DE69621915T2

DE69621915T2 - Anti-dns-antikörpernachweis mittels erkennung und bindung telomerischer dns-sequenzen

Info

Publication number: DE69621915T2
Application number: DE69621915T
Authority: DE
Inventors: Eava-Marjatta Salonen
Original assignee: Biohit Oy
Current assignee: Biohit Oy
Priority date: 1995-03-01
Filing date: 1996-02-29
Publication date: 2003-01-23
Anticipated expiration: 2016-03-01
Also published as: AU720912B2; EP0812421B1; WO1996027131A1; FI100556B; EP0812421A1; FI950962A0; DE69621915D1; ATE219580T1; NZ301725A; ZA961628B; FI950962L; ES2175069T3; AU4721596A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von anti-DNA- Antikörpern in Proben, die von eukaryontischen Organismen erhalten werden, insbesondere Körperflüssigkeiten von Wirbeltieren, und genauer gesagt ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis von anti-DNA-Antikörpern in Körperflüssigkeiten von Menschen und Haustieren. Die Erfindung betrifft auch einen Testkit zur Durchführung des besagten Verfahrens und Arzneistoffe und eine Therapie für Patienten, die an Krankheiten leiden, bei denen die Anwesenheit von anti-DNA-Antikörpern eine Rolle spielt, insbesondere Autoimmunerkrankungen wie Lupus Erythematodes und Rheumatoide Arthritis.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Lupus Erythematodes ist eine Autoimmunerkrankung (Antikörper werden gegen Selbstantigene produziert), bei der das Immunsystem des Körpers aus unbekannten Gründen das Bindegewebe angreift, als ob es fremd sei, und eine Entzündung verursacht. Von der Vielzahl an autoreaktiven Antikörpern, die sich während dieser Krankheit spontan bilden, sind hohe Spiegel an zirkulierenden Autoantikörpern gegen DNA der beste Beweis der Erkrankung.
Beim Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) kommen im Blut fast unabdingbar Antikörper vor, die gegen eine oder mehrere Komponenten von Zellkernen gerichtet sind. Gewisse Manifestationen bei SLE scheinen mit der Anwesenheit verschiedener anti-Zellkern- Antikörper und von genetischen Markern assoziiert zu sein, die nahegelegt haben, daß SLE eine Familie von Krankheiten sein könnte [Mills, J.A., Medical Progress 33, 1871-1879 (1994)].
Der allgemeinere Typus von Lupus Erythematodes, Lupus Erythematodes discoides (DLE) betrifft ausgesetzte Bereiche der Haut. Die ernstere und tödliche Form, Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) betrifft viele Syteme des Körpers, einschließlich der Gelenke und der Nieren.
Tiermodelle haben bestätigt, daß ein Organschaden und frühzeitiger Tod nur nach Verschiebung des B-Zell-Repertoires zu Autoreaktivität auftreten [Klinman, D.M.J. Clin. Invest. 86, 1249-1254 (1990). Klinman, D.M. et al., J. Immunol. 144, 506-511 (1990)]. Von Lupus nephritis, insbesondere diffuser proliferativer Glomerulonephritis, ist bekannt, daß sie mit zirkulierenden Antikörpern gegen doppelsträngige (native) DNA assoziiert ist [Casals, S. et al., Arthritis Rheum. 7, 379-390 (1964); Tan E.M. et al., J. Clin. Invest. 82, 1288-1294 (1966)]. Der Nachweis von anti-Zellkern-Antikörpern ist ein empfindlicher Durchmusterungstest auf SLE. Anti-Zellkern-Antikörper treten bei mehr als 95% der Patienten auf [Hochberg, M.C. Rheum. Disc. Clin. North Am. 16, 617-39 (1990)].
Der allgemeinste Antikörper bei Patienten mit SLE ist gegen nucleosomale DNA- Histon-Komplexe gerichtet und ergibt ein homogenes Färbungsmuster beim Immunfluoreszenztest auf anti-Zellkern-Antikörper [Mohan, C. et al., J. Exp. Med. (1993) 177, 1367-81]. Anti-Zellkern-Antikörper sind auch bei den meisten anderen rheumatischen Erkrankungen zu sehen [Tan, E.M., Adv. Immunol. (1989) 44, 93-151] und werden transient bei Virusinfektionen produziert und sind bei etwa 2 Prozent der normalen Population vorhanden, üblicherweise mit niedrigen Titern.
Antikörper gegen native oder doppelsträngige DNA und Sm, ein ribonucleäres Proteinantigen, sind für die Diagnose von SLE spezifischer als andere anti-Zellkern- Antikörper [Mills, J.A., Medical Progress 33, 1871-1879 (1994)]. Bei Patienten mit anti- nativen DNA-Antikörpern ist es üblicher, daß sie Nephritis haben, wobei der Titer dieses Antikörpers ein nützliches Maß für die Aktivität der Erkrankung ist [Swaak, A.J.G. et al., Ann. Rheum. Dis. 1986, 45: 359-66; ter Borg, E.J. et al., Arthritis Rheum. 1990: 33, 634-43].
Die durchschnittliche Überlebensrate von 10 Jahren ab der Diagnose für Patienten mit SLE, die in der letzten Dekade beobachtet wurde, ist nahezu 90 Prozent [Pistiner et al., Semin.
Es ist weiterhin eine Aufgabe der Erfindung, ein diagnostisches Verfahren zum Nachweis von Lupus Erythematodes, Rheumatoider Arthritis, Sclerodermie und anderen Autoimmunerkrankungen, insbesondere Systemischer Lupus Erythematodes, in Vertebraten durch Nachweis erhöhter Spiegel an anti-DNA-Antikörpern in einer Körperflüssigkeit des Vertebraten mit der Hilfe von Telomersequenzen, die für die Säuger spezifisch sind, und/oder mit der Hilfe von Antikörpern oder Fragmenten von Antikörpern bereitzustellen, die für die Telomersequenzen spezifisch sind.
In der folgenden Beschreibung und den Ansprüchen sollte der Ausdruck "Telomersequenz", wie er allgemein im Kontext der Erfindung verwendet wird, so verstanden werden, daß er jede DNA-Telomersequenz bedeutet, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die besteht aus einzelsträngiger Vertebraten-Telomersequenz, einem komplemetären Strang dazu, einem doppelsträngigen Vertebraten-Telomer, und einem Teil oder einer Wiederholung oder einer Kombination der vorher genannten, wobei diese Sequenzen in der Lage sind, die anti- DNA-Antikörper zu binden.
Der Ausdruck für die Telomersequenz spezifischer Antikörper sollte so verstanden werden, daß er jeden Antikörper bedeutet, der spezifisch an die Telomersequenz bindet und somit in der Lage ist, mit dem anti-DNA-Antikörper zu konkurrieren. Der spezifische Antikörper kann von jeder Ig-Klasse sein, ist aber vorzugsweise ein Antikörper der IgG-, IgM- oder IgA-Klasse. Spezielle Vorteile der Erfindung werden durch die Verwendung von Fragmenten des spezifischen Antikörpers erhalten, insbesondere Fab oder F(ab')&sub2;. Die Fragmente können von natürlicherweise vorkommenden anti-DNA-Antikörpern abgeleitet sein oder sie können vorzugsweise mittels rekombinanter DNA-Techniken produziert sein.
Es ist auch eine Aufgabe der Erfindung, einen Testkit zum Nachweis von anti-DNA- Antikörpern bereitzustellen, wobei der Testkit vorzugsweise immobilisierte Telomersequenzen umfaßt, die in der Lage sind, an anti-DNA-Antikörper zu binden. Der Testkit umfaßt vorzugsweise eine Markierung, die die Bindung des anti-DNA-Antikörpers an die Telomersequenz anzeigt.
Ein Ziel der Erfindung ist es, quantitative und qualitative Testkits zum Nachweis von anti-DNA-Antikörpern bereitzustellen.
Es ist auch ein Ziel der Erfindung, durch die selektive Bindung der anti-DNA- Antikörper an Telomersequenzen außerhalb des Körpers des Vertebraten Mittel zur Entfernung von anti-DNA-Antikörpern aus flüssigen Proben bereitzustellen, insbesondere aus einer Körperflüssigkeit eines Vertebraten wie dem Serum eines Menschen. Das Mittel umfaßt vorzugsweise eine Säule oder Matrix, die immobilisierte Telomersequenzen umfaßt, die in der Lage sind, anti-DNA-Antikörper zu binden.
Es ist weiterhin eine Aufgabe der Erfindung, einen Arzneistoff bereitzustellen, der in der Lage ist, bei Patienten, die an einer Autoimunkrankheit leiden, die Bindung von anti- DNA-Antikörper zu inhibieren oder ihre Aktivität zu reduzieren, wobei der Arzneistoff eine Menge an Telomersequenzen oder Fragmenten von Antikörpern dagegen enthält, die wirksam bei der Hemmung der Bindung der Telomersequenz oder bei der Neutralisation der zerstörerischen Wirkung der Patienten-spezifischen anti-DNA-Antikörper ist.
Telomere, terminale DNA-Protein-Komplexe von Chromosomen, sind wichtig beim Schutz, der Positionierung und für die Stabilität von Chromosomen [E.H. Blackburn und J.W. Szostak, Annu. Rev. Biochem. 53, 163 (1984); V.A. Zakian, Annu. Rev. Genet. 23, 579 (1989)]. Sie sind auch erforderlich für die vollständige Replikation des chromosomalen Terminus während jedes Zellzyklus. Alle bekannten eukaryontischen Telomere bestehen aus Hunderttausenden von einfachen, wiederholten Tandemsequenzen von DNA und assoziierten Proteinen. Ein funktionelles menschliches Telomer ist so definiert, daß es eine Wiederholung der Sequenz 5'-TTAGGG-3' besitzt [E.H. Blackburn, Nature 350, 569 (1991); R.K. Moyzis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 6622 (1988); J. Meyne et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86, 7049 (1989)]. Alle Vertebraten haben dieselbe Telomersequenz (TTAGGG)n [Moyzis, R.K., Buckingham, J.M., Cram, L.S., Dani, M., Deaven, L.L., Jones, M.D., Meyne, J., Ratliff, R.L. & Wu, J.-R. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 6622-6626, J. Meyne, R.L. Ratliff, R.K. Moyzis Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 86, 7049 (1989)]. Eine allgemeine Struktur von wiederholten Sequenzen von G- und C-reichen komplementären Strängen der eukaryontischen Telomeren ist (T oder A)m(G)n [Blackburn, E.H. und Szostak, J.W. Annu. Rev. Biochem. 53, 163-194 (1984); Weiner, A.M. Cell 52, 155-157 (1988)].
Telomere können unter Verwendung eines Fluoreszenzmikroskops an den Spitzen der Chromosomen sichtbar gemacht werden. Wenn markierte (GGGTTA)&sub7;·(TAACCC)&sub7;- Oligomere mit Metaphasen-Chromosomen hybridisiert wurden, war unter Verwendung eines Biotin-Avidin-Nachweissystems an den Enden der Chromosomen das gesprenkelte Fluoreszenzsignal eindeutig zu sehen [Meyne, J.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 86, 7048- 7053 (1989)]. Obwohl Telomersequenzen in der Evolution hoch konserviert sind, ist die korrekte Sequenz der Telomereinheit für die Telomerfunktion erforderlich, da zum Beispiel das Hinzufügen von Telomer-DNA, die eine mutierte Telomersequenz beinhaltete, zu den Enden von endogenen Tertrahymena-Telomeren (die eine Sequenzwiederholung 5'- TTGGGG-3' haben) zur Instabilität der Länge von Telomeren und zum Tod führte [Yu et al., Nature (London) 344, 126-132 (1990); Harley, C.B. et al., Nature (London) 345, 458-460 (1990)].
Die Struktur und Funktion von Telomeren wurden von E.H. Blackburn, Nature, 350, 569-573 (1991) beschrieben. Es wurde nicht berichtet, daß Telomere eine Verbindung mit SLE oder anderen Autoimmunerkrankungen haben.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung und auch der anderen und weiteren Aufgaben und der Natur und der Vorteile der Erfindung wird Bezug genommen auf die folgende ausführliche Beschreibung der spezifischen Ausführungsformen.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem neuen Befund, daß Autoantikörper (anti- DNA-Antikörper) durch Telomere erkannt und gebunden werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zum Nachweis von Autoantikörpern oder anti-DNA- Antikörpern in Proben von eukaryontischem Ursprung, insbesondere Körperflüssigkeiten von Vertebraten, insbesondere Serum, offenbart
Körperflüssigkeiten, die außer Serum anti-DNA-Antikörper enthalten können, sind cerebrospinale Flüssigkeit, Synovialflüssigkeit, pleurale Flüssigkeit, Aszites, Speichel, Tränen, Urin, Drüsensekrete, Lymphe usw. Von den Antikörpern der Klassen IgG, IgM und IgA ist bekannt, daß sie in den Blutstrom sezerniert werden, während vor allem IgA-Antikörper in Speichel, Tränen usw. gefunden werden. Die bevorzugte Körperflüssigkeit zum quantitativen Nachweis gemäß der Erfindung ist Säugerserum.
Telomere sind in der Natur evolutionär hoch konserviert, und alle Eukaryonten haben Telomere mit einer sehr eng verwandten Struktur. Das Vertebraten-Telomer ist aus wiederholten Sequenzen von G- und C-reichen komplementären Strängen aufgebaut, mit einem G-reichen Strang, der sich über den reichen Strang als 3'-Überhang erstreckt. Andere eukaryontische Telomere haben sehr ähnliche Sequenzen, üblicherweise ist nur ein Nucleotid in dem Hexapeptid unterschiedlich. Somit ist die vorliegende Erfindung auf Menschen und Tiere gleichermaßen anwendbar.
Es ist auch möglich, Teile des Telomers zu verwenden, die die anti-DNA-Antikörper als Bindungspartner erkennen. Somit kann ein Teil der Hexanucleotidwiederholung wie TTAG verwendet werden, um die Erkennung durchzuführen.
Es wurde gefunden, daß die anti-DNA-Antikörper in einigen Proben spezifischer an den einen oder den anderen der komplementären einzelsträngigen Sequenzen binden können, während einige leichter an eine doppelsträngige Telomer-DNA (dsDNA) binden.
Es ist auch möglich, spezifische Antikörper gegen die Telomersequenz, um um die Bindungsreaktion zwischen Telomer und anti-DNA-Antikörper in der Probe zu konkurrieren, zu verwenden. Insbesondere Fragmente der leichten Kette, Fabs der spezifischen Antikörper, können zur Kompetition mit den anti-DNA-Antikörpern verwendet werden.
Die in der vorliegenden Erfindung verwendete Telomersequenz ist entweder die einzelsträngige Telomersequenz, welche bei Vertebraten 5'-TTAGGG-3' ist, ihre komplementäre Sequenz (bei Vertebraten 5'-CCCTAA-3'), ein funktioneller Teil der vorstehenden, ein Oligonucleotid, das eine oder mehrere Wiederholungen der Telomersequenz oder der komplementären Sequenz aufweist, eine dopplesträngige DNA, die aus den vorstehenden einzelsträngigen Sequenzen gebildet wird, oder ein Oligonucleotidteil davon oder Wiederholungen des Telomerdubletts.
In dem Verfahren zum Nachweis von anti-DNA-Antikörpern gemäß der vorliegenden Erfindung wird die ausgewählte funktionelle Telomersequenz auf eine Weise synthetisiert, die dem Durchschnittsfachmann bekannt ist, z. B. in kommerziellen Nucleotid-Synthesegeräten. Die erhaltene Sequenz wird dann bevorzugt auf einem Träger immobilisiert, der die Wände von Mikrotitermulden, Glas- oder Plastikperlen, eine poröse Unterlage, Sepharose usw. umfasssen kann, wobei die Träger dem Durchschnittsfachmann bekannt sind.
Immobilisierungs- (Festphasen-)verfahren sind dem Durchschnittsfachmann auch bekannt. Mit der Telomersequenz können zum Beispiel die Wände von Mikrotitermulden, Glas- oder Plastikperlen beschichtet werden, poröse Unterlagen, Filterpapier oder dergleichen imprägniert werden. Die Immobilisierung kann direkt auf dem fraglichen Material erfolgen oder vorzugsweise unter Verwendung des Streptavidin-Biotin-Systems, das eine stärkere und genauer orientierte Immobilisierung der Telomersequenz bereitstellt. Die Telomersequenzen können am 3'- oder 5'-Ende biotinyliert werden. Das tatsächlich für die Immobilisierung verwendete Verfahren ist jedoch nicht kritisch für die Durchführung der Erfindung. Die verwendete Menge an Telomersequenz ist zwischen 7-2 ug/ml oder sogar beträchtlich mehr. Die Menge an Telomersequenz ist für die Durchführung des Tests nicht kritisch. Man glaubt, daß ein bevorzugter Bereich zwischen 100-500 ng/ml ist.
Der spezifische Antikörper gegen die Telomersequenz und die Fragmente davon können aus dem Serum von Patienten, die an Autoimmunkrankheiten mit anti-DNA- Antikörpern leiden, auf eine Weise bereitgestellt werden, die dem Durchschnittsfachmann bekannt sind, oder sie können mittels rekombinanter DNA-Verfahren bereitgestellt werden. Somit können die Telomersequenzen gemäß der vorliegenden Erfindung für die Produktion von anti-DNA-Antikörpern und Fragmenten davon für die therapeutische Verwendung verwendet werden.
Wenn eine immobilisierte Telomersequenz mit einer zu testenden Probe in Kontakt gebracht wird, wird jeder in der Probe anwesende anti-DNA-Antikörper an die immobilisierte Sequenz binden. Der bei der Bindungsreaktion gebildete Komplex kann mittels Verfahren nachgewiesen werden, die in der Immunchemie bekannt sind. Entsprechend können spezifische Antikörper gegen die Telomersequenz oder die Fab-Fragmente davon in einem kompetitiven immunchemischen Test verwendet werden, um die Anwesenheit von anti-DNA- Antikörpern in einer Probe anzuzeigen.
Die durch die Telomersequenzen erkannten Autoantikörper können von verschiedenen Immunglobulin-Klassen sein, welche bisher unbekannte Unterschiede bei der Progression der Krankheit oder des Krankheitsmusters anzeigen können. Somit können die Autoantikörper von der IgG-, IgM-, IgA-, IgD- oder IgE-Klasse sein, da die anti-DNA-Antikörper zu jeder der bekannten Immunglobulin-Klassen gehören können.
Verschiedene anti-Ig-Antikörper werden die Anwesenheit von Autoantikörpern verschiedener Ig-Klassen nachweisen. Somit werden zum Beispiel markierte anti-IgG verwendet, um die Anwesenheit von Autoantikörpern der IgG-Klasse zu bestimmen, anti- IgM-Antikörper werden verwendet, um Autoantikörpern der IgM-Klasse nachzuweisen, und so weiter.
Es ist im Stand der Technik bekannt, daß SLE-Patienten vorwiegend Autoantikörpern der IgG-Klasse haben, während zum Beispiel Rheumapatienten vorwiegend IgM- Autoantikörpern in ihrem Serum zu haben scheinen. Die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests zeigen jedoch, daß SLE-Patienten oft Autoantikörper entweder der IgG-, IgM- oder IgA-Klasse haben, wobei die Spiegel der Autoantikörper der IgG-Klasse bei 50 von 52 getesteten Patienten, die bekanntermaßen SLE haben, erhöht sind im Vergleich mit SLE-negativen Patienten. Die beiden Patienten, die relativ niedrige Spiegel an Antikörpern der IgG-Klasse hatten, waren über 70 Jahre alt, und wenn die Antikörper der IgG- IgM- und IgA-Klasse getestet wurden, ergaben alle 52 SLE-Patienten mit dem diagnostischen Test der Erfindung positive Testergebnisse.
Die gebundenen anti-DNA-Antikörper können mit der Hilfe einer Markierung an einem anti-Ig-Antikörper nachgewiesen werden, in im Stand der Technik bekannter Weise, wobei die Empfindlichkeit des Tests von der Markierung, dem Immuntest usw. abhängt. Die Markierung kann eine radioaktive Markierung, eine Enzymmarkierung, eine Fluorochrom- oder Fluoreszenzmarkierung, eine Farbstoff-, Sol-, Biotinmarkierung, eine lumineszierende Markierung, ein gefärbter Latexpartikel und/oder ein markierter polyclonaler oder monoclonaler Antikörper oder dergleichen sein. Die Telomersequenz oder ein Fab- oder F(ab')&sub2;-Fragment können auch markiert werden und bei bekannten Arten von kompetitiven Immuntests verwendet werden. Der Test kann auch ein EIA, ein Radioimmuntest, ein Immunfluoreszenztest, ein Immunpräzipitations-, ein Komplementfixierungs-, ein Immunchromatographietest oder jeder andere sein, der zum Nachweis der Bindung von Autoantikörpern und einer Telomer-DNA geplant ist.
Der Test kann als ein quantitativer Test wie ein EIA-Test oder als mehr oder weniger qualitativer Schnelltest, wie gewünscht, unter Verwendung von Verfahren formuliert werden, die per se im Stand der Technik bekannt sind und die in den hier folgenden Beispielen exemplarisch dargestellt sind.
Die in Verbindung mit der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests zeigen sehr stimmig, daß eine Diagnose von Patienten mit systemischem Lupus erythematodes unter Verwendung einer Telomersequenz für die Erkennung von anti-DNA-Antikörpern durchgeführt werden kann. Von 52 SLE-Patienten wurden alle bei der Bindung des Autoantikörpers von mindestens einer Ig-Klasse positiv diagnostiziert, wenn sie mit den Tests der vorliegenden Erfindung getestet wurden. Die Tests der vorliegenden Erfindung sind leicht durchzuführen, sie sind schnell und zuverlässig. Der Bedarf für diese Art von Tests auf dem Fachgebiet ist enorm, da bisher die Testung auf SLE unsicher und mühselig war. Tatsächlich war keine sichere Diagnose möglich, bis klare Zeichen einer ernsthaften Erkrankung erschienen.
Die durchgeführten Tests zeigen auch, daß Patienten mit rheumatoider Arthritis durch den Nachweis der Anwesenheit von anti-DNA-Antikörpern, insbesondere der IgM-Klasse, diagnostiziert werden können.
Darüber hinaus zeigten mehrere Psoriasis-Patienten erhöhte Spiegel an anti-DNA- Antikörpern im Vergleich mit gesunden Kontrollen.
Beim systemischem Lupus erythematodes (SLE) enthält das Serum von Patienten fast unweigerlich Antikörper, die gegen die Zellkerne gerichtet sind (anti-DNA-Antikörper). Einige von ihnen sind direkt verantwortlich für die von der Krankheit verursachten Schäden. Gemäß der Erfindung wurde gefunden, daß Telomersequenzen diese Autoantikörper binden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung umfaßt daher die Verwendung dieser Bindungsaffinität zur Entfernung von anti-DNA-Antikörpern aus Körperflüssigkeiten, insbesondere aus dem Serum von Menschen.
Die Entfernung von anti-DNA-Antikörpern kann in einer Affinitätssäule durchgeführt werden, die immobilisierte Telomersequenzen enthält, die in der Lage ist, anti-DNA- Antikörper aus einer flüssigen Probe zurückzuhalten. Die Flüssigkeit kann bei Bedarf erneut durch die Säule geführt werden. Nach der Verwendung können die gebundenen anti-DNA- Antikörper mittels Verfahren, die per se bekannt sind, von der Säule entfernt werden, und die Säule kann erneut verwendet werden. Die behandelte Flüssigkeit wie menschliches Serum kann in kontinuierlicher Weise an den Patienten zurückgegeben werden oder für andere Zwecke verwendet werden.
Die Entfernung von anti-DNA-Antikörper aus einer Flüssigkeit kann auch unter Verwendung verschiedener Batch-Verfahren erreicht werden, wobei die Telomersequenzen auf einer Matrix von geeigneter Art wie Plastikperlen, Filter usw. immobilisiert sind.
Die Häufigkeit und die Zeit, die für die Behandlung zum Beispiel von Serum eines Menschen, der an SLE leidet, mittels einer Affinitätssäule oder eines anderen Mittels zur Entfernung von anti-DNA-Antikörpern erforderlich ist, können mit einem Test verfolgt werden, der gemäß der vorliegenden Erfindung geplant ist.
Es wurde gefunden, daß die Telomersequenzen die anti-DNA-Antikörper binden und ihre Bindungskapazität neutralisieren und daß entsprechend Antikörperfragmente, die für die Telomersequenzen spezifisch sind, mit der Bindung der anti-DNA-Antikörper an die Telomersequenzen konkurrieren und somit verhindern, daß die anti-DNA-Antikörper an Telomere gebunden werden.
Die Telomersequenzen, Teile oder Wiederholungen von ihnen, einzel- oder doppelsträngig, und Antikörperfragmente, die in den vorstehend beschriebenen Tests verwendet werden, können somit auch als aktive Mittel in Medikamenten gegen die zerstörerische Aktivität der anti-DNA-Antikörper bei Patienten verwendet werden, die an Krankheiten und/oder Störungen leiden, die von der Anwesenheit von anti-DNA-Antikörpern verursacht werden oder diese beteiligen.
Spezifischer ist der aktive Teil des Medikaments eine einzel- oder doppelsträngige Telomersequenz, eine Wiederholung oder ein Teil davon, eine komplementäre Sequenz oder eine beliebige Kombination der vorstehenden (im allgemeinen als Telomersequenz bezeichnet), die von einem anti-DNA-Antikörper des Patienten erkannt wird, oder ein Fragment (Fab oder F(ab')&sub2;) eines Antikörpers, der für die Telomersequenzen spezifisch ist. Ein Medikament gemäß der vorliegenden Erfindung umfaßt somit eine Menge einer Telomersequenz oder eines Antikörperfragments, wie vorstehend definiert, welche wirksam ist bei der Inhibition oder Reduktion der zerstörerischen Aktivität der anti-DNA-Antikörper des Patienten.
Besondere Vorteile werden durch die Verwendung der vorstehend erwähnten Antikörperfragmente in Medikamenten bereitgestellt, da sie mit autologen anti-DNA- Antikörpern um die Bindung an die Telomersequenzen des Patienten konkurrieren. Den Fab- oder F(ab')&sub2;-Fragmenten fehlen die Effektorfunktionen, und sie werden die Komplement- Kaskade nicht aktivieren, was zur Zerstörung der Zelle führt, wenn sie an ein Antigen gebunden ist, wie es die vollständigen anti-DNA-Antikörper tun.
Die vorliegende Erfindung umfaßt Medikamente für Menschen ebenso wie tiermedizinische Präparate, die die Vertabraten-Telomersequenz enthalten.
Die vorliegende Erfindung ermöglicht es weiterhin, dem fraglichen Patienten genau die Telomersequenz oder das spezifische Antikörperfragment zu verabreichen, das am wirksamsten sein wird, die Bindung der eigenen anti-DNA-Antikörper des Patienten an Telomersequenzen zu verhindern. Der Patient kann zunächst mit einem Test gemäß der vorliegenden Erfindung getestet werden, um zu bestimmen, welche Telomersequenz am besten an die anti-DNA-Antikörper bindet. Somit werden Tests bestimmen, ob einzel- oder doppelsträngige Telomersequenzen verwendet werden sollten, und von welcher Ig-Klasse die anti-DNA-Antikörper des Patienten sind.
In dieser therapeutischen Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird das Therapieschema vorzugsweise individuell für jeden Patienten geplant, basierend auf der anti- DNA-Antikörper-Bindung, d. h. welche Immunglobulin-Klasse, IgG, IgM, IgA usw., und welche Telomerform sie bevorzugen.
Die Menge an aktivem Telomermittel, die einem Patienten verabreicht werden sollte, wird je nach Rasse, Alter, Krankheitszustands des Patienten variieren und die wirksamste Dosis wird auf einer von-Fall-zu-Fall-Basis bestimmt werden müssen. Die Telomere sind jedoch DNA-Sequenzen, die als solche in Chromosomen existieren und sind somit Teil des Säugerkörpers. Somit ist nicht anzunehmen, daß die maximale Menge von Telomer, die einem Patienten verabreicht wird, kritisch sein wird. Bei Toxizitätstests in Kaninchen wurde nach der Verabreichung von Telomer kein Effekt beobachtet. Die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendeten Fabs werden von Säugerursprung sein oder mittels rekombinanter Verfahren so hergestellt werden, daß sie selbigen ähneln, und werden daher für den Säugerkörper verträglich sein.
Das aktive Telomermittel der vorliegenden Erfindung kann auf eine Art, die im Gebiet der Pharmazie bekannt ist, in pharmazeutische Herstellungen wie injizierbare Lösungen formuliert werden.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung, ohne sie jedoch in irgendeiner Weise zu beschränken.

Beispiel 1

Synthese von Telomersequenzen

Die Synthese von Oligonucleotiden wurde mit einem kommerziellen Gerät durchgeführt, dem Oligonucleotide-Synthesegerät (Applied Biosystems). Die folgenden Oligonucleotide wurden synthetisiert
Bestellnummer 2667: 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3'
Bestellnummer 2668: 5'-CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA-3'
Im Labor wurde wie folgt eine Duplex-DNA (2667 + 2668) gebildet:
Ein Volumen von 50 ul (50 ug) von jedem Oligo (2667 und 2668) in einem Puffer aus 10 mM Tris, pH7, 4,1 mM EDTA, der 50 mM NaCl enthielt, wurde kombiniert und 5 Minuten auf 75ºC erhitzt. Man ließ das Gemisch eine Stunde auf Raumtemperatur abkühlen. Mit dem abgekühlten Gemisch wurden unmittelbar Polystyrol-Mikrotitermulden (Nung) in einer Konzentration von 1 oder 2 ug pro ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, pH 7,4) beschichtet. Jede Mulde erhielt 100 ul Beschichtungslösung.

Beispiel 2

Test für den Nachweis von anti-DNA-Antikörper

1. Polystyrol-Mikrotitermulden wurden mit den einzelsträngigen Oligonucleotiden 2667 oder 2668 oder mit der Duplex-DNA (2667 + 2668), die in Beispiel 1 erhalten worden war, beschichtet. Die Beschichtungskonzentration war 1 oder 2 ug pro ml PBS, pH 7,4. Das Beschichtungsvolumen war 100 ul. Die Platten wurden ohne Abdeckung bei Raumtemperatur inkubiert, bis sie trocken waren.
2. Die Platten wurden dreimal mit 10 mM PBS, pH 7,4 gewaschen, das 0,05% Tween 20 (Fluka AG) enthielt.
3. Eine Nachbeschichtung wurde durch Aufbringen eines 100 ul-Volumens von Dulbecco-Puffer, der 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, pro Mulde durchgeführt, um die unspezifische Bindung zu blockieren. Die Inkubation betrug eine Stunde bei 37ºC unter einer Klebeabdeckung, um differentielles Verdampfen zu verhindern.
4. Die Platten wurden wie in 2 gewaschen, luftgetrocknet und bei +4ºC für die spätere Verwendung aufbewahrt.

Beispiel 3

Der Nachweis von Autoantikörpern gegen Telomersequenzen

1. Serum von Patienten mit der Diagnose SLE und von gesunden Kontrollen wurde 1 : 10 mit Dulbecco-Puffer verdünnt, der 0,5% BSA und 0,05% Tween 20 enthielt, und ein Volumen von 100 ul der Serumverdünnung wurde in den beschichteten Mulden unter einer Plastikklebeabdeckung 2 Stunden bei 37ºC inkubiert.
2. Die Platten wurden dreimal mit 10 mM PBS, pH 7,4 gewaschen, das 0,05% Tween 20 (Fluka AG) enthielt.
3. Ein Volumen von 100 ul von mit alkalischer Phosphatase markiertem Schwein-anti- Mensch IgG (zur Bestimmung der Autoantikörper der IgG-Klasse, Orion Diagnostica, Espoo, Finnland) oder von mit alkalischer Phosphatase markiertem Schwein-anti-Mensch IgM (zur Bestimmung der Autoantikörper der IgM-Klasse), 1 : 200 verdünnt mit Dulbecco-Puffer, der 0,5% BSA und 0,05% Tween 20 enthielt, wurde zugegeben.
Die Inkubation fand eine Stunde bei 37ºC statt.
4. Die Platten wurden wie in 2 gewaschen
5. Ein Volumen von 100 ul Substrat, 0,2% Dinatriumsalz von para- Nitrophenylphosphat in Diethanolamin-Puffer, pH 10,0, wurde pro Mulde zugegeben und die Platten wurden bei Raumtemperatur 30 min inkubiert.
6. Ein Volumen von 100 ul 1M Natriumhydroxid (NaOH) wurde pro Mulde zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
7. Die Absorption der Mulden wurde unter Verwendung eines Titertek Multiscan- Spektrophotometers bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt.
Die Ergebnisse des Tests sind in den Tabellen 1 und 2 gezeigt. TABELLE 1: Tests bei Patienten mit SLE

Beispiel 4

Inhibierung der Bindung von anti-DNA-Antikörpern an immobilisierte Telomersequenzen

Um den Beweis zu erbringen, daß die Bindung spezifisch ist und daß die Antikörper mit der spezifischen Telomersequenz neutralisiert werden können, wurde der Test, wie in Beispiel 3 beschrieben, mit der folgenden Modifikation durchgeführt. Eine Menge von 5 ug/ml von Oligonucleotid 2667, 2668 bzw. der Duplex-DNA (2667 + 2668) wurde zu einer 1 : 25 Verdünnung eines Patientenserums zugegeben und bei Raumtemperatur eine Stunde inkubiert. Nach dieser Inkubation wurde ein Volumen von 100 ul von jeder Inkubation pro Mulde zugegeben, die mit der identischen Telomersequenz beschichtet war (wie in Beispiel 2). Die Inkubation dauerte 2 Stunden bei 37ºC und die Bindung der Autoantikörper der IgG- oder IgM-Klasse wurde unter Verwendung der entsprechenden, markierten Schwein-anti-IgG- oder -IgM-Antikörper getestet, wie in Beispiel 3. Dasselbe 1 : 25 verdünnte Patientenserum ohne Zusatz von Telomersequenz diente als Kontrolle.
Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 gezeigt.

TABELLE 3

Inhibition der Bindung von Autoantikörpern der IgG-Klasse an immobilisierte Telomersequenzen durch die in der Tabelle angezeigte Telomersequenz. Immobilisierte Sequenz 2667 Immobilisierte Sequenz 2668 Immobilisierte Sequenz 2667 + 2668
Inhibition der Bindung von Autoantikörpern der IgM-Klasse an immobilisierte Telomersequenzen durch die in der Tabelle angezeigten Telomersequenzen. Immobilisierte Sequenz 2667 Immobilisierte Sequenz 2668 Immobilisierte Sequenz 2667 + 2668
Die vorstehenden Resultate zeigen, daß die Telomersequenzen in der Lage sind, in vitro die im Serum vorhandenen anti-DNA-Antikörper zu binden. Dies deutet eindeutig darauf hin, daß die Telomersequenzen auch in vivo in der Lage sind, die Telomer-spezifische anti- DNA-Antikörperbindungsstelle zu inhibieren. Es wird daher vorgeschlagen, die Telomersequenzen als spezifische therapeutische Mittel bei Patienten zu verwenden, die an Autoimmunerkrankungen leiden, die die Anwesenheit von anti-DNA-Antikörpern in der Körperflüssigkeit des besagten Patienten umfassen.

Beispiel 5

Inhibierung der Bindung von Autoantikörpern der IgG-Klasse an Teile der Telomersequenz

Der Test von Beispiel 4 wurde mit den Teilsequenzen GGG bzw. CCC wiederholt. Die Resultate sind in der nachstehenden Tabelle gezeigt. Immobilisierte Sequenz 2667 Immobilisierte Sequenz 2668 Immobilisierte Sequenz 2667 + 2668
Die Resultate zeigen, daß eine gewisse Bindung auch an Teile der Telomersequenz stattfindet.

Beispiel 6

Immobilisierung von Streptavidin biotinylierten Telomersequenzen

1. Herstellung von Streptavidin beschichteten Platten, Streifen, Latexteilchen und Filterpapier

Ein Volumen von 100 ul gereinigtem Streptavidin (1,25-10 ug/ml), das bei Algol Oy, Finnland gekauft wurde, wurde in 0,01 M PBS (phosphatgepufferter Salzlösung), pH 7,4 bei Raumtemperatur immobilisiert. Das nicht gebundene Streptavidin wurde durch dreimaliges Waschen mit dem Waschpuffer 10 mM PBS, der 0,15 M NaCl und 0,05% Tween 20 (Fluka AG, Deutschland) enthielt, entfernt, dann erfolgte Lufttrocknung und Aufbewahrung bei 4ºC, wenn nicht sofort eine Verwendung stattfand. Eine Beschichtungskonzentration von 2 ug/ml wurde später für die Bindung der biotinylierten Oligonucleotide verwendet.

2. Synthetische Telomersequenzen

Biotinylierte synthetische Oligonucleotide wurden bei Pharmacia, Schweden gekauft. Die folgenden Oligonucleotide wurden synthetisiert:
EMS 1: 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3'-Biotin
EMS 2: 5'-CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA-3'-Biotin
SME 1: Biotin-5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3'
SME 2: Biotin-5'-CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA-3'
EMS 1 + 2 und SME 1 + 2: Duplex-DNAs (EMS 1 + 2 und SME 1 + 2) wurden im Labor wie folgt hergestellt.
Ein Volumen von 50 ul (50 ug) von jedem Oligo (EMS 1 und EMS 2 und SME 1 und SME 2) wurden in einem Puffer von 10 mM Tris - 1 mM EDTA, das 50 mM NaCl enthielt, pH 7,4, kombiniert und 5 min bei 75ºC erhitzt. Das Gemisch (EMS 1 + 2 oder SME 1 + 2) wurde eine Stunde bei Raumtemperatur abkühlen gelassen. Das abgekühlte Gemisch (100 ul) wurde unmittelbar in einem Bindungspuffer von 0,01 M PBS, das 0,15 M NaCl, 0,05% Tween 20 und 0,5% Rinderserumalbumin (BSA) enthielt, verdünnt (200 ng/ml), und man ließ es 2 h bei 37ºC an immobilisiertes Streptavidin binden. Derselbe Bindungs- (oder Inkubations-) Puffer wurde bei der Komplexbildung von Streptavidin-EMS 1- (oder -SME 1-) und Streptavidin-EMS 2- (oder -SME 2-) Komplexen verwendet.
Die Festphasen gebundenen Streptavidin-Oligonucleotid-Komplexe wurden nach dreimaligem Waschen mit dem vorstehenden Waschpuffer für den Nachweis von anti-DNA- Antikörpern verwendet. Die Festphasen-Komplexe wurden zwei Monate bei Raumtemperatur, +4ºC und -20ºC ohne statistisch signifikanten Verlust an Bindungsaktivität aufbewahrt.
Die Konzentration an Oligonucleotiden funktionierte in einem Bereich von 7-500 ng/ml gut, aber die Konzentration von 200 ng/ml wurde für den Nachweis von anti-DNA- Antikörpern ausgewählt. Das Maximum der Bindung wurde bei +37ºC bereits in 30 min erreicht.

Beispiel 7

Nachweis von Autoantikörpern gegen Telomersequenzen

1. Serum (und cerebrospinale Flüssigkeit) von Patienten mit der Diagnose Systemischer Lupus erythematodes (SLE), rheumatoide Arthritis und Psoriasis und von gesunden Kontrollen wurde jeweils 1 : 50 mit dem Bindungspuffer von Beispiel 6 verdünnt, der 0,5% BSA und 0,05% Tween 20 enthielt. Ein Volumen von 100 ul der Serumverdünnung wurde pro Mulde aufgebracht, die Streptavidin-Telomer-Komplexe enthielten, und eine Stunde bei +37ºC (oder bei Raumtemperatur) unter Plastik-Klebeabdeckung inkubiert.
2. Die Platten wurden dreimal mit 10 mM PBS, pH 7,4 gewaschen, das 0,05% Tween 20 enthielt.
3. Ein Volumen von 100 ul von mit alkalischer Phosphatase markiertem Schwein-anti- Mensch IgG- (gamma-Ketten spezifisch), IgM- (u-Ketten spezifisch) oder IgA- (alpha-Ketten spezifisch) Konjugat (Orion Diagnostica, Espoo, Finnland), 1 : 200 verdünnt mit 10 mM PBS, pH 7,4, das 0,5% BSA und 0,05% Tween 20 enthielt, wurde zugegeben.
Die Inkubation fand eine Stunde bei 37ºC statt.
4. Die Platten wurden wie in 2 gewaschen
5. Ein Volumen von 100 ul Substrat, 0,2% Dinatriumsalz von para- Nitrophenylphosphat in Diethanolamin-Puffer wurde pro Mulde zugegeben, und die Platten wurden bei Raumtemperatur 30 min inkubiert.
6. Ein Volumen von 100 ul 1M Natriumhydroxid (NaOH) wurde pro Mulde zugegeben, um die Reaktion zu stoppen.
7. Die Absorption der Mulden wurde unter Verwendung eines Titertek Multiscan- Spektrophotometers (Flow Laboratories, U.K.) bei einer Wellenlänge von 405 nm bestimmt.
Einige der Ergebnisse des Tests sind in den Tabellen 4, 5, 6 und 7 dargestellt, die die Mittelwerte von repräsentativen durchgeführten Doppeltests zeigen. In den Tabellen steht W für weiblich und M steht für männlich, die Zahlen in Verbindung damit geben das Alter der Patienten.
Die Tabellen zeigen SLE- und RA-Patienten, die erhöhte Spiegel an anti-DNA- Antikörpern im Vergleich mit gesunden Kontrollen haben. Einige Psoriasis-Patienten haben auch erhöhte Spiegel an anti-DNA-Antikörpern. Die gesunden Kontrollen hatten eindeutig niedrigere Absorptionsspiegel. Der Grenzwert der Absorption bei 405 nm für den vorliegenden Test ist 0,150 (A 405 = 0,150). Spiegel, die über 0,150 erhöht waren, wurde primär bei der IgG-Klasse in SLE-Patientenseren und bei der IgM-Klasse von RA- Patientenseren erhalten. TABELLE 4 Tests mit SLE-Patienten TABELLE 5 Tests mit Patienten mit Rheumatoider Arthritis (RA) TABELLE 6 Kontrolltests (keine Diagnose auf SLE oder RA) Gesunde Kontrollen TABELLE 7 Tests bei Psoriasis-Patienten

Beispiel 8

Latex-Agglutinationstest

1. Ein Volumen von 50 ul an Polystyrol-Latexperlen (Sigma. St. Louis, U.S.A.) mit einem Teilchendurchmesser von 1,1 um (u) wurde in 10 mM PBS, pH 7,4 bei einer Konzentration von 5 ug Streptavidin/ml über Nacht bei Raumtemperatur inkubiert. 2. Alles ungebundene Streptavidin wurde von dem gebundenen durch Waschen mit 0,01 M PBS, pH 7,4 entfernt, gefolgt von Zentrifugation.
3. Ein Volumen von 50 ul an biotinyliertem Oligonucleotid EMS 1 von Beispiel 6 (5 ug/ml in PBS, pH 7,4, das 0,05% Tween und 0,5% BSA enthielt) wurde mit den Streptavidin beschichteten Latexteilchen inkubiert.
4. Alles ungebundene Oligonucleotid wurde von dem gebundenen durch Waschen mit 0,01 M PBS, pH 7,4, entfernt, gefolgt von Zentrifugation.
5. Seren von SLE-Patienten wurden 1 : 5 mit Inkubationspuffer verdünnt (7,5 g Glycin/l, ergänzt mit 10 g NaCl/l, pH 8,2).
6. Ein Tropfen (50 ul) der Verdünnung an Patientenserum wurde mit einem Tropfen der beschichteten Latexteilchen inkubiert.
7. Mit anti-DNA-positiven Seren trat eine sichtbare Agglutination der Latexteilchen auf, während die negativen Seren keine Reaktion ergaben
Der Test stellt einen schnellen qualitativen Test für die Diagnose von SLE bereit.

Beispiel 9

Komplementfixierungstest

1. Anti-DNA-Antikörperpositive SLE-Seren und Kontrollseren wurden seriell in Veronal-Puffer, pH 7,6, verdünnt (auch Barbital-Puffer genannt). Ein Volumen von 25 ul der verdünnten Proben wurden auf U-förmige Mikrotiter-Mulden übertragen.
2. Die nicht markierten Telomersequenzen 2667, 2668 bzw. 2667 + 2668 gemäß der Definition in Beispiel 1 wurden mit einer Konzentration von 10 ug/ml zu der Serumverdünnung zugegeben, und 25 ul wurden pro Probenmulde zugegeben.
3. Meerschweinchen-Komplement (25 ul) wurden über Nacht pro Mulde zugegeben.
4. Am Morgen wurde ein hämolytisches System (25 ul einer Suspension von roten Zellen des Schafs und 25 ul an Kaninchen-anti-Schaf-Antikörpern) zu den Probenmulden zugegeben. Die Reaktionsgemische wurden geschüttelt und dann 30 min bei 37ºC inkubiert, erneut geschüttelt und erneut 30 min bei 37ºC inkubiert.
5. Die Ergebnisse wurden sowohl objektiv als auch durch die Inhibition eines Lichtweges durch das Reaktionsgemisch sichtbar gemacht, gemessen mit einem Spektrophotometer. Eine totale Hämolyse (die Zerstörung von Zellen) wurde mit den Seren ohne Antikörper zu dem getesteten Antigen (in diesem Fall die Telomersequenzen) erhalten. Die Anwesenheit von anti-DNA-Antikörpern in den getesteten Serumproben resultierte in einem sichtbaren roten Pellet in der entsprechenden Reaktionsmulde (basierend auf dem Verbrauch von Komplement in dem Reaktionssystem).
Der Komplementfixierungstest stellt einen schnellen qualitativen Test für die Diagnose von anti-DNA-Antikörpern in einer Probe bereit.

Beispiel 10

Nachweis von anti-Telomer-Antikörpern unter Verwendung eines Immunfluoreszenz-Antikörper-Verfahrens

1. Die Metaphasen-Chromosomen von drei-Tages-Kulturen von Blutlymphocyten, fixiert auf Glasobjektträgern, wurden vom Department of Obstetrics and Gynaecology, Helsinki University Central Hospital, erhalten.
2. Serumproben mit und ohne anti-DNA-Antikörper wurden 1 : 20 mit 0,01 M PBS, pH 7,4, das 0,5% BSA (Rinderserumalbumin) enthielt, verdünnt und auf dem Objektträger in einer Feuchtigkeitskammer 30 min bei +37ºC inkubiert.
3. Die Träger wurden dreimal 5 min bei Raumtemperatur gewaschen und luftgetrocknet.
4. Die Objektträger wurden mit einer 1 : 10-Verdünnung von FITC (Fluoresceinisothiocyanat) konjugierten Ziege-anti-Mensch-IgG-Antikörpern (Kallestad, Austin, Texas 78746, USA) in einer Feuchtigkeitskammer 30 min bei +37ºC inkubiert.
5. Die Objektträger wurden wie in 3) gewaschen und luftgetrocknet.
6. Ein Fixiermittel und Deckplättchen wurden zugegeben, und die Träger waren fertig zur mikroskopischen Untersuchung.

Ergebnisse:

Die anti-DNA-Seren ergaben mit einer 1 : 50 Vergrößerung und Öl eine positive gefleckte Fluoreszenzfärbung (eine typische Telomerfärbung), während mit anti-DNA- negativen Seren keine Färbung zu sehen war.
Dieses Verfahren stellt einen schnellen Test zum Nachweis von anti-DNA-Antikörpern in einer Probe bereit.

Beispiel 11

Schneller Nachweis von anti-DNA-Antikörpern mit markiertem anti-Ig

1. Einige Tropfen einer Telomersequenz gemäß Beispiel 1 bzw. Beispiel 6 werden zu Stücken von Filterpapier gegeben.
2. Ein Tropfen von Patientenserum bzw. von Spucke (Speichel) wird auf die Telomertropfen gegeben.
3. Die Filter werden gespült, um nicht gebundene Flüssigkeit zu entfernen.
4. Ein Tropfen von markiertem anti-Mensch-IgG bzw. markiertem anti-Mensch-IgA wird an den vorigen Tropfenstellen zu den Filtern zugegeben.
5. Im Falle der Anwesenheit von anti-DNA-Antikörpern in den Probetropfen ergab die Markierung unter Verwendung eines farbbildenden oder niederschlagbildenden Substrats ein sichtbares positives Signal.
Der vorstehende Test stellt einen rohen, aber sehr billigen, einfachen und schnellen Nachweis auf anti-DNA-Antikörper in Körperflüssigkeiten bereit, ohne die Notwendigkeit jeglicher Spezialausrüstung,

Beispiel 12

Verwendung verschiedener Antikörperavidität (Affinität) bei der Bindung einzel- oder doppelsträngiger DNA

Vier Patientenseren von typischen SLE-Fällen wurden für den Test ausgewählt. Die Patienten waren 16 (P16), 17 (P17), 38 (P38) und 63 (P63) Jahre alt. Der Test wurde wie in Beispiel 7 beschrieben parallel mit dem ansonsten gleichen Experiment durchgeführt, mit der Ausnahme daß nach der Seruminkubation die gebundenen DNA-Antikörper dreimal 5 min bei Raumtemperatur mit frisch hergestelltem 8 M Harnstoff gewaschen wurden, der in 10 mM PBS, pH 7,4, das 0,05% Tween 20 enthielt, verdünnt war. Von dieser Behandlung ist bekannt, daß sie die Antikörper niedriger Avidität von dem Antigen freisetzt, aber keinen oder nur einen geringen Effekt auf die Antikörper mit hoher Avidität hat.
Die Ergebnisse zeigten, daß die anti-DNA-Antikörper eine verschiedene und teilweise altersabhängige Affinität für Telomere hatten. Drei der vier Patienten zeigten eine anti-DNA- Bindung mit niedriger Avidität zu einzelsträngiger DNA (EMS 1 oder EMS 2), da die gebundenen Antikörper (P16, P38 und P63) mit 8 M Harnstoff entfernt werden konnten. Die Avidität der Antikörper zu Duplex-DNA (EMS 1 + 2) war höher, da nur in zwei Fällen die gebundenen anti-DNA-Antikörper (P38 und P63) mit 8 M Harnstoff völlig entfernt wurden. Der Test kann verwendet werden, um die Länge der Zeit zu bestimmen, die der Patient anti-DNA-Antikörpern ausgesetzt war. Eine lange Erkrankung und eine folgliche lange Zeit, die der Patient ausgesetzt war, führten zu anti-DNA-Antikörpern, die eine höhere Affinität zu der Telomersequenz haben. Auch das Alter des Patienten sollte jedoch im allgemeinen in Betracht gezogen werden, da von der Menge an Telomeren bekannt ist, daß sie mit dem Alter einer Person in Beziehung stehen.

Beispiel 13

Lagerung von beschichteten Streptavidin-Telomer-Komplexen bei verschiedenen Temperaturen

Die Kapazität (oder Aktivität) von Streptavidin-Telomer-Komplexen, anti-DNA- Antikörper aus Patientenserum zu binden, wurde getestet, nachdem die mit dem Streptavidin- Telomer beschichteten Platten (EMS 1, EMS 2 oder EMS 1 + 2 aus Beispiel 6) bei +37ºC, Raumtemperatur, bei +4ºC oder bei -20ºC einen Tag (Grundlinie), zwei Wochen, einen Monat oder zwei Monate inkubiert worden waren. In jedem Fall wurde der Test unter Verwendung desselben Patientenserums (1 : 50 Verdünnung), desselben Konjugats (1 : 200 Verdünnung von mit alkalischer Phosphatase markiertem Schwein-anti-Mensch-IgG) und derselben Puffer und Reagentien, wie in Beispiel 7 für den Nachweis von Autoantikörpern gegen Telomersequenzen beschrieben, durchgeführt. Jede Messung wurde in drei Mulden durchgeführt.
Die Ergebnisse zeigen, daß während der Lagerung bei +4ºC oder bei -20ºC in zwei Monaten keine Bindungsaktivität der beschichteten Komplexe verloren ging. Eine 20%-ige Verringerung beim Absorptionswert (direkt proportional zu der Bindungsaktivität der beschichteten Komplexe) wurde nach der Lagerung bei Raumtemperatur erhalten, und eine 30 %-ige Verringerung bei +37ºC, verglichen mit dem Grundlinienwert.

Beispiel 14 a

Anti-DNA-Antikörper-Trennsäule unter Verwendung einer Telomer-Affinitätssäule

1. Wegwerf-Plastiksäulen mit einem Filterverschluß von 4 um (u) wurden mit einer Suspension von Polystyrol-Latexteilchen (Serva, Heidelberg, Deutschland) mit einer Teilchengröße von 1,1 um (u) beladen.
2. Gereinigtes Streptavidin mit einer Konzentration von 2 ug/ml in PBS, pH 7,4, wurde auf die Säule aufgetragen und mit der Suspension über Nacht bei Raumtemperatur in einem Roller inkubiert.
3. Alles ungebundene Streptavidin wurde durch Zentrifugation entfernt und die Streptavidin beschichteten Teilchen wurden zehnmal mit PBS, pH 7,4, gewaschen.
4. Die biotinylierten Telomersequenzen EMS 1, EMS 2 oder EMS 1 + 2 aus Beispiel 6 mit einer Konzentration von 2 ug/ml wurden mit den Streptavidin beschichteten Latexteilchen 2 Stunden in einem Rollgerät bei Raumtemperatur inkubiert.
5. Alle ungebundenen Telomersequenzen wurden durch zehnmaliges Waschen der Säule mit PBS entfernt.
6. Die anti-DNA-Seren von Patienten mit SLE wurden auf die Säule aufgebracht, 5 min bei Raumtemperatur in der Säule inkubiert und dann durch die Säule geschickt.
7. Die Säule wurde zehnmal mit PBS, pH 7,4, gewaschen, und die an die Telomersequenz gebundenen anti-DNA-Antikörper wurden unter Verwendung einer 5- minütigen, sich wiederholenden Inkubation mit 0,1 M Glycin, pH 3, in einem Rollgerät eluiert, gefolgt von einer Zentrifugation. Ein Volumen von 200 ul pro Fraktion wurde nach jeder Inkubation entnommen, gefolgt von einer Einstellung des pH-Werts auf 7,4.
8. Die Ergebnisse zeigen deutlich, daß anti-DNA-Antikörper an die Telomer- Affinitätssäule binden. Unter Verwendung einer kleinen Säule (0,4 ml Affinitätsmatrix) und von unverdünnten Proben an anti-DNA-Antikörpern wurde etwa die Hälfte der ursprünglich im Patientenserum vorhandenen Antikörper (A405 0,963-1,420) an die Säule gebunden (A405 0,444-0,670). Mit einer Vergrößerung der Säulengröße oder durch zyklische Wiederverwendung der Säule werden alle anti-DNA-Antikörper, die für Telomersequenzen spezifisch sind, gebunden und aus den Seren entfernt.

Beispiel 14 b

Entfernung von anti-DNA-Antikörpern bei einer chargenweisen Trennung

Die Entfernung von anti-DNA-Antikörpern aus den Seren von Beispiel 13a wurde auch unter Verwendung eines chargenweisen Trennungssystems durchgeführt, wobei die Affmitätssäule weggelassen wurde. In diesem Fall wurde die Affinitätsmatrix mit den anti- DNA-Seren inkubiert, gefolgt von Zentrifugation und/oder direkter Filtration des Serums durch eine Filtersäule von 0,22 um.
Die Entfernung der anti-DNA-Antikörper wurde auch auf diese Weise erfolgreich durchgeführt.

Beispiel 15

Toxizitätstest von Telomersequenzen in vivo

Jedes Kaninchen (8 Wochen alt) erhielt dreimal mit 10 Tagen Abstand intravenös 100 ug der Sequenzen EMS 1, EMS 2 oder EMS 1 + 2 aus Beispiel 6 in vollständigem Freundschem Adjuvans. Die Kaninchen wurden 2 Monate täglich auf ihren körperlichen Zustand untersucht, der als normal befunden wurde.
Der Nachweis von Antikörpern gegen Telomersequenzen wurde ähnlich wie bei Menschen durchgeführt, mit der Ausnahme des Konjugats, das mit alkalischer Phosphatase markiertes Schwein-anti-Kaninchen-IgG war. Keine Antikörper gegen Telomersequenzen wurden in den Seren der Kaninchen gefunden.

Beispiel 16

Gereinigte menschliche F(ab')&sub2;- oder Fab-Antikörper gegen Telomersequenzen als therapeutische Mittel

Reinigung von menschlichem JgG aus einem Patientenserum, das anti-DNA- Antikörper enthält

1. Menschliches IgG aus dem Serum eines Patienten mit SLE wurde unter Verwendung einer ProSepRA-Matrix hoher Kapazität (Bioprocessing, Co Durham, England) gereinigt, die aus mit Protein A beschichteten Glasperlen mit einer Bindungskapazität von 40 mg IgG/ml Perlen besteht.
Dieses Verfahren kann auch verwendet werden, um anti-DNA-Antikörper der IgG- Klasse aus Patientenserum zu absorbieren.
2. Das Serum wurde durch die Säule gegeben und die Säule gewaschen, bis im Durchfluß A280 = 0 war.
3. Das gebundene IgG wurde mit 0,1 M Glycin, pH 3,0, von der Säule eluiert. Die Fraktionen, die IgG enthielten, wurden vereint, mit 1 M Tris-Puffer neutralisiert, über Nacht gegen PBS, pH 7,4, dialysiert, und ihr Proteingehalt wurde gemessen.

Reinigung von F(ab')&sub2;-Antikörpern aus gereinigtem IgG

1. Bei der Reinigung von F(ab')&sub2;-Fragmenten von dem gereinigtem IgG wurde der Immuno PureR F(ab')&sub2;-Herstellungs-Kit (Pierce, Nr. 44888, Rockford, Illinois 61105, USA) gemäß den Vorschriften des Herstellers verwendet. Im Prinzip wird der rohe Pepsin-IgG- Verdauungsansatz durch eine Protein A-Säule gegeben, wo das gesamte IgG und der Fc-Teil von IgG gebunden werden, aber nicht die F(ab')&sub2;-Fragmente, die von der Säule eluieren, vereint werden und gegen PBS, pH 7,4, dialysiert werden.

Ergebnis:

Die gereinigten F(ab')&sub2;-Antikörper banden in Dosis-abhängiger Weise die immobilisierten Telomersequenzen, nachgewiesen durch einen EIA unter Verwendung von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziege-anti-Mensch-IgG, F(ab')&sub2; (Pierce, Rockford, Illinois 61105, USA) für den Nachweis des Telomer-gebundenen F(ab')&sub2;-Antikörpers. Das Ergebnis zeigt, daß F(ab')&sub2;-Antikörper Telomersequenzen binden. Sie können unter Verwendung einer Telomer-Affinitätschromatographie zur Monospezifität gereinigt werden. Da sie menschlichen Ursprungs sind, können sie sicher intravenös als Konkurrenten für autologe anti-DNA-Antikörper der IgG-Klasse bei der Bindung von Telomersequenzen verwendet werden. Den F(ab')&sub2;-Antikörpern fehlen Effektorfunktionen und sie aktivieren nicht die Komplementkaskade, wenn sie an ein Antigen binden.
Die Behandlung von F(ab')&sub2;-Antikörpern mit reduzierenden Mitteln resultiert in der Bildung von monomeren Fab-Antikörpern, welche die biologische Form von rekombinanten Fabs sind, die unter Verwendung von Phagen-Displaysystemen hergestellt werden. Die monomeren Fabs, ob biologischen Ursprungs oder vorzugsweise mit rekombinanter DNA- Technik hergestellt, können intravenös als therapeutische Mittel in derselben Weise wie F(ab')&sub2; als Konkurrenz für gesamte anti-DNA-Antikörper und somit zur Verhinderung der schädlichen Wirkung von gesamten anti-DNA-Antikörpern in den Körperflüssigkeiten von Patienten verwendet werden.

Beispiel 17

Die Subklassen der Antikörper der IgG-Klasse, erkannt durch Telomersequenzen

Der Test wurde, wie in Beispiel 7 beschrieben, durchgeführt, mit der Ausnahme daß mit alkalischer Phosphatase markierte Maus-anti-IgG1-, IgG2-, IgG3- oder IgG4-Antikörper (Zymed Laboratories, Inc. Calif. USA) zum Nachweis der Subklassen-Spezifität der IgG-anti- DNA-Antikörper verwendet wurden.
Die Resultate von 20 getesteten Seren von Patienten mit SLE zeigen, daß anti-DNA- Autoantikörper, die von den Telomersequenzen EMS 1, EMS2 oder EMS1 + 2 erkannt werden, primär von der IgG1-Klasse und in einem gewissen Ausmaß Antikörper der IgG2-Klasse sind. TABELLE 8

Beispiel 18

Pharmazeutische Herstellung

Eine pharmazeutische Herstellung wird von der Telomersequenz 2667: 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3' durch Auflösen von 1 ug/ml der Sequenz in physiologischem Puffer hergestellt. Die Lösung wird bei 4ºC unter sterilen Bedingungen gelagert.
Eine zweite pharmazeutische Herstellung wird in entsprechender Weise von den Fab- Antikörpern der IgG-Klasse von Beispiel 16 hergestellt.

Beispiel 19

Verabreichung einer Telomersequenz oder von Fab an SLE-Patienten

Das Serum von SLE-Patienten wird mit einem Test gemäß der Erfindung diagnostiziert. Bei dem Serum wird gefunden, daß es eine erhöhte Menge an anti-DNA- Antikörpern der IgG-Klasse enthält, die vor allem an die Telomersequenz 2667 von Beispiel 1 binden.
Die pharmazeutischen Herstellungen von Beispiel 18 werden den Patienten intravenös mit einer 100 ml-Dosis dreimal in drei Wochen verabreicht. Nach dem Verabreichungszeitraum wird das Serum der besagten Patienten erneut in einem Test gemäß der Erfindung getestet, und es wird gefunden, daß die Absorptionslevel im Vergleich zu den ursprünglichen wegen der Bindung der Telomere bzw. Fabs an die im Blutstrom zirkulierenden anti-DNA-Antikörper, reduziert sind.

SEQUENZPROTOKOLL

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:
(i) ANMELDER:
(A) NAME: Salonen, Eeva-Marjatta
(B) STRASSE: Tunturikatu 15 B
(C) STADT: Helsinki
(E) LAND: Finnland
(F) POSTLEITZAHL (PLZ): 00100
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Diagnostisches Verfahren, Testkit, Arzneistoff und therapeutische Behandlung für Autoimmunerkrankungen
(iii) ZAHL AN SEQUENZEN: 2
(iv) KORRESPONDENZADRESSE:
(A) ADRESSAT: Borenius & Co Oy Ab
(B) STRASSE: Arkadiankatu 21 A
(C) STADT: Helsinki
(E) LAND: Finnland
(F) POSTLEITZAHL (PLZ): 00100
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
(A) TELEPHON: +358-0-492593
(B) TELEFAX: +358-0-493542
(C) TELEX: 124260 boco fi
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 1:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:
(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NR: 2:
(i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
(A) LÄNGE: 30 Basenpaare
(B) TYP: Nucleinsäure
(C) STRANGFORM: Einzelstrang
(D) TOPOLOGIE: linear
(ii) MOLEKÜLTYP: cDNA (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

Claims

1. Verfahren zum Nachweis von anti-DNA-Autoantikörpern in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, dass die Probe mit einer DNA-Telomersequenz, ausgewählt aus einer Gruppe bestehend aus einer einzelsträngigen Telomersequenz, einem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Telomer und einem Teil oder einer Wiederholung oder einer Kombination der vorher genannten, in Kontakt gebracht wird, um die Bindung der Autoantikörper an die DNA-Telomersequenz zu ermöglichen.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Telomersequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Vertebratentelomerstrang 5'-TTAGGG-3', dem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Vertebratentelomer, einem funktionellen Teil von einem der Stränge, einer Wiederholung einer der Stränge und einer Kombination der vorher genannten.

3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Wiederholung des Telomerstranges ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3', 5'-CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA-3' und einem Duplex der beiden Stränge.

4. Verfahren nach Anspruch 1, wobei ein Antikörper gegen die Telomersequenz oder ein Fragment des Antikörpers, insbesondere ein F(ab')&sub2;- oder ein Fab- Fragment, für den Nachweis verwendet wird.

5. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Immunglobulinklasse (Ig) der anti- DNA-Autoantikörper mit Hilfe von anti-Ig-Antikörpern, insbesondere anti-IgG-, anti-IgM- oder anti-IgA-Antikörpern, bestimmt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Immunglobulin-Unterklasse der anti- DNA-Autoantikörper mit Hilfe von spezifischen Unterklasse-anti-Ig- Antikörpern, insbesondere anti-IgG1- oder anti-IgG2-Antikörpern, bestimmt wird.

7. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Probe Körperflüssigkeit eines Vertebraten ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Körperflüssigkeit menschliches Serum oder cerebrospinale Flüssigkeit ist.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8 zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten bei Vertebraten, wobei die Probe mit Körperflüssigkeit des Vertebraten mit der DNA-Telomersequenz des Vertebraten in Kontakt gebracht wird und ein erhöhter anti-DNA-Autoantikörperspiegel in der Körperflüssigkeit als Indikator einer solchen Krankheit in dem Vertebraten gewertet wird.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Autoimmunkrankheit aus der Gruppe ausgewählt ist bestehend aus Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und Sclerodermie.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Autoimmumkrankheit systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist.

12. Verfahren nach Anspruch 9, wobei die Telomersequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Vertebratentelomerstrang 5'-TTAGGG-3', dem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Vertebratentelomer, einem funktionellen Teil der Stränge, einer Wiederholung von einem der Stränge und einer Kombination der vorher genannten.

13. Verfahren nach Anspruch 12, wobei die Wiederholung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG- 3', 5'-CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA-3', und einem Duplex der beiden Stränge.

14. Verfahren nach Anspruch 9, wobei ein Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers gegen die Telomersequenz, insbesondere ein F(ab')&sub2;- oder ein Fab-Fragment, für die Diagnose eingesetzt wird.

15. Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Immunglobulin (Ig)-Klasse der anti- DNA-Autoantikörper mit Hilfe von anti-Ig-Antikörpern, insbesondere anti-IgG-, anti-IgM- oder anti-IgA-Antikörpern, bestimmt wird.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei SLE in einem menschlichen Patienten dadurch nachgewiesen wird, dass eine Probe mit Körperflüssigkeit des Patienten mit einer immobilisierten Telomersequenz eines Vertebraten in Kontakt gebracht wird, um in der Flüssigkeit befindliche anti-DNA- Autoantikörper an die immobilisierte Telomersequenz zu binden und einen erhöhten Spiegel von gebundenen IgG-Klasse-Autoantikörpern unter den gebundenen anti-DNA-Autoantikörpern nachzuweisen.

17. Verfahren nach Anspruch 15, wobei rheumatoide Arthritis in einem menschlichen Patienten dadurch nachgewiesen wird, dass eine Probe mit Körperflüssigkeit des Patienten mit einer immobilisierten Telomersequenz eines Vertebraten in Kontakt gebracht wird, um anti-DNA-Autoantikörper, die im Serum sind, an die immobilisierte Telomersequenz zu binden und einen erhöhten Spiegel von gebundenen lgM-Klasse-Autoantikörpern unter den gebundenen anti-DNA-Autoantikörpern nachzuweisen.

18. Testkit zum Nachweis von anti-DNA-Autoantikörpern, insbesondere für die Diagnose von Autoimmunkrankheiten in Vertebraten, dadurch gekennzeichnet, dass der Testkit eine immobilisierte DNA-Telomersequenz eines Vertebraten enthält, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer einzelsträngigen Telomersequenz eines Vertebraten, einem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Telomer eines Vertebraten, einem Teil, einer Wiederholung oder einer Kombination von einem der vorher genannten, die anti-DNA-Autoantikörper in der Körperflüssigkeit von Vertebraten binden kann, und einen Marker, der die Bindung oder die Hemmung der Bindung des anti-DNA-Autoantikörpers an die Sequenz anzeigen kann.

19. Testkit nach Anspruch 18, der einen Antikörper oder ein Fragment eines Antikörpers gegen die Telomersequenz, insbesondere ein F(ab')&sub2;- oder ein Fab-Fragment, enthält, zur Verwendung beim Nachweis.

20. Testkit nach Anspruch 19, der spezifische anti-Ig-Antikörper, insbesondere anti-IgG-, anti-IgM- oder anti-IgA-Antikörper, enthält, zur Verwendung bei der Bestimmung der Immunglobulin (Ig)-Klasse der anti-DNA-Autoantikörper

21. Testkit nach Anspruch 20, der eine spezifische Unterklasse von anti-Ig- Antikörpern, insbesondere anti-IgG1- oder anti-IgG2-Antikörper, enthält, zum Nachweis von Immunglobulin-Unterklassen der anti-DNA-Autoantikörper.

22. Testkit nach Anspruch 18, wobei die Autoimmunkrankeit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und Sclerodermie.

23. Testkit nach Anspruch 22, wobei die Autoimmunkrankheit systemischer Lupus erythematodes (SLE) ist.

24. Testkit nach Anspruch 18, wobei die Telomersequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus dem Vertebraten-Telomerstrang 5'-TTAGGG-3', dem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Vertebratentelomer, einem funktionellen Teil der Stränge, einer Wiederholung eines der Stränge und einer Kombination der vorher genannten.

25. Testkit nach Anspruch 24, wobei die Wiederholung des Telomerstranges ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3', 5'-CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA-3', und einem Duplex der beiden Stränge.

26. Testkit nach Anspruch 18, wobei die Telomersequenz am 3'- oder am 5'- Ende biotinyliert und an einem Streptavidin beschichteten Träger immobilisiert ist.

27. Testkit nach Anspruch 19, wobei der Marker auf einem Telomer-spezifischen anti-Ig-Antikörper, auf einem Fragment davon oder auf einer zweiten Telomersequenz bereitgestellt wird.

28. Testkit nach Anspruch 19, wobei der Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer radioaktiven Markierung, einer Enzymmarkierung, einem Fluorochrom oder einer fluoreszienden Markierung, einem Farbstoff, Biotin, einer Iumineszierenden Markierung und gefärbten Teilchen wie zum Beispiel gefärbten Latexteilchen.

29. Testkit nach Anspruch 19, der eine Menge eines oder mehrerer markierter anti-Ig-Antikörper enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus anti-IgG-, anti-IgM-, anti-IgA-, anti-IgD- und anti-IgE-Antikörpern oder Unterklassen davon.

30. Testkit nach Anspruch 29, wobei der anti-Ig-Antikörper ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus anti-IgG-, anti-IgM-, anti-IgA-, anti-IgG1- und anti- IgG2-Antikörpern.

31. Testkit nach Anspruch 18 oder 26, wobei die Telomersequenz an den Wänden von Mikrotiterplattenvertiefungen, an Sepharose, an Glas- oder an Plastikperlen oder an einer porösen Unterlage immobilisiert ist.

32. Festphasenmittel für das Entfernen von anti-DNA-Autoantikörpern aus einer flüssigen Probe, wobei das Mittel in Form einer Affinitätssäule vorliegt, die mit Festmaterial gepackt ist, wie zum Beispiel Glas- oder Plastikperlen oder einem porösen Material, einschließlich einer immobilisierten DNA- Telomersequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer einzelsträngigen Telomersequenz, einem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Telomer, einem Teil oder einer Wiederholung oder einer Kombination der vorher genannten, und die in der Flüssigkeit befindliche anti-DNA-Autoantikörper binden kann.

33. Festphasenmittel nach Anspruch 32, wobei die Telomersequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Vertebratentelomerstrang 5'- TTAGGG-3', dem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Vertebratentelomer, einem funktionellen Teil von einem der Stränge, einer Wiederholung von einem der Stränge und einer Kombination der vorher genannten.

34. Festphasenmittel nach Anspruch 33, wobei die Wiederholung des Telomerstranges ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus 5'-TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG TTAGGG-3', 5'-CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA CCCTAA-3', und einem Duplex der beiden Stränge.

35. Festphasenmittel nach Anspruch 32, wobei die Telomersequenz am 3'- oder am 5'- Ende biotinyliert und an einem Streptavidin beschichteten Träger immobilisiert ist.

36. Verwendung von Telomersequenzen oder Fragmenten von oder Antikörpern davon, wobei die Telomersequenz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer einzelsträngigen Telomersequenz eines Vertebraten, einem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Vertebraten-Telomer, und einem Teil oder einer Wiederholung oder einer Kombination der vorher genannten zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung von Autoimmunerkrankungen und/oder Krankheiten, die hervorgerufen werden durch anti-DNA-Autoantikörper oder diese beinhalten, wobei die Telomersequenz in dem Medikament an einen pharmazeutisch verträglichen Träger gebunden ist.

37. Verwendung nach Anspruch 36, wobei die Autoimmunkrankheit ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Lupus erythematodes, rheumatoider Arthritis und Sclerodermie.

38. Testkit zum Nachweis von anti-DNA-Autoantikörpern, insbesondere zur Diagnose von Autoimmunkrankheiten bei Vertebraten, dadurch gekennzeichnet, dass der Testkit eine nicht-immobilisierte DNA- Telomersequenz eines Vertebraten beinhaltet, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer einzelsträngigen Telomersequenz eines Verbraten, einem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Telomer eines Vertebraten, einem Teil oder einer Wiederholung oder einer Kombination der vorher genannten, die in der Flüssigkeit des Vertebraten befindliche anti-DNA-Autoantikörper binden kann, und aus einem Marker, der die Bindung des anti-DNA-Autoantikörpers an die Sequenz anzeigen kann, und einem Mittel zum Nachweis der Bindung.

39. Verfahren zur Reinigung eines anti-Telomer-Antikörpers oder eines Fragments des anti-Telomer-Antikörpers aus einer Flüssigkeit durch Binden der anti-Telomer-Antikörpers in der Flüssigkeit an eine Telomersequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer einzelsträngigen Telomersequenz, einem dazu komplementären Strang, einem doppelsträngigen Telomer und einem Teil oder einer Wiederholung oder einer Kombination der vorher genannten, die an einer Affinitätssäule immobilisiert ist.