 wurden bei allen Patienten beobachtet. Wie die Anmeldet vorher beschrieben haben (13), wiesen diese durch GM2 induzierten Antikörper manchmal eine Kreuz- Reaktivität mit GD2 auf (Patient 1, 100 ug-Dosis).

Serologische Antwortreaktionen gegen KLH und OS-21

Wie in Tabelle 7 gezeigt wird, wurde eine Reaktivität gegen KLM vor der Immunisierung nicht beobachtet, steigerte sich aber fortschreitend mit den erhöhten Dosen an QS-21. Obwohl die 50, 100 und 200 ug-Dosen an QS-21 signifikant höhere Titer an IgG- Antikörpern gegen KLH induzierten, als die 0 oder die 10 ug-Dosis, bestand kein signifikanter Unterschied zu den serologischen Titern, die bei der 50, der 100 und der 200 ug- Dosis induziert wurden. Die Antikörpertiter gegen QS-21 wurden nach vier Immunisierungen durch ELISA untersucht. Es gab keine signifikante Erhöhung der Antikörper gegen QS-21 zwischen den Prä- und den Immunserum-Proben (Daten werden nicht gezeigt).

DTH-Antwortreaktionen auf GM2 und KLH

An den GM2- oder GM2-HSA-Hautteststellen wurden keine Hautrötungen oder Verhärtungen nachgewiesen. An den meisten KLH-Hautteststellen wurden deutliche Hautrötungsreaktionen nach 24 und 48 Stunden nachgewiesen, und diese Reaktionen waren bei den Patienten am größten, die die 200 ug-Dosis erhalten hatten (mittlerer Durchmesser 4,0 auf 6,0 cm). Diese waren mit nur minimaler Verhärtung verbunden, was auf eine Kombination aus DTH und durch Antikörper vermittelter Reaktion hindeutet, die eine genaue Quantifizierung der DTH-Antwortreaktion (durch Patienten zu Hause) schwierig macht.

Weitere klinische Versuche

Unter Verwendung der gleichen Dosis des Impfstoffs wie vorstehend (Biomira Inc.) wurden sechs Patienten mit fortgeschrittener Krankheit behandelt. Weiter sechs Patienten mit fortgeschrittener Krankheit wurden mit 1/10 der GM2-KLH-Dosis und wieder mit 100 ug QS-21 behandelt. Die Antikörpertiter beider Gruppen waren niedriger als diejenigen, die bei Patienten mit einem früheren Stadium der Krankheit beobachtet worden waren, aber die 7 ug- GM2-I3osis erschien bei der Induktion der IgM- und der IgG-Antikörpertiter als gleich wirksam wie die 70 ug Dosis.
In einer anderen Untersuchung wurden 6 Patienten mit einem frühen Stadium der Krankheit mit einem GM2-KLH-Konstrukt behandelt. Die IgG-Antikörpertiter waren denjenigen vergleichbar, die nach der Verabreichung des Biomira-Konstrukts beobachtet worden waren, obwohl die IgM-Antikörpertiter etwas geringer schienen. Alle Patienten stellten jedoch nach der Immunisierung Antikörper her, und der Impfstoffwurde gut toleriert.
Eine weitere Untersuchung wird 18 Patienten umfassen, die zu Beginn in wöchentlichen Intervallen Impfungen mit GM2-KLH erhalten (ein Protokoll, das sich bei Untersuchungen an Mäusen als überlegen erwiesen hat). Die Patienten werden zufällig ausgewählt, einige erhalten keine Vorbehandlung mit der niedrigen Cyclophosphamid-Dosis, und die anderen erhalten eine Vorbehandlung mit einer niedrigen Dosis Cyclophosphamid. Bis zu diesem Zeitpunkt sind 10 Patienten behandelt worden, und es scheint kein Unterschied zwischen den Patienten zu bestehen, die Cyclophosphamid erhalten haben und denjenigen, die kein Cyclophosphamid erhalten haben, und die Antikörpertiter scheinen dieses Mal mit der neuen Vorschrift denjenigen der vorangegangen Versuche mit dem gleichen Konjugat überlegen zu sein.

IDiSKUSSION

Dies war ein Phase I-Versuch, der dazu entworfen worden war, die maximal tolerierte Dosis (MTD) an QS-21 zur Verwendung bei den Außer-Haus-Patienten und die QS-21-Dosis, die die größte immunpotenzierende Wirkung liefert, zu identifizieren. Die vermutliche MTD wurde zu 200 ug QS-21 pro Impfung identifiziert. Obwohl das niedrige Fieber und das Unbehagen und die großen örtlichen entzündlichen Reaktionen bei der 200 ug-Dosis nicht als MTD im Zusammenhang mit einer hohen 112-Dosis oder einer kombinierten Chemotherapie wie sie bei hospitalisierten Patienten mit fortgeschrittenen Melanomen verwendet wird (23, 24), angesehen werden können, waren sie signifikant im Zusammenhang mit der Behandlung von Außer-Haus-Patienten bei der Adjuvanzbestimmung und wären zur Immunisierung gegen Infektionskrankheiten bei normalen Empfängern nicht annehmbar. Die 100 ug-Dosis führte jedoch bei 44 Injektionen nur zu 2 Fällen mit niedrigem Fieber, und die örtlichen entzündlichen Antwortreaktionen beeinträchtigten die täglichen Aktivitäten nicht und waren im Allgemeinen auf 2-4 Tage beschränkt. Diese Dosis wurde von der Patientengruppe des klinischen Versuchs gut toleriert. Es gab eine deutliche Steigerung der örtlichen und der systemischen Toxizität beim Übergang von der 100 ug-Dosis zu 200 ug, der uns zögern ließ, die Dosis weiter zu steigern. Während das Fieber und das Unbehagen bei der höchsten Dosis ähnlich waren zu denjenigen, die manchmal bei anderen immunologischen Adjuvanzien wie z. B. BCG und DETOX beobachtet wurden (15, 25), waren die örtlichen Reaktionen ganz unterschiedlich. Die subcutan injizierte 200 ug-Dosis QS-21 führte zu einer Fläche von 10-20 cm im Durchmesser mit Hautrötung und Verhärtung, die heiß und empfindlich gegen Berührung war. Diese örtliche Antwortreaktion ist diffuser als die Antwortreaktion, die üblicherweise bei Dosen von DETOX oder BCG beobachtet wird, die vergleichbare systemische Symptome hervorrufen. Ein überraschendes Merkmal dieser Antwortreaktionen war, dass einige Tage später (oder höchstens 10 Tage später) diese Reaktion vollständig abgeklungen waren und es keinen Hinweis darauf gab, dass die Impfung an dieser Stelle verabreicht worden war. Bei keinem Patienten wurden Geschwüre, Ausfluß von Wundflüssigkeit oder Knotenbildung an der Injektionsstelle nachgewiesen.
Ein zweiter überraschender Befund dieser Untersuchung war, dass QS-21 bei jeder verwendeten Dosis zu einer qualitativ unterschiedlichen Immunantwort auf das GM2- Gangliosid führte. Sogar bei der 10 ug-Dosis stellten alle Patienten IgG-Antikörper her, die durch Dot-IBlot-Immunfärbungen gegen GM2 nachweisbar waren. GM2-KLH-Irnpfstoffe alleine oder mit optimalen Dosen an BCG oder DETOX, oder GM2, das an die Oberfläche von BCG, die Sahnonella Minnesota-Mutante R595 oder an Proteosomen angeheftet war, hatten nur selten zu mehr als einer nachweisbaren IgG-Antwortreaktion pro 6 immunisierten Patienten geführt (2, 4, 5). Die IgM- und die IgG-Antikörpertiter gegen GM2 erhöhten sich mit steigenden Dosen QS-21, schienen aber zwischen der 100 und der 200 ug-Dosis ein Plateau zu erreichen. Die IgG-Antikörper gegen KLH erhöhten sich in ähnlicher Weise mit steigenden Dosen QS-21. Die maximalen IgG-Titer waren bei der 50, 100 und 200 ug-Dosis signifikant höher als bei der 0 oder 10 ug-Dosis, aber dis Titer bei den drei höheren Dosen waren nicht deutlich voneinander unterschieden. Diese Ergebnisse zeigen, dass die 100 und die 200 ug-Dosis QS-21 die optimale Antikörperantwortreaktion gegen GM2 induzieren, und dass die 100 ug-Dosis besser toleriert wird. Die anfänglichen Hautrötungs-Hauttest- Antwortreaktionen gegen KLH bei Patienten, die mit GM2-KLH alleine oder mit GM2-KLH plus unterschiedlichen Dosen an QS-21 immunisiert worden waren, war unerwartet. Sie könnte eine Kombination von durch Antikörper vermittelter, zur Arthus-Reaktion ähnlicher Reaktion, und einer DTH-Reaktion darstellen. Es ist auch möglich, dass die niedrigere Dosis KLH bei den Hauttests im Unterschied zu derjenigen, die von Anderen in Untersuchungen (26) verwendet wurde (25 ug im Gegensatz zu 100 ug) nicht ausreichte, um eine starke nachweisbare DTH-Reaktion hervorzurufen, oder dass die hohe Epitopdichte des GM2- Gangliosids auf dem KLH im Impfstoff nicht die normale Weiterverarbeitung und Präsentation des Antigen erlaubte, die zur Induktion einer klassischen DTH-Antwortreaktion gegen KLH erforderlich ist.
Trotz der weitverbreiteten Verwendung von QS-21 und anderen Saponin enthaltenden Adjuvanzien bei Versuchstieren und in der Veterinärpraxis (14-19), bleibt der Wirkungsmechanismus unbekannt. Es ist möglich aus diesen Untersuchungen einige Schlußfolgerungen über den Wirkungsmechanismus von QS-21 zu machen. Das Fehlen von fühlbaren Knoten an den Injektionsstellen läßt vermuten, dass eine Depotwirkung mit Granulombildung nicht stattfindet. Trotz der Potenz von QS-21 als Adjuvanz scheint es ein schlechtes Immunogen zu sein. Sogar nach wiederholten Immunisierungen ergab sich keine nachweisbare Antikörperantwortreaktion. Daher kann, nicht wie bei anderen Adjuvanzien wie z. B. C. parvum, BCG und komplettem Freundschem Adjuvanz, die Immunogenität von QS- 21 zu seiner Adjuvanzwirkung nicht mit beitragen. Niedriges Fieber und Unbehagen, die bei der 200 ug-Dosis beobachtet wurden, und diffuse Hautrötungen und Verhärtung an den Injektionsstellen legen nahe, dass eine Freisetzung von Cytokinen beteiligt ist. Die intradermale Injektion von IL-2 führte zu sehr ähnlichen Reaktionen, die sich bei der Biopsie als charakteristische Merkmale klassischer DTH-Reaktionen herausstellten (27, 28). Ein teilweises Umschalten der GM2-Antikörper zu einer IgG-Antwortreaktion legt eine Induktion der Hilfe von T-Zellen nahe, die möglicherweise als Folge dieser Induktion von Cytokinen auftritt.
Die Anmelder haben vor Kurzen die Überlegenheit von KLH über andere Träger gezeigt, die zur Verbesserung der Immunogenität von Gangliosiden untersucht wurden (12), und die Anmelder zeigen hier die optimale Dosis an QS-21 für die weitere Verbessenmg dieser Wirkung auf Da sich die Anmelder auf einen großen Phase Iii-Versuch mit Gangliosid-Impfstoff bei Melanompatienten mit dem AJCC-Stadium III vorbereiten, bleibt noch eine Anzahl an Variablen zu untersuchen. Die Anmelder führen derzeit vorklinische Untersuchungen mit diesem Gangliosid-KLH plus QS-21-Impfstoff und der Verwendung verschiedener anderer immunologischer Adjuvanzien durch. Darüber hinaus sind klinische Versuche mit unterschiedlichen Imniunisierungsprotokollen und unterschiedlichen Dosen an GM2-KLH geplant. Die überraschenden Befunde bei dem hier beschriebenen Phase I- Versuch sind 1) es wurde kein Hinweis auf Granulombildung bei irgendeiner QS-21-Dosis nachgewiesen und 2) dass bei der gut tolerierten Dosis von 100 ug, die serologische Antwortreaktion gegen GM2 jeder anderen, die mit den vorher untersuchten GM2- Impfstoffen beobachtet wurde, quantitativ und qualitativ eindrucksvoll überlegen war. TABELLE 6 ANZAHL VON AUFGETRETENEN NACHTEILIGEN REAKTIONEN (UND IHRER HEFTIGKEIT) BEI JEDER QS-21-DOSIS BEI PATIENTEN, DIE IMPFSTOFFE ERHALTEN HATTEN, DIE 500 ug GM2-KLH ± QS-21 ENTHIELTEN
* 7(1): örtlicher Schmerz oder Empfindlichkeit wurde nach 7 von 22 Impfungen empfunden, die 10 ug QS-21 enthielten. Die Zahl in der Klammer gibt die mittlere Heftigkeit nach den allgemeinen Toxizitätskriterien des NCI (NCI Common Toxicity Criteria) an, in diesem Fall eine leichte örtliche Empfindlichkeit. Bei der örtlichen Toxizität bedeutet (1) geringe Empfindlichkeit und Hautrötung, (2) mäßige Hautrötung und Verhärtung < 10 cm, Schmerz, der keine narkotisierenden Schmerzmittel erfordert, (3) Hautrötung und Verhärtung ≥10 cm, Schmerz, der narkotisierende Schmerzmittel erfordert (nicht beobachtet). Bei der systemischen Toxizität bedeutet (1) (Fieber)-Temperaturen im Bereich von 101º-103º F, leichte Kopfschmerzen, leichte Muskelschmerzen oder leichtes Unwohlsein ohne Erbrechen. TABELLE 7 SEROLOGISCHE ANTWORTREAKTION NACH DER IMPFUNG MIT GM2-KLH PLUS VERSCHIEDENEN Q5-21-DOSEN TABELLE 7 - Fortsetzung
a Ein Patient besaß vor der Behandlung eine maximale ELISA-Titer-Antwortreaktion von 1/20. 2ah1 in der Klammer gibt die Anzahl an Patienten mit einer bestimmten Antwortreaktion an. In diesem Fall sind dies fünf Patienten, die keine nachweisbaren GM2-Antikörper aufwiesen.

Fünfte Reihe der ExDerimente

EINLEITUNG

Das Auftreten von bösartigen Melanomen hat in den letzten Dekade rasch zugenommen. 1992 entwickelten in den Vereinigten Staaten über 32.000 Personen Melanome, und es wurden 6.700 Sterbefälle durch Melanome aufgezeichnet (1). Nach einem geeigneten Teilentfernung der primären Melanome, reicht die fünfjährige Überlebensrate von mehr als 95% bei Patienten mit primären Tumoren einer Dicke von < 0,75 mm bis zu 50% bei Patienten mit primären Tumoren von > 4,0 mm Dicke (2). Patienten mit regionalen Lymphknoten-Metastasen (AJCC-Stadium III) haben eine 5-Jahres-Überlebensrate von 25-35% nach wahlweiser oder therapeutischer Zerlegung (Entferung) (3). Es wurde gezeigt, dass keine Adjuvanz-Therapie die Wiederauftrittsrate vermindert und die Überlebensrate bei diesen Patienten nach der Operation erhöht. Eine große Vielzahl von Mitteln wurde bei diesen Adjuvanz-Versuchen untersucht (zusammengefaßt in 4, 5) einschließlich Chemotherapie, unspezifische Immunstimulatoren, Interferone und verschieden Arten von Melanom- Impfstoffen. Im Hinblick auf die Melanom-Impfstoffe, bestand die Herausforderung darin, Verfahren zu entwickeln, die die Immunogenität der Impfstoffe in Bezug auf Stärke und Spezifität der sich ergebenden Immunantwort überwachen. Da humorale Immunreaktionen auf Impfstoffe mit einer Genauigkeit quantifiziert und untersucht werden können, die erst jetzt auch bei zellulären Immunreaktionen möglich wird, haben sich die Anmelder auf Melanom-Antigene konzentriert, die humorale Immunität hervorrufen. Von diesen serologisch definierten Antigenen erschienen Ganglioside, insbesondere GM2 als attraktive Ziele für eine aktive Immunisierung (5-8). Die Anmelder haben vor Kurzem gezeigt, dass die Immunisierung mit gereinigtem GM2, das an BCG angeheftet ist, nach der Vorbehandlung mit einer niedrigen Dosis Cy bei einem hohen Prozentsatz an Melanompatienten zur Induktion von IgM-Antikörpern führte (8, 9). Die GM2-Antiköperantwortreaktion zeigte ein von T-Zellen unabhängiges Muster, d. h. kurze Dauer, Fehlen einer IgG-Antwortreaktion und Fehlen einer Booster-Wirkung bei wiederholten Impfungen. Die induzierten Antikörper waren bei Anwesenheit von menschlichem Komplement für GM2-exprimierende Melanomzellen cytotoxisch, und Patienten, die GM2-Antikörper nach der Immunisierung herstellten, wiesen einen signifikant längeren krankheitsfreien Zeitraum und eine höhere Überlebensrate auf, als die Patienten, die dies nicht taten (9). Der Zweck der vorliegenden Untersuchung bestand darin, die nützlichen Wirkungen der durch den Impfstoff induzierten GM2-Antikörperproduktion in einem zufallsverteilten Kontrollversuch zu bestätigen.

Material und Methoden

Patienten

Patienten mit dokumentierten pathologischen Melanom-Metastasen, die auf örtliche Hautbereiche und Lymphknoten beschränkt waren (AJCC-Stadium III) waren für einen Zeitraum von 2 Wochen bis zu 13 Wochen nach der vollständigen Entfernung der Hautmetastasen oder der regionalen Lymphknoten geeignet. Andere Auswahikriterien umfaßten: Alter > 15 Jahre; Karnofsky-Aktivitäts-Status 90; Serum-Creatinin < 2,5 mg/dl, Serum-Bilirubin < 2,5 mgldl; keine weiteren Krebsarten; keine Chemotherapie oder Strahlentherapie während eines 8-wöchigen Zeitraums vor der Impfung. Schwangere Frauen wurden ausgeschlossen. Alle Patienten wurden untersucht, und die Eignung wurde innerhalb von zwei Wochen vor der Zufallsverteilung bestimmt. Die anschließenden klinischen Folgeuntersuchungen wurden von dem ersten Onkologen des Patienten durchgeführt.

Zufallsverteilung und Folgeuntersuchungen

Das informierte Einverständnis wurde von allen Patienten erhalten, und sie wurden nach der Anzahl der positiven Lymphknoten (1, 2-4, ≥ 5), dem Vorliegen der im Ubergang befindlichen Krankheit und dem Zeitraum zwischen der Operation und der Impfung (2-6 Wochen, 7-13 Wochen) gruppiert. Die Patienten wurden mit Hilfe des Computers zufallsverteilt (mit der angepassten Zuordnung der Blockgröße, um in etwa die gleiche Anzahl in den beiden Zweigen abzusichern), um mit GM2/BCG oder mit BCG alleine immunisiert zu werden. Es wurden weder die Patienten noch das medizinische Personal üher den Typ des verabreichten Impfstoffs bis zwei Wochen nach der letzten Impfung informiert. Die Informationen über die Folgeuntersuchungen von allen Patienten wurden über einen einwöchigen Zeitraum alle 4-6 Monate durch Telefonate mit ihren ersten Ärzten erhalten. Das Datum des Wiederauftretens, das radiographisch oder pathologisch dokumentiert wurde, wurde verwendet, um den krankheitsfreien Zeitraum zu bestimmen. Da die beiden unspezifischen Bestandteile dieses Impftestansatzes, d. h. BCG und die niedrige Cyclophosphamid-Dosis, eine aufzeigbare Anti-Tumor-Aktivität haben könnten (10, 11, 12), wurden sie für den Kontrollzweig als geeigneter als keine Behandlung angesehen.

GM2/BCG-Impfstoff

Das zur Impfstoftherstellung verwendete Gangliosid GM2 wurde aus zwei Quellen erhalten, Hirngewebe aus Katzen mit Tay-Sachs-Krankheit (in diesen Katzen als autosomales rezessives Merkmal weitergegeben) und GM1, das aus den Hirnen von Nutz-Kühen präpariert worden war, und von Supelco, Bellefonte, PA bezogen wurde. Scheiben von Tay-Sachs- Katzenhirnen (bereitgestellt von Dr. Mario Ratazzi, Mt. Sinai Hospital, New York, NY) wurden mit Chloroform/Methanol extrahiert, und der Extrakt wurde peracetyliert, einer Florisil-Chromatographie unterworfen, um Phospholipide zu entfernen, deacetyliert, dialysiert und einer DEAE-Sephadex-Säulen-Chromatographie unterworfen (13). Nach der Dialyse wurde das GM2, das die Hauptfraktion darstellte, durch präparative Dünnschicht- Chromatographie aufgetrennt. GM2 wurde aus GM1 aus Rinderhirn durch Spaltung der endständigen Galactose unter Verwendung von β-Galactosidase wie vorher beschrieben (14) hergestellt. Das GM2 aus den beiden Quellen war durch Dünnschicht-Chromatographie (TLC) und Immun-TLC unter Verwendung monoclonaler Antikörper aus Mäusen, die GM2 erkennen, nicht unterscheidbar (13). Jede Charge GM2 war zu mehr als 98% rein, wie durch Dünnschicht-Chromatographie und densitometrische Aufnahme definiert wurde. Die Chargen wurden durch Standardtests auf Sterilität und auf Sicherheit in Meerschweinchen und Mäusen hin untersucht.
Gereinigtes GM2 wurde getrocknet und bei 4ºC aufbewahrt. 10&sup7; lebende Einheiten (oder 3 · 10&sup6; lebende Einheiten zur Anwendung bei Patienten mit einem positiven PPD-Test) des BCG-Stammes Tice (University of Illinois, Chicago, IL) wurden in destilliertem Wasser durch Behandlung mit Ultraschall zusammen mit 200 ug getrocknetem, gereinigtem GM2 suspendiert. Die Suspension wurde lyophilisiert und bei -80ºC aufbewahrt. Der Rückstand wurde kurz vor der Verabreichung des Impfstoffs in 0,5 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) resuspendiert. Es wurde herausgefunden, dass sich GM2 unter diesen Bedingungen an BCG anheftet, dies geschieht vermutlich durch hydrophobe Bindungen, wie die Anmelder vorher berichtet haben (8). Zur Verwendung bei der Kontrollgruppe wurde BCG in PBS suspendiert. Alle Patienten in der GM2IBCG-Gruppe erhielten 200 ug GM2 pro Impfung. Diese linpfstoffe und das Impfprotokoll wurden durch die Aufsichtskommission (Jnstitutional Review Bord) des Memorial Hospital genehmigt und unter einer IND der U. S. Food and Drug Administration verwendet. Die ersten Patienten erhielten GM2 aus Katzerihirn. Anschließend wurde ein erhöhter Anteil an aus GM1 stammenden GM2 verwendet, da GM2 aus Katzenhim nicht länger verfügbar war. Alle Patienten erhielten intradermale Impfstoffinjektionen an 6-10 Stellen einer Extremität mit intakter Lymphdrainage, und diese wurde zweimal in zweiwöchigen Intervallen jedesmal unter Verwendung einer anderen Extremität wiederholt. Zwei und fünf Monate nach den anfänglichen Impfreihen wurden Booster-Immunisierungen verabreicht.

Die Verabreichung von Cy

Allen Patienten wurde fünf bis sieben Tage vor der ersten und der vierten Injektion eine einzige Dosis von 200 mg/M2 Cy (Cytoxan; Mead Johnson and Co., Evansville, IN) intravenös verabreicht.

Gangliosid-Reagenzien

GD2 wurde durch Behandlung von GDlb mit β-Galactosidase (G. W. Jourdian, University of Michigan, Ann Arbor, M1) gemäß veröffentlichten Verfahren (14) hergestellt. GM1 wurde von Supelco (Bellefonte, PA) bezogen. GD3 war ein Geschenk der Fidia Research Laboratories (Abano Terme, Italien), und GDlb wurde von der gleichen Quelle bezogen. GM3 wurde aus roten Blutkörperchen von Hunden gereinigt (13). GM2 für Dot- B1ot-Immuntbrbungen (Fig. 11) wurde aus GM1 durch Behandlung mit β-Galactosidase hergestellt oder aus menschlichen Melanom-Biopsie-Proben wie vorher beschrieben extrahiert (13).

Serologische Verfahren

Die Seren wurden zum Zeitpunkt jeder Impfung gewonnen, 2 und 6 Wochen nach Impfung 3, 4 und 5 und 3 Monate nach Impfung 5. Der ELISA für die GM2- oder die BCG- Antikörper (9) wurde mit Patientenseren und sekundären Anti-Mensch-IgM- oder Anti- Mensch-IgG-Antikörpern aus Kaninchen oder mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Protein A (Kirkegaard and Perry Labs, Gaithersburg, MD) durchgeführt. Die abgelesenen Werte, die mit normalen Seren aus Spendern ohne GM2-Reaktivität erhalten wurden, wurden von den abgelesenen Werten abgezogen, die mit den Patientenseren erhalten wurden. Der Antikörpertiter wurde, wie vorher beschrieben (9), als die höchste Serumverdünnung definiert, die eine korrigierte Extinktion von > 0,10 ergab. Die Dot-Blot-Immunfärbungen wurden wie vorher beschrieben durchgeführt (8, 9) und mit 0, 1+, 2+ oder 3+ wie in Fig. 1 gezeigt bewertet. Die Seren wurden als positiv eingeordnet, wenn die GM2-Reaktivität bei dem Dot-Blot 2+ oder 3+ mit einem ELISA-Titer von 1/20 betrug oder I+ bei dem Dot-Blot mit einem ELISA-Titer von ≥1/80. Komplement-abhängige Cytotoxizitäts-Testansätze wurden so durchgeführt, wie vorher für normales menschliches Serum (1/3 verdünnt) als Komplement-Quelle beschrieben wurde, und die sichtbare Quantifizierung der nicht überlebenden Zellen erfolgte durch Giemsa-Färbung (8, 15).

Hauttests auf Hypersensitivität des verzögerten Typs (DTH)

Liposomen mit einer Lamelle wurden aus Eier-Phosphatidylcholin hergestellt und zehnmal durch einen 0,1 Mikron-Filter gepresst. Am Tage des Hauttests (2 Wochen nach der vierten Impfung) wurden 1,5 mg Phosphatidylcholin-Liposomen und 25 ug GM2 in PBS gemischt und in einem Branson 1200 Wasserbad-Ultraschallgerät (Shelton, CT) mit Ultraschall behandelt. Die Hauttests (0,1 ml Volumen) mit a) 25 ug GM2 und b) 25 ug/1,5 mg GM2/Liposomen wurden durchgeführt und wie vorher beschrieben (16, 17) nach 48 Stunden abgelesen.

ERGEBNISSE

Merkmale der Patienten

Zwischen dem 10. März 1987 und dem 17. März 1989 wurden insgesamt 123 Patienten aufgenommen. Bei der Übersicht wurde gefunden, dass ein Patient das AJCC- Stadium 11 der Krankheit aufwies (keine positiven Lymphknoten), und er wurde daher in die Analyse nicht mit einbezogen. Alle 122 geeigneten Patienten wurden unabhängig von der Anzahl an Impfstoffen (Impfungen) die sie erhalten hatten, zufallsverteilt in die Analyse mit einbezogen. Zwei Patienten (einer in jeder Gruppe) entschied sich, die Studie nach einer Immunisierung zu verlassen, da sie es zu schwierig fanden, sich mit der Unsicherheit einer experimentellen Therapie und der zufälligen Auswahl umzugehen. Ein Patient der BCG- Gruppe hatte nur zwei Inimunisierungen erhalten, als ein Voranschreiten der Krankheit entdeclkt wurde, und die Behandlung wurde nicht fortgesetzt. Alle anderen Patienten erhielten zumindest die anfängliche Reihe an drei Immunisierungen und verblieben bis zur Abschluß oder bis zum Voranschreiten der Krankheit im Protokoll. Ein Patient in der BCG-Gruppe erhielt bei der fünften Impfung unabsichtlich GM2/BCG (er stellte GM2-Antikörper her, und blieb frei von Krankheit). Die mittlere Zeitspanne der Folgeuntersuchungen beträgt fünf Jahre und drei Monate mit einer minimalen Zeitspanne der Folgeuntersuchungen von vier Jahren und drei Monaten nach der vor der Zufallsauswahl erfolgten Operation.
Die Merkmale der 122 zufällig ausgewählten Patienten werden in Tabelle 8 gezeigt. Der einzige wichtigste Vorhersagefaktor für Patienten mit einem Melanom des Stadiums III ist die Anzahl an positiven Lymphknoten (3). Andere Faktoren, die mit einer schlechten Prognose verbunden sind, umfassen Kopf und Nacken oder Rumpf als primären Stellen und im Übergangsstadium befindliche Melanome (3). Die GM2-BCG- und die BCG-Gruppe waren hinsichtlich dieser Vorhersagefaktoren vergleichbar. TABELLE 8 MERKMALE DER PATIENTEN

Nebenwirkungen

Die Vorbehandlung mit Cy führte gelegentlich zu mildem Brechreiz oder Übelkeit für 2-24 Stunden, wurde aber meist gut vertragen. Die intradermale Injektion von BCG führte bei allen Patienten, die drei oder mehr Immunisierungen erhalten hatten, zu Entzündungen und Schorfbildung mit Ausfluß von Wundflüssigkeit. Um die Entzündungsreaktionen auf einem zumutbaren Grad zu halten, wurde die BCG-Dosis um den Faktor 3 vermindert, wenn die Schorfbildung oder der Ausfluß von Wundflüssigkeit zuerst entdeckt wurde. Folglich betrug die mittlere BCG-Dosis zum Zeitpunkt der letzten Immunisierung 3 · 10&sup6; lebende Einheiten bei beiden Behandlungsgruppen. Die Dosis von 10&sup7; Einheiten wurde nur bei 10% der Patienten beibehalten, und bei einigen Patienten war eine weitere Absenkung der Dosis auf 10&sup6; Einheiten erforderlich. GM2 hatte keine Wirkung auf die Entzündungsreaktion auf BCG und verursachte keine weiteren Nebenwirkungen.

Serologische Antwortreaktionen gegen GM2

Die aufeinanderfolgenden Anti-GM2-IgM-Antikörpertiter vor und nach der Impfung mit GM2/BCG werden in Fig. 10 für die ersten fünf behandelten Patienten (in 1987) und letzten fünf behandelten Patienten (in 1989), die die vollständige Reihe an GM2/BCG- Immunisierungen erhalten hatten, gezeigt. Wie bei einer vorangegangenen Untersuchung (9) bestand die Antikörperantwortreaktion vorwiegend aus dem IgM-Typ, und zeigte häufig eine Steigerung des Titers nach jeder Immunisierung, die eher einer wiederholten Primärantwort ähnelte, als einer sich rückerinnernden Sekundärantwort. Die Präimmunseren und die Immunseren mit maximalen Titer aller Patienten wurden auch durch Dot-Blot-Immunfärbung untersucht, um die Spezifität der durch ELISA nachgewiesenen Antikörper zu bestätigen. Die Dot-Blot-Immunfärbungen mit den zehn Seren, die in Fig. 10 gezeigt werden, sind in Fig. 11 dargestellt. Wie vorher beschrieben (8, 9), wurde gelegehtlich vor der Behandlung eine Reaktivität gegen GM1 mit niedrigem Titer nachgewiesen. Die durch den Impfstoff induzierte Reaktivität war auf GM2 beschränkt; es wurde keine Reaktivität mit GM3, GD2, GDIb oder GD3 beobachtet. Die GM2-Antikörper waren in der Lage, mit menschlichem Komplement die Komplement-abhängige Cytotoxizität bei Untersuchungen an GM2 exprimierenden Tumorzellen zu vermitteln (Tabelle 9). Während des zweijährigen Patienten- Berichtszeitraums wurde keine Veränderung dieses Musters der Antikörperantwortreaktion und der Spezifität beobachtet. Die Ergebnisse der serologischen Analyse aller Patienten sind in Tabelle 10 zusammengefaßt. Es wurde gefunden, dass sieben der 64 Patienten des BCG- Zweigs sowohl beim ELISA (mittlerer Titer 1/40) als auch bei der Dot-Blot-Immunfärbung (Durchschnitt 2+) GM2-Antikörper aufwiesen. Diese Antikörper bestanden in 5 Fällen bereits vorher und wurden in 2 Fällen erst nach der BCG-Impfung nachgewiesen. Die Titer der GM2-Antikörper erhöhten sich bei 3 von 5 Patienten, die vorher GM2-Antikörper aufwiesen, nach der BCG-Impfung 4-fach oder höher. Im Gegensatz dazu, zeigte nur einer der 58 Patienten, die GM2/BCG erhalten hatten, bei beiden Testansätzen vor der Immunisierung eine GM2-Reaktivität, und 50 von 58 Patienten wiesen GM2-Antikörper (mittlerer ELISA-Titer 1/160) in ihren Seren nach der Immunisierung auf, wie durch Dot-Blot-Immunfärbung (mittlerer Titer 3+) bestätigt wurde. Die serologische Gesamt-Anti-GM2-IgM-Antwortrate (2+ oder 3+ beim Dot-Blot und ein ELISA-Titer von ≥1/20 oder 1+ beim Dot-Blot und ein ELISA-Titer von ≥1/80) in beiden Gruppen betrug 11% bei BCG alleine und 86% bei GM2/BCG.
In keinem Patientenserum wurden vor der Immunisierung IgG-Antikörper nachgewiesen, und sie wurden in keinem Patienten durch die Immunisierung mit BCG induziert (Tabelle 10). Die Impfung mit GM2/BCG induzierte eine positive IgG- Antikärperantwortreaktion bei acht Patienten (mittlerer ELSIA-Titer 1/80, mittlerer Dot-Blot- Wert 2+). Diese Antwortreaktionen waren kurzlebig (mittlere Verweildauer 8 Wochen) und steigerten sich im Allgemeinen bei den weiteren Imniunisierungen nicht. Die IgG-Reaktivität war in allen Fällen auf GM2 beschränkt (Daten werden nicht gezeigt). Alle acht Patienten wiesen ebenfalls IgM-Antikörper auf, die einen höheren Titer und eine längere Verweildauer als die IgG-Antikörper besaßen. TABELLE 9 VERGLEICH DER GM2-ANTIKÖRPERTITER VOR UND NACH DER IMMUNTSIERUNG MIT GM2/BCG, WIE SIE DURCH ELISA UND CYTOTOXIZITÄTSTESTS MIT MENSCHLICHEM KOMPLEMENT BESTIMMT WURDEN
* Zielzellen: Astrocytom-Zelllinie SK-MG 6. TABELLE 10 GM2-ANTIKÖRPER IM SERUM VON MELANOMPATIENTEN VOR UND NACH DER IMMUNISIERUNG MIT GM2/BCG ODER MIT BCG-IMPFSTOFFEN

DTH-Antwortreaktion auf GM2

Nach der anfänglichen Reihe von drei Impfungen wurden Hauttests auf DTH gegen GM2 und andere Antigene durchgeführt. Alle Patienten, die drei oder mehr Immunisierungen erhalten hatten, entwickelten starke DTH-Antwortreaktionen gegen BCG. Acht Patienten (vier, die mit BCG und vier, die mit GM2BC geimpft worden waren) zeigten positive DTH- Antwortreaktionen gegen GM2 und GM2-Liposomen (die dazu verwendet worden waren, GM2 an der Hautteststelle zu halten) mit Verhärtungen von 10 bis 33 mm. Weitere Untersuchungen offenbarten, dass diese 8 Patienten eine ähnliche Reaktivität mit Gangliosidfreien Liposomen und mit anderen Gangliosiden aufwiesen. Somit gab es keinen Hinweis auf eine GM2-spezifische DTH bei irgendeinem Patienten.

Serologische Antwortreaktionen gegen BCG

Die Seren aller Patienten wurden auf IgG-Reaktivität beim ELISA gegen 103 lebensfähige Organismen/Vertiefung mit BCG, das in den ELISA-Platten wie für Ganglioside beschrieben angetrocknet war, untersucht. Vor der Impfung wurde keine Reaktivität beobachtet. Die Impfseren wiesen BCG-Antikörpertiter von 1/40 - 1/80 bei beiden Behandlungsgruppen auf, unabhängig davon, ob die Patienten GM2-Antikörper herstellten oder nicht.

Korrelation der Antikörperantwortreaktion und der Immunisierung mit dem krankheitsfreien Zeitraum und der Überlebensrate

Der Vergleich des krankheitsfreien Zeitraums und der Gesamt-Überlebensrate von allen Patienten, die GM2-Antikörper produzierten, wie durch zwei Testansätze dokumentiert (ELISA-Titer ≥1/180 und Dot-Blot Wert 1+ oder ELISA-Titer ≥1/20 und Dot-Blot-Werte ≥ 2+) mit denjenigen von Patienten, die keine GM2-Antikörper herstellten, werden in Fig. 12 gezeigt. Signifikante Unterschiede wurden sowohl beim krankheitsfreien Zeitraum als auch bei der Gesamt-Überlebensrate beobachtet (p = 0,004 beziehungsweise 0,02, im 10 g-Rang- Test). Von den sechs Patienten, die GM2-Antikörper vor der Immunisierung herstellten (5 haften BCG und einer hatte GM2/BCG erhalten), entwickelte nur einer (ein Patient der BCG- Gruppe) eine wiederauftretende Krankheit, was nahe legt, dass die natürliche Produktion von GM2-Antikörpern bei Patienten mit Melanomen mit einem vorteilhaften Verlauf verbunden ist. Im Gegensatz dazu, entwickelten von acht Patienten, die nach der Immunisierung mit GM2/BCG keine GM2-Antikörper herstellten, sechs wiederauftretende Melanome und starben, was nahelegt, dass die Unfähigkeit GM2-Antikörper nach der Immunisierung herzustellen, eine ungünstige Prognose anzeigt. Die mittleren Antikörpertiter bei den sechs Patienten, die natürliche GM2-Antikörper herstellten, waren die gleichen, wie die Titer bei den acht GM2-Antikörper-negativen Patienten in dem GM2/BCG-Zweig, was anzeigt, dass diese Patienten sich in ihrer Fähigkeit eine serologische Antwortreaktion auf ein nicht verwandtes Antigen zu entwickeln nicht unterschieden.
Wenn die sechs Patienten, die GM2-Antikörper vor der zufälligen Verteilung herstellten (fünf im BCG-Zweig und einer im GM2/BCG-Zweig) von der Analyse ausgeschlossen werden, war der krankheitsfreie Zeitraum der GM2/BCG-Gruppe signifikant länger als der der BCG-Gruppe (p = 0,02 im log-Rang-Test), und ein Trend zu einer höheren Gesamt-Überlebensrate wurde für die GM2/BCG-Gruppe ebenfalls beobachtet (Fig. 13). Das Plateau der Kurve liegt bei 40-52 Monaten, mit Unterschieden von 23% beziehungsweise 14% bei dem krankheitsfreien Zeitraum und der Gesamt-Überlebensrate.
Die geringe Anzahl an Patienten, die IgG-Antikörper herstellten, die nach der Immunisierung mit GM2 reagierten, macht es unmöglich, eine Schlußfolgerung über die relativen Verdienste der IgM- und der IgG-Antikörper gegen GM2 zu ziehen. Fünf der acht Patienten, die für IgG- GM2-Antikörper positiv waren, sind bis zu diesem Zeitpunkt frei von Krankheit geblieben. Der Vergleich der beiden Behandlungsgruppen in ihrer zufälligen Verteilung wird in Fig. 14 gezeigt. Die Kurven gehen bei 40 bis 52 Monaten in eine Plateau über mit 18% Unterschied beim krankheitsfreien Zeitraum und 11% Unterschied bei der Gesamt- Überlebensrate zugunsten der Impfung mit GM2/BCG. Diese Unterschiede waren statistisch nicht signifikant. Der krankheitsfreien Zeitraum (30%) und die Gesamt-Überlebensrate (46%) nach 51 Monaten (der minimale Zeitraum der Folgeuntersuchungen) bei der BCG-Gruppe sind ähnlich den Raten, die die Anmelder früher bei Patienten beobachteten, die zufällig verteilt waren und BCG oder keine Behandlung erhielten (28). Wie in Fig. 14 gezeigt, war die nützliche Wirkung der Immunisierung deutlicher, wenn die beiden Behandlungsgruppen nach der Anzahl der positiven Knoten (1 oder 2 oder mehr) eingeteilt wurden. Die Immunisierung hatte bei Patienten mit nur einem positiven Knoten weniger Einfuß. Im Gegensatz dazu, war der krankheitsfreie Zeitraum bei Patienten mit zwei oder mehreren positiven Knoten, die GM2/BCG erhalten hatten, signifikant länger als derjenige der Patienten, die mit BCG alleine immunisiert worden waren (p = 0,02 im log-Rang-Test). Ein ähnlicher Trend wurde bei der Überlebensrate beobachtet (p = 0,08 im log-Rang-Test).

DISKUSSION

Die Anmelder haben beträchtliche Anstrengungen unternommen, Gangliosid- Impfstoffe zu entwickeln, die hohe Spiegel an Serum-Antikörpern induzieren (18, 19), weil 1) Ganglioside Haupt-Zelloberflächen-Bestandteile von Melanomzellen darstellen (14, 20-25), 2) menschliche monoclonale Antikörper mit einer Spezifität für Ganglioside mit einer relativ hohen Häufigkeit aus Patienten mit Melanomen isoliert werden können (14, 25-28) und 3) menschliche Tumorzellen, die Gangliosid-Antigene exprimieren, durch Anti-Gangliosid- Antikörper in Gegenwart von menschlichem Komplement lysiert werden können (13, 29). Es wurde herausgefunden, dass das Gangliosid GM2 beim Menschen besonders immunogen wirkte" und es wurde gezeigt, dass Impfstoffe, die gereinigtes GM2 und BCG als Adjuvanz enthielten, GM2-Antikörper bei Melanompatienten hervorrufen, die mit einer niedrigen Dosis Cyclophosphamid vorbehandelt worden waren (8, 9). Mit der hier vorgestellte Untersuchung war beabsichtigt zwei Fragen zu beantworten - induziert die Impfung mit einem GM2/BCG- Impfstoff die Produktion von GM2-Antikörpern bei einem hohen Prozentsatz an Melanompatienten und verändert die Induktion der GM2-Antikörper den Verlauf der Krankheit bei Patienten mit Melanomen des Stadiums III nach der vollständigen Entfernung des ganzen erkennbaren Tumors?
im Hinblick auf die Induktion von GM2-Antikörpern war die Immunisierung mit GM2/BCG bei der Mehrzahl der Patienten deutlich wirksamer. Von 58 Patienten, die den GM2/BCG-hnpfstoff erhalten hatten, stellten 50 GM2-Antikörper her, die sowohl durch ELISA als auch durch Dot-Blot-Immun-Färbungstests nachgewiesen wurden. Wie bei früheren Experimenten (9), gehörten die induzierten GM2-Antikörper zum größten Teil zur IgM-Klasse; IgG-Antikörper wurden weniger häufig nachgewiesen. Die Korrelation zwischen der GM2-Antikörperproduktion und einem günstigeren klinischen Verlauf (9) wurde hier ebenfalls bestätigt und auf eine homogenere Population an krankheitsfreien Melanompatienten mit dem AJCC-Stadium III ausgedehnt. Die Patienten, die GM2- Antikörper herstellten (egal, ob dies natürlich auftrat oder durch den Impfstoff induziert wurde), hatten einen signifikant längeren krankheitsfreien Zeitraum und eine höhere Gesamt- Überlebensrate als die Patienten, die keine Antikörperantworlreaktion zeigten. Bereits bestehende GM2-Antikörper (vor der Impfung) wurden bei dieser Reihe bei sechs Patienten beobachtet und schienen mit einer besonders günstigen Prognose verbunden zu sein. Da das Auftreten spontaner GM2-Antikörperproduktion in der allgemeinen Bevölkerung und bei den Melanompatienten ähnlich zu sein scheint (10%) (8, 9), bleibt die Beziehung zu der Entwicklung und dem Wachstum von Melanomen unbekannt. Es ist bemerkenswert, dass der Titer der bereits bestehenden GM2-Antikörper sich über den neunmonatigen Nachfolgeuntersuchungszeitraum nicht veränderte, wohingegen die durch den Impfstoff induzierten GM2-Antikörper im Allgemeinen nur 8-12 Wochen nach der Immunisierung nachweisbar waren. Diese Beobachtung wirft die Möglichkeit auf, dass das Weiterbestehen der Antikörperherstellung für einen günstigen klinischen Ausgang wichtig ist, und es zeigt den Bedarf für die Entwicklung von GM2-Impfstoffen an, die lang andauernde GM2- Anitkörperantwortreaktionen hervorrufen. Im Gegensatz zu den geimpften Patienten, die GM2-Antikörper entwickelten, wiesen die 8 Patienten, die nach der Immunisierung mit GM2/BCG keine GM2-Antikörper herstellten, ein besonders rasches Voranschreiten der Krankheit auf, wobei das Wiederauftreten gewöhnlich entdeckt wurde, bevor die vollständige Reihe der fünf Immunisierungen verabreicht worden war. Andere Vorhersagefaktoren waren bei diesen Patienten nicht weniger günstig, noch war ihre Antikörperantwortreaktion gegen BCG weniger heftig als die Antwort bei GM2-Antikörperpositiven Patienten, was anzeigt, dass eine allgemeine Unterdrückung des Immunantwort (Immunsupression) nicht der zu Grunde liegende Mechanismus war.
Eine Verbindung zwischen der GM2-Antikörperproduktion und einer verbesserten Prognose wurde ebenfalls bei Untersuchungen des als OFA-I bezeichneten Antigens vermutet (31), einem antigenen System der Zelloberfläche, das in vielen Melanomen exprimiert wird. Verschiedene Hinweise haben gezeigt, dass die Reaktivität von Antikörpern gegen OFA primär gegen das Gangliosid GM2 gerichtet ist (30, 25). Patienten mit erhöhten IgM-Titern gegen OFA-I, die entweder bereits vorhanden waren oder nach der Immunisierung mit bestrahlten Melanomzellen (hergestellt wurden), wiesen eine verlängerte Überlebensrate auf (31).
Obwohl die Behauptung verstärkend, dass GM2-Antikörper mit einer günstigen Prognose bei Patienten mit Melanomen verbunden sind, stellt diese Untersuchung ebenfalls die Probleme dar, die bei der Planung von zufallsverteilten Impfversuchen auftauchen. Die bereits bestehende Antikörperproduktion bei 5 Patienten der Kontrollgruppe im Gegensatz zu 1 Patienten in der GM2/BCG-Gruppe und das Fehlen einer GM2-Antikörperantwortreaktion bei 8 geimpften Patienten in der GM2/BCG-Gruppe, führte zu einer Abschwächung des Unterschiedes zwischen den beiden zufällig ausgewählten Behandlungsgruppen bis hin zu einem Punkt, an dem der therapeutische Nutzen bei der GM2/BCG-Gruppe nicht mehr signifikant war. Es ist klar, dass bei weiteren Untersuchungen Patienten mit bereits bestehenden Antikörpern gegen GM2 ausgeschlossen oder zumindest anders eingeteilt werden müssen. Von gleicher Bedeutung ist die Notwendigkeit, die Immunogenität des Impfstoffs zu steigern. Die Anmelder haben in dieser Hinsicht Ansätze erkundet, die erfolgreich im Zusammenhang mit Kohlenhydrat-Impfstoffen gegen bakterielle Infektionen verfolgt wurden (zusammengefaßt in 32), einschließlich der chemischen Modifizierung von Gangliosiden, um eng verwandte Derivate zu erhalten (33, 34), der Konjugation des Gangliosids mit immunogenen Trägerproteinen (35) und die Verwendung potenterer Adjuvanzien (36). Der Ansatz, den die Anmelder als am wirksamsten herausfanden, bestand darin, GM2 mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin (KLH) zu konjugieren, und das GM2-KLH- Konjugat mit QS-21 (einem Saponin-Extrakt aus Saponaria Quillaja) als Adjuvanz zu verabreichen. In einer Pilotstudie bei Patienten mit Melanomen führte die Verabreichung dieses Impfstoffs zu IgM-Antikörpertitern gegen GM2, die viel größer waren als diejenigen, die nach (Impfung mit) GM2/BCG beobachtet wurden, und sogar noch wichtiger, zu einer gleichmäßigen Produktion von GM2-Antikörpern, die zur IgG-Klasse gehörten, wobei somit offenbar eine T-unabhängige Antikörperantwortreaktion in eine T-abhängige Antwortreaktion umgewandelt wurde (27).
Ein weiterer Ansatz zur Verbesserung der klinischen Wirksamkeit des hier beschriebenen GM2/BCG-Impfstoffs wäre der Einschuß zusätzlicher immunogener Melanom-Ganglioside in den Impfstoff. Experimente an Mäusen weisen darauf hin, dass die Konjugation mit KLH und die Verwendung des Adjuvanz QS-21 ebenfalls die Immunogenität von GD3 verbessert (35), ein noch stärker exprimiertes Melanom-Gangliosid, von dem bislang gezeigt wurde, dass es bei Patienten mit Melanomen eine sehr niedrige Immunogenität besitzt. Wenn diese Beobachtungen bei Untersuchungen am Menschen bestätigt werden können, besitzen die Anmelder nun die Grundlage zur Konstruktion eines mehrwertigen (polyvalenten) Gangliosid-Konjugat-Impfstoffs, der verschiedene Haupt- Melanom-Ganglioside umfassen würde, und damit die Heterogenität der Gangliosid- Expression umgehen würde, die bei menschlichen Melanomen beobachtet wird. Die Anmelder glauben, dass die Ergebnisse der hier vorgestellten Untersuchung die weitere Verfolgung dieses Ansatzes rechtfertigen.

Referenzen der ersten und der zweiten Serie der Experimente

1. Apple, R. J., Domen, P. L., Muckerheide, A. und Michael, J. G. (1988). Cationization of Protein Antigens: IV. Increased Antigen Uptake by Antigen Presenting Cells. J. Immunol. 40: 3290.
2. Berd, D., Mastrangelo, M. J., Engstrom, P. F., Paul, A. und Maguire, H. (1982). Augmentation of the human immune response by cylcophosphamide. Cancer Res. 42: 4862.
3. Borch, R. F., Bernstein, M. D. und Durst, H. D. (1971). The cyanohydridoborate anion as a selective reducing agent. J. American. Chem. Soc. 93: 2897.
4. Cahan, I. D., Irie, R.., Singh, R., Cassidenti, A. und Paulson, J. C. (1982) Identification of a Human Neuroectodermal Tumor Antigen (OFA-I-2) as Ganglioside GD2, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7629.
5. Carubia, J. M., Yu, R. K., Macala, L. J., Kirkwood, J. M., Varga, J. M. (1984). Gangliosides of Normale and Neoplastic melanocytes. Biochem. Biophys. Res. Comm. 120: 500.
6. Chang, S. P. und Rittenberg, M. B. (1981). Immunologic memory to phosphorylcholine in vitro. I. Asymmetric expression of clonal dominance. J. Immunol. 126: 975.
7. Criegee R. (1957) The course of ozonization of unsaturated compounds. Record of Chemical Progress 18: 111.
8. Donnelly, J. J., Deck, R. R and Llu, M. A. (1991). Adjuvant activity of the outer membrane protein complex of Neisseria meningitidis serogroup B for a polysaccharide protein conjugate. Vaccines 91. Cold Spring Harbor Laboratory Press. S. 403.
9. Eilber, F. R., Morton, D. L., Holmes, E. C., Sparks, F. C. und Ramming, K. P. Adjuvant immunotherapy with BCG in treatment of regional-lymph-node metastases from malignant melanoma. N. Engl. J. Med. 194: 237-240, 1976.
10. Eskola, J., Kayrty, H., Takaia, A. K., Peltola, H., Ronneberg, P. R., Kha, E., Pekkanen, E., McVerry, P. H. und Makela, P. H. (1990). A Randomized Prospective Field Trial of a Conjugate Vaccine in the Protection of Infants and Young Children Against Invasive Haemophilus Influenza Type b Disease. N. Engl. J. Med. 323: 1381.
11. Cray, G. R. (1974). The direct Coupling of Oligosaeeharides to Proteins and Derivatised Gel. Arch. Biochem. Biophys. Acta. 163: 426.
12. Gray, G. R. (1978). Antibodies to Carbohydrates: Preparation of Antigens by Coupling Carbohydrates to Proteins by Reduetive Axnination with Cyanoborohydride. Meth. Enzymol. 50: 155.
13. Hakomori, S. I. (1985). Aberrant Glycosylation in Cancer Cell Membranes as Focused on Glycolipides: Overview and Perspeetive. Cancer Res. 45: 2405.
14. Hamilton, W. B., Helling, F., Lloyd, K. O., Livingston, P. O. (1993) Gangliosides Expression on Human Malignant Melanoma Assessed by Quantitative Immune Thin Layer Chromatography. Int. J. Cancer 53: 1.
15. Hilal, E. Y., Pinsky, C. M., Hirsaut, Y., Wanebo, H. J., Hansen, J. A., Braun, D. W. Jr., Fortner, J. G., und Oettgen, H. F. (1981) Surgical adjuvant therapy of nialignant melanoma with Corynebacterium parvum. Cancer 48: 245.
16. Houghton, A. N., Mintzer, D., Cordon-Cardo, C., Welt, S., Friegel, B., Yadhan, S., Carswell, E., Melamed, M. R., Oettgen, H. F. und Old, L. J. (1985) Mouse Monoclonal IgG3 Antibody Detecting GD3 Ganglioside: A Phase I trial in Patients with Malignant Melanoma. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82: 1242.
17. Itonori, S., Hidari, K., Sanal, Y., Taniguchi, M. und Nagai, Y. (1989). Involvement of the Acyl Chain of Ceramide in Carbohydrate Recognition by an Anti-glycolipid Monoclonal Antibody: The Case of an Anti-Melanoma Antibody, M2590, to GM3- Ganglioside. Glycoconjugate J. 6: 551.
18. Kanfer, J. N. und Hakomori, S. (1983). Sphingolipid Biochemistry. In: Hanahan, D. J., Handbook of Lipid Research, New York, Plenum Press.
19. Kensil, C. R., Patel, U., Lennick, M. und Marciani, D. (1991) Saponin adjuvants from Quillaja saponaria Molina. J. Immunol. 146: 431.
20. Kundu, S. K., Marcus, D. M. und Veh, R. W. (1980). Preparation and properties of antibodies to GD3 and GM1 gangliosides. J. Neurochem. 34: 184.
21. Landsteiner, K. und Chase, M. W. (1942). Experiments on Transfer of Cutaneous Sensitivity to Simple Compounds. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 49: 688.
22. Livingston, P. O. (1989). The basis for ganglioside vaccines in melanoma. In: Human Tumor Antigens and Speeific Tumor Therapy, UCLA Symposia on Molecular and Cellular Biology, R Metzgar und M. Mitchell, Hrsg., Alan R Liss, Inc., New York, N. Y., Band 99: 287.
23. Livingston, P. O. (1991). Active specifle immunotherapy in the treatment of cancez. In: Oettgen, H. F., Hrsg., Immunology and Allergy Clinics of North America: Human Cancer Immunology 11. London, U. K., W. B. Saunders Co., Bd. 11: 2, 402-423.
24. Livingston, P. O., Calves, M. J., Helling, F., Zollinger, W. O., Blake, M. S. und Lowell, G. H. (1993b). GD3/proteosome vaccine induce consistent IgM antibodies against die ganglioside GD3. Vaccine, im Druck.
25. Livingston, P. O., Cunningham-Rundles, S., Marfleet, G., Gnecco, C., Wong, G. Y., Schiffinan, G., Enker, W. E. und Hoffmann, M. K. (1987). Inhibition of suppressor cell activity by cyclophosphamide in patients with malignant melanoma. J. Biol. Resp. Mod. 6: 392.
26. Livingston, P. O., Natoli, E. J. Jr., Calves, M. J., Stocken, E., Oettgen, H. F. und Old, L. J. (1987). Vacccine containing purified GM2 ganglioside elicit GM2 antibodies in melanoma padents. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2911.
27. Livingston, P. O., Ritter, G. und Calves, M. J. (1989). Antibody response after immunization with the ganglioside GM1, GM2, GD2 and GD3 in the mouse. Cancer Immunol. Immunother. 29: 179-184.
28. Livingston, P. O., Ritter, G., Srivastava, P., Padavan, M., Calves, M. J. Oettgen, H. F. und Old, L. J. (1989). Characterization of IgG and IgM antibodies induced in melanoma patients by immunization with purified GM2 ganglioside. Cancer Res. 49: 7045.
29. Livingston, P. O., Watanabe, T., Shiku, H., Houghton, A. N., Albino, A., Takahashi, T., Resnick, L. A., Michitsch, R., Rinsky, C. M., Oettgen, H. F. und Old, L. J. (1982). Serological response of melanoma patients receiving melanoma cell vaccines: I. autologous cultured melanoma cells. Int. J. Cancer 30: 413-422.
30. Livingston, P. O., Wong, G. Y., Adluri, S., Tao, Y., Padavan, M., Parente, R., Hanlon, C., Calves, M. J., Helling, F., Ritter, G., Oettgen, H. F. und Old, L. J., (1993a). A Randomized Trail of Adjuvant Vaccination with BCG Versus BCG Plus the Melanoma Ganglioside GM2. In Vorbereitung.
31. Longenecker, B. M., Williams, D. J., MacLean, G. D., et aL, (1987). Monoclonal antibodies and synthetic tumor-associated glycoconjugates in the study of the expression of Thomsen-Friedenreich-like and Tn-like antigens on human cancers. JNCI 78: 489.
32. Lowell, G. H., Ballou, W. R., Smith, L. F., Wirtz, R. A., Zollinger, W. D. und Hockmeyer, W. T. (1988). Proteosome-Lipopeptide Vaccines: Enhancement of Immunogenicity for malaria CS peptides. Science 240: 800.
33. Marciani, D. J., Kensil, C. R., Beltz, G. A., Hung, C. H., Cronier, J. und Aubert, A. Genetically engineered subunit vaccine against FeLV: protective immune response in cats. Vaccine 9: 89.
34. MaeLean, G. D., Bowen-Yacyshyn, M. B., Samuel, J., Meikle, A., Stuart, G., Nation, J., Poppema, S., Jerry, M., Koganty, R., Wong, T. und Longenecker, B. M. (1992). Active Immunization of Human Ovarian Cancer Patients Against a Common Carcinoma (Thomsen-Friedenreich) determinant using a Synthetic Carbohydrate Antigen. J. Immunotherapy 11: 292.
35. Neuenhofer, 5., Schwarzmann, G., Egge, H. und Sandhoff, K. (1983) Synthesis of Lysogangliosides. Biochem. 24: 525.
36. Nores, G., Dohi, T., Taniguchi, M. und Hakomori, S.-I. (1987). Density-dependent Recognition of Cell Surface GM3 by a Certain Anti-Melanoma Antibody, and GM3 Lactone as a Possible Immunogen: Requirements for Tumor Associated Antigen and Immunogen. J. Immunol. 139 IX: 3171.
37. Old, L. J. (1981) Cancer immunology: The search for specificity - G. H. A. Clowes Memorial Lecture. Cancer Res. 41: 361.
38. Pappas, J. J., Keaveneiy, W. P., Gaucher, E. und Melvin, B. (1966). A new and convenient method for converting olefms to aldehyde. Tetrahedron Letters 36: 4273.
39. Ritter, G., Boosfeld, E., Adluri, R., Calves, M., Oettgen, H. F., Old, L. J. und Livingston, P. O. (1991). Antibody Response to Immunization with Ganglioside GD3 and GD3 Congeners (Lactones, Amide and Gangliosidol) in Patients with Malignant Melanoma. Int. J. Cancer 48: 379.
40. Ritter, G., Boosfeld, E., Markstein, E., Yu, R. K., Ren, S., Oettgen, H. F., Old, L. J. und Livingston, P. O. (1990a). Biochemical and serological characteristics of natural 9-Oacetyl GD3 from human melanoma and bovine buttermilk and chemically Oacetylated GD3. Cancer Res. 50: 1403.
41. Ritter, G., Boosfeld, E., Calves, M., Oettgen, H. F., Old L. J. und Livingston, P. O. (1990b). Antibody response after immunization with gangliosides GD3, lactones, GD3 amide and GD3 gangliosidol in the mouse. GD3 lactone I induces antibodies reactive with human melanoma. Immunbiology 182: 32.
42. Romball, G. C. und Weigle, W. O. (1984). T cell competence to heterologous and homologous thyroglobulins during the induction of experimental autoimmune thyroiditis. Eur. J. Immunol. 14: 887.
43. Roy, R. und Lafferiere, C. A. (1990). Michael Addition as the Key Step in the Synthesis of Sialyloligosaccharide-Protein Corijugates from N-Acroloylated Glycopyranosylamines. J. Chem. Soc. Chem. Commun. 1709.
44. Svennerholm, L. (1957). Quantitative estimation of sialic acids. 11. Colorimetric resorcinol-hydrochloric acid method. Biochem. Biophys. Acta 24: 604.
45. Tam, J. P. (1988). Synthetic Peptide Vaccine Design: Synthesis and Properties of a High-Density Multiple Antigenic Peptide System. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5409.
46. Tam, J. P. und Lu, Y. (1989). Vaccine Engineering: Enhancement of Immunogenicity of Synthetic Peptide Vacccines Related to Hepatitis in Chemically Defined Models Consisting of T- and B-Cell Epitopes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 9084.
47. Teale, J. M. und Abraham, K. M. (1987) The regulation of antibody class expression. Immun. Today 8: 122.
48. Tsuchida, T., Saxton, R. E., Morton, D. L. und Irie, R. F. (1987) Gangliosides of Human Melanoma. J. Natl. Cancer Lnst. 781: 45.
49. Nicolai, H., Muller, H. E., Zilliken, F. (1978). Substrate Specificity of Neuraminidase from Erysipelothrix rhusiopathiae. Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. 359: 393.
50. Wiegandt, H. und Baschang, G. (1965). Die Gewinnung des Zuckeranteils der Glykosphingolipide durch Ozonolyse und Fragmentierung. Z. Naturforschung 20b: 164.
51. Weight, W. O. (1977) Autoimunity: Genetic, Immunologic, Virologic and Clinical Aspects. New York, Academic, S. 141.
52. Yamaguchi, H., Furukaw, K., Fortunato, S., Livingston, P. O., Lloyd, K. O., Oettgen, H. F. und Old, L. J. (1987) Cell-surface Antigens of Melanoma Recognized by Human Monoclonal Antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2416.

Referenzen der dritten Serie der Experimente

1. Hakomori, S. I. (1985). Abberant glycosylation in cancer cell membranes as focused on glycolipides: Overview and perspectives. Cancer Res. 45: 2405.
2. Carubia, J. M., R. K. Yu, L. J. Mascala, J. M. Kirkwood und J. M. Varga (1984). Gangliosides on normal and neoplastic melanocytes. Biochem. Biophys. Res. Comm. 120: 500.
3. Hamilton, W. B., F. Helling, K. O. Lloyd und P. O. Livingston (1993). Ganglioside expresssion on human malignant melanoma assessed by quantitative inimune thin layer chromatography. Int. J. Cancer 53: 1.
4. Tsuchida, T., RE. Saxton, D. L. Morton und R. F. Irie (1987). Gangliosides of human melanoma. J. Natl. Cancer Inst. 78 I: 45.
5. Livingston, P. O., E. J. Jr. Natoli, M. J. Calves, E. Stockert, H. F. Oettgen, und L. J. Old (1987). Vaccines containing purifled GM2 ganglioside elicit GM2 antibodies in melanoma patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2911.
6. Livingston, P. O., G. Ritter, P. Srivatava, M. J. Calves, H. F. Oettgen, und L. J, Old (1989). Chareterization of IgG and IgM antibodies induced in melanoma patients by immunization with purified GM2 ganglioside. Cancer Res. 49: 7045.
7. Livingston, P. O., G. Y. Wong, S. Adluri, Y. Tao, M. Padavan, R. Parente, C. Hanlon, M. J. Calves, F. Helling, G. Ritter, H. F. Oettgen und L. J. Old (1994). Improved survival in AJCC Stage III melanoma patients with GM2 antibodies. A randomized trial of adjuvant vaecination with GM2 ganglioside. J. Clin. Oncol., im Druck.
8. Livingston, P. O. (1989). The Basis for ganglioside vaccines in melanoma. In: Human tumor antigens and specifle tumor therapy. Bd. 99., R Metzgar und M. Mitchell, Hrsg., Alan lt Liss Inc., New York, NY, S. 287.
9. Helling, F., A. Shang, M. J. Calves, 5. Zhang, S. Ren, R. K. Yu, H. F. Oettgen und P. O. Livingston (1994). GD3 vaccines for melanoma: Superior immunogenicity of KLH conjugate vaccines. Cancer Res., im Druck.
10. Kensil, C. R., U. Patel, M. Lennick und D. Marciani (1991). Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina Cortex. J. Immunol. 146: 431.
11. Newman, M. J., J.-Y. Wu, B. H. Gardner, K. J. Murroe, D. Leombruno, J. Recchia, C. R. Kensil und R. T. Coughlin (1992). Saponin Adjuvant Induction of Ovalbumin-specifle CD8+ Cytotoxic T-Lymphcyte Responses. J. immunol. 148: 2357.
12. Cahan, L. D., RF. Irie, R. Singh, A. Cassidenti und J. C. Paulson (1982). Identifcation of a neuroectodermal tumor antigen (OFA-I-2) as ganglioside GD2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7629.
13. Dippold, W. G., K. O. Lloyd, L. T. Li, H. Ikeda, H. F. Oettgen und L. J. Old (1980). Cell surface antigens of human malignant melanoma: Definition of six antigenic systems willi monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 6114.
14. Hawkes, R, E. Niday und J. A. Gordon (1982). Dot-immunebinding assay for monoclonal and other antibodies. Anal. Biochem 119: 142.
15. Basten, A. und J. G. Howard (1973). Thymus independence. In: Contemporary Topics in Inimunobiology. A. J. S. Davies, Hrsg., Plenum Press, New York, Bd. 2, S. 265.
16. Mosier, D. E. und A. J. Feeney (1987). The physiology of B Lymphcytes capable of generating anti-polysaccharide antibody responses. In: Towards Hetter Carbohydrate Vaccines. R. Beil und G. Torrigiani, Hrsg., J. Wiley & Sons Ltd., London, Großbritannien, S. 243.
17. Jennings, H. J., F. E. Ashton, A. Gamian, F. Michon und R. Roy (1987). A chemically modified group B meningococcal polysaccharide vaccine. In: Towards Better Carbohydrate Vaccines. R. Beil und G. Torrigiani, Hrsg., J. Wiley & Sons Ltd., London, Großbritannien, S. 11.
18. Schneerson, R., J. B. Robbins, S. C. Szu und Y, Yang (1987). Vaccines composed of polysaccharide protein conjugates: current status, unanswered questions, and prospects for the futwe. In: Towards Better Carbohydrate Vaccines. R. Beil und G. Torrigiani, Hrsg., J. Wiley & Sons Ltd., London, Großbritannien, S. 307.
19. Geysen, H. M., R. Macfarlan, S. J. Rodda, G. Tribbick, T. J. Mason und P. Schoofs (1987). Peptides which mimic carbohydrate antigens. In: Towards Beuer Carbohydrate Vaccines. R. Beil und G. Torrigiani, Hrsg., J. Wiley & Sons Ltd., London, Großbritannien, S. 103.
20. Soederstroem, T. (1987) Anti-idiotypes as surrogate polysaccharide vaccines. In: Towards Better Carbohydrate Vaccines. R. Beil und G. Torrigiani, Hrsg., J. Wiley & Sons Ltd., London, Großbritannien, S. 119.
21. Landsteiner, K. und M. W. Chase (1942). Experiments on transfer of cutaneous sensitivity to simple compounds. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 49: 688.
22. Avery, O. T. und W. F. Goebel (1929). Chemo-immunological studies on conjugated carbohydrate-proteins. J. Exp. Med. 50: 533.
23. Schneerson R., O. A. Barrera und J. B. Sutton (1980). Preparation, characterization, and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b polysaccharide protein conjugates. J. Exp. Med. 152: 361.
24. Lepow, M. L., J. S. Sainuleson und L. K. Gordon (1985). Safety and immunogenicity of Haemophilus influenzae type b-polysaccharide diphtheria toxoid conjugate vaccine in infants 9 to 15 months of age. J. Pediatr. 106: 185.
25. Chu, C. Y., R. Schneerson, J. B. Robbins und S. C. Rastogi (1983). Further studies on the immunogenicity of Haemophilus influenzae type b and pneumococcal type 6A polysaccharide protein conjugates. mtl Immun. 50: 245.
26. Marburg, S. D. Jorn, L. Tolman, B. Arison, J. McCauley, P. J. Kniskern, A. Hagopian und P. P. Vella. Biomolecular chemistry of macromolecules: synthesis of bacterial polysaccharide conjugates with Neisseria meningitidis membrane protein. J. Am. Chem. Soc. 108: 5282.
27. Anderson, P (1983). Antibody response to Haemophilus influenzae type b and diphtheria toxin induced by conjugates of oligosaccharides of the type b capsule with the nontoxic CRM 197. mii Immun. 39: 233.
28. Turner, R. B., C. O. Cimino und B. J. Sullivan (1991). Prospective comparison of the immune response of infants to three Haemophilus influenzae type b vaccines. Pediatr. Infect. Dis. J. 10: 108.
29. Anderson, P., M. E. Pichichero und R. A. Insel (1985). Immunogens consisting of oligosaccharides from the capsule of Haemophilus influenzae type b coupled to diphtheria toxoid or CRM 197. J. Clin. Invest. 76: 52.
30. Weinberg, G. A., M. S. Einhorn, A. A. Lenoir, P. D. Granoff und D. M. Granoff (1987). Immunologic priming to capsular polysaccharide in infants immunized with Haemophilus influenzae type b polysaccharide-Neisseria meningitidis outer membrane protein conjugate vaccine. J. Pediatr. 118: 22.
31. Ritter, G., E. Boosfeld, R. Adluri, M. Calves, H. F. Oettgen, L. J. Old und P. O. Livingston (1991). Antibody response to immunization with ganglioside GD3 and GD3 congeners (lactones, amide and gangliosidol) in patients with malignant melanoma. Int. J. Cancer 48: 379.
32. Ritter, G., E. Boosfeld, Markstein, M. J. Calves, H. F. Oettgen, L. J. Old und P. O. Livingston (1990). Biochemical and serological characteristics of natural 9-O-acetyl GD3 from human melanoma and bovine buttermilk and chemically Oacetylated GD3. Cancer Res. 50: 1403.
33. Chapman, P. B. und A. N. Houghton (1991). Induction of IgG Antibodies against GD3 Ganglioside in Rabbits by an Anti-idiotypie Monoclonal Antibody. J. Clin. Invest 88: 186.
34. Svennerholm, L. (1963) Chromatographic separation of human brain gangliosides. J. Neurochem. 10: 613.

Referenzen der vierten Serie der Experimente

1. Livingston, P. O., Kaelin, K., Pinsky, C. M., Oettgen, H. F. und Old, L. J. The serological response of patients with stage 11 melanoma to allogenic melanoma cell vaccines. Cancer 1985, 56: 2194-2200.
2. Livingston, P. O. Experimental and clinical studies with active specific immunotherapy. In: Immunity to Cancer 11 (Hrsg. Mitchell, M. S.) Alan R. Liss, Inc., New York, 1989, S. 309-321.
3. Livingston, P. O. Jones-Calves, M. und Natoli, E. J. Jr. Approaches to augmenting the immunogenicity of the ganglioside GM2 in mice: Purified GM2 is superior to whole cells. J. Immunol. 1987, 138: 1524-1529.
4. Livingston, P. O., Natoli, E. J. Jr., Calves, M. J., Stockert, E., Oettgen, H. F. und Old, L. J. Vaccines containing purif ed GM2 ganglioside elicit GM2 antibodies in melanoma patients. Proc. Nat1. Acad. Sci. USA 1987, 84: 2911-2915.
5. Livingston, P. O. Ritter, G., Srivastava, P., Padavan, M., Calves, M. J. Oettgen, H. F. und Old, L. J. Characterization of IgG and IgM antibodies induced in melanoma patients by immunization with purifled GM2 ganglioside. Cahcer Res. 1989, 49: 7045- 7050
6. Livingston, P. O., Wong, G. Y. C., Adluri, S., Tao, Y., Padavan, M., Parente, R., Hanlon, C., Jones-Calves, M., Helling, F., Ritter, G., Oettgen, H. F. und Old, L. J. A randomized trail of adjuvant vaccination with GM2 ganglioside in patients with AJCC Stage Iii melanoma. J. Clin. Oncol. 1994, im Druck.
7. Livingston, P. O. Experimental and clinical studies with active specific immunotherapy. In: Immunity to Cancer 11 (Hrsg. Mitchell, M. S.), Alan R. Liss Inc., New York, 1989, S. 309-321.
8. Eskola, J., Kayrty, H., Takaia, A. K., Peltola, H., Ronneberg, P. R., Kha, E., Pekkanen, E., McVerry, P. H. und Makela, P. H. A randomized prospective field trial of a conjugate vaccine in the protection of infants and young children against invasive Haemophilus influenzae type b disease. N. Engl. J. Med. 1990, 323: 1381-1387.
9. Livingston, P. O., Koganty, R. R., Longenecker, B. M., Lloyd, K. O. und Calves, M. J. Studies on the immunogenicity of synthetic and natural Thomsen-Friedenreich (TF) antigens in mice: Augmentation of the response by Quil A and SAF-m adjuvants and analysis of the specifity of the responses. Vaccine Res. 1991, 1: 99-109.
10. MacLean, G. D., Bowen-Yacyshyn, M. B., Samuel, J., Meikle, A., Stuart, G., Nation, J., Poppema, S., Jerry, M., Koganty, R., Wong, T. und Longenecker, B. M. Active immunization of human ovarian cancer patients against a common carcinoma (Thomsen-Friedenreich) determinant using a synthetic carbohydrate antigen. J. Immunotherapy 1992, 11: 292-305.
11. MacLean, G. D., Reddish, M., Koganty, It, Wong, T., Gandhi, S., Smolenski, M., Samuel, J., Nabholtz, J. M. und Longenecker, B. M. Immunization of breast cancer patients using a synthetic sialy-Tn glycoconjugate plus DETOX adjuvant. J. Immunol. Immunother. 1993, 36: 215-222.
12. Helling, F., Shang, Y., Calves, M., Oettgen, H. F. und Livingston, P. O. Increased immunogenicity of GD3 conjugate vaccines: Comparison of various carrier proteins and selection of GD3-KLH for further testing. Cancer Res. 1994, im Druck.
13. Helling, F., Adluri, S., Calves, M., Koganty, R. R, Oettgen, H. F. und Livingston, P. O. Increased immunogenicity of GM2 conjugated with KLH and used with adjuvants in patients with melanoma. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 1993, S. 34.
14. Kensil, C. R., Soltysik, S., Patel, U. und Marciani, D. Structure/function relationship in adjuvants from Quillaja saponaria Molina. In: Vaccines 92 (Hrsg. Brown, F., Chanock, R. M., Ginsberg, H., Lerner, R. A.) Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1992, S. 35- 40.
15. Kensil, C. R., Patel, U., Lennick, M. und Marciani, D. Separation and characterization of saponins with adjuvant activity from Quillaja saponaria Molina cortex. J. Immunol. 1991, 146: 431-437.
16. White, A. C., Cloutier, P. und Coughlin R. T. A purifled saponin acts as an adjuvant for a T-independent antigen. In: Immunobiology of Protein and Peptides VI (Hrsg. Atassi, M. Z.), Plenum Press, NY, 1991, S. 207-210.
17. Wu, J.-Y., Gardner, B. H., Mutphy, C. L, Seals, J. R, Kensil, C. R., Recchia, J., Beltz, G. A., Newman, G. W. und Newman, M. J. Saponin adjuvant enhancement of antigenspecific immune responses to an experimental HIV-1 vaccine. J. Immunol. 1992, 148: 1519-1525.
18. Newman, M. J., Wu, J.-Y., Gardner, B. H., Munroe, K. J., Leombruno, D., Recchia, J., Kensil, C. R. und Coughlin, R. T. Saponin adjuvant induction of ovalbumin-specific CD8+ cytotoxic T-lymphcyte responses. J. Imnxunol. 1992, 148: 2357-2362.
19. Marciani, D. J., Kensil, C. R., Beltz, G. A., Hung, C.-H., Cronier, J. und Aubert, A. Genetically-engineered subunit vaccine against feline leukaemia virus: proteetive immune response in cats. Vaccine 1991, 9: 89-96.
20. Cahan, L. D., Irie, R. F., Singh, R., Cassidenti, A. und Paulson, J. C. Identifleation of a neuroectodermal tumor antigen (OFA-I-2) as ganglioside GD2 . Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1982, 79: 7629-7633.
21. Dippold, W. G. Lloyd, K. O., Li, L. T. C., Ikeda, H., 0ettgen, H. F. und Old, L. J. Cell surface antigens of human malignant melanoma: Definition of six antigenic systems with monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1980, 77: 6114-6118.
22. Hawkes, R, Niday, E. und Gordon, J. A. Dot-immunebinding assay for monoclonal and other antibodies. Anal. Biochem. 1982, 119: 142-147.
23. Rosenberg, S. A., Lotze, M. T., Muul, L. M., Chang, A. E., Avis, F. P., Leitnian, S., Linehan, W. M., Robertson, G. N., Lee, R. E., Rubin, J. T., Seipp, C. A., Simpson, C. G. und White, D. E. A progress report on the treatment of 157 patients with advanced cancer using lymphokine-aetivated killer cells and interleukin-2 or high dose interleukin-2 alone. N. Engl. J. Med. 1987, 316: 789-905.
24. Del Prete, S. A., Maurer, L. H., 0'Donnell, J., Foreier, R. J. und LeMarbre, P. Combination chemotherapy with cisplatin, carmustine, dacarbazine, and tamoxifen in metastatic melanoma. Cancer Treat. Rep. 1984, 68: 1403-1405.
25. Mitchell, M. S., Kan-Mitehell, J., Kempf, R. A., Harel, W., Shau, H. und Lind, S. Active specific immunotherapy for melanoma: Phase I trial of allogenic lysates and a novel adjuvant, Cancer Res. 1988, 48: 5883-5893.
26. Berd, D., Mastrangelo, M. J., Engstom, P. F., Paul, A. und Maguire, H. Augmeptation of the human immune response by cyclophospbamide. Cancer Res. 1982, 42: 4862- 4866.
27. Kaplan, G., Kiessling, R., Teklemariam, S., Hancock, G., Sheftel, G., Job, C. K., Converse, P., Ottenhoff, T. H. M., Becx-Bleumink, M., Dietz, M. und Cohn, Z. A. The reconsitution of cell-mediated iinmunity in the cutaneous lesison of lepromatous leprosy by recombinant interleukin 2. J. Exp. Med. 1989, 169: 893.
28. Kaplan, G., Cohn, Z. A. und Smith, K. A. Rational immunotherapy with interleukin 2. Biotechnology 1992, 10: 157.

Referenzen der fünften Serie der Experimente

1. Boring, C. C., Squires, T. S., Tong, T.: Cancer Statistics in Ca - A Cancer Journal for Clinicans. New York, NY, JB Lippineott Co., 1992, Bd. 42, Nr. 1, S. 19-38.
2. Balch, C. M., Smalley, R. V., Bartolucci, A. A., et al.: A randomized prospective clinical trial of adjuvant C. parvum immunotherapy in 260 patients with clinically localized melanoma (Stage I): Prognostic factors analysis and prelirninary results of immunotherapy. Cancer 49: 1079, 1982.
3. Coit, D. G., Rogatko, A., Brennan, M. F.: Prognostic factors in patients with melanoma metastatic to axillary or inguinal lymph nodes. Ann. Surg. 214: 627-636, 1991.
4. Steffens, T. A., Livingston, P. O.: The status of adjuvant therapy of melanoma. In: Surgical Oncology Clinics of North America. Philadelphia, PA, W. B. Saunders Company, 1992, S. 307-333.
5. Oettgen, H. F., Livingston, P. O., Old, L. J.: Melanoma. In: DeVita, VT Jr., Heliman S. Rosenberg SA, (Hrsg.): Biologie Therapy of Cancer. Philadelphia, PA, JB Lippincott C ompany, 1991, S. 682-701.
6. Livingston, P. O.: Construction of cancer vaccines with carbohydrates and protein (peptide) tumor antigens. Current Opinion in Immunology 4: 624-629, 1992.
7. Tai, T., Cahan, L. D., Tsuchida, T. et aL: Immunogenicity of melanoma-associated gangliosides in cancer patients. Int. J. Cancer 35: 607-612, 1985.
8. Livingston, P. O., Natoli, E. J. Jr., Calves, M. J. et al.: Vacecines containing purified GM2 ganglioside elicit GM2 antibodies in melanoma patients. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2911-2915, 1987.
9. Livingston, P. O., Ritter, G., Srivastava, P. et al.: Characterization of IgG and IgM antibodies induced in melanoma patients by immunization with purified GM2 ganglioside. Cancer Res. 49: 7045-7050, 1989.
10. Greenspan, E. M.: Is BCG an "orphan" drug suffering from chemotherapists' overkill? Cancer Invest. 4 81-92, 1986.
11. Awwad, M., North, R. J.: Cyclophosphamid-induced immunologically mediated regression of a cyclophosphamide-resistant murine tumor: A consequence of eliminating precursor L3T4+ suppressor T-cells. Cancer Res. 49: 1649-1654, 1989.
12. Mokyr, M. B., Dray, S.: Some advantages of curing mice bearing a large subcutaneous MOPC-3I5 tumor with a low dose rather than a high dose of cyclophosphamide. Cancer Res. 43: 3112-3119, 1983.
13. Natoli, E. J. Jr., Livingston, P. O., Cordon-Cardo, C. et al.: A murine monoclonal antibody detecting N-acetyl and N-glycolyl GM2: Characterization of cell surface reactivity. Cancer Res. 46: 4116-4120,1986.
14. Cahan, L. D., Irie, R. F., Singh, R., et al.: Identifleation of a human neuroectodermal tumor antigen (OFA-I-2) as ganglioside GD2. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 7629, 1982.
15. Livingston, P. O., DeLeo, A. B., Jones, M. et al.: Comparison of approaehes for augmenting the serological response to the Meth A antigen. Preatreatment with Cyclophosphamide is most effective. J. Immunol. 131: 2001, 1983.
16. Livingston, P. O., Cunningham-Rundles, S., Marfleet, G. et al.: Inhibition of suppressor cell activity by cyclophosphamide in patients with malignant melanoma. J. Biol. Resp. Mod. 6: 392403, 1987.
17. Pinsky, C. M., El Domeiri, A., Caron, A. S. et al.: Delayed hypersensitivity reactions in patients with cancer. Rec. Results Cancer Res. 47: 37-41, 1974.
18. Livingston, P. O., Oettgen, H. F., Old, L. J.: Specifle active immunotherapy in cancer therapy. In: Mihich E (Hrsg.): Immunological Aspects of Cancer Therapeutics. John Wiley and Sons.Inc., 1982, S. 363-404.
19. Livingston, P. O.: Active specifle immunotheraphy in the treatment of cancer. In: Oettgen HF (Hrsg.): Immunology and Allergy Clinics of North America: Human Cancer Immunology 11. London, UK, WB Saunders Co., 1991, Bd. 11: 2, S. 402-423.
20. Portoukalian, J., Zwingelstein, G., Dore, J.: Lipid composition of human malignant melanoma tumors at various levels of malignant growth. Eur. J. Biochem. 94: 19-23, 1979.
21. Tsuchida, T., Saxton, R. E., Morton, D. L. et al.: Gangliosides of human melanoma. JNCI 78: 45-54, 1987.
22. Hamilton, W. B., Heling, F., Lloyd, K. O. et aL: Ganglioside expression on human malignant melanoma assessed by immune thin layer chromatography. Int. J. Cancer 53: S66-573, 1992.
23. Watanabe, T., Pukel, C. S., Takeyama, H. et al.: Human melanoma antigen AH is an autoantigenic ganglioside related to GD2. J. Exp. Med. 156: 1884-1889, 1992.
24. Pukel, C. S., Lloyd, K. O., Travassos, L. R. et al.: GD3, a prominent gangloside of human melanoma detection and characterization by mouse monoclonal antibody. J. Exp. Med. 155: 1133-1147, 1982.
25. Tai, T., Paulson, J. C., Cahan, L. D. et al.: Ganglioside GM2 as a human tumor antigen (OFA-I-1). Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 5392-5396, 1983.
26. Furukawa, K., Yamaguchi, H., Oettgen, H. F. et al.: Two human monoclonal antibodies reacting with the major gangliosides of human melanomas and comparison with corresponding mouse monoclonal antibodies. Cancer Res. 49: 191-196, 1989.
27. Yamaguchi, H., Furukawa, K., Fortunato, S. R. et al.: Cell-surface antigens of melanoma recognized by human monoclonal antibodies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 2416-2420, 1987.
28. Yamaguchi, H., Furukawa, K., Fortunato, S. R. et al.: Human monoclonal antibodies with dual GM2/GD2 specificity derived from an immunized melanoma patient. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3333-3337, 1990.
29. Welt, S., Carswell, E. A., Vogel, C.-W. et al.: Immune and nonimmune effector functions of IgG3 mouse monoclonal antibody R24 detecting the disialoganglioside GD3 on the surface of melanoma cells. Clin. Immunol. Immunopath. 45: 214-229, 1987.
30. Ide, R. F.: Oncofetal antigen (OFA-I): A human tumor-associated fetal antigen immunogenic in man. In: Rosenberg S (Hrsg.): Serologica1 analysis of human cancer. New York, NY, Academic Press, 1980, S. 493-513.
31. Jones, P. C., Sze, L. L. Liu, P. Y. et al.: Prolonged survival for melanoma patients with elevated IgM antibody to oncofetal antigen. JNCI 66: 249-254, 1981.
32. Beil, R., Torrigiani, G. (Hrsg.): Towards Better Carbohydrate Vaccines. New York, John Wiley & Sons Ltd., S. 1-363, 1987.
33. Ritter, G., Boosfeld, E., Calves, M. J. et al.: Antibody response after immunization with gangliosides GD3, GD3 lactones, GD3 amide and GD3 gangliosidol in the mouse. GD3 lactone I induces antibodies reactive with human melanoma. Immunobiology 182: 32-43, 1990.
34. Ritter, G., Livingston, P. O.: Cancer associated ganglioside antigens. In: Longenecker M (Hrsg.): Seminars in Cancer Biology, London, UK, WB Saunders, 1991, Bd. 2: 40- 409.
35. Helling, F., Shang, Y., Calves, M., et al.: GD3 vaccines for melanoma: Superior immunogenicity of KLH conjugate vaccines. Cancer Res. Jan 1994, im Druck.
36. Livingston, P. O., Koganty, R., Longenecker, B. M. et al.: Studies on the immunogenicity of synthetic and natural Thomson-Friedenreich (TF) antigens in mice: Augmentation of the response by Quil A and SAF-m adjuvants and analysis of the specificity of the response. Vaccine Res. 1: 99-109, 1992.
37. Helling, F., Adluri, S., Calves, M., et al.; Increased immunogenicity of GM2 conjugated with KLH and used with adjuvants in patients with melanoma. Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 34: 491, 1993.
38. Svennerholm, L. Chromatographic separation of human brain gangliosides. J. Neurochem. 10: 613-623, 1963.

Claims

1. Zusammensetzung umfassend:

(a) ein Konjugat (i) eines Gangliosidderivates, das einen unveränderten Oligosaccharidteil und einen veränderten Ceramidteil umfasst, mit (ii) einem auf einem immunogenen Protein basierenden Träger;

(b) ein Saponin, das aus der Rinde eines Quillaja saponaria Molina-Baumes gewonnen werden kann; und

(c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger;

wobei die relativen Mengen eines solchen Konjugats und eines solchen Saponins eine Stimulierung oder Verstärkung der Antikörperproduktion in einem Individuum bewirken, wobei der auf einem immunogenen Protein basierende Träger von einem Protein stammt, das ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Malaria T-Zell-Epitop, einem äußeren Membranprotein von Neisseria meningitidis, kationisiertem Rinderserumalbumin, Keyhole-Limpet-Hämocyanin oder einem Derivat davon, und Polylysin;

wobei in dem Konjugat das Gangliosidderivat mit dem auf einem immunogenen Protein basierenden Träger über einen vom Ceramid stammenden Kohlenstoff des Gangliosidderivats mit dem auf einem immunogenen Protein basierenden Träger konjugiert ist.

2. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Ceramidteil eine Sphingosinbase umfasst, und wobei in dem Konjugat das Gangliosidderivat mit dem auf einem immunogenen Protein basierenden Träger über einen C-4-Kohlenstoff der Sphingosinbase des Ceramidteils des Gangliosidderivats konjugiert ist.

3. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der auf einem immunogenen Protein basierende Träger eine &epsi;-Aminolysylgruppe umfasst, und wobei in dem Konjugat das Gangliosidderivat mit dem auf einem immunogenen Protein basierenden Träger über die &epsi;-Aminolysylgruppe des auf einem immunogenen Protein basierenden Trägers konjugiert ist.

4. Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei der Ceramidteil eine Sphingosinbase umfasst, und der auf einem immunogenen Protein basierende Träger eine &epsi;-Aminolysylgruppe umfasst, und wobei in dem Konjugat das Gangliosidderivat mit dem auf einem immunogenen Protein basierenden Träger über einen C-4- Kohlenstoff der Sphingosinbase des Ceramidteils des Gangliosidderivats mit der &epsi;-Aminolysylgruppe des auf einem immunogenen Protein basierenden Trägers konjugiert ist.

5. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Saponin, das aus der Rinde eines Quillaja saponaria Molina-Baumes gewonnen werden kann, QS-21 ist.

6. Zusammensetzung umfassend:

(a) ein Konjugat (i) eines Oligosaccharidteils eines Gangliosids mit (ii) Keyhole-Limpet-Hämocyanin;

(c) einen pharmazeutisch verträglichen Träger;

wobei die relativen, Mengen eines solchen Konjugats und eines solchen Saponins die Stimulierung oder Verstärkung der Antikörperproduktion in einem Individuum bewirken.

7. Zusammensetzung nach Anspruch 6, wobei das Saponin, das aus der Rinde eines Quillaja saponaria Molina-Baumes gewonnen werden kann, QS-21 ist.

8. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Gangliosidderivat mit Keyhole-Limpet-Hämocyanin konjugiert ist.

9. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 8, wobei das Gangliosidderivat ein Derivat eines Gangliosids ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus GM2, GM3, GD2, GD3, GD3-Lacton, O-Acetyl-GD3 und GT3 ist.

10. Zusammensetzung nach Anspruch 9, wobei das Gangliosidderivat ein Derivat von GM2 oder GD2 ist.

11. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Gangliosidderivat ein Derivat von GM2 ist.

12. Zusammensetzung nach Anspruch 10, wobei das Gangliosidderivat ein Derivat von GD2 ist.

13. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 12, wobei die Menge des Konjugats eine Menge zwischen 1 ug und 200 ug ist.

14. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Menge des Konjugats eine Menge zwischen 50 ug und 90 ug ist.

15. Zusammensetzung nach Anspruch 14, wobei die Menge des Konjugats 70 ug ist.

16. Zusammensetzung nach Anspruch 13, wobei die Menge des Konjugats eine Menge zwischen 1 ug und 10 ug ist.

17. Zusammensetzung nach Anspruch 16, wobei die Menge des Konjugats 7 ug ist.

18. Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 17, wobei die Menge des Saponins eine Menge zwischen 10 ug und 200 ug ist.

19. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Menge des Saponins 100 ug ist.

20. Zusammensetzung nach Anspruch 18, wobei die Menge des Saponins 200 ug ist.

21. Verwendung eines Konjugats (i) eines Gangliosidderivats, das einen unveränderten Oligosaccharidteil und einen veränderten Ceramidteil umfasst, mit (ii) einem immunogenen auf Protein basierenden Träger und einem Saponin, das aus der Rinde eines Quillaja saponaria Molina-Baumes gewonnen werden kann, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 20 definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung oder Verstärkung der Antikörperproduktion in einem Individuum.

22. Verwendung eines Konjugats (1) eines Gangliosidderivats, das einen unveränderten Oligosaccharidteil und einen veränderten Ceramidteil umfasst, mit (ii) einem auf einem immunogenen Protein basierenden Träger und einem Saponin, das aus der Rinde eines Quillaja saponaria Molina-Baumes gewonnen werden kann, wie in einem der Ansprüche 1 bis 5 oder 8 bis 20 definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs in einem Individuum.

23. Verwendung eines Konjugats (i) eines Oligosaccharidteils eines Gangliosids mit (ii) Keyhole-Limpet-Hämocyanin und einem Saponin, das aus der Rinde eines Quillaja saponaria Molina-Baumes gewonnen werden kann, wie in Anspruch 6 oder 7 definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Stimulierung oder Verstärkung der Antikörperproduktion in einem Individuum.

24. Verwendung eines Konjugats (i) eines Oligosaccharidteils eines Gangliosids mit (ii) Keyhole-Limpet-Hämocyanin und einem Saponin, das aus der Rinde eines Quillaja saponaria Molina-Baumes gewonnen werden kann, wie in Anspruch 6 oder 7 definiert, für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von Krebs in einem Individuum.

25. Verwendung nach Anspruch 22 oder 24, wobei der Krebs epithelialen Ursprungs ist.

26. Verwendung nach Anspruch 22 oder 24, wobei der Krebs neuroektodermalen Ursprungs ist.

27. Verwendung nach Anspruch 26, wobei der Krebs neuroektodermalen Ursprungs ein Melanom ist.

28. Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei in dem Konjugat das Gangliosidderivat mit dem auf einem immunogenen Protein basierenden Träger über eine stabile Aminbindung zwischen dem C-4-Kohlenstoff der Sphingosinbase des Ceramidteils des Gangliosidderivats und einer &epsi;- Aminolysylgruppe des auf einem immunogenen Protein basierenden Trägers konjugiert ist.