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WO2005025650A1 - Apherese-vorrichtung - Google Patents

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Publication number
WO2005025650A1
WO2005025650A1 PCT/AT2004/000312 AT2004000312W WO2005025650A1 WO 2005025650 A1 WO2005025650 A1 WO 2005025650A1 AT 2004000312 W AT2004000312 W AT 2004000312W WO 2005025650 A1 WO2005025650 A1 WO 2005025650A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
column
dna
apheresis
lupus
lupus erythematosus
Prior art date
Application number
PCT/AT2004/000312
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Frank Mattner
Walter Schmidt
Original Assignee
Frank Mattner
Walter Schmidt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Frank Mattner, Walter Schmidt filed Critical Frank Mattner
Publication of WO2005025650A1 publication Critical patent/WO2005025650A1/de

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/44—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material not provided for elsewhere, e.g. haptens, metals, DNA, RNA, amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A61M1/3472—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration with treatment of the filtrate
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61M—DEVICES FOR INTRODUCING MEDIA INTO, OR ONTO, THE BODY; DEVICES FOR TRANSDUCING BODY MEDIA OR FOR TAKING MEDIA FROM THE BODY; DEVICES FOR PRODUCING OR ENDING SLEEP OR STUPOR
    • A61M1/00—Suction or pumping devices for medical purposes; Devices for carrying-off, for treatment of, or for carrying-over, body-liquids; Drainage systems
    • A61M1/34—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration
    • A61M1/3472—Filtering material out of the blood by passing it through a membrane, i.e. hemofiltration or diafiltration with treatment of the filtrate
    • A61M1/3486—Biological, chemical treatment, e.g. chemical precipitation; treatment by absorbents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/21—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin from primates, e.g. man

Definitions

  • the invention relates to an apheresis device comprising a solid support that can be contacted with the blood or plasma flow.
  • Apheresis is understood to mean treatment methods whose therapeutic effects are based on the extracorporeal elimination of pathogenic proteins, protein-bound pathogenic substances, free pathogenic substances or pathogenic cells of the blood. If the pathogenic protein can only be eliminated from the cell-free plasma, the plasma is separated from the blood cells beforehand using a membrane plasma separator (plasma separation) or using a hemocentrifuge. In the case of unselective plasma exchange (plasmapheresis), the patient plasma exchanged is separated as a whole, with all other vital proteins being eliminated in addition to the pathogens. It is therefore necessary to substitute the removed plasma with electrolytes, human albumin or fresh plasma.
  • pathogenic proteins can be removed from the separated plasma very specifically with the aid of adsorption, precipitation or filtration, the plasma being able to be reinfused after the removal without significant loss of volume.
  • These selective processes have the advantage that a substitution solution can be dispensed with.
  • the pathogenic proteins are specifically adsorbed directly from the non-pretreated blood without prior plasma separation, which means that - in contrast to the plasma separation methods - both the plasma separation and the addition of a substitution solution can be omitted.
  • Another sub-form of apheresis is zytapheresis, in which cells are removed from the blood. Leukocytes, erythrocytes, thrombocytes, granulocytes or even stem cells can be obtained selectively.
  • apheresis eg as plasmapheresis or zytapheresis
  • donor plasma as a plasma preserve, to isolate various plasma fractions or to obtain blood products
  • apheresis methods are becoming increasingly popular in the therapeutic field Importance.
  • a whole range of metabolic diseases eg (familial) hypercholesterolemia, progressive coronary heart disease with isolated Lp (a) elevation, chylomicronemia syndrome, liver failure, ...), kidney diseases (Goodpasture syndrome, systemic lupus erythematosus with Lu - pusnephritis, Wegner's granulomatosis, haemolytic-uraemic syndrome, idiopathic focal-sclerosing glomerulonephritis, paraprotein-associated syndromes, cryoglobulinemic purpura, HLA sensitization in kidney transplantation, Among, diseases of the nervous system (myasthenia barri syndrome, guillainia syndrome, Guillasthenia gravis , Chronic demyelinating polyradiculoneuritis, para-protein polyneuropathy, Lambert-Eaton syndrome, Refsum syndrome, Among diseases of the immune system (rheumatoid arthritis, inhibitor hemophilia, pemphigus, ...),
  • Lupus is a chronic inflammatory autoimmune disease with complex clinical manifestations.
  • SLE systemic lupus erythematosus
  • Lupus as the most important immunological abnormalities, includes the presence of pathogenic autoantibodies, the lack of B and T lymphocyte regulation and disturbed removal of autoantigens and immune complexes. Almost all autoantibodies in lupus cases are directed against intracellular nucleoprotein particles.
  • dsDNA double-stranded DNA
  • Anti-DNA antibodies bind to nucleosomes, laminin, collagen type IV and heparan sulfate, whereby these antibodies can induce nephritis.
  • the anti-DNA antibodies probably lead directly to tissue damage.
  • the most important immunological abnormalities also include abnormalities in T lymphocyte functions, complement deficiencies and disorders in the cytokine network (in particular production of and response to IL-2).
  • Antibodies used in apheresis procedures have several disadvantages: they can due to their nature only be applied gently to the apheresis column and they can easily diffuse from the column. In addition, because of their size, antibodies can only be provided on the column in low densities (binding site per unit area) and they are complex and expensive, especially industrial production (GMP guidelines). For this reason, the one described in Harata et al. The approach described has not yet been implemented in product development.
  • the object of the present invention was therefore to provide a new treatment and prevention strategy for lupus.
  • the present invention provides an apheresis device comprising a solid support which can be contacted with the blood or plasma flow and which has specific low-molecular receptors for a DNA-binding autoantibody.
  • apheresis device comprising a solid support which can be contacted with the blood or plasma flow and which has specific low-molecular receptors for a DNA-binding autoantibody.
  • the low molecular weight receptors in the apheresis device which are contacted with the patient's blood or plasma, are specific for a specific antibody, it is only important that with this specific adsorption the harmful autoantibodies that target the cell - and cause tissue damage in lupus, from which blood is eliminated, so that they cannot have their fatal effect.
  • the present invention is therefore based on a completely different application approach for apheresis than the lupus treatment that is proposed in US Pat. No.
  • low molecular weight means those affinity molecules for DNA-binding autoantibodies which have a molecular weight of less than 10 kDa, preferably less than 5 kDa, in particular less than 2 kDa.
  • Preferred receptors according to the invention therefore have a molecular weight of 0.1 to 10 kDa , preferably between 0.2 and 8 kDa, in particular between 0.3 and 7 kDa.
  • the affinity molecules are preferably biocompatible, in particular peptides or short nucleic acids.
  • the low molecular weight receptor according to the present invention can either be directly or indirectly (for example via a suitable linker Suitable linkers include organic at least bifunctional compounds as well as peptide or carbohydrate linkers, etc. (the linkers are of course not to be regarded as part of the low-molecular CETP affinity molecule according to the invention (with a correspondingly low molecular weight).
  • the affinity or receptor molecule according to the invention is a DNA autoantibody affinity peptide.
  • This DNA autoantibody affinity peptide according to the present invention is an oligo or polypeptide which, immobilized on an apheresis column, is able to bind DNA-binding autoantibodies from the plasma stream as part of an apheresis treatment.
  • affinity peptides can be easily produced, for example by chemical synthesis.
  • the peptides according to the present invention are, on account of their size alone, much more stable and resistant to denaturing effects (such as can occur specifically when binding to the solid phase and influence affinity).
  • the affinity peptide used according to the invention has a length of 1 to 50 amino acid residues. With longer peptides, the production becomes increasingly complex and complex.
  • the low-molecular DNA autoantibody affinity peptide preferably has a length of 10 to 40, in particular 15 to 20, amino acid residues. This size is easy to handle chemically and synthetically and can also be used in large-scale production, even when non-natural amino acids are used.
  • the existing and known apheresis devices in all embodiments can be easily adapted to the present invention.
  • Such carriers, methods or devices are described, inter alia, in US Pat. Nos. 5,476,715, 6,036,614, 5,817,528 or 6,551,266.
  • Corresponding commercial apheresis devices are also marketed by companies such as Fresenius, Affina, Plasmaselect, ASAHI, Kaneka, Braun, etc., such as the LDL-Therasorb R , the Immunosorba R , the Prosorba R , the Globaffin 1 *, the Ig-Therasorb R , the Immusorba R , the Liposorba R , the HELP R , the DALI R , the bilirubin-bile acid absorber BR-350, the Prometheus R detoxification, the MARS R , the ADAsorb system from Medicap or the plasma FLO -System.
  • companies such as Fresenius, Affina, Plasmaselect, ASAHI, Kaneka, Braun, etc., such as the LDL-Therasorb R , the Immunosorba R , the Prosorba R , the Globaffin 1 *, the Ig-Therasorb R , the Immu
  • DNA autoantibodies are understood to mean all DNA-associated autoantibodies occurring in lupus patients, that is to say antibodies which are specific for the nucleosome, dsDNA (dsDNA antibody) and for dsDNA: protein complexes (ie complexes of dsDNA with nucleic acid associated proteins), both complexes of a structural nature (for example histones or dsDNA with histones) and those of a functional nature (for example with repressors or transcription factors), for example DNA: histone complexes, nucleoprotein particles, nucleosomes, laminin , Collagen type IV and heparan sulfate; complexes of nucleic acids with nucleic acid-associated proteins or peptides, such as polymerases, telomerases and the aforementioned proteins, insofar as they occur in lupus patients.
  • DNA histone complexes, nucleoprotein particles, nucleosomes, laminin , Collagen type IV and
  • All of these antibodies are, according to the invention, as anti-DNA autoantibodies or lupus View autoantibodies (in contrast to non-specific materials such as protein A, peptide GA M, tryptophan, dextran sulfate, etc.).
  • the low molecular weight receptors for these DNA autoantibodies which can be used according to the invention must be able to specifically remove these autoantibodies from the blood or plasma of lupus patients or persons at risk of lupus.
  • the present invention accordingly also relates to all apheresis devices which contain a carrier with any low-molecular receptor specific for these lupus antibodies.
  • the carriers with the low molecular weight receptors are able to specifically bind the lupus antibodies from the blood or plasma flow in the aphe- rese device and thus selectively separate them (from the other immunoglobulins).
  • These DNA antibody receptors can preferably be peptides or nucleic acids.
  • Particularly preferred receptors are dsDNA molecules, dsDNA mimicks, e.g. dsPNA molecules, peptide mimicks for (ds) DNA, or mixtures of these substances, and molecules of the same binding specificity.
  • Peptides as DNA autoantibody-binding low-molecular receptors can consist of D- or L-amino acids or combinations be composed of D- and L-amino acids and, if necessary, have been changed by further modifications, ring closings or derivatizations.
  • Peptide receptors for the DNA antibodies can be provided from peptide libraries that are commercially available. These peptides are preferably at least 5, preferably 6, amino acids long, in particular at least 8 amino acids, preferred lengths being up to 11, preferably up to 14 or 20, amino acids. According to the invention, however, longer peptides can also be readily used as receptors which bind DNA autoantibodies, but, as mentioned above, the advantages of the present invention described for molecules which are larger than 10kDA are no longer so clear and therefore are not preferred. Oligomers (such as polyethyleneimine and polylysine) are also suitable as receptors.
  • phage libraries For the production of such DNA autoantibody-binding low molecular weight receptors, phage libraries, peptide libraries, e.g. generated by combinatorial chemistry or by high throughput screening techniques for various structures, suitable (see e.g. in Phage Display: A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor), et al; Willats WG, Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol Biol. 2002 Dec; 50 (6): 837-54; http: //www.microcollections .de / showpublications .php #).
  • libraries that use the ribosomal display or the bacterial display are also suitable.
  • Corresponding libraries and methods for their generation are known to the person skilled in the art and, inter alia, in US 2004/0110281 A, WO 00/72880 and WO 02/059148 A.
  • dsDNA plasmids, circular dsDNA, linear dsDNA, dsRNA, cDNAs, PCR fragments
  • complementary oligonucleotides “decoy” -01igodeoxynuleotides (ds oligonucleotides, which in terms of sequence represent binding sites for transcription factors), etc.
  • ds oligonucleotides which in terms of sequence represent binding sites for transcription factors
  • Plasmid DNAs to be used according to the invention can be found, for example, in corresponding databases (http: //www.belspo.be/bccm/db/plasmid search. Asp) from commercial providers (http: // www.strataqene. Com /) or in the scientific literature (aniatis T, et al. Molecular Cloning A Laboratory Manual; http: //www.ncbi. nlm. nih.
  • Biological organisms from the group of prokaryotes and eukaryotes as well as viruses and bacteriophages are suitable sources of genomic DNA.
  • the nucleic acid backbone can be provided, for example, by the natural phosphoric diester compounds, but also by phosphorothioates or combinations or chemical variations (for example as PNA), the bases being U, T, A, C according to the invention , G, H and mC can be used.
  • the 2 'residues of the nucleotides which can be used according to the present invention are preferably H, OH, F, Cl, NH 2 , O-methyl, O-ethyl, O-propyl or O-butyl, the nucleic acids also can be modified, for example provided with protective groups, as are usually used in oligonucleotide synthesis.
  • Protecting group is understood to mean etherification of the oxygen atom, whereas in the 2 modification the —OH group is replaced by something else.
  • oligonucleotide stabilization techniques used for the antisense technology were developed to provide the nucleic acids (eg leading companies ISIS and Ribozyme Pharmaceuticals, especially their patent documents and homepage).
  • the aptamers for the DNA autoantibodies can be found, for example, using the method described below.
  • Immobilized DNA autoantibodies are contacted with a mixture of nucleic acids, high-affinity binding nucleic acids being separated from the less affine or non-binding nucleic acids.
  • the mixtures with nucleic acids are typically nucleic acid libraries which have been produced, for example, by combinatorial chemistry.
  • a nucleic acid library contains a multiplicity of nucleic acids that differ from one another, with randomization (with natural and / or non-natural nucleotides) being set up at least in a partial sequence region.
  • randomization with natural and / or non-natural nucleotides
  • a conserved sequence area can, but need not, be provided. Randomization in n positions with m different nucleotides leads to a library with n m elements.
  • a column is loaded (inside) with DNA autoantibodies and DNA autoantibodies are immobilized in the column
  • the mixture of nucleic acids is applied to a first end of the column, with a defined volume flow of carrier substance running through the column, running from the first End to the second end of the column
  • the nucleic acids are bound and immobilized with decreasing affinity of the nucleic acids for DNA autoantibodies at an increasing distance from the first end of the column
  • the volume flow of carrier substance through the column is after a defined runtime terminated
  • the column is separated by a plurality of divisions into column segments, each segment being assigned a path coordinate
  • the immobilized nucleic acids are unspecifically desorbed from at least one segment and the segment is assigned assigned route coordinate.
  • the expression inside the column means in general within a lumen.
  • the printout of the column should include all types of solid support systems, for example
  • the immobilization of DNA autoantibodies can be carried out according to the usual methods of column chromatography. Any mechanical construct that has a lumen with two ends is called a column. All materials customary for columns, such as metals, glass and / or plastics, are suitable as the structural material.
  • the inside of the column can be provided with a matrix that binds DNA autoantibodies and / or the structural material can be suitable or prepared for the direct binding of the target molecules.
  • a mixture of nucleic acids denotes nucleic acid libraries with a number of typically 10 6 to 10 22 / mol, in particular 10 10 to 10 21 / mol, of different nucleic acid species.
  • each nucleic acid species is represented statistically, for example with 10 to 10 17 , in particular 100 to 10 13 , molecules.
  • the carrier substance is usually a liquid in which the nucleic acid library is soluble and stable. All buffers and the like customary for nucleic acid libraries can be used for this.
  • the volume flow of carrier substance can be adjusted before the nucleic acid library is applied.
  • the nucleic acid library is then added to the carrier substance stream on the column inlet side.
  • the nucleic acid library can also be given up immediately.
  • the "grafting" which was given by the nucleic acid library, emerges again on the column exit side (widened by folding with diffusion), bound nucleic acids from the "grafting” separated and immobilized in the column.
  • the volume flow through the column is expediently set to be low or non-turbulent, preferably laminar (sum of the acceleration vectors of the carrier substance over the column volume, in particular over the column cross section, minimally, ideally 0).
  • the total number of DNA autoantibody molecules in the column is typically 10 2 to 10 16 times, in particular 10 3 to 10 15 times, the amount Number of nucleic acid molecules of a single species in the applied nucleic acid library.
  • the binding of the nucleic acids to the DNA autoantibody molecules is preferably carried out under conditions which correspond to a later use of the nucleic acids in apheresis, for example in a suitable buffer which is appropriately matched with regard to temperature, ionic strength, pH and buffer conditions.
  • the carrier substance and the solvent of the nucleic acid library are then to be selected accordingly with regard to their components.
  • the column can be divided into a plurality of column segments, for example by cutting the column, the cuts preferably being carried out orthogonally to the volume flow vector.
  • the column may also have previously been composed of column segments, with one column segment preferably being closely aligned with the next column segment in the direction of the volume flow vector (joining cross section orthogonal to the volume flow vector).
  • the division can take place by dissolving the previously formed composite of column segments.
  • the non-specific desorption can take place by elution with a sufficiently strong ligand by displacement, complexation, modification and / or destruction of DNA autoantibodies, physico-chemically or thermally.
  • Mechanical methods for example ultrasound, can also be used for desorption or for increasing desorption. Combinations of the above desorption methods can also be used. It goes without saying that the nucleic acids must not be decomposed by the desorption process used.
  • the steps described above are based on the knowledge that a nucleic acid library can be separated spatially according to the affinity for the target molecule, in the case described here, for DNA autoantibodies by means of affinity chromatography analogously to a protein mixture.
  • the invention is further based on the knowledge that a blending of desorbing nucleic acids of different affinity which occurs by means of non-specific desorption can be avoided by dividing the column with the nucleic acids bound therein, as it were, into affinity sections and that in the affinity sections or column segments thus obtained bound nucleic acids easily and without disruptive ligand Desorb couplings, for example in the context of a PCR or RT-PCR, and have them amplified non-specifically as well. Subsequent selection artifacts are avoided.
  • Ligands especially high concentrations of ligands, are also not required for desorption. Finally, practically all bound and then desorbed nucleic acid molecules are available for amplification. This makes it possible to work with low nucleic acid concentrations. In principle, it is sufficient if every species is represented on average in the nucleic acid library with one molecule. If the number of DNA autoantibody molecules in a column segment is statistically 1, then even individual nucleic acid species can be separated according to their affinity for the target molecule.
  • a segment to which a desired affinity is assigned is (isolated) processed for desorption.
  • this requires - except for maximum affinity, where the first column segment, based on the volume flow vector, is processed further - an idea of the affinity distribution in the applied nucleic acid library. It is therefore preferred, as a rule, that the immobilized nucleic acids are desorbed and obtained separately from each segment with the respective assignment of the travel coordinates of each segment to the nucleic acids obtained therefrom.
  • any type of desorption is possible.
  • the non-specific desorption is preferably carried out by means of conventional physico-chemical or thermal processes.
  • Thermal desorption takes place by heating the column segment or the solution contained therein.
  • the heating can be carried out, for example, by electrical heating or irradiation with microwaves or IR.
  • the heating techniques from the PCR technology are suitable.
  • other amplification methods such as using ligase, can of course also be used.
  • the non-specific desorption can be supported by chemical modification of the DNA autoantibodies, eg oxidation by sodium perjo- dat or the like, or by unspecific complex formation, for example by means of borate or the like for blocking cis-trans-diol bonds in carbohydrates.
  • the non-specific desorption is carried out by thermal desorption in a, preferably extended, high-temperature phase of a PCR or RT-PCR.
  • a synergy effect is achieved here, since amplification is generally required anyway, especially when working with nucleic acid libraries with low concentrations of the nucleic acid species.
  • To increase the yield for example, 5 to 60, preferably 20 to 60, most preferably 45 to 55 cycles are used.
  • at least one labeled primer can be used.
  • the primer can have at least one endonuclease interface. Such an interface serves, for example, to free the amplificate from larger areas of the primer sequence.
  • Nucleotide building blocks can be labeled, for example, using fluorescent dyes.
  • fluorescent dyes are: Alexa TM Fluor 488, Fluor 532, Fluor 546, Fluor 568, Fluor 594, Oregon Green 488, Fluorescein, Rhodamine 6G, Tetramethylrhodamine, Rhodamine B and Texas Red.
  • the amplificate can also be obtained through two different chemical modifications Different ends can be marked, provided that the groups introduced during the modification are suitable for being able to be bound as ligands to a different affinity matrix.
  • washing process steps between suitable process steps.
  • at least one washing process step is carried out between process steps d) and e).
  • the solvent or the medium of the nucleic acid library or the carrier substance, for example, is suitable for washing.
  • the inside of the column is coated with DNA autoantibodies and its immobilization by means of covalent binding, preferably after activation with chemically highly reactive groups (for example tresyl chloride, cyanogen bromide and / or periodate) or via bifunctional spacer compounds after modification with chemically less reactive groups (for example amine, hydroxy, keto and / or carboxyl).
  • chemically highly reactive groups for example tresyl chloride, cyanogen bromide and / or periodate
  • bifunctional spacer compounds after modification with chemically less reactive groups (for example amine, hydroxy, keto and / or carboxyl).
  • spacer structures of suitable spacer compounds are: substituted and unsubstituted C2-C10 alkyl groups, substituted and unsubstituted C2-C10 alkenyl groups, substituted and unsubstituted C2-C10 alkynyl groups, substituted and unsubstituted C4-C7 carbocylo alkyl groups, substituted and unsubstituted C4-C7 carbocylo, carbocylo and unsubstituted C7-C14 aralkyl groups, a heterocyclic molecule with heteroatoms selected from nitrogen, oxygen, sulfur, where said substitutions can consist of alkyl, alkenyl, alkynyl, alkoxy, thiol, thioalkoxy, hydroxyl, aryl, benzyl, phenyl, Nitro, halogen, ether groups with 2 to 10 carbon atoms and 1 to 4 oxygen or sulfur atoms, polyalkyl glycol, halogen, hydroxyl,
  • each column segment contains 0.1 to 10 3 , preferably 1 to 10 2 , most preferably 1 to 10, DNA autoantibody molecules on average.
  • the nucleic acid library can contain on average 0.1 to 10 3 , preferably 1 to 10 2 , most preferably 1 to 10, nucleic acid molecules of a species.
  • the structural material of the column basically all the work known, for example, from affinity chromatography substances in question. These include columns made of silica gel or polymers, such as polyethylene after activation by chemical derivatization or plasma activation.
  • the length of the column segments is expediently in the range from 0.1 ⁇ m to 1 mm, preferably 0.1 to 100 ⁇ m, most preferably 0.5 to 10 ⁇ m. Such cuts can easily be made using a microtome, for example.
  • the inside diameter of the column is expediently in the range from 0.05 to 1 mm, preferably from 0.1 to 0.5 mm, most preferably from 0.2 to 0.4 mm.
  • Undesirable nucleic acids are, for example, nucleic acids which bind to inner surfaces of the column that are free of DNA autoantibodies.
  • a DNA autoantibody-free column can then be connected upstream and the nucleic acid library can be guided through it beforehand.
  • the nucleic acids desorbed from one or more segments can be subjected repeatedly to the method according to the invention, if appropriate after amplification, and / or the elutropy of the conditions during the desorption can be increased (temperature, ionic strength, pH, buffer conditions).
  • the spatial density of DNA autoantibodies and consequently the bound nucleic acids, i. e. the number of DNA autoantibody molecules in a column segment can be reduced.
  • DNA autoantibody binding aptamers are therefore also preferred DNA autoantibody binding receptors in the context of the present invention.
  • the DNA autoantibody-binding low-molecular receptors which are preferably composed of peptides, antibodies or nucleic acids are used on a suitable carrier material for the extra-corporal elimination of DNA autoantibodies in lupus (risk) patients.
  • the carrier in the apharea apparatus When the present invention is used in routine medical practice, it is necessary for the carrier in the apharea apparatus to be sterile and pyrogen-free, so that any carrier substance or each receptor / carrier combination which fulfills these features is preferred according to the invention (see e.g. US 6 030 614 or US 5 476 715).
  • Suitable examples include porous homopolymers, copolymers or terpolymers of vinyl-containing monomers (for example acrylic acid, such as TSK Toyopearl, Fractogel TSK), supports with modifications (activations) with oxirane-containing compounds (for example epichlorohydrin) and, if appropriate, further reactions with Compounds containing NH 3 , amino or carboxyl, or CNBr or CNCl adsorbents, as described in EP 110 409 A and DE 36 17 672 A.
  • Particularly preferred adsorption materials for therapeutic purposes are suitable for avoiding a loss of blood cells, do not activate the complement system or only activate it slightly and keep aggregate formation in the extra-corporeal circulation as far as possible.
  • the carrier materials used should preferably also be sufficiently stable in the form of a receptor coupled to sterilization measures, in particular to ethylene oxide saturation, glutaraldehyde saturation, gamma radiation, steam treatment, UV treatment, solvent treatment and / or detergent treatment, etc.
  • sterilization measures in particular to ethylene oxide saturation, glutaraldehyde saturation, gamma radiation, steam treatment, UV treatment, solvent treatment and / or detergent treatment, etc.
  • suitable supports also include monoliths (supports based on cross-linked glycidyl methacrylate-co-ethylene glycol dimethacrylate polymer) and Subpol (Poschalko et al., J Am Chem Soc. 2003 Nov 5; 125 (44): 13415-26.).
  • the present invention relates to the use of the device according to the invention for providing a treatment or treatment device for lupus diseases or for preventing such a disease, in that the device is suitably prepared for the treatment of the respective patient.
  • a patient is attached to the apheresis apparatus for a period of time sufficient to effectively eliminate DNA autoantibodies, contacting the patient's blood or plasma flow with the solid support comprising the DNA autoantibody binding receptor, followed by the DNA autoantibodies are bound.
  • peripheral or central venous vein access or arterial venous fistula must of course be ensured, as well as sufficient anticoagulation and the necessary quantification and measurement data recorded.
  • most apheresis procedures will require a primary separation of plasma and blood cells before the actual plasma treatment.
  • Special persons who require preventive measures are family members, persons at risk from special exogenous / endogenous factors (sunlight, hormones, gender, diagnosis (e.g. detection of DNA autoantibodies in the blood), ...) or persons with a different risk factor for lupus, especially due to genetic factors.
  • the lupus diseases which can be treated according to the invention include all types which are associated with the presence of DNA autoantibodies within the meaning of the present invention.
  • a CIM® epoxy monolithic column (BIA Separations, SI) is equilibrated according to the manufacturer's instructions with 0.5 M Na phosphate buffer at pH 8.0 and a plasmid DNA is likewise activated according to the manufacturer's instructions and coupled to the CIM column , The column is washed several times with phosphate buffer (+ 1 M NaCl) and excess epoxy groups are optionally blocked.
  • Quality assurance is carried out by means of a control in the washing and equilibration eluate; only columns without active epoxy groups and without DNA leakage in the eluate are used further and installed in an apharesis apparatus.
  • An agarose bulk material (Sepharose CL4B) is aseptically filled into a sterile and pyrogen-free container and the material is washed aseptically, the gel material being dried completely under vacuum between each washing step. The Sepharose is then steam sterilized in an autoclave for 30 minutes at 115 ° C.
  • the Sepharose is taken up in a sterile container in 60% acetone / water and activated with CNBr and triethylamine (14 g CNBr per 96 ml acton; 30 ml triethylamine in 66.2 ml 87% acetone). Then an acetone / HCl solution was added (392 ml sterile, pyrogen-free water; 16.3 ml 5N HCl, 408 ml acetone). The activated Sepharose will washed and fed to the coupling reaction within 2 hours to prevent the hydrolysis of activated groups.
  • a sterile-filtered, couplable plasmid DNA solution is introduced into the reaction vessel and stirred for at least 90 min. Finally, the reaction solution is washed thoroughly
  • the plasmid-coupled Sepharose is filled into sterile and depyrogenized glass columns with glass sinters and subjected to a final quality control (eluate analysis for reaction products, heavy metals etc.; particle analysis, pyrogenicity; sterility) ,
  • Apheresis is an alternative therapeutic method in which blood outside the body is taken from substances that cause disease. So far, apheresis has been used in human medicine to treat more than 100 diseases. With the help of apheresis, disease-relevant substances in autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis, myasthenia gravis, endocrine ophthalmopathy, multiple sclerosis, systemic lupus erythematosus, Stiff-Man syndrome and type 1 diabetes were completely or at least partially removed from the blood. So far, however, apheresis has only been recognized as an alternative method for the treatment of therapy-resistant chronic diseases, which are associated with severe stress and a significant reduction in the quality of life of the affected patients. A key reason for this is that no detailed knowledge of the mechanisms of action successful apheresis therapy.
  • test animals are first provided with chronic vascular catheters.
  • the plasma and cellular components of the blood are then separated using plasma filters. While the cellular components return immediately to the animal, the plasma can be cleaned by various adsorption processes (immunoadsorption or the like) before being returned.
  • adsorption processes immunoadsorption or the like
  • the good tolerability of such repeated apheresis treatments has already been demonstrated for various rat strains (body mass, hematocrit, general condition).
  • the apheresis test system has been tested in animals with a minimum weight of 250 g and has been used on rat models for autoimmune diseases (type 1 diabetes, collagen type II-induced arthritis).
  • the extracorporeal system for plasmapheresis on a small animal model can be used for various types of adsorption.
  • the application of this test system to models for chronic diseases enables (A) to test new treatment and prevention strategies, (B) to decode the mechanisms of action of various apheresis technologies and (C) to determine the indication for individual apheresis therapy methods.
  • the IDK is your competent partner for the preclinical testing of newly developed apheresis procedures and can make a significant contribution to the transfer and market launch of new therapeutic procedures from the development phase to animal experiments and clinical use in patients (http: //www.praeklinik. De /).
  • apheresis Before the experimental apheresis therapy begins, the animals are provided with arterial and venous catheters, or chronically catheterized rats (vascular catheters, which are used to apply test substances and to take blood samples, as well as to carry out apheresis therapy and Clamp studies in animal models are suitable).
  • apheresis first separates blood cells and plasma using a plasma filter. While the blood cells are being refunded directly into the animal (via the venous catheter), the separated plasma is guided past the adsorbent prepared in Example 1 (the ligands being separated from the plasma by binding to the immobilized affinity peptides) before it is transferred to the animal is fed again.
  • the column is flushed with acetone.
  • an anhydrous solution (2 ml acetone, 1 ml tresyl chloride, a few drops of pyridine) is passed through the column (10-fold column volume) and incubated overnight on ice.
  • the column is then rinsed with 20 times the column volume of 100% acetone (anhydrous).
  • the activated column can be stored in 1 mM HC1.
  • a polyethylene tube is rinsed with 20 times the column volume at room temperature with a solution (2% potassium permanganate (KMn0 4 ) (w / v) in concentrated sulfuric acid (H 2 S0)) and then with distilled water.
  • a solution 2% potassium permanganate (KMn0 4 ) (w / v) in concentrated sulfuric acid (H 2 S0)
  • bi- or polyvalent molecules can be used for crosslinking which have at least one reactive aldehyde group (eg 1% glutaraldehyde). These are passed through the column at 4 ° C. for 1 h.
  • the reaction is then stabilized by reducing conditions (for example sodium cyanoborohydride (0.00025% w / v in 0.15 M NaCl, pH 3.9).
  • the tresyl chloride-activated column is flushed with 0.1 M Na 2 CO 3 (pH 8.5).
  • a peptide or protein (2 mg / ml 0.1 M Na 2 CO 3 , pH 8.5) passed through the column several times for 2 h at 37 ° C. and then for 4 h on ice.
  • an excess of 0.2 M glycine, pH 8 is then passed through the column.
  • the activated column is flushed with 0.1 M Na 2 CO 3 (pH 8.5).
  • DNA autoantibodies (2 mg / ml 0.1 M Na 2 CO 3 , pH 8.5) are passed through the column several times for 2 h at 37 ° C. and then for 4 h on ice.
  • an excess of 0.2 M glycine, pH 8 is then passed through the column.
  • 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimide (EDC), 5% w / v can be added).
  • the tresyl chloride-activated column is flushed with 0.1 M Na 2 CO 3 (pH 8.5). If elimination is to take place against a molecule with one or more primary or secondary amino acids, this molecule or the mixture (2 mg / ml 0.1 M Na 2 CO 3 , pH 8.5) is passed through the column several times overnight at RT , To block free binding sites on the column, an excess of 0.2 M glycine, pH 8 is then passed through the column. If no elimination against certain molecules with one or more primary or secondary amines is desired, all binding sites of the column are blocked with glycine.
  • a suitable buffer e.g. B. a buffer solution (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2 and gelatin 0.001% (w / v), pH 8.3), for 1 h on ice over the column.
  • the nucleic acids of the combinatorial nucleic acid library are taken up in 1 ml of the same buffer and heated to 95 ° C. for 10 min to melt double strands and then passed over the column several times (4-30 times). The columns are then separated and washed overnight on ice with the chosen buffer (see above). The column is separated in the direction of flow using a suitable cutting tool.

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Abstract

Beschrieben wird eine Apheresevorrichtung mit einem dem Blut- oder Plasmafluss kontaktierbaren festen Träger, mit einem spezifischen DNA-Autoantikörper hindernde Rezeptor zur Behandlung von Lupus-Patienten.

Description

Apherese-Vorrichtung
Die Erfindung betrifft eine Apherese-Vorrichtung, umfassend einen mit dem Blut- oder Plasmafluss kontaktierbaren festen Träger.
Unter Apherese werden Behandlungsverfahren verstanden, deren Therapieeffekte auf der extrakorporalen Elimination pathogener Proteine, proteingebundener pathogener Substanzen, freier pathogener Substanzen oder pathogener Zellen des Blutes beruhen. Wenn das pathogene Protein nur aus dem zellfreien Plasma eliminiert werden kann, wird das Plasma vorher von den Blutzellen mit Hilfe eines Membranplasmaseparators (Plasmaseparation) oder mit Hilfe einer Hämozentrifuge getrennt. Beim unselektiven Plasmaaustausch (Plasmapherese) wird das ausgetauschte Patientenplasma als gesamtes separiert, wobei neben den Pathogenen auch alle anderen lebensnotwendigen Proteine eliminiert werden. Dadurch ist die Substituierung des entnommenen Plasmas mit Elektrolyten, Humanalbumin oder Frischplasma erforderlich. Bei selektiven Plas- maphereseverfahren können mit Hilfe von Adsorption, Präzipitation oder Filtration pathogene Proteine ganz spezifisch aus dem separierten Plasma entfernt werden, wobei das Plasma nach der erfolgten Entfernung ohne wesentlichen Volumenverlust reinfundiert werden kann. Diese selektiven Verfahren haben den Vorteil, dass hierbei auf eine Substitutionslösung verzichtet werden kann. Bei selektiven Vollblutaphereseverfahren werden die pathogenen Eiweiße spezifisch und ohne vorherige Plasmaseparation direkt aus dem nicht vorbehandelten Blut adsorbiert, womit - im Gegensatz zu den Plasmaseparationsverfahren - sowohl die Plasmaseparation als auch die Zugabe einer Substitutionslösung entfallen können. Eine weitere Unterform der Apherese ist die Zytapherese, bei welcher Zellen aus dem Blut entfernt werden. Dabei können selektiv Leukozyten, Erythrozyten, Thrombozyten, Granulozyten oder sogar Stammzellen gewonnen werden.
Obgleich die Apherese (z.B. als Plasmapherese oder Zytapherese) gegenwärtig vorwiegend zur Gewinnung von Spenderplasma (als Plasmakonserve, zur Isolierung verschiedener Plasmafraktionen oder zur Gewinnung von Blutprodukten) verwendet wird, gewinnen Aphereseverfahren zunehmend auch auf therapeutischem Gebiet an Bedeutung. So werden gegenwärtig eine ganze Reihe von Stoffwechselkrankheiten (z.B. (familiäre) Hypercholesterinämie, pro- grediente koronare Herzkrankheit mit isolierter Lp (a) -Erhöhung, Chylomikronämie-Syndrom, Leberversagen, ... ) , Nierenkrankheiten (Goodpasture Syndro , Systemischer Lupus erythematodes mit Lu- pusnephritis, Wegnersche Granulomatose, Hämolytisch-urämisches Syndrom, Idiopathische fokal-sklerosierende Glomerulonephritis, Paraproteinä ie assoziierte Syndrome, Kryoglobulinämische Purpu- ra, HLA-Sensibilisierung bei Nierentransplantation, ... ) , Erkrankungen des Nervensystems (Myasthenia gravis, Guillain-Barri- Syndrom, Chronische demyelinisierende Polyradikuloneuritis, Pa- raproteinä ische Polyneuropathie, Lambert-Eaton-Syndrom, Refsum- Syndrom, ... ) , Erkrankungen des Immunsystems (Rheu atoide Arthritis, Hemmkörperhämophilie, Pemphigus, ... ) , Erkrankungen des Blutkreislaufs und der Mikrozirkulation (Hyperviskositätssyn- drom, Antiphospholipidantikörper-Syndro , Thrombotische Mikroan- giopathie nach Knochenmarktransplantation, Altersabhängige Makuladegeneration, Hörsturz, Periphere Störungen der MikroZirkulation, Idiopathische dilatative Kardio yopathie, Transplantatvaskulopathie nach Herztranspantation, Homozygote familiäre Hypercholesterinämie, Fokal segmentale Glomeruloskle- rose, Hämolytisch-urämisches Syndrom, ... ) , Vergiftungen, akute Leberinsuffizienz, Neoplasmen, Hyperhydratation, Thyreotoxikose, etc., mit Aphereseverfahren behandelt (siehe Pschyrembel (257. Auflage) Stichwort „Plasmapherese"; www.nephrologie.de/172Apha- rese.htm) .
Lupus ist eine chronische entzündliche Autoimmunerkrankung mit komplexen klinischen Manifestationen. Der unter „systemischer Lupus erythematosus" (SLE) bekannte Lupus in Menschen betrifft zwischen 40 und 250 von 100.000 Personen, zumeist Frauen. Lupus umfasst als wichtigste immunologische Abnormitäten die Präsenz pathogener Autoantikörper, das Fehlen der B- und T-Lymphozyten- Regulation und die gestörte Entfernung von Autoantigenen und Immunkomplexen. Nahezu alle Autoantikörper in Lupus-Fällen sind gegen intrazelluläre Nukleoprotein-Partikel gerichtet. Antikörper gegen (doppelsträngige) DNA (dsDNA) werden in 50 bis 80 % der SLE-Patienten aufgefunden, wobei diese Antikörper ausschließlich mit SLE verbunden sind. Die Atiologie ist weitgehend unbekannt, obgleich genetische, hormonale und Umweltfaktoren die Anfälligkeit betreffen können, wie eben bei allen Autoimmunerkrankungen. Der Krankheitsverlauf ist sehr variabel und kann vom (seltenen) akuten tödlichen bis zum jahrzehntelangen chronischen Verlauf reichen.
Alle Lupus-Patienten weisen Gelenks- und/oder Hautstörungen auf. Weiters sind in 30 bis 70 % der Fälle Nieren, Herz, Lungen und das zentrale Nervensystem (ZNS) betroffen, wobei die Prognose stets dann schlecht ist, wenn mehrere Organe betroffen sind. Rund 90 % der Patienten erleiden Arthralgie, jedoch weniger entzündlich als in als bei rheumatoider Arthritis. Lymphozytopenie tritt ebenfalls häufig bei SLE Patienten auf.
Lupus-Patienten weisen ein hohes Niveau an Autoantikörpern auf. Anti-DNA-Antikörper binden dabei an Nukleosomen, Laminin, Kollagen Typ IV und Heparansulfat, wobei diese Antikörper Ne- phritis induzieren können. Die anti-DNA-Antikörper führen dabei wahrscheinlich direkt zu Gewebeschäden. Zu den wichtigsten immunologischen Abnormitäten zählen weiters Abnormitäten der T- Lymphozytenfunktionen, Komplement-Defizienzen und Störungen im Cytokin-Netzwerk (insbesondere Produktion von und Antwort auf IL-2) .
Lupus wird heute meist mit Glukokortikoiden, nichtsteroidalen Antiphlogistika und Immunsuppressiva behandelt. Auch Plasmapherese wird zur Behandlung von Lupus verwendet (siehe oben) , wobei jedoch bislang stets sämtliche Immunglobuline unspezifisch entfernt werden (z.B. durch Immunadsorption an Protein A, Peptid- GAM, Tryptophan oder an Dextransulfat (JP 54/090896 A, Kutsuki et al., Therapeutic Apheresis 2(1) (1998), 18-24; Zemlin et al., Zeitschrift für Geburtshilfe und Neomatologie 206 (2002), 22-25; Suzuki et al., J.Clin.Aph. II (1996), 16-22; Autoim unity 19 (1994), 105-112; Arter. & Rheum. 34 (1991), 1546-1552)), nicht jedoch nur Immunglobuline einer bestimmten Spezifität (s. z.B. US 6,030,614, 5,817,528 und 6,551,266). Ein Verfahren zur selektiven Adsorption von anti-DNA Antikörpern durch therapeutische Plasmapherese über eine Säule mit monoklonalen anti-idio- typischen Antikörpern wird durch Harata et al. (J. Clin. Apheresis 6 (1991), 34-39) vorgschlagen. Antikörper im Einsatz bei Aphereseverfahren haben jedoch mehrere Nachteile: sie können aufgrund ihrer Natur nur schonend auf die Apheresesäule aufgebracht werden und sie können leicht von der Säule abdiffundieren. Antikörper können außerdem aufgrund ihrer Größe nur in geringen Dichten (Bindungsstelle pro Flächeneinheit) auf der Säule vorgesehen werden und sie sind aufwändigund teuer, vor allem industriellen Herstellung (GMP-Richtlinien) . Aus diesem Grund ist der in Harata et al. beschriebene Ansatz bisher nicht in eine Produktentwicklung umgesetzt worden.
In spezifischen biologischen Therapien konzentrierte man sich bislang auf die Verwendung rekombinanter Cytokine (z.B. TGF-ßl) , blockierender Antikörper und löslicher Rezeptoren. Auch Gentherapie-Ansätze (z.B. mit Cytokin-Inhibitoren) wurden bereits vorgeschlagen (Mageed et al., Gene Therapy 10 (2003), 861-874).
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war daher die Bereitstellung einer neuen Behandlungs- und Präventionsstrategie für Lupus.
Demgemäß wird mit der vorliegenden Erfindung eine Apherese-Vorrichtung, umfassend einen mit dem Blut oder Plasmafluss kontaktierbaren festen Träger, der spezifische niedermolekulare Rezeptoren für einen DNA-bindenden Autoantikörper aufweist, zur Verfügung gestellt. Mit der vorliegenden Apherese-Vorrichtung kann gezielt bei Lupus-Patienten bzw. Personen mit Lupus-Risiko mittels Apherese eine Clearance von DNA-Autoantikörpern vorgenommen werden. Hierbei ist es nicht kritisch, ob die niedermolekularen Rezeptoren in der Apherese-Vorrichtung, die mit dem Blut oder Plasma des Patienten kontaktiert werden, spezifisch für einen bestimmten Antikörper sind, wesentlich ist nur, dass mit dieser spezifischen Adsorption die schädlichen Autoantikörper, die die Zeil- und Gewebeschäden in Lupus verursachen, aus dem Blut eliminiert werden, so dass sie nicht ihre fatale Wirkung ausüben können. Damit beruht die vorliegende Erfindung auf einem völlig anderem Anwendungsansatz für die Apherese als die Lupus- Behandlung, die in der US 6,030,614, 5,817,528 und 6,551,266 vorgeschlagen wird, nämlich auf der Eliminierung der spezifischen DNA-Autoantikörper und nicht auf der (unspezifischen) Eliminierung sämtlicher Antikörper, womit zwar auch die Autoantikörper, aber zudem noch die sonst benötigten anderen Immunglobuline entfernt werden, was selbstverständlich zu einer erniedrigten Immunabwehr beim Patienten führt.
Unter „niedermolekular" werden erfindungsgemäß diejenigen Affinitätsmoleküle zu DNA-bindenden Autoantikörpern angesehen, die ein Molekulargewicht von unter 10 kDa, vorzugsweise von unter 5 kDa, insbesondere unter 2 kDa, aufweisen. Bevorzugte erfindungsgemäße Rezeptoren weisen daher ein Molekulargewicht von 0,1 bis 10 kDa auf, vorzugsweise zwischen 0,2 bis 8 kDa, insbesondere zwischen 0,3 und 7 kDa. Vorzugsweise sind die Affinitätsmoleküle biokompatibel, insbesondere Peptide oder kurze Nukleinsäuren. Der niedermolekulare Rezeptor gemäß der vorliegenden Erfindung kann entweder direkt oder indirekt (z.B. über einen geeigneten Linker) an den festen Aphereseträger gebunden werden. Geeignete Linker schließen organische zumindest bifunktionale Verbindungen ebenso ein wie Peptid- oder Kohlehydratlinker, etc. (die Linker sind selbstverständlich nicht als Teil des erfindungsgemäßen niedermolekularen CETP-Affinitätsmolekül (mit entsprechendem niedrigen Molgewicht) anzusehen.
In einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem erfindungsgemäßen Affinitäts- oder Rezeptormolekül um ein DNA- Autoantikörper Affinitätspeptid. Dieses DNA-Autoantikörper-Af- finitätspeptid gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein Oligo- oder Polypetid, das - immobilisiert an einer Apheresesäule - in der Lage ist, DNA-bindende Autoantikörper im Rahmen einer Aphe- resebehandlung aus dem Plasmastrom zu binden. Derartige Affini- tätspeptide lassen sich einfach herstellen, etwa durch chemische Synthese. Im Gegensatz zu Antikörpern sind die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung alleine schon aufgrund ihrer Größe wesentlich stabiler und resistenter gegenüber Denaturierungs- effekten (wie sie speziell bei der Bindung an die Festphase auftreten können und die Affinität beeinflussen) . Diese Stabilitätsvorteile lassen sich noch verstärken, indem im Peptid auch eine oder mehrere nicht-natürliche Aminosäuren (also andere als die 20 „klassischen" Aminosäuren) vorgesehen werden, oder dadurch dass eine oder mehrere D-Aminosäuren vorgesehen werden. Ebenfalls aufgrund der - selbst gegenüber Antikörper-Fragmenten - um ein Vielfaches kleineren Größe der Peptide lassen sich erfindungsgemäß viel höhere Dichten (Bindungsstellen pro Flächeneinheit) auf der Apheresesäule vorsehen: im Vergleich mit Anti- körpern ermöglicht die Verwendung eines erfindungsgemäßen CETP- Affinitätspeptids (mit einer Länge von etwa 20 Aminosäuren) eine um den Faktor 200 größere Packung von Bindungsaktivitäten auf der Säule. Höhere Dichten ermöglichen aber eine höhere Effizienz der Säule. Dadurch können höhere Flussraten und somit kürzere Apheresebehandlungszeiten erzielt werden, ein wichtiger Akzeptanzfaktor bei dieser Therapieform, wodurch die Vorteile etwa gegenüber der von Harata et al. vorgeschlagenen Variante mit an- tiidiotypischen Antikörpern klar hervortreten.
Aus praktischen Gründen weist das erfindungsgemäß verwendete Af- finitätspeptid eine Länge von 1 bis 50 Aminosäureresten auf. Bei längeren Peptiden wird die Herstellung zunehmend aufwändiger und komplexer. Vorzugsweise weist das niedermolekulare DNA-Autoanti- körper-Affinitätspeptid eine Länge von 10 bis 40, insbesondere von 15 bis 20 Aminosäureresten auf. Gerade diese Größe ist chemisch-synthetisch einfach zu handhaben und auch in großtechnische Produktion umsetzbar, selbst wenn nicht-natürliche Aminosäuren eingesetzt werden.
Dabei können erfindungsgemäß die bereits bestehenden und bekannten Apherese-Vorrichtungen in allen Ausführungsformen leicht an die vorliegende Erfindung angepasst werden. Insbesondere sollte bei der Wahl des festen Trägers (und der Apheresevorrichtung) auf dessen (deren) medizintechnische Eignung Bedacht genommen werden. Derartige Träger, Verfahren oder Vorrichtungen sind unter anderem in der US 5 476 715, 6 036 614, 5 817 528 oder 6 551 266 beschrieben. Entsprechende kommerzielle Apherese-Apparate werden auch unter anderem von den Firmen Fresenius, Affina, Plasmaselect, ASAHI, Kaneka, Braun, etc. vertrieben, wie z.B. das LDL-TherasorbR, das ImmunosorbaR, das ProsorbaR, das Globaffin1*, das Ig-TherasorbR, das ImmusorbaR, das LiposorbaR, das HELPR, das DALIR, das Bilirubin-Gallensäure-Absorberer BR-350, das PrometheusR Entgiftung, das MARSR, das ADAsorb-System von Medicap oder das Plasma FLO-System. All diese Systeme - obgleich in der kommerziellen Form nicht primär immer auf die spezifische Eliminierung eines einzelnen Proteins gerichtet - können ohne weiteres von einem Apherese-Fachmann an die vorliegende Erfindung angepasst werden, z.B. als Immunapherese und/oder unter Einbau des erfindungsgemäßen festen Trägers (z.B. als Säule) in das Apherese-Gerät.
Unter „DNA-Autoantikörpern" werden erfindungsgemäß sämtliche in Lupus-Patienten auftretenden DNA-assoziierten Autoantikörper verstanden, also Antikörper, die spezifisch für das Nukleosom, dsDNA (dsDNA-Antikörper) und für dsDNA: Protein-Komplexe (also Komplexen von dsDNA mit Nukleinsäure-assoziierten Proteinen) sind. Dabei kommen sowohl Komplexe struktureller Natur (z.B. Histone oder dsDNA mit Histonen) als auch solche funktioneller Natur (z.B. mit Repressoren oder Transkriptionsfaktoren) in Betracht, z.B. DNA:Histon-Komplexe, Nukleoprotein-Partikel, Nu- kleosomen, Laminin, Kollagen Typ IV und Heparansulfat; Komplexe aus Nukleinsäuren mit Nukleinsäure-assoziierten Proteinen oder Peptiden, wie Polymerasen, Telomerasen und den zuvor genannten Proteinen, soweit sie in Lupus-Patienten auftreten. Alle diese Antikörper sind erfindungsgemäß als anti-DNA-Autoantikörper oder Lupus-Autoantikörper anzusehen (im Gegensatz zu den unspezifischen Materialien wie Protein A, Peptid-GAM, Tryptophan, Dextransulfat, etc.). Die erfindungsgemäß verwendbaren niedrigmolekularen Rezeptoren für diese DNA-Autoantikörper müssen in der Lage sein, diese Autoantikörper aus dem Blut oder Plasma von Lupus-Patienten oder Personen mit einem Risiko für Lupus spezifisch zu entfernen. Die vorliegende Erfindung betrifft demgemäß auch sämtliche Apheresevorrichtungen, die einen Träger mit einem beliebigen niedrigmolekularen Rezeptor spezifisch für diese Lupus-Antikörper enthalten. Wesentlich ist dabei nur, dass die Träger mit den niedrigmolekularen Rezeptoren in der Lage sind, die Lupus-Antikörper aus dem Blut- oder Plasmastrom in der Aphe- resevorrichung spezifisch zu binden und so selektiv (von den anderen Immunglobulinen) abzutrennen. Diese DNA-Antikörper-Rezeptoren können dabei vorzugsweise Peptide oder Nukleinsäuren sein.
Besonders bevorzugt sind als Rezeptoren dsDNA-Moleküle, dsDNA- Mimicks, wie z.B. dsPNA Moleküle, Peptid-Mimicks für (ds)DNA, oder Mischungen dieser Substanzen, sowie Moleküle gleicher Bindungsspezifität .
Peptide als DNA-Autoantikörper-bindende niedrigmolekulare Rezeptoren können dabei aus D- oder L-Aminosäuren oder Kombinationen von D- und L-Aminosäuren zusammengesetzt sein, und gegebenenfalls durch weitere Modifizierungen, Ringschlüsse oder De- rivatisierungen verändert worden sein. Geeignete
Peptidrezeptoren für die DNA-Antikörper können aus Peptidbiblio- theken zur Verfügung gestellt werden, die kommerziell erhältlich sind. Vorzugsweise sind diese Peptide zumindest 5, vorzugsweise 6, Aminosäuren lang, insbesondere mindestens 8 Aminosäuren, wobei bevorzugte Längen sich bis zu 11, vorzugsweise bis zu 14 oder 20 Aminosäuren erstrecken können. Erfindungsgemäß können jedoch auch längere Peptide ohne weiteres als DNA-Autoantikörper bindende Rezeptoren herangezogen werden, jedoch sind wie oben erwähnt bei Molekülen, die größer sind als lOkDA die geschilderten Vorteile der vorliegenden Erfindung nicht mehr so deutlich und daher nicht bevorzugt. Desweiteren eignen sich Oli- gomere (wie z.B. Polyethylenimin und Polylysin) als Rezeptoren.
Zur Herstellung derartiger DNA-Autoantikörper-bindender niedrigmolekularer Rezeptoren sind selbstverständlich auch Phagen-Bi- bliotheken, Peptid-Bibliotheken, z.B. mittels kombinatorischer Chemie erzeugt oder mittels high throughput screening-Techniken für verschiedenste Strukturen, geeignet (siehe z.B. in Phage Display : A Laboratory Manual by Carlos F. Barbas (Editor) , et al; Willats WG, Phage display: practicalities and prospects. Plant Mol Biol. 2002 Dec; 50 (6) : 837-54 ; http: //www.microcollections .de/showpublications .php#) . Neben Phagenbibliotheken auf Randomisierungsbasis eigen sich ebensolche Bibliotheken, die sich des ribosomalen Displays oder des bakteriellen Displays bedienen. Entsprechende Bibliotheken und Verfahren zu ihrer Generierung sind dem Fachmann bekannt und unter anderem in US 2004/0110281 A, WO 00/72880 und WO 02/059148 A.
Beispiele für derartige Peptide, die Mimicks für antigene und immunogene Epitope von dsDNA i-Lupus darstellen, sind in Sun et al. (Int. Immun. 13(2) (2001), 223-232) beschrieben („positive clones" in Tabelle 1, insbesondere RLTSSLRYNP; gefunden durch „rando peptide libraries"), in US 6 001 964 (insbesondere die Sequenz X-G-W-X-R-V) , Gaynor et al. (PNAS 94 (1997), 1955-1960; insbesondere DWEYSVWLSN als Konsensus-Sequenz), etc. Weiters können erfindungsgemäß neben dsDNA (Plasmide, zirkuläre dsDNA, lineare dsDNA, dsRNA, cDNAs, PCR-Fragmente komplementäre Oligonukleotide, „Decoy"-01igodeoxynuleotide (ds Oligonukleoti- de, die von der Sequenz her Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren darstellen), etc.) auch niedermolekulare DNA- Autoantikörper-bindende Rezeptoren auf Basis von Nukleinsäuren, sogar als „Aptameren" eingesetzt werden, wobei auch diese mit verschiedensten (Oligonukleotid-) Bibliotheken (z.B. mit 2-180 Nukleinsäureresten) aufgefunden werden können (z.B. Burgstaller et al., Curr. Opin. Drug Discov. Dev. 5 (5) (2002) , 690-700; Fa- mulok et al., Acc. Chem. Res. 33 (2000), 591-599; Mayer et al . , PNAS 98 (2001), 4961-4965, uvm.). Erfindungsgemäß zu verwendende Plasmid-DNAs finden sich in beispielsweise in entsprechenden Datenbanken (http: //www.belspo.be/bccm/db/plasmid search. asp) bei kommerziellen Anbietern (http: //www. strataqene. com/) oder in der wissenschaftlichen Literatur ( aniatis T, et al . Molecular Cloning A Laboratory Manual; http: //www.ncbi . nlm. nih. qov/en- trez/query. fcqi?db=pubmed&cmd=search&term=plasmid) . Als Quelle für genomische DNA eignen sich biologische Organismen aus der Gruppe der Prokaryonten und Eukaryonten ebenso wie Viren und Bakteriophagen.
Das Nukleinsäurerückgrat kann bei Rezeptoren auf Nukleinsäureba- sis beispielsweise durch die natürlichen Phosphordiester-Ver- bindungen aber auch durch Phosphorothioate oder Kombinationen oder chemische Variationen (z.B als PNA) zur Verfügung gestellt werden, wobei als Basen erfindungsgemäß vor allem U, T, A, C, G, H und mC eingesetzt werden können. Die 2 ' -Reste der Nukleotide, die gemäß der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, sind vorzugsweise H, OH, F, Cl, NH2, O-Methyl, O-Ethyl, O-Propyl oder O-Butyl, wobei die Nukleinsäuren auch modifiziert werden können, also beispielsweise mit Schutzgruppen, wie sie üblicherweise in der Oligonukleotidsynthese angewendet werden, versehen werden. Unter „Schutzgruppe" wird dabei eine Veretherung des Sauerstoffatoms verstanden, wohingegen bei der 2 -Modifikation die -OH-Gruppe durch etwas anderes ersetzt wird. Für beide Varianten bestehen im Stand der Technik sehr vielfältige Möglichkeiten, besonders bevorzugte Schutzgruppen sind dabei Methyl-, Allyl-, Propyl-, u. dgl . (also z.B. 2 Λ-0CH3, 2 -0-CH=CH2, etc.); besonders bevorzugte Modifikationen sind 2 -Desoxy, 2Λ-Amino, 2 -Fluoro, 2λ-Bromo, 2 -Azido, aber auch Metalle, wie Selen, etc.. Weiters können erfindungsgemäß auch die Oligonukleotid- Stabilisierungstechniken, die für die Antisense-Technologie (Ri- bozyme, RNAi, etc., z.B. mit Phospothioaten) entwickelt wurden, zur Bereitstellung der Nukleinsäuren herangezogen werden (s.z.B. die dabei führenden Firmen ISIS und Ribozyme Pharmaceuticals, insbesondere deren Patentdokumente und Homepage) .
Die Aptamere für die DNA-Autoantikörper findet man bespielsweise mit dem nachfolgend beschriebenen Verfahren. Man kontaktiert immobilisierte DNA-Autoantikörper mit einer Mischung aus Nukleinsäuren, wobei hochaffin bindende Nukleinsäuren von den weniger affin oder gar nicht bindenden Nukleinsäuren abgetrennt werden. Bei den Mischungen mit Nukleinsäuren handelt es sich typischerweise um Nukleinsäurenbibliotheken, welche beispielsweise im Wege der kombinatorischen Chemie hergestellt wurden. Eine Nukle- insäurebibliothek enthält eine Vielzahl voneinander unterschiedlicher Nukleinsäuren, wobei zumindest in einem Teilsequenzbereich eine Randomisierung (mit natürlichen und/oder nicht-natürlichen Nukleotiden) eingerichtet ist. Es kann, muss aber nicht, ein konservierter Sequenzbereich vorgesehen sein. Randomisierung in n Positionen mit m verschiedenen Nukleotiden führt zu einer Bibliothek mit nm Elementen.
Für das Auffinden der DNA-Autoantikörper-spezifischen Affinitätsnukleinsäuren werden folgende Schritte durchgeführt. a) eine Säule wird (innenseitig) mit DNA-Autoantikörper beladen und DNA-Autoantikörper werden in der Säule immobilisiert, b) das Gemisch an Nukleinsäuren wird einem ersten Ende der Säule aufgegeben, wobei durch die Säule ein definierter Volumenstrom an Trägersubstanz, laufend vom ersten Ende zum zweiten Ende der Säule, eingerichtet ist, c) die Nukleinsäuren werden mit abnehmender Affinität der Nukleinsäuren zu DNA-Autoantikörper in zunehmendem Abstand vom ersten Ende der Säule gebunden und immobilisiert, d) der Volumenstrom an Trägersubstanz durch die Säule wird nach einer definierten Laufzeit beendet, e) die Säule wird durch eine Mehrzahl von Teilungen in Säulensegmente aufgetrennt, wobei jedem Segment eine Laufwegkoordinate zugeordnet wird, f) aus zumindest einem Segment werden die immobilisierten Nukleinsäuren unspezifisch desorbiert und unter Zuordnung der dem Segment zugeordneten Laufwegkoordinate gewonnen. Der Ausdruck innenseitig der Säule meint innerhalb eines Lumens in aller Allgemeinheit. Der Ausdruck der Säule sollte alle Arten fester Trägersysteme umfassen können, z.B. auch nicht vollständig umschlossene Trägersysteme sind möglich.
Die Immobilisierung von DNA-Autoantikörper kann nach den üblichen Methoden der Säulenchromatographie erfolgen. Als Säule ist jedes mechanisches Konstrukt bezeichnet, welches ein Lumen mit zwei Enden aufweist. Als Strukturmaterial kommen alle für Säulen üblichen Materialien, wie Metalle, Glas und/oder Kunststoffe in Frage. Die Säule kann innenseitig mit einer DNA-Autoantikörper bindenden Matrix versehen sein und/oder das Strukturmaterial kann zur direkten Bindung der Targetmoleküle geeignet oder vorbereitet sein. Ein Gemisch aus Nukleinsäuren bezeichnet Nukle- insäurebibliotheken mit einer Anzahl von typischerweise 106 bis 1022/Mol, insbesondere 1010 bis 1021/Mol, voneinander verschiedener Nukleinsäurenspezies. In der auf die Säule aufgetragenen Bibliothek ist jede Nukleinsäurespezies statistisch beispielsweise mit 10 bis 1017, insbesondere 100 bis 1013, Molekülen vertreten. Die Trägersubstanz ist üblicherweise eine Flüssigkeit, in welcher die Nukleinsäurebibliothek löslich und stabil ist. Hierfür kommen alle für Nukleinsäurebibliotheken üblichen Puffer und dergleichen in Frage. Der Volumenstrom an Trägersubstanz kann vor Auftrag der Nukleinsäurebibliothek eingestellt werden. Dann wird die Nukleinsäurebibliothek säuleneingangsseitig dem Trägersubstanzstrom zugegeben. Die Nukleinsäurebibliothek kann aber auch unmittelbar aufgegeben werden. Nach einer Laufzeit, welche durch den Aufbau der Säule und den eingestellten Volumenstrom bestimmt ist, tritt der "Pfropfen", welcher durch die Nukleinsäurebibliothek aufgegeben wurde, säulenausgangsseitig wieder aus (verbreitert durch Faltung mit der Diffusion) , wobei gebundene Nukleinsäuren aus dem "Pfropfen" abgetrennt und in der Säule immobilisiert wurden. Zweckmäßigerweise wird der Volumenstrom durch die Säule wenig- bzw. nicht-turbulent, vorzugsweise laminar, eingestellt (Summe der Beschleunigungsvektoren der Trägersubstanz über das Säulenvolumen, insbesondere über den Säulenquerschnitt, minimal, idealerweise 0) . Die Gesamtanzahl der DNA- Autoantikörper-Moleküle in der Säule beträgt typischerweise das 102- bis 1016-fache, insbesondere das 103- bis 1015-fache, der An- zahl an Nukleinsäuremolekülen einer einzelnen Spezies in der aufgetragenen Nukleinsäurebibliothek. Die Bindung der Nukleinsäuren an die DNA-Autoantikörper-Moleküle erfolgt vorzugsweise unter Bedingungen, welche einem späteren Einsatz der Nukleinsäuren bei der Apherese entsprechen, beispielsweise in einem geeigneten Puffer, welcher entsprechend abgestimmt ist hinsichtlich Temperatur, Ionenstärke, pH-Wert und Pufferbedingungen. Die Trägersubstanz sowie das Lösungsmittel der Nukleinsäurenbibliothek sind dann entsprechend hinsichtlich derer Komponenten auszuwählen. Die Teilung der Säule in eine Mehrzahl von Säulensegmente kann beispielsweise durch Zerschneiden der Säule erfolgen, wobei die Schnitte vorzugsweise orthogonal zum Volumenstromvektor erfolgen. Die Säule kann aber auch zuvor aus Säulensegmenten zusammengesetzt worden sein, wobei sich ein Säulensegment vorzugsweise in Richtung des Volumenstromvektors an das nächste Säulensegment dicht aneinanderreiht (Fügequerschnitt orthogonal zum Volumenstromvektor) . Dann kann die Teilung durch Auflösung des zuvor gebildeten Verbundes aus Säulensegmenten erfolgen. Die unspezifische Desorption kann durch Eluierung mit einem hinreichend starken Liganden durch Verdrängung, Komplexierung, Modifikation und/oder Zerstörung von DNA-Autoantikörpern, physikoche- misch oder thermisch erfolgen. Auch mechanische Verfahren, beispielsweise Ultraschall, können zur Desorption oder zur Verstärkung der Desorption eingesetzt werden. Es können auch Kombinationen der vorstehenden Desorptionsverfahren angewandt werden. Es versteht sich, dass die Nukleinsäuren von dem verwendeten Desorptionsverfahren nicht zersetzt werden dürfen.
Die oben beschriebenen Schritte beruhen auf der Erkenntnis, dass eine Nukleinsäurebibliothek sich analog einer Proteinmischung mittels der Affinitätschromatographie räumlich nach Massgabe der Affinität zum Targetmolekül, im hier beschriebenen Fal, für DNA- Autoantikörper, trennen lässt. Die Erfindung beruht weiterhin auf der Erkenntnis, dass eine mittels unspezifischer Desorption sich einstellende Vermengung desorbierender Nukleinsäuren verschiedener Affinität dadurch vermeidbar ist, dass vor der unspezifischen Desorption die Säule mit den darin gebundenen Nukleinsäuren gleichsam in Affinitätsabschnitte aufgeteilt und die in den so erhaltenen Affinitätsabschnitten bzw. Säulensegmenten gebundenen Nukleinsäuren sich leicht und ohne störende Liganden- koppelungen beispielsweise im Rahmen einer PCR oder RT-PCR unspezifisch desorbieren und ebenso unspezifisch amplifizieren lassen. Subsequente Selektionsartefakte werden vermieden. Ebenso wenig sind Liganden, insbesondere hohe Konzentrationen an Liganden, zur Desorption erforderlich. Schließlich stehen praktisch alle gebundenen und dann desorbierten Nukleinsäuremoleküle für eine Amplifikation zur Verfügung. Dies erlaubt es, mit geringen Nukleinsäurekonzentrationen zu arbeiten. Es ist grundsätzlich bereits ausreichend, wenn in der Nukleinsäurebibliothek jede Spezies im statistischen Mittel mit einem Molekül vertreten ist. Wenn die Anzahl der DNA-Autoantikörper-Moleküle in einem Säulensegment statistisch 1 beträgt, dann können sogar einzelne Nukleinsäurespezies nach ihrer Affinität zum Targetmolekül getrennt werden.
Grundsätzlich reicht es aus, wenn ein Segment, welchem eine gewünschte Affinität zugeordnet ist, (isoliert) zur Desorption weiterverarbeitet wird. Dies setzt allerdings - außer bei maximaler Affinität, wobei das, bezogen auf den Volumenstromvektor, erste Säulensegment weiter verarbeitet wird - eine Vorstellung über die Affinitätsverteilung bei der aufgetragenen Nukleinsäurebibliothek voraus. Bevorzugt ist es daher in der Regel, dass die immobilisierten Nukleinsäuren aus jedem Segment separat desorbiert und gewonnen werden unter jeweiliger Zuordnung der Lauf egkoordinaten jeden Segments zu den daraus gewonnenen Nukleinsäuren.
Grundsätzlich ist jede Art der Desorption möglich. Vorzugsweise wird die unspezifische Desorption mittels üblicher physikoche- mischer oder thermischer Verfahren durchgeführt wird. Thermische Desorption erfolgt durch Erwärmung des Säulensegments bzw. der darin enthaltenen Lösung. Die Erwärmung kann beispielsweise durch elektrische Beheizung oder Einstrahlung von Mikrowellen oder IR erfolgen. Insbesondere sind die Erwärmungstechniken aus der PCR Technologie geeignet. Neben der Amplifikation von Nukleinsäuren bzw. Aptameren mittels Polymerase können selbstverständlich auch andere Amplifikationsverfahren, wie beispielsweise mittels Ligase, angewandt werden. Die unspezifische Desorption kann durch chemische Modifikation von den DNA-Autoantikörpern unterstützt werden, z.B. Oxidation durch Natriumperjo- dat oder dergleichen, oder durch unspezifische Komplexbildung, z.B. mittels Borat oder dergleichen zur Blockierung von cis- trans-Diolbindungen in Kohlenhydraten.
Daher ist es bevorzugt, wenn die unspezifische Desorption durch thermische Desorption in einer, vorzugsweise verlängerten Hochtemperaturphase einer PCR oder RT-PCR durchgeführt wird. Hierbei wird ein Synergieeffekt erzielt, da in aller Regel, insbesondere beim Arbeiten mit Nukleinsäurebibliotheken mit niedrigen Konzentrationen der Nukleinsäurespezies, eine Amplifi- zierung ohnehin erforderlich ist. Zur Erhöhung der Ausbeute wird beispielsweise mit 5 bis 60, vorzugsweise mit 20 bis 60, höchstvorzugsweise mit 45 bis 55, Zyklen gearbeitet. Im Rahmen der Amplifikation kann mit mindestens einem markierten Primer gearbeitet werden. Der Primer kann mindestens eine Endonuklease- schnittstelle aufweisen. Eine solche Schnittstelle dient beispielsweise dazu, das Amplifikat von größeren Bereichen der Primersequenz zu befreien. Nukleotidbausteine, sei es im Primer oder bei den zu selektierenden Nukleinsäuren, können beispielsweise mittels Fluoreszenzfarbstoffen markiert sein. Als Fluoreszenzfarbstoffe seien beispielsweise genannt: Alexa TM Fluor 488, Fluor 532, Fluor 546, Fluor 568, Fluor 594, Oregon Green 488, Fluorescein, Rhodamine 6G, Tetramethylrhodamine, Rhodamine B und Texas Red. Das Amplifikat kann auch durch zwei verschiedene chemische Modifikationen an verschiedenen Enden markiert sein, sofern die bei der Modifikation eingeführten Gruppen geeignet sind, als Liganden jeweils an einer unterschiedlichen Affinitätsmatrix gebunden werden zu können.
Es empfiehlt sich, zur sicheren Abtrennung nicht-affiner oder niedriger-affiner Nukleinsäuren zwischen geeigneten Verfahrenstufen Waschverfahrensschritte einzufügen. Insbesondere ist es bevorzugt, wenn zwischen den Verfahrensschritten d) und e) zumindest ein Waschverfahrensschritt durchgeführt wird. Zum Waschen ist beispielsweise das Lösungsmittel bzw. das Medium der Nukleinsäurebibliothek bzw. die Trägersubstanz geeignet.
Bevorzugt ist es, wenn die innenseitige Belegung der Säule mit DNA-Autoantikörpern und dessen Immobilisierung mittels kova- lenter Bindung, vorzugsweise nach Aktivierung mit chemisch hoch- reaktiven Gruppen (beispielsweise Tresylchlorid, Cyanbromid und/oder Periodat) oder über bifunktionale Spacerverbindungen nach Modifikation mit chemisch wenig reaktiven Gruppen (beispielsweise Amin, Hydroxy, Keto und/oder Carboxyl) , durchgeführt wird. Beispiele für Spacergerüste geeigneter Spacerverbindungen sind: substituierte und unsubstituierte C2-C10 Alkylgruppen, substituierte und unsubstituierte C2-C10 Alkenylgruppen, substituierte und unsubstituierte C2-C10 Alkynylgruppen, substituierte und unsubstituierte C4-C7 Carbocylo alkylgruppen, substituierte und unsubstituierte C4-C7 Carbocylo alkenylgruppen, substituierte und unsubstituierte C7-C14 Aralkylgruppen, ein he- terocyclisches Molekül mit Heteroatomen ausgewählt aus Stickstoff, Sauerstoff, Schwefel, wobei besagte Substitutionen bestehen können aus Alkyl, Alkenyl, Alkynyl, Alkoxy, Thiol, Thio- alkoxy, Hydroxyl, Aryl, Benzyl, Phenyl, Nitro, Halogen, Äthergruppen mit 2 bis 10 Kohlenstoffatomen und 1 bis 4 Sauerstoff oder Schwefel Atomen, Polyalkyl glycol, Halogen, Hydroxyl, Thiol, Keto, Carboxyl, Amide, Ätherverbindungen, Thioäther, Ar- nidinederivaten, Guanidinederivaten, Glutamylderivaten, Nitrat (0N02) , Nitro (N02) , Nitril, Trifluoromethyl (-CF3) , Trifluorome- thoxy (-OCF3), O-Alkyl, S-Alkyl, NH-Alkyl, N-Dialkyl, O-Aralkyl, S-Aralkyl, NH-Aralkyl, Amino, Azido (N3) , Hydrazino (NHNH2) , Hy- droxylamino (ONH2) , Sulfoxide (SO), Sulfone (S02) , Sulfide (S-) , Disulfide (S-S) , Silyl bestehen kann. Spacerverbindungen sind typischerweise bifunktional, wobei die Funktionalitäten gleich oder verschieden sein können und beispielsweise ausgewählt sind aus der Gruppe bestehend aus "N-Hydroxysuccinimid und Hydrazide" .
Zur Verringerung der Varietät innerhalb der aus einem Säulensegment erhältlichen Nukleinsäuren ist es bevorzugt, wenn jedes Säulensegment im statistischen Mittel 0,1 bis 103, vorzugsweise 1 bis 102, höchstvorzugsweise 1 bis 10, DNA-Autoantikörper-Moleküle enthält. Hierauf abgestimmt kann die Nukleinsäurebibliothek, wie aufgetragen, im statistischen Mittel 0,1 bis 103, vorzugsweise 1 bis 102, höchstvorzugsweise 1 bis 10, Nukleinsäuremoleküle einer Spezies enthalten.
Für das Strukturmaterial der Säule kommen grundsätzlich alle beispielsweise aus der Affinitätschromatographie bekannten Werk- stoffe in Frage. Hierzu gehören Säulen aus Kieselgel oder Polymere, wie Polyethylen nach Aktivierung durch chemische De- rivatisierung oder Plasmaaktivierung. Die Länge der Säulensegmente liegt zweckmäßigerweise im Bereich von 0,1 μm bis 1 mm, vorzugsweise 0,1 bis 100 μm, höchstvorzugsweise 0,5 bis 10 μm. Solche Schnitte lassen sich unschwer beispielsweise mittels eines Mikrotoms herstellen. Der Innendurchmesser der Säule liegt zweckmäßigerweise im Bereich von 0,05 bis 1 mm, vorzugsweise von 0,1 bis 0,5 mm, höchstvorzugsweise von 0,2 bis 0,4 mm.
Zweckmäßig ist es, wenn vor der eigentlichen Trennung (Bindung oder mechanische Auftrennung) der Nukleinsäuren unerwünschte Nukleinsäuren eliminiert werden. Unerwünschte Nukleinsäure sind beispielsweise Nukleinsäuren, welche an DNA-Autoantikörper-freie Innenoberflächen der Säule binden. Dann kann eine DNA-Autoantikörper-freie Säule vorgeschaltet und die Nukleinsäurebibliothek zuvor hierdurch geleitet werden.
Bei den vorstehenden Verfahrensweisen kann kontinuierlich, i. e. beispielsweise durch Hintereinanderschalten von Säulen, oder diskontinuierlich, beispielsweise durch zwischenzeitliches Auffangen des Eluenten aus der Vorsäule, gearbeitet werden.
Zur Erzielung einer weiteren Verbesserung der Affinitätstrennung kann grundsätzlich auf verschiedene Weisen verfahren werden. So können die aus einem oder mehreren Segmenten desorbierten Nukleinsäuren, ggf. nach Amplifikation wiederholt den erfindungsgemäßen Verfahren unterworfen werden, und/oder die Elutropie der Bedingungen bei der Desorption kann erhöht werden (Temperatur, Ionenstärke, pH-Wert, Pufferbedingungen) . Alternativ kann die Raumdichte von DNA-Autoantikörpern und folglich der gebundenen Nukleinsäuren, i. e. die Anzahl der DNA-Autoantikörper-Moleküle, in einem Säulensegment verringert werden.
DNA-Autoantikörper bindende Aptamere sind daher ebenfalls bevorzugte DNA-Autoantikörper-bindende Rezeptoren im Rahmen der vorliegenden Erfindung.
Erfindungsgemäß werden daher die DNA-Autoantikörper-bindenden niedermolekularen Rezeptoren, die vorzugsweise aus Peptiden, An- tikörpern oder Nukleinsäuren bestehen, an ein geeignetes Trägermaterial zur extra-korporalen Eliminierung von DNA-Autoantikörper in Lupus- (Risiko-) Patienten verwendet.
Bei der Anwendung der vorliegenden Erfindung in medizinischer Routinepraxis ist es erforderlich, dass der Träger in der Apha- reseapparatur steril und pyrogenfrei ist, so dass jede Trägersubstanz bzw. jede Rezeptor-/Träger-Kombination, die diese Merkmale erfüllt, erfindungsgemäß bevorzugt ist (siehe z.B. US 6 030 614 oder US 5 476 715) . Zu den geeigneten Beispielen zählen poröse Homopolymere, Co- oder Terpolymere von Vinyl enthaltenden Monomeren (z.B. Acryl-Säure, wie z.B. TSK Toyopearl, Fractogel TSK) , Träger mit Modifkationen (Aktivierungen) mit Oxiran enthaltenden Verbindungen (z.B. Epichlorohydrin) und gegebenenfalls weiteren Reaktionen mit NH3, Amino oder Carboxyl enthaltenden Verbindungen, oder CNBr oder CNCl-Adsorbientien, wie in der EP 110 409 A und der DE 36 17 672 A beschrieben. Besonders bevorzugte Adsorptionsmaterialien für therapeutische Zwecke sind geeignet, einen Verlust von Blutzellen zu vermeiden, aktivieren das KomplementSystem nicht oder nur geringfügig und halten eine Aggregatbildung im extra-korporalen Kreislauf möglichst hintan. Weiters sollten die eingesetzten Trägermaterialien vorzugsweise auch in rezeptorgekoppelter Form ausreichend stabil gegenüber Sterilisierungsmaßnahmen sein, insbesondere gegenüber Ethylen- Oxid-Sättigung, Glutaraldehyd-Sättigung, Gamma-Bestrahlung, Dampfbehandlung, UV-Behandlung, Lösungsmittelbehandlung und/oder Detergensbehandlung, etc.. Beispielsweise können auch Produkte auf Sepharose-, Agarose-, Acryl-, Vinyl-, Dextran- etc. -Basis eingesetzt werden, die vorzugsweise geeignete funktioneile Gruppen zur Anbindung der DNA-Autoantikörper bindenden Rezeptoren bereits kommerziell erhältlich aufweisen. Weitere geeignete Träger schließen auch Monolithe ein (Träger auf Basis von quervernetzten Glycidylmethacrylat-co-ethylenglykoldimethacrylat- Polymer) und Subpol (Poschalko et al., J Am Chem Soc. 2003 Nov 5; 125(44) :13415-26.) .
Zur Kopplung der Rezeptoren an die geeigneten Träger ist die dem Fachmann bekannte Chemie einsetzbar (z.B. Bioconjugate Techni- ques, Greg T Her anson, Ed., Academic Press, Ine, San Diego, CA, 1995, 785pp) . Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtung zur Bereitstellung einer Behandlung oder Behandlungsvorrichtung für Lupus-Erkrankungen oder zur Vorbeugung einer derartigen Erkrankung, indem die Vorrichtung geeignet zur Behandlung des jeweiligen Patienten hergerichtet wird. Bei der Durchführung der Behandlung wird ein Patient für eine zur effektiven Eliminierung von DNA- Autoantikörpern ausreichende Zeitdauer an die Aphereseapparatur angeschlossen, wobei der Blut- oder Plasmafluss des Patienten mit dem festen Träger, umfassend den DNA-Autoantikörper bindenden Rezeptor, kontaktiert wird, worauf die DNA-Autoantikörper gebunden werden. Im Zuge der Apherese-Behandlung sind natürlich peripherer oder zentralvenöser Venenzugang bzw. arterievenöse Fistel sicherzustellen, ebenso wie ausreichende Antikoagulation, sowie die erforderlichen Quantifizierungs- und Messdaten aufzuzeichnen. Weiters wird bei den meisten Aphereseverfahren eine Primär-Trennung von Plasma und Blutzellen vor der eigentlichen Plasmabehandlung erforderlich sein. Besondere Personen, bei denen eine vorbeugende Maßnahme erforderlich ist, sind familiär belastete Personen, Personen mit Risiko durch besondere exogene/endogene Faktoren (Sonnenlicht, Hormone, Geschlecht, Diagnose (z.B. Detektion von DNA-Autoantikörpern im Blut),...) oder Personen mit einem anderen Risikofaktor für Lupus, insbesondere aufgrund genetischer Faktoren.
Die Lupus-Erkrankungen, die erfindungsgemäß behandelt werden können schließen sämtliche Typen ein, die mit der Anwesenheit von DNA-Autoantikörpern im Sinne der vorliegenden Erfindung verbunden sind. Dazu zählt daher besonders Lupus erythematodes, vorzugsweise chronischer diskoider Lupus erythematodes (antinu- kleäre Antikörper, vor allem gegen Histone) , Pseudo-Lupus erythematodes (antimitochondriale Antikörper) , Chillblain-Lupus, Antikardiolipin-Syndrom (Kardiolipin-Antikörper) , Medikamenten- induzierter Lupus erythematodes, neonataler Lupus erythematodes (diaplazentare Übertragung mütterlicher Antikörper) , Lupus erythematodes profundus, subakuter kutaner Lupus erythematodes (an- tinukleäre Antikörper) , systemischer Lupus erythematodes (antinukleäre Antikörper, dsDNA-Antikörper) , insbesondere systemischer Lupus erythematodes. Bei der spezifischen Behandlung der jeweiligen Lupus-Unterformen kann dabei auch auf ein spezifisches Set von DNA-Antikörper-Rezeptoren zurückgegriffen werden und ein Krankheits- oder sogar Patienten-spezifischer Träger verwendet werden, abhängig von der Art und dem Titer der spezifischen DNA-Autoantikörper im Patienten.
Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele, auf die sie selbstverständlich nicht eingeschränkt ist, näher erläutert.
1. Herstellung des DNA-Autoantikörper-Rezeptor tragenden Trägers
1.1 Monolithische Säule
Eine CIM® Epoxy Monolithic Säule (BIA Separations, SI) wird gemäß den Angaben des Herstellers mit 0,5 M Na-Phosphat-Puffer bei pH 8,0 äquilibriert und eine Plasmid-DNA ebenfalls gemäß Herstellerangaben aktiviert und an die CIM-Säule gekoppelt. Die Säule wird mehrfach mit Phosphat-Puffer gewaschen (+ 1 M NaCl) und überschüssige Epoxy-Gruppen gegebenenfalls noch blockiert.
Qualitätssicherung wird mittels Kontrolle im Wasch- und Äquilibrationseluat durchgeführt; nur Säulen ohne aktive Epoxy- Gruppen und ohne DNA-Leakage im Eluat werden weiterverwendet und in eine Apharese-Apparatur eingebaut.
1.2 Sepharose-Säule
Ein Agarose Bulk-Material (Sepharose CL4B) wird aseptisch in einen sterilen und pyrogenfreien Behälter gefüllt und das Material aseptisch gewaschen, wobei zwischen jedem Waschschritt das Gelmaterial völlig unter Vakuum getrocknet wird. Die Sepharose wird anschließend für 30 Minuten bei 115 °C im Autoklaven dampfs- terilisiert .
Nach der Sterilisierung wird die Sepharose in einem sterilen Behälter in 60% Aceton/Wasser aufgenommen und mit CNBr und Trie- thylamin aktiviert (14 g CNBr pro 96 ml Acton; 30 ml Triethylamin in 66,2 ml 87 %igem Aceton) . Dann wurde eine Ace- ton/HCl-Lösung zugesetzt (392 ml steriles, pyrogenfreies Wasser; 16,3 ml 5 N HCl, 408 ml Aceton). Die aktivierte Sepharose wird gewaschen und innerhalb von 2 h der Kopplungsreaktion zugeführt, um die Hydrolyse von aktivierten Gruppen zu verhindern.
Eine sterilfiltrierte kopplungsfähige Plasmid-DNA-Lösung wird in das -Reaktionsgefäß eingebracht und für mindestens 90 min gerührt. Schließlich wird die Reaktionslösung gründlich gewaschen
(mit isotonischem Phosphat-Puffer) , bis keine Reaktionsprodukte im Eluat nachweisbar sind, und die Plasmid-gekoppelte Sepharose in sterile und depyrogenisierte Glassäulen mit Glassintern gefüllt und einer abschließenden Qualitätskontrolle unterzogen (Eluatanalyse hinischtlich Reaktionsprodukten, Schwermetallen etc.; Partikelanalyse, Pyrogenizität; Sterilität).
2. Tiermodell für die Apherese-Behandlung von SLE-Patienten
Im Institut für Diabetes "Gerhardt Katsch" ist ein miniaturisiertes extrakorporales System zur Anwendung der Apherese-Thera- pie am Kleintiermodell Ratte entwickelt worden. Ein derar-tiges Apherese-Testsystem ist weltweit nur sehr begrenzt verfüg-bar. Die wiederholte Apherese-Behandlung beim gleichen Ver-suchstier und sich daran anschließende Untersuchungen in der Nachbeobachtungsphase zur Beurteilung des Therapieerfolges haben einen hohen Neuheitswert und sind im internationalen Schrifttum bisher nicht beschrieben worden.
Die Apherese ist ein alternatives Therapieverfahren, bei dem Blut außerhalb des Körpers krankheitsverursachende Substanzen entzogen werden. In der Humanmedizin ist die Apherese bisher zur Behandlung von mehr als 100 Krankheiten eingesetzt worden. Mit Hilfe der Apherese konnten krankheitsrelevante Substanzen u.a. bei Autoimmunerkrankungen wie rheumatoider Arthritis, Myasthenia gravis, endokriner Ophthalmopathie, Multipler Sklerose, systemischem Lupus erythematosus, Stiff-Man-Syndrom und Typ-1-Diabetes vollständig oder zumindest teilweise aus dem Blut entfernt werden. Bisher wird die Apherese jedoch nur als alternatives Verfahren zur Behandlung von Therapie-resistenten chronischen Erkrankungen, die mit starken Belastungen und einer deutlichen Einschränkung der Lebensqualität der betroffenen Patienten verbunden sind, anerkannt. Ein wesentlicher Grund dafür ist, dass bisher keine detaillierten Kenntnisse zu den Wirkmechanismen ei- ner erfolgreichen Apherese-Therapie vorliegen.
Durch Verwendung anerkannter Tiermodelle, wie z.B. für den Typ- 1-Diabetes und die rheumatoide Arthritis, können sowohl die Wirkmechanismen der Apherese-Verfahren weiter aufgeklärt als auch neuartige Indikationsstellungen für die Apherese-Behandlung präklinisch getestet werden. Für die Durchführung von Apherese- Behandlungen werden die Versuchstiere zunächst mit chronischen Gefäßkathetern versehen. Im extrakorporalen Kreislauf werden anschließend die plasmatischen und zellulären Bestandteile des Blutes über Plasmafilter getrennt. Während die zellulären Bestandteile sofort an das Tier zurückgehen, kann das Plasma vor der Rückführung durch verschiedene Adsorptionsverfahren (Immunadsorption o.a.) gereinigt werden. Die gute Verträglichkeit solcher wiederholter Apherese-Behandlungen ist bereits für verschiedene Rattenstämme belegt worden (Körpermasse, Hämatokrit, Allgemeinzustand) . Das Apherese-Testsystem ist bei Tieren mit einem Mindestgewicht von 250g erprobt und an Ratten-Modellen für Autoimmunerkrankungen (Typ-1-Diabetes, Kollagen Typ II-indu- zierte Arthritis) eingesetzt worden.
Das extrakorporale System zur Plasmapherese am Kleintiermodell kann für verschiedene Arten der Adsorption herangezogen werden. Die Anwendung dieses Testsystems an Modellen für chronische Erkrankungen ermöglicht (A) die Erprobung neuer Behandlungs- und Präventionsstrategien, (B) die Entschlüsselung der Wirkmechanismen verschiedener Apherese-Technologien und (C) die Ermittlung der Indikationsstellung für einzelne Apherese-Therapieverfahren. Das IDK ist Ihr kompetenter Partner bei der präklinischen Testung neu entwickelter Apherese-Verfahren und kann wesentlich zur Überführung und Markteinführung neuer therapeutischer Verfahren von der Entwicklungsphase über die tierexperimentelle Erprobung bis hin zur klinischen Anwendung beim Patienten beitragen (http: //www.praeklinik. de/) .
Vor Beginn der experimentellen Apherese-Therapie werden die Tiere mit arteriellen und venösen Kathetern versehen, beziehungsweise es werden chronisch katheterisierte Ratten (Gefäßkatheter, die zur Applikation von Testsubstanzen und zur Blutproben-ent- nahme sowie zur Durchführung der Apherese-Therapie und der Clamp-Untersuchungen im Tiermodell geeignet sind) eingesetzt. In einem ersten Schritt werden bei der Apherese zunächst Blutzellen und Plasma mittels Plasmafilter getrennt. Während die Blutzellen unmittelbar in das Tier refundiert werden (über den venösen Katheter) wird das getrennte Plasma an dem in Beispiel 1 hergestellten Adsorptions-Mittel vorbeigeführt (wobei die Liganden durch Bindung an die immobilisierten Affinitätspeptide aus dem Plasma abgetrennt werden) , bevor es dem Tier wieder zugeführt wird.
3. DNA-Autoantikörper-Aptamere
3.1 Aktivierung einer Kieselgelsäule mit Tresylchlorid
Die Säule wird mit Aceton durchspült. Zur Aktivierung wird eine wasserfreie Lösung (2 ml Aceton, 1 ml Tresylchlorid, einige Tropfen Pyridin) durch die Säule gegeben (lOfaches Säulenvolumen) und diese über Nacht auf Eis inkubiert. Anschließend wird die Säule mit dem 20fachen Säulenvolumen 100%Aceton (wasserfrei) durchspült. Die aktivierte Säule kann in 1 mM HC1 aufbewahrt werden.
3.2 Aktivierung einer Polyethylensäule
Ein Polyethylenschlauch wird mit dem 20fachen Säulenvolumen bei Raumtemperatur mit einer Lösung (2% Kaliumpermanganat (KMn04) (w/v) in konzentrierter Schwefelsäure (H2S0) ) und anschließend mit destilliertem Wasser durchspült. Zur weiteren Kopplung der Säulenoberfläche können bi- oder polyvalente Moleküle zum Cross- linking verwendet werden, die mindestens eine reaktive Aldehydgruppe (z. B. 1% Glutaraldehyd) aufweisen. Diese werden für 1 h bei 4° C durch die Säule gegeben. Anschließend wird die Reaktion durch reduzierende Bedingungen (z. B. durch Natrium Cyanoborhy- drid (0.00025% w/v in 0.15 M NaCl, pH 3,9) stabilisiert.
3.3 Koppelung von DNA-Autoantikörpern an die aktivierte Kieselgelsäule
Die Tresylchlorid-aktivierte Säule wird mit 0,1 M Na2C03 (pH 8,5) durchspült. Zur Koppelung wird ein Peptid oder Protein (2 mg/ml 0,1 M Na2C03, pH 8,5) mehrfach für 2 h bei 37° C und anschließend für 4 h auf Eis durch die Säule gegeben. Zur Blockierung freier Bindungstellen der Säule wird anschliessend ein Überschuss von 0,2 M Glycin, pH 8 für durch die Säule gegeben.
3.4 Koppelung eines Glykoproteins an die aktivierte Polyethylen- säule
Die aktivierte Säule wird mit 0,1 M Na2C03 (pH 8,5) durchspült. Zur Koppelung werden DNA-Autoantikörper (2 mg/ml 0,1 M Na2C03, pH 8,5) mehrfach für 2 h bei 37° C und anschließend für 4 h auf Eis durch die Säule gegeben. Zur Blockierung freier Bindungstellen der Säule wird anschließend ein Überschuss von 0,2 M Glycin, pH 8 durch die Säule gegeben. Zur Verbesserung der Reaktion kann 1- Ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid (EDC) , 5% w/v zugegeben werden) .
3.5 Herstellung einer Säule zur Eliminierung unerwünschter Moleküle
Die Tresylchlorid-aktivierte Säule wird mit 0,1 M Na2C03 (pH 8,5) durchspült. Soll gegen ein Molekül mit einer oder mehreren primären oder sekundären A inen die Elimination erfolgen wird dieses Molekül oder das Gemisch (2 mg/ml 0,1 M Na2C03, pH 8,5) mehrfach über Nacht bei RT durch die Säule gegeben. Zur Blockierung freier Bindungstellen der Säule wird anschließend ein Überschuss von 0,2 M Glycin, pH 8 für durch die Säule gegeben. Wird keine Elimination gegen bestimmte Moleküle mit einer oder mehreren primären oder sekundären Aminen gewünscht, werden alle Bindungstellen der Säule mit Glycin blockiert.
Weitere Derivatisierungsverfahren finden sich beispielsweise in den folgenden Literaturstellen: Patterson, W. J. , National Aero- nautics and Space Administration, Technical Memorandum, NASA TMX-73311, U.S. Government Printing Office, Washington, D. C, 1976, Ma, S. M., Gregonis, D. E., von Wagenen, R. A. , and Andrade, J. D., in "Hydrogels for Medical and Related Applications" (J. D. Andrade, Ed.), Amer. Chem. Soc. Symp . Series, Vol. 31, p. 241, 1976, Harris, J. M. , Struck, E. C, Case, M. G., Pa- ley, M. S., Van Alstine, J. M. , and Brooks, D. E., J. Polymer Sei., Polymer Che . Ed., 22, 341 (1984), Regnier and Noel, Reg- nier, F. E., and Noel, R. J. , J. Chromatog. Sei., 14, (1976), Yalpani, M. and Brooks, D. E., J. Polymer Sei., Polymer Chem. Ed., 23, 395 (1985) .
3.6 Durchführung des Kontaktes der Nukleinsäuren an DNA-Autoantikörper und Trennung der Säule
Die beschichteten Säulen werden Leckage frei hintereinander geschaltet, erst die Säulen zur Elimination unerwünschter Moleküle, anschließend die DNA-Autoantikörper-Säule. Zur Äquilibrierung wird ein geeigneter Puffer, z. B. eine Pufferlösung (10 mM Tris-HCl, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2 und Gelatine 0,001% (w/v), pH 8,3), für 1 h auf Eis über die Säule gegeben. Die Nukleinsäuren der kombinatorischen Nukleinsäurebibliothek werden in 1 ml des gleichen Puffers aufgenommen und zum Aufschmelzen von Doppelsträngen für 10 min auf 95° C erwärmt und anschließend mehrfach (4-30mal) über die Säule gegeben. Anschließend werden die Säulen getrennt und über Nacht auf Eis mit dem gewählten Puffer (s. o.) gewaschen. Die Auftrennung der Säule in Strömungsrichtung erfolgt mit einem geeigneten Schneidwerkzeug.

Claims

Patentansprüche :
1. Apheresevorrichtung mit einem dem Blut- oder Plasmafluss kontaktierbaren festen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass der feste Träger einen spezifischen niedermolekularen DNA-Autoantikörper bindenden Rezeptor aufweist.
2. Vorrichtung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass der DNA-Autoantikörper bindende Rezeptor ausgewählt ist aus dsDNA, dsPNA, DNA-Autoantikörper-Aptameren, dsDNA-Mimick-Peptiden, dsDNA: Protein-Komlexen oder Mischungen dieser Substanzen.
3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger eine sterile und pyrogenfreie Säule ist.
4. Verwendung einer Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, zur Bereitstellung einer Behandlung von Lupus-Erkrankungen oder zur Vorbeugung derselben.
5. Verwendung nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die Lupus-Erkrankung ausgewählt ist aus Lupus erythematodes, vorzugsweise chronischer diskoider Lupus erythematodes, PseudoLupus erythematodes, Chillblain-Lupus, Antikardiolipin-Syndrom, Medikamenten-induzierter Lupus erythematodes, neonataler Lupus erythematodes, Lupus erythematodes profundus, subakuter kutaner Lupus erythematodes, systemischer Lupus erythematodes, insbesondere systemischer Lupus erythematodes.
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